專利名稱：瘧疾單管-套式/多重pcr基因診斷試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種傳染病的診斷試劑一瘧疾的基因診 斷試劑盒及其檢測(cè)方法具體涉及運(yùn)用多項(xiàng)創(chuàng)新設(shè)計(jì)方案優(yōu)化的單管-套式/多重PCR技 術(shù)。背親技術(shù)瘧疾分為惡性瘧、間円瘧、三閂瘧和卵形瘧，分別由寄生在人體血液紅血 球內(nèi)的4種人瘧原蟲引起即惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、間R瘧原蟲 (P.vivax)、三閂瘧原蟲(P.maiariae)和卵圓瘧原蟲(P.ovale);可由按蚊屬 (An叩heles)的約30多種媒介按蚊叮咬吸血傳播。發(fā)病常有寒戰(zhàn)、高熱、頭痛和出汗 等全身癥狀呈間歇熱周期性發(fā)作，在流行區(qū)居民由于反復(fù)感染可引起嚴(yán)重貧血、營(yíng)養(yǎng)不 良、發(fā)育不良以及脾臟腫大，對(duì)嬰幼兒童和孕婦胎兒的健康發(fā)育的損害尤為嚴(yán)重，如不 及時(shí)有效的抗瘧治療可引起腦型瘧、、腫水腫、腎功能不全和腎功能衰竭等兇險(xiǎn)發(fā)作乃 至死亡。是世界上危害最嚴(yán)重的三大傳染病(艾滋病，結(jié)核和瘧疾)之一。WHO已把控 制瘧疾定為本世紀(jì)行動(dòng)目標(biāo)之一。由于4種瘧原蟲的生物學(xué)和免疫學(xué)特性，致病性，對(duì) 抗瘧藥的治療效應(yīng)，對(duì)媒介按蚊的敏感性以及它們?cè)谌蛄餍械膮^(qū)域分布各異；對(duì)各種 瘧疾的及時(shí)正確治療、防制措施與策略的制訂，乃至抗疤藥和疫苗研制均有賴于靈敏、 準(zhǔn)確的診斷和鑒別診斷。目前，瘧原蟲對(duì)抗瘧藥和媒介按蚊對(duì)殺蟲劑已產(chǎn)生廣泛的抗藥 性，使全球瘧疾控制更加困難。據(jù)WHO估計(jì)全球每年約有2.75億人感染瘧疾，因患瘧 疾死亡人數(shù)在100力'以上w。我國(guó)歷史上瘧疾曾經(jīng)猖獗流行,每年發(fā)病人數(shù)以百萬計(jì),解 放后經(jīng)過數(shù)十年積極防治，大面積流行已經(jīng)控制,許多地區(qū)已逐步達(dá)到基本消滅瘧疾,但 是由于我國(guó)幅員遼闊，邊境線長(zhǎng)，地區(qū)經(jīng)濟(jì)文化衛(wèi)生條件發(fā)展不均衡，我國(guó)大部分農(nóng)村 地區(qū)瘧疾傳播的環(huán)境條件依然存在，在許多省份局部地區(qū)流行不斷發(fā)生，隨著對(duì)外經(jīng)濟(jì) 文化交流和旅游業(yè)的發(fā)展，特別與非洲和東南亞等瘧疾高度流行國(guó)家地區(qū)的人員交往曰 益增加，境外傳染源輸入的威脅倍增，根據(jù)2002 2006年疫情報(bào)告與漏報(bào)調(diào)査綜合估計(jì)全國(guó)每年的瘧疾實(shí)際發(fā)病人數(shù)仍在70萬左右。瘧疾依然是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康和 生命的傳染病和寄生蟲病。瘧疾診斷方法包括臨床診斷、病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子(基因)診斷。由于 瘧疾的主要臨床表現(xiàn)與其他傳染病相似難于鑒別，單憑臨床癥狀極易誤診。常用的血清 學(xué)方法如間接熒光抗體試驗(yàn)等，其陽性只反映近年曾感染瘧疾，主要應(yīng)用于瘧疾血清流 行病學(xué)調(diào)査評(píng)價(jià)；ELISA等檢測(cè)抗原的方法，因其敏感性和特異性不高，難于實(shí)際應(yīng)用。 因此兩者均不能作為瘧疾病人的確診依據(jù)。目前，已沿用50多年的顯微鏡病原學(xué)診斷 (鏡檢法)仍然是瘧疾病人確診的主要依據(jù)。鏡檢法雖然較簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，結(jié) 果判斷主觀性強(qiáng)，其靈敏性與準(zhǔn)確性決定于鏡檢員的素質(zhì)和經(jīng)驗(yàn)；特別是檢出低原蟲血 癥的敏感性差，WHO瘧疾專家在《瘧疾診斷的新展望》報(bào)告中指出有經(jīng)驗(yàn)的鏡檢員可 能檢出5 10個(gè)蟲/pl低原蟲血癥，但是一般鏡檢員的實(shí)際檢出低限僅為100~150個(gè) 蟲/^1["。按目前常規(guī)血檢，每張血片僅檢査100-200個(gè)油鏡視野，甚至達(dá)不到100個(gè) 視野(約占整個(gè)血膜的1/10-1/20)，低密度帶蟲者漏檢是不可避免的。顯然，基于上述 固有缺陷，鏡檢法已不能滿足現(xiàn)代瘧疾防治與研究中檢出低原蟲血癥的需要，特別是不 適合流行病學(xué)調(diào)查監(jiān)測(cè)、疫苗研制、抗瘧藥物試驗(yàn)和篩選獻(xiàn)血員等大規(guī)模血樣的檢測(cè)。從上世紀(jì)七十年代起，研究較多的瘧疾新診斷方法是吖啶橙染色熒光顯微鏡檢査瘧 原蟲，其中比較成功的有我國(guó)的吖啶橙直接滴染法和國(guó)外的QBC法(毛細(xì)管定量血沉棕 黃層吖啶橙染色)，能提高工作效率，檢出率可達(dá)到或超過普通鏡檢法的水平；但因蟲 種鑒定困難、與鏡檢法同樣需要熟練技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)、結(jié)果判斷主觀性、以及需使用價(jià)格昂 貴的熒光顯微鏡或適當(dāng)?shù)臒晒饧ぐl(fā)光源等原因難于實(shí)際應(yīng)用。上世紀(jì)末在WHO積極倡導(dǎo)和資助下發(fā)展起來的抗原捕獲快速診斷試驗(yàn)(RDTs)即免 疫層析色譜試紙法，因簡(jiǎn)便、快速，且不須專業(yè)技術(shù)只要簡(jiǎn)單培訓(xùn)的基層人員可以操作； 已有若干評(píng)價(jià)報(bào)告，國(guó)外并有商品化生產(chǎn)，適用于基層醫(yī)院特別是缺乏顯微鏡及鏡檢人員的農(nóng)村診所，以便快速診斷及時(shí)給病人抗瘧治療，具有現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。但其敏感性和特異性較差且費(fèi)用較高；有報(bào)告指出三種RDT (ParaSight-F: OptiMal; ICT尸//外)均 顯示很髙的假陽性和假陰性(假陽性髙達(dá)29.2%) w，特別是治療后55%的病例在10-17 天內(nèi)仍存在可檢出的抗原，而鏡檢法和PCR均陰性，表明誤診、漏診較多。因此RDT不 能滿足瘧疾防治研究中要求精確診斷的需要，特別是不適用于要求檢出低原蟲血癥的藥 物和疫苗研究、防治方案的考核評(píng)價(jià)和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)等""。近十多年分子診斷技術(shù)的研究和應(yīng)用發(fā)展很快，PCR為基礎(chǔ)的診斷試驗(yàn)已公認(rèn)是 最有前途的新瘧疾診斷方法?，F(xiàn)已證明套式PCR在檢出低原蟲血癥和混合感染的敏感性 超過鏡檢法及現(xiàn)有其他實(shí)驗(yàn)診斷方法，有很好的可重復(fù)性和較少主觀性["'9':套式PCR 已廣泛應(yīng)用于瘧疾流行病學(xué)、抗瘧藥物試驗(yàn)、疫苗研究、獻(xiàn)血員的篩選以及有條件的臨 床實(shí)驗(yàn)室用于瘧疾的確診和鑒別診斷；Johnston等(美國(guó)CDC 2006)提出應(yīng)當(dāng)考慮在 參考實(shí)驗(yàn)室和一切具有分子實(shí)驗(yàn)基本條件的實(shí)驗(yàn)室采用套式PCR作為瘧疾的確診手段[10]近年報(bào)告的套式PCR瘧疾診斷試驗(yàn)m-'"多數(shù)仍參照Snounou, G. S.等(1993， 1996) 報(bào)告的方法["—':']，以小亞單位核糖體RNA (SSUrRNA)基因作為靶基因，通常設(shè)計(jì)l對(duì)屬特 異引物和2-4對(duì)種特異引物；檢出2種或2種以上人瘧原蟲的第一 輪PCR(使用屬特異引物) 擴(kuò)增的產(chǎn)物需移入2-4個(gè)新試管作為模板，分別用2-4對(duì)種特異引物作第二輪擴(kuò)增， 一份 血樣需要做3-5次擴(kuò)增同時(shí)有2-4份擴(kuò)增產(chǎn)物需做電泳才能得出結(jié)果，且操作步驟多易造 成污染。如簡(jiǎn)單地將2-4對(duì)種特異引物放在同一管內(nèi)作第2輪多重PCR，將產(chǎn)生嚴(yán)重的非 特異擴(kuò)增，其檢出低原蟲密度的敏感性和檢出混合感染的能力也明顯地降低['°]。因此要 獲得較好的結(jié)果，目前用于瘧疾診斷的套式/多重PCR仍需分為多管2輪擴(kuò)增。復(fù)雜的試 劑、繁重的試驗(yàn)操作、嚴(yán)重的非特異擴(kuò)增以及費(fèi)用較高等問題，限制了高靈敏的套式PCR 瘧疾診斷試驗(yàn)在我國(guó)瘧疾防治研究領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用。近年我們?cè)谔岣咛资?多重PCR的特異性和穩(wěn)定性，簡(jiǎn)化試劑和操作步驟的研究中，主要通過創(chuàng)新標(biāo)簽引物設(shè)計(jì)等多項(xiàng)優(yōu)化 措施，實(shí)現(xiàn)了在簡(jiǎn)化試劑、操作步驟和降低成本的同時(shí)保持套式/多重PCR高度敏感性、 特異性和穩(wěn)定性；研制出簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確而又價(jià)廉的套式/多重PCR瘧疾診斷試劑盒， 為套式/多重PCR瘧疾診斷試驗(yàn)應(yīng)用于一切有條件的實(shí)驗(yàn)室，為瘧疾臨床、流行病學(xué)調(diào)査 研究、瘧疾監(jiān)測(cè)以及抗瘧藥和疫苗研制試驗(yàn)等領(lǐng)域提供一個(gè)常規(guī)診斷、確診與鑒別診斷 的可靠工具[14' 15〕。 發(fā)明內(nèi)容-為克服上述現(xiàn)行套式/多重PCR瘧疾診斷試驗(yàn)的缺陷，本發(fā)明創(chuàng)新了包括模板制備， 引物設(shè)計(jì)以及反應(yīng)程序等多項(xiàng)優(yōu)化措施，研制出一種可同時(shí)檢出惡性瘧原蟲和/或間R 瘧原蟲的單管-套式/多重PCR瘧疾基因診斷試劑盒及其檢測(cè)方法。本試劑盒選用多拷貝的線粒體基因組細(xì)胞色素氧化酶基因(co;ri)作靶基因，每個(gè)原 蟲含有多個(gè)線粒體，因而增加了模板分子數(shù)量有利于提高敏感性。在co;^基因保守區(qū)設(shè)計(jì)瘧原蟲屬特異套式PCR外側(cè)引物1對(duì) Um-1882 5' -CCCTTCTCGCCATTTGA-3' Um-2817 5' -CGAACCTTCTTACCGTTAT-3'同時(shí)運(yùn)用創(chuàng)新的標(biāo)簽引物設(shè)計(jì)原理[一，設(shè)計(jì)合成與人和瘧原蟲基因無錯(cuò)配的公共標(biāo) 簽引物一個(gè)；在cor/基因瘧原蟲種特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)惡性瘧原蟲特異和間R瘧原蟲特異的 套式PCR內(nèi)側(cè)引物各一對(duì)，每條引物5'端添加標(biāo)簽引物序列；最后在這些引物的5' 端再添加與引物3'互補(bǔ)的適當(dāng)序列(通常6-12個(gè)bp)使形成發(fā)夾的熔點(diǎn)(Tm)在70~ 80'C。經(jīng)過梯度PCR和矩陣試驗(yàn)反復(fù)測(cè)試篩選確定引物序列及其最佳反應(yīng)程序。它們的序列如下T-zk2-3.65'－TAGATAGTCGTCGCCGGTCGTCTATCTA-3'Fmt誦19955'-AGTCTGGTCGTCGCCGGTCGTCTATCTAAGAACTCTATAAATAACCAGACT-3'Fmt-26055'-GATAGATAACATCGTCGCCGGTCGTCTATCTAACTTCTGGTATGTTATCTATC-3'Vmt-23615'-ACGTGCATCGTCGCCGGTCGTCTATCTACATGCTGTCATACATGATGCACGT-3'Vmt-26155'-TCCTGATACTCGTCGCCGGTCGTCTATCTATTTTCATCATTAGTATCAGGA-3'8這種新型結(jié)構(gòu)的原蟲種特異標(biāo)簽引物和公共標(biāo)簽引物的反應(yīng)溫度限制在設(shè)定的較 髙溫度范圍，低于其退火溫度時(shí)它們形成自身封閉的二級(jí)結(jié)構(gòu)，有效地防止引物之間或 引物與其他非靶序列核酸鏈之間退火。瘧原蟲線粒體基因組僅為約6 kb的線狀DNA， 在反應(yīng)程序中可使用較低的解鏈溫度，使細(xì)胞核染色體DNA處于不解鏈(或不充分解 鏈)狀態(tài)，避免了特異引物與人基因組DNA的錯(cuò)配，從而保證了引物的高度特異性。 檢出惡性瘧和間閂瘧原蟲的低限都達(dá)到1個(gè)蟲/每jil血，而檢測(cè)健康人血樣時(shí)不出現(xiàn)任 何非特異擴(kuò)增條帶。濾紙血樣用1 X PCR緩沖液或1 X模板制備緩沖液(pH7.6 7.9)浸泡洗脫血 紅蛋白，95"/5-10min直接熱裂解法制備DNA模板采用亞微量反應(yīng)容積，其反應(yīng)總 量15nl僅為常規(guī)套式PCR的1/3 1/7，從而大大簡(jiǎn)化了試驗(yàn)歩驟又降低了成本。本發(fā)明提供的單管-套式/多重PCR瘧疾基因診斷試劑盒包括如下組件1 IOX濾紙血模板緩沖液(pH7.6-7.9) 1.0 ml X 1支(可供制配20份血樣)2 Dl試劑16(Hil X l支(檢測(cè)20份血樣，每人份8nl )。組成在1 X PCR緩 沖系統(tǒng)(10鵬ol/L Tris-HC1 pH 8.0， 50 mmol/L KC1, 1.5 mmol/L MgCl， 0. 05% NP-40, 0. 05% Tween-20， 4 dNTP各200 umol/L)中，含1對(duì)瘧原蟲屬 特異引物Umf-1882 (60 nmol/L)和Umr-2817 (40陽L/L)。3 D2試劑60 ul X 1支(檢測(cè)20份血樣，每人份3 ul)。組成在1 X PCR緩 沖系統(tǒng)中，含種特異引物Fmft-1995和Fmrt-2605(各14nmol/L)， Vmft-2361 和Vmrt-2615 (各17.5 nmol/L)。標(biāo)簽引物T-zk2-3. 6 (3.5 umol/L)。4 自備試劑純水，石蠟油，Taq酶 本發(fā)明同時(shí)提供應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒診斷瘧疾的檢測(cè)方法1血樣采集本試劑盒適用于檢測(cè)濾紙血樣，用濾紙法采集血液樣本既簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì) 又方便保存和運(yùn)輸。2采用緩沖液熱裂解法制備濾紙血樣DNA模板2.1 1 pi濾紙血樣DNA制備方法 1/4濾紙血樣圓片(約含l Jil全血)，放入O. 2 ml PCR反應(yīng)管，加入l X模板制備緩沖液(BF) 100 W,溶血離心洗脫血紅 蛋白后，重新加入緩沖液5jil , 95'C加熱5 min即可用作PCR模板，直接加入 試劑即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。2.2 4 ti 1濾紙血樣DNA制備方法 取6 mm直徑濾紙血樣l片(約含4 u l全血) 放入0.5 ml錐型管，加入l X模板制備緩沖液400 W，溶血離心洗脫血紅 蛋白后，重新加入l X BF 20 J4， 95 "加熱5 10 min，旋渦振蕩，離心l min，吸出上清作為PCR擴(kuò)增模板，4 1C冰箱保存?zhèn)溆谩? UT-PCR試驗(yàn)第一反應(yīng)每管加入D1試劑7.5 nl ，模板DNA提取液5 jil ， Taq酶l. 0 U和 石蠟油1滴，按下列設(shè)定程序反應(yīng)21個(gè)循環(huán)，第一反應(yīng)結(jié)束，每管添加D2試劑 2. 5 pl ， Taq酶l. 0 U，同上簡(jiǎn)短離心后進(jìn)行第二反應(yīng)49個(gè)循環(huán)；共計(jì)70個(gè)循環(huán) 反應(yīng)程序如下。第l-2循環(huán)(94/90s) (86"/ 45s: 48"/40s; 72XV90s) X2 第3-20循環(huán)(84XV30s: 49XV40s: 72"/60s) X 18 第21循環(huán)(72"/3， ； 4.0"/3， ) X 1第22-25循環(huán)(84XV45s;61. 5/40s; 72"C/90s; 84"C/30s; 661C/40; 72 1C/05s: 61.51C/40s; 72"/90s) X 4 第26-29循環(huán)(841C/30s: 70XV30s: 72XV60s) X 4 第30-69循環(huán)(84TC/30s: 74XV30s: 721C/60s) X40 第70循環(huán)結(jié)束程序(72XV3， 分析儀上觀察和攝像.惡性瘧原蟲呈現(xiàn)611 bp帶，間R瘧原蟲呈現(xiàn)255 bp帶。


圖1:應(yīng)用單管-套式/多重PCR瘧疾基因診斷試劑盒檢測(cè)系列稀釋惡性瘧和間FI瘧 原蟲感染血樣的電泳圖譜。 1 6: 1 X PCR緩沖液(pH 7. 6 7. 9)熱裂解法制備4 pl濾紙血樣DNA模 板，1 3: 為100， 10， l個(gè)惡性瘧原蟲/nl血，4 6:為100， 10， l個(gè)間閂 癥原蟲All血；M: DNA標(biāo)志；7 12: 5%Chelex —100離子交換法制備4^1濾紙血樣DNA模板，7 9為100 10， 1個(gè)個(gè)惡性瘧原蟲AU血，10 12為100， 10, l個(gè)間閂瘧原蟲/jil血。 13， 14為健康人濾紙血樣模板(陰性對(duì)照) 惡性瘧原蟲特異帶611 bp 間閂瘧原蟲特異帶255 bp
具體實(shí)施例方式1. 用濾紙法采集血液樣本，常規(guī)消毒耳垂或指端刺血均可，濾紙片中央直接接觸 血滴，使血液滲透濾紙達(dá)2 4cm直徑，自然風(fēng)干后用白紙間隔放入薄膜袋內(nèi)， 室溫或4X:保存；或用活頁紙打孔器，打出6mm直徑小圓片(約含4 5pl全血)， 置0. 5 1. 5 ml錐型管內(nèi)4"保存。2. 濾紙血樣模板DNA的制備2.1 1 ii 1濾紙血樣DNA制備方法剪取6 mm直徑濾紙血樣圓片的]/4 (約7 ram2 含1J4全血)，放入0.2mlPCR反應(yīng)管，加入l X PCR緩沖液(BF)pH 7.6~7. 9或 PH 7.6 7.9純水100 J4,室溫溶血10 min， 18 000Xg離心2 min，吸去上清，僅 留濾紙和管底沉淀，重新加入l X BF 5 W， 95 'C加熱5 min，直接加入試劑即 可進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。2.2 4 ix 1濾紙血樣DNA制備方法取6mm直徑濾紙血樣l片(約含4 u l全血)放入0.5 ml錐型管，加入l X PCR緩沖液400 J4,室溫溶血IO min， 18 OOOXg 離心2 min,吸去上清，僅留濾紙和管底沉淀，重新加入1XBF 20 4, 95 T加 熱5-10 min，其間旋渦振蕩30 s， 18 OOOXg離心l min，吸出上清作為PCR擴(kuò)增 模板，4 r冰箱保存?zhèn)溆谩?3， UT-PCR試驗(yàn)操作反應(yīng)歩驟每次試驗(yàn)除待檢樣本外，另設(shè)陽性(惡性瘧、間閂 瘧病人血樣)和陰性(健康人血樣)對(duì)照各一管。每管加入D1試劑7.5 ii 1，上 述制備的濾紙血樣模板DNA提取液5 Ul ， Taq酶l.O U和石蠟油l滴，簡(jiǎn)短離心 后啟動(dòng)PCR儀,待升溫至94'C,放入反應(yīng)管，按下列程序開始第一反應(yīng) 第1-2循環(huán)(94/90s) (861C/ 45s: 48TC/40s: 72TC/90s) X 2 第3-20循環(huán)(84XV30s: 49XV40s: 721C/60s) X 18 第21循環(huán)(72TC/3' ; 4.0TC/3， ) X 1 .第一反應(yīng)結(jié)束，取出反應(yīng)管,在4.0r條件下,每管添加D2試劑2.5 lil，Taq酶1.0 U，同上簡(jiǎn)短離心后繼續(xù)進(jìn)行第二反應(yīng) 第22-25循環(huán)(84XV45s;61.5/40s; 721C/90s; 84"/30s; 661C/40; 72"/05s; 61.5"C/40s; 72"C/90s) X 4 第26-29循環(huán)(841C/30s: 70r/30s: 72"/60s) X 4 第30-69循環(huán)(84tl/30s: 74"/30s: 72t:/60s) X 40 第70循環(huán)結(jié)束程序(72"C/3' ; 4.0XV3' ) X 1 4，電泳鑒定取PCR第二反應(yīng)最終產(chǎn)物10yl作2%瓊脂糖凝膠電泳,248 um紫外透射分析儀上觀察和攝像.惡性瘧原蟲呈現(xiàn)611 bp帶，間H瘧原蟲呈現(xiàn)255 bp帶。參考文獻(xiàn)[1] WHO Report on infectious diseases cause 90% of infectious diseases deathsRemoving Obstacles to Health Development 1999， 6-8 [2]盛慧鋒，周水森，顧政誠(chéng)，等.2002年全國(guó)瘧疾形勢(shì)中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志2003， 21 (4): 193-196 [3] A Joint WHO/USAID informal consultation .New Perspectives MalariaDiagnosis[J] WHO/MAL/2000.1091 [4] Rubio JM， et al. ， Limited level of accuracy provided by available rapid diagnosis tests for malaria enhances the need for PCR-based reference laboratories. J. Clin. Microbiol, July 2001, p. 2736-2737. [5] Metzger WG， Vivas-Martinez S, Rodriguez I， et al.,Malaria diagnosis underfield conditions in the Venezuelan Amazon. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2007Oct 3;[6] Tham， J. M., Lee, S. H., Tan, T- M C., et al. ， Detection and species determination of malaria parasites by PCR: comparison with microscopy and with paraSight-F and ICT malaria Pf tests in a clinical environment. Journal of Clinical Microbiology. 1999 37:1269-1273.[7] Zaman S, Tan L， Chen HH， et al. ， The detection of /7aaz70cY咖/a/c/paraw and 尸.FJ'raAT in DNA-extracted blood samples using polymerase chain reaction[J]-Trans R Soc Trop Med Hyg. 2001 95:391-397.[8] Singh B， Bobogare A， Cox-Singh J， Snounou G， Abdullah MS, Rahman HA. A genus-and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 1999 Apr;60 (4) :687-92.[9] Stephanie P, Johnston, Norman J\ Pieniazek, Maniphet V. Xayavong， Susan B. Slemenda, Patricia P. Wilkins， and Alexandre J. da Silva PCR as aMicrobiology, Mar. 2006， p. 1087 - 1089. [1.0] Russell E Coleman*, Jetsumon Sattabongkot， Sommai Promstaporm， et al.， Comparison of PCR and microscopy for the detection of asymptomatic malaria in a /Vs柳0(y/咖/aJci; ar"/K/i/iraA" endemicarea in Thailand胞Jarj,s /o"r朋J 2006，5:121[11] Ndao M， Bandyayera E， Kokoskin E,. et al. ， Comparison of blood smear, antigen detection, and nested-PCR methods for screening refugees from regions where malaria is endemic after a malaria outbreak in Quebec, Canada. J Clin Microbiol. 2004 Jun; 42 (6) :2694-700.〔12] Snounou G. ， et al. ， High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and Biochemical Parasitology, 1996 61， 315-320.[13] Snounou G., et al. ， Suganya Viriyakosol, William J"arra， et al.， Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Molecular and Biochemical Parasitology, 1993a 58:283—292.[14] Huang TY, Wang SH , Li XM， et al. Tag Primer-Nested/Multiplex PCR for Detection of尸/352 0 //咖faZc!.; ar咖and /Vas啦cZ/咖w'va;r[J]. Chin J Parasitol Dis,2005， 23,140-142. (in Chinese)(黃天誼，王世海，黎學(xué)銘，等.標(biāo)簽引物-套式/多重PCR檢測(cè)惡性瘧原蟲和間FI瘧原蟲 的研究[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2005， 23: 140-142.) [15]GU0 Chuan-kun, U Xue-raing， LI J"in-hui，et al., Primary Study on the Sensibility, Specificity and Stability of Tag-primer Nested/multiplex PCR for Malaria Diagnosis. Chin J Parasitol Dis, 2007, 25，140-142. (in Chinese)(郭傳坤，黎學(xué)銘，李錦輝，毛瑋，林珍，杜進(jìn)發(fā)，黃天誼，等.套式/多重PCR診斷瘧疾的 敏感性、特異性和穩(wěn)定性初探[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2007， 25: 140-142.)。
權(quán)利要求
1，瘧疾單管-套式/多重PCR(UT-PCR)基因診斷試劑盒，其特征在于選用多拷貝的線粒體基因組細(xì)胞色素氧化酶基因(coxl)作靶基因，在coxl基因保守區(qū)設(shè)計(jì)瘧原蟲屬特異套式PCR外側(cè)引物1對(duì)，它們的序列是Umf-1882 5′-CCCTTCTCGCCATTTGA-3′Umr-2817 5′-CGAACCTTCTTACCGTTAT-3′
2,根據(jù)權(quán)利要求1所述的瘧疾UT-PCR基因診斷試劑盒，其特征在于運(yùn)用創(chuàng)新的標(biāo)簽引物設(shè)計(jì)原理，]，設(shè)計(jì)合成與人和瘧原蟲基因無錯(cuò)配的公共標(biāo)簽引物一個(gè)；在COW基因瘧原蟲種特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)惡性瘧原蟲特異和間FI瘧原蟲特異的套式PCR內(nèi)側(cè)引物各一對(duì)，每條引物5'端添加標(biāo)簽引物序列；最后在這些引物的5'端再添加與引物3'端互補(bǔ)的適當(dāng)序列(通常6-12個(gè)bp)使形成發(fā)夾的熔點(diǎn)(Tm)在70-80'C。經(jīng)過反復(fù)測(cè)試篩選確定的引物序列如下 T-zk2-3.6 5' -TAGATAGTCGTCGCCGGTCGTCTATCTA-3'Fmt-1995 5' -AGTCTGGTCGTCGCCGGTCGTCTATCTAAGAACTCTATAAATAACCAGACT-3' Fmt-2605 5' -GATAGATAACATCGTCGCCGGTCGTCTATCTAACTTCTGGTATGTTATCTATC-3 Vmt-2361 5' -ACGTGCATCGTCGCCGGTCGTCTATCTACATGCTGTCATACATGATGCACGT-3 Vmt隱2615 5' -TCCTGATACTCGTCGCCGGTCGTCTATCTATTTTCATCATTAGTATCAGGA-3'
3，根據(jù)權(quán)利要求1所述的瘧疾UT-PCR基因診斷試劑盒，其特征在于采用濾紙法采集 血樣，濾紙血樣用1 X模板制備緩沖液(pH7.6-7.9)浸泡洗脫血紅蛋白，95'C/5-I0 min直接熱裂解法制備DNA模板。
4，根據(jù)權(quán)利要求1所述的瘧疾UT-PCR基因診斷試劑盒，其特征在于采用亞微量反應(yīng) 容積，其反應(yīng)總量15 fil僅為常規(guī)套式PCR的1/3~1/7，從而大大降低成本。
5，根據(jù)權(quán)利要求1所述的瘧疾UT-PCR基因診斷試劑盒，其特征在于包括下列組件 ①10 X濾紙血模板制備緩沖液(pH 7.6-7.9) 1.0 ml X l支，臨用時(shí)用純水或雙 蒸水稀釋10倍(可供制備20份血樣模板DNA);② Dl試劑160 ul X l支(檢測(cè)20份血樣，每人份8 ul)。③ D2試劑60 ul X 1支(檢測(cè)20份血樣，每人份3 ul)。
PF陽性對(duì)照模板DNA 20 ul X 1支 PV陽性對(duì)照模板DNA 20 ul X 1支
6,根據(jù)權(quán)利要求5所述的瘧疾UT-PCR基因診斷試劑盒，其特征在于所述D1試劑的 組成為在1 X PCR緩沖系統(tǒng)(10 mmol/L Tris-HCl pH 8. 0, 50 mmol/L KC1， 1. 5 鵬ol/L MgCl， 0.05% NP-40， 0.05% Tween-20, 4 dNTP各200腦ol/L)中，含1 對(duì)瘧原蟲屬特異引物IM-1882 (60 nmol/L)和Umr-2817 (40,1/L)。所述D2 試劑的組成為在1 X PCR緩沖系統(tǒng)中，含惡性瘧原蟲種特異引物Fmft-1995和 Fmrt-2605 (各14 nraol/L)，間R癥原蟲種特異引物Vmft-2361和Vmrt-2615 (各 17.5 nraol/L)和公共標(biāo)簽引物T-zk2-3. 6 (0.35 umol/L)。
7，瘧疾UT-PCR基因診斷試劑盒診斷瘧疾的檢測(cè)方法包括如下步驟① 用濾紙法采集血液樣本② 制備濾紙血樣DNA模板:提供2種方法可任選一種1 ii 1濾紙血樣DNA制備方法或 4 ul濾紙血樣DNA制備方法，我們推薦使用后者。③ UT-PCR試驗(yàn)反應(yīng)步驟己高度簡(jiǎn)化，全程反應(yīng)都在一個(gè)管內(nèi)完成，反應(yīng)分為2步，第一 反應(yīng)20個(gè)循環(huán)，由1對(duì)屬特異引物引導(dǎo)作基礎(chǔ)擴(kuò)增，以提高模板分子的數(shù)量和質(zhì) 量；第21循環(huán)結(jié)束于4C取出反應(yīng)管，添加D2試劑(含2對(duì)原蟲種特異引物和. 1個(gè)公共標(biāo)簽引物)即繼續(xù)反應(yīng)。第二反應(yīng)44個(gè)循環(huán)，由原蟲種特異引物引導(dǎo)4 個(gè)循環(huán)種特異片段擴(kuò)增；其后40個(gè)循環(huán)由單一公共標(biāo)簽引物引導(dǎo)特異片段的增量 擴(kuò)增。 電泳鑒定取PCR第二反應(yīng)最終產(chǎn)物10 ul作2%瓊脂糖凝膠電泳，248 um紫外透射分析儀上觀察和攝像.惡性瘧原蟲呈現(xiàn)611 bp帶，間閂瘧原蟲呈現(xiàn)255 bp帶。
8，根據(jù)權(quán)利要求7所述的瘧疾UT-PCR基因診斷試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述 的4 u 1 (或114)濾紙血樣DNA制備方法為 取6 mm直徑濾紙血樣1片約含 4 ul全血(或l/4片約含l[il全血)放入0.5ml (或200W)錐型管，加入1XPCR 緩沖液400 Ml，(或100W)室溫溶血10 min， 18 000Xg離心2 min，吸去上清， 僅留濾紙和管底沉淀，重新加入1XBF 20 (或5W)， 95卩加熱5-10min，其間 旋渦振蕩30 s， 18 OOOXg離心l min，吸出上清作為PCR擴(kuò)增模板，4 "C冰箱保 存?zhèn)溆谩?br> 9，根據(jù)權(quán)利要求7所述的瘧疾UT-PCR基因診斷試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于第一反 應(yīng)每管加入D1試劑7. 5 ul，上述制備的濾紙血樣模板DNA提取液5 ul ， Taq酶l. 0 U和石蠟油l滴，簡(jiǎn)短離心后啟動(dòng)PCR儀，待升溫至94X:，放入反應(yīng)管，按下列程序開 始第l-2循環(huán)(94/90s) (86"/ 45s: 48TC/40s; 72XV90s) X 2 第3-20循環(huán)(84XV30s: 49"/40s: 72"C/60s) X 18 第21循環(huán)(72"/3， ； 4.0XV3， ) X 1 . 10，根據(jù)權(quán)利要求7所述的瘧疾UT-PCR基因診斷試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于步驟 ③所述的第二反應(yīng)為第一反應(yīng)結(jié)束,取出反應(yīng)管，在4. OX:條件下，每管添加D2試劑 2.5 ul,Taq酶l.O U，同上簡(jiǎn)短離心后按下列程序繼續(xù)進(jìn)行第二反應(yīng) 第22—25循環(huán)(84XV45s;61.5/40s; 721C/90s; 84t!/30s; 66TC/40; 72XV05s; 61. 5"C/40s; 721C/90s) X 4 第26-29循環(huán)(841C/30s: 70"C/30s; 72"C/60s) X 4 第30-69循環(huán)(841C/30s: 74"C/30s: 72"/60s) X 40 第70循環(huán)結(jié)束程序(72X73， 4.0TC/3' ) X 1 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種瘧疾單管-套式/多重PCR基因診斷試劑盒及其檢測(cè)方法。該發(fā)明根據(jù)4種人瘧原蟲線粒體細(xì)胞色素氧化酶(cox1)基因序列，運(yùn)用創(chuàng)新的引物設(shè)計(jì)理念，設(shè)計(jì)合成瘧原蟲屬特異引物、瘧原蟲種特異標(biāo)簽引物和公共標(biāo)簽引物等多項(xiàng)優(yōu)化措施，使傳統(tǒng)試劑復(fù)雜操作繁重的套式/多重PCR簡(jiǎn)化為僅用4ul濾紙血樣，單管2步反應(yīng)即可同時(shí)檢出惡性瘧與間日瘧原蟲，其敏感性與特異性均超過顯微鏡檢查法，達(dá)到可檢出1個(gè)蟲/每ul血的水平。不僅可檢出瘧疾現(xiàn)癥病人，也可檢出低原蟲血癥的慢性病人和無癥狀帶蟲者；可作為各級(jí)醫(yī)院瘧疾確診和鑒別診斷的可靠手段，也為瘧疾防治監(jiān)測(cè)，抗瘧藥物試驗(yàn)和瘧疾疫苗研究以及獻(xiàn)血員篩選提供一個(gè)簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)、靈敏、準(zhǔn)確的瘧疾診斷工具。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101240337SQ20071030351
公開日2008年8月13日 申請(qǐng)日期2007年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日
發(fā)明者李錦輝, 杜進(jìn)發(fā), 珍 林, 瑋 毛, 郭傳坤, 黃天誼, 黎學(xué)銘 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心