專利名稱：一種低頻高幅疊加高頻低幅加載的方法及生物反應(yīng)器的制作方法
一種低頻高幅疊加高頻低幅加載的方法及生物反應(yīng)器技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞工程和組織工程領(lǐng)域，特別是一種低頻高幅疊加 高頻低幅載荷應(yīng)用于細胞、組織培養(yǎng)和保存的方法及相關(guān)的生物反應(yīng) 器，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。背景技術(shù)：
隨著組織工程的發(fā)展，人們對移植物和培養(yǎng)物培養(yǎng)條件的生物力學(xué)(biomehanics)和力學(xué)生物學(xué)(mechanobiology)研究越來越重視。最 近幾年相關(guān)研究者對不同的力學(xué)刺激，以優(yōu)化培養(yǎng)物的結(jié)構(gòu)和功能做了大 量研究。國內(nèi)有研究者采用靜張應(yīng)力對大鼠髁突軟骨細胞增殖效應(yīng)進行研 究，實驗表明細胞增殖數(shù)量隨靜張應(yīng)力增高而升高[華西口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2003, 21 (1)， 57-60];也有研究空氣壓應(yīng)力對體外培養(yǎng)軟骨細胞分泌細 胞因子的影響[解剖學(xué)報，2001， 32 (4)， 385-387]，離心力在體外構(gòu)建 組織工程軟骨中的作用[中華實驗外科雜志。2005， 22 (3)， 281-283], 周期性流體應(yīng)力刺激對組織工程軟骨分化影響的實驗研究[骨與關(guān)節(jié)損傷 雜志，2003， 18 (9)， 620-622]。這些加載方法可以促進細胞增殖或功能 發(fā)揮，但和真正軟骨受載是有差別的。Mauck等[J Biomech Eng， 2000; 122(3): 252-260]把軟骨細胞接種在瓊脂糖凝膠進行動態(tài)直接施壓，載荷 大小是使復(fù)合體變形10%，頻率為lHz，探索功能化軟骨組織工程的培養(yǎng)， 4周后發(fā)現(xiàn)GAG (氨基葡聚糖)升高45%，膠原含量增加37%，明顯高于未加 載組。Buschmann等施加lHz，應(yīng)變3%的動態(tài)壓載荷進行軟骨構(gòu)建，實驗表 明硫酸軟骨素增加15%-25%，脯氨酸增加10%-25%，同時，在這種力學(xué)條件 下研究不同培養(yǎng)時間培養(yǎng)物彈性模量的變化。力學(xué)環(huán)境在生物反應(yīng)器的研制占有重要位置，力學(xué)因素影響生物 體的整體，器官、組織、細胞和分子水平等各層次的生物學(xué)過程[Guilak et al. Functional Tissue Engineering, 2003， Springer]。 力學(xué)條 件的優(yōu)化十分重要。比如人體在行走等活動中骨組織等受到的是低頻 高幅載荷，同時肌肉為保持身體形態(tài)對骨施加高頻低幅載荷，因此從 仿生角度，這種低頻高幅疊加高頻低幅加載方式可能優(yōu)化組織工程或 組織保存的力學(xué)環(huán)境。有些專利技術(shù)給出了壓力和剪應(yīng)力耦合作用的生物反應(yīng)器，發(fā)明專利(申請?zhí)?00480038317.9，公開號CN 1898375A)介紹了用于對具有三維 形狀、活性和機械抗力的細胞移植體進行培養(yǎng)和刺激的方法和生物反應(yīng) 器。以軟骨組織工程為例，Schulz和Bader， Ivan Martin總結(jié)了組織培養(yǎng) 時的環(huán)境[TRENDS in Biotechnology Vol. 22 No. 2 ， 2004，卯80-86; Eur BiophysJ， DOI 10. 1007/s00249-007-0139-1, 2007]。包括(a)為電場； (b)錐形粘度計條件，細胞在旋轉(zhuǎn)錐形體下方受到剪切力作用；(c)旋 轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器給細胞提供微重力環(huán)境，傳質(zhì)過程較好；(d)單項灌流 系統(tǒng)；(e)拉伸條件；(f)水壓及灌流條件；(g)直接壓縮。其后介紹了 各種培養(yǎng)條件的耦合系統(tǒng)；特別是各種力學(xué)條件的聯(lián)合使用。但都沒有涉 及低頻高幅疊加高頻低幅加載方式。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的旨在提供一種低頻高幅疊加高頻低幅加載應(yīng)用于培養(yǎng) 物培養(yǎng)的方法及生物反應(yīng)器。本發(fā)明所述的低頻高幅疊加高頻低幅載荷用于培養(yǎng)物培養(yǎng)的方法， 是在生物反應(yīng)器內(nèi)進行，包括具備5% C02和37度溫度調(diào)節(jié)的細胞培養(yǎng)培 養(yǎng)箱，及灌流等條件，將培養(yǎng)物固定于培養(yǎng)室底板，其具體過程如下 灌流系統(tǒng)保證培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)液的更換，培養(yǎng)物處于細胞可生長的生物 環(huán)境下，由計算機控制，通過加載器件使培養(yǎng)物被施加壓載荷，該載 荷具有低頻高幅疊加高頻低幅的特征，其低頻范圍為b. l-10Hz，高幅 應(yīng)變范圍為0.001-0.2;高頻范圍為5-80Hz，低幅應(yīng)變范圍為 0.000001-0.01。各載荷波形可為方波、正弦波、三角波等，加載時間 為每24h加載l-3次，每次10min-360 min，培養(yǎng)l-60天。這樣培養(yǎng)物受 到的是低頻高幅疊加高頻低幅載荷作用，在此種力學(xué)環(huán)境使組織生長、 發(fā)育，完成培養(yǎng)物的培養(yǎng)。本發(fā)明所述的培養(yǎng)液是生物學(xué)細胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)液，可從市場上購 買。所述的培養(yǎng)箱是生物學(xué)細胞培養(yǎng)常規(guī)使用的，可從市場上購買。本發(fā)明所述的培養(yǎng)物是細胞、組織、細胞與支架復(fù)合體或移植組 織，其中，組織及移植組織是指骨、軟骨等。所說的通過加載器件使培 養(yǎng)物被施加壓載荷，是指在培養(yǎng)物表面直接施加動態(tài)低頻高幅疊加高 頻低幅載荷或給培養(yǎng)物覆蓋彈性硅膠膜及多孔剛性薄板后間接加載。本發(fā)明為低頻高幅疊加高頻低幅加載方法設(shè)計了一種生物反應(yīng)器。 生物反應(yīng)器包括培養(yǎng)箱、培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)、加載機構(gòu)、培養(yǎng)室和計算機；加載機構(gòu)、培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)和培養(yǎng)室都放在培養(yǎng)箱內(nèi)。該加載機 構(gòu)主要包括框架、力傳感器、兩個串聯(lián)一起的壓電陶瓷位移器和位移 傳感器。該培養(yǎng)室是一個封閉的容器，上下面分別為上下壓塊，上壓 塊與培養(yǎng)室之間有滑動密封墊；上壓塊與培養(yǎng)室之間可有相對滑動， 封閉的培養(yǎng)室壁上有培養(yǎng)液灌流接頭，培養(yǎng)物放在培養(yǎng)室的上下壓塊 之間。該灌流系統(tǒng)包括培養(yǎng)液儲存瓶，通過硅膠管與培養(yǎng)室連接，由 蠕動泵提供流動動力，都可在市場購買。該計算機是裝有壓電陶瓷位 移器軟件系統(tǒng)(其軟件可按需要在市場購買)及蠕動泵控制系統(tǒng)，可 對壓電陶瓷位移器及蠕動泵進行自動控制。生物反應(yīng)器工作時，壓電陶瓷位移器與培養(yǎng)室的上壓塊連接，培養(yǎng) 室內(nèi)有培養(yǎng)物，壓電陶瓷位移器上方連接力傳感器，這樣力傳感器、 壓電陶瓷位移器與培養(yǎng)室一起放在框架內(nèi)，由預(yù)緊螺栓消除間隙。計 算機控制分別輸入的兩個壓電陶瓷位移器的電壓信號，不同電壓信號 形成兩個壓電陶瓷位移器不同驅(qū)動位移，使培養(yǎng)物受到低頻高幅疊加 高頻低幅加載波形。載荷的大小和形狀分別由力傳感器、位移傳感器 傳輸?shù)接嬎銠C上顯示。灌流系統(tǒng)保證培養(yǎng)液的更換。本發(fā)明的有益效果是低頻高幅疊加高頻低幅加載方式更接近某 些組織生長發(fā)育的力學(xué)環(huán)境，實驗表明此種加載方式比靜態(tài)培養(yǎng)促進 了細胞的增殖。
圖l為本發(fā)明所述的方法總框圖；圖2為本發(fā)明生物反應(yīng)器中的加載機構(gòu)立體示意圖；圖3為圖2的剖面示意圖；圖4為本發(fā)明生物反應(yīng)器中的灌流系統(tǒng)示意圖；圖5為每種壓電陶瓷驅(qū)動器可加載的四種波形示意圖；圖6為一種低頻高幅疊加高頻低幅加載波形示意圖；圖中l(wèi)框架；2預(yù)緊螺桿；3導(dǎo)向管；4位移傳感器；5加載頭；6 上壓塊；7培養(yǎng)室；8培養(yǎng)平臺；9灌流接頭；IO壓電陶瓷驅(qū)動器；11壓電陶瓷驅(qū)動器；12加載下壓塊，13滑動密封墊，14培養(yǎng)物，15力 傳感器，16培養(yǎng)箱。
具體實施方式本發(fā)明所述的低頻高幅疊加高頻低幅載荷用于培養(yǎng)物培養(yǎng)的方法， 是在生物反應(yīng)器內(nèi)進行，如圖1所示，它包括具備5% C02和37度溫度調(diào) 節(jié)的細胞培養(yǎng)培養(yǎng)箱，及灌流等條件，在無菌條件下把目標(biāo)細胞和支 架材料復(fù)合體、離體組織或臨床移植物轉(zhuǎn)移到消毒過的培養(yǎng)室內(nèi)，按細 胞、組織培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)過程操作，將培養(yǎng)物固定于培養(yǎng)室底板，由蠕動泵 驅(qū)動培養(yǎng)液灌注，保持培養(yǎng)液新鮮，培養(yǎng)液中加入活性因子(如，骨形 態(tài)蛋白等)。由計算機控制，通過加載器件使培養(yǎng)物被施加載荷，該 載荷具有低頻高幅疊加高頻低幅的特征，其低頻范圍為O. l-10Hz，高 幅應(yīng)變范圍為O. 001-0.2;高頻范圍為5-80Hz，低幅應(yīng)變范圍為 0.000001-0.01，各載荷波形可為方波、正弦波、三角波等；加載時間 為每24h加載l-3次，每次10min-360 min，培養(yǎng)1-60天。例如，載荷波 形為方波，低頻率為O. 5Hz，高幅應(yīng)變?yōu)?.01;疊加載荷波形為正弦波， 頻率為20Hz，低幅應(yīng)變?yōu)镺. 000001。這樣培養(yǎng)物受到的是低頻高幅疊 加高頻低幅載荷作用，如圖6所示，在此種力學(xué)環(huán)境下，使組織生長、 發(fā)育，完成培養(yǎng)物的培養(yǎng)。本發(fā)明所述的培養(yǎng)液是生物學(xué)細胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)液，可從市場上購 買。所述的培養(yǎng)箱是生物學(xué)細胞培養(yǎng)常規(guī)使用的，可從市場上購買。本發(fā)明所述的培養(yǎng)物是細胞、組織、細胞與支架復(fù)合體或移植組 織。所說的給培養(yǎng)物施加載荷，是指在培養(yǎng)物表面直接施加動態(tài)低頻 高幅疊加高頻低幅載荷或給培養(yǎng)物覆蓋彈性硅膠膜及多孔剛性薄板后 間接加載。本發(fā)明為低頻高幅疊加高頻低幅加載方法設(shè)計了一種生物反應(yīng)器， 如圖2-6所示。該生物反應(yīng)器包括培養(yǎng)箱16、加載機構(gòu)(圖2、 3所示)、 培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)(圖4所示)、培養(yǎng)室7和計算機；加載機構(gòu)、培養(yǎng)液 灌流系統(tǒng)和培養(yǎng)室7都放在培養(yǎng)箱內(nèi)。該加載機構(gòu)主要包括框架l、力 傳感器15、兩個串聯(lián)一起的壓電陶瓷位移器ll， 12和位移傳感器4。力 傳感器15、兩個串聯(lián)一起的壓電陶瓷位移器ll， 12和位移傳感器4和加 載頭5放在導(dǎo)向管3內(nèi)，該培養(yǎng)室7是一個封閉的容器，上、下面分別為 上、下壓塊6、 12,上壓塊6與培養(yǎng)室7之間有滑動密封墊13;上壓塊6與培養(yǎng)室7之間可有相對滑動，封閉的培養(yǎng)室7的容器壁上穿設(shè)有培養(yǎng) 液灌流接頭9，培養(yǎng)物14放在培養(yǎng)室7的上、下壓塊6、 12之間。該灌流 系統(tǒng)(如圖4所示)包括培養(yǎng)液儲存瓶，通過硅膠管與培養(yǎng)室7連接， 由蠕動泵提供流動動力，都可在市場購買。該計算機是裝有壓電陶瓷 位移器軟件系統(tǒng)及蠕動泵控制系統(tǒng)，可對壓電陶瓷位移器及蠕動泵進 行自動控制。該生物反應(yīng)器工作時，壓電陶瓷位移器ll與加載頭5連接，加載 頭5與培養(yǎng)室7的上壓塊6連接，培養(yǎng)室7內(nèi)有培養(yǎng)物14，壓電陶瓷位移 器10上方連接力傳感器15,這樣力傳感器15、壓電陶瓷位移器IO、 11、 加載頭5和培養(yǎng)室7—起放在框架1內(nèi)的培養(yǎng)平臺8上，由預(yù)緊螺栓2緊壓 消除其間隙。其中培養(yǎng)平臺8可上、下調(diào)節(jié)位置。計算機控制分別輸入 的兩個壓電陶瓷位移器的電壓信號，不同電壓信號形成兩個壓電陶瓷 位移器不同驅(qū)動位移，壓電陶瓷驅(qū)動器IO實現(xiàn)低頻高幅加載，同時壓 電陶瓷驅(qū)動器ll實現(xiàn)高頻低幅加載，載荷波形由位移傳感器4檢測，載 荷大小由力傳感器15檢測，傳輸?shù)接嬎銠C上顯示。這樣實現(xiàn)對培養(yǎng)物 的低頻高幅疊加高頻低幅加載。該生物反應(yīng)器使用的實例用于細胞力學(xué)響應(yīng)的研究以骨組織工程為例，培養(yǎng)物在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，其受到低頻高幅 疊加高頻低幅載荷作用，剌激支架內(nèi)細胞生物學(xué)活動。采用成骨細胞系定量種植在規(guī)則、多孔的松質(zhì)骨支架上，然后移到 培養(yǎng)室內(nèi)，固定到培養(yǎng)室底板，加培養(yǎng)液灌注培養(yǎng)。反應(yīng)器放在培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)箱內(nèi)有02、 C02、溫度自動控制，由蠕 動泵驅(qū)動培養(yǎng)液灌注，保持培養(yǎng)液新鮮，灌注速度為0.01ml/min。培 養(yǎng)液中加入標(biāo)準(zhǔn)濃度的生長因子BMPs。施加低頻高幅疊加高頻低幅載荷，低頻為lHz，高幅應(yīng)變?yōu)?.002， 高頻為20Hz，低幅應(yīng)變?yōu)镺. 00002， 24小時加載1 h。培養(yǎng)4天，取出復(fù) 合體檢測細胞總量的變化，低頻高幅疊加高頻低幅載荷組的細胞總量 遠遠高于靜態(tài)培養(yǎng)組，達到1.2-2.3倍。低頻高幅疊加高頻低幅載荷條 件可能有利于細胞、組織的生長、發(fā)育。
權(quán)利要求
1、一種低頻高幅疊加高頻低幅載荷用于培養(yǎng)物培養(yǎng)的方法，是在生物反應(yīng)器內(nèi)進行，其特征在于包括具備5％CO2和37度溫度調(diào)節(jié)的細胞培養(yǎng)培養(yǎng)箱及灌流等條件，將培養(yǎng)物固定于培養(yǎng)室底板，其具體過程如下灌流系統(tǒng)保證培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)液的更換，培養(yǎng)物處于細胞可生長的生物環(huán)境下，由計算機控制，通過加載器件使培養(yǎng)物被施加壓載荷，該載荷具有低頻高幅疊加高頻低幅的特征，其低頻范圍為0.1-10Hz，高幅應(yīng)變范圍為0.001-0.2；高頻范圍為5-80Hz，低幅應(yīng)變范圍為0.000001-0.01；各載荷波形為方波、正弦波、三角波；加載時間為每24小時加載1-3次，每次為10-360分鐘，培養(yǎng)1-60天；這樣培養(yǎng)物受到的是低頻高幅疊加高頻低幅載荷作用，在此種力學(xué)環(huán)境下使組織生長、發(fā)育，完成培養(yǎng)物的培養(yǎng)。
2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的生物反應(yīng)器，其特征在于該生物反應(yīng)器包括培養(yǎng)箱、培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)、加載機構(gòu)、培養(yǎng)室和計算機；加載機 構(gòu)、培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)和培養(yǎng)室都放在培養(yǎng)箱內(nèi)；該加載機構(gòu)主要包括 框架、力傳感器、兩個串聯(lián)一起的壓電陶瓷位移器和位移傳感器；該 培養(yǎng)室是一個封閉的容器，上、下面分別為上、下壓塊，上壓塊與培 養(yǎng)室之間有滑動密封墊；上壓塊與培養(yǎng)室之間可有相對滑動，封閉的 培養(yǎng)室壁上設(shè)有培養(yǎng)液灌流接頭，培養(yǎng)物放在培養(yǎng)室的上、下壓塊之 間；該灌流系統(tǒng)包括培養(yǎng)液儲存瓶，通過硅膠管與培養(yǎng)室連接，由蠕 動泵提供流動動力；該計算機裝有壓電陶瓷位移器軟件系統(tǒng)及蠕動泵 控制系統(tǒng)，可對壓電陶瓷位移器及蠕動泵進行自動控制。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的低頻高幅疊加高頻低幅加載的方法，其特征 在于所述的培養(yǎng)物是細胞、組織、細胞與支架復(fù)合體或移植組織。
4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物反應(yīng)器，其特征在于所述的培養(yǎng)物 是細胞、組織、細胞與支架復(fù)合體或移植組織。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的低頻高幅疊加高頻低幅加載的方法，其特 征在于通過加載器件使培養(yǎng)物被施加壓載荷，是指在培養(yǎng)物表面直 接施加動態(tài)低頻高幅疊加高頻低幅載荷。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的低頻高幅疊加高頻低幅加載的方法，其特 征在于通過加載器件使培養(yǎng)物被施加壓載荷，是指給培養(yǎng)物表面覆 蓋彈性硅膠膜后間接加載。
7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的低頻高幅疊加高頻低幅加載的方法，其特 征在于通過加載器件使培養(yǎng)物被施加壓載荷，是指給培養(yǎng)物表面覆 蓋多孔剛性薄板后間接加載。
全文摘要
一種低頻高幅疊加高頻低幅加載的方法及生物反應(yīng)器，它在包括具備O₂、CO₂和溫度調(diào)節(jié)、細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)箱，及培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)等條件下，將培養(yǎng)物固定于培養(yǎng)室底板；在培養(yǎng)期間，對培養(yǎng)物表面施加不同低頻高幅疊加高頻低幅載荷，其中低頻為0.1-10Hz，高幅應(yīng)變?yōu)?.001-0.2；高頻為5-80Hz，低幅應(yīng)變?yōu)?.000001-0.01，每種載荷波形可為方波、正弦波、三角波等的波形都可實現(xiàn)。為該方法設(shè)計了一種生物反應(yīng)器，它包括培養(yǎng)箱、培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)、加載機構(gòu)、培養(yǎng)室和計算機；加載機構(gòu)、培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)和培養(yǎng)室都放在培養(yǎng)箱內(nèi)，實現(xiàn)對培養(yǎng)物的低頻高幅疊加高頻低幅加載，完成對培養(yǎng)物的培養(yǎng)。實驗表明此種加載方式比靜態(tài)培養(yǎng)促進了細胞的增殖。
文檔編號C12N13/00GK101402952SQ20071030388
公開日2009年4月8日 申請日期2007年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日 公開號200710303886.發(fā)明者張春秋, 樊瑜波 申請人:北京航空航天大學(xué)