專利名稱：一株對氧還循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿菌的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明要求保護的技術(shù)方案涉及一種通過分子生物學(xué)手段，利用代謝工程改造的細菌， 具體的說是一株對氧還循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿菌菌株、構(gòu)建方法及其在檢測氧還循環(huán)反 應(yīng)劑的生物傳感器研究中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
研究顯示，氧化應(yīng)激參與了神經(jīng)退行性變、癌癥和衰老等的發(fā)生過程。其中，主要因素 之一就是氧還循環(huán)反應(yīng)劑(redox cycling reagents),這類物質(zhì)在細胞內(nèi)經(jīng)過氧化還原循環(huán)反應(yīng) 產(chǎn)生活性氧簇(ROS)而參與上述疾病的發(fā)生發(fā)展。氧還循環(huán)反應(yīng)劑在一些酶的催化下，被 還原當量NADH/NADPH所還原發(fā)生單電子傳遞反應(yīng)，將電子傳遞給分子氧生成超氧陰離子 (見圖1)。超氧陰離子產(chǎn)生的過程是(l)在硫辛酸脫氫酶的催化下，氧還循環(huán)反應(yīng)劑(RW) 被還原(R+); (2)被還原的氧還循環(huán)反應(yīng)劑(R+)將電子傳遞給分子氧生成超氧陰離子，而 本身又被重新氧化為原來的狀態(tài)(R++)。硫辛酸脫氫酶是一類普遍存在的黃素酶，在大腸桿 菌中至少有三種這類酶，其中的兩種酶已經(jīng)被鑒定，它們是硫氧還蛋白還原酶和NADPH: 鐵氧還蛋白還原酶。在哺乳動物細胞這類酶主要包括微粒體NADPH-細胞色素P-450還原、 黃素嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶。上述網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)就是在硫辛酸脫氫酶和氧還循環(huán)反應(yīng)劑的催 化下，NADPH迅速氧化分子氧生成超氧陰離子?？傊毎┞对谘踹€循環(huán)反應(yīng)劑下有兩 個主要的后果1)細胞內(nèi)大量還原當量NAD(P)H的消耗；2)細胞內(nèi)過氧化物的大量生成。
氧還循環(huán)反應(yīng)劑是主要的工農(nóng)業(yè)污染物之一，對于工農(nóng)業(yè)污染物的監(jiān)測已經(jīng)發(fā)展了一些 物理化學(xué)方法，質(zhì)譜儀、氣相色譜儀及其它現(xiàn)代化的儀器無疑為污染物的精確監(jiān)測提供了強 有力的技術(shù)，但是，這些物理化學(xué)方法需要昂貴的儀器和專門的實驗室，更重要的是，這些 技術(shù)雖說能夠精確定量污染物，但是不能提供這些污染物的生物有效度、細胞內(nèi)潛在的修飾/ 去毒作用以及體內(nèi)的協(xié)同/拮抗效應(yīng)等生物學(xué)關(guān)鍵信息。因此，有必要發(fā)展一種生物傳感器來 對這些有毒物質(zhì)進行檢測。在過去的十幾年里，利用生物檢測技術(shù)來檢測特殊污染物的研究 引起了廣泛的關(guān)注，生物檢測技術(shù)的基本原理即是利用模式生物對特定化學(xué)物質(zhì)的分子反應(yīng)
機理。對于生物檢測技術(shù)而言需要三種必需的元件1)針對特定或具有相似性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì) 的感應(yīng)器；2)由感應(yīng)器控制的啟動子；3)受此啟動子控制的報告基因。在設(shè)計生物檢測技 術(shù)時，由于細菌具有在環(huán)境中大量存在、生長快速、低成本及易維護等優(yōu)點而受到研究人員 普遍親睞。至今，己經(jīng)研發(fā)了一系列針對特定有機物和無機化合物如重金屬、甲苯及其衍 生物和其它物質(zhì)檢測的生物傳感器。現(xiàn)在己經(jīng)比較清楚大腸桿菌針對氧還循環(huán)反應(yīng)劑反應(yīng)的分子機理。兩種氧還反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因 子，SoxR和OxyR，主要負責介導(dǎo)細胞對氧還循環(huán)反應(yīng)劑的反應(yīng)。SoxR包含兩個結(jié)構(gòu)域N 端螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋DNA結(jié)合域和C端的調(diào)節(jié)域。SoxRC端的四個半胱氨酸殘基(Cys)作為鐵 硫中心(2Fe-2S)的配體。純化的SoxR是一同源二聚體，每一單體包含一個鐵硫中心(2Fe-2S)。 在普通培養(yǎng)條件下，細菌中SoxR (2Fe-2S)處于還原狀態(tài),無任何轉(zhuǎn)錄活性。當在培養(yǎng)基中加 入氧還循環(huán)反應(yīng)劑時，SoxR立即被氧化，并刺激其唯一目標基因^xS的表達。其產(chǎn)物SoxS是 Ara-C相關(guān)轉(zhuǎn)錄激活子，能誘導(dǎo)36種基因的表達，其中包括含有Mn-超氧化物歧化酶(SODA)、 核酸內(nèi)切酶IV、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、延胡索酸酶C、烏頭酸酶A和NADPH-鐵氧還蛋白氧化 還原酶等基因。
OxyR是大腸桿菌中另一種主要的氧還轉(zhuǎn)錄因子。與SoxR不同，OxyR含有兩個氧還活性 半胱氨酸殘基(Cysl99和Cys208)。 OxyR氧化和還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)域的晶體結(jié)構(gòu)顯示這兩個氧 還活性半胱氨酸殘基之間大約相隔17A。在氧化狀態(tài)下，二硫鍵的形成導(dǎo)致OxyR調(diào)節(jié)域結(jié)構(gòu) 的顯著改變。OxyR二硫鍵可逆的形成被認為代表細胞內(nèi)感受過氧化氫的一種機制，然而，也 有人認為OxyR有其它的激活機制。因為部分由氧還循環(huán)反應(yīng)劑刺激細胞產(chǎn)生的超氧陰離子被 轉(zhuǎn)化為過氧化氫，所以O(shè)xyR在大腸桿菌內(nèi)也被氧還循環(huán)反應(yīng)劑所激活。活化的OxyR刺激一 大類基因的表達，其中包括過氧化氫酶I a^G)、谷氨酰氧還蛋白I (grxj)、烷基過氧化氫還 原酶大亞單位(fl/y F)和鐵氧還蛋白2 (RjcC)等基因。
研究人員巳嘗試應(yīng)用大腸桿菌wx&:/acZ融合基因、sox&:/wxOX4AE融合基因、 M^4::/^CZX4S五融合基因檢測氧還循環(huán)反應(yīng)劑。但是，這些融合基因建構(gòu)對氧還循環(huán)反應(yīng)劑 的檢測受到很大的限制，因其敏感度不高，不能用于環(huán)境中氧還循環(huán)反應(yīng)劑的檢測。
新的研究焦點集中在增加對氧還循環(huán)反應(yīng)劑生物檢測的靈敏度上來，在我們的研究中， 提出這樣一個假設(shè)限制檢測敏感性的主要因素是大腸桿菌對氧還循環(huán)反應(yīng)劑的快速生物反 應(yīng)，即氧還循環(huán)反應(yīng)劑刺激細胞產(chǎn)生的超氧陰離子和過氧化氫被相關(guān)基因編碼的酶類迅速降 解，使得啟動融合基因的報告基因產(chǎn)生的信號不夠強，導(dǎo)致了檢測靈敏度不高。
研究顯示，負責分解大腸桿菌中超氧化物的酶有三種Mn-超氧化物岐化酶(MflL4)， Fe-超氧化物岐化酶(wc/B)和Cu/Zn-超氧化物岐化酶(卵dC)。 Fe-超氧化物岐化酶為組成性表 達，負責內(nèi)源性超氧化物的清除。Mn-超氧化物岐化酶的表達分別受到轉(zhuǎn)錄因子Fur (鐵吸收 調(diào)節(jié))和wd5 (有氧呼吸控制)系統(tǒng)的抑制，但是，氧還循環(huán)反應(yīng)劑通過wjd S調(diào)節(jié)系統(tǒng)誘 導(dǎo)其高表達。Cu/Zn-超氧化物岐化酶只在靜止期的大腸桿菌內(nèi)積聚，并分泌到外周胞質(zhì)中。 然而Cu/Zn-超氧化物岐化酶對早期靜止期的細胞生長重要，細胞溶質(zhì)中的Mn-超氧化物岐化酶 和Fe-超氧化物岐化酶主要負責大腸桿菌細胞內(nèi)超氧化物轉(zhuǎn)化成氧和過氧化氫。研究顯示敲除 wt^和^K^能增加大腸桿菌對氧還循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性，但不會顯著影響在豐富培養(yǎng)基中的 需氧生長。大腸桿菌中還有兩類主要的催化酶過氧化氫酶I/催化酶(& 5)和垸基過氧化氫還原酶 (a/y^和a/^C)，它們負責將過氧化氫轉(zhuǎn)化成氧和水。烷基過氧化氫還原酶對過氧化氫的親 合力要強于過氧化氫酶I，是內(nèi)源性過氧化氫主要的清除者。另一方面，過氧化氫酶I (to/G) 性質(zhì)更加活躍，主要負責高濃度時過氧化氫的清除。
敲除這些基因(w^4、 ^c^、 "/^cF和;t^G)將會顯著增加大腸桿菌對氧還循環(huán)反應(yīng)劑
的敏感性。現(xiàn)在己有TOcJL4和soc^雙突變株(JI312)和)fc^G突變株(JI361)的商品供應(yīng)， 但是這些突變株都是通過轉(zhuǎn)座子致基因干擾制備而得的，其中一些還帶有抗生素抗性標記。 為避免大腸桿菌內(nèi)導(dǎo)入額外的缺失/突變和表達質(zhì)粒，我們在構(gòu)建多基因缺失株時不導(dǎo)入任何 DNA標志。需氧生長的大腸桿菌細胞內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生內(nèi)源性過氧化物和過氧化氫。因此，大腸桿 菌內(nèi)源性過氧化物和過氧化氫的本底水平將會限制其對由氧還循環(huán)反應(yīng)劑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的 檢測敏感度。
研究顯示一種不需氧末端氧化酶一延胡索酸還原酶是有氧生長大腸桿菌細胞內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)源 性過氧化物和過氧化氫的主要催化酶。編碼延胡索酸還原酶基因一/raL4BCD的失活基本不影 響其需氧生長能力，但能顯著減少內(nèi)源性過氧化物和過氧化氫的產(chǎn)生。大腸桿菌延胡索酸還 原酶由四個亞單位組成，其中兩個亞單位，黃素結(jié)合蛋白(FrdA)和鐵蛋白(FrdB),構(gòu)成 催化延胡索酸還原成琥珀酸的可溶性結(jié)構(gòu)域。其余兩個亞單位(FrdC和FrdD)是跨膜多肽， 涉及膜上與甲萘醌的電子傳遞。與琥珀酸脫氫酶不同，延胡索酸還原酶有一特殊性質(zhì)，即其 黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)成份具很高的電子密度，這些性質(zhì)使得延胡索酸還原酶比琥珀 酸脫氫酶更易與氧反應(yīng)產(chǎn)生過氧化物和過氧化氫。其結(jié)構(gòu)信息與早期的觀察表明，是延胡索 酸還原酶，而不是琥珀酸酰氫酶，是有氧生長條件下大腸桿菌產(chǎn)生的內(nèi)源性過氧化物和過氧 化氫主要的催化酶。
為了使大腸桿菌內(nèi)源性過氧化物和過氧化氫的產(chǎn)生保持在最低水平，編碼延胡索酸還原 酶的/hi4SCD基因應(yīng)被敲除。因此，上述相關(guān)基因的敲除構(gòu)建一株穩(wěn)定的多基因突變株作為 檢測氧還循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感器的反應(yīng)宿主，能夠解決生物檢測氧還循環(huán)反應(yīng)劑時細菌本 身靈敏度不高的問題，為研發(fā)高敏感性檢測氧還循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感器打下良好的基礎(chǔ)， 經(jīng)檢索本研究構(gòu)建的多基因突變菌株在國內(nèi)外均無文獻報道及專利授權(quán)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建對氡還循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿 菌菌株，以解決生物檢測氧還循環(huán)反應(yīng)劑時細菌本身敏感性不高的問題。
本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用技術(shù)方案:構(gòu)建一株多基因缺失的大腸埃希氏菌^^/ieWc;H'fl
CO//WMC-001,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址中國北 京，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2006年11月22日，保藏編號CGMCCNo: 1867。用于本發(fā)明￡.co// WMC-001菌株基因敲除工作的工具是條件復(fù)制質(zhì)粒pKOV，其構(gòu)建的 打耙載體包括pKOV-TOflL4、 pKOV—otffi、 pKOV-fe^G、 pKOV國a/z; CF及pKOV-/raL45CI>，其 中以載體pKOV-/"MSCD為例構(gòu)建(見圖3 )。
本發(fā)明的Eco//WMC-001菌株的構(gòu)建方法是利用條件復(fù)制質(zhì)粒pKOV作為工具，利用 同源重組原理，通過基因敲除技術(shù)將細菌基因組中編碼分解超氧化物的酶(m^4和wc^)和 分解過氧化物和過氧化氫的酶和fl/y CF)及生成內(nèi)源性超氧化物和過氧化氫的酶 (/raL45CZ))全部敲除，其中以/^45CD基因的敲除為例說明敲除的方法，利用聚合酶鏈反 應(yīng)(PCR)技術(shù)將大腸桿菌基因組中與目的基因/^L45CD兩側(cè)相連DNA片段N和C進行擴 增。按照我們的經(jīng)驗，需要較大的DNA片段N和C (每段DNA長度為 500bp)才能利用宿 主重組酶系統(tǒng)成功進行重組。對于DNA片段N，引物No被設(shè)計成含有內(nèi)切酶位點，引 物Ni5'端含有33bp長度的拖尾；DNA片段C的引物Co被設(shè)計成含有S"/I內(nèi)切酶位點，引 物Ci 5'端也含有33bp長度的拖尾，序列與引物Ni 5'端拖尾互補。從兩PCR反應(yīng)中合成的 DNA產(chǎn)物通過交叉PCR連接形成不含有目的基因/^^50)的一段DNA片段。
/rcW^CD基因敲除的合成DNA片段被克隆進pKOV質(zhì)粒的Wort、 &/I內(nèi)雙酶切位點。 克隆的質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入重組頻繁的大腸桿菌株MC4100。經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布于含氯 霉素/LB平板并置42。C孵育。平板上存活的菌落指示重組pKOV質(zhì)粒巳成功整合進入基因組 DNA，因為游離質(zhì)粒不會在非允許溫度下復(fù)制增殖。存活的菌落將會立即被置于含5%(W/V) 蔗糖的平板上置3(TC培養(yǎng)以選擇發(fā)生第二次重組事件的大腸桿菌克隆。對蔗糖抵抗且對氯霉 素敏感的細菌克隆被挑選用作進一步分析。
如果插入及整合事件全發(fā)生在目的基因/W^SCZ)的同一側(cè)的話，將會產(chǎn)生象親代一樣的 大腸菌株。另一方面，如果插入與整合發(fā)生在目的基因/^MBCD的不同側(cè)的話，就會刪除基 因/n"5CZ)。因此，陽性克隆通過針對目的基因/nWSCD兩側(cè)序列的引物的PCR方法加以確 證。此基因替換方法實現(xiàn)在不導(dǎo)入基因組中任何抗生素抗性DNA標志的情況下實現(xiàn)精確基 因刪除。使用不同的打靶載體進行重復(fù)操作，將另外四個基因敲除，就獲取具有卵W、 wd5、 itoG、 a/^CF及/raL450)五個基因缺失的Eco/; WMC-001菌株。
本發(fā)明的有益效果是這個菌株對于典型氧還循環(huán)反應(yīng)劑VitK3、 PMS和PQ的敏感性 明顯高于野生菌MC4100，并且在幾個突變菌株中五.co/!'WMC-001的敏感性是最高的。利用 本發(fā)明提供的Eco/z'WMC-001菌株作為檢測氧還循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感器的反應(yīng)宿主菌，可 以使其對氧還循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性明顯增加，利用本發(fā)明提供的菌株作為宿主菌可以在環(huán)境 污染物一氧還循環(huán)反應(yīng)劑的檢測中得到應(yīng)用。


下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步說明。
圖1:氧還循環(huán)反應(yīng)劑(11++)在細胞內(nèi)產(chǎn)生超氧陰離子 圖2: /AYi4^:Z)基因片段交叉PCR反應(yīng) 圖3:打靶載體pKOV-/raL4SCZ)的構(gòu)建 圖4: ./^4SCD基因敲除的流程圖
圖5:五個基因缺失的大腸桿菌模式圖 圖6:突變菌生長曲線
圖7:突變菌對VitK3敏感性(終點法) 圖8:突變菌對VitK3敏感性圖(生長曲線法)
圖9:突變菌對PMS敏感性圖(生長曲線法) 圖10:突變菌對PQ敏感性圖(生長曲線法)
圖ll:突變菌對VitK3敏感性圖(MIC法)
圖12:突變菌對PMS敏感性圖(MIC法)
圖13:突變菌對PQ敏感性圖(MIC法)
圖14: PQ藥液稀釋 圖中標號說明 A: MflL4突變株； G: A加G突變株； C: a/^CF突變株； B: mc^突變株； F: /rd^8CZ)突變株； BF: wc/S、 /W/^CD雙突變株； AB: mW、 too^雙突變株；
CBF: a一CF、 mo 仏/r^4BCD三突變株； GCBF: to,G、 a/z; CF、 toc/5、々aL45CD四突變株；
AGCBF: GCBF: torG、 a/ipCF、 soc^、/ra^5CZ)五突變株￡.co//WMC-001 。
PQ:百草枯。
具體實施例方式
以下通過實施例進一步描述本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。 實施例l
將通過兩步PCR擴增出包含基因/^i4BCD兩端各500bp左右不含該基因lkb左右的PCR 片斷，克隆到pKOV條件復(fù)制質(zhì)粒，構(gòu)建？&0^/ ^^^)打靶載體(見圖2、 3);將該重組 子轉(zhuǎn)化入高重組率的大腸桿菌MC4100中，通過溫度及蔗糖的選擇，發(fā)生兩次同源重組，最 后將基因/raL45Ci)替換，得到基因/^4SCD缺失的大腸桿菌，同樣原理利用w^、卵必、 ferfG和a/^CF四個基因的打靶載體，可以依次敲除這些基因，從而得到了/raL45CD、 soW、 m必、tofG和a/^CF五個基因缺失的大腸桿菌突變株。
實施例2
用于本發(fā)明的對氧還循環(huán)反應(yīng)劑超敏感的大腸桿菌的構(gòu)建具體方法如下
第一部分打靶載體的制備
一、目的基因的獲得
(一) 引物信息及合成
根據(jù)Harvard Molecular Technology Group & Lipper Center for Computational Genetics網(wǎng)站 提供的引物序列，聯(lián)合Primer5.0及DNAMAN軟件對引物作適當改動，/raL4BCD，網(wǎng)站所給 的序列是單個基因，這里是需要把四個基因一起刪除，所以要選用/^i4及^r/D兩個外側(cè)基因 的外側(cè)引物作為PCR的引物，引物由大連寶生物公司合成。用無菌去離子水將引物溶解，配 成濃度為10 pmol/L。
(二) 兩步PCR反應(yīng)
第一步擴增兩個同源臂
用接種針挑取LB平板五.co/z' MC4100 —單個菌落少許，混于取含15 pL無菌水的200 nL PCR反應(yīng)管中，沸水煮10 min， 1,2000 rpm離心3~5 min把凝結(jié)在蓋子上的水滴離到管底。 取以下配好體系5iaL加入該管中，混勻。 _
ReagentsVolume(|oL)
dNTP Mixture (2.5 mM)2
尸戶6e5f DN A Polymerase (5 U/pL)0.09
ra《ai a 7i^ (5U/(jL)0.03
Primer No or Co0.4
Primer Ni or Ci0.4
10xbuffer(plus Mg2+)2
Total~5
PCR反應(yīng)條件如下94°C 1 min; 88°C4 min; 94°C 10 sec， 66°C3 min， 25個循環(huán)；72°C 10 min， 4。C保存。取5)iL產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純 化試劑盒進行純化，最后加適量的TE或ddH20溶解洗脫備用。 第二步交叉PCR
體系如下
ReagentsVolume(|jL)
dNTP Mixture (2.5 mM)2
尸戸6eW DNA Polymerase (5 U/|iL)0.09
ra《(5U/(jL)0.03
N端同源臂PCR反應(yīng)產(chǎn)物0.5
C端同源臂PCR反應(yīng)產(chǎn)物0.5
Primer No0.4
Primer Co0.4
lOxbuffer(plus Mg2+)2
ddH2014
Total20
PCR反應(yīng)條件同第一步PCR。
(三) PCR產(chǎn)物加A反應(yīng)
在上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物中按每50 加入5 U的比例加入￡x Tfl^^聚合酶，72°C 10 min。
(四) PCR片斷純化回收
加A反應(yīng)產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化，最后加適量的TE或ddH20溶解洗脫備用。
(五) 、目的片段與pMD18-T simple載體連接
按TaKaRa公司的pMD18-T simple Vector試劑盒說明書進行T載體與目的基因的連接。
連接反應(yīng)體系
ReagentsVolume((jL)
pMD18-T simple Vector1
回收產(chǎn)物1
ddH203
Ligation Solution5
Total10
連接反應(yīng)于16'C過夜。
(六) 轉(zhuǎn)化
通過冷CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH-5a感受態(tài)細胞中。
(七) 測序
挑選一個經(jīng)外側(cè)引物No、 CoPCR鑒定，質(zhì)粒酶切鑒定證實的單克隆送大連寶生物公司 測序，測序結(jié)果中被刪除基因兩端同源臂與NCBI上提供的標準參考序列比對。
(八) 重組克隆pMD18T-/ni45a 的雙酶切和目的片段/ni4BO)的回收1. 堿裂解法小量質(zhì)粒DNA的制備
2. pMD18TV^^SCD質(zhì)粒的雙酶切和目的片段//yMSC"的回收
提取的質(zhì)粒DNA進行雙酶切，其反應(yīng)體系如下37°C，酶切3h。目的片段々^4BCD的
切膠回收酶切反應(yīng)后產(chǎn)物行0.8%低熔點瓊脂糖凝膠電泳，在長波紫外燈下切割目的DNA
片段，以TaKaRa公司膠回收試劑盒進行回收。最后以Du-800核酸/蛋白分析儀對回收產(chǎn)物定
量(見圖4)。 _
_Reagents _Volume(|jL)
pMD18T-/r雄CZ) 10 淑I (10U/|aL) 1 &/I (而"L) 1 10xHBuffer 2 0.1%BSA 2
_ddH20_^_
_ Total 20
二 pKOV載體片段的制備
(一) 堿裂解法中量制備pKOV載體
因為質(zhì)粒pKOV是低拷貝的(5-10個/ce11)，為了得到足夠的量就選用質(zhì)粒中量提取法。
(二) pKOV質(zhì)粒的雙酶切及其回收
體系及酶切條件同質(zhì)粒，回收純化載體片段。 三、打耙載體pKOV-/ni4fiCi)的構(gòu)建及保存
(一) 目的片斷與載體的連接反應(yīng)_
_R6ag6nts_Volume((xL)
pKOV載體 2 /W^BCD片斷 3 T4 DNA連接酶 2 lOxbuffer 2.5
ddH20_10.5
Total 20 —
連接反應(yīng)于16'C過夜。
(二) 將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH-5a感受態(tài)細胞中
(三) 陽性克隆的鑒定 1. PCR鑒定
用接種針挑取LB CM+平板單個菌落少許，混于取含14 無菌水的200 pLPCR反應(yīng)管 中，沸水煮10min， 1,2000 rpm離心3 5 min把蓋子上的水蒸氣離到管底。取以下體系加入 該管中，混勻。dNTP Mixture (2.5 mM)
MgCl2 (25 mM) 7k^i a7^ (5U/|aL) Primer No or Co Primer Ni or Ci lOxbuffer(plus Mg2+) Total
Volutne([xL)
1.5 0.1 0.4 0.4 2
說明書第9/15頁
PCR反應(yīng)條件如下94°C 1 min; 88°C 4 min; 94°C 10 sec, 66°C 3 min， 25個循環(huán)； 72°C 10min， 4。C保存。取5 產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。 電泳顯示PCR片斷長度在lkb左右的原被克隆挑選出，進行下面的質(zhì)粒提取和雙酶切鑒定。 2.質(zhì)粒雙酶切鑒定
1) 上述克隆質(zhì)粒的中量提取(同上述)
2) 體系及酶切條件同pMD18T-/^^a)質(zhì)粒。酶切反應(yīng)后產(chǎn)物行0.8%低熔點瓊脂糖凝膠電 泳鑒定。酶切片斷在lkb左右證實打靶載體構(gòu)建成功，菌種置含甘油15。/。的LBCM+中，-70 'C保存，備用。
四、打耙載體pKOV-soflL4、 pKOV-sorf5、 pKOV-Aflrt 和pKOV-flA/;CF的構(gòu)建及保存
利用同樣操作程序，構(gòu)建另外四個打靶載體pKOV-5oW、 pKOV—oc^、 pKOV-toW和 pKOV-a/z/7CF轉(zhuǎn)化入DH-5a中，菌種置含甘油15%的LB CM+中，-70°。保存，備用。
第二部分Ecd'WMC-001菌株的構(gòu)建
一、/nW50)基因的敲除
(一) 同源重組率高的MC4100感受態(tài)細胞的制備
(二) 打靶載體pKOV-yhi45CZ)轉(zhuǎn)化入Eco/Z MC4100感受態(tài)細胞
1. DH-5a中pKOV-y^45CD打耙載體的提取(試劑盒法TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification KitVer.2.0)
2. 打靶載體pK0V-/^45O)轉(zhuǎn)化
(三) 第一步同源重組(//vM5CD整合到大腸桿菌的基因組中) 1. 30°C LBCM+平板生長出的單個菌落PCR鑒定
用接種針挑取LB CM+平板單個菌落少許，混于取含14 ^il無菌水的200 ^ PCR反應(yīng)管中， 沸水煮10 min， 1，2000 rpm離心3~5 min把蓋子上的水蒸氣離到管底。取以下配好體系6.4 pl 加入該管中，混勻。_Reagents_Volume(|jL)
dNTP Mixture (2.5 mM) ^ MgCl2 (25 mM) 1.5 7^幽7^ (5U/^iL) 0.1 Primer No or Co 0.4 Primer Ni or Ci 0.4
lOxbuffer(plus Mg2+)_2
Total 6.4
PCR反應(yīng)條件如下94°C 1 min; 88。C4min; 94°C 10 see, 66°C 3 min， 25個循環(huán)；72 °C 10 min， 4'C保存。取5 pi產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。
2. PCR結(jié)果為約lkb的原菌落取3 5個克隆稀釋于42'C預(yù)熱lmlLB培養(yǎng)基中，按10倍、 100倍稀釋，并各取0.1mL分別涂于42。C預(yù)熱的LBCM+的平板上。待菌液完全吸收后，倒 置培養(yǎng)皿，42'C過夜。
(四) 第二步同源重組(質(zhì)粒與基因組分離并丟失)
1. 42°C LBCM+平板生長的單個菌落的PCR鑒定(方法同上)
2. PCR產(chǎn)物為兩條帶，其亮度相當(約lkb和長片斷4kb左右的長度)證明已經(jīng)發(fā)生了第一 步同源重組，片斷及質(zhì)粒已經(jīng)整合到基因組上。選取這樣的菌落3 5個克隆，分區(qū)劃線于42 。C預(yù)熱的LBCM+的平板上，42。C培養(yǎng)18-20 h，長出單個菌落。
3. 選取上述菌落3 5個稀釋于3(TC預(yù)熱lmLLB培養(yǎng)基中，按103、 104、 105倍稀釋，并各 取O.l mL分別涂于3(TC預(yù)熱的LB 5%蔗糖的平板上。待菌液完全吸收后，倒置培養(yǎng)皿，30 'C過夜。
(五) 氯霉素(CM+)平板的負篩選
用接種針挑取30'C， LB 5%蔗糖的平板上生長的單個菌落，分別接種于LB CM+平板上 和LB 5%蔗糖平板上，3(TC過夜培養(yǎng)。
(六) 合格菌落的PCR篩選
30°C LBCM+平板不生長，LB5。/。蔗糖平板上生長的菌落作PCR鑒定(方法見上述)
PCR產(chǎn)物約為lkb的菌落初步證實為已經(jīng)敲除掉基因的陽性菌落。
PCR進一步鑒定證實敲除成功。 二、 sorf5、 fl/^CF、 Aa,G和sodL4基因的順序敲除
利用同樣的方法，依次敲除wcffi、 a/^CF、 fe^G和M^4四個基因，獲得最終菌株 MC4亂實施例3
為了檢測五個基因突變菌株￡.co// MC4100對氧還循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性，我們選擇具有 代表性的氧還循環(huán)反應(yīng)劑VitK3、 PMS和PQ做氧還循環(huán)反應(yīng)劑敏感性實驗，具體實施如下
一、 突變菌株生長曲線測定
1. 種子液制備
取LB平板上的單個新鮮菌落，接種于2mlLB液體培養(yǎng)基，200 rpm， 37'C振蕩過夜， 培養(yǎng)至飽和狀態(tài)。
2. 調(diào)整起始菌液的OD6oo值
(1) 吸取飽和菌液200nl加入到含有LB液體培養(yǎng)基1,800 pl的比色皿中吹吸混勻，用空白LB 液體培養(yǎng)基調(diào)零，測定OD,值，結(jié)果乘10即為飽和菌液的OD6oo值。
(2) 按照公式V4 / 0D6()()，計算出需加入到50mlLB液體培養(yǎng)基中的菌液量，使起始菌液 OD6oo值約為0.02
(3) 按照計算好的量吸取種子液加入50mlLB液體培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，同時分別吸取菌液 2ml加入到比色皿中測定OD6oo值(作為0hOD畫值)。
(4) 分裝將上述稀釋好的培養(yǎng)，按照2mL/管加入到無菌試管中。
3. 標記編號
五個基因突變株，按照2h、 4h、 6h、 8h、 10 h、 12 h、 14 h、 16h標記； 野生型菌株按照lh、 2h、 3h、 4h、 5h、 6h標記。
4. 培養(yǎng)
將上述試管在37'C下振蕩培養(yǎng)。然后分別按對應(yīng)時間將試管取出，立即放冰箱中貯存， 待培養(yǎng)結(jié)束時一同測定OD值。
5. 生長量測定
將未接種的LB培養(yǎng)基傾倒入比色杯中，選用600nm波長分光光度計上調(diào)節(jié)零點，作為 空白對照，并對不同時間培養(yǎng)液從Oh起依次進行測定，對濃度大的菌懸液用未接種的LB液 體培養(yǎng)基適當稀釋后測定，使其OD值在0.10-0.65以內(nèi)，經(jīng)稀釋后測得的OD值要乘以稀釋 倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實際的OD值。
6. 結(jié)果
以時間為橫坐標，OD6oo值為縱坐標，繪制大腸桿菌的生長曲線。
二、 突變菌株對氧還循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性實驗
(一)突變菌株對VitK3、 PMS及PQ的敏感性實驗(生長曲線法) 1.種子液的準備
取LB平板上的單個新鮮菌落，接種于20mlLB液體培養(yǎng)基，200rpm， 37。C振蕩過夜，
培養(yǎng)至飽和狀態(tài)。2. 調(diào)整起始菌液的OD6oo值
(1) 吸取飽和菌液200nl加入到含有LB液體培養(yǎng)基l,800pl的比色皿中吹吸混勻，用空白LB 液體培養(yǎng)基調(diào)零，湖!l定OD6oo值，結(jié)果乘10即為飽和菌液的OD6oo值。
(2) 按照公式V4 / OD6(K)，計算出需加入到50mlLB液體培養(yǎng)基中的菌液量，使起始菌液 OD6oo值約為0.02。
(3) 按照計算好的量吸取種子液加入50mlLB液體培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，同時分別吸取菌液 2ml加入到比色皿中測定OD6(K)值(作為0hOD,值)。
(4) 將三角燒瓶放入振蕩培養(yǎng)箱，200rpm， 37。C振蕩培養(yǎng)，同時開始計時。
3. 加入氧還循環(huán)反應(yīng)劑
WT培養(yǎng)lh取出，以每20ml分裝入含有不同量氧還循環(huán)反應(yīng)劑的50ml無菌離心管中，充 分混勻，然后，以每管2ml再分裝，以時間作為標記。
MT培養(yǎng)2h取出，以每20ml分裝入含有不同量氧還循環(huán)反應(yīng)劑的50ml無菌離心管中，充 分混勻，然后，以每管2ml再分裝，以時間作為標記。
將分裝好的試管放入振蕩培養(yǎng)箱，200rpm， 37'C振蕩培養(yǎng)
4. OD6oo值測定
WT每隔1 h取出相應(yīng)的試管測定OD6oo值。 MT每隔2 h取出相應(yīng)的試管測定OD6(K)值。
5. 數(shù)據(jù)處理
繪制不同濃度氧還循環(huán)反應(yīng)劑影響兩種菌株的生長曲線。 (二)突變菌株對VitK3、 PMS及PQ的敏感性實驗(終點法)
1. 種子液的準備
取平板上的單個菌落，接種于20mlLB液體培養(yǎng)基，200 rpm， 37。C振蕩培養(yǎng)至飽和狀態(tài)。
2. 氧還循環(huán)反應(yīng)劑敏感性試驗流程 (1)調(diào)整起始菌液的OD6oo值
1) 吸取飽和菌液200nl加入到含有LB液體培養(yǎng)基1，800 pl的比色皿中吹吸混勻，用LB調(diào)零， 測定OD6oo值，結(jié)果乘10即為飽和菌液的OD6oo值。
2) 按照公式V4 /OD6Q()，計算出需加入到50mlLB液體培養(yǎng)基中的菌液量，使起始菌液00600 值約為0.02
3) 按照計算好的量吸取種子液加入50mlLB液體培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，同時分別吸取菌液2ml 加入到比色皿中測定OD6oo值(作為OhOD6oo值)，lm咖入到一支無菌1.5mlEP管中(4°C 保存，用于CFU的測定)。
4) 將三角燒瓶及試管同時放入振蕩培養(yǎng)箱，200rpm， 37'C振蕩培養(yǎng)，同時開始計時。(2) 加入氧還循環(huán)反應(yīng)劑
WT培養(yǎng)lh， MT培養(yǎng)2h取出，以每3ml分裝入含有不同量的氧還循環(huán)反應(yīng)劑的無菌試管中， 混勻。
(3) 將分裝好的試管放入振蕩培養(yǎng)箱，200rpm， 37'C振蕩培養(yǎng) WT菌株培養(yǎng)至6h取出試管(時間從0h即OD60()值0.02時開始計算)每支取200pl測定
OD,值(方法同種子液的測定)剩余取l ml加入到一支無菌1.5 mlEP管中(4'C保存，用于CFU 的測定)。MT菌株培養(yǎng)12h (以下同上) 3. CFU測定
WT取0h、 6h的菌液用無菌0.9。/。 (150mM)生理鹽水(NS)稀釋至106、 107和108倍， (根據(jù)OD值確定選用哪個稀釋倍數(shù)作為涂板用，原則按照lOD60() lxl09 cells/ml)吸取200pl 涂在LB固體平板上，37'C過夜培養(yǎng)，次日觀察細菌個數(shù)，計數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算原菌液的 活細菌數(shù)。
MT取0h、 12h的菌液按照上述處理 (三)瓊脂稀釋法測定VitK3、 PMS和PQ對各種菌株的最低抑菌濃度MIC 1.實驗前的準備工作
(1) 配制所需的培養(yǎng)基 LB固體液體
(2) 藥物原液配制
1) 0,1 MVitK3配制
準確稱取VitK3粉末0.17128 g溶于無水乙醇并定容至10 ml用，0.22 pm濾菌器過濾除 菌，-20匸避光保存。
2) 0.1 MPMS
準確稱取PMS粉末0.30634 g溶于超純水并定容至10 ml，用0.22 pm濾菌器過濾除菌， -20°。避光保存。
3) 0.1 MPQ
瓶裝PQ(100mg)全量溶解在2mL超純水，并最終定容在3.889mL，用0.22 pm濾菌 器過濾除菌，-2(TC避光保存。(3) 藥液稀釋見圖14
(4) 種菌
將實驗菌選用經(jīng)過平板新鮮培養(yǎng)并分純后的單個菌落接種于2 ml LB液體試管中37°C 200 rpm過夜
2. 實驗當n
(1) 將培養(yǎng)基融化放置57"C水浴中備用
(2) 加藥將稀釋好的不同濃度的氧還循環(huán)反應(yīng)劑對應(yīng)終濃度按量加入平板中
(3) 倒平板用無菌15ml離心管(帶刻度)量取10ml培養(yǎng)基，倒入加好藥液的平皿中，
充分與其混勻。
(4) 將凝固好的固體平皿放置37i:溫箱中30min，去掉水汽。
(5) 稀釋菌用微量加樣器吸取原始菌液100 pl加入到800 ^ LB液體培養(yǎng)基中，五個基因 和四個基因突變株做10—'稀釋，其它菌株做10—2稀釋，使菌液達到約107CFU/ml。
(6) 將稀釋后菌液取1 nl滴加在含不同濃度VitK3的平皿上，以野生菌做為對照，放置溫箱 37°C 18 24h。
3. 記錄結(jié)果
試驗第二天，觀察細菌有無生長，以未見細菌生長的最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。 三、實驗結(jié)果
敲除fi:個基因后，細菌在有氧環(huán)境下生長緩慢(見圖8)，但是對于VkK3、 PMS和PQ 的敏感性顯著高于野生型大腸桿菌MC4100 (見圖7、 8、 9、 10);并且對于VitK3、 PMS和
PQ的敏感性在所有構(gòu)建的菌株中是最高的(見圖11、 12、 1)。我們之前提出的假設(shè)是細菌 屮本身存在的 些基因限制了其對氧還循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性，經(jīng)過敲除這些基因后發(fā)現(xiàn)細菌
的敏感性確實顯著增加，這就證明我們的假設(shè)是成立的。這個敏感菌株的構(gòu)建，解決了用于 檢測氧還循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感器中宿主菌本身靈敏度不高的問題，用這個菌株作為生物傳感器的宿主來檢測污染物氧還循環(huán)反應(yīng)劑將會增加檢測的靈敏度，以解決現(xiàn)階段存在的生物 檢測環(huán)境中的氧還循環(huán)反應(yīng)劑敏感性不高的問題，為靈敏地檢測氧還循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感 器的研發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1. 一種對于氧還循環(huán)反應(yīng)劑敏感的大腸桿菌菌株，其特征在于，名稱為E.coli WMC-001，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會，普通微生物中心，編號CGMCC No.1867。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的對于氧還循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿菌菌株WMC-OOl，其特 征在于，該菌為多基因突變株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述多基因突變菌株，其特征在于，利用基因敲除技術(shù)，敲除五.co/ZMC4100 基因組中編碼分解超氧化物的酶和wd5)和分解過氧化物和過氧化氫的酶(fe^G和 a/y CF)及生成內(nèi)源性超氧化物和過氧化氫的酶(/raL4BCXO。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述多基因突變株的構(gòu)建方法，其特征在于，利用條件復(fù)制質(zhì)粒pKOV作 為工具，重組頻繁的MC4100為研究對象，通過同源重組的方法順序敲除/W^BCZ)、
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述多基因突變株的構(gòu)建方法，其特征在于，重組片斷的構(gòu)建利用交叉PCR 擴增出含有基因兩端同源臂的PCR片斷，/^WSCZ) PCR片斷構(gòu)建。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述五個基因的敲除的方法，其特征在于，用于基因敲除的打靶載體，包 括pKOV-wdL4 、 pKOV-soii 5 、 pKOV-to〖G 、 pKOV-a/^CF及pKOV-/raL4BC￡>,,其中以 pKOV:/^45CD為例其載體構(gòu)建。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述多基因突變株的構(gòu)建方法，其特征在于，基因敲除的步驟以々WSCD 的敲除為例將權(quán)利要求5所述打靶載體pKOV-/^L^CD轉(zhuǎn)化入￡.co// MC4100，通過兩次同 源重組，最后將/^4i5CD替換。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3、 4、 5、 6、 7所述多基因突變株的構(gòu)建方法，其特征在于，利用同樣的原 理，依次將/ra^flOX m必、"一CF、 to G和^i4敲除，最終形成/raL45CD、 w必、a—CF、 to/G和卵W五個基因缺失的多基因突變菌株，命名為￡co// WMC-OOl。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述構(gòu)建的多基因突變株E.co// WMC-OOl，其特征在于，這個菌株對于典 型氧還循環(huán)反應(yīng)劑百草枯(paraquat, PQ)、維生素K3 (vitamin K-3， VitK3)和吩嗪硫酸甲 酯(phenazinemethosulfate, PMS)的敏感性明顯高于野生菌MC4100，并且在幾個突變菌株 中WMC-001的敏感性是最高的。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述對于氧還循環(huán)反應(yīng)劑高敏感突變菌株￡.co/z' WMC-001 ，其特征在于， 這個敏感菌株的構(gòu)建解決了生物監(jiān)測氧還循環(huán)反應(yīng)劑時細菌本身靈敏度不高的問題，能夠在 靈敏地檢測氧還循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感器的研究中得到應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及對氧還循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿菌菌株、構(gòu)建方法及其在對污染物，氧還循環(huán)反應(yīng)劑檢測中的應(yīng)用，菌株名稱為E.coli WMC-001，敲除親本株E.coli MC4100基因組中影響細菌對氧還循環(huán)反應(yīng)劑敏感性的基因分解超氧化物的酶(sodA和sodB)和分解過氧化物和過氧化氫的酶(katG和ahpCF)及生成內(nèi)源性超氧化物和過氧化氫的酶(frdABCD)的基因。此方法在不添加細菌基因組中任何DNA標志的前提下，將目的基因精確敲除，形成比較穩(wěn)定的多基因突變株E.coli WMC-001，它對氧還循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性明顯增加，從而解決了生物檢測氧還循環(huán)反應(yīng)劑時細菌本身靈敏度不高的問題。
文檔編號C12N1/21GK101469317SQ20071030538
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月25日
發(fā)明者呂建新 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院