專利名稱：癌癥診斷標(biāo)記物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用粒細(xì)胞群落刺激因子(G-CSF)的基因表達(dá)變 異體的癌癥診斷標(biāo)記物及其制備方法，具體涉及一種使用具有與G-CSF 的外顯子4區(qū)域的5'-端連接的外顯子2區(qū)域的3，-端的寡聚核苷酸作為 癌癥診斷標(biāo)記物的診斷癌癥和/或評估癌癥發(fā)展?fàn)顟B(tài)的方法。
背景技術(shù)：
癌癥診斷一般通過下列方法來實(shí)現(xiàn)(1)使用顯微鏡諸如光學(xué)顯微 鏡或者電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析；(2)檢測在癌組織中特異性表達(dá)的 蛋白質(zhì)的免疫組化測定(Iran, 5Zom^/.丄，3:99， 1999; Z朋cet, 2:483, 1986)， 或者(3)分析在癌組織中發(fā)現(xiàn)的異常生物分子諸如突變基因的分子診斷。 與分子診斷相比，形態(tài)學(xué)和免疫組化診斷需要更長時(shí)間和更高的成本。 由于分子診斷具有相對簡單的步驟并且產(chǎn)生結(jié)果時(shí)間較短，已經(jīng)變成發(fā) 展新的癌癥診斷方法的主要手段。近來，Health Digit公司開發(fā)了用于診斷 各種癌癥的蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)，并在世界上首次得到中國藥品監(jiān)督管理局 (CSDA)臨床測試證實(shí)(www.health-digitcom)。但是，蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)不是僅 僅使用一種生物標(biāo)記物來診斷所有種類的癌癥，而是使用10種或更多種蛋 白質(zhì)作為標(biāo)記物。
為了將這種診斷方法有效地應(yīng)用于癌癥診斷，最重要地是選擇并使用能 夠更精確并容易檢測癌癥發(fā)生的癌癥診斷標(biāo)記物。已經(jīng)報(bào)道許多基因(Steve, M.等人，《/ C〃". 0腳/，, 20:3165~3175, 2002; Sridlhar， R.等人, / C7/w. <9 co/ogy, 20:1932 1941,2002)和蛋白質(zhì)(Goessl,等人，t/ra/ogy, 58:335 338, 2001; Zhou,等人，Omcerrwa" 66:217~224, 2001;韓國專利公開 號(hào).2001-0061173)作為診斷標(biāo)記物，其中的一些已經(jīng)在臨床上用于癌癥診
4具有較低器官特異性的CEA、 BFP、 TPA 和IAP具有較低的敏感性，因此產(chǎn)生了假陽性數(shù)據(jù)。而且，具有較高器官特 異性的生物標(biāo)記物諸如AFP、 PIVKAII、酯酶I、 CA19-9、 CA50、 Span-l 抗原、CA15-3和BCA225僅僅被用于目標(biāo)器官。
在候選癌癥診斷標(biāo)記物開發(fā)中，許多研究人員使用微陣列技術(shù)，試圖發(fā) 現(xiàn)具有診斷應(yīng)用的根據(jù)病理和生理?xiàng)l件顯示不同結(jié)果的基因，(Liu， H.X.等 人，27:55~58, 2001; Wilson, C.A.等人'O"coge朋，14:1-16, 1997; Weissenstdner, T., iVwc/e/c v4c/& 26:687, 1998; Zolezzi, F.等人，^m. / Me<i. Gewef., 71:366-370, 1997; Mottes J.R.和Iverson， L.E., 7Vewra", 14:613-623, 1995; Crook, R.等人，4:452~455, 1998; Jiang, Z.H.和Wu, J.Y.,尸rac. Soc. 脂.MW" 220:64~72, 1999)。
但是，由于通過上述提到的方法發(fā)現(xiàn)的候選癌癥診斷標(biāo)記物絕大部 分由表達(dá)的序列標(biāo)記(EST)構(gòu)成，它們僅僅被發(fā)現(xiàn)為具有數(shù)據(jù)的特性， 因此難以選擇可靠的特異性候選者并獲知(catch on)它們來源的真正基 因。特別地，通過人類基因組分析得知基因的數(shù)目并且還得知許多異構(gòu) 體或者變異體通過它們得到表達(dá)而具有生物功能及其復(fù)雜性。因此，其 已經(jīng)變成用于未來的另一種大的主題，以發(fā)現(xiàn)整個(gè)基因組中被表達(dá)的基 因和條件變異體以及它們的功能是什么。這些變化的變異體可以是找出 它們中異常變異體的形成和引起癌癥的可能性之間的相關(guān)性的良好基礎(chǔ) (Cartegni, L.等人，Ato. i ev. 3:285~298, 2002; Schweighoffer, R等人，
尸/wvwflcoge"ow/c^ 1:187~197, 2000; Blencowe， B.J., 7>efi^ 5"c/" 25:106 110, 2000; Cooper, T.A.和Mattox, W., X肌i/wm. 61:259 266， 1997)。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了長期研究，來開發(fā)新的可診斷各種癌癥 的癌癥診斷標(biāo)記物，結(jié)果，確認(rèn)在G-CSF基因轉(zhuǎn)錄過程中外顯子3區(qū)域 的缺失在腫瘤細(xì)胞或者腫瘤組織中特異性顯示，從而提出了有關(guān)使用
5G-CSF mRNA, cDNA變異體片段或者蛋白質(zhì)作為癌癥診斷標(biāo)記物診斷癌癥 的方法(WO 2003/027288 Al)。在使用G-CSF基因片段作為上述申請的 專利的癌癥診斷標(biāo)記物的微陣列中，G-CSF基因的外顯子1、2、4和5DNA 片段與G-CSF基因的外顯子3DNA區(qū)域一起被用作檢測生物樣品中具有 缺失外顯子3區(qū)域的G-CSF基因片段的核酸探針。本發(fā)明的通過檢測 G-CSF基因的外顯子3區(qū)域缺失表達(dá)的診斷癌癥的方法是使用基因變異 體的特性診斷癌癥的技術(shù)之一，并被認(rèn)為是有用的候選癌癥診斷標(biāo)記物， 因?yàn)樵撟儺愺w在大多數(shù)癌癥中存在。
同時(shí)，包括G-CSF基因的大多數(shù)基因通常表達(dá)許多異構(gòu)體和變異體， 于是，固定在微陣列上的探針片段必須在檢測G-CSF基因的外顯子3區(qū) 域的缺失中具有高度的敏感性。而且，正常G-CSF或者它們的片段的表 達(dá)可在腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織中與突變G-CSF異構(gòu)體一起存在，因此僅僅 通過檢測其基因表達(dá)中G-CSF的外顯子3區(qū)域的存在的癌癥診斷可導(dǎo)致 可信度的喪失或者較低的敏感性，此外，還具有評估癌癥發(fā)展的狀態(tài)問 題。
因此，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)付出了極大的努力來開發(fā)新的核酸探針 用于檢測可滿足上述要求或者解決上述問題的沒有外顯子3區(qū)域的 G-CSF基因片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)含有具有與G-CSF基因的外顯子4區(qū)域的 5'-末端連接的G-CSF基因的外顯子2區(qū)域的3，-末端的核酸序列的寡聚 核苷酸被用作癌癥診斷標(biāo)記物時(shí)，與其它探針相比其具有顯著增加的高 度敏感性，并確定癌癥發(fā)展的狀態(tài)可通過使用含有具有與G-CSF基因的 外顯子4區(qū)域的5'-末端連接的G-CSF基因的外顯子2區(qū)域的3，-末端的 核酸序列的寡聚核苷酸與具有一部分或者全部G-CSF基因的外顯子3區(qū) 域的序列的寡聚核苷酸一起作為癌癥診斷標(biāo)記物精確地被診斷，由此完 成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的主要目的在于提供用于診斷癌癥的寡聚核苷酸，其
基本含有具有與粒細(xì)胞群落刺激因子基因的外顯子4區(qū)域的5'-末端連接 的外顯子2區(qū)域的3'-末端的剪接位點(diǎn)的核酸序列。
本發(fā)明的另一目的在于提供含有寡聚核苷酸的用于癌癥診斷的診斷 試劑盒和使用寡聚核苷酸診斷癌癥的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了用于癌癥診斷標(biāo)記物的寡聚核苷 酸，其基本上含有含有具有與G-CSF基因的外顯子4區(qū)域的5，-末端連接 的外顯子2區(qū)域的3'-末端的核酸序列的寡聚核苷酸的剪接位點(diǎn)的核酸序 列。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的寡聚核苷酸基本上包括序列號(hào)l或2的核酸 序列。
本發(fā)明還提供了含有寡聚核苷酸的用于癌癥診斷的診斷試劑盒。 在本發(fā)明中，用于癌癥診斷的診斷試劑盒優(yōu)選為用于評估癌癥發(fā)展?fàn)顟B(tài)
的試劑盒，其另外含有基本上包括一部分或者全部G-CSF基因的外顯子3
區(qū)域的序列的寡聚核苷酸。
在本發(fā)明中還提供了用于診斷癌癥的方法，所述方法包括下列步驟 (a)從哺乳動(dòng)物生物樣品中獲得G-CSF核酸樣品；(b)擴(kuò)增得到的G-CSF
核酸樣品；和(c)檢測擴(kuò)增的樣品中含有具有與G-CSF基因的外顯子4
區(qū)域的5'-末端連接的外顯子2區(qū)域的3，-末端的剪接位點(diǎn)的核酸序列的
寡聚核苷酸。
在本發(fā)明的方法中，步驟(c)優(yōu)選包括其中在擴(kuò)增的樣品中同時(shí)檢 測包括一部分或者全部G-CSF基因的外顯子3區(qū)域的序列的寡聚核苷酸 與含有具有與G-CSF基因的外顯子4區(qū)域的5，-末端連接的外顯子2區(qū)域 的3'-末端的剪接位點(diǎn)的核酸序列的寡聚核苷酸的步驟。
通過下列詳細(xì)描述和所附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征和實(shí)施方式將更加顯而易見。


圖1是生產(chǎn)來自人類G-CSF基因的正常蛋白質(zhì)和變異體的過程的示意圖。
圖2顯示了可通過兩種類型(A型、B型)的人類G-CSF基因的外 顯子2區(qū)域形成的外顯子2區(qū)域和外顯子3區(qū)域的接合區(qū)域。
圖3顯示了在PCR中引物的連接位置和根據(jù)該位置所預(yù)期的PCR 產(chǎn)物。
圖4是DNA芯片的設(shè)計(jì)，其包括擴(kuò)增的G-CSF基因的每個(gè)區(qū)域的 探針(E2:由G-CSF基因的外顯子2區(qū)域設(shè)計(jì)的探針；E2E3a:由類型A的具 有與G-CSF基因的外顯子2區(qū)域的3'-末端和外顯子3區(qū)域的5'-末端連 接的剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)的探針；E2E3b:由類型B的具有與G-CSF基因的外顯 子2區(qū)域的3'-末端和外顯子3區(qū)域的5'-末端連接的剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)的探 針；E3-1, E3-3, E3-4和E3-6: G-CSF基因的外顯子3區(qū)域設(shè)計(jì)的探針；E2E4a: 由類型A的具有與G-CSF基因的外顯子2區(qū)域的3'-末端和外顯子4區(qū)域 的5'-末端連接的剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)的探針；E2E4b:由類型B的具有與G-CSF 基因的外顯子2區(qū)域的3'-末端和外顯子4區(qū)域的5'-末端連接的剪接位 點(diǎn)設(shè)計(jì)的探針；P:被構(gòu)造成通過熒光標(biāo)記作為位置標(biāo)記物來區(qū)分位置的探 針;N:陰性對照(點(diǎn)樣液)。
圖5顯示了使用圖4的DNA芯片的雜交結(jié)果。紅色圓圈顯示了顯示信 號(hào)的探針。
圖6顯示了根據(jù)細(xì)胞和組織類型的圖4的DNA芯片的雜交結(jié)果(A:正 常人血液，B:肺癌(A549)， C:大腸癌(SES-T), D:胃癌(1:AGS, 2: YCC-2, 3: HwangOO, E:頸部腫瘤(l: C33A, 2: HeLa), F:增殖腫瘤細(xì)胞(HT1080), G:乳 腺癌MDA-MB-231), H:胰腺癌(Capan-2)， I:肝癌(SK-Hepl), J:黑素肉瘤 (SK-Mel),K:白血病(JurketcDNA文庫)，L:胚腎(293))。紅色圓圈顯示能夠區(qū)分腫瘤組織和正常組織的探針信號(hào)。
圖7是DNA芯片的示意圖，其包括被設(shè)計(jì)成檢測G-CSF基因的剪接位 點(diǎn)的探針(E2E4:由具有與兩種類型(A型、B型)的G-CSF基因的外顯 子2區(qū)域的3'-末端和外顯子4區(qū)域的5'-末端連接的剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)的探 針；E2E3:由具有與兩種類型(A型、B型)的G-CSF基因的外顯子2 區(qū)域的3'-末端和外顯3區(qū)域的5'-末端的剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)的探針；P:被構(gòu) 造成通過熒光標(biāo)記作為位置標(biāo)記物來區(qū)分位置的探針；N:陰性對照(點(diǎn)樣 液))。
圖8顯示了根據(jù)細(xì)胞和組織類型的圖7的DNA芯片的雜交結(jié)果。紅色 圓圈顯示可在癌癥的情況下特異性顯示信號(hào)的探針。
圖9是DNA芯片的示意圖，其上固定有由每個(gè)G-CSF基因的外顯子區(qū) 域設(shè)計(jì)的探針以檢査每個(gè)探針的診斷效率。
圖IO是顯示G-CSF基因中每個(gè)探針的位置的示意圖。包括在用于不具 有外顯子3的G-CSF基因的探針中的橢圓形中的探針由剪接變異體的外顯 子2的3'末端和外顯子4的5'末端設(shè)計(jì)。
圖11顯示了根據(jù)細(xì)胞類型和顯示有效的候選探針的探針信號(hào)強(qiáng)度，該 有效性可通過信號(hào)強(qiáng)度來推斷。
圖12顯示了使用圖9的DNA芯片的雜交結(jié)果，紅色圓圈顯示可僅僅在 癌癥中特異性顯示信號(hào)的探針。
圖13顯示了根據(jù)細(xì)胞和組織類型的圖9的DNA芯片的雜交結(jié)果。通過 Scanarray 5000 (A:正常血液(WBC), B: 293 (胚胎細(xì)胞系)，C: SES-N (正常大 腸),D: SES-T (大腸癌),E: Colo205 (克隆的癌細(xì)胞系),F: DLD-1 (克隆的癌細(xì) 胞系)，G: HwangOO (胃癌細(xì)胞)，H: YCC-3 (胃癌細(xì)胞系)，J: MDA-MB-231 (乳 腺癌細(xì)胞系)，K: NCI-H460 (肺癌細(xì)胞系)，L: Caki-2 (腎癌細(xì)胞系)，M: Capan-2 (胰腺癌細(xì)胞系)，N: SK-Mel2(黑素肉瘤)，O: HepG-2 (肝細(xì)胞癌)，P: SK-Hepl (肝臟癌細(xì)胞系))得到的雜交反應(yīng)圖像。紅色圓圈顯示在癌癥的情況
9下特異性顯示信號(hào)的探針。
圖14顯示了通過將每種探針與點(diǎn)樣液混合制備的DNA芯片。用藍(lán)色方
塊標(biāo)記的部分是代表癌癥的探針定位于其上的區(qū)域。
圖15顯示了使用圖14的DNA芯片根據(jù)實(shí)施例8和實(shí)施例9的通過利 用序列號(hào)32和序列號(hào)33的引物而擴(kuò)增來自正常和腫瘤臨床樣品的人類 G-CSF核苷酸序列得到的雜交產(chǎn)物的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及一種用于診斷癌癥和/或評估癌癥發(fā)展?fàn)顟B(tài)的方法，該方 法使用基本上含有具有與在通過包括微陣列的基因分析方法在轉(zhuǎn)錄后加 工之后產(chǎn)生的G-CSF基因變異體片段的外顯子2區(qū)域的3'-末端和外顯子 4區(qū)域的5'-末端連接的剪接位點(diǎn)的核酸序列。換言之，本發(fā)明涉及一種 用于診斷癌癥和/或評估癌癥發(fā)展?fàn)顟B(tài)的方法，該方法使用通過缺失 G-CSF基因的外顯子3區(qū)域以連接外顯子2區(qū)域和外顯子4區(qū)域作為癌 癥診斷標(biāo)記物得到的G-CSF變異體。
G-CSF基因的外顯子1 5在正常人體的剪接過程中正常連接，但剪 接以腫瘤細(xì)胞或者腫瘤發(fā)展細(xì)胞中不具有外顯子3的變異體形式發(fā)生以 產(chǎn)生不具有外顯子3的mRNA(圖1)。人類G-CSF基因的外顯子2區(qū)域 具有兩種類型(A型、B型)，因此外顯子2區(qū)域和外顯子3區(qū)域的剪接 位點(diǎn)也具有兩種類型(圖2)。而且，G-CSF基因的剪接結(jié)果是，具有所 有外顯子1~外顯子5的G-CSF mRNA從正常細(xì)胞中被分離，而不具有 外顯子3的mRNA從腫瘤細(xì)胞中被分離，上述mRNAs的差別可通過PCR 使用對G-CSF基因特異的引物來確認(rèn)(圖3)。
在識(shí)別兩種基因在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)(或者抑制)以及基因突 變的分子生物學(xué)方法以PCR (Bottema, C.D., MwtoA 233:93-102， 1993; Nelson, D丄.，Ow. O/ /". Dev., 1:62-68, 1991; Pourzand, C.和Cerutti, P.,
Mw如.288:113-121， 1993; Holland, P.M.等人，尸rac. A^/. f/SA8:7276-7280, 1991 )、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP， Glavac, D., i/ww. 19:384-394, 2002; Strippoli, P.等人，J Mo/. MW., 8:567-572, 2001), DNA 序列分析(Sanger, F.等人，Prac. Ato/. Jrad Scf. 74:6463-5467, 1997),
蛋白截短檢測(Hardy， C.A.， MeAoA Mo/. 5fo/.， 187:87-108， 2002),自動(dòng)核苷 酸序列分析(Boutin, R等人，/^m. 7kfMto" 15(2):201-203, 2000),雜合體缺失 研究(Yang, Q.等人，C//". Ca"cer及仏，8:2890-2893, 2002),微衛(wèi)星穩(wěn)定性研究 (Furlan, D.等人，J!尸aAo/., 197:603-609, 2002),使用MALDI-TOF的基因分析 (Leushner ,五x戸/. to嵐Z)扭，1:11-18, 2001),通過雜交進(jìn)行基因分析 (Wetmur， J.G" Critical Reviews in Biochem. Mol. Biol" 26:227-259, 1991),使用 DNA芯片進(jìn)行基因分析(Goessl等人，f/ra/og);, 58:335-338， 2001; Zhou等人, Ca"cer及杠7>eW.， 66:217-224, 2001;韓國專利
發(fā)明者劉昭永, 李相燁, 柳元敏, 柳來春, 琴基昌 申請人:株式會(huì)社美迪基尼斯