專利名稱：：He4與其它生化標(biāo)記物在卵巢癌評估中的應(yīng)用的制作方法HE4與其它生化標(biāo)記物在卵巢癌評估中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
：本公開一般性涉及癌癥的診斷、分級、分期和預(yù)后的領(lǐng)域。更具體來說，本發(fā)明涉及卵巢癌的領(lǐng)域。本公開內(nèi)容還涉及了包括生物標(biāo)記物表達(dá)的卵巢癌診斷、分級、分期和預(yù)后領(lǐng)域。癌癥包括范圍廣泛的疾病，在世界上大約每4個人中就有1個人受到影響。癌癥的負(fù)面影響的嚴(yán)重性是深刻的，普遍影響到了醫(yī)療保險和程序以及社會。由于多種類型的癌癥標(biāo)志是惡性細(xì)胞的快速和不受調(diào)控的增殖，因此改善針對癌癥的方法的一個決定性難題是對早期檢測和診斷的需求。早期檢測被廣泛認(rèn)為是降低癌癥死亡率的最好方法。因此，已經(jīng)進(jìn)行許多嘗試以建立準(zhǔn)確而可靠地診斷惡性病癥存在的標(biāo)準(zhǔn)。具體來說，針對被稱為腫瘤相關(guān)抗原的血清學(xué)定義的抗原性標(biāo)記物的應(yīng)用進(jìn)行了研究，這些腫瘤相關(guān)抗原或者僅由癌細(xì)胞表達(dá)，或者以明顯較高的水平存在于患有惡性病癥的對象中。然而，由于腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的高度異質(zhì)性，例如癌抗原的極端多樣性，因此對癌癥診斷中有用的其它腫瘤標(biāo)記物存在著需求。已知有許多與癌相關(guān)抗原具有反應(yīng)性的單克隆抗體。這些單克隆抗體結(jié)合各種不同的癌相關(guān)抗原，包括糖蛋白、糖脂和粘蛋白。許多這類單克隆抗體識別在來源于給定細(xì)胞譜系或組織類型的某些腫瘤但不是其它腫瘤上表現(xiàn)出受限表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原。可用于鑒定特定類型的惡性腫瘤的腫瘤相關(guān)抗原的例子相對較少。例如單克隆抗體B72.3，特異性結(jié)合高分子量(〉106Da)的腫瘤相關(guān)粘蛋白抗原，該抗原選擇性地表達(dá)于許多不同的癌上，包括即便不是所有也是大部分的卵巢癌、絕大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌。5然而，在外科切除腫瘤后檢測細(xì)胞相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物例如被B72.3所識別的粘蛋白抗原，對于診斷篩查來說用途有限，診斷篩査中在實(shí)體腫瘤塊積累以前對惡性病癥的早期檢測是優(yōu)選的。通過篩查外科切除的樣本的腫瘤相關(guān)抗原對特定類型的癌癥進(jìn)行診斷時，通常只有在檢測到積累的腫瘤塊后才進(jìn)行有創(chuàng)手術(shù)，對此的替代方法是提供可用于在得自無創(chuàng)或微創(chuàng)術(shù)對象的樣本中檢測此類抗原的組合物和方法。例如，在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和其它癌中，目前有許多可溶性腫瘤相關(guān)抗原，它們可在易獲得的生物流體樣品例如血清或粘膜分泌物中檢出。一種此類標(biāo)記物是CA125，其為一種也散落于血流中的癌相關(guān)抗原，可在血清中檢出(例如Bast等，1983N.Eng.J.Med.309:883;Lloyd等，1997Int.J.Cane.71:842)。血清和其它生物流體中的CA125水平同其它標(biāo)記物的水平一起測量，如癌胚抗原(CEA)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC)、組織多肽特異性抗原(TPS)、唾液酸化TN粘蛋白(STN)和胎盤堿性磷酸酶(PLAP)，以試圖提供卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和其它癌的診斷和/或預(yù)后情況(例如Sarandakou等，1997ActaOncol.36:755;Sara油kou等，1998Eur.J.Gynaecol.Oncol.19:73;Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):2945;Kudoh等，1999Gynecol.Obstet.Invest.47:52;Ind等，1997Br.J.Obstet.Gynaecol.104:1024;Bell等，1998Br.J.Obstet.Gynaecol.105:1136;Cioffi等，1997Tumori83:594;Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):2949;Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):3019)。但是，單獨(dú)的血清CA125水平升高或與其它己知指標(biāo)相結(jié)合，并不能提供對惡性腫瘤或特定惡性腫瘤如卵巢癌或子宮內(nèi)膜癌的確定診斷。例如，相對于宮頸癌和生殖道癌來說，陰道液和血清中CA125、CEA和SCC的升高在良性婦科疾病中與炎癥最密切相關(guān)(例如Moore等，1998Infect.Dis.Obstet.Gynecol.6:182;Sarandakou等，1997ActaOncol.36:755)。血清CA125升高也可伴有神經(jīng)母細(xì)胞瘤，而CEA和SCC水平升高可伴有結(jié)腸直腸癌。另一種標(biāo)記物，分化抗原間皮素，表達(dá)于正常間皮細(xì)胞表面還有某些癌細(xì)胞上，包括上皮性卵巢腫瘤和間皮瘤。與間皮素(Chang等，1992Cane.Res.52:181;Chang等，1992Int.J.Cane.50:373;Chang等，1992Int.J.Cane.51:548;Chang等，1996Proc.Nat.Acad.Sci.USA93:136;Chowdhury等，1998Proc.Nat.Acad.Sci.USA95:669;Yamaguchi等，1994J.Biol.Chem.269:805;Kojima等，1995J.Biol.Chem.270:21984)和結(jié)構(gòu)相關(guān)的間皮素相關(guān)抗原(MRA;參見例如Scholler等，1999Proc.Nat.Acad.Sci.USA96:11531)有關(guān)的組合物和方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)是已知的，包括如在WO00/50900和美國申請系列號No.09/513,597中描述的在癌癥檢測和治療中的應(yīng)用。對于可用于多標(biāo)記物診斷篩選的其它的標(biāo)記物存在著迫切的需求。"四個二硫鍵核心"蛋白家族包含功能多樣的酸-和熱-穩(wěn)定的小分子的異質(zhì)群組，其包括人類附睪四個二硫鍵核心蛋白，或"HE4a"(Kirchhoff等，1991Biol.Reprod.45:350-357;Wang等，1999Gene229:101;Schummer等，1999Gene238:375)。HE4cDNA首先從人類附睪中分離(Kirchhoff等，1991Biol.Reprod.45:350-357)，隨后HE4cDNA以高頻率在從卵巢癌構(gòu)建的cDNA文庫中被檢出(Wang等，1999Gene229:101;Schummer等，1999Gene238:375)。HE4a，"四個二硫鍵核心"蛋白家族的新成員，描述于美國專利申請公布號No.2003/0108965Al中。HE4a顯示出與HE4高度相似但有所不同的序列。HE4a已經(jīng)描述于美國專利申請No.10/233,150中，在此引為參考，它包括了在本公開中使用的SEQIDNO名稱。對于本公開的意圖來說，HE4或HE4a的檢測被認(rèn)為是同義的，檢測的任何一個分子都可以用于本文描述的方法中。HE4a是否是與HE4不同的分子、或HE4a的序列是否只是代表了對已公布的HE4序列的校正，并不重要。發(fā)明簡述本公開包括了評估患者(例如出現(xiàn)骨盆腫塊的患者)是否患有卵7巢癌的方法。該方法包括在從患者獲得的樣品中評估至少兩種標(biāo)記物，包括HE4標(biāo)記物和選自SMRP、CA125和CA72-4的另一種標(biāo)記物。標(biāo)記物的水平升高與患者患有卵巢癌的可能性增加相關(guān)。例如，可以評估樣品中的HE4和CA125標(biāo)記物或HE4和SMRP標(biāo)記物。這種方法可以用于辨別患者的骨盆腫塊是良性的還是卵巢癌。在另一個實(shí)施方案中，本公開涉及了評估患有卵巢癌的患者對治療的反應(yīng)的方法。該方法包括對在治療過程的不同時間從患者獲得的樣品中的至少兩種標(biāo)記物進(jìn)行評估，包括HE4標(biāo)記物和選自SMRP、CA125和CA72-4的另一種標(biāo)記物。在后來的時間標(biāo)記物的水平降低表明患者對治療有反應(yīng)。治療可以是例如腹膜內(nèi)化療或給患者施用與CA125特異性結(jié)合的抗體。本公開還涉及了在已經(jīng)進(jìn)行了卵巢癌治療的患者中評估疾病復(fù)發(fā)的方法。該方法包括在從治療后的患者獲得的樣品中評估至少兩種標(biāo)記物，包括HE4標(biāo)記物和選自SMRP、CA125和CA72-4的另一種標(biāo)記物。標(biāo)記物的水平升高表明患者卵巢癌復(fù)發(fā)?？梢栽谥委熀髮?biāo)記物進(jìn)行多次評估，標(biāo)記物水平增加表明患者卵巢癌復(fù)發(fā)。在另一個實(shí)施方案中，本公開涉及了對患者將發(fā)展卵巢癌的可能性進(jìn)行評估的方法。該方法包括在從患者獲得的樣品中評估至少兩種標(biāo)記物，包括HE4標(biāo)記物和選自SMRP、CA125和CA72-4的另一種標(biāo)記物。標(biāo)記物水平升高與患者將發(fā)展卵巢癌的可能性的增加相關(guān)。在另一個實(shí)施方案中，本公開包括在患有卵巢癌的患者中對腫瘤進(jìn)行分期和/或分級的方法。該方法包括在從患者獲得的樣品中評估至少兩種標(biāo)記物，包括HE4標(biāo)記物和選自SMRP、CA125和CA72-4的另一種標(biāo)記物。標(biāo)記物水平升高與更晚期的卵巢癌階段和/或更高等級的卵巢癌相關(guān)。幾個表格的簡述表1包含了通過在設(shè)定的特異性水平下比較標(biāo)記物的靈敏度而歸納出的實(shí)施例1的結(jié)果。表2包含了實(shí)施例2中描述的患有和未患有惡性腫瘤的對象中的年齡分布。表3包含實(shí)施例2中描述的患有良性疾病的對象的臨床診斷。表4包含了實(shí)施例2中描述的患有卵巢癌的對象的組織學(xué)和階段分布。表5包含了實(shí)施例2中描述的卵巢癌和良性腫瘤的標(biāo)記物平均值和中值的比較。表6包含了實(shí)施例2中描述的在設(shè)定的特異性水平下標(biāo)記物組合的靈敏度值的比較。表7包含了實(shí)施例2中描述的患有I期卵巢癌或良性疾病的對象中腫瘤標(biāo)記物的比較。表8包含了實(shí)施例2中描述的患有良性和I期卵巢癌的對象在特異性水平設(shè)置為90%、95%和98%的情況下腫瘤標(biāo)記物組合的靈敏度的比較。表9概括了實(shí)施例3中描述的患有良性疾病的對象在特異性水平設(shè)置為90%、95%和98%的情況下單個標(biāo)記物和標(biāo)記物組合的靈敏度值。發(fā)明詳述9本公開的主題總的來說涉及使用生物標(biāo)記物的組合在女性中對卵巢癌進(jìn)行評估。對HE4單獨(dú)地或與一種或多種其它的卵巢癌標(biāo)記物(特別是標(biāo)記物CA125、SMRP和CA72-4)組合在一起進(jìn)行評估，可以用于診斷在人類患者中發(fā)生的卵巢癌，以及評估癌癥對各種不同類型的治療(例如腹膜內(nèi)化療或用抗CA125抗體例如Edmonton,Alberta,Canada的ViRexx公司的OVAREX⑧產(chǎn)品進(jìn)行治療)的反應(yīng)。此外，這些標(biāo)記物的評估可用于監(jiān)測患者卵巢癌的復(fù)發(fā)，或評估患者將發(fā)展卵巢癌的可能性。定義本文中使用的術(shù)語"樣品"是指可以與患者特定有關(guān)的材料，從中可以確定、計(jì)算或推斷出與患者有關(guān)的特定信息。樣品可以全部或部分由來自患者的生物材料構(gòu)成。樣品也可以是以某種方式與患者接觸的材料，這種方式使得對樣品進(jìn)行的測試提供了與患者有關(guān)的信息。樣品也可以是已經(jīng)與其它材料接觸過的材料，這種其它材料不是患者的，但是能夠使第一材料隨后被測試以確定與患者有關(guān)的信息。樣品可以接觸患者之外的生物材料源，只要本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員仍然能夠從樣品確定與患者有關(guān)的信息就行。還可以理解的是，不是樣品的外來材料或信息也可用于將患者與樣品結(jié)論性地聯(lián)系在一起。舉一個非限制性的例子，雙盲實(shí)驗(yàn)需要圖表或數(shù)據(jù)庫以將樣品與患者相匹配。本文中使用的術(shù)語"患者"是指作為確定與生物體有關(guān)的信息的分析對象的生物體。盡管在本文描述的方法的大部分實(shí)施方案中患者是人類，但那些方法不限于用于人類個體?；颊呖梢允且唤M人類?；颊咭部梢允侨说囊徊糠?。這種實(shí)施方案的非限制性例子是，患者可以是與人體不相連的組織樣品，或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。在某些實(shí)施方案中，患者也可以是非人類的生物體。本文中使用的術(shù)語"參比值"是指當(dāng)與分析結(jié)果相比時，與特定結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)的值。在優(yōu)選實(shí)施方案中，參比值是根據(jù)比較HE4a表達(dá)與已知臨床結(jié)果的研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)評論來確定的。在本文的實(shí)施例部分中顯示了一些這樣的研究。但是，來自文獻(xiàn)的研究和本文描述的方法的用戶的經(jīng)驗(yàn)也可用于產(chǎn)生或調(diào)整參比值。參比值也可以通過考慮與患者的醫(yī)療史、遺傳學(xué)、年齡和其它因素特別相關(guān)的情況和結(jié)果來確定。本文使用的術(shù)語"體液"是指從患者獲得的稠度基本為流體的材料，但是可以有固體或顆粒物質(zhì)與其結(jié)合。體液也可以含有不是來自于患者的材料和部分。例如體液可以用水稀釋，或可以含有防腐劑例如EDTA。體液的非限制性例子是血液、血清、漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、腦脊液、唾液、分泌組織和器官的粘膜分泌液、陰道分泌物、乳汁、眼淚、以及腹水液例如與非實(shí)體腫瘤有關(guān)的腹水液。其它的例子包括胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔的流體等。生物流體還可以包括與患者或生物源接觸的液體溶液，例如細(xì)胞和器官培養(yǎng)基，包括細(xì)胞或器官條件培養(yǎng)基、灌洗液等。如果樣品是在治療性組合物或方法的施用前、施用時或施用后或在其后進(jìn)行的后續(xù)隨診過程中獲得的，那么樣品是"在治療過程中"從患者獲得的。該術(shù)語的使用明確地包含了樣品在進(jìn)行治療之前和之后(即為了評估治療的有效性或復(fù)發(fā))被獲得的情況，以及在較長期的治療過程中間斷地獲取多個樣品的情況。具體說明卵巢癌是最致命的婦科惡性腫瘤。據(jù)估計(jì)，在2005年將有超過22,000名女性將得以診斷并有超過16,000人將死于疾病(Murray等，2005.Ca.Cancer.J.Clin.2005;55(1):10-30)。這些女性中大部分表現(xiàn)出附件腫塊，在上腹部中具有或不具有疾病的征象。但是，在美國，所有女性中的20%將被診斷出在某些點(diǎn)具有附件腫塊或囊腫，而其中僅有很少百分比表現(xiàn)為惡性腫瘤。11卵巢癌通過外科手術(shù)進(jìn)行分期，研究顯示，由婦科腫瘤醫(yī)生進(jìn)行手術(shù)的患者比由非婦科腫瘤醫(yī)生進(jìn)行手術(shù)的患者更經(jīng)常適當(dāng)分期和去除腫塊。與由良性婦科醫(yī)生進(jìn)行手術(shù)相反，對于何時應(yīng)該將有附件腫塊的患者托付給婦科腫瘤醫(yī)生進(jìn)行外科探査必須頻繁地進(jìn)行臨床決定。CA125腫瘤標(biāo)記物可用于幫助預(yù)測哪些有骨盆腫塊的患者可能患有卵巢癌。不幸的是，許多良性的婦科和非婦科癥狀也能升高CA125，這降低了它的特異性；在多達(dá)一半的患有早期卵巢癌的患者中也發(fā)現(xiàn)了CA125正常。需要更精確的測試來確定出現(xiàn)附件腫塊的患者中惡性腫瘤的風(fēng)險，從而幫助婦科腫瘤醫(yī)生對患者大致分診。卵巢癌的存活率低部分是由于在疾病的早期階段缺少癥狀并缺少有效的篩查。結(jié)果是，70。/。的患者在診斷時已患有III期或IV期疾病，5年存活率大約為44%(Murry等，同上)。對于早期疾病(I期)來說，5年存活率在74%到90%的范圍內(nèi)(Averette等，1995，Cancer76(6):1096-1103;Young等，1990N.Engl.J.Med.，322(15):1021-1027)。不幸的是，目前還沒有卵巢癌的有效的篩選篩查檢驗(yàn)，因此需要靈敏度和特異性增加的腫瘤標(biāo)記物。能夠?qū)⒘夹耘c惡性腫塊充分區(qū)分開的標(biāo)記物或標(biāo)記物的組合，也將是作為有潛力的篩查檢驗(yàn)用于評估的良好候選者。在卵巢癌中使用最廣泛的標(biāo)記物是血清腫瘤標(biāo)記物CA125,但是對于早期疾病的檢測來說，它既不夠靈敏也不夠特異(Einhorn等，1992,Hematol.Oncol.Clin.North.Am.6(4):843-850;Campbell等，1990,Br.J.Obstet.Gynaecol.97(4):304-311;Jacobs等，1993，BMJ306(6884):1030-1034;DePriest等，1993，Gynecol.Oncol.51(2):205-209)。令人失望的是，在高風(fēng)險患者的評估中組合使用超聲成像和血清CA125水平，還沒有顯示出降低了該疾病的死亡率(Jacobs等，1990，Br.J.Obstet.Gynaecol.97(10):922-929;Karlan等，1993Am.J.Obstet.Gynecol.169(3):494-501;Bourne等，1993，BMJ306(6884):1025-1029;Schwartz等，1991，Yale丄Biol.Med.64(6):557-571)。也已經(jīng)評估了幾種新的腫瘤標(biāo)記物以確定它們在鑒定卵巢癌中的用途。最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在患有卵巢癌的女性中，可溶性間皮素相關(guān)肽(SMRP)和HE4的水平升高(Schaner等，2003，Mol.Biol.Cell14(11):4376-4386;Hough等，2000，CancerRes.60(22):6281-6287;Scholler等，1999,Proc.Natl.Acad.Sd.U.S.A.96(20):11531-11536;Hellstrom等，2003,CancerRes.63(13):3695-3700)?？扇苄蚤g皮素相關(guān)肽是巨核細(xì)胞增強(qiáng)因子家族的成員，在患有卵巢癌的患者的血清和尿液中都已經(jīng)檢測到14。在初步研究中，在92%的患有卵巢癌的女性中血清SMRP的水平升高了，與此相比在患有良性疾病的女性中只有10%升高。使用尿液進(jìn)行分析，在患有卵巢癌的女性中有67。/。的SMRP水平升高了，與此相比是健康志愿者為14%，而患有良性婦科疾病者為20%(Bones等，2003，美國臨床化學(xué)聯(lián)合會第55屆年會，AmericanAssociationforClinicalChemisty，55thAnnualMeeting)。最近通過微陣列技術(shù)鑒定出骨橋蛋白是有潛力的卵巢癌標(biāo)記物，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它在卵巢癌患者的血清中升高了(Kim等，同上)。Kim等已經(jīng)表明在卵巢癌患者中骨橋蛋白的組織表達(dá)增加以及血清水平增加；但是，為了獲得80%的靈敏度，將特異性降低到了只有80%(Kim等，同上)。CA72-4是最早在1980年代早期被描述的蛋白，當(dāng)用作單標(biāo)記物并當(dāng)與CA125組合時(Negishi等，1993,Gyneco1Oncol.48:148-154;Skates等，2004,J.ClinicalOncology22(20):4059-楊6;Fayed等，1998,DiseaseMarkers14:155-160)，已經(jīng)被顯示出在各種癌癥中升高(Colcher等，Proc.Nat.Acad.Sci.78(5):3199-3203)，包括卵巢癌。激活素和抑制素也已經(jīng)作為可能的標(biāo)記物得以研究，盡管在上皮癌中靈敏度還不高(Robertson等，2002,MolecularandCellularEndocrinology191(1):97-103;Robertson等，2004,Endocrine-RelatedCancer,11:35-49)。HE4是一種llkDa的蛋白，是附睪分泌蛋白E4的前體，其基因最初是通過微陣列技術(shù)鑒定的。在正常的卵巢組織中僅有極小量基因表達(dá)，在卵巢癌中表達(dá)升高5。在卵巢癌女性中有88%的血清HE4水平升高了，相比較而言在患有良性婦科病癥的女性中為5%(Kim等，2003,JAMA287(13)1671-1679)。有趣的是，SMRP和HE4分析水平的升高不依賴于疾病的階段和絕經(jīng)狀態(tài)。使用尿液分析，在50%的I期患者和79%的II期患者中SMRP的水平升高了，提高了增加早期疾病檢測的可能性(Bones等，同上)。本文描述的方法涉及HE4a，是本文描述的"四個二硫鍵核心"蛋白家族的成員，其表現(xiàn)出與HE4高度相似但是有所不同的序列(Kirchhoff等，1991Biol.Reproduct.45:350-357)。正如本文描述的那樣，HE4a(不是HE4)令人意外地顯示出在某些惡性腫瘤中的過表達(dá)，例如在子宮內(nèi)膜癌中以及許多其它人類組織中，這與人類附睪上皮細(xì)胞中HE4的受限制的表達(dá)模式形成了鮮明的對比(Kirchhoff等，1991)。本文描述的方法還部分涉及了組合物和方法，用于檢測對象中天然存在的細(xì)胞表面和/或可溶形式的HE4a，包括在患有某些癌癥(例如子宮內(nèi)膜癌)的對象中這類多肽的升高的水平。因此，本公開提供了通過特異性檢測這些細(xì)胞表面和/或可溶的HE4a多肽，檢測和診斷對象中惡性腫瘤病癥的有用的組合物和方法。按照本文描述的方法，可以在來自對象或生物來源的生物樣品中檢測可溶性人類HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)。生物樣品可以通過從對象或生物來源獲得血液樣品、活檢樣品、組織外植體、器官培養(yǎng)物、生物流體或任何其它的組織或細(xì)胞制備物來提供。對象或生物來源可以是人類或非人類的動物、原代細(xì)胞培養(yǎng)物或改造的培養(yǎng)物細(xì)胞系，包括但不限于可以含有染色體整合的或游離的重組核酸序列的遺傳工程的細(xì)胞系、永生化的或可以永生化的細(xì)胞系、體細(xì)胞雜交細(xì)胞系、分化的或可以分化的細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株系等。在本文公開的方法的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，對象或生物來源可以被懷疑患有惡性腫瘤病癥或有惡性腫瘤病癥的風(fēng)險，該病癥在某些其他優(yōu)選實(shí)施方案中14可以是子宮內(nèi)膜癌癥例如子宮內(nèi)膜癌，在本文公開的方法的某些其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，對象或生物來源可以已知沒有這些疾病的風(fēng)險或存在。在某些實(shí)施方案中，生物樣品包括至少一種來自于對象或生物來源的細(xì)胞，在其它某些優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品是含有另一種腫瘤標(biāo)記物例如CA-125或可溶性人類間皮素相關(guān)抗原多肽的生物流體。生物流體典型為生理溫度下的液體，并可以包括在對象或生物來源中存在、從中抽取、表達(dá)或以其他方式從中提取的天然存在的流體。某些生物流體源自于特定的組織、器官或定位的區(qū)域，而某些其它生物流體可以更為整體或全身地存在于對象或生物來源中。生物流體的非限制性例子包括血液、血清和槳膜液、血漿、淋巴液、尿液、腦脊液、唾液、分泌組織和器官的粘膜分泌液、陰道分泌物、乳汁、眼淚、以及腹水液例如與非實(shí)體腫瘤有關(guān)的腹水液。其它的例子包括胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔的流體等。生物流體還可以包括與對象或生物源接觸的液體溶液，例如細(xì)胞和器官培養(yǎng)基，包括細(xì)胞或器官條件培養(yǎng)基、灌洗液等。在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品是無細(xì)胞的液體溶液，例如血清、血漿或離心的尿液的上清液。在某些其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品含有完整的細(xì)胞，在某些其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品含有包含了核酸序列的細(xì)胞提取物，該核酸序列編碼具有SEQIDNOS:11或13中顯示的氨基酸序列的HE4a抗原多肽、或其片段或變異體。在本文所述的方法的其它實(shí)施方案中，需要在進(jìn)行分析以前，對細(xì)胞進(jìn)行物理或化學(xué)的破碎或裂解，以提供分析用細(xì)胞內(nèi)容物。樣品中的"以可溶形式天然存在的分子"可以是可溶性蛋白、多肽、肽、氨基酸或其衍生物；脂類、脂肪酸或類似物、或其衍生物；碳水化合物、糖類或類似物、或其衍生物；核酸、核苷酸、核苷、嘌呤、嘧啶或相關(guān)的分子、或其衍生物等；或其任何組合，例如，糖蛋白、糖脂、脂蛋白、蛋白脂或本文提供的生物樣品的可溶性或無細(xì)胞組分的任何其它生物分子。"以可溶形式天然存在的分子"也指溶液中或存在于生物樣品中、包括本文提供的生物流體中的分子，并且它們不與完整細(xì)胞的表面結(jié)合。例如，以可溶形式天然存在的分子可以包括但不是必須限于溶質(zhì)；大分子復(fù)合物的成分；從細(xì)胞脫落、分泌或輸出的物質(zhì)；膠體；微粒或納米粒子或其它細(xì)懸浮顆粒等。對象中存在惡性腫瘤病癥是指對象中存在發(fā)育異常的、癌性的和/或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，包括例如贅生的、腫瘤的、非接觸性抑制的或致癌轉(zhuǎn)化的細(xì)胞等。出于說明而不是限制，在本文所述的方法中，惡性腫瘤病癥還可以是指對象中存在能夠分泌、脫落、輸出或釋放HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)的癌細(xì)胞，以至于在來自對象的生物樣品中可以檢測到這種多肽的水平升高。例如在優(yōu)選實(shí)施方案中，這樣的癌細(xì)胞是惡性上皮細(xì)胞例如腺癌細(xì)胞，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中這樣的癌細(xì)胞是惡性間皮瘤細(xì)胞，它們是在例如內(nèi)胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔中發(fā)現(xiàn)的鱗狀細(xì)胞上皮或間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化變異體。在本文所述的方法的大多數(shù)優(yōu)選實(shí)施方案中，其存在表明了存在惡性腫瘤病癥的腫瘤細(xì)胞是子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，包括原發(fā)和轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞。將惡性腫瘤分類為子宮內(nèi)膜癌的標(biāo)準(zhǔn)在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的，來自原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤的人類子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株的建立和表征也是同樣。在其它實(shí)施方案中，惡性腫瘤病癥可以是間皮瘤、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌或其它形式的癌癥，包括任何各種不同的癌癥例如鱗狀細(xì)胞癌和腺癌，也包括肉瘤和血液惡性腫瘤(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等)。這些以及其它惡性腫瘤病癥的分類對于熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人來說是已知的，本公開提供了在這樣的惡性腫瘤病癥中無需過多試驗(yàn)就確定HE4a多肽存在的方法。在本文包含的實(shí)施例中提供了參比值。這些值適合于本文所述方法的實(shí)踐。但是應(yīng)該注意的是，本文所述方法的使用并不限于那些參16比值或數(shù)據(jù)。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員可以根據(jù)他們的具體需要獲得參比值。這樣的參比值可以在患者因?yàn)橐伤茞盒阅[瘤的子宮或子宮內(nèi)膜腫塊而進(jìn)行活檢程序時，通過分析患者的HE4a表達(dá)來獲得。獲得這類參比值的方法被包含在本文中并在實(shí)施例中提供。本文所述方法的使用者可能將獲得與本文提供的參比值不同的參比值，以集中于特定的患者類型。可以預(yù)見到這樣的類型可以包括年齡、遺傳背景、癌癥風(fēng)險、醫(yī)療史、血型、生理特征例如體重，以及其它的類型。本文提供的用于在對象中篩査惡性腫瘤病癥存在的方法，其特征可以是使用特異性針對HE4a抗原多肽的抗體或特異性針對HE4a多肽的抗體。特異性針對HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)的抗體可以容易地產(chǎn)生為單克隆抗體或多克隆抗血清，或可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的方法產(chǎn)生為被設(shè)計(jì)成具有所需的性質(zhì)的遺傳工程免疫球蛋白(Ig)。例如，作為說明而不是限制，抗體可以包括重組IgG、具有免疫球蛋白衍生序列的嵌合融合蛋白或"人源化的"抗體(參見例如美國專利No.5,693,762、5,585,089、4,816,567、5,225,539、5，530，101，在此引為參考)，它們都可以按照本文所述的方法用于檢測人類HE4a多肽。這樣的抗體可以如本文所提供的制備，包括下面描述的用HE4a多肽進(jìn)行免疫。例如，象本文提供的那樣，公開了編碼HE4a多肽的核酸序列，因此本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員可以常規(guī)制備這些多肽用作免疫原。例如，下文將更詳細(xì)描述的單克隆抗體如2H5、3D8和4H4，可用于根據(jù)在本文所述的方法中實(shí)踐某些方法。術(shù)語"抗體"包括多克隆抗體、單克隆抗體、其片段例如F(ab')2和Fab片段、以及作為與HE4a多肽特異性結(jié)合的分子的任何天然存在或重組產(chǎn)生的結(jié)合配偶體?？贵w，如果以Ka大于或等于大約104M"、優(yōu)選大于或等于大約105M"、更優(yōu)選大于或等于大約106M_1、更優(yōu)選大于或等于大約1(^M'1與HE4a多肽結(jié)合，它們就被定義為是"免疫特異性的"或特異性結(jié)合。結(jié)合配偶體或抗體的親和性可以使用常規(guī)技術(shù)容易地確定，例如在Scatchard等，Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660(1949)中描述的那些技術(shù)。確定其它蛋白作為HE4a多肽的結(jié)合配偶體，可以使用鑒定和獲得與其它蛋白或多肽特異性相互作用的蛋白的許多已知方法中的任何一種來進(jìn)行，例如酵母雙雜交篩選系統(tǒng)，如在美國專利No.5,283,173和美國專利No.5,468,614中所述，或其等同物。本文描述的方法也包括了使用HE4a多肽和基于HE4a多肽的氨基酸序列的肽來制備與HE4a多肽特異性結(jié)合的結(jié)合配偶體和抗體?？偟膩碚f，抗體可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的各種不同技術(shù)中的任何一種來制備(參見例如Harlow和Lane，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊》Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,198S)。在一種這樣的技術(shù)中，首先將含有HE4a多肽的免疫原，例如在表面上具有HE4a多肽的細(xì)胞或分離的HE4a多肽，注射到適當(dāng)?shù)膭游镏?例如小鼠、大鼠、兔、綿羊和山羊)，優(yōu)選按照預(yù)定的計(jì)劃加入一次或多次增強(qiáng)免疫，然后定期從動物取血。然后可以從這些抗血清中通過例如使用與適當(dāng)?shù)墓滔嘀С治锱悸?lián)的多肽的親和層析方法純化出特異性針對HE4a多肽的多克隆抗體。特異性針對HE4a多肽或其變異體的單克隆抗體可以使用例如Kohler和Milstein的技術(shù)(1976Eur.J.Immunol.6:511-519)及其改進(jìn)技術(shù)來制備。簡單來說，這些方法包括制備能夠產(chǎn)生具有所需特異性(即與目的間皮多肽具有反應(yīng)性)的抗體的永生細(xì)胞系。這樣的細(xì)胞系可以從例如從上述免疫的動物獲得的脾細(xì)胞來產(chǎn)生。然后通過與骨髓瘤細(xì)胞融合伴侶、優(yōu)選為與被免疫的動物同種同源者進(jìn)行融合來使脾細(xì)胞永生化。例如，可以使用膜融合促進(jìn)劑例如聚乙二醇或非離子去污劑將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞結(jié)合幾分鐘，然后以低密度接種在支持雜交細(xì)胞生長但不支持骨髓瘤細(xì)胞生長的選擇性培養(yǎng)基上。優(yōu)選的篩選技術(shù)使用HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶)進(jìn)行篩選。經(jīng)過足夠的時間，通常為大約1到2周之后，觀察到雜交體的集落。選出18單菌落并測試與多肽的結(jié)合活性。具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤是優(yōu)選的。本文公開的方法中考慮到了產(chǎn)生與HE4a多肽特異性結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤。單克隆抗體可以從生長的雜交瘤集落的上清液中分離。此外，各種不同的技術(shù)可以用于增加產(chǎn)率，例如將雜交瘤細(xì)胞系注射到適合的脊椎動物宿主例如小鼠或其它適合的宿主的腹膜腔中。然后可以從腹水液或血液中收獲單克隆抗體?？梢酝ㄟ^常規(guī)的技術(shù)例如層析、凝膠過濾、沉淀和抽提從抗體中除去污染物。例如，抗體可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過在固定化的蛋白G或蛋白A上進(jìn)行層析來純化。在某些實(shí)施方案中，使用抗體的抗原結(jié)合片段可能是優(yōu)選的。這樣的片段包括Fab片段，它可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備(例如通過用木瓜蛋白酶消化來產(chǎn)生Fab和Fc片段)。Fab和Fc片段可以通過親和層析(例如在固定化的蛋白A柱上)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來分離。這樣的技術(shù)在本
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中是眾所周知的，參見，例如Weir，D.M.,《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊》HandbookofExperimentalImmunology,1986，BlackwellScientific,Bostono利用與編碼各種不同效應(yīng)蛋白的序列按閱讀框架連接的DNA序列編碼的免疫球蛋白V區(qū)結(jié)構(gòu)域而對于預(yù)先選定的抗原具有特異結(jié)合親和性的多功能融合蛋白，在本
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中是已知的，例如在EP-B1-0318554、美國專利No.5,132,405、美國專利No.5,091,513和美國專利No.5,476,786中公開的那些。這樣的效應(yīng)蛋白包括多肽結(jié)構(gòu)域，其可以通過本
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的專業(yè)人員熟悉的各種技術(shù)中的任何一種用來檢測融合蛋白的結(jié)合，這些技術(shù)包括但不限于生物素模擬序列(參見，例如，Luo等，1998J.Biotechnol.65:225，在此引為參考)、用可檢測的標(biāo)記部分進(jìn)行的直接共價修飾、與特異性標(biāo)記的報告分子的非共價結(jié)合、可檢測的底物的酶法修飾或固定在(共價或非共價地)固相支持物上。用于本文公開的方法的單鏈抗體也可以通過例如噬菌體展示的方法來產(chǎn)生和篩選(參見例如美國專利No.5,223,409;Schlebusch等1997Hybridoma16:47;在此引為參考)。簡單來說，在該方法中，DNA序列被插入到絲狀噬菌體例如M13的基因III或基因VIII基因中。已經(jīng)開發(fā)了幾種用于插入的帶有多克隆位點(diǎn)的載體(McLafferty等，Gene128:29-36，1993;Scott和Smith,Science249:386-390，1990;Smith和Scott，MethodsEnzymol.217:228-257，1993)。插入的DNA序列可以隨機(jī)產(chǎn)生，或可以是結(jié)合HE4a多肽的已知結(jié)合結(jié)構(gòu)域的變異體。使用這種方法可容易地產(chǎn)生單鏈抗體。一般來說，插入片段編碼6到20個氨基酸。插入序列編碼的肽展示在噬菌體的表面上。表達(dá)了HE4a多肽的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體通過與結(jié)合固定化的HE4a多肽來進(jìn)行篩選，例如使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
中熟知的方法和本文公開的核酸編碼序列制備的重組多肽。未結(jié)合的噬菌體通過清洗液除去，清洗液一般含有10mMTris、lmMEDTA，并且不含鹽或含有低濃度的鹽。結(jié)合的噬菌體用例如含有鹽的緩沖液洗脫。NaCl的濃度逐步增加，直到所有的噬菌體都被洗脫。一般來說，以較高親和力結(jié)合的噬菌體將被較高的鹽濃度所釋出。將洗脫的噬菌體在細(xì)菌宿主中繁殖?？梢赃M(jìn)行附加輪次的篩選以選自幾個高親和力結(jié)合的噬菌體。然后測定結(jié)合的噬菌體中插入片段的DNA序列。一旦知道了結(jié)合肽的預(yù)測的氨基酸序列，就可以通過重組手段或合成來制備足夠的在本文中用作特異性針對HE4a多肽的抗體的肽。當(dāng)抗體以融合蛋白形式產(chǎn)生時使用重組的方法。肽也可以被產(chǎn)生成兩個或多個相似的或不相似肽的串聯(lián)排列，以最大化親和力或結(jié)合o為了檢測與特異性針對HE4a多肽的抗體反應(yīng)的抗原決定簇，檢測試劑一般為抗體，它可以按照本文的描述制備。對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員來說，使用抗體檢測樣品中的多肽已知有各種不同的分析方式，包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫熒光、免疫沉淀、平衡透析、免疫擴(kuò)散以及其它的技術(shù)。參見例如Harlow和Lane,《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊》Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory,1988;Weir，D.M.,《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊》HandbookofExperimentalImmunology,1986，BlackwellScientific,Boston。例如，分析可以用Western印跡的方式進(jìn)行，其中將來自生物樣品的蛋白制備物進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)哪ど喜⑹蛊渑c抗體反應(yīng)。然后可以使用適合的檢測試劑來檢測膜上抗體的存在，這是本
技術(shù)領(lǐng)域：
中熟知的并將在下面描述。在另一個實(shí)施方案中，分析包括使用固定在固相支持物上的抗體來結(jié)合靶HE4a多肽并將其從其余的樣品中取出。然后可以使用與獨(dú)特的HE4a多肽抗原性決定簇反應(yīng)的第二抗體，例如，含有可檢測的報告部分的試劑，來檢測結(jié)合的HE4a多肽。作為非限制性的例子，根據(jù)本實(shí)施方案，識別獨(dú)特的抗原性決定簇的固定抗體和第二抗體可以是本文描述的選自單克隆抗體2H5、3D8和4H4的任何兩種單克隆抗體。或者，可以使用競爭性分析，其中HE4a多肽用可檢測的報告部分標(biāo)記，并在將固定抗體與樣品孵育之后令其與固定HE4a多肽特異性抗體結(jié)合。樣品的成分對標(biāo)記的多肽與抗體的結(jié)合的抑制程度表明了樣品與固定抗體的反應(yīng)性，因此表明了樣品中HE4a的水平。固相支持物可以是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的可以結(jié)合抗體的任何材料，例如微量滴定板中的測試孔、硝酸纖維素濾膜或其它適合的膜?；蛘?，支持物可以是珠子或圓盤，例如玻璃、纖維玻璃、膠乳或塑料例如聚苯乙烯或聚氯乙烯?？贵w可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的各種不同的技術(shù)固定在固相支持物上，這些技術(shù)在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中有充分的描述。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測樣品中HE4a抗原多肽的分析方法是雙抗體夾心分析方法。該分析方法可以如下進(jìn)行，首先將固定在固相支持物、通常為微量滴定板的孔上的HE4a多肽特異性抗體(例如單克隆抗體如2H5、3D8或4H4)與生物樣品進(jìn)行接觸，從而使得樣品中21天然存在的并具有可與抗體反應(yīng)的抗原性決定簇的可溶性分子與固定抗體結(jié)合(例如在室溫下30分鐘的孵育時間一般就足夠了)以形成抗原-抗體復(fù)合物或免疫復(fù)合物。然后從固定的免疫復(fù)合物中除去未結(jié)合的樣品組分。接下來，加入特異性針對HE4a抗原多肽的第二抗體，其中第二抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)不會競爭性地抑制固定的第一抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)與HE4a多肽(例如，與固定在固相支持物上的單克隆抗體不同的單克隆抗體例如2H5、3D8或4H4)的結(jié)合。第二抗體可以按照本文提供的方法可檢測地標(biāo)記，以便它可以被直接檢測?；蛘?，第二抗體可以通過使用可檢測地標(biāo)記的第二(或"第二階段")抗-抗體、或通過本文提供的特異性檢測試劑間接地檢測。本文所述的方法不限于任何特定的檢測步驟，因?yàn)槭煜っ庖叻治龅娜藛T將會認(rèn)識到，在雙抗體夾心免疫分析中有大量的試劑和安排可用于免疫學(xué)檢測特定的抗原(例如間皮素多肽)。在使用上面描述的雙抗體夾心分析的本文所公開方法的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種特異性針對HE4a抗原多肽的固定抗體是多克隆抗體，第二種特異性針對HE4a抗原多肽的抗體是多克隆抗體。任何非競爭性HE4a抗體的組合都可以與本文所述的方法一起使用。包括單克隆抗體、多克隆抗體及其組合。在本文公開的方法的某些其它實(shí)施方案中，第一種特異性針對HE4a抗原多肽的固定抗體是單克隆抗體，第二種特異性針對HE4a抗原多肽的抗體是多克隆抗體。在本文所述方法的某些其它實(shí)施方案中，第一種特異性針對HE4a抗原多肽的固定抗體是多克隆抗體，第二種特異性針對HE4a抗原多肽的抗體是單克隆抗體。在本文所述方法的某些其它的高度優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種特異性針對HE4a抗原多肽的固定抗體是單克隆抗體，第二種特異性針對HE4a抗原多肽的抗體是單克隆抗體。例如，在這些實(shí)施方案中，應(yīng)該注意的是本文提供的單克隆抗體2H5、3D8和4H4識別HE4a多肽上不同的和非競爭性的抗原性決定簇(例如表位)，因此這些單克隆抗體的任何成對組合都可以使用。在本文所述方法的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種特異性針對HE4a抗原多肽的固定抗體和/或第二種特異性針對HE4a抗原多肽的抗體可以是本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的和本文提到的任何種類的抗體，作為說明性而非限制性的例子是Fab片段、F(ab')2片段、免疫球蛋白V區(qū)融合蛋白或單鏈抗體。熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人員將會認(rèn)識到，本文公開的方法包含了在本文公開和要求權(quán)利的方法中其它的抗體形式、片段、衍生物等的應(yīng)用。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二抗體可以含有可檢測的報告部分或標(biāo)記例如酶、染料、放射性核素、發(fā)光基團(tuán)、熒光基團(tuán)或生物素等。任何報告部分或標(biāo)記都可以與本文所述方法一起使用，只要其信號與清洗后保留在支持物上的抗體的量直接相關(guān)或成比例就行。然后使用適合于特定的可檢測的報告部分或標(biāo)記的方法確定仍然結(jié)合在固相支持物上的第二抗體的量。對于放射活性基團(tuán)來說，一般來說閃爍計(jì)數(shù)或放射自顯影方法是適合的?？梢允褂酶鞣N偶聯(lián)技術(shù)來制備抗體-酶偶聯(lián)物(綜述參見例如Scouten,W.H.，MethodsinEnzymology135:30-65,1987)。光譜方法可用于檢測染料(包括例如酶反應(yīng)的比色產(chǎn)物)、發(fā)光基團(tuán)和熒光基團(tuán)。生物素可以使用與不同的報告基團(tuán)(通常為放射活性或熒光基團(tuán)或酶)偶聯(lián)的親和素或鏈親和素來檢測。酶報告基團(tuán)一般可以通過加入底物(一般進(jìn)行特定的時間段)，然后對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行光譜、分光光度法或其它分析來檢測。標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)添加物可用于使用眾所周知的技術(shù)確定樣品中抗原的水平。在另一個實(shí)施方案中，本文所述方法包括使用本文提供的HE4a抗原多肽，通過檢測來自生物來源或?qū)ο蟮纳飿悠分械拿庖咛禺愋苑磻?yīng)性抗體來篩查惡性腫瘤病癥的存在。根據(jù)本實(shí)施方案，HE4a抗原多肽(或其包含本文提供的截短的HE4a抗原多肽的片段或變異體)被可檢測地標(biāo)記，并與生物樣品相接觸，以檢測樣品中以可溶形式天然存在的抗體與HE4a抗原多肽的結(jié)合。例如，可以使用本文公開的序列配合眾所周知的方法例如在體外翻譯過程中摻入易于檢測的(例如放射性標(biāo)記的)氨基酸、或者通過使用其它可檢測的報告部分例如在上面描述的那些，以生物合成來標(biāo)記HE4a抗原多肽。不希望受到理論的23束縛，本文所述方法的本實(shí)施方案考慮到了，本文公開的某些HE4a多肽例如HE4a融合多肽可以提供具有特定免疫原性的肽，因此產(chǎn)生了特異性的和可檢測的抗體。例如，根據(jù)該理論，某些HE4a融合多肽可以代表能夠喚起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)的"非自身"抗原，而缺少融合結(jié)構(gòu)域的HE4a多肽可能被免疫系統(tǒng)視為更類似"自身的"抗原，不容易引發(fā)體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。正如上面注意到的那樣，本文所述的方法部分涉及了令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，即可溶形式的HE4a抗原多肽在對象中天然存在，包括在患有某些癌癥的對象中這類可溶性的HE4a多肽的水平升高了。根據(jù)本文公開的方法，篩查惡性腫瘤病癥存在的方法可以通過在對象的生物樣品中檢測一個以上腫瘤相關(guān)標(biāo)記物來進(jìn)一步加強(qiáng)。因此，在某些實(shí)施方案中，本文所述方法提供了篩查的方法，該方法除了檢測天然存在的可溶性樣品成分與特異性針對HE4a抗原多肽的抗體的反應(yīng)性之外，還包括了使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的和本文提供的已建立的方法檢測至少一種惡性腫瘤病癥的其它可溶性標(biāo)記物。正如前面注意到的那樣，目前有許多可溶性腫瘤相關(guān)抗原可以在容易獲得的生物流體樣品中檢測到。例如，本文所述方法的某些實(shí)施方案涉及人類間皮素多肽，其包括多肽，例如新的可溶間皮素相關(guān)抗原(MRA)多肽，它們被描述在Scholler等(1999Proc.Nat.Acad.Sci.USA96:11531)以及也描述在美國專利No.6,770,445中。正如本文提供的那樣，"間皮素多肽"是可溶性的多肽，具有含有多肽序列EVEKTACPSGKKAREIDES(SEQIDNO:14)的氨基酸序列，此外還具有至少一個與至少一種具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體具有反應(yīng)性的抗原性決定簇，該抗體競爭性抑制MAbK-l(Chang等1996Proc.Nat.Acad.Sci.USA93:136;MAbK-1可以從例如SignetLaboratories,Inc.,Dedham,Mass.獲得)或在美國專利No.6,770,445中提供的單克隆抗體OV569、4H3、3G3或1A6的免疫特異性結(jié)合。因此，這些可根據(jù)本文所述方法應(yīng)用的額外的可溶性腫瘤相關(guān)抗原可以包括但不必限于間皮素和間皮素相關(guān)抗原、CEA、CA125、唾液酸化TN、SCC、TPS和PLAP(參見例如Bast等，1983N.Eng.J.Med.309:883;Lloyd等，1997Int.J.Cane.71:842;Sarandakou等，1997ActaOncol.36:755;Sarandakou等，1998Eur.J.Gynaecol.Oncol.19:73;Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):2945;Kudoh等，1999Gynecol.Obstet.Invest.47:52;Ind等，1997Br.J.Obstet.Gynaecol.104:1024;Bell等，1998Br.J.Obstet.Gynaecol.105:1136;Cioffi等，1997Tumori83:594;Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):2949;Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):3019)，還可以包括任何已知的標(biāo)記物，所述標(biāo)記物在生物樣品中的存在可以與本文提供的至少一種惡性腫瘤病癥的存在相關(guān)聯(lián)。或者，編碼HE4a多肽的核酸序列可以使用標(biāo)準(zhǔn)的雜交和/或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)來檢測。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文提供的HE4a的cDNA序列來設(shè)計(jì)適合的探針和引物。分析一般來說可以使用從生物來源獲得的各種樣品中的任何一種來進(jìn)行，這些生物來源例如真核細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、從這些生物體制備的提取物以及在活生物體中發(fā)現(xiàn)的流體。實(shí)施例一般方法在實(shí)施例中使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的，描述在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch,E.F.和Maniatis,T.的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,(1989)(Maniatis)和T.J.Silhavy，M.L.Bennan，和L.W.Enquist的《基因融合實(shí)驗(yàn)》ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1984)以及Ausubel，F(xiàn).M.等的《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版(1987)中。縮寫的意義如下"h"表示小時，"min"表示分鐘，"sec"表示秒，"d"表示天，"mL"表示毫升，"L"表示升，"U"表示單位，"pM"表示皮摩爾?，F(xiàn)在將參考下面的實(shí)施例對本公開的主題進(jìn)行描述。提供這些實(shí)施例的目的僅僅是為了說明，主題不限于這些實(shí)施例，而是應(yīng)該包括明顯是本文提供的指導(dǎo)的結(jié)果的所有變化。實(shí)施例1開發(fā)使用新的血清腫瘤標(biāo)記物的多標(biāo)記物分析方法用于檢測卵巢癌在美國，所有女性中有20%將被診斷出有附件腫塊或囊腫，其中有一小部分表現(xiàn)為惡性。卵巢癌通過外科手術(shù)進(jìn)行分期，研究顯示，由婦科腫瘤醫(yī)生進(jìn)行手術(shù)的患者比由非婦科腫瘤醫(yī)生進(jìn)行手術(shù)的患者更常得到適當(dāng)?shù)姆制诤腿コ[塊。CA125腫瘤標(biāo)記物可幫助預(yù)測哪些有骨盆腫塊的患者可能患有卵巢癌。但是，許多良性婦科癥狀也能升高CA125，這降低了它的特異性。需要更精確的檢測來幫助對這些患者進(jìn)行分診，以集中專門經(jīng)驗(yàn)來治療該疾病。本方法應(yīng)用幾種新的腫瘤標(biāo)記物以開發(fā)了多標(biāo)記物分析方法，用于預(yù)測卵巢癌的風(fēng)險并幫助婦科腫瘤醫(yī)生對有骨盆腫塊的患者分診。現(xiàn)在描述在本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)中使用的方法。這是一項(xiàng)IRB批準(zhǔn)的前瞻性試驗(yàn)。在獲得知情同意書后，從要接受附件腫塊手術(shù)的女性中在手術(shù)前獲得血清樣品，并分析CA125、SMRP、HE4、CA72-4和骨橋蛋白的水平。所有的病理結(jié)果與腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行了比較。對于每種單獨(dú)的標(biāo)記物以及這些標(biāo)記物的所有組合估算了對數(shù)回歸模型。進(jìn)行交叉驗(yàn)證分析以獲得在95%和98%特異性下26的靈敏度?，F(xiàn)在描述從本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果。分析了179位患者50例卵巢癌(14例I期)和129例良性卵巢腫塊。在良性腫塊和癌癥之間HE4、SMRP、CA125和CA72-4的值都不相同。組合所有的標(biāo)記物，HE4、SMRP和CA125保持有預(yù)測性，AUC為92%。當(dāng)在95%的特異性下對所有可能的標(biāo)記物組合進(jìn)行比較時，CA125和HE4的組合具有最高的靈敏度，為74.5Q/。。向CA125加入HE4將測試的靈敏度增加了7.4%。這些數(shù)據(jù)概括在表l中。表1組別交叉驗(yàn)證的靈敏度95%特異性98%特異性單獨(dú)CA12566%36%HE468%51%SMRP31%25%CA72-425%23%骨橋蛋白14%4%與CA125的組合CA125+HE474%68%CA125+SMRP57%46%CA125+CA72-463%51%CA125+骨橋蛋白66%38%最佳的3種CA125+HE4+CA72470%66%最佳的4種CA125+HE4+CA724+SMRP66%66%所有CA125+HE4+CA72-4+SMRP+骨橋蛋白66%63%27實(shí)施例2下面是在本實(shí)施例中使用的方法。血清和尿樣經(jīng)過同意后在手術(shù)前獲得。尿液也從手術(shù)前沒用的導(dǎo)管插入術(shù)樣品中收集。收集30mL的全血樣品和大于10mL的尿樣。全血被收集在三個10mL的血清分離管(SST)中。將SST管離心、分離，在收集后3個小時內(nèi)將上清液冷凍在-80。C。將10mL尿樣收集到或轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)挠糜谶\(yùn)輸和儲存的試管中，也在收集的當(dāng)天冷凍在-80。C。血清和尿樣成批運(yùn)送到Fujirebio診斷實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn)和長期儲存。分析了下列血清腫瘤標(biāo)記物的水平CA125、HE4、SMRP、CA72-4、激活素、抑制素和骨橋蛋白的水平以及尿SMRP。手術(shù)后，對所有患者的病理報告進(jìn)行瀏覽，并分類成良性或惡性。惡性腫瘤的組織學(xué)類型和良性疾病的具體診斷也被記錄，所有患有卵巢癌的患者的疾病階段也被記錄。所有的腫瘤標(biāo)記物與最終的病理學(xué)結(jié)果進(jìn)行比較。如果合適，使用t-檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)在患有良性疾病和患有癌癥的患者之間比較平均值和中值。也進(jìn)行了僅比較患有I期癌癥患者和患有良性疾病患者的亞組分析。對于每種單獨(dú)的標(biāo)記物以及標(biāo)記物的所有組合估算了對數(shù)回歸模型。進(jìn)行了交叉驗(yàn)證分析，以獲得每個單獨(dú)的標(biāo)記物以及標(biāo)記物的組合在90%、95%和98%特異性下的靈敏度。對于I期亞組也進(jìn)行了靈敏度分析。下面是本實(shí)施例的結(jié)果。征集了244名有附件腫塊的患者。排除了兩位在手術(shù)前沒有獲得血清的女性和排除了7位被發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處的原發(fā)性癌癥的轉(zhuǎn)移癌的女性。因此235位患者對于分析來說是合格的。這些女性的病理學(xué)結(jié)果表明有69例卵巢癌(14例I期)和166例良性卵巢腫塊?；加泻臀椿加袗盒阅[瘤的患者的年齡分布顯示在表2中，患有癌癥的患者意料之內(nèi)地比患有良性疾病的患者年齡大。在患有良性疾病的女性中發(fā)現(xiàn)的準(zhǔn)確診斷顯示在表3中。最常見的診斷是良性囊腺瘤或囊腺纖維瘤，占患有良性疾病的女性的大約三分之一。卵巢癌的組織學(xué)和階段分布顯示在表4中。與卵巢癌的流行病學(xué)一致，大部分的女性(71%)有血清腫瘤并被發(fā)現(xiàn)患有III期疾病(67%)。在良性腫塊和癌癥之間，HE4、SMRP、CA125、CA72-4、活化素和抑制素的平均值和中值都明顯不同。骨橋蛋白的水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)有明顯的差別。該數(shù)據(jù)顯示在表5中。然后對于所有的個體標(biāo)記物以及標(biāo)記物組合計(jì)算了在卯％、95%和98%特異性下的靈敏度如表6所示。CA125和HE4是最好的惡性腫瘤的個體預(yù)測因子。正如在表1.5中顯示的那樣，它們彼此之間不緊密相關(guān)，表明它們識別不同的疾病亞群。當(dāng)對可能的標(biāo)記物組合進(jìn)行比較時，CA125和HE4的組合在特異性設(shè)置為95。/。時靈敏度最高，為77。/。。包含其它的標(biāo)記物不明顯地增加靈敏度。表1.5ROC曲線AUCHE4a(AUC)CA-125(AUC)p-值良性對子宮內(nèi)膜癌79%54%<0扁良性對I期卵巢癌76%48%<0扁良性對II期卵巢癌88%69%0.253良性對III期卵巢癌86%66%0逮良性對IV期卵巢癌86%66%0扁然后進(jìn)行了僅比較患有I期疾病和患有良性疾病的患者的亞組分析。平均值和中值顯示在表7中。在卵巢癌患者和良性疾病患者之間HE4、CA125和SMRP明顯不同。在不同的特異性設(shè)置下靈敏度顯示29在表8中。HE4是最靈敏的單個標(biāo)記物，在95y。特異性下靈敏度為50%。加入CA125或任何其它的標(biāo)記物，沒有明顯地增加檢測I期疾病的靈敏度。表2在病例和良性例中的年齡分布<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表3在良性疾病中的診斷分布<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實(shí)施例3下面是本實(shí)施例中使用的方法。數(shù)據(jù)從兩個研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行的兩項(xiàng)獨(dú)立的IRB批準(zhǔn)的前瞻性試驗(yàn)獲得。在獲得知情同意書之后，從要接受附件腫塊外科手術(shù)的女性中在手術(shù)前獲得血清樣品，并分析CA125、SMRP、HE4和CA72-4的水平。所有的病理結(jié)果與腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行了比較。對于每種單獨(dú)的標(biāo)記物以及所有2、3和4種標(biāo)記物的組合使用對數(shù)回歸確定了卯％、95%和98%的設(shè)定特異性下的靈敏度。下面是本實(shí)施例的結(jié)果。分析了448份樣品。其中有267例良性病例和181例卵巢癌(27例I期、20例II期、U5例III期和19例IV期)。在良性腫塊和癌癥之間HE4、SMRP、CA125和CA72-4的中值都明顯不同(p<0.001)。在良性腫塊和I期惡性腫瘤的鑒別中，在CA125中加入HE4在90%的特異性下將靈敏度增加了22.2%。HE4和CA125的組合對于所有的階段都優(yōu)于單獨(dú)使用HE4或CA125(p<0.003)。這里的結(jié)果概述在表9中。34表9<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>在本文中引用的每個專利、專利申請和出版物的公開內(nèi)容在此以其全文引為參考。盡管己經(jīng)參考具體的實(shí)施方案公開了本發(fā)明的主題，但是顯然本
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的其它專業(yè)人員可以設(shè)計(jì)出其它的實(shí)施方案和變化，而不背離本文描述的主題的真實(shí)精神和范圍。隨附的權(quán)利要求包含了所有這樣的實(shí)施方案和等同的變化。權(quán)利要求1.評估患者是否患有卵巢癌的方法，該方法包括在從患者獲得的樣品中評估至少兩種標(biāo)記物，包括HE4標(biāo)記物和選自SMRP、CA125和CA72-4的另一種標(biāo)記物，其中標(biāo)記物的水平升高與患者患有卵巢癌的可能性增加相關(guān)。2.權(quán)利要求l中的方法，其中所述患者表現(xiàn)骨盆腫塊。3.權(quán)利要求l中的方法，包括評估HE4和CA125標(biāo)記物。4.權(quán)利要求l中的方法，包括評估HE4和SMRP標(biāo)記物。5.辨別患者中的骨盆腫塊是良性的還是卵巢癌的方法，該方法包括在從患者獲得的樣品中評估至少兩種標(biāo)記物，包括HE4標(biāo)記物和選自SMRP、CA125和CA72-4的另一種標(biāo)記物，其中標(biāo)記物的水平升高與骨盆腫塊是卵巢癌的可能性增加相關(guān)。6.權(quán)利要求5中的方法，包括評估HE4和CA125標(biāo)記物。7.權(quán)利要求5中的方法，包括評估HE4和SMRP標(biāo)記物。8.評估患有卵巢癌的患者對治療的反應(yīng)的方法，該方法包括在治療過程的不同時間從患者獲得的樣品中評估至少兩種標(biāo)記物，包括HE4標(biāo)記物和選自SMRP、CA125和CA72-4的另一種標(biāo)記物，其中在后來的時間標(biāo)記物的水平降低表明患者對治療有反應(yīng)。9.權(quán)利要求8中的方法，包括評估HE4和CA125標(biāo)記物。10.權(quán)利要求8中的方法，包括評估HE4和SMRP標(biāo)記物。11.權(quán)利要求8中的方法，其中所述治療是腹膜內(nèi)化療。12.權(quán)利要求8中的方法，其中所述治療包括對患者施用與CA125特異性結(jié)合的抗體。13.在已經(jīng)進(jìn)行了卵巢癌治療的患者中評估復(fù)發(fā)的方法，該方法包括在從治療后的患者獲得的樣品中評估至少兩種標(biāo)記物，包括HE4標(biāo)記物和選自SMRP、CA125和CA72-4的另一種標(biāo)記物，其中標(biāo)記物的水平升高表明卵巢癌在患者中復(fù)發(fā)。14.權(quán)利要求13中的方法，其中在治療后對標(biāo)記物進(jìn)行多次評估，其中標(biāo)記物的水平增加表明卵巢癌在患者中復(fù)發(fā)。15.權(quán)利要求13中的方法，包括評估HE4和CA125標(biāo)記物。16.權(quán)利要求13中的方法，包括評估HE4和SMRP標(biāo)記物。17.權(quán)利要求13中的方法，其中所述治療是腹膜內(nèi)化療。18.權(quán)利要求13中的方法，其中所述治療包括對患者施用與CA125特異性結(jié)合的抗體。19.評估患者將發(fā)展卵巢癌的可能性的方法，該方法包括在從患者獲得的樣品中評估至少兩種標(biāo)記物，包括HE4標(biāo)記物和選自SMRP、CA125和CA72-4的另一種標(biāo)記物，其中標(biāo)記物的水平升高與患者將發(fā)展卵巢癌的可能性增加相關(guān)。20.權(quán)利要求19中的方法，包括評估HE4和CA125標(biāo)記物。21.權(quán)利要求20中的方法，其中所述患者表現(xiàn)正常的CA125標(biāo)記物水平，而HE4標(biāo)記物的水平升高與患者將發(fā)展卵巢癌的可能性增加相關(guān)。22.權(quán)利要求19中的方法，包括評估HE4和SMRP標(biāo)記物。23.在患有卵巢癌的患者中對腫瘤進(jìn)行分期的方法，該方法包括在從患者獲得的樣品中評估至少兩種標(biāo)記物，包括HE4標(biāo)記物和選自SMRP、CA125和CA72-4的另一種標(biāo)記物，其中標(biāo)記物的水平升高與更晚期的卵巢癌階段相關(guān)。24.在患有卵巢癌的患者中對腫瘤進(jìn)行分級的方法，該方法包括在從患者獲得的樣品中評估至少兩種標(biāo)記物，包括HE4標(biāo)記物和選自SMRP、CA125和CA72-4的另一種標(biāo)記物，其中標(biāo)記物的水平升高與更高等級的卵巢癌相關(guān)。全文摘要本發(fā)明涉及HE4/HE4a標(biāo)記物與一種或多種其它標(biāo)記物一起在評估患者的卵巢癌中的應(yīng)用。文檔編號C12Q1/25GK101460630SQ200780007130公開日2009年6月17日申請日期2007年1月4日優(yōu)先權(quán)日2006年1月4日發(fā)明者伊麗莎白·薩默斯,理查德·摩爾申請人:富士瑞必歐美國公司