專利名稱：核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reactin: PCR)所得多核普
酸產(chǎn)物進行實時檢測的裝置。
背景技術(shù)：
PCR是對DNA鏈進行復(fù)制的循環(huán)性酶反應(yīng)，其出于以下原因能夠?qū)ψ?為目標的目標序列分子進行指數(shù)函數(shù)式的擴增將在先循環(huán)中復(fù)制的PCR 產(chǎn)物(核酸擴增產(chǎn)物)用作在后循環(huán)的模板。在實時PCR中，例如使用相干 的兩種熒光染料標記的序列特異性探針(TaqMan探針)，用激發(fā)光照射PCR 產(chǎn)物，激起熒光并測定熒光強度，從而對PCR產(chǎn)物的擴增進行實時監(jiān)測。
而且，當用于定量時，對于已知樣品擴增曲線的指數(shù)函數(shù)擴增范圍設(shè) 定閾值(圖7的(6))，然后計算出該閾值與擴增曲線的交點(閾值循環(huán)數(shù)Ct， 圖7的(8))。當以Log值的形式來表示初期DNA量時，該閾值循環(huán)數(shù)Ct與 檢測樣品的初期DNA量之間存在線性關(guān)系，可以制作出表示該線性關(guān)系的 校正曲線。以該校正曲線為基準可以推知檢測樣品的初期DNA量。這樣， 就能夠基于PCR的擴增速度理論進行準確的定量。
在這里，由于實際的PCR效率不是100%，擴增出的PCR產(chǎn)物的濃度 可以以式(l)表示。=[DNA]0(l+e)c: PCR產(chǎn)物的濃度q:目標模板的初期濃度
e:平均PCR效率
c:循環(huán)數(shù)
即，如果平均PCR效率e為100%(即，上式(l)中e=l)，則PCR產(chǎn)物的 濃度[DNA]為2的循環(huán)數(shù)次方，呈指數(shù)函數(shù)式地擴增。然而，在循環(huán)的初期、 中期和后期，效率e逐漸降低，擴增曲線為圖7所示的狀況。圖7的橫軸為 循環(huán)數(shù)、縱軸為熒光強度，循環(huán)初期以指數(shù)函數(shù)的形式擴增(圖7的(5)),循
環(huán)中期以線性函數(shù)的形式擴增(圖7的(6))，而循環(huán)后期則由于平臺效應(yīng)而不 再擴增(圖7的(7))。
而且，引起平臺效應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)方面的因素如下。
-dNTP和引物的水解
.DNA聚合酶(生產(chǎn)模板拷貝的DNA合成酶)的熱失活
單鏈PCR片段的復(fù)性引起的引物退火效率降低
-非特異性PCR產(chǎn)物的竟爭因素
.焦磷酸酯等PCR抑制物的積累
DNA聚合酶的外切酶活性引起的PCR產(chǎn)物水解
因此，實時PCR的前提條件是在上式(1)的關(guān)系成立的指數(shù)函數(shù)擴增范. 圍內(nèi)進行測定(專利文獻1)。 專利文獻l:特表2005-516630號公報 專利文獻2:專利第2909216號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題
此外，作為實時PCR中使用的反應(yīng)容器， 一般使用稱作微孔板的具有 多個孔(由凹陷構(gòu)成的反應(yīng)區(qū)，例如96個)的容器。雖然向各孔中分加了一 定初期DNA濃度的反應(yīng)溶液，但由于裝置方面的下述誤差因素，反應(yīng)容器 的各個孔的擴增曲線存在偏差。
'光學(xué)系統(tǒng)的誤差
*校正溶液的濃度誤差
-才交正溶液的分加誤差
反應(yīng)容器的蓋或封口膜的光透過性誤差
-反應(yīng)容器的污染誤差
-反應(yīng)溶液的分加誤差
這里，由于價格低廉的關(guān)系，下述方法成為給反應(yīng)容器(微孔板)的孔加 蓋的主流方法在反應(yīng)容器的 一面的整個區(qū)上粘貼帶有粘合劑的前述封口 膜。而且，激發(fā)光通過封口膜照射到各孔，PCR產(chǎn)物(反應(yīng)產(chǎn)物)發(fā)出的焚光 也是通過封口膜才被CCD相機等光檢測部檢測到(這些構(gòu)成裝置的光學(xué)系 統(tǒng))。這樣，雖然封口膜、反應(yīng)容器本體構(gòu)成了焚光強度測定方面的光學(xué)系
統(tǒng)的重要要素，但是，這些均屬易耗品，很難指望它們具有均一且高精度 的光學(xué)性能。
圖4為光檢測部所檢測到的PCR前的反應(yīng)容器的實際圖像。從整體來 看，反應(yīng)容器的孔的周圍是黑色的，但是，作為背景的該圖像各像素的亮 度(背景熒光強度)卻并非一定，如該圖的(l)中所示，由于光學(xué)系統(tǒng)的污染、
雜散光(迷走光)等出現(xiàn)了斑點。如果開始PCR反應(yīng)，則該斑點會如圖5的(2) 中所示那樣，與孔部分的圖像(圖5中顯示為圓形的96個圖像)重疊，而被 孔本體的熒光強度拉長。
因而，傳統(tǒng)上，首先準備未裝入DNA的空反應(yīng)容器，對于各個孔，分 別測定空孔狀態(tài)的熒光強度，將其作為標準校正值進行存儲。然后，通過 進行如下的校正處理，進行這樣的光學(xué)系統(tǒng)的校正，所述校正處理為從 實際熒光強度的測定值中減去存儲的校正值。然而，歸因于空反應(yīng)容器污 染的誤差是各反應(yīng)容器固有的，存在的問題是當使用被認定為標準的來 自其它空反應(yīng)容器的校正值時，在測定值方面會產(chǎn)生誤差。
此外，在專利文獻2中，使用第2熒光信號對第1熒光信號進行修正， 然而，除了本來必須測定的發(fā)出第1熒光的溶液之外，還必須再加上發(fā)出 參照用的第2熒光的溶液，這樣不但操作復(fù)雜，而且成本激增。此外，必 須非常高精度地分注發(fā)出第2熒光的溶液并高精度地進行測定，才能有效 果。此外，還存在的問題是為測定第2熒光必須安裝特殊的濾光器(光學(xué) 7 4A夕)，還有獲取和處理數(shù)據(jù)需要相當長的時間，例如每次測定均需要 交替使用發(fā)出第1熒光溶液用濾光器和發(fā)出第2焚光溶液用濾光器。
本發(fā)明是為了解決這些傳統(tǒng)技術(shù)上的問題而完成的，其目的是提供一 種核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置，該核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置能夠有效地 排除或降低裝置上的誤差因素，而不使用用于修正的第2焚光信號。 解決問題的方法
權(quán)利要求1的發(fā)明的裝置對多個反應(yīng)區(qū)實施溫度循環(huán)，對各反應(yīng)區(qū)中 的來自核酸擴增產(chǎn)物的熒光強度進行實時檢測，其中，通過檢測得自反應(yīng) 區(qū)的熒光測定值[DNA]raw和得自該反應(yīng)區(qū)附近的反應(yīng)區(qū)外區(qū)域的熒光測定 值[DNA]bg、并從熒光測定值[DNA]raw中減去熒光測定值[DNA]bg來確定 該反應(yīng)區(qū)的焚光強度[DNA]rea。
權(quán)利要求2的發(fā)明的裝置，其特征在于在上述發(fā)明中，熒光測定值bg為得自反應(yīng)區(qū)附近的多個反應(yīng)區(qū)外區(qū)域的熒光測定值的簡單平均、 或者經(jīng)過指定加權(quán)后的平均值。
權(quán)利要求3的發(fā)明的裝置，其特征在于在上述各發(fā)明中，在每次檢 測焚光測定值[DNA]raw時，檢測熒光測定值[DNA]bg，從該熒光測定值 [DNA]raw中減去熒光測定值[DNA]bg，這樣來確定熒光強度[DNA]real。
權(quán)利要求4的發(fā)明的裝置對多個反應(yīng)區(qū)實施溫度循環(huán)，實時檢測各反 應(yīng)區(qū)中的來自核酸擴增產(chǎn)物的熒光強度，其中，對于每個溫度循環(huán)的從各 反應(yīng)區(qū)得到的熒光強度[DNA]n(第n個循環(huán)的熒光強度)，使用該熒光強度 [DNA]n的最大值或與之相關(guān)的值[DNA]max進行標準化，對于使用該標準 化的熒光強度[DNA]nN繪制的擴增曲線的指數(shù)函數(shù)擴增區(qū)設(shè)定閾值Th，由 此來計算出閾值循環(huán)數(shù)Ct。
權(quán)利要求5的發(fā)明的裝置，其特征在于在上述發(fā)明中，通過用每個 反應(yīng)區(qū)的熒光強度[DNA]n除以下述值來計算出熒光強度[DNA]nN，其中， 所述值為最大值或與之相關(guān)的值[DNA]max、或者將[DNA]max加上作為 比較對象的反應(yīng)區(qū)共有的值而得的值。
權(quán)利要求6的發(fā)明的裝置，其特征在于在權(quán)利要求4或權(quán)利要求5 中，從各反應(yīng)區(qū)的熒光強度[DNA]n及最大值或與之相關(guān)的值[DNA]max中 減去指數(shù)函數(shù)擴增區(qū)以前的熒光強度[DNA]base ，這樣來繪制擴增曲線。
發(fā)明的效果
本發(fā)明中，在對多個反應(yīng)區(qū)實施溫度循環(huán)、實時檢測來自各反應(yīng)區(qū)中 的核酸擴增產(chǎn)物的熒光強度的核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置中，檢測得自反 應(yīng)區(qū)的熒光測定值[DNA]raw和得自該反應(yīng)區(qū)附近的反應(yīng)區(qū)外區(qū)域的焚光測 定值[DNA]bg，從該焚光測定值[DNA]raw中減去焚光測定值[DNA]bg，由 此來確定該反應(yīng)區(qū)的焚光強度[DNA]real，因此，對于每個反應(yīng)區(qū)，能夠分 別獲得該反應(yīng)區(qū)的核酸擴增產(chǎn)物固有的焚光強度[DNA]real，其中扣除了歸 因于該反應(yīng)區(qū)及其周圍的光透過性誤差、污染、雜散光的背景焚光強度。 這樣一來，可以實現(xiàn)準確的擴增曲線的制作和定量化。這種情況下，不需 要使用第2熒光信號，因此，不會造成成本增加或操作困難，數(shù)據(jù)的獲取 和處理所需的時間也會縮短。
在權(quán)利要求2的發(fā)明中，在上述發(fā)明的基礎(chǔ)上，焚光測定值[DNA]bg 為得自反應(yīng)區(qū)附近的多個反應(yīng)區(qū)外區(qū)域的熒光測定值的簡單平均、或者進 行了指定加權(quán)后的平均值，因此，可以更準確地計算出背景熒光強度，高
精度地進行熒光強度[DNA]real的確定。
在權(quán)利要求3的發(fā)明中，在上述各發(fā)明的基礎(chǔ)上，在每次檢測熒光測 定值[DNA]raw時，檢測焚光測定值[DNA]bg ，并且從該熒光測定值 [DNA]raw中減去焚光測定值[DNA]bg，這樣來確定熒光強度[DNA]real,因 此，即使反應(yīng)中背景熒光強度有變化， 一般也可以實時且精度良好地獲得 核酸擴增產(chǎn)物固有的熒光強度[DNA]real 。
權(quán)利要求4的發(fā)明中，在對多個反應(yīng)區(qū)實施溫度循環(huán)、實時檢測來自 各反應(yīng)區(qū)中的核酸擴增產(chǎn)物的焚光強度的核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置中， 對于每次所述溫度循環(huán)，測定從各反應(yīng)區(qū)得到的焚光強度，第n次溫度循 環(huán)的從各反應(yīng)區(qū)得到的焚光強度記作熒光強度[DNA]n，對于每一個焚光強 度[DNA]n，使用這些焚光強度[DNA]n的最大值或與之相關(guān)的值[DNA]max 進行標準化，對于使用該標準化的熒光強度[DNA]nN繪制的擴增曲線的指 數(shù)函數(shù)擴增區(qū)設(shè)定閾值Th，由此計算出閾值循環(huán)數(shù)Ct，因此，可以校正光 學(xué)系統(tǒng)的誤差、校正溶液的濃度誤差、校正溶液的分加誤差、反應(yīng)溶液的 分加誤差等裝置方面的誤差因素等引起的各反應(yīng)區(qū)熒光強度的偏差，并使 之降低，能夠計算出高準確度的閾值循環(huán)數(shù)Ct。
權(quán)利要求5的發(fā)明中，在上述的基礎(chǔ)上，通過用每個反應(yīng)區(qū)的熒光強 度[DNA]n除以下述值來計算出熒光強度[DNA]nN，其中，所述值為最大 值或與之相關(guān)的值[DNA]max、或者將其加上作為比較對象的對反應(yīng)區(qū)而言 共有的值而得的值，這樣抑制了標準化的效果，充分確保了閾值處的校正 效果，使循環(huán)中期至后期的擴增曲線與實際數(shù)據(jù)相近似，能夠容易地對裝 置方面誤差因素以外的因素引起的數(shù)據(jù)的行為進行把握。
在權(quán)利要求6的發(fā)明中，在權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的基礎(chǔ)上，從各 反應(yīng)區(qū)的熒光強度[DNA]n及最大值或與之相關(guān)的值[DNA]max中減去指數(shù) 函數(shù)擴增區(qū)以前的焚光強度[DNA]base,來繪制擴增曲線，因此，能夠把握 來自反應(yīng)區(qū)的核酸擴增產(chǎn)物本身的熒光強度狀況，而排除反應(yīng)區(qū)的反應(yīng)溶 液本身發(fā)出的熒光的強度。


圖1:本發(fā)明的實施方式的實時檢測裝置的結(jié)構(gòu)圖。
圖2:構(gòu)成圖1的實時檢測裝置的反應(yīng)檢測裝置的豎直剖面圖。
圖3:圖2的反應(yīng)檢測裝置的水平剖面圖。
圖4:顯示反應(yīng)容器的背景熒光強度狀態(tài)的圖。
圖5:顯示反應(yīng)后的熒光強度狀態(tài)的圖。
圖6:顯示反應(yīng)后的熒光強度狀態(tài)的另一個圖。
圖7:某個孔的DNA擴增曲線。
圖8:全部孔的DNA擴增曲線。
圖9:對圖8的數(shù)據(jù)進行了標準化時的DNA擴增曲線。
圖10:對圖8的數(shù)據(jù)進行了不完全標準化時的DNA擴增曲線。
圖11:構(gòu)成圖1的實時檢測裝置的處理裝置的功能區(qū)塊圖。
發(fā)明的
具體實施例方式
以下，基于附圖對本發(fā)明的實施方式進行詳述。 實施方式1
圖1為本發(fā)明實施方式的實時檢測裝置R的結(jié)構(gòu)圖，圖2為構(gòu)成圖1 的實時檢測裝置R的反應(yīng)檢測裝置1的豎直剖面圖，圖3為反應(yīng)檢測裝置1 的水平剖面圖。本發(fā)明的實時檢測裝置R包括反應(yīng)檢測裝置1和處理裝置 C，所述處理裝置C包括對來自反應(yīng)檢測裝置1的檢測數(shù)據(jù)進行實時處理的 計算機。
實施方式的反應(yīng)檢測裝置1是這樣的裝置其在對作為反應(yīng)樣品的染 色體DNA進行擴增的同時，通過光學(xué)測定方法對與該擴增相關(guān)的反應(yīng)狀態(tài) 進行檢測。該反應(yīng)檢測裝置1具備上面形成有反應(yīng)室4的本體3、以及設(shè)置 于該反應(yīng)室4的后方、本體3的上面的反應(yīng)檢測部5。而且，該反應(yīng)室4中 設(shè)置有由鋁等傳熱材料形成的反應(yīng)區(qū)塊(反応:/口 y夕)6。該反應(yīng)區(qū)塊6中 形成有用于保持反應(yīng)容器7的多個保持穴8，所述反應(yīng)容器7具有多個孔 7A' ,所述孔7A' 的內(nèi)部收納有由DNA(目標模板XDNA等)、各種試劑、 作為基質(zhì)的溶液等混合而成的反應(yīng)溶液。
在本實施方式中使用的反應(yīng)容器7是微孔板，其中， 一體式地形成有 縱向12個x橫向8個共96個作為反應(yīng)區(qū)的孔7A' ，各孔7A"通過連接壁 (孔7A(反應(yīng)區(qū))夕卜的區(qū)域、即反應(yīng)區(qū)外區(qū)域)連接。而且，作為反應(yīng)容器，孔
并非僅限于一體化成形的制品，其還可以由多根管構(gòu)成。此外，該孔7A的 個數(shù)并不限于此，除此之外，還可以由例如384個一體式地構(gòu)成，其操作 性好。此外，反應(yīng)容器7的各孔7A，其上面形成有開口，該上面開口貼合 有密封材料(、二 一>)制的蓋9,以阻止因溫度處理而引起的反應(yīng)溶液的蒸發(fā)。 此外，在本實施方式中，熒光強度檢測是透過該蓋9進行檢測的，因此使 用光透過性的合成樹脂材料。
而且，在該本體2內(nèi)具有對反應(yīng)區(qū)塊6進行加熱、冷卻的佩爾捷元件 10。而且，通過利用未圖示的控制裝置對該佩爾捷元件IO進行溫度控制， 對反應(yīng)區(qū)塊6循環(huán)式地進行加熱、冷卻，這樣，可以對反應(yīng)容器7的各孔 7A內(nèi)的DNA(反應(yīng)樣品)進行培養(yǎng)(擴增)。
在從設(shè)置于本體2后端上面的反應(yīng)檢測部5到另一端(本實施方式中是 形成有反應(yīng)室4的本體2前端上方)的范圍內(nèi)設(shè)置暗室結(jié)構(gòu)部12。該暗室結(jié) 構(gòu)部12的前面向前方開放，而且，在該前面開口形成向前下方傾斜的所述 擋蓋2,并使該擋蓋2開閉自如。而且，該擋蓋2的結(jié)構(gòu)使其可以通過在暗 室結(jié)構(gòu)部12的前方即本體3上面前部到該暗室結(jié)構(gòu)部12內(nèi)后部的范圍內(nèi) 形成的軌道部件13前后移動，當處于移動至后方的狀態(tài)時，該擋蓋2被收 納于暗室結(jié)構(gòu)部12內(nèi)。
而且，在該擋蓋2內(nèi)，在該擋蓋2閉合的狀態(tài)下，與反應(yīng)室4的反應(yīng) 區(qū)塊6相對地一體設(shè)置按壓部件15,該按壓部件15可以自由移動，其用于 將反應(yīng)容器7按在反應(yīng)區(qū)塊6。該按壓部件15是由導(dǎo)熱性良好的鋁材等構(gòu) 成的板材，其上與各孔7A的上面相對應(yīng)地形成多個透孔(透孔)。
而且，在該按壓部件15的上面一側(cè)(上側(cè))設(shè)置有作為光學(xué)透鏡的菲涅 耳透鏡21。該菲涅耳透鏡21通常是在平面上形成有多個溝，以此來折射、 放大(拡大)入射光。此時，菲涅耳透鏡21在折射、放大入射光時，具有將 入射光收斂為平行或接近平行的狀態(tài)并使之透過的光學(xué)特性，由此，入射 光在進行投射時，處于將各光路的離散加以修正后的狀態(tài)。
另一方面，在反應(yīng)區(qū)塊6的上方，在構(gòu)成封閉反應(yīng)室4的前上方的擋 蓋2的反應(yīng)室4一側(cè)的面上，設(shè)置有反射板22。本實施方式中的反射板22 由鏡子等構(gòu)成，所述鏡子等由平板構(gòu)成，具體而言，其將后述的光源燈23 發(fā)出的光反射(屈曲)向菲涅耳透鏡21 。
其它方面，在反應(yīng)檢測部5內(nèi)具備光源燈23、具備多個帶通濾光器(克
里斯欣森濾光器，八7卜、、八只7 4/L夕)的濾器裝置35、反射板26、 CCD 相機27以及轉(zhuǎn)動濾器裝置35的濾器驅(qū)動裝置28。
光源燈23是這樣的燈，其根據(jù)反應(yīng)液內(nèi)的作為檢測對象的DNA產(chǎn)物 的量照射光，所述光包含用于從該反應(yīng)溶液激發(fā)熒光的激發(fā)光，其通常使 用卣素燈。反射板26將從光源燈23照射的指定波長的光反射成指定角度， 使其射向反射板22(反射板22 t偏光^甘3)。此外，該反射板26具有透過 指定熒光的性質(zhì)。在本實施方式中，從配置在反應(yīng)檢測部5側(cè)部的光源燈 23發(fā)出的光通過該反射板26被反射向前方，該光源燈23的光照射到反射 板22。
濾器裝置35是通過將多種帶通濾光器呈輪狀配置而構(gòu)成的裝置，其在 濾器驅(qū)動裝置28的驅(qū)動下轉(zhuǎn)動，從而選擇指定帶通濾光器，使其處于光源 燈23與反射板26之間或反射板22與相機27之間。而且，在圖中，位于 光源燈23與反射板26之間的是帶通濾光器24，位于反射板22與相機27 之間的是帶通濾光器25。
帶通濾光器24是具有如下性質(zhì)的濾光器在光源燈23發(fā)出的光成分 中，其僅允許由反應(yīng)溶液激發(fā)熒光所需波長的光透過；通過該濾器24的光 為用于由反應(yīng)溶液的特定成分激發(fā)出焚光的激發(fā)光。
帶通濾光器25是具有如下性質(zhì)的濾光器通過反射板22而由反應(yīng)容 器7的各孔7A內(nèi)的反應(yīng)溶液激發(fā)出的熒光及反射光中，其只允許指定的所 熒光成分透過；這里，該熒光以外的反射光纟皮遮蔽。
相機27是對透過帶通濾光器25的菱光進行檢測的裝置，用該相機27 檢測到的焚光圖像被輸入所述控制裝置從而送達處理裝置C，這樣來分析各 反應(yīng)溶液的濃度即擴增量。而且，在帶通濾光器24、 25方面，根據(jù)作為檢 測對象的反應(yīng)溶液以及與之對應(yīng)使用的熒光染料的種類，可以任意地確定 這些帶通濾光器24、 25的組合，并有選擇地使用。
通過以上的結(jié)構(gòu)，所述控制裝置控制所述佩爾捷元件10，實施熱變性 步驟將反應(yīng)區(qū)塊6的保持穴8所保持的反應(yīng)容器7內(nèi)的反應(yīng)溶液加熱到 例如+95。C的熱變性溫度，使反應(yīng)溶液熱變性。接著，控制裝置控制佩爾捷 冷卻元件10，將反應(yīng)區(qū)塊6冷卻到例如+6(TC ，進行收納于反應(yīng)容器7內(nèi)的 熱變性后的反應(yīng)溶液中的DNA的退火步驟和延伸步驟?？刂蒲b置以該熱變 性步驟、退火步驟、延伸步驟為l個循環(huán)，反復(fù)多次例如40次，由此進行
利用PCR法的DNA等的培養(yǎng)(擴增)。
在該培養(yǎng)過程中或該培養(yǎng)結(jié)束時，反應(yīng)4全測部5定期地(例如在一個循 環(huán)結(jié)束后)實施檢測行為，以檢測反應(yīng)容器7內(nèi)的反應(yīng)溶液中DNA的擴增 狀態(tài)。檢測行為中，首先，光源燈23照射的光經(jīng)由帶通濾光器24到達反 射板26。帶通濾光器24僅允許光源燈23發(fā)出的光中的激發(fā)熒光所需波長 的光、即激發(fā)光透過。該激發(fā)光由于反射板26而從暗室結(jié)構(gòu)部12內(nèi)通過， 照射向反射板22方向，而且，由于反射板22，該激發(fā)光的照射方向朝向與 反應(yīng)區(qū)塊6相對設(shè)置的菲涅耳透鏡21,即，由上自下照射。
照射到該菲涅耳透鏡21的激發(fā)光，由于該透鏡21的光學(xué)特性而對光 進行聚焦，使入射角度改變?yōu)榕c收納于反應(yīng)區(qū)塊6的反應(yīng)容器7的各孔7A 平行或接近平行的角度。這樣一來，透過該透鏡21的激發(fā)光經(jīng)由形成于按 壓部件15的各透孔，以平行或接近平行的入射角度入射到各孔7A。
以平行或接近平行的角度入射到各孔7A內(nèi)的激發(fā)光，照射預(yù)先添加了 指定熒光染料的孔7A內(nèi)的DNA，由此，發(fā)出與PCR產(chǎn)物的量相應(yīng)的熒光。 產(chǎn)生的熒光以及來自其它PCR產(chǎn)物的反射光同樣經(jīng)由形成于按壓部件15 的各透孔及菲涅耳透鏡21到達反射板22。
此后，到達反射板22的焚光及其它反射光，在該反射板22的作用下， 在暗室結(jié)構(gòu)部12內(nèi)沿基本水平方向形成光路，同時經(jīng)由與該反射板22對 向設(shè)置的帶通濾光器25到達相機27。而且，這種情況下，由于擋蓋2的封 閉，暗室結(jié)構(gòu)部12內(nèi)成為暗室，從而可以抑制熒光衰減等不良事件。
此時，由于反射板26由能夠透過熒光的材料構(gòu)成，因此透過該反射板 26的反射光及焚光會照射到帶通濾光器25。帶通濾光器25方面，如上所 述，根據(jù)該濾器25的種類，只有指定熒光能夠透過，因此只有指定熒光會 照射到設(shè)置于其后方的相機27。
而且，在相機27，對接受的熒光進行拍攝，由此來檢測反應(yīng)容器7的 各孔7A內(nèi)PCR產(chǎn)物的焚光狀態(tài)。然后，該檢測到的與各PCR產(chǎn)物的焚光 狀態(tài)相關(guān)的檢測數(shù)據(jù)(圖4 圖6所示圖像數(shù)據(jù))被從控制裝置輸送至處理裝 置C，通過該處理裝置C的分析，能夠檢測各樣品的濃度，即DNA等的擴 增量。由于各孔7A的位置與圖像的位置的關(guān)系是事先已知的，因此，通過 求出孔7A的圖像的各像素的亮度，能夠分別測定孔7A的焚光強度，能夠 由該焚光強度把握PCR產(chǎn)物的量。
如圖ll所示，處理裝置C包括運算處理部(CPU)31、存儲裝置(存儲手 段)32、鍵盤(或鼠標等輸入裝置)33、顯示器(輸出裝置)34、打印機(輸出裝 置)36、外部存儲裝置37等，所述運算處理部(CPU)31對由反應(yīng)檢測裝置1 輸送的檢測數(shù)據(jù)進行處理，所述存儲裝置(存儲手段)32與所述運算處理部 31連接，所述外部存儲裝置37例如FD、 CD、 DVD、存儲器等。由反應(yīng)檢 測裝置1輸送的檢測數(shù)據(jù)存儲于存儲裝置32，由運算處理部31來進行后述 的處理，從而在顯示器34等上顯示輸出。
下面，對該處理裝置C中的檢測數(shù)據(jù)處理程序進行說明。圖5、圖6 為由反應(yīng)檢測裝置1輸送至處理裝置C的檢測數(shù)據(jù)的圖像。各圖像中，顯 現(xiàn)白色的96個圓形圖像分別為孔7A內(nèi)的PCR產(chǎn)物發(fā)出的熒光。而且，在 實施方式中，以SYBRPremixExTaq(注冊商標)為基礎(chǔ)，由PCR正向引物、 PCR反向引物、模板(作為初期值投入的XDNA)和dH20來調(diào)制反應(yīng)溶液。 此外，圖5、圖6中，上半部分的48個孔7A內(nèi)分加了 0.2pg/pL濃度的反 應(yīng)溶液(X組)，下半部分的48個孔7A內(nèi)分加了加倍〖表度即0.4pg L的反 應(yīng)溶液(Y組)。而且，溫度循環(huán)為40次。
反應(yīng)開始后，隨著溫度循環(huán)次數(shù)的增加，熒光強度相應(yīng)于DNA的擴增 量增加。描繪該過程的就是前述圖7的擴增曲線。該擴增曲線是分別對各 孔7A得到的，其顯示于顯示器34(圖8)。然后，如果使用鍵盤(鼠標)33對 指數(shù)函數(shù)擴增區(qū)(圖7的(5))設(shè)定閾值Th(圖7的(11))，則在該圖中可以讀出 此時的循環(huán)數(shù)Ct(閾值循環(huán)數(shù)Ct)為24.5。該閾值循環(huán)數(shù)Ct與檢測樣品的初 期DNA量之間存在相關(guān)關(guān)系，能夠制作出反映該線性關(guān)系的校正曲線。運 算處理部31以該校正曲線為基礎(chǔ)推算檢測樣品的初期DNA量。這樣，可 以基于PCR的擴增速度論進行準確的定量。
(A)排除裝置方面的誤差因素
如前述，在反應(yīng)開始前反應(yīng)檢測裝置1的相機27所拍攝的圖像數(shù)據(jù)中， 各像素的亮度并非一定，如圖4的(1)所示，由于光學(xué)系統(tǒng)的污染、雜散光 等會出現(xiàn)斑點。在反應(yīng)進行中，則該斑點會如圖5的(2)中所示那樣，與孔 7A的圖像重疊，而被孔7A固有的熒光強度拉長。
因而，在處理裝置C的運算處理部31中，為了求出孔固有的焚光強度， 實施以下處理。即，例如，對于圖6中右數(shù)第2二列上數(shù)第二行(B11)的孔 7A，測定該Bll的孔7A(圖6的(4))的焚光測定值[DNA]rawB11,存儲于存
儲裝置32。接著，測定該Bll的孔7A附近的連接壁部分中周圍4點的熒 光測定值[DNA]bgl、 [DNA]bg2、 [DNA]bg3、 [DNA]bg4，求出這4點的熒 光測定值的平均值(背景焚光測定值)，存儲于存儲裝置32。然后，通過像式 (2)那樣從熒光測定值[DNA]rawB11中減去該平均值，計算出Bll的孔7A 固有的熒光強度[DNA]rea舊1 。realBl l=[DNA]rawBl l-(([DNA]bgl+[DNA]bg2+[DNA]bg3+[DNA ]bg4)/4)….(2)
在每次進行焚光測定值[DNA]raw的檢測時，對于全部96個孔分別實 施該處理，確定全部的孔7A固有的熒光強度[DNA]real。這樣一來，對于 各孔7A(反應(yīng)區(qū))分別得到了該孔7A的DNA產(chǎn)物固有的熒光強度 [DNA]real,其中已經(jīng)扣除了由該孔7A及其周邊的光透過性的誤差或污染、 以及雜散光等引起的背景熒光測定值[DNA]bg。
因此，可以實現(xiàn)準確的擴增曲線的制作與定量化。此時，沒有必要使 用在傳統(tǒng)方案中說明的第2熒光信號，而僅依靠處理裝置C中的運算處理 即可完成，所以不會造成成本提高或操作性下降，能夠縮短獲取及處理數(shù) 據(jù)所需的時間。
而且，在實施方式中，測定孔7A的周圍4點的熒光測定值[DNA]bgl、 [DNA]bg2、 [DNA]bg3、 [DNA]bg4，并將其平均值從熒光測定值[DNA]raw 中扣除，但并不限于此，取l點，或者取2點或3點的平均均是可以的。 只是像實施方式那樣使用4點的平均值的話，能夠更準確地計算出背景熒 光強度，高精度地確定熒光強度[DNA]real。此外，實施方式中采用的是孔 7A周圍4點熒光測定值的簡單平均，但并不限于此，也可以考慮污染狀態(tài) 的斑點，在對各點分別進行指定加權(quán)后，再進行平均。
此外，反應(yīng)前和反應(yīng)后，背景熒光強度的變化(漂移，卜"J7卜)并不明 確。然而，在實施方式中，每次檢測熒光測定值[DNA]raw時，；險測熒光測 定值[DNA]bgl [DNA]bg4，從熒光測定值[DNA]raw中減去熒光測定值 [DNA]bgl [DNA]bg4的平均值，來確定焚光強度[DNA]real，因此，即使反 應(yīng)中背景熒光強度發(fā)生變化，通常也能夠?qū)崟r地、精度良好地得到DNA產(chǎn) 物固有的熒光強度[DNA]real。
(B)標準化1
接著，圖8顯示了全部96個孔7A的擴增曲線。橫軸為溫度循環(huán)數(shù)，
縱軸為熒光強度。如前述，在圖5、圖6上半部分的X組與下半部分的Y 組中，分加的反應(yīng)溶液存在濃度差異，由此看來，如果是固有的話，反應(yīng) 曲線應(yīng)該出現(xiàn)2條線。此外，閾值循環(huán)數(shù)Ct也應(yīng)該為2個點。然而，由于 前述光學(xué)系統(tǒng)的誤差、校正溶液的濃度誤差、校正溶液的分注誤差或反應(yīng) 溶液的分注誤差等裝置上的誤差因素，各孔7A的擴增曲線出現(xiàn)離散("， 7《)，閾值循環(huán)數(shù)Ct也像(8)、 (9)那樣出現(xiàn)了多個(離散)。
因而，運算處理部31基于從鍵盤(鼠標)33的指定選擇指令，進行數(shù)據(jù) 的標準化。即，運算處理部31使用按溫度循環(huán)數(shù)n確定并存儲于存儲裝置 32中的熒光強度[DNA]n(第n個溫度循環(huán)的固有熒光強度[DNA]real)、每個 孔7A的熒光強度的最大值[DNA]max(到第n個溫度循環(huán)為止的熒光強度 [DNA]real中最大的一個，存儲于存儲裝置32)、以及作為比較對象的孔 7A(實施方式中是全部孔7A)共有的值Z,通過式(3)的運算，獲得標準化的 焚光強度[DNA]nN。nN=[DNA]n/([DNA]max+Z)…(3)
通過該處理，將各孔7A的熒光強度標準化。圖9為Z=0的情況。通過 該標準化可以校正降低各孔7A的由裝置上的誤差因素引起的熒光強度離 散，因此，與圖8的情況相比，X組、Y組各自的閾值循環(huán)數(shù)Ct的離散有 所降低。由此，可以高準確度地計算出閾值循環(huán)數(shù)。而且，在圖9中，為 了使整體尺度為合適的值，將[DNA]nN乘以一個全部孔共有的值來表示。
(C)標準化2
這里，作為在循環(huán)后期的平臺區(qū)熒光強度出現(xiàn)離散的因素，除了上述 裝置上的誤差因素之外，還會因化學(xué)反應(yīng)的離散而發(fā)生。而且，關(guān)于該因 素，可以認為其并非成比例地影響指數(shù)函數(shù)擴增區(qū)的熒光強度。即，有些 情況下，使平臺效應(yīng)的區(qū)域的熒光強度不完全一致是比較好的。
這種情況下，使用鍵盤(鼠標)33使式(3)的Z的值增大。圖10顯示了 Z=20000時的各個孔7A的擴增曲線。使Z的值增大會弱化標準化的效果。 然而，在圖10中可知特別是從循環(huán)中期到后期的擴增曲線的行為與實際 焚光強度的行為(圖8)相近似。另一方面，可以充分確保了閾值處的校正效 果。這樣一來，抑制了標準化的效果，充分確保了閾值處的校正效果，而 且使從循環(huán)中期到后期的擴增曲線與實際數(shù)據(jù)近似，可以容易地把握由裝 置誤差因素以外的因素引起的數(shù)據(jù)的行為。
這里，在進行這樣的不完全標準化時，可以如式(4)那樣確定Z的值。
Z=a[DNA]max+p…(4)
a、 (3為各孔7A共有的系數(shù)。
此外，運算處理部31使用熒光強度的移動平均數(shù)來計算前述的最大值 [DNA]max。這是因為熒光強度[DNA]real實際上呈現(xiàn)鋸齒(乂 -《！i )狀。然 而，作為用于標準化的最大值，可以使用該鋸齒的峰值，也可以使用該峰 值的例如90%等數(shù)值(這些都是與最大值相關(guān)的值)。
(D)基線的校正
這里，圖8的(10)為循環(huán)初期其反應(yīng)結(jié)果的水平無法檢測的區(qū)，但，由 于孔7A內(nèi)的反應(yīng)溶液本身自始發(fā)出一定的焚光，所以該區(qū)中通常熒光強度 也并非為0。因而，基于來自鍵盤(鼠標)33的指示，運算處理部31進行基 線的校正。即，運算處理部31以循環(huán)初期的區(qū)(10)的各孔7A的熒光強度的 平均值[DNA]base為基線，從前述[DNA]n及[DNA]max中減去該平均值后， 進行上述標準化處理。圖9、圖10中，初期焚光強度為零O，這是因為進 行了該處理([DNA]base可以使用[DNA]n的最小值)。
這樣一來，能夠把握來自PCR產(chǎn)物本身的熒光強度的狀況，其中，排 除了孔7A內(nèi)的反應(yīng)溶液本身發(fā)出的焚光的強度。
而且，不言自明的是，上述實施方式所示的物質(zhì)、量、數(shù)并非僅限于此。
權(quán)利要求
1. 一種核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置，該裝置對多個反應(yīng)區(qū)實施溫度循環(huán)，實時檢測來自各反應(yīng)區(qū)中的核酸擴增產(chǎn)物的熒光強度，其中，檢測從所述反應(yīng)區(qū)得到的熒光測定值[DNA]raw、以及從該反應(yīng)區(qū)附近的反應(yīng)區(qū)外區(qū)域得到的熒光測定值[DNA]bg，并從所述熒光測定值[DNA]raw中減去所述熒光測定值[DNA]bg，由此來確定該反應(yīng)區(qū)的熒光強度[DNA]real。
2. 權(quán)利要求1的核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置，其中，所述焚光測定值 [DNA]bg為從所述反應(yīng)區(qū)附近的多個反應(yīng)區(qū)外區(qū)域得到的熒光測定值的簡 單平均、或者進行了指定加權(quán)后的平均值。
3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置，其中，在 每次檢測所述焚光測定值[DNA]raw時，檢測所述熒光測定值[DNA]bg，并 從該焚光測定值[DNA]raw中減去焚光測定值[DNA]bg，由此來確定所述熒 光強度[DNA]real。
4. 一種核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置，該裝置對多個反應(yīng)區(qū)實施溫度循 環(huán)，實時檢測來自各反應(yīng)區(qū)中的核酸擴增產(chǎn)物的焚光強度，其中，對于每次所述溫度循環(huán)，測定從各反應(yīng)區(qū)得到的焚光強度，第n次溫 度循環(huán)的從各反應(yīng)區(qū)得到的熒光強度記作焚光強度[DNA]n ，對于每一個焚 光強度[DNA]n，使用這些焚光強度[DNA]n的最大值或與之相關(guān)的值 [DNA]max進行標準化，對于使用該標準化的熒光強度[DNA]nN繪制的擴 增曲線的指數(shù)函數(shù)擴增區(qū)設(shè)定閾值Th，由此計算出閾值循環(huán)數(shù)Ct。
5. 權(quán)利要求4的核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置，其中，用每個所述反應(yīng) 區(qū)的焚光強度[DNA]n除以下述值，由此計算出所述熒光強度[DNA]nN，所 述值為所述最大值或與之相關(guān)的值[DNA]max、或者將其與作為比較對象 的對所述反應(yīng)區(qū)共有的值相加而得的值。
6. 權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置，其中，從 每個所述各反應(yīng)區(qū)的熒光強度[DNA]n及最大值或與之相關(guān)的值[DNA]max 中減去所述指數(shù)函數(shù)擴增區(qū)之前的所述熒光強度[DNA]base,來繪制所述擴 增曲線。
全文摘要
本發(fā)明提供一種核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置，其能夠有效地排除或降低裝置方面的致誤差因素，而無需使用用于修正的第2熒光信號。對多個孔(7A)實施溫度循環(huán)，并實時檢測來自各孔(7A)中的核酸擴增產(chǎn)物的熒光強度。檢測得自孔(7A)的熒光測定值[DNA]raw、以及得自該孔(7A)鄰近周邊的連接壁的熒光測定值[DNA]bg，通過從熒光測定值[DNA]raw中減去熒光測定值[DNA]bg來確定該孔(7A)的熒光強度[DNA]real。
文檔編號C12M1/00GK101395261SQ20078000804
公開日2009年3月25日 申請日期2007年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月6日
發(fā)明者園田泰亮, 巖間明文, 玉置裕一 申請人:三洋電機株式會社