專利名稱：：細胞的富集的制作方法細胞的富集本發(fā)明涉及間充質干細胞(MSC)的富集。認為MSC是能夠在大量科學和臨床應用中使用的重要細胞。例如，己經提出并且研究了MSC在基于細胞的治療中的應用。因為MSC是可以被誘導分化為許多細胞類型，包括骨骼、軟骨和脂肪細胞譜系的多能干細胞，所以它們是有用的。MSC可以在體外被誘導分化，且然后用作"成熟"細胞，或者其可以被維持在未分化的形式并容許原位分化。MSC還具有能夠在體外作為貼壁細胞單層增生的有用特征。不幸地，到目前為止，MSC在科學和臨床上具有有限的應用。其中的一個原因在于一直難以容易地分離有效數(shù)量的MSC。例如，已知骨髓是MSC的來源，且許多研究人員試圖從骨髓吸出物中分離這樣的細胞。然而，僅分離了少量的細胞，且這使得科學界相信只有非常少量的MSC存在于這樣的組織中。由于為分離臨床上有效數(shù)量的MSC需要不切實際量的組織，所以這代表一個問題。產生有效數(shù)量的唯一方法一直是分離MSC，然后在體外培養(yǎng)它們，有時數(shù)周，從而使數(shù)量可以得到擴增或增加("bulked-up")。然而，這樣的培養(yǎng)步驟具有許多缺點。第一，培養(yǎng)擴增是費時的。這限制了MSC的臨床有效性。存在著一些緊急需干細胞的實例。例如，如果臨床醫(yī)生希望向骨折的受試者施用干細胞，從而促進康復，則在受傷的幾小時之內獲得合適數(shù)量的干細胞將是理想的。然而，常規(guī)知識將指示臨床醫(yī)生應該從來自受傷受試者的骨髓吸出物中分離MSC;然后在培養(yǎng)中擴增群體；并且在一段時間后將干細胞引入到受傷的骨骼中。然而，整個過程可進行數(shù)周，且在這段時間后，MSC在部分痊愈的組織中可能幾乎沒有用處了。因此，由于細胞來源不是能容易獲得的，許多基于細胞的治療是不切實際的。第二，MSC的培養(yǎng)可以在培養(yǎng)的細胞中導致"表型漂變"。如果培養(yǎng)的MSC開始分化，則該漂變可能發(fā)生。這種分化可以是不可預知的，且經?？赡苎刂黄谕淖V系。備選地，人工培養(yǎng)條件能夠阻止細胞分化為如果細胞在體內保存時可能分化的表型。因此，應該認識到培養(yǎng)的細胞可能不以與細胞在體內生長相同的方式生長。這也導致了臨床和科學界對在培養(yǎng)中擴增的MSC的價值的質疑。第三，培養(yǎng)中對MSC的操作和擴增能夠導致MSC的衰老，其可能促成隨后的體內功能喪失。延長的MSC培養(yǎng)擴增還能夠導致遺傳不穩(wěn)定性和細胞轉化。此外，制定規(guī)章的團體諸如FDA質疑了在產生用于治療人類用途的細胞中使用動物產品的恰當性，對于MSC細胞培養(yǎng)擴增程序的情形也是如此。最后，通常很難成功地獲得干細胞群先體外后體內的擴增。為了克服這個困難，必需頻繁地使用外源因素諸如血清和生長因子，從而促進干細胞增殖。所述試劑可以既昂貴又引起復雜的培養(yǎng)條件，這需要技術人員的大量工作。因此，應該理解保證直接方便的不必在體外擴增的MSC來源將是理想的。然而，迄今為止仍沒有這樣的細胞的容易獲得的來源，且本發(fā)明的一個目的是提供像這樣的MSC來源。按照本發(fā)明的第一方面，提供了富集間充質干細胞(MSC)的方法，其包括-(a)用足以將MSC從細胞外基質釋放到液體培養(yǎng)基中的量的膠原酶處理包括細胞和細胞外基質的組織樣品；和(b)分離含有MSC的培養(yǎng)基組分。優(yōu)選地，步驟(b)包括利用下文更加詳細討論的嚴格表型標準分離MSC。按照本發(fā)明的第二方面，提供了按照本發(fā)明第一方面富集的分離的間充質干細胞(MSC)。按照本發(fā)明的第三方面，提供了用作藥物的按照本發(fā)明第一方面富集的分離的間充質干細胞(MSC)。按照本發(fā)明的第四方面，提供了用于富集間充質干細胞(MSC)的試劑盒，其包括膠原酶和任選地，用于維持、生長或分化細胞的培養(yǎng)基。術語"間充質干細胞"，我們指多能(pluripotent)或全能(multipotent)干細胞，其能夠作為貼壁細胞單層進行增殖并能夠被誘導分化成中胚層譜系的細胞(例如，骨骼、軟骨、肌肉、腱、韌帶或脂肪細胞)。對上述分化合適的信號可以由環(huán)境因子包括可溶性因子(諸如生長因子)和有干細胞或其后代位于其上的底物所提供。采用多能的(plmipotent)或全能的(muMpotent)，以具有其常規(guī)含義，即多能(pluripotent)細胞是能夠分化生成多種分化的譜系的干細胞；而全能(muWpotent)細胞可以包括具有更受限分化潛能的組細胞或前體細胞，即能夠生成在同一譜系內的不同細胞類型的細胞。本發(fā)明上下文中的間充質干細胞可以包括源自骨髓腔(包括吸出物和小梁骨核)、滑膜或脂肪墊(如下文進一步討論)的干細胞。例如，本發(fā)明上下文中的間充質干細胞可以包括這樣類型的干細胞，所述類型是先前從處理過的脂肪吸出物(LPAs)分離而來的，并將其鑒定為具有生成包括下列各項的譜系的能力成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞和神經元樣細胞。本發(fā)明基于實施例1，2和3中的研究，在所述實施例中本發(fā)明人確定從骨髓腔、滑膜和關節(jié)脂肪墊中分別能夠富集驚人數(shù)量的MSC。他們確定按照本發(fā)明的第一方面，該富集步驟可以包括相對簡單的酶組織消化。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)該步驟產生具有表型為CD45雙D7-FIB+LNGFR+的MSC群。D7-FIB是識別成纖維細胞/上皮細胞的單克隆抗體(可從供應商諸如Serotec,NovusBiologicals或Abeam商購)，LNGFR是低親和力神經生長因子受體CD271(可從供應商諸如BectonDickinson或MiltenyiBiotec商購)。本發(fā)明人證明了該CD45MD7-FIB+LNGFR+細胞群包括產克隆和多能MSC。這引起他們意識到常規(guī)臨床組織材料能夠用作充足數(shù)量的MSC的來源(大約106個高度純化的細胞)，從而直接用于多種重要的治療、診斷和研究目的。這被認為是非常令人驚訝的，因為通過常規(guī)方法分離的制劑僅產生小量的MSC，其需要進行具有上述全部相關缺點的擴增或增加("bulked-up")，而形成有效數(shù)量。通過膠原酶處理組織樣品而產生的驚人數(shù)量的MSC使臨床醫(yī)生或科學家立即獲得可用的有效數(shù)量的細胞，該細胞能夠在不暴露于體外細胞培養(yǎng)的人工環(huán)境的情形下得以使用。按照本發(fā)明從中富集MSC的組織樣品可以源自大量本領域技術人員公知的包含MSC的來源。這些包括骨髓、小梁骨(二者均被看作是相同器官，即骨髓腔的主要整體部分)和還有軟組織諸如滑膜和關節(jié)脂肪墊。本發(fā)明不涉及預計或不預計MSC被在這樣的組織中發(fā)現(xiàn)的事實。例如，眾所周知地，骨髓包括MSC，并且已經從骨髓吸出物中分離出非常小量的這樣的MSC。需要從吸出物中分離并培養(yǎng)這些細胞，以擴增MSC數(shù)量達到科研或臨床的有效數(shù)量。本發(fā)明的創(chuàng)造性步驟包含在這樣的事實中，即，膠原酶能夠用于從組織(例如，含有骨髓和小梁骨的活組織切片樣品)中釋放空前數(shù)量的新鮮的MSC。從現(xiàn)有技術不能預測到科研和/或臨床有效數(shù)量的新鮮MSC(i)包含在相對小體積的組織中；和(ii)能夠通過酶處理得以釋放。實際上，存在著針對試圖按照本發(fā)明富集MSC的技術偏見。這是因為技術人員會認為如此低的細胞產量會致使生成有效數(shù)量MSC所需要處理的組織體積將是不切實際的。這種普遍的觀點建立在MSC是位于間充質祖細胞層級頂點的稀少細胞的歷史性認知的基礎上；然而本發(fā)明人認為與當前MSC定義一致的高度可塑性對許多結締組織細胞，包括一些定型前的(pre-committed)祖細胞和間充質譜系血管周圍細胞(周細胞)而言是與生俱來的。最優(yōu)選地，本發(fā)明方法的步驟(b)包括通過應用嚴格的表型標準選擇MSC群。按照技術發(fā)展水平，存在著(1)缺乏關于體內MSC表型的充分的知識，因此缺乏清楚地區(qū)分MSC和污染細胞的能力；(2)缺乏對新鮮MSC能夠在臨床上有效的認識，因為新鮮提取的MSC具有比培養(yǎng)擴增的MSC更高的增殖能力…-因此技術人員需要比預測的更少的"新鮮"細胞；和(3)缺乏這樣的理解，S卩，甚至部分純但新鮮的MSC制劑(按照步驟(b)分離級分可能含有血小板、巨噬細胞和其它生成生長因子的細胞)可以比表型純合的經培養(yǎng)處理的MSC在臨床上更加有效。MSC的表型選擇/鑒定可以基于識別大量的位于耙細胞群上的MSC標記。這些標記包括表1中識別的那些。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>盡管許多標記是有效的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)某些標記對識別按照本發(fā)明制備的新鮮MSC特別有效。因此，D7-FIB,LNGFR(艮卩CD271),CD13,CD73和CD90是特別有用的標記。對于識別新鮮MSC最優(yōu)選的標記鑒定具有這樣表型的細胞CD45teD7-FIB+LNGFR+。本發(fā)明人認為LNGFR+對于識別按照本發(fā)明的MSC而言是一種最重要的標記。應該理解上述標記對于按照本發(fā)明步驟(b)分離MSC，以及為了鑒定細胞的目的而言是有效的。例如，如下文中更加詳細地討論，當通過FACS分類分離時，可以利用本發(fā)明人關于MSC表型的知識。優(yōu)選地，組織樣品是骨髓(BM)或含有BM和小梁骨(TB)的核心活組織切片。以下以及在實施例1中更加詳細地描述從這些組織富集MSC的方法。本發(fā)明基于本發(fā)明人關于表征表型和證明從BM吸出物中回收MSC(基于該表型)的低產率的工作。他們確定了BM吸出物中所有MSC的活性受限于稀少的CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞群。因此，希望分離MSC的任何人應該選擇CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞。該實施例描述了他們如何進一步研究該細胞群的頻率和克隆發(fā)生。正是在這些研究過程中，他們高興且吃驚地發(fā)現(xiàn)表型純的MSC具有許多與基質外膜網狀細胞(ARCs)共同的特性。BM基質網絡由ARCs，內皮細胞和周圍的周細胞，脂肪細胞，巨噬細胞和骨內膜細胞組成，后者細胞內襯在骨骼的表面。ARCs形成互相連接的細胞網絡，其參與造血細胞-支持的基質功能，并且已經表明了它們作為脂肪細胞和成骨細胞的前體的作用。本發(fā)明人假設MSC活性和可塑性是許多，如果不是全部ARCs，周細胞，前脂肪細胞和骨內膜細胞所固有的，且全部這些細胞屬于同一間充質細胞譜系。本發(fā)明人關于ARCs和MSC相似表型的數(shù)據(jù)支持該假說。在文獻中描述了這樣的事實相當特化的間充質細胞(諸如脂肪細胞或成骨細胞)能夠在體外轉分化和去分化。因此，本發(fā)明人提示相似的過程能夠在體內發(fā)生，且收獲這些間充質譜系細胞(其可以僅通過酶處理獲得)會釋放增多數(shù)量的高可塑性MSC。相反地，在BM吸出過程中，這些間充質細胞保持在原位，緊緊地相互附著并圍繞細胞外基質(與容易被吸出的疏松附著的造血細胞相比較)。因此，本發(fā)明人假定先前在BM吸出物中發(fā)現(xiàn)的低數(shù)量MSC不是它們實際在體內數(shù)量的全部代表。因此，他們發(fā)現(xiàn)通過按照本發(fā)明第一方面的方法用膠原酶處理組織樣品，能夠從組織中釋放出空前數(shù)量的CD451SD7-FIB+LNGFR+細胞(MSC)。這引導他們意識到可以從小體積組織中快速而容易地獲得科研和臨床上有效數(shù)量的CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞/MSC。按照本發(fā)明還可以從其他結締或軟組織中分離MSC。這些組織包括滑膜和關節(jié)脂肪墊(分別如在實施例1和3中所描述)。本發(fā)明人證明了使用骨髓活組織切片樣品開發(fā)的方法能夠應用于這些組織以富集驚人數(shù)量的具有相同基本表型和相似功能性的MSC(即，CD45ffiD7-FIB+LNGFR+)。本發(fā)明人還認識到處于不同組織中的CD45ttD7-FIB+LNGFR+細胞可以沒有進行特異性的局部分化途徑，并因此在不同應用中起作用(即，BMCD45^D7-FIB+LNGFR+細胞應該更適合于骨修復應用，而滑膜CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞應該更適合于軟骨修復應用)。本發(fā)明人表明在滑膜和脂肪墊中，CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞具有周細胞的形貌(topography)(即，間充質細胞參與支持組織脈管形成和新脈管形成)。他們表明這些CD45MD7-FIB+LNGFR+占裾了與脈管周細胞相同的生態(tài)位(niche)，可能是相同的；是產克隆的；且具有與BMMSC相似的功能性。因此本發(fā)明的方法提供從固體組織，包括滑膜和脂肪中的這一特殊血管周圍生態(tài)位富集MSC的方法。本發(fā)明的方法容許大多數(shù)骨髓MSC活性的純化，且還容許大多數(shù)滑膜和脂肪墊MSC活性的純化。本發(fā)明第一方面的方法可以用于從來自其他組織，包括但不僅限于胎盤和臍帶的血管周圍(周細胞)生態(tài)位中分離MSC。認為這些組織源富含特別適合于神經變性應用的MSC。因此，按照本發(fā)明的方法，從胎盤或臍帶富集的MSC，可以優(yōu)選地用于治療神經變性病癥。在周細胞分布范圍內分離的軟組織MSC僅具有與BMMSC相同的表型，但是可以具有BMMSC所有的潛力，且因此可以用于下述全部應用中。組織樣品的來源依賴于所富集的MSC的最終用途。優(yōu)選的組織樣品是來自骨，并且特別是骨髓(BM)。從BM樣品中富集的MSC在骨修復應用中特別有用。BM活組織切片材料可以獲自于大量的身體部位(例如，胸骨、股骨、骨盆或髂嵴)。優(yōu)選的BM來源是股骨頭或髂嵴?？梢酝ㄟ^鉆取活組織切片(例如，利用4mm的鉆取活組織切片)收集樣品。備選地，可將股骨頭切成兩半，并利用骨研磨機(BoneMill)(DePuy或其他制造商)均質化，從而獲得甚至更小的片段以經歷酶消化?？梢詮膩碜曰颊呋蛑驹刚叩镊尼栈罱M織切片中獲得的自體BM，并且可以從尸體捐獻者的任何小梁骨中獲得大數(shù)的MSC用于研究目的或用于異源MSC應用。在膠原酶處理前，可將核心活組織切片樣品或小組織片段置于PBS(磷酸緩沖的鹽水)中，從而防止它們干燥。然而，不應該用PBS大量洗滌樣品。這是為了保持BM，以便穿過骨髓的MSC(ARCs)和附著于骨骼的MSC(骨內膜細胞)均可用于酶提取。在優(yōu)選的實施方案中，按照本發(fā)明的富集受影響的組織樣品包括源自骨髓的漂浮脂肪組分(FFF)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了從前在分離MSC過程中丟棄的該組分，構成了驚人的豐富的MSC來源。僅通過舉例的方式，可以將0.1克組織樣品(取作單活組織切片)置于0.5ml膠原酶溶液(例如，來自干細胞科技(StemCellTechnologies)(產品號07902)的商業(yè)膠原酶溶液，其為在20%(v/v)胎牛血清(FCS)中的0.25%的膠原酶溶液)中。應該理解膠原酶可以獲自于大量的商業(yè)來源(例如，加拿大溫哥華的干細胞科技公司(StemcelltechnologiesInc))?？梢允褂迷S多不同的膠原酶。然而，優(yōu)選地，該酶有效用于消化膠原蛋白I。應該理解需要膠原酶的量足以從受到處理的樣品中釋放出MSC。該量應該取決于因素的數(shù)量，其包括所用樣品的類型(例如，來自骨骼活組織切片或脂肪墊的樣品)；受到處理的樣品量；包含樣品的緩沖液/溶液的體積；和使用酶的溫育時間。作為一般的指導，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)大約100-500單位的酶，和更優(yōu)選地250-375單位的酶足以從O.lgBM活組織切片樣品，滑膜或脂肪墊樣品(以0.5ml的體積，在37X:，溫育時間為3-4小時)釋放出MSC。此外，100-500單位的酶，和更優(yōu)選地250-375單位的酶，足以從所述O.lgBM樣品中釋放出大約10，000-50，000個MSC，且優(yōu)選地大約25,000-150,000個MSC(通過FACS純化至100%純度)。如此顯著數(shù)量的MSC可以得到釋放是令人驚訝地和意義重大的，因為已知相似，和甚至更小劑量的新鮮MSC在患有OI的兒童中和在骨非結合治療中具有功效。應該理解如果僅需要"半純的"MSC(例如從膠原酶處理過的樣品中傾析而出的細胞級分，所述樣品未經歷進一步的富集步驟，例如利用微珠或FACS分選進一步純化)，則制劑中應該存在更多細胞。應該在對膠原酶活性最佳的溫度下進行樣品溫育。這通常是大約37°C。然而，應該理解一些膠原酶具有稍微不同的最佳催化溫度，和/或能夠在一個溫度范圍(例如2(TC-47X:)內起作用。在本發(fā)明第一方面方法的優(yōu)選實施方案中，將4mm鉆取活組織切片BM樣品置于0.5ml0.25%膠原酶中?？蓪⒃撁副３衷?7"C，以消化樣品0.5-8小時，但更優(yōu)選地，3-4小時。培養(yǎng)過程中，可以進行每小時檢查并"輕敲"樣品，從而監(jiān)測細胞從活組織切片中的釋放。細胞釋放后，膠原酶溶液變渾濁，而BM活組織切片本身變得更白(暴露骨)或軟組織活組織切片完全溶解。特別是對于BM活組織切片樣品，第二次獨立的1小時膠原酶處理可以優(yōu)選地釋放骨內襯細胞，并由此獲得特別富集最高成骨潛力的MSC的細胞級分。在優(yōu)選的溫育時間結束時，可以進行最后的輕敲，從而確保最大細胞釋放。利用許多本領域己知的方法(例如，稀釋、過濾或離心及隨后傾析)能夠終止膠原酶活性。終止膠原酶活性和按照步驟(b)分離細胞的優(yōu)選方法包括用超過20倍的過量PBS(v/v)或相似緩沖液稀釋樣品?？梢允褂米⑸淦?針頭混合釋放的細胞和PBS，并迫使剩余的細胞從活組織切片中出來進入到溶液中。隨后立即通過70微米的細胞濾網過濾PBS/細胞混合物，并然后將其轉移到另一個離心管中進行離心(在1800rpm下進行5分鐘)。然后丟棄膠原酶/PBS溶液，并將細胞沉淀重新混懸于適合細胞計數(shù)和后繼操作(磁性和FACS分離)的培養(yǎng)基中，通常是含有2MFCS的DMEM。膠原酶消化和細胞分離后(例如，如前段中所述)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)表型純的MSC群(CD45ffiD7-FIB+LNGFR+細胞)的比例比吸出物中的高出100倍多。細胞的數(shù)量可能是所釋放的總細胞的5-10%或更多。按照本發(fā)明該制劑是臨床上有效的。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明人確定了通過在步驟(a)中包括進一步酶消化能夠制備的最佳MSC制劑。因此，應該理解進一步酶消化的選擇應該受到所處理的樣品和MSC的最終用途的指導。通過舉例的方式，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)第二次膠原酶處理和/或透明質酸酶(hyluronidase)處理可以特別有效地用于骨釋放最大數(shù)量的MSC。進行第二次膠原酶處理和透明質酸酶處理的的方案記述在實施例中。最優(yōu)選地，當組織是骨且MSC將用于骨修復目的時，將步驟(a)改造為包括第二次膠原酶處理和/或透明質酸酶處理。按照本發(fā)明的某些實施方案，步驟(b)能夠通過進一步的程序性步驟得到補充，所述程序性步驟能夠用于提高MSC制劑的質量，并且這些可以包括(1)死細胞/碎片的去除和(2)MSC的進一步富集。細胞碎片/死細胞的去除能夠通過大量已知的方法(例如，利用來自Miltenyi生物技術(MiltenyiBiotec)的死細胞去除試劑盒(DeadCellRemovalKit))完成。如果進一步的富集是通過磁性珠完成的(見下)，則該步驟的理想的。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)如果進一步的富集步驟是FACS分選(也見下)，則不需要該細胞碎片/死細胞的去除。為了后繼的以磁性為基礎從釋放的細胞級分中富集MSC，能夠使用多種方法。例如，本發(fā)明人用抗成纖維細胞微珠(直接與D7-FIB抗體綴合)、MACSelect微珠(直接與LNGFR抗體綴合)或CD271-APC微珠(全部來自Miltenyi生物技術，比利茲(Bisley)，英國)進行了陽性選擇。這兩種方法均導致隨后MSC比例超過10倍的增加(達到膠原酶消化液中全部細胞的50-60%)?；诒景l(fā)明人對于MSC表型的知識，他們相信其他可能有效的微珠是CD73-綴合的或CD105-綴合的(后者可從Miltenyi生物技術商購獲得)。備選地，可以使用譜系-陰性消耗法，該方法利用經仔細選擇絕對不與MSC交互反應的抗體混合物。因此隨著微珠的使用，本發(fā)明的應用能夠導致比迄今認為可能的高至少10倍的可用MSC用于治療發(fā)展。FACS分選能夠用于進一步富集按照本發(fā)明的方法所產生的MSC級分。通過FACS分選可以輕易地獲得超過95%的MSC純度。此外，基于PI，7AAD或其他死細胞排除染色，可以消除死細胞/碎片。FACS分選容許MSC的純化在短于1小時的時間內完成。應該理解MSC富集還能夠通過利用識別細胞上的細胞表面標記的抗體或其他試劑完成。表2提供了它們識別的能夠用于分離MSC的抗體和標記。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>CD73SH3PEBDCD105SH2PESsrotecCD90Thy-lFITCBDCD63HOP-26PEBDCD49aInterginVLA-1PEBDCD118LIF受體PEBDCD130Gpl30PEBDCD81TAPA-1PEBDCD39NAFITCBDJAM2NAPEScrotscCD10GAIXA，MMEAPCBDALP堿性磷酸酶PE發(fā)育研究雜交瘤庫(developmentalStudiesHybridomaBank)，愛荷華大學CD146MCAMPEBD包含MSC的級分可以立即使用。備選地，能夠利用常規(guī)低溫技術冷凍MSC，從而在將來使用。按照本發(fā)明第一方面純化的MSC通常對MSC和干細胞領域的科學研究人員來說是非常有用的。技術人員應該理解本發(fā)明所述的方法、細胞和試劑盒在多種預后或診斷測試中也特別有用。例如，血液學實驗室能夠富集MSC(按照本發(fā)明)/骨髓基質支持細胞，以作為篩選下列疾病中基質異常診斷測試的一部分，所述疾病包括，但不僅限于，骨髓纖維化、骨髓瘤和骨髓增生異常綜合癥。骨科/整形外科/風濕病學/內分泌學和其他臨床部門能夠對MSC/成骨細胞祖細胞進行富集，以作為篩選骨質疏松癥、骨石化癥、骨關節(jié)炎和骨壞死中的成骨細胞異常診斷測試的一部分。用于糖尿病/肥胖癥的診斷測試能夠利用按照本發(fā)明富集的MSC/脂肪細胞祖細胞/前脂肪細胞，作為篩選所述疾病中脂肪細胞發(fā)育中的異常的診斷測試的一部分。此外，關于"衰老"的診斷和預后測試能夠利用按照本發(fā)明富集的MSC，作為篩選/預測它們在移植前自體治療能力的診斷測試的一部分。本發(fā)明的方法對解釋骨髓微環(huán)境生物學的科學家是特別有用的。該方法提供純化大量基質支持細胞的方法，這容許在健康和疾病中先體外后體內地研究它們的生物學。骨髓基質細胞/MSC在培養(yǎng)擴增后，經歷了相當大的改變，這使當前的Dexter型基質培養(yǎng)物成為體內生物學的不可靠的替代物。本發(fā)明容許骨髓微環(huán)境在正常骨髓、骨髓增生異常骨髓和惡性骨髓中得到更好的理解。先體外后體內地研究骨髓基質的能力對定義一批基本骨髓病癥，例如多骨髓瘤和轉移性骨髓疾病的生長因子、趨化因子和細胞因子支持具有重要的影響。這能夠引起一批用于骨髓病癥的新型治療。同樣地，對于理解健康和疾病中的骨髓微環(huán)境的潛力能夠影響治療骨相關疾病，包括骨質疏松癥的新型治療的發(fā)展。本發(fā)明的方法能夠用于生產按照本發(fā)明第三方面的藥物，該藥物能夠用于細胞治療技術中。細胞治療可以利用自體或異源的MSC。按照本發(fā)明第三方面的藥物應該包括按照本發(fā)明第一方面的方法分離的細胞和生理用緩沖液或支架。該緩沖液包括無菌細胞培養(yǎng)基(和優(yōu)選地不需要添加血清的成分明確的培養(yǎng)基等)，所述培養(yǎng)基維持MSC處于生存狀態(tài)，并且安全施用于待治療受試者。該支架包括無菌生物相容性材料，其支持MSC附著和分化，并且安全施用于待治療受試者。當需要自體細胞治療時，按照本發(fā)明第一方面提供的MSC特別有效。本發(fā)明第一方面的方法使臨床醫(yī)生能夠獲得來自受試者的組織樣品；用膠原酶處理該組織，從而釋放臨床有效數(shù)量的MSC;并然后向受治療的受試者重新引入該細胞。本發(fā)明的方法容許臨床醫(yī)生快速地向被提取了組織樣品的受試者重新引入MSC。例如，能夠在提取樣品幾天內，同一天或，在臨床和支持人員的小心協(xié)調下在幾小時內(例如3小時內)，將細胞重新引入。這可以意味著能夠在不需要將受試者移出治療室或手術室的情形下，提取組織樣品并將富集的MSC重新引入。這體現(xiàn)了超越現(xiàn)有技術的顯著改進，所述現(xiàn)有技術包括收獲MSC;培養(yǎng)MSC從而擴增數(shù)量；并然后向受試者重新引入細胞(通常至少數(shù)周后)。這體現(xiàn)了本發(fā)明特別重要的特征。因此，按照本發(fā)明第五方面，提供了對需要細胞治療的受試者進行所述治療的方法，該方法包括(a)從所述受試者中獲得包含MSC和細胞外基質的組織樣品；(b)用一定量的膠原酶處理所述組織樣品，所述量足以將MSC從細胞外基質釋放到液體培養(yǎng)基中；(c)分離含有MSC的培養(yǎng)基級分；和(d)在允許所述受試者從所述細胞治療受益的身體部位，將所述組分重新引入到所述受試者中。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)能夠從受試者中分離驚人數(shù)量的MSC，所述數(shù)量足夠以治療相關量重新引入到同一受試者中。優(yōu)選地，通過使用本發(fā)明第一方法的方法，按照本發(fā)明的第五方面，可以富集MSC(例如，從骨髓/小梁骨)。優(yōu)選地，在獲得樣品的24小時內，優(yōu)選地12小時內和優(yōu)選地3-4小時內，將級分重新引入。優(yōu)選地，使用按照本發(fā)明第五方面的方法所使用的細胞，從而不需要冷凍所述MSC。本發(fā)明人確定了本發(fā)明可適用于大量自體細胞治療方案，其包括但不僅限于(1)骨修復(外傷骨折、部分骨缺陷、顱面重建、竇上升適應癥、脊骨融合適應癥、骨瘤/囊腫適應癥)(2)軟骨修復(外傷性損傷、骨關節(jié)炎)(3)骨骼肌修復(杜興肌營養(yǎng)不良和其他)(4)腱修復(運動員中的外傷損傷)(5)韌帶修復(運動員中的外傷性損傷)(6)半月板修復(運動員中的外傷損傷)(7)心肌修復(心肌梗死和心肌癥后)(8)脊髓損傷，帕金森氏病和其他神經變性疾病(9)免疫介導的組織排斥，移植物-抗-宿主疾病和類風濕性關節(jié)炎(免疫調節(jié)的細胞治療)(10)脂肪物質的再生(例如，與跖骨等相關的脂肪墊的重建；或與乳房相關的脂肪組織的再生，例如在手術或事故后的乳房重塑中)。(11)MSC能夠分化為內皮細胞。因此該方法對于脈管手術或局部缺血脈管損傷是有效的，其中在該治療中可能需要非常大量的能夠形成內皮的細胞。(12)骨質疏松癥。本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案是將按照本發(fā)明制備的MSC用于骨修復中(上述l)。作為置換手術、外傷、癌癥、骨關節(jié)炎、骨質疏松癥、先天性異?；蚬趋廊毕莸慕Y果，每年超過一百萬的整形外科手術包括骨修復。大的骨缺陷的重建持續(xù)需要骨移植，其具有許多缺點，包括供體部位損傷、疼痛和感染和病原體傳染的潛在風險。在骨質疏松癥中，完整髖部置換手術依然是目前可用的取代髖部骨折的唯一治療。即使隨著降低新骨折風險的骨合成代謝藥物(諸如，特立帕肽和雷奈酸鍶(strontiumrandate))的新發(fā)展，但是由于人口老齡化，預測(projected)全世界骨質疏松性髖部骨折的發(fā)生率在將來的50年中會增加最少3倍。因此，一般而言，發(fā)現(xiàn)修復這些骨折和復原骨的新方法是緊急的健康保健的首要問題。在這種情形中，使用MSC的細胞治療提供了新的解決方案。MSC是缺乏與胚胎干細胞相關的倫理關注的成熟干細胞，且已知其在體內形成骨。因此，利用MSC的骨組織改造(任選地，利用骨傳導支架和骨誘導生長因子)是在外傷和重建手術中骨異源或自體移植的備選方案。對于骨折治療，通過局部遞送MSC，實現(xiàn)了骨連接速度和修復的骨的質量的極大提高。MSC細胞治療也是對成骨不全(OI)非常有效的治療。迄今為止，這些己知的治療一直依賴于MSC在培養(yǎng)中的擴增，從而能夠產生臨床有效的數(shù)量。盡管MSC培養(yǎng)-擴增產生幾乎無限供應量的細胞，但是其制備過程漫長且成本高。這排除或嚴格限制了一般公眾對這些產品的使用(例如，對于政府資助的衛(wèi)生保健諸如英國的NHS)。除高成本外，長期的MSC培養(yǎng)與嚴重生物問題，諸如用于細胞轉化的能力、突變的積累、細胞衰老和全能性(multipotentiality)喪失有關。最后，為了評估擴增的MSC的純度和成骨"能力"，仍然存在重要的調節(jié)因素。例如，現(xiàn)已證明了培養(yǎng)的MSC的CD73，CD105和其他"經典"標記對于全能(multipotent)細胞(表達在皮膚和其他成纖維細胞類型上)不特異。因此，存在著新型、經濟且得到更好表征的MSC產品的領域。應該理解按照本發(fā)明第一方面的方法制備的MSC應該填補該領域。本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)可以從組織樣品中分離出臨床有效數(shù)量的新鮮MSC。與擴增的MSC相反，新鮮分離的MSC的明顯優(yōu)點是能夠獲得該細胞產品的速度。按照本發(fā)明第一方面的方法，在5小時的分離程序后，小的小梁骨活組織切片樣品可以產生5xl()5個純MSC(CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞)。新鮮分離的MSC的第二個優(yōu)點是它們顯示出高純度的完整表型特性。第三個優(yōu)點是它們更高的成骨潛力。在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，將按照本發(fā)明制備的MSC用于軟骨修復(上述2)和特別地用于治療骨關節(jié)炎(OA)中。OA是特征為具有關節(jié)器官衰退的關節(jié)分解的疾病。認為關節(jié)軟骨的喪失在受害者子群中是關鍵的主要事件。尚未證明用小分子的治療干預在軟骨再生中起作用。目前利用細胞治療的軟骨修復的黃金標準是自體軟骨細胞移植(ACI)方法。然而常規(guī)ACI從最初的軟骨收獲的時間到治療可能需要數(shù)月。這是非常昂貴的程序，且因此實用性受到限制。此外，該程序僅適合于年輕的受試者，因為來自軟骨的細胞在增殖和分化中顯示出與年齡相關的衰退，由此促成在年長受試者中利用ACI方法缺乏成功。而且，該方法是潛在有害的，其原因在于它包括首先從軟骨中提取活組織切片。然而，ACI方法是判斷全部其他細胞治療的基準。近期，與ACI相關的發(fā)展，包括使用基質協(xié)助細胞移植，已經得到了發(fā)展，但是這些并沒有避開該方法較廣的局限性。與骨再生相比較，其中大量骨誘導基質，生長因子和細胞產品己經進入了市場，情況對于軟骨修復而言相當不同。因此，應該理解在ACI程序的技術回顧中，具有分化為關節(jié)軟骨潛力的MSC可以被視為用于OA治療發(fā)展的潛在細胞來源。然而，意識到的MSC的稀有性意味著這些細胞還必須經歷冗長的培養(yǎng)擴增程序，其伴隨著感染、暴露于胎牛血清、細胞衰老、潛力消失、花費和成本的風險。本發(fā)明的方法使臨床醫(yī)生能夠迅速地獲得大量的干細胞，并快速地將它們返回到OA關節(jié)軟骨缺陷中。這體現(xiàn)了OA治療的顯著進步。倘若隨著用于OA評估的磁共振成像的普遍使用，，越來越多地識別到軟骨缺陷，那么迅速分離大量MSC的能力在當前的趨勢中特別實用。在本發(fā)明更進一步優(yōu)選的實施方案中，將按照本發(fā)明制備的MSC用于治療骨質疏松癥。本發(fā)明人注意到含有成骨祖細胞的MSC(按照本發(fā)明制備的)的生物學和表型與從培養(yǎng)擴增的MSC顯著不同。培養(yǎng)擴增的MSC已經形成了用于評估人類成骨祖細胞功能的黃金標準。進行大規(guī)模MSC/成骨祖細胞的純化的能力能夠為在骨質疏松癥中的治療途徑發(fā)現(xiàn)開'辟新的途徑。按照本發(fā)明進一步的實施方案，本發(fā)明人確定了按照本發(fā)明還能夠從異質來源分離MSC，并然后將其應用到受試者的細胞治療中，所述受試者患有能夠通過干細胞治療進行治療的醫(yī)學病癥(例如，骨折或OA)。能夠從尸體捐獻者的多種部位，包括髖部、椎骨和胸骨髓；從親戚/同胞；或匹配的無關捐獻者中富集異源MSC。因此按照本發(fā)明的第六方面，提供了對需要細胞治療的受試者進行所述治療的方法，該方法包括(a)從尸體或捐獻者中獲得包含MSC和細胞外基質的組織樣品；(b)用一定量的膠原酶處理所述組織樣品，所述量足以將MSC從所述細胞外基質釋放到液體培養(yǎng)基中；(c)分離含有MSC的培養(yǎng)基級分；和(d)在允許所述受試者從所述細胞治療受益的身體部位，將所述組分引入到所述受試者中。應該理解尸體或捐獻者與受試者是相同物種。最優(yōu)選地，所述受試者是人。然而，本發(fā)明人注意到許多其他動物(例如，母牛、馬、山羊和綿羊)中保留了LNGFR標記。因此，應該理解能夠使用相同的程序獲得用于在動物(例如，寵物如狗，和特別是馬)中進行骨或軟骨修復的細胞。能夠將該富集的異源MSC來源用于與本發(fā)明第五方面相關列出的相同的治療方案(1-12)中?？梢詤⒖荚陔S后的細胞分化上要實現(xiàn)的理想的治療特定，而選擇按照本發(fā)明的方法從中富集MSC的組織。例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)從滑膜組織中富集的MSC產生具有顯著成軟骨特性的細胞，且因此優(yōu)選地，應該從處于這樣狀態(tài)的滑膜中富集MSC，其中在所述狀態(tài)中需要在治療上促進軟骨的產生類似地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)從髕下脂肪墊富集的MSC生成具有一貫高成脂特性的細胞，且因此優(yōu)選地，應該從處于這樣狀態(tài)的脂肪墊中富集MSC，其中在所述狀態(tài)中需要在治療上促進脂肪組織的產生。按照本發(fā)明第六方面富集的MSC還能在這種情形下的基因治療中獲得應用，其中在所述情形中異源MSC具有改正接受治療的受試者中的異常缺陷的基因型。能夠用所述細胞治療的病癥包括(a)與骨和軟骨功能損失相關的先天性異常，包括但不僅限于成骨不全和稀有的軟骨發(fā)育不良和肌肉遺傳疾病(b)與基質功能損失相關的血液學異常，包括骨髓瘤和骨髓增生異常綜合癥和其他。按照本發(fā)明進一步的實施方案，能夠改造本發(fā)明第五和第六方面的治療方案，由此處理在步驟(c)中分離的級分，從而在引入(或重新引入)受試者中前，從遺傳上修飾富集的MSC。優(yōu)選地，遺傳修飾來自受試者的MSC(即自體MSC)，并將其重新引入到所述受試者中。然而，應該理解一些臨床狀態(tài)能夠指示可能需要來自尸體或捐獻者來源的MSC。實際上，所述MSC(來自尸體或捐獻者來源)能夠包括需要的基因型。因此能夠將該細胞引入到受試者中，從而改正一種遺傳異常(如以上所預期地)，并能夠進行遺傳修飾，從而對正接受治療的受試者具有進一步的遺傳影響。因此，按照本發(fā)明富集的細胞能夠用于治療許多具有遺傳組成的病癥，其包括以上(1)-(9)和特別地(10)和(11)中所預期的那些。按照本發(fā)明第四方面的試劑盒能夠包括上述任何膠原酶。優(yōu)選地，所述膠原酶消化膠原蛋白I。膠原酶能夠獲自溶組織梭菌(C7^n'&扁/^to/;;"cMm)(例如，由加拿大溫哥華的干細胞科技公司(StemcellTechnolgiesInc)，供應)。該試劑盒能夠任選地含有對膠原酶(例如，磷酸緩沖液(PBS)-任選地，包含終濃度20%的胎牛血清)和樣品(這也可以是PBS，優(yōu)選地含有2%胎牛血清，或另一種生理用緩沖液諸如DMEM)適合的稀釋液和緩沖液。當步驟(b)欲包括進一步的MSC純化時，優(yōu)選地，該試劑盒進一步包含用于實現(xiàn)這一目的試劑。因此，該試劑盒能夠包括適合于MSC磁性珠分離的試劑和設備。因此，如本文所述，該試劑盒能夠包括MACS柱、微珠、MACS緩沖液(含有0.1%牛血清清蛋白)。備選地，該試劑盒能夠包含用于進一步純化釋放的MSC的FACS試劑(例如，表2中列出的抗體，和緩沖液(例如，PBS))。本發(fā)明通過實施例和參考下列附圖得到進一步的舉例說明，其中圖1:舉例說明如實施例1中所述，從骨髓(BM)中分離的MSC的多參數(shù)流式細胞術結果；圖2:A，B，C和E舉例說明骨髓(BM)中的MSC的組織學分析以及隨后的擴增；D說明由分離的MSC引起的堿性磷酸酶表達的流式細胞術分析結果；和F是舉例說明如實施例1中所述地，在體內和培養(yǎng)的細胞所引起的IL-7和IL-7R表達水平隨時間的變化的柱狀圖；圖3:包括上下兩組圖。圖3的上組圖舉例說明了FACS數(shù)據(jù)，其表明通過本發(fā)明的方法，依賴骨髓樣品的富集而產生的MSC的高比例。圖3的下組圖展示了流式細胞術數(shù)據(jù)和顯微照片，其說明了這些按照本發(fā)明富集的BMMSC具有MSC表型，并能夠產生一定范圍的不同的細胞譜系，這與它們的全能狀態(tài)相一致。圖4:進一步舉例說明膠原酶消化程序對分離具有較高成骨能力的骨內襯細胞/細胞級分的有效性。A和B—膠原酶消化步驟前(左)和后(右)，BM腔的掃描電子顯微鏡方法(A)和熒光共聚焦顯微鏡方法(B)圖像，其顯示出去除了大部分但不是全部骨內襯細胞。B的右圖舉例說明了骨表面(在彩色圖像上顯示為綠色鈣熒光素染色)上的細胞的減少(因為與彩色圖像的左側相比，右側含有較少的由DAPI染色的藍色細胞)。(C)舉例說明了與第一次膠原酶消化(左)相比，第二次膠原酶消化(右)中如較暗顏色(成骨祖細胞，茜素紅染色)所示的CFU-成骨細胞數(shù)量的增多。第二次消化去除殘留的骨內襯細胞，且留下的細胞僅為骨細胞(D)，所述骨細胞陷入骨本身中且因此使酶難以接近(一些區(qū)域的模糊顯示骨細胞位于不同的位面)。圖5:也包括上下兩組圖。圖5的上組圖舉例說明FACS數(shù)據(jù)，其顯示出按照本發(fā)明關于源自骨髓樣品的漂浮脂昉片段的的富集產生的驚人高比例的MSC。圖5的下組圖展示了流式細胞術數(shù)據(jù)和顯微照片，其說明了這些按照本發(fā)明從FFF富集而來的MSC具有MSC的表型，并能夠產生一定范圍的不同的細胞譜系，這顯示了它們的全能狀態(tài)。圖6:顯示組織學切片的照片，其說明了如上實施例2所討論地，D7-FD3抗體染色全部成纖維細胞，而LNGFR僅染色在血管周圍區(qū)域中的成纖維細胞。圖7:顯示組織學切片的照片，其對比了的血管內襯的內皮細胞和實施例2中所述的與組織樣品中的血管相關的MSC的分布。圖8:舉例說明了實施例2中的代表試驗，該試驗說明了實施例2中從滑膜富集而來的MSC中的LNGFR表達。組(i)顯示一團滑膜組織的最初消化，由此通過PI選通去除死/干細胞。如基于其CD45/SSC分布圖而識別地，大部分細胞是非造血的，含有小比例的淋巴細胞(2%)和大量單核細胞/巨噬細胞(MM)(9%)。MM具有低CD14，這與巨噬細胞上的表達相一致。組(ii)舉例說明了用CD13的雙標記，并證明了全部滑膜組織成纖維細胞(CD31+)表達D7-FIB，即另一種成纖維細胞標記(A);CD31+細胞均一地表達低水平的CD166(ALCAM)，即一種推定的MSC標記(B);LNGFR，即一種BMMSC標記，也通過滑膜組織成纖維細胞(CD13+)表達，且顯示出陽性光譜，從非常亮到較暗的細胞(C)。(D)顯示出對照染色。組(m)舉例說明了用D7-FIB的雙標記，并證明了LNGFR，即一種BMMSC標記，在滑膜組織成纖維細胞上表達(D7-FIB+)且顯示出陽性光譜，從非常亮到較暗的細胞(左組)，LNGFR在滑膜組織內皮細胞上無表達(CD31+)，這證實了免疫組化數(shù)據(jù)。圖9:舉例說明了實施例2中用于分離MSC的分選方案，且還舉例說明了通過該富集方案產生的細胞的形態(tài)學。圖10:顯示了如實施例2中所述的軟骨片的培養(yǎng)和組織學切片照片，其說明了從滑膜分離而來并經過體外培養(yǎng)之后的MSC的分化。圖ll:顯示了如實施例3中所述的組織學切片的照片，其說明了脂肪墊中LNGFR+細胞具有血管周圍的形貌。圖12:也顯示了如實施例3中所述的組織學切片的照片，其說明了脂肪墊中LNGFR+細胞具有血管周圍的形貌，并進一步說明了脂肪墊MSC的表型和分選方案。實施例l:從骨髓樣品富集間充質干細胞1.1材料和方法l丄l樣品收集(i)從正常捐獻者的背部髂嵴中獲得BM吸出物(2-10ml)。用Lymphoprep(Nycomed,奧斯陸，挪威)分離后，收集BM單核細胞(MNC)。通過攪動手工分散集中在漂浮脂肪級分(FFF)中的細胞聚集物，并對其進行離心。單泡脂肪細胞保持漂浮在上層，而基質細胞集中到沉淀中。(ii)從在經過同意的患有骨關節(jié)炎(OA)患者的髖部關節(jié)造形術過程中摘除的股骨頭中獲得BM活組織切片材料。由外科醫(yī)生將股骨頭切成兩半，并在裝有PBS的無菌容器中遞送到實驗室中。利用4mm鉆取活組織切片收集樣本。備選地，利用骨研磨機(DePuy或其他制造商)攪勻股骨頭，從而獲得平均較小的片段以進行酶消化。l丄2膠原酶消化用0.5ml0.25%膠原酶(干細胞科技，溫哥華，加拿大灘化0.1g鉆取活組織切片樣品3-4小時。這相當于大約250-375單位的酶。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這對于細胞回收和生存能力是最佳的。l丄3MSC級分的處理優(yōu)選的溫育時間結束時，用超過20倍的過量PBS(v/v)稀釋膠原酶溶液，并使用注射器/針頭混合所釋放的細胞和PBS，并迫使剩余的細胞從活組織切片中出來進入到溶液中。隨后立即通過70微米的細胞濾網過濾PBS/細胞混合物，并然后將其轉移到另一個離心管中進行離心(在1800rpm下進行5分鐘)。然后丟棄膠原酶/PBS溶液，并將細胞沉淀重懸于適合細胞計數(shù)和后繼操作(磁性和FACS分離)的培養(yǎng)基中，通常是含有2%FCS的DMEM。從一些樣品中，對CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞進行了流式細胞術、純化、擴增和分化，如前所述。(Jones等，關節(jié)炎風濕病(ArthritisRheum)2002:46:3349-60)。1.2結果1.2.1證實了骨髓(BM)吸出物中稀少的間充質干細胞(MSC)具有D7-FIB+CD45"LNGFR+表型本發(fā)明人確定了在BM吸出物中所有MSC活性受限于CD45<sD7-FIB+LNGFR+細胞稀有種群。他們進一步研究了該種群的頻率和克隆發(fā)生。對于同一捐獻者，通過4色細胞計數(shù)法的測量，BM(單核細胞)MNC級分中CD45低D7-FIB+LNGFR+細胞的平均頻率是0.039士0.037%(圖1，上)，且其在量級上與相同樣品中發(fā)生的0.007±0.006%0=30)的平均CFU-F頻率相當。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在用D7-FIB微珠預富集后，該稀有細胞群的頻率增高100倍(高達7±6%,11=38)(圖1，中間圖)。該預富集步驟是用直接與D7-FIB綴合的微珠(抗-成纖維細胞微珠，Miltenyi生物技術)進行的陽性選擇。簡要地，將IOS個BMMSC與100pl微珠在室溫下溫育15分鐘，再以1800rpmX5分鐘洗滌，從而去除未結合的微珠。然后將細胞應用到MiniMacs柱(置于磁體中)中，并將未結合的級分收集到6mlMACS緩沖液(具有0.5%BSA的PBS)中。隨后，將該柱移出磁體，并將結合的組分(含有MSC)釋放到0.5-lmlMACS緩沖液中。這是MACS分離的標準方案。FACS分選選擇CD451氏D7-FIB+LNGFR+種群后，CD45低D7-FIB+LNGFR+細胞群的純度增高到超過95%(圖1，下圖)。在標準CFU-F測定中，在該富集的種群中，每6個細胞中的1個(17±4%，n=6)形成確定的由30或更多細胞的集群(Castro-Malaspina等(1980)血液(Blood)56第289-301頁)。由匹配的CD45+細胞沒有生長出集群。這些數(shù)據(jù)證實了BM吸出物中所有生成克隆的MSC包含在稀有的CD45^D7-FIB+LNGFR+種群中。1.2.2體內BMMSC的基質特征本發(fā)明人注意到從BM吸出物中純化的MSC顯示出基質形態(tài)學(具有許多突出物的星形)，這令人回想到BM外膜網狀細胞(ARC)，并且在它們的細胞質中發(fā)現(xiàn)了小脂肪滴(圖2A)。在BM活組織切片上，具有ARC形態(tài)學的細胞對CD10標記顯示陽性，所述CDIO標記在體內MSC中表達(圖2B)。而且，純化的體內BMMSC統(tǒng)一地對堿性磷酸酶(ALP)顯示陽性，這是ARC的主要特征(圖2C)。用針對ALP的抗體(B4-78克隆，針對ALP骨/肝同種型)進行的染色證明了在所有體內MSC上的均一表達(圖2D)。MSC培養(yǎng)擴增后，ALP表達逐漸消失(圖2E)。IL-7，即一種對于淋巴細胞生成的基質支持至關重要且已知是由ARC產生的細胞因子，也在擴增后衰退(圖2F)。培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞始終對ALP顯示陰性，并表達最少量的IL-7(圖2，E和F)。當綜合這些數(shù)據(jù)時，本發(fā)明人吃驚地認識到體內BMMSC具有許多與ARC相一致的特征，且這些特征在體外培養(yǎng)后消失了。這提示了兩件事。第一，MSC培養(yǎng)可能是不理想的，因為其導致表型改變。第二，技術人員應該尚未意識到體內MSC具有ARC樣特性。ARC形成相互連接的細胞網絡，并且能夠通過酶處理得到釋放。因此，本發(fā)明人意識到利用酶消化分離MSC也將是可能的。本發(fā)明人認為MSC活性存在于ARC和可能其他從前沒注意到的細胞，諸如骨內襯細胞、周細胞和前脂肪細胞中。所有這些不可能吸出，且這就是為什么需要酶消化作用。1.2.3從BM基質細胞聚集物中酶釋放體內MSC已經認識到MSC能夠具有ARC樣特性，本發(fā)明人研究了組織的酶消化作用是否會釋放MSC。他們對獲自股骨頭的材料測試了該想法，該股骨頭材料是在患有骨關節(jié)病(OA)患者的髖部關節(jié)造形術過程中摘除的。MSC代表了來自BM吸出物的單細胞混懸液中非常稀有的種群。來自1()8個吸出的BMMNC中高純度MSC(CD45低D7陽FIB+LNGFR+)的平均細胞產量是11,000個細胞(范圍4，000-63，000,n-14)，相當于2，000MSC/毫升吸出的骨髓。該產量太低以至于不具臨床有效性，并需要體外擴增以產生有效量的細胞。此外，如上所示，本發(fā)明人認為擴增步驟能夠導致MSC表型的改變。已經認識到體內BMMSC共有許多與ARC細胞相同的特征，本發(fā)明人下一步測試了與常規(guī)骨髓吸出物來源相反，使用1.1中所述方法(基于能夠分解ARC/基質網絡的那些)的酶促提取方法是否適合于從固體組織活組織切片中釋放增多數(shù)量的MSC。3小時或3-4小時的膠原酶處理活組織切片釋放了CD45ffiD7-FIB+LNGFR+細胞，其在形態(tài)學和表型上與從吸出物純化的MSC相似，但是，令人驚訝地，在從活組織切片樣品中釋放的種群中那些細胞的比例比在吸出物中發(fā)現(xiàn)的水平高100倍(5±3%活細胞，11=8,與BM吸出物中的0.039+-0.037%或細胞，『30,相反)。該增高顯示在圖3上組圖中所示的FACS結果中。此外，本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)盡管源自疾病的微環(huán)境，按照本發(fā)明第一方面的方法從消化的活組織切片中純化的CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞就增殖和分化而言保持了正常的MSC功能，盡管軟骨形成的水平減低了(l士l嗎硫酸葡胺聚糖(GAG)/片，與通過正常BM對照產生的3士2昭，1^4相比較)。該發(fā)現(xiàn)與源自OA患者BM的MSC的己知性質相一致。當使用來自正常個體的小梁骨活組織切片時，獲得正常水平的MSC軟骨形成(數(shù)據(jù)未顯示)。該研究的結果顯示在圖3的下組圖中，其舉例說明了按照本發(fā)明第一方面方法富集的MSC顯微照片和FACS分析。該組中左圖顯示的FACS結果舉例說明了在由示例其MSC性質的標記所選通的CD45ffiD7-FIB+LNGFR+細胞(即新鮮MSC)上的表達。該組右圖中所示的顯微照片說明了通過膠原酶消化所獲得的CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞能夠分化為3種間充質譜系。從消化的活組織切片中分選而來的高度富集的MSC(CD45<ftD7-FIB+LNGFR+)的產率比通常獲自吸出物的那些平均高50倍(且在某些情形中超過100倍)(~550,000個細胞/108總細胞，范圍80,000-800,000，n=6,與來自1()8個吸出的BMMNC中的11,000個細胞，范圍4,000-63,000,n=14相比較)。平均，O.lg活組織切片產生大約150,000個CD45低D7-FIB+LNGFR+細胞，其相當于大約25,000CFU-F(n=7)。釋放的細胞級分中CFU-F的比例直接與CD45MD7-FIB+LNGFR+細胞的頻率有關(R=0.89,n=7)。因此，本發(fā)明人能夠從單個O.lcm3(重量0.1g)的活組織切片中獲得大約10,000個MSCS或25,000或150,000個MSC(依賴于分別列舉的方法，即CFU-F測定或流式細胞術)。本發(fā)明人吃驚地認識到該產率足夠高，足以容許得自該方法的MSC的直接臨床應用。這些產率與使用150-350毫升BM吸出物等效。實際上，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過按照本發(fā)明第一方面的方法由膠原酶消化所釋放的CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞的頻率(2-9。/。，n-8)如此高，以至于為了使它們能夠獲得檢測，分離或用作治療，不再需要利用微珠進行預富集。在另一方面，如果將來自常規(guī)BM吸出物中的相同MSC劑量(即，150-350毫升)用于相同的目的，則必須對MSC進行相當大地濃縮，從而確保相似的純度水平。這說明了本發(fā)明人的方法是何等的有利，因為本發(fā)明容許臨床醫(yī)生在不需要復雜耗時的富集步驟或在培養(yǎng)中擴增的情形下，快速地利用取自樣品的MSC。而且，本發(fā)明人確定了按照本發(fā)明的方法能夠處理來自單一患者的一個股骨頭，并提供足夠用于多種治療的MSC，這在如果使用BM吸出物時是不可能的。1.2.3利用膠原酶雙消化酶促釋放高度成骨MSC對于骨修復的應用，使用具有突出成骨能力的MSC是理想的。已經認識到MSC活性可以存在于骨內襯細胞中，本發(fā)明人能夠顯示除如1.1中所述的3-4小時膠原酶消化步驟以外的其他酶促提取方法適合于釋放具有增高成骨能力的MSC。如圖4中A和B所示，本發(fā)明人能夠證明使用1.1中所述的方法的膠原酶消化步驟去除了大部分但非全部骨內襯細胞(平均大約2%總DNA留在骨上，n=3)。當在收集了第一次的消化物后對活組織切片片段進行了第二次1小時的膠原酶消化步驟，殘留在骨上的細胞的比例減少了接近5倍，且回收的細胞總產量增高了平均5%(n=3)。盡管第二次消化的克隆發(fā)生與第一次消化相似(分別地，13CFU-Fs/5,000釋放的細胞，與12CFU-Fs/5,000釋放的細胞相比較，11=3)，但是其成骨能力經常是兩倍高(分別地，170嗎Ca++/5，000釋放的細胞，與90嗎Ca++/5,000釋放的細胞相比較)(圖4C)。本發(fā)明人還能夠證明第二次膠原酶消化步驟可以被1小時的0.5ml在PBS中稀釋到終濃度50U/ml的透明質酸酶(西格瑪(Sigma))溶液的處理所替代。與膠原酶消化類似，用透明質酸酶的處理在37。C在細胞振蕩器上進行。該處理還釋放骨內襯細胞，其貢獻了所釋放總細胞的額外的5%(n=3)。使用膠原酶或透明質酸酶獲得的第二次消化物中的CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞的MSC標記表型與第一次消化物中的(0073+++〔0105+€090+++€0146++,『2)相似。該雙消化步驟后，保持在原位的唯一殘留細胞位于骨內(骨細胞)(圖4D)。因此，應該理解為了骨修復應用處理骨樣品的優(yōu)選方法是進行如上所述的第二次膠原酶處理或備選地透明質酸酶處理。1.2.3從漂浮脂肪聚集物中酶促釋放體內MSC正常BM包含漂浮的脂肪滴，稱為漂浮的脂肪級分(FFF)，在作為MSC富集開端的制備BMMNC的過程中通過密度梯度離心將其丟棄。在衰老的個體(因為他們的骨髓日益變成脂肪狀的)或患有一些疾病的人群(諸如類風濕性關節(jié)炎或骨質疏松癥)中，F(xiàn)FF增多。本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法可以應用于吸出物，從而增加MSC的產量。這需要收集FFF。然后按照本發(fā)明進行膠原酶處理，從而從成熟脂肪細胞中分離基質細胞/ARCs/MSCs。本發(fā)明人分析了利用常規(guī)現(xiàn)有技術從正常BM收集的吸出物中漂浮的脂肪組分(FFF)聚集物。在利用相同捐獻者的研究中，在分散的FFF中具有CD45^D7-FIB+LNGFR+表型的細胞比例為0.3±0.1%，因此比相應的MNC級分中存在的比例(0.03士0.006，『5)高10倍。因此本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)按照現(xiàn)有技術經常會被丟棄的FFF代表了有價值的MSC來源。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當用膠原酶消化FFF時，產生的CD45ffiD7-FIB+LNGFR+細胞的比例進一步得到增高，并達到總活細胞的7±5%(n=5)(圖5，上組圖)。該產量比按照現(xiàn)有技術用作MSC來源的MNC級分中的產量高200倍。從FFF中釋放出的CD451SD7-FIB+LNGFR+細胞與它們的MNC負體相比具有相似擴展的表型，并在擴增后是全能的(如圖5下組圖中所示，其舉例說明了上述研究了相同細胞譜系的FACS結果和形態(tài)學研究)。從FFF富集而來的CD45低D7隱FIB+LNGFR+細胞是ALP陽性的，且在它們的細胞質中含有小脂肪滴。這表明該細胞具有體內"前脂肪細胞"狀態(tài)。它們的體內堿性磷酸酶表達提示它們的"前成骨細胞"狀態(tài)。綜上所述，這提示了個體單細胞所固有的全能性。作為一個整體，這些數(shù)據(jù)顯示BM中存在的大部分MSC不以單個細胞(可以預期利用如現(xiàn)有技術所提示的吸出物來收集的類型)的形式存在。相反，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)大部分BMMSC結合在基質細胞網絡中，其與相鄰細胞，包括漂浮脂肪細胞和膠原蛋白基質形成聚集物。根據(jù)這個驚人的發(fā)現(xiàn)，應該承認本發(fā)明第一方面的方法(利用膠原酶消化從而從基質細胞和基質中釋放MSC)可以用于從比另外可以利用現(xiàn)有技術獲得的大得多的起始種群中分離和富集MSC。因此，本發(fā)明第一方面的方法提供了新穎的且有創(chuàng)造性方法，通過該方法可以實現(xiàn)MSC的增加的富集。實施例2:從滑膜富集間充質干細胞2.1材料和方法2.1.1樣品收集研究了來自8種滑膜組織來源的樣品來自一名正常捐獻者，來自4名患有RA的患者，一名患有OA的患者，一名患有痛風的患者和一名患有血清反應陰性關節(jié)炎的患者。在診斷關節(jié)內窺鏡檢查過程中提取滑膜活組織切片。將小組織的活組織切片(大約44mg)置于裝有2ml培養(yǎng)基(通常DMEM/2%FCS)的15ml離心管中，從而運送到實驗室中。2.1.2膠原酶的消化一旦進入實驗室中，去除培養(yǎng)基，將活組織切片置于0.25%膠原酶溶液中，并在持續(xù)旋轉的條件下消化3或4小時。當樣品被完全消化時，膠原酶溶液變渾濁，且細胞活組織切片完全分解和消失。溫育后，加入10mlPBS，并使用注射器/針頭破壞任何可能殘留的組織團塊。隨后立即通過70微米的細胞濾網過濾PBS/細胞混合物，并然后將其轉移到另一個離心管中進行離心(在1800rpm下進行5分鐘)。然后丟棄膠原酶/PBS溶液，并將細胞沉淀重懸于適合細胞計數(shù)和后繼操作(磁性和FACS分離)的培養(yǎng)基中，通常是含有2%FCS的DMEM。2丄3細胞分選方案對于CD45低D7-FIB+LNGFR+細胞，利用圖9中示意性顯示的方案，使用上述膠原酶消化技術富集從滑膜樣品釋放的細胞。簡要地，以高碘化丙錠(PI)染色為基礎丟棄死細胞，且隨繼對剩余的活細胞進行分選，從而選擇具有低CD45表達但高LNGFR表達的那些細胞。圖9的最后一幅圖像中說明了通過該方案產生的分選的細胞的成纖維細胞形態(tài)。這些分選的CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞隨繼能夠在培養(yǎng)中產生成長的細胞單層，這與它們的高度增殖本性相一致。2.2結果2.2.1免疫化學和流式細胞術分析已經在許多其他組織中報道了間充質干細胞，但是先前尚不知它們的體內形貌和表型。本發(fā)明人研究了固體組織，包括滑膜和關節(jié)脂肪墊中CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞的形貌。在滑膜中，D7-FIB抗體染色了全部的成纖維細胞，而LNGFE僅染色了血管周圍區(qū)域的成纖維細胞(圖6)。圖7中顯示了說明CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞的周細胞樣分布的結果。CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞區(qū)別于內皮細胞(已知為CD31+和馮維勒布蘭德因子+)，所述內皮細胞在血管內腔內深處形成單細胞厚度的層(免疫標記顯示在圖7A中)。相反，CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞形成如同延伸到組織中的數(shù)層陽性細胞一樣的血管支持，這與固體組織中的MSC是周細胞的概念相一致(圖7B)。2.2.2從滑膜中酶促釋放MSC利用以上2.1中概述的方法從滑膜中釋放MSC。按照本發(fā)明第一方面的方法酶消化滑膜產生高比例的CD45ffiD7-FIB+LNGFR+細胞，如圖8中所示。發(fā)現(xiàn)該CD45低D7-FIB+LNGFR+細胞富集與從中分離所述細胞的樣品的健康狀態(tài)無關(例如，組(iii)中來自痛風的組織樣品，進一步說明本發(fā)明第一方面的方法在從甚至患有疾病的患者中治療性分離自體MSC的適宜性。從多樣的滑膜樣品中(一種來自正常捐獻者，4種來自患有RA的患者，一種來自患有OA的患者，一種來自患有痛風的患者和一種來自患有血清反應陰性關節(jié)炎的患者)富集了CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞。不依賴于疾病的性質，CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞以平均比例15±9%，和在其他數(shù)據(jù)組中的16士10%，存在于所有滑膜消化物中。與顯示了全部成纖維細胞對于D7-FIB陽性標記的免疫組化數(shù)據(jù)相一致，CD45MD7-FIB+細胞以增高的比例存在于滑膜消化物中(平均比例76±20%，和在另一個數(shù)據(jù)組中為50士12%)。圖8的組(ii)禾P(iii)中顯示了證明LNGFR和D7-FIB在滑膜組織膠原酶消化物上的表達的代表性試驗。特別是，圖(iii)顯示了CD45^LNGFR+細胞(滑膜周細胞)構成CD45^D7-FIB+細胞(滑膜成纖維細胞)的級分，這與免疫組化數(shù)據(jù)相一致。表型上的共同性提示了它們共同的間充質譜系本性且MSC存在于具有兩種表型的細胞中可能性。2.2.3分選的CD45^LNGFR+細胞含有MSC的功能證據(jù)由分選的CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞產生細胞單層(第4次傳代)，所述CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞是按照本發(fā)明第一方面的方法從滑膜組織(即，從滑膜周細胞)富集而來。如下所述，對這些細胞單層進行成骨、成脂肪和成軟骨分化(n=l)的功能體外測定。i)用100nM地塞米松、0.05mML-抗壞血酸-2-磷酸酯和10mM(3甘油磷酸(全部來自西格瑪)誘導成骨分化。分別利用西格瑪試劑盒82和1%茜素紅(西格瑪)檢測堿性磷酸酶(AP)活性和基質礦化。利用西格瑪試劑盒85測量了Ca+"的沉積。ii)在增補了0.5mM異丁基甲基黃嘌呤(isobutilmethylxantine)(西格瑪)、60一B引哚美辛(ICN，Basingstoke,英國)和0.5mM氫化可的松(西格瑪)的DMEM/10。/。FCS中誘導成脂分化。如前所述，用0.5%的油紅顯現(xiàn)脂質泡的累積。iii)對于成軟骨分化，將2.5xl()S個細胞置于無血清的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由高葡萄糖DMEM(Gibco)、100嗎/ml丙酮酸鈉、40嗎/ml脯氨酸、50嗎/mlL-抗壞血酸-2-磷酸酯、lmg/mlBSA、lxITS+、100nM地塞米松(全部來自西格瑪)和iong/mlTGF-卩3(R&D系統(tǒng)(R&DSystems))組成。每隔一天更換培養(yǎng)基。在第3周收獲沉淀，并制備冷凍切片(5(im厚)。用1%甲苯胺藍(西格瑪)顯現(xiàn)硫酸化的GAG。利用愛茜藍結合測定(IDS)領!j量sGAG。3周分化后，源自CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞的培養(yǎng)物成功地分化為成脂、成骨和成軟骨的表型，所述CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞是按照本發(fā)明從滑膜組織中釋放而來的。該研究的結果顯示在圖9中，其展示了說明由培養(yǎng)的細胞所獲得的表型的顯微照片。比較源自分選的滑膜CD45"D7-FIB+LNGFR+細胞的細胞和源自BM(n=5)或滑膜(n=5)的培養(yǎng)物的細胞的全能性，其中培養(yǎng)物是通過標準可塑-貼壁(plastic-adherence)方法產生的。產生的脂肪細胞的比例是相似的(分別地，30%對比33±-15%和22±15%),且產生的鈣量(指示骨形成)處于相同范圍內(分別地，100嗎/盤對比80士37昭和121±47昭)。具體地，軟骨形成是非常強的，且產生的蛋白聚糖(GAG)的量高于對照培養(yǎng)物(分別地，9昭/片對比2.6±1.9嗎/片和2.2±1.4昭)。擴展該數(shù)據(jù)組，從而以n=15對滑膜進行比較。得到了相似的結果，且在該情形中，產生的蛋白聚糖(GAG)的量高于對照培養(yǎng)物(分別地，9嗎/片對比2.6±1.9嗎/片和1.8±1.7)?？傊?，CD45^D7-FIB+LNGFR+級分含有超過總消化物成軟骨活性的2/3，僅將1/3留給了剩余的級分。這些數(shù)據(jù)顯示與對照培養(yǎng)物相比，滑膜的CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞(滑膜周細胞)含有MSC活性，且特別富含成軟骨活性。2.2.4以單細胞水平證實MSC存在于按照本發(fā)明富集的滑膜CD45ffiD7-FIB+LNGFR+細胞群中本發(fā)明人研究了按照本發(fā)明從滑膜組織中釋放的個體細胞的產克隆能力(11=3名捐獻者，全部患有RA)。通過利用圖9中示意性顯示的方案的FACS分選純化CD45ffiD7-FIB+細胞(滑膜成纖維細胞)。平均起來，通過該方案分選的貼壁細胞的10%能夠經歷12-13次細胞分裂，然而這些中僅有25%(或總貼壁CD45teD7-FIB+細胞的2.5%)是高度增殖性的(能夠經歷20-22次細胞分裂)。另外，對通過膠原酶消化一種滑膜組織(RA)而釋放的細胞進行分選，從而選擇CD45^D7-FIB+LNGFR+種群(滑膜周細胞)。在該試驗中，總貼壁CD45^D7-FIB+LNGFR+細胞的4%是高度增殖和產克隆的(能夠i圣歷20-22次細胞分裂)。所有這三種單MSC來源的克隆是三能性的(圖IO)。這些試驗顯示高度產克隆和全能(multipotential)MSC存在于滑膜成纖維細胞和滑膜周細胞群中，且它們數(shù)字上富含在周細胞級分(CD45ffiD7-FIB+LNGFR+細胞)中，其中所述滑膜成纖維細胞和滑膜周細胞是按照本發(fā)明利用膠原酶消化從滑膜組織中釋放而來的。此外，這些結果說明了該富集的滑膜血管周圍CD45WD7-FIB+LNGFR+細胞是特別好的軟骨祖細胞來源。能夠從一個小的44mg的活組織切片獲得的滑膜周細胞的細胞產量是平均400,000個細胞(n=8)。該量足以用于治療小病灶性軟骨缺陷(目前用于標準自體軟骨細胞移植(ACI)程序的細胞密度是1()S個細胞/cm2)。如果使用滑膜成纖維細胞或總滑膜組織消化物，則利用一個小的活組織切片可以治療大得多的軟骨缺陷(高達10cmS)。滑膜組織具有高度再生能力，且收集多個活組織切片或較大部分的滑膜將能夠治療如在OA和RA中見到的非常大的軟骨缺陷?；ぶ芗毎母叨仍鲋澈彤a克隆活性提示與常規(guī)ACI標準相比，可以使用小得多的細胞接種密度(例如，最初的細胞數(shù)量)。實施例3:MSC存在于髕下脂肪墊中關節(jié)脂肪墊中的MSC(由LNGFR+免疫標記顯示)具有與該細胞在滑膜中的形貌相似的血管周圍形貌，如圖11和12，A所示。按照本發(fā)明對髕下脂肪墊(在初步試驗中n=4，并擴展到n=6，全部是患有OA的患者)進行膠原酶消化。流式細胞術數(shù)據(jù)證實了脂肪墊周細胞(CD45^LNGFR+細胞)構成脂肪墊成纖維細胞(CD45^D7-FIB+細胞)級分(圖12,B)。流式細胞術顯示CD45^LNGFR+細胞的平均比例在初步試驗(n=4)中是20±12%，且在11=6時甚至更好(37±9)。利用流式細胞術還研究了所述消化物中CD45^D7-FIB+細胞(成纖維細胞)的比例，且結果顯示(與來自滑膜研究的數(shù)據(jù)一致)這些細胞組成消化物更高的比例(60±12%(n=4)禾卩51±17%(n=6))。與我們所分析的滑膜消化物相比，脂肪墊中成纖維細胞的比例是相似的(分別地，50對比51%)，然而周細胞(CD45^LNGFR+細胞)的比例是兩倍高(分別地，37對比16%)。這提示在細胞產量方面，脂肪墊可能是對于選擇MSC特別有用的組織來源。為了從脂肪墊消化物中純化CD45"D7-FIB+LNGFR+細胞(周細胞)，本發(fā)明人使用了基于微珠的使用MACSdect抗-LNGFR微珠的技術(圖12，C)。MACSdect抗-LNGFR微珠可購自Miltenyi生物技術。選擇方案與對D7-FIB微珠所述的方案嚴格相同(見上)。在該磁性分選程序(n=4)后的細胞純度低于通過直接FACS分選所獲得的那些(~60-70%純度對比95%)(圖20，C)。然而，本發(fā)明人認為這可能是由于評估純度的方法的局限性，而非實際純度本身。盡管有這些局限性，來自膠原酶消化物的脂肪墊來源的CD45③LNGFR+周細胞的克隆發(fā)生能力與滑膜來源的CD45^LNGFR+細胞相似(總貼壁CD45ffiLNGFR+細胞的4%)。源自分選的脂肪墊周細胞的集群顯現(xiàn)在圖12，C中。分選的脂肪墊來源的CD45"LNGFR+周細胞甚至在培養(yǎng)擴增前具有一些全能性。這可能得到評估，是因為釋放的/分選的細胞的數(shù)量足以進行分化測定中的體外測試。這些測定的結果顯示表3中，其比較了下列特性i)通過膠原酶消化產生的CD45氣NGFR+細胞；禾口ii)通過膠原酶消化產生的CD45^LNGFR'細胞；iii)在培養(yǎng)中擴增(標準方法)后的對照脂肪墊來源的可塑-貼壁細胞。利用標準擴增方案獲得來自上述(iii)的細胞。簡要地按照標準方案消化脂肪墊。將5"05-106個細胞接種到小的25cr^的燒瓶中，并培養(yǎng)直到匯合。對匯合的細胞進行胰蛋白酶化，并分置于另外兩個燒瓶中直到匯合。如上所述，將擴增的細胞(第1次傳代)用于測試全能性。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>從表3中可以看出，脂肪墊來源的CD45^LNGFR+細胞比CD45ffiLNGFRtffl胞更具成軟骨性。平均而言，對照培養(yǎng)的脂肪墊來源的MSC比新鮮的CD45^LNGFR+細胞產生更高的成軟骨性(分別地，9±7對比2.4±4.4,n=6和11=4)。本領域技術人員應該理解源自接受治療性施用MSC的患者的分化的細胞應該提供增高的和有利的在本文中鑒定的成軟骨特性，其中所述MSC是按照本發(fā)明富集而來的。能夠從小的30mg活組織切片中獲得的脂肪墊周細胞的細胞產量是平均700,000個細胞(n=2)。該量足以用于治療小病灶性軟骨缺陷(目前用于標準自體軟骨細胞移植(ACI)程序的細胞密度是1(^個細胞/cm2)。能夠從1克組織中獲得的脂肪墊周細胞的細胞產量是平均23"06個細胞(n=2)。能夠從整個脂肪墊獲得的脂肪墊周細胞的細胞產量是平均500xl()S個細胞(n=2)。這使其能夠治療如在OA和RA中見到的非常大的軟骨缺陷。這將使得能夠使用異源狀態(tài)中的脂肪墊，從而為許多治療提供成軟骨級分。總之，這些結果證明了存在于關節(jié)脂肪墊中的CD45^LNGFR+細胞是i)血管周圍的，ii)產克隆的；和iii)全能的。這些特性都與這些細胞作為包含間充質干細胞的鑒定相一致。利用本發(fā)明的富集方法，可能將這些細胞純化到充足數(shù)量(超過io6個細胞)，從而在不求助體外培養(yǎng)擴增的情形下，直接測試它們的全能性。對于通過本方法的富集，使用髕下脂肪墊，即一種細胞來源，是特別優(yōu)選的，其原因在于該組織的大尺寸，且在脂肪墊中存在相當高比例的CD45^LNGFR+細胞。這些特性使髕下脂肪墊成為利用本發(fā)明第一方面的方法獲得未處理MSC的極好的來源。該富集的細胞特別適合于組織改造應用。綜上所述，這些數(shù)據(jù)顯示(1)第一次比較了新鮮分選而來的細胞群和擴增細胞的全能性，并顯示出新鮮分選而來的細胞群具有MSC活性；(2)CD45^LNGFR+細胞比CD45^LNGFR;細胞具有更高的成軟骨性和成骨性(因此，CD45^LNGFR+細胞代表了對本發(fā)明第一方面的步驟(b)中的選擇而言優(yōu)選的表型)；和(3)新鮮細胞的成脂活性與擴增的細胞相似，因此人們可以簡單地從身體的一部分收集和消化脂肪，并將細胞注射/移植到其他部分中。不需要在培養(yǎng)中擴增細胞來提高它們的脂肪生成。權利要求1.分離和富集間充質干細胞(MSC)的方法，該方法包括(a)用一定量的膠原酶處理包括細胞和細胞外基質的組織樣品，所述量足以將MSC從細胞外基質釋放到液體培養(yǎng)基中；和(b)分離含有MSC的培養(yǎng)基級分。2.按照權利要求l的方法，其中所述組織樣品來自骨髓。3.按照權利要求2的方法，其中所述樣品是來自骨盆、胸骨或股骨的鉆取活組織檢査。4.按照上述權利要求中任一項的方法，其中所述組織樣品包括漂浮的脂肪級分(FFF)。5.按照權利要求1的方法，其中所述組織樣品來自選自包括骨吸出物、滑膜和脂肪墊的組的組織。6.按照上述權利要求中任一項的方法，其中將所述樣品置于含有0.25%膠原酶的緩沖液中。7.按照上述權利要求中任一項的方法，其中將所述樣品用膠原酶處理3-4小時。8.按照上述權利要求中任一項的方法，其中所述含有MSC的級分是通過去除任何固體并離心液體培養(yǎng)基以分離含有單細胞的級分而獲得。9.按照上述權利要求中任一項的方法，其中步驟(a)包括兩次獨立的膠原酶消化。10.按照上述權利要求中任一項的方法，其中步驟(a)還包括透明質酸酶消化。11.按照權利要求9或10的方法，其中所述組織樣品是骨，并且所述MSC是用于骨修復。12.按照上述權利要求中任一項的方法，其中步驟(b)還包括進一步的富集步驟。13.按照權利要求12的方法，其中所述進一步的富集步驟利用磁性珠進行。14.按照權利要求12的方法，其中所述進一步的富集步驟包括FACS分選。15.按照權利要求12-14中任一項的方法，其中所述進一步的富集步驟是基于分離具有這樣的表型的MSC，所述表型其特征在于表1中鑒定的標記之一。16.按照權利要求15的方法，其中所述表型是CD45ffiLNGFR+，CD45ffiD7-FIB+LNGFR+或CD45teD7-FIB+。17.按照通過權利要求1-16中任一項所定義的方法富集的分離的間充質干細胞(MSC)。18.按照權利要求17的分離的間充質干細胞(MSC)，其用作藥物。19.按照權利要求18的藥物，其用在細胞治療中。20.按照權利要求18或19的藥物，其中對所述MSC進行遺傳操作，以用于基因治療。21.富集間充質干細胞(MSC)的試劑盒，該試劑盒包括膠原酶。22.對需要細胞治療的受試者進行所述治療的方法，該方法包括(a)從所述受試者獲得包含MSC和細胞外基質的組織樣品；(b)用一定量的膠原酶處理所述組織樣品，所述量足以將MSC從細胞外基質釋放到液體培養(yǎng)基中；(c)分離含有MSC的培養(yǎng)基級分；和(d)在允許所述受試者從所述細胞治療受益的身體部位，將所述級分重新引入到所述受試者中。23.對需要細胞治療的受試者進行所述治療的方法，該方法包括(a)從尸體或捐獻者中獲得包含MSC和細胞外基質的組織樣品；(b)用一定量的膠原酶處理所述組織樣品，所述量足以將MSC從細胞外基質釋放到液體培養(yǎng)基中；(c)分離含有MSC的培養(yǎng)基級分；和(d)在允許所述受試者從所述細胞治療受益的身體部位，將所述級分引入到所述受試者中。24.按照權利要求22或23的方法，該方法包括進一步的對MSC進行遺傳操作的步驟。25.按照權利要求22-24中任一項的方法，其中所述細胞治療是用于臨床控制病癥的目的，所述病癥選自包括下列各項的組骨修復、軟骨修復、骨骼肌修復、腱修復、韌帶修復、半月板修復、心肌修復、脊髓損傷、帕金森氏病和其他神經變性疾病、免疫介導的組織排斥、移植物-抗-宿主疾病、類風濕性關節(jié)炎、脂肪物質的再生、脈管修復或局部缺血脈管損傷或骨質疏松癥。26.按照權利要求22-24中任一項的方法，其用于修復骨。27.按照權利要求22-24中任一項的方法，其用于修復軟骨。28.按照權利要求22-24中任一項的方法，其用于治療骨關節(jié)炎。29.按照權利要求22-24中任一項的方法，其用于治療骨質疏松癥。30.由權利要求19所定義的藥物用于治療由權利要求25-29中任一項所定義的病癥的應用。全文摘要本發(fā)明涉及分離和富集間充質干細胞(MSC)的方法，該方法包括用一定量的膠原酶處理包含細胞和細胞外基質的組織樣品，所述量足以將MSC從細胞外基質中釋放到液體培養(yǎng)基中，并且然后再分離含有MSC的培養(yǎng)基級分。該分離的MSC可以是以驚人的大量分離的，以至于該級分可以在大量臨床情形中具有直接的應用。這代表了現(xiàn)有技術的進步，所述現(xiàn)有技術需要從不同來源匯集大體積樣品組織或需要在培養(yǎng)中擴增MSC。因此，本發(fā)明還涉及按照本發(fā)明第一方面的方法分離的細胞的臨床用途。文檔編號C12N5/0775GK101400786SQ200780008778公開日2009年4月1日申請日期2007年1月17日優(yōu)先權日2006年1月18日發(fā)明者丹尼斯·麥戈納格爾,保羅·艾莫里,埃萊娜·約內斯,安妮·英格利希申請人:利茲大學