專利名稱：增強感染性細小病毒載體在昆蟲細胞中的生產(chǎn)的制作方法
增強感染性細小病毒載體在昆蟲細胞中的生產(chǎn) 與相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2006年1月20日提交的美國臨時專利申請No. 60/760，S12、2006年2月6日提交的美國臨時專利申請No. 60/765,665、 和2006年6月14日提交的美國臨時專利申請No. 60/804,772的優(yōu)先權(quán)， 這些都名為"增強感染性細小病毒載體在昆蟲細胞中的生產(chǎn)"，其內(nèi) 容合并在此引為參考。發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及細小病毒載體的生產(chǎn)，更具體來說，涉及重組腺相關(guān) 病毒(rAAV)在昆蟲細胞中的生產(chǎn)及其應用?，F(xiàn)有技術(shù)的說明細小病毒(Parvoviridae)科的病毒是小DNA病毒，其特征特別 在于它們感染特定宿主的能力。細小病毒科包括兩個亞科感染脊椎 動物的細小病毒亞科和感染昆蟲的濃核病毒亞科。細小病毒亞科(被 稱為細小病毒)包括依賴病毒屬，其成員的獨特性在于，在大多數(shù)情 況下，這些病毒需要與輔助病毒例如腺病毒或皰疹病毒共感染以造成 有效感染。依賴病毒屬包括腺相關(guān)病毒(AAV)，它們通常感染人類 (例如血清型2、 3A、 3B、 5和6)或靈長類(例如血清型1和4)， 以及感染其它溫血動物的相關(guān)病毒(例如牛、犬、馬和羊的腺相關(guān)病 毒)。細小病毒和細小病毒科的其它成員在《費氏病毒學》(FIELDS VIROLOGY,第三版，1996)的第69章，Kenneth I. Bems的"細小病 毒禾斗病毒及其復制(Parvoviridae: The Viruses and Their Replication)，， 中有一般性的描述。近年中，由于其有效感染不分裂細胞和分裂細胞的能力、整合到 人類基因組中單一染色體位點的能力、以及對人類來說引起相對低的 致病風險的能力，AAV作為用于基因治療的優(yōu)選病毒載體而出現(xiàn)。鑒于這些優(yōu)點，重組的腺相關(guān)病毒(rAAV)目前正用于B型血友病、惡 性黑色素瘤、囊性纖維變性和其它疾病的基因治療臨床試驗。在使用目前的哺乳動物細胞生產(chǎn)系統(tǒng)進行大規(guī)模rAAV生產(chǎn)以用 于臨床試驗和商業(yè)化中所涉及的困難，即便不是完全令人卻步的，也 是巨大的。例如，對于某些臨床研究來說，可能需要超過10"個rAAV 的粒子。為了生產(chǎn)該數(shù)量的rAAV粒子，將需要轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)大約1011 個培養(yǎng)的人類293細胞，相當于5000個175cn^的搖瓶的細胞。在本 技術(shù)領(lǐng)域中已經(jīng)意識到了與使用現(xiàn)有的哺乳動物細胞系生產(chǎn)AAV有關(guān) 的相關(guān)困難。還有一種可能性就是，在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)的 預定用于臨床使用的載體會被哺乳動物細胞中存在的不想要的、可能 是致病的物質(zhì)所污染。給使用細小病毒或AAV作為載體進一步增加困 難的是，工程化新的載體以及在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系中表達所需多肽的 整個過程是非常耗時耗力的。此外，最近在使用昆蟲細胞生產(chǎn)AAV中 的進展導致了生產(chǎn)基本上無感染性的病毒粒子。因此，對于生產(chǎn)細小病毒載體的改進的方法和工具仍然有著需求。 本發(fā)明的載體生產(chǎn)系統(tǒng)提高了生產(chǎn)細小病毒載體的過程的簡便性和效 能。在本技術(shù)領(lǐng)域中也存在著對在感染性AAV粒子的生產(chǎn)中使用昆蟲 細胞的改進的方法的需求。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了新的方法、宿主細胞和載體構(gòu)建物，它們通過增加 VP1結(jié)構(gòu)組分的表達同時將VP2和VP3結(jié)構(gòu)組分的表達保留在基本正 常的水平上，使得感染性rAAV有效地生產(chǎn)。本發(fā)明的一個方面是提供了生產(chǎn)包裝的細小病毒載體的方法。總的來說，本發(fā)明的方法包括(a) 提供宿主細胞；(b) 將含有核苷酸序列的一個或多種載體導入宿主細胞，所述核苷 酸序列編碼(i) 兩側(cè)含有TR的轉(zhuǎn)基因；以及(ii) 病毒包裝功能，含有足以導致感染性細小病毒粒子被包裝的細小病毒Rep組分和細小病毒Cap組分，其中相對于VP2和VP3補充了 足以增加感染性病毒粒子的生產(chǎn)的VP1并處于在宿主細胞中指導表達 的調(diào)控序列的控制之下；以及(c) 將病毒輔助功能的編碼核酸導入昆蟲細胞以便在昆蟲細胞中 進行表達；(d) 在足以產(chǎn)生包裝的感染性細小病毒載體的條件下培養(yǎng)宿主細胞。另一方面，本發(fā)明提供了在昆蟲細胞中生產(chǎn)rAAV的方法，該方 法包括(a) 提供昆蟲細胞；(b) 將含有核苷酸序列的一個或多個細小病毒載體導入昆蟲細胞， 所述核苷酸序列編碼(i) 兩側(cè)含有AAVTR的轉(zhuǎn)基因；以及(ii) 桿狀病毒包裝功能，含有足以導致感染性細小病毒粒子被包裝 的AAV Rep組分和AAV Cap組分，其中相對于VP2和VP3補充了足 以增加感染性病毒粒子的生產(chǎn)的VP1;以及(c) 將桿狀病毒輔助功能的編碼核酸導入昆蟲細胞以便在昆蟲細 胞中進行表達；(d) 在足以產(chǎn)生包裝的感染性細小病毒載體的條件下培養(yǎng)昆蟲細胞。優(yōu)選病毒包裝功能來自于桿狀病毒表達系統(tǒng)。在一個實施方案中， 桿狀病毒包裝系統(tǒng)或載體可以被構(gòu)建成帶有AAV Rep和Cap編碼區(qū)，這可以通過將這些基因工程化到桿狀病毒載體的多角體編碼區(qū)中并通 過轉(zhuǎn)染到宿主細胞中生產(chǎn)病毒重組體來進行。優(yōu)選宿主細胞是桿狀病 毒感染的細胞，或其中導入了附加的編碼桿狀病毒輔助功能的核酸， 或其中包含了這些桿狀病毒輔助功能。這些桿狀病毒可以表達AAV組分，從而促進了病毒殼體的產(chǎn)生。宿主細胞可以包括Sf9和Sf21。在優(yōu)選實施方案中，可以對AAV的rep蛋白進行密碼子優(yōu)化，以 改變同源性，減少由于同源核苷酸之間的重組事件而產(chǎn)生的不利的或 未預料到的基因組變化。因此，當宿主是昆蟲細胞時，AAV Rep、 AAVCap、 VP1、VP2和/或VP3編碼區(qū)的編碼序列可以優(yōu)選密碼子優(yōu)化， 以便在特定的昆蟲宿主細胞中表達。因此，例如

圖12中顯示的AAV2 Rep52的序列(SEQIDNO. 1)為了在昆蟲細胞中表達可以被優(yōu)化成圖 13所示(SEQIDN0.2);圖14中顯示的AAV2 Rep78的序列(SEQ ID NO. 3)為了在昆蟲細胞中表達可以被優(yōu)化成圖15中所示(SEQ ID NO. 4);圖16中顯示的AAV2殼體2.5的序列(SEQ ID NO. 5)為了 在昆蟲細胞中表達可以被優(yōu)化成圖17中所示(SEQIDNO.6);圖18 中顯示的AAV8VP1的序列(SEQ ID NO. 7)為了在昆蟲細胞中表達 可以被優(yōu)化成圖19中所示(SEQIDNO. 8);圖20中顯示的AAV9 VPl 的序列(SEQ ID NO. 9)為了在昆蟲細胞中表達可以被優(yōu)化成圖21中 所示(SEQIDNO. 10);圖22中顯示的AAV2 VPl的核苷酸序列(SEQ ID NO. 11)可以被突變以優(yōu)化成圖16中所示(SEQ ID NO. 5);圖23 中顯示的AAV2 VPl的氨基酸序列(SEQ ID NO. 12)可以被突變以優(yōu) 化成圖24中所示(SEQIDNO. 13)。這樣，密碼子將被優(yōu)化以用于昆 蟲細胞。被優(yōu)化的序列還包括基本上同源的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了將用于表達的轉(zhuǎn)基因投送到細胞中的方法，包括 給細胞施用含有核苷酸序列的一個或多種載體，所述核苷酸序列編碼(i) 兩側(cè)含有TR的轉(zhuǎn)基因；以及(ii) 用于復制Rep組分與Cap組分和包裝感染性細小病毒粒子的桿 狀病毒的輔助功能，其中相對于VP2和VP3補充了足以增加感染性病毒粒子的生產(chǎn)的VP1。VP1的補充可以通過例如下面所述來實現(xiàn)(a) 在昆蟲細胞中導入含有表達VP1、 VP2和VP3的核苷酸序列 的Cap載體，并在昆蟲細胞中導入含有表達VP1的核苷酸序列的VP1 載體；或(b) 在昆蟲細胞中導入含有Cap組分的核苷酸序列(用于表達 VP1、 VP2和VP3)和VP1組分的核苷酸序列的單一載體。另一方面，本發(fā)明提供了將用于表達的轉(zhuǎn)基因投送到細胞中的方 法，包括給細胞施用含有核苷酸序列的一個或多個桿狀病毒載體，所 述核苷酸序列編碼-(i) 兩側(cè)含有TR的轉(zhuǎn)基因；以及(ii) 用于復制包含在載體中的AAV的Rep組分和AAV的Cap組 分的桿狀病毒輔助功能，其中相對于VP2和VP3補充了足以增加感染 性病毒粒子的生產(chǎn)的VP1。AAV rep組分可以插入到與Cap組分不同的載體中。或者，附加 的VP1組分可以插入到Rep組分或Cap組分的相同載體中。Rep組分 可以被包含在單獨的載體中。Cap載體和VPl載體一般可以感染復數(shù)(moi)至少為1導入到昆 蟲細胞中。載體可以同時或順序?qū)氲郊毎?，?yōu)選以引起感染性病 毒的生產(chǎn)增加的足夠量同時導入。在一個實施方案中，VP1載體的表達控制序列與Cap載體的表達 控制序列相比提供的表達相對較弱。例如，合適的VP1載體表達是Cap 載體的表達的大約1%到大約75%、 Cap載體表達的大約1%到大約 50%、或Cap載體的表達的大約1%到大約25%。較弱的表達可以通過 例如使用突變的多角體啟動子來提供。理想的是，補充VP1導致產(chǎn)生了大約10:10:80 VP1:VP2:VP3的分子比率。補充VP1可以導致產(chǎn)生的 包裝的感染性細小病毒載體的量比沒有進行補充的相應方法高出了大 約10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 15、 160、 170、 180、 190或200倍。用于本方法的昆蟲細胞優(yōu)選來自鱗翅目(lepidoptera)或從該目的 細胞衍生而來。優(yōu)選昆蟲細胞來自夜蛾(Spodoptera )或夜蛾 (Trich叩ulsia)屬，例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉紋 夜蛾(Trichopulsia ni)。優(yōu)選的細胞系包括源自于上述任何昆蟲的SF9、 SF21、 HighFive""^細胞(BRI-TN-5B1-4) 、 Mimic-SF9細胞。在另一方面，本發(fā)明提供了含有至少一種載體的重組宿主細胞，其中至少一種載體含有的核苷酸序列編碼 兩側(cè)含有細小病毒TR的轉(zhuǎn)基因；以及足以導致感染性細小病毒粒子包裝的桿狀病毒包裝功能和細小病毒Rep和Cap組分，其中相對于VP2和VP3來說補充了足以增加感染 性病毒粒子生產(chǎn)的VP1。在還一方面，本發(fā)明提供了用于表達病毒粒子的試劑盒，其中所 述試劑盒含有至少兩種載體，其中所述載體含有的核苷酸序列編碼 兩側(cè)含有細小病毒TR的轉(zhuǎn)基因；以及足以導致感染性細小病毒粒子包裝的桿狀病毒包裝功能，含有細 小病毒Rep組分和Cap組分，其中相對于VP2和VP3來說補充了足以 增加感染性病毒粒子生產(chǎn)的VP1。該試劑盒還可以含有昆蟲細胞和用于在昆蟲細胞中進行表達的編 碼桿狀病毒輔助功能的核酸。附圖簡述圖1顯示了可以用于AAV生產(chǎn)的四種重組桿狀病毒。圖2顯示了在昆蟲細胞中產(chǎn)生的載體的較低VP1/VP3比率。圖3顯示了通過用表達VP1的桿狀病毒進行共感染而產(chǎn)生的細胞 裂解液中增加的VP1水平。圖4顯示了用表達VP1的桿狀病毒感染的細胞產(chǎn)生的病毒粒子中 增加的VP1水平。圖5顯示了用在Sf9和293細胞中產(chǎn)生的AAV2.5-GFP載體轉(zhuǎn)導 HepG2細胞的結(jié)果。圖6顯示了通過加入額外的2.5VP1導致的AAV-2.5GFP感染性的 增加。圖7顯示了另外四種可以用于AAV生產(chǎn)的重組桿狀病毒，其中的 載體顯示出包含了末端重復(ITR)和啟動子。圖8顯示了用于生產(chǎn)感染性AAV的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)只包含三 種載體，其中編碼VP1、 VP2和VP3的基因與AAV復制組分一起包含 在同樣的載體中。圖9顯示了用于生產(chǎn)感染性AAV的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)只包含兩 種載體，其中編碼VP1、 VP2和VP3的基因與AAV復制組分一起包含 在同樣的載體中，而第二種載體包含了 GFP的基因和其它用于增加 VP1表達的基因。圖IO顯示了生產(chǎn)感染性AAV的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)只包含兩種 載體，其中復制組分包含在每種載體上。圖11顯示了用于生產(chǎn)感染性AAV的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包含兩 種載體，其中復制組分包含在單種載體中，而編碼VP1、 VP2和VP3 的基因與其它用于增加VP1表達水平的基因包含在同樣的載體中。圖12顯示了編碼AAV2 Rep52蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)。圖13顯示了為編碼AAV2 Rep52蛋白在昆蟲細胞中表達而優(yōu)化的 核苷酸序列(SEQIDN0.2)。圖14顯示了編碼AAV2 Rep78蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)。圖15顯示了為編碼AAV2 Rep78蛋白在昆蟲細胞中表達而優(yōu)化的核苷酸序列(SEQIDN0.4)。圖16顯示了編碼AAV病毒殼體2.5的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)。圖17顯示了為編碼AAV病毒殼體2.5在昆蟲細胞中表達而優(yōu)化的核苷酸序列(SEQIDNO.6)。圖18顯示了編碼AAV8VP1蛋白的核苷酸序列(SEQIDNO. 7)。 圖19顯示了為編碼AAV8 VP1蛋白在昆蟲細胞中表達而優(yōu)化的核苷酸序列(SEQIDNO. 8)。圖20顯示了編碼AAV9 VP1蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO. 9)。 圖21顯示了為編碼AAV9 VP1蛋白在昆蟲細胞中表達而優(yōu)化的核苷酸序列(SEQIDNO. 10)。圖22顯示了編碼AAV2 VP1 Cap蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.11)。圖23顯示了 AAV2 VP1 Cap蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO. 12)。 圖24顯示了昆蟲細胞中AAV2.5 VP1 Cap蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO. 13)。發(fā)明具體內(nèi)容 定義除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng) 域中的普通技術(shù)人員所通常理解的意義相同。用于本發(fā)明的描述中的 術(shù)語僅僅是出于描述具體實施方案的目的，并不打算對本發(fā)明進行限 制。當用于本發(fā)明的說明書和隨附的權(quán)利要求中時，單數(shù)形式的"a"、 "an"和"the"意在也包含了復數(shù)的形式，除非文中另有明確指示。所有 在本文中提及的出版物、專利申請、專利和其它的參考文獻以其全文 引為參考。"AAV Cap"是指AAV Cap蛋白VP1、 VP2和VP3及其類似物。 "AAV Rep"是指AAV Rep蛋白及其類似物。"AAVTR"是指回文序列，包含基本上互補的、對稱排列的序列， 包括天然的AAV TR的類似物及其類似物。"生物學有效的"對于病毒載體的量來說，是指足以導致感染(或 轉(zhuǎn)導)和轉(zhuǎn)基因在靶細胞中表達的量。"嵌合的"對于病毒殼體或粒子來說，是指殼體或粒子包含來自 不同細小病毒、優(yōu)選不同AAV血清型的序列，如同Rabinowitz等在 2002年12月10日授權(quán)的美國專利6,491，卯7、標題為"重組細小病毒 載體以及審!l造方法(Recombinant parvovirus vectors and method of making)"中所描述的那樣，其公開內(nèi)容在此以其全文引為參考。"依賴病毒"是指眾所周知的包含腺相關(guān)病毒(AAV)的屬，包 括但不限于1型AAV 、 2型AAV 、 3型AAV 、 4型AAV 、 5型 AAV 、 6型AAV 、鳥AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV和羊AAV。 參見例如BernardN. Fields等的《病毒學》(Virology)第二巻第69章 (第三版，Lippincott-Raven Publishers)，其全部內(nèi)容在此引為參考。"雙鏈體載體"在本文中可以與"二聚的"或"自身互補的"載 體交換使用。雙鏈體細小病毒粒子可以包含，例如，含有病毒粒子DNA (vDNA)的細小病毒殼體。該vDNA是自身互補的，因此當從病毒殼 體中釋放時它可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。雙鏈體vDNA表現(xiàn)出為宿主細胞提 供不需要常規(guī)的細小病毒載體所需的第二鏈合成就可以被宿主細胞表 達(即轉(zhuǎn)錄和任選翻譯)的雙鏈DNA。適合用于本發(fā)明的雙鏈體載體 的例子在以Samulski等的名義于2004年2月12日出版的美國專利公 布No. 2004/0029106、題目為"雙鏈體細小病毒載體(Duplexed parvovirus vectors)"中有描述，其全部公開內(nèi)容在此合并引為參考。 雙鏈體載體基因組優(yōu)選含有足夠的包裝序列，以便包入選定的細小病 毒殼體(例如AAV殼體)中。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員將會認識到，雙鏈體VDNA可以不是在所有條件下都以雙鏈形式存在，但是在有利于 互補的核苷酸堿基退火的條件下有此能力。"雙鏈體細小病毒粒子" 包括雜交的、嵌合的和定向的病毒粒子。優(yōu)選雙鏈體細小病毒粒子具有AAV殼體，如上所述，它還可以是嵌合的或定向的殼體。"表達控制序列"是指調(diào)節(jié)與其可操作連接的核苷酸序列的表達 的一個或多個核酸序列。當表達控制序列控制和/或調(diào)節(jié)核苷酸序列的 轉(zhuǎn)錄和/或翻譯時，該表達控制序列與該核苷酸序列是"可操作連接的"。 表達控制序列的元件可以包括例如啟動子、增強子、內(nèi)部核糖體進入 位點(IRES)、轉(zhuǎn)錄終止子、起始密碼子、內(nèi)含子剪接信號和終止密 碼子。術(shù)語"表達控制序列"意在至少包含被設(shè)計用于影響表達的序 列，也可以包含其它與轉(zhuǎn)錄、翻譯、易位、分泌、分離等有關(guān)的元件， 例如前導序列和融合配偶序列。表達控制序列優(yōu)選被設(shè)計用于最小化 或消除不需要的框架內(nèi)和外的潛在起始密碼子以及不需要的潛在剪接 位點。可以包含序列例如多聚腺苷化序列(pA)以提供添加的polyA 尾巴，mRNA3'末端的腺嘌呤殘基鏈，該序列被稱為polyA序列。表 達控制序列可以被設(shè)計成增加mRNA的穩(wěn)定性。在昆蟲細胞中影響轉(zhuǎn) 錄和翻譯穩(wěn)定性的表達控制序列例如啟動子、以及影響翻譯的序列例 如Kozak序列，是已知的。表達控制序列可以被設(shè)計成通過按需增加 或降低表達水平來調(diào)節(jié)與它們可操作連接的核苷酸序列的表達。"帶側(cè)翼的"對于側(cè)翼有其它的元件的序列來說，是指相對于序 列來說，在上游和/或下游、即5'和/或3'存在一個或多個側(cè)翼元件。術(shù) 語"帶側(cè)翼的"不是為了表示序列必需是連續(xù)的。例如，在編碼轉(zhuǎn)入 基因和側(cè)翼元件的核酸之間可以有間插序列。"側(cè)翼"帶有兩個其它 元件(例如TR)的序列(例如轉(zhuǎn)基因)，是指一個元件位于序列的5' 端，另一個位于序列的3'端；但是，其間可以有間插序列。"雜交體"對于病毒粒子來說，是指病毒TR和病毒殼體來自不 同細小病毒的病毒粒子。優(yōu)選病毒TR和殼體來自AAV的不同血清型(例如，在國際專利公布WO 00/28004以及Chao等，(2000) Molecular Therapy2:619中描述的；其公開內(nèi)容在此以其全文合并。"與昆蟲細胞相容的"對于病毒載體、輔助功能或包裝功能來說， 是指促進昆蟲細胞被核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染和/或在該昆蟲細胞中表達異源核 酸的任何核酸序列。"包裝的病毒載體"等是指其功能是作為核酸序列的投送載體的 病毒粒子、例如細小病毒粒子，例如含有轉(zhuǎn)基因和側(cè)翼帶有TR的相關(guān) 表達控制序列、包裝在病毒殼體中的重組病毒載體。"細小病毒"是指細小病毒科，包括但不限于自主復制的細小病 毒和依賴病毒。自主細小病毒包括細小病毒屬、紅病毒(Erythrovirus) 屬、濃核病毒(Densovirus)屬、重復病毒(Iteravims)屬和Contravirus 屬的成員。示例的自主細小病毒包括但不限于小鼠細小病毒、牛細小 病毒、犬細小病毒、雞細小病毒、貓泛白細胞減少癥病毒、貓細小病 毒、鵝細小病毒和B19病毒。其它的自主細小病毒對于本領(lǐng)域的專業(yè) 技術(shù)人員來說是熟知的。參見例如Bernard N. Fields等的《病毒學》 (Virology)第二巻第69章(第三版，Lippincott-Raven Publishers); S丄Flint等的《病毒學原理》(Principles of Virology)(第二版，ASM Press, 2004)中關(guān)于細小病毒科特征的敘述。各種不同的自主細小病 毒以及AAV的不同血清型的基因組序列(和相應的氨基酸序列)、以 及TR與Cap和Rep多肽的序列在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。這樣的序 列可以在文獻或公共數(shù)據(jù)庫例如GenBank中發(fā)現(xiàn)。參見例如GenBank 登記號NC 002077、 NC 001863、 NC 001862、 NC 001829、 NC 001729、 NC 001701、 NC 001510、 NC 001401、 AF063497、 U897卯、AF043303、 AF028705、 AF028704、 J02275、 J01901、 J02275、 X01457、 AF288061、 AH009962、 AY028226、 AY028223、 NC 001358、 NC 001540，其公開 內(nèi)容在此以其全文引為參考。也參見例如Chiorini等，(1999) J. Virology 73:1309; Xiao等，(1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu等，(1996) Virology 221:208;國際專利公布WO 00/28061 、 WO 99/61601、 WO 98/11244;以及美國專利No. 6,156,303，它們的公開內(nèi)容在此以其 全文引為參考。關(guān)于AAV1、 AAV2和AAV3 TR序列的早期描述由匹 茲堡大學(University of Pittsburgh)的Xiao, X.在其1996年的PhD論 文"腺相關(guān)病毒(AAV) DNA復制和整合的性質(zhì)(Characterization of Adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration)"中提供， 其公開內(nèi)容在此以其全文引為參考。在后面的部分中將對病毒載體和 病毒殼體進行更詳細的描述。除非特別指明，"多肽"包括肽和蛋白。"重組體"是指與自然界中通常發(fā)現(xiàn)的不同的遺傳實體。當用于 多聚核苷酸或基因時，它是指多聚核苷酸是克隆、限制和/或連接步驟 與其它導致產(chǎn)生與自然界中發(fā)現(xiàn)的多聚核苷酸不同的構(gòu)建物的程序的 各種組合的產(chǎn)物。"重組病毒載體"是指含有一個或多個異源序列(即不是病毒來 源的多聚核苷酸序列)的重組多聚核苷酸載體。在重組細小病毒載體 的情況下，重組多聚核苷酸側(cè)翼具有至少一個、優(yōu)選兩個反向末端重 復序列(ITR)。"基本同源性"或"基本相似性"當用于核酸或其片段時，是指 適當?shù)暮塑账岵迦肫位騽h除片段與另一個核酸(或其互補鏈)進行 最適比對時，序列中至少大約95%到99%的核苷酸序列是一致的。"定向的"對于病毒殼體或粒子來說，是指具有趨向性的殼體或 粒子，例如在國際專利公布No. WO 00/28004中描述的那樣，該專利的 全部公開內(nèi)容在此引為參考。"治療性多肽"或"治療性產(chǎn)物"是指可以緩解、減輕或延遲由于在細胞或?qū)ο笾卸嚯娜鄙倩蛉毕荻a(chǎn)生的癥狀發(fā)作的多肽?；蛘?，"治療性多肽"指以其他方式給予對象益處的多肽，例如抗癌癥效果 或改進移植存活性。細胞被病毒"轉(zhuǎn)導"或"感染"是指病毒進入細胞建立起潛伏的 或活性的(即裂解)感染。細胞的"轉(zhuǎn)染"是指遺傳物質(zhì)被導入細胞以對細胞進行遺傳修飾。 轉(zhuǎn)染可以通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的各種方法來完成，例如轉(zhuǎn)導或電穿孔。"轉(zhuǎn)基因"在廣義上用于指任何整合到病毒載體中以在靶細胞中 表達的異源核苷酸序列和相關(guān)的表達控制序列，例如啟動子。本領(lǐng)域 的專業(yè)技術(shù)人員會認識到可以根據(jù)在靶細胞中促進轉(zhuǎn)基因表達的能力 來選擇表達控制序列。轉(zhuǎn)基因的例子是編碼治療性多肽的核酸。"載體"是指含有準備投送到宿主細胞中的多聚核苷酸的重組質(zhì) ?；虿《?，既可以是體外的也可以是體內(nèi)的。本文描述的發(fā)明總的來說涉及了用于生產(chǎn)包裝的細小病毒載體的 細胞、遺傳構(gòu)建物、方法和策略。細小病毒載體作為研究基因和多肽 表達的研究工具是高度有用的，在基因治療領(lǐng)域中也顯示出了良好的 前途。但是，使用細小病毒載體進行工作在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，并且 耗費時間，此使得它們的使用比理想的效率和成本效益要低。使用細 小病毒載體的一個具體障礙是生產(chǎn)感染性細小病毒粒子所需的耗時耗 力的過程。本發(fā)明的生產(chǎn)策略總的來說涉及培養(yǎng)本發(fā)明的包裝細胞以 產(chǎn)生被包裝的病毒載體。本發(fā)明的包裝細胞總的來說包括具有下面的 包裝細胞功能的細胞(1)病毒載體功能，(2)包裝功能，以及(3)輔 助功能。AAV的生產(chǎn)方法總的來說包括(1)提供組分功能，(2)將組分功能導入相容的細胞，以及(3)將細胞維持在足以產(chǎn)生AAV的條件下。 每個包裝細胞功能將在后面的部分中討論。本發(fā)明的方法可用于生產(chǎn)包裝的病毒載體?？偟膩碚f，包裝的病毒載體包括包裝在殼體例如細小病毒殼體、定向的AAV殼體、或嵌合的AAV殼體中的病毒載體。病毒載體和病毒殼體以及包裝的病毒載體的組分將在下面的部分中更 全面地討論。包裝細胞如上所述，本發(fā)明的包裝細胞一般來說包括具有下列包裝細胞功能的細胞(1)病毒載體功能，(2)包裝功能，(3)輔助功能，以及(4)相關(guān)的表達控制序列。在生產(chǎn)過程中，包裝細胞一般包括一種或多種 病毒載體功能以及包裝功能和輔助功能，足以導致病毒載體的表達和 包裝。這些不同的功能可以使用遺傳構(gòu)建物例如質(zhì)?；驍U增子， 一起 或分別提供給包裝細胞，它們在細胞系中可以存在于染色體外，或整 合到細胞的染色體中。細胞系可以提供有任何一種或多種已經(jīng)摻入的 所述功能，例如細胞系具有一種或多種摻入到染色體外或整合到細胞染色體DNA中的載體功能，細胞系具有一種或多種摻入到染色體外或 整合到細胞染色體DNA中的包裝功能，或細胞系具有摻入到染色體外 或整合到細胞染色體DNA中的輔助功能。編碼包裝細胞功能例如轉(zhuǎn)座 蛋白的核苷酸序列與至少一個用于在昆蟲細胞中表達的表達控制序列 可操作地連接。任何將一個或多個帶有包裝細胞功能的核苷酸序列導入用于復制 和包裝的細胞宿主的方法都可以使用，包括但不限于電穿孔、磷酸鈣 沉淀、微注射、陽離子或陰離子脂質(zhì)體、以及脂質(zhì)體與核定位信號相 結(jié)合。在使用病毒載體通過轉(zhuǎn)染提供包裝功能的實施方案中，可以使 用用于產(chǎn)生病毒感染的標準方法。本發(fā)明的核苷酸序列可以穩(wěn)定地導入昆蟲染色體中?？梢酝ㄟ^例 如使用含有與昆蟲基因組的區(qū)域高度同源的核苷酸序列的載體來幫助 將本發(fā)明的核苷酸序列摻入到基因組中。使用特異的序列，例如轉(zhuǎn)座 子，是將核苷酸序列導入基因組的另一種方法。通常，通過通常由加入到細胞中的核酸序列編碼的標記物基因的表達來選擇或鑒定經(jīng)歷了 這種"轉(zhuǎn)化"、即將核酸序列加入到細胞中的細胞。然后可以通過例如Southern印跡或聚合酶鏈反應(PCR)方法來確定核酸序列摻入到 基因組中。病毒載體功能本發(fā)明的包裝病毒載體的病毒載體組分一般包括至少一個轉(zhuǎn)基因 和用于控制轉(zhuǎn)基因表達的相關(guān)表達控制序列。病毒載體可以包括足以 確保轉(zhuǎn)基因整合到靶細胞的基因組中的順式作用功能。 一般來說，病 毒載體包含一部分細小病毒基因組，例如缺失了 rep和cap并用轉(zhuǎn)基因 及其相關(guān)表達控制序列代替的AAV基因組。轉(zhuǎn)基因一般側(cè)翼有兩個 AAVTR，代替了缺失的病毒rep和cap的0RF。包含了適當?shù)谋磉_控 制序列，例如組織特異性啟動子和其它適合用于促進轉(zhuǎn)基因在靶細胞 中組織特異性表達的調(diào)控序列。轉(zhuǎn)基因一般是可以表達以產(chǎn)生治療性 多肽或標記物多肽的核酸序列。病毒載體可以是任何適合的核酸構(gòu)建 物，例如DNA或RNA構(gòu)建物，可以是單鏈的、雙鏈的或雙鏈體。病毒載體功能可以被適合地提供為雙鏈體載體模板，正如在 Samulski等的美國專利公布No. 2004/0029106中描述的那樣(全部公開內(nèi)容在此引為關(guān)于其教導的雙鏈體載體的參考)。雙鏈體載體是二 聚體自身互補的(sc)多聚核苷酸(一般為DNA)。例如，可以選擇 雙鏈體載體的DNA以便由于鏈內(nèi)堿基配對形成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。雙鏈體 DNA載體的雙鏈可以包裝在病毒殼體內(nèi)。雙鏈體載體提供了可以與雙 鏈DNA病毒載體相比較的功能，可以減少對靶細胞合成通常由病毒包 殼的單鏈基因組的互補DNA的需要。被選擇用于病毒載體的TR(可分解的和不可分解的)優(yōu)選為AAV 序列，優(yōu)選具有血清型l、 2、 3、 4、 5和6?？煞纸獾腁AVTR不需要 有野生型TR序列(例如，野生型序列可以通過插入、缺失、截短或錯 義突變來改變)，只要TR介導所需的功能例如病毒包裝、整合和/或原病毒拯救等就行。TR可以是作為AAV反向末端重復序列起作用的 合成序列，例如在Samulski等的美國專利No. 5，478，745中描述的"雙 D序列"，該專利的全部公開內(nèi)容以其全文引為參考。典型情況下、 但不是必需的，TR來自同樣的細小病毒，例如，兩個TR序列都來自 AAV2。包裝功能包裝功能包括用于病毒載體的復制和包裝的基因，例如AAV rep 和cap。包裝功能可以包括例如對于病毒基因表達、病毒載體復制、病 毒載體從整合狀態(tài)的拯救、病毒基因表達以及病毒載體包裝到病毒粒 子中來說必需或有用的功能。包裝功能可以使用遺傳構(gòu)建物，例如質(zhì) ?；驍U增子， 一起或分開提供給包裝細胞。包裝功能可以存在于包裝 細胞中染色體之外，但是優(yōu)選整合到細胞的染色體DNA中。桿狀病毒包裝功能可以包括產(chǎn)生重組桿狀病毒所需的功能，例如 在Bac-Bac⑧表達系統(tǒng)(Invitrogen)中發(fā)現(xiàn)的和Luckow等，1993， J. Virol. 67，4566中描述的，包括含有Gus和/或CAT基因、表達/3-葡糖苷酸酶 和/或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的控制表達質(zhì)粒，用于生產(chǎn)重組桿狀病毒。來自一種以上AAV血清型的序列可以被合并用于生產(chǎn)AAV。例 如，AAVTR核苷酸序列可以來自一種血清型，例如AAV2，而任何其 它的核苷酸序列可以包括來自一種或多種其它血清型例如血清型3的 開放閱讀框架或編碼序列。AAV血清型1、 2、 3、 4和5是用于本發(fā)明 情況下AAV核苷酸序列的合適來源的例子。殼體組分包裝功能包括殼體組分。殼體組分優(yōu)選來自細小病毒殼體，例如 AAV殼體或嵌合的AAV殼體功能。適合的細小病毒殼體組分的例子 是來自細小病毒科例如自主細小病毒或依賴性病毒的殼體組分。例如， 殼體組分可以選自AAV殼體，例如AAV1、 AAV2、 AAV3、 AAV4、AAV5和/或AAV6殼體。殼體組分可以包括來自兩種或多種AAV殼體 的組分。此外，本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)相對于VP2和VP3補充VP1導致產(chǎn) 生更高百分率的感染性粒子。在一個實施方案中，細胞中補充的VP1 感染復數(shù)為培養(yǎng)物中至少100%的細胞提供了大約1、2或3的額外VP1 載體。無論VP1補充是怎樣完成的，該方法比不補充的情況產(chǎn)生了高 出至少大約10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 15、 160、 170、 180、 190或200倍的感染性病毒粒子。應該認識到這種VP1補充可以以各種方式完成。例如，本發(fā)明的 方法可以包括(a)提供昆蟲細胞；(b)將含有下列的編碼核苷酸序列的 一種或多種載體導入昆蟲細胞(i)側(cè)翼有TR的轉(zhuǎn)基因；以及(ii)包 括的Rep組分和Cap組分足以導致感染性細小病毒粒子包裝的桿狀病 毒包裝功能，其中相對于VP2和VP3補充VP1，足以增加感染性病毒 粒子的生產(chǎn)；(c)將用于在昆蟲細胞中表達的桿狀病毒輔助功能的編碼 核酸導入細胞；以及(d)將細胞在足以產(chǎn)生包裝的感染性細小病毒載體 的條件下培養(yǎng)。在下面實施例闡述的一種方法中， 一個Cap載體提供 VP1 /VP2/VP3，第二個VP1載體補充由Cap載體產(chǎn)生的VP1。因此， 在該方法中，補充可以如下實現(xiàn)(a)在昆蟲細胞中導入含有一種或多 種表達VP1、 VP2和VP3的核苷酸序列的Cap載體；以及(b)在昆蟲 細胞中導入含有表達VP1的核苷酸序列的VP1載體。C叩載體和VP1 載體一般以至少1的感染復數(shù)導入到昆蟲細胞中。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，VP1的過表達可以導致高水平的粒子降解。因此， 在本發(fā)明的一個實施方案中，VP1載體的表達控制序列與Cap載體的 表達控制序列相比，提供了相對較弱的表達。例如，合適的VP1載體 表達是Cap載體表達的大約1%到大約75%、 Cap載體表達大約1%到 大約50%、或Cap載體表達的大約1%到大約25%。較弱的表達可以使 用例如所提供的突變的多角體啟動子來提供。理想情況下，VP1的補充導致產(chǎn)生了大約10:10:80 VP1:VP2:VP3的分子比率。VP1的補充可 以導致產(chǎn)生的包裝的感染性細小病毒載體的量比不進行補充的相應方 法高出大約10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 15、 160、 170、 180、 190或200倍。殼體組分的選擇一般是根據(jù)例如靶細胞類型、所需的表達水平、 所表達的異源核苷酸序列的性質(zhì)、與病毒生產(chǎn)有關(guān)的問題等考慮因素。 例如，使用AAV1殼體對于靶向骨骼肌、肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(例如 腦)的細胞可能是有利的；AAV5用于靶向氣道和肺的細胞；AAV3用 于靶向骨髓細胞；AAV4用于腦的特定細胞(例如可增補的細胞)。一 整套AAV VP殼體蛋白包括VP1、 VP2和VP3。含有編碼AAVVP殼 體蛋白的核苷酸序列的ORF可以含有少于整套的VP蛋白。但是，在 優(yōu)選實施方案中提供了整套的VP蛋白。VP殼體蛋白可以提供在同樣 載體和/或在不同載體上的不同ORFs中。在更優(yōu)選的實施方案中， 一種或多種VP殼體蛋白是嵌合的蛋白， 含有來自兩種或多種病毒、優(yōu)選為兩種或多種AAV的氨基酸序列，正 如在Rabinowitz等2002年12月10日被授權(quán)的標題為"重組細小病毒 載體和制造方法(Recombinant parvovirus and method of making )"的 美國專利6,491,907中描述的那樣，該專利的全部公開內(nèi)容在此以其全 文引為參考。例如，嵌合病毒殼體可以包括來自腺相關(guān)病毒(AAV)的殼體區(qū) 域和來自B19病毒的至少一個殼體區(qū)域。嵌合的殼體可以包括例如具 有一個或多個B19殼體亞基的AAV殼體，例如AAV殼體亞基可以被 B19殼體亞基所取代。例如，在優(yōu)選實施方案中，AAV的VPl、 VP2 或VP3亞基可以被B19的VP1、 VP2或VP3亞基所取代。作為另一個 例子，嵌合的殼體可以包含2型AAV殼體，其中的2型VPl亞基被來 自1、 3、 4、 5或6型AAV殼體、優(yōu)選為3、 4或5型殼體的VPl亞基 所取代。或者，嵌合的細小病毒具有2型AAV殼體，其中的2型VP2亞基已經(jīng)被來自1、 3、 4、 5或6型AAV殼體、優(yōu)選為3、 4或5型殼 體的VP2亞基所取代。同樣的，其中來自1、 3、 4、 5或6型(更優(yōu)選 為3、 4或5型)AAV的VP3亞基取代了 2型AAV殼體的VP3亞基 的嵌合細小病毒是優(yōu)選的。作為另一種替代方案，其中兩個2型AAV 亞基被來自不同血清型AAV (例如l、 3、 4、 5或6型AAV)的亞基 所取代的嵌合細小病毒是優(yōu)選的。在本實施方案的示例的嵌合細小病 毒中，2型AAV的VP1和VP2、或VP1和VP3、或VP2和VP3亞基 被不同血清型的AAV (例如l、 3、 4、 5或6型AAV)的相應亞基所 取代。同樣地，在其它的優(yōu)選實施方案中，嵌合細小病毒具有1、 3、 4、 5或6型AAV殼體(優(yōu)選為2、 3或5型殼體)，其中的一個或兩個亞 基已經(jīng)被來自不同血清型者所取代，正如前面對2型AAV所描述的那 樣。在其它實施方案中， 一個細小病毒的次要亞基可以用其它細小病 毒的任何次要亞基所取代(例如，2型AAV的VP2可以用3型AAV 的VP1取代；B19的VP1可以取代AAV的VP1和/或VP2)。同樣的， 一個細小病毒的主要殼體亞基可以用其他細小病毒的主要殼體亞基所 取代。本發(fā)明還提供了含有AAV殼體的嵌合細小病毒，其中在主要 VP3亞基中的環(huán)狀區(qū)被自主細小病毒的主要亞基的環(huán)狀區(qū)(優(yōu)選為相 應的環(huán)狀區(qū))所取代。具體來說，來自1、 2、 3、 4、 5或6型AAV的 VP3亞基的環(huán)狀區(qū)1、 2、 3和/或4被自主細小病毒的主要亞基的環(huán)狀 區(qū)所取代。特別優(yōu)選的嵌合病毒殼體包括AAV2.5殼體，它含有編碼AAV2.5 VP1殼體蛋白的核苷酸序列，其中所表達的蛋白具有下列的突變263 Q— A; 265插入T; 705 N— A; 708 V— A;以及716 T— N (SEQ ID NO. 13)。復制組分包裝功能也包括復制組分。例如，復制組分可以包括Rep78、Rep68、 Rep52、 Rep40和/或其各種類似物。使用少于4種Rep酶是可 能的，例如只有Rep:78/R印68酶之一和只有Rep52/Rep40酶之一。優(yōu) 選情況下，在昆蟲細胞中表達的Rep序列是Rep 78和Rep52。輔助功能包裝細胞功能也包括輔助功能。輔助功能包括建立包裝細胞的活 性感染所需的輔助病毒元件。輔助功能的存在對于啟動病毒載體的包 裝來說是需要的。例子包括來自腺病毒、桿狀病毒和/或皰疹病毒的足 以導致病毒載體包裝的功能。例如，腺病毒輔助病毒功能一般包括腺 病毒組分Ela、 Elb、 E2a、 E4和VARNA。包裝功能可以通過用所需 的病毒感染包裝細胞來提供。包裝功能可以使用遺傳構(gòu)建物例如質(zhì)粒 或擴增子， 一起或分別提供給包裝細胞。包裝功能可以存在于包裝細 胞中染色體之外，但是優(yōu)選整合到細胞的染色體DNA中。感染復數(shù)(MOI)和感染時間將依賴于使用的病毒類型和使用的 包裝細胞系。可以使用任何適合的輔助載體。該載體可以通過本領(lǐng)域 已知的任何適合的方法導入到包裝細胞中。在昆蟲細胞用作包裝細胞 的優(yōu)選方法中，桿狀病毒可以用作輔助病毒。適合的提供輔助功能的方法使用了帶有有效生產(chǎn)AAV所需的所 有輔助基因的非感染性腺病毒小質(zhì)粒(Ferrari等，(1997) Nature Med. 3:1295; Xiao等，(1998) J. Virology 72:2224)。使用腺病毒小質(zhì)粒獲 得的rAAV滴度比使用野生型腺病毒感染的常規(guī)方法獲得的滴度高40 倍(Xiao等，(1998) J. Virology 72:2224)。這種方法避免了需要用腺 病毒進行共轉(zhuǎn)染(Holscher等，(1994), J. Virology 68:7169; Clark等， (1995) Hum. Gene Ther. 6:1329; Trempe和Yang， (1993)，在第5次細 小病毒專題討論會中，Crystal River ， Fla.)。在AAV包裝方法中皰疹病毒也可以用作輔助病毒。編碼AAV Rep 蛋白的雜交體皰疹病毒可以有利地促進可更加放大的AAV載體生產(chǎn)計劃。已經(jīng)描述了表達AAV-2rep和cap基因的I型雜交單純性皰疹病毒 (HSV-I)載體(Conway等，(1999) Gene Therapy 6:986和WO 00/17377，其公開內(nèi)容在此以其全文引入)。將帶有輔助功能的核苷酸序列導入用于復制和包裝的細胞宿主的 任何方法都可以使用，包括但不限于電穿孔、磷酸鈣沉淀、微注射、 陽離子或陰離子脂質(zhì)體、以及脂質(zhì)體與核定位信號的組合。在通過使 用病毒載體轉(zhuǎn)染或使用輔助病毒感染而提供輔助功能的實施方案中， 可以使用標準的產(chǎn)生病毒感染的方法。表達控制序列病毒載體功能、包裝功能和輔助功能每個都與一個或多個相關(guān)的 表達控制序列、例如一個或多個啟動子序列、翻譯起始序列和終止密 碼子可操作地連接。為了在昆蟲細胞中進行生產(chǎn)，可以使用與昆蟲細 胞基因表達相容的轉(zhuǎn)錄啟動子。對表達控制序列進行選擇以最大化感 染性病毒粒子的生產(chǎn)。細胞系用作包裝細胞的優(yōu)選細胞系是昆蟲細胞系，優(yōu)選來自鱗翅目的細 胞或從該目細胞衍生的細胞。任何允許AAV復制并可以在培養(yǎng)中維持 的昆蟲細胞都可以用于本發(fā)明中。優(yōu)選昆蟲細胞來自夜蛾(Spodoptera 或Trichopulsia)屬。例子包括草地貪夜蛾，例如Si9或Sf21細胞系、 果蠅(Drosophila)屬的細胞系、或蚊子細胞系，例如白紋伊蚊(Aedes albopictus)衍生的細胞系。優(yōu)選的細胞系是草地貪夜蛾Sf9細胞系。 其它的例子包括High FiveTM細胞(BRI-TN-5B1-4)和Mimic-SF9細胞。 從任何本文列出的細胞衍生的細胞也可以用于本發(fā)明的實踐中。下面的參考文獻在此因它們關(guān)于使用昆蟲細胞進行異源多肽表 達、將核酸導入這樣的細胞的方法以及在培養(yǎng)中維持這樣的細胞的方 法而引為參考《分子生物學方法》(Methods in Molecular Biology)，Richard主編，Humana Press, NJ (1995); O'Reilly等，《桿狀病毒表達 載體實驗室手冊》(Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual), Oxford Univ. Press (1994); Samulski等，J. Vir. 63:3822-8 (1989); Kajigaya等，Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991); Ruffmg等，J. Vir. 66:6922-30 (1992); Kimbauer等，Vir. 219:37-44 (1996); Zhao等，Vir.272:382-93 (2000);以及Samulski等，美國專利 No.6，204,059。生長細胞昆蟲細胞在培養(yǎng)物中的生長條件以及在培養(yǎng)中異源產(chǎn)物在昆蟲細 胞中的生產(chǎn)描述在Richard (1995)，同上;O'Reilly等，(1994)同上； Samulski等，(1989)同上；Kajigaya等，(1991)同上；Ruffing等，(1992) 同上；Kirnbauer等，(1996)同上；Zhao等，(2000)同上；以及Samulski 等，美國專利No. 6,204,059。生產(chǎn)策略本發(fā)明提供了制造包裝的病毒載體的方法。該方法一般包括將下 列的包裝細胞功能導入昆蟲細胞(l)病毒載體功能，(2)包裝功能，(3) 輔助功能，以及(4)相關(guān)的表達控制序列。這些功能應該足以導致有被 囊的病毒載體的產(chǎn)生。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，提供這些功能的各種構(gòu)造 是可能的。在每種情況下，獲得的包裝細胞然后被孵育以產(chǎn)生被包裝 的病毒載體，然后使用在本技術(shù)領(lǐng)域中已知的分離技術(shù)分離包裝的病 毒載體。將帶有病毒載體功能、包裝功能和輔助功能的核苷酸序列導入用 于復制和包裝的細胞宿主的任何方法都可以使用，包括但不限于電穿 孔、磷酸鈣沉淀、微注射、陽離子或陰離子脂質(zhì)體、以及脂質(zhì)體與核 定位信號的組合。在通過使用病毒載體轉(zhuǎn)染提供病毒載體功能的實施 方案中，可以使用標準的產(chǎn)生病毒感染的方法。獲得的包裝細胞本身是本發(fā)明的一個方面。本發(fā)明也包含了制造 感染性AAV粒子的方法，其中包裝細胞被維持在足以產(chǎn)生感染性粒子 的條件下。包裝的病毒載體的純化不含有污染性輔助病毒的載體保存物可以通過本技術(shù)領(lǐng)域任何已 知的方法來獲得。例如，雙鏈體病毒和輔助病毒可以易根據(jù)大小區(qū)分 開。也可以根據(jù)對肝素底物的親和性將雙鏈體病毒與輔助病毒分開(Zolotukhin等(1999) Gene Therapy 6:973)。優(yōu)選使用缺失的復制缺 陷性輔助病毒，以便任何污染性輔助病毒不是復制成分。另一種替代 方法是可以使用缺少晚期基因表達的腺病毒輔助病毒，因為介導雙鏈 體病毒的包裝只需要腺病毒早期基因表達。晚期基因表達缺陷的腺病 毒突變體在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的(例如tsl00K和tsl49腺病毒突變 體)。目的產(chǎn)物一般來說，目的產(chǎn)物是基因產(chǎn)物，它可以是多肽、RNA分子或其 它希望在哺乳動物細胞或昆蟲細胞中表達的基因產(chǎn)物。目的產(chǎn)物可以 包括例如用作標記物多肽以評估細胞的轉(zhuǎn)化和表達的多肽、融合蛋白、 具有所需生物活性的多肽、可以彌補遺傳缺陷的基因產(chǎn)物、RNA分子、 轉(zhuǎn)錄因子、以及其它在調(diào)控和/或表達中有影響的基因產(chǎn)物。例如，目 的基因產(chǎn)物包括了提供所需效果或調(diào)控功能的核苷酸序列(例如轉(zhuǎn)座 子、轉(zhuǎn)錄因子)。目的基因產(chǎn)物的例子包括但不限于激素受體(例 如鹽皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素和甲狀腺激素受體)；膜內(nèi)蛋白(例如TM-1 和TM-7);細胞內(nèi)受體(例如孤兒受體、類視黃醇受體、維生素D3 和維生素A受體)；信號分子(例如激酶、轉(zhuǎn)錄因子或分子例如信號 轉(zhuǎn)導蛋白和細胞因子超家族(例如紅細胞生成素、生長激素、干擾素、 和白細胞介素、和集落刺激因子)的轉(zhuǎn)錄受體的激活劑)；G-蛋白偶 聯(lián)受體，例如激素、降鈣素、腎上腺素、胃泌素以及旁分泌或自分泌 介質(zhì)，例如生長抑素(stomatostatin)或前列腺素；神經(jīng)遞質(zhì)受體(去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺或乙酰膽堿)；病原性抗原，可以是病 毒、細菌、過敏原或癌性來源的抗原；以及酪氨酸激酶受體(例如胰 島素生長因子和神經(jīng)生長因子)。目前在AAV介導的基因治療試驗中使用的基因產(chǎn)物也是重要的基因產(chǎn)物(例如CFTR和因子IX)。目的基因產(chǎn)物可以是治療性基因產(chǎn)物。治療性基因產(chǎn)物是當在耙細胞中表達時提供所需治療效果的多肽、RNA分子或其它基因產(chǎn)物， 這些治療效果例如除去被感染的細胞、表達具有所需生物活性的多肽、 和/或表達用于反義治療的RNA分子(例如調(diào)控耙細胞基因組中的內(nèi)源 或異源基因的表達)。例如Goldsmith等的WO 90/07936描述了一種在 組織中除去特定細胞的系統(tǒng)，這是通過使用只能在該組織中被激活的 啟動子以僅在所需細胞中表達治療性基因產(chǎn)物來進行的。例如，在將 要接受異源移植(heterologous transplant)或移植(graft)的患者中， 可以施用針對靶向移植物的T細胞的毒素的編碼多核苷酸。AAV蛋白可以是目的基因產(chǎn)物。例如，Rep蛋白序列，例如Rep78 或Rep68或其功能性片段，可以是在哺乳動物細胞或昆蟲細胞中表達 的目的基因產(chǎn)物。編碼Rep78和/或Rep68的核酸序列，如果存在于病 毒載體中并在用本發(fā)明產(chǎn)生的rAAV轉(zhuǎn)導的哺乳動物細胞或昆蟲細胞 中表達的話，可以將rAAV整合到被轉(zhuǎn)導的哺乳動物細胞或昆蟲細胞 的基因組中。通過使任何其它的用rAAV導入到細胞中的目的基因產(chǎn) 物長期或永久表達，Rep78和/或Rep68在rAAV轉(zhuǎn)導或感染的哺乳動 物細胞或昆蟲細胞中的表達可以對rAAV的某些應用提供優(yōu)勢。選擇性標記物是一種類型的目的基因產(chǎn)物。選擇性標記物是基因 序列或由該基因序列編碼的多肽。選擇性標記物編碼的多肽的表達使 得被含有選擇性標記物的表達載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞能夠容易地與不含 有編碼選擇性標記物的表達載體的宿主細胞區(qū)分開來。實例是這樣的 宿主細胞，其可以使用選擇性標記物，以便在否則將殺死宿主細胞的 選擇性過程中存活下來，例如用抗生素處理。這樣的選擇性標記物可以是一種或多種抗生素抗性因子，例如新霉素抗性(例如neo)、潮霉素抗性和嘌呤霉素抗性。選擇性標記物也可以是細胞表面標記物，例 如神經(jīng)生長因子受體或其截短的版本。然后可以使用針對細胞表面標 記物的抗體來篩選表達細胞表面標記物的細胞。針對細胞表面標記物 的抗體可以被直接標記(例如用熒光底物)，或者可以使用第二個標 記的抗體或底物與針對細胞表面標記物的抗體的結(jié)合來檢測?；蛘?， 細胞可以使用酶、例如將前毒素(更昔洛韋)轉(zhuǎn)化為毒素的單純性皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSVTK)或?qū)⑶岸舅?'-氟胞嘧啶(5'-FC)轉(zhuǎn) 化成毒素5'-氟尿嘧啶(5'-FU)的細菌胞嘧啶脫氨酶(CD)、來進行 負篩選?；蛘?，任何編碼多肽的核酸序列，只要多肽易于被抗體識別， 都可以用作選擇性標記物。編碼選擇性標記物的核酸可以編碼例如P-內(nèi)酰胺酶、熒光素酶、 綠色熒光蛋白(GFP) 、 /3-半乳糖苷酶或其它在本技術(shù)領(lǐng)域中情況被了 解的報告基因，包括細胞表面標記物，例如CD4或截短的神經(jīng)生長因 子(NGFR)(對于GFP，參見WO 96/23810; Heim等，Current Biology 2:178-182 (1996); Heim等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995);或Heim 等，Science 373:663-664 (1995);對于j8-內(nèi)酰胺酶，參見WO 96/30540)。 在優(yōu)選實施方案中，選擇性標記物是^-內(nèi)酰胺酶。編碼選擇性標記物 的核酸可以編碼例如熒光多肽。熒光多肽可以通過測定任何定量性熒 光特征的量例如特定波長下熒光的量、或在發(fā)射光譜范圍內(nèi)熒光的積 分來檢測。最適情況下，選擇具有容易檢測的熒光特征的熒光多肽。 測量熒光的技術(shù)對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是眾所周知的。編碼哺乳動物細胞中表達的目的基因產(chǎn)物的至少一個核苷酸序列 中，核苷酸序列與至少一個哺乳動物細胞相容的表達控制序列例如啟 動子可操作地連接。在本技術(shù)領(lǐng)域中已知有許多這樣的啟動子。本領(lǐng) 域的專業(yè)技術(shù)人員將會理解，優(yōu)選的啟動子包括可誘導的、組織特異 性的或細胞周期特異性的啟動子。例如，已經(jīng)報道E2F啟動子可以在 體內(nèi)介導腫瘤選擇性的、特別是神經(jīng)細胞腫瘤選擇性的表達，而它們原本在這些細胞是體內(nèi)抑制的(Parr等，Nat Med. 3:1145-9 (1997))。 本發(fā)明的應用本發(fā)明的另一個方面是使用本文描述的病毒載體、包裝功能和輔 助病毒功能將核苷酸序列投送到細胞中的方法。病毒載體可以通過本 領(lǐng)域任何適合的已知方法體外投送到細胞中或體內(nèi)投送到對象中?；?者，病毒載體也可以象本技術(shù)領(lǐng)域中已知的那樣，離體(ex vivo)投 送到細胞中，然后給對象施用該細胞。本發(fā)明的方法和病毒載體也可以有利地用于治療具有代謝病癥 (例如鳥氨酸(ornithine)氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶缺陷)的個體。在這樣的應 用中雙鏈體載體是優(yōu)選的。這樣的病癥一般需要被包裝的病毒載體相 對快速地啟動治療性多肽的表達。作為另一個可選方案，可以施用病 毒載體以提供能夠增加移植存活能力的藥劑(例如超氧化物歧化酶) 或?qū)箶⊙Y的藥劑。此外，對wtAAV載體具有不應性的樹突狀細胞(DC) (Jooss等， (1998) 72:4212)對于本文公開的病毒載體來說是可感染的。因此，作 為另一方面，病毒載體提供了將核苷酸序列投送到DC的方法，例如誘 導針對所述核苷酸序列編碼的多肽的免疫反應。優(yōu)選核苷酸序列編碼 來自感染性因子的抗原或癌癥抗原。作為另一方面，病毒載體可以用于在需要調(diào)控轉(zhuǎn)基因(例如編碼 激素或生長因子的轉(zhuǎn)基因，如下所述)表達水平的情況下投送異源核 苷酸序列。與rAAV載體相比，本文公開的病毒載體更快速地表達轉(zhuǎn) 基因，使得這些基因投送介質(zhì)更適合治療方案。任何異源的核苷酸序列(如上文定義的)都可以通過病毒載體投 送。目的核酸包括編碼多肽、優(yōu)選為治療性(例如用于醫(yī)學或獸醫(yī)應 用)或免疫原性(例如用于疫苗)的多肽的核酸。優(yōu)選異源核苷酸序列的長度將少于大約2.5 kb (更優(yōu)選長度少于大約2.4kb、更優(yōu)選少于大約2.2 kb、更優(yōu)選少于大約2.0kb)，以利 于雙鏈體模板被細小病毒(例如AAV)殼體的包裝。示例的核苷酸序 列編碼因子IX、因子X、溶酶體酶(例如與泰-薩氏(Tay-Sachs)病有 關(guān)的氨基己糖苷酶A或與亨特(Hunter)綜合征/MPS II有關(guān)的艾杜 糖醛酸硫酸酯酶)、紅細胞生成素、血管生成抑制素、內(nèi)皮抑制素、 超氧化物歧化酶、球蛋白、瘦蛋白、過氧化氫酶、酪氨酸羥化酶以及 細胞因子(例如a-干擾素、^-干擾素、7-干擾素、白介素-2、白介素-4、 白介素-12、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、淋巴細胞毒素等)、肽生 長因子和激素(例如生長激素、胰島素、胰島素類生長因子1和2、血 小板源性生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、神經(jīng)生長 因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3或-4、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細胞源性生長 因子、轉(zhuǎn)化生長因子-a和-)3等)、受體(例如腫瘤壞死因子受體)。 在另一個示例的實施方案中，異源核苷酸序列編碼單克隆抗體、優(yōu)選 單鏈單克隆抗體或針對癌癥或腫瘤抗原(例如HER2/neu，和下文描述 者)的單克隆抗體。其它說明性的異源核苷酸序列編碼自殺基因產(chǎn)物 (胸腺嘧啶激酶、胞嘧啶脫氨酶、白喉毒素、細胞色素P450、脫氧胞 苷激酶以及腫瘤壞死因子)、對癌癥治療中使用的藥物賦予抗性的蛋 白、以及腫瘤抑制劑基因產(chǎn)物。作為另一種選擇方案，轉(zhuǎn)基因可以編碼報告多肽(例如酶例如綠 色熒光蛋白、堿性磷酸酶)。或者，在本發(fā)明的特定實施方案中，目的核酸可以編碼反義核酸、 核酶(例如在美國專利No. 5,877,022中描述的那些)、影響剪接體介 導的反式剪接的RNA(參見Puttaraju等，(1999) Nature Biotech. 17:246; 美國專利No. 6,013,487;美國專利No. 6,083,702)、介導基因沉默的 干擾RNA (RNAi)(參見Sharp等，(2000) Science 287:2431)或其它 非翻譯的RNA，例如"指導"RNA (Gorman等，(1998) Proc. Nat. Acad.Sci. USA 95:4929; Yuan等的美國專利No. 5,869,248)等。病毒載體也可以編碼與宿主染色體上的基因座享有同源性并與其 重組的異源核苷酸序列。該方法可以用于校正宿主細胞中的遺傳缺陷。本發(fā)明也可以用于在對象中表達免疫原性多肽，例如用于免疫接 種。核酸可以編碼本技術(shù)領(lǐng)域中已知的任何目的免疫原，包括但不限 于來自人類免疫缺陷病毒、流感病毒、gag蛋白、腫瘤抗原、癌癥抗原、 細菌抗原、病毒抗原等的免疫原。細小病毒用作疫苗在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的(參見例如Miyamura 等，(1994) Proc. Nat Acad. Sci USA 91:8507; Young等的美國專利Nos. 5，916，563， Mazzara等的美國專利5,905,040， Samulski等的美國專利 No. 5，882，652、美國專利No. 5,863,541;其公開內(nèi)容在此以其全文引為 參考)?？乖梢源嬖谟诩毿〔《镜臍んw中?；蛘?，抗原可以從導入 到重組載體基因組中的異源核酸表達。任何目的免疫原都可以由細小 病毒載體提供。本技術(shù)領(lǐng)域中熟知的目的免疫原包括但不限于來自人 類免疫缺陷病毒、流感病毒、gag蛋白、腫瘤抗原、癌癥抗原、細菌抗 原、病毒抗原等的免疫原。免疫原性多肽或免疫原可以是適合保護對象免于疾病的任何多 肽，所述基本包括但不限于微生物、細菌、原生動物、寄生蟲和病毒 性疾病。例如，免疫原可以是正粘病毒免疫原(例如流感病毒免疫原， 如流感病毒血細胞凝集素(HA)表面蛋白或流感病毒核蛋白基因，或 馬流感病毒免疫原)、或慢病毒免疫原(例如馬傳染性貧血病毒免疫 原、猿免疫缺陷病毒(SIV)免疫原、或人類免疫缺陷病毒(HIV)免 疫原，如HIV或SIV包膜GP160蛋白、HIV或SIV基質(zhì)/殼體蛋白、 以及HIV或SIV的gag、 pol和env基因產(chǎn)物)。免疫原也可以是砂粒 病毒免疫原(例如拉沙熱病毒免疫原，如拉沙熱病毒核殼體蛋白基因 和拉沙熱包膜糖蛋白基因)、痘病毒免疫原(例如牛痘，如牛痘L1或L8基因)、黃病毒免疫原(例如黃熱病病毒免疫原或日本腦炎病毒免 疫原)、線狀病毒免疫原(例如埃博拉病毒免疫原，或馬堡病毒免疫原、例如NP和GP基因)、布尼亞病毒免疫原(例如RVFV、 CCHF 和SFS病毒)、或冠狀病毒免疫原(例如傳染性人類冠狀病毒免疫原， 如人類冠狀病毒包膜糖蛋白基因，或豬傳染性胃腸炎病毒免疫原，或 禽傳染性支氣管炎病毒免疫原)。免疫原還可以是脊髓灰質(zhì)炎(polio) 免疫原、皰疹抗原(例如CMV、 EBV、 HSV免疫原)、腮腺炎免疫原、 麻疹免疫原、風疹免疫原、白喉毒素或其它白喉免疫原、百日咳抗原、 肝炎(例如甲肝或乙肝)免疫原，或任何在本技術(shù)領(lǐng)域已知的其它疫 苗免疫原?；蛘?，免疫原可以是任何腫瘤或癌癥細胞抗原。優(yōu)選腫瘤或癌癥 抗原表達在癌細胞表面上。示例的癌癥和腫瘤細胞抗原描述在S. A. Rosenberg, (1999) Immunity 10:281中。其它說明性的癌癥和腫瘤抗原 包括但不限于BRCA1基因產(chǎn)物、BRCA2基因產(chǎn)物、gp100、酪氨酸 酶、GAGE-1/2、 BAGE、 RAGE、 NY-ESO-l、 CDK4、 /3-聯(lián)蛋白、MUM-1、 Caspase胱天蛋白酶-8、 KIAA0205、 HPVE、 SART-1、 PRAME、 p15、 黑素瘤腫瘤抗原(Kawakami等，(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515) ; Kawakami等，(1994) J. Exp. Med.， 180:347; Kawakami等， (1994) Cancer Res. 54:3124)，包括MART-1 (Coulie等，(1991) J. Exp. Med. 180:35) 、 gpl00(Wick等，(1988) J. Cutan. Pathol. 4:201 )和MAGE 抗原MAGE糧l、MAGE-2和MAGE-3( Van der Bruggen等，(1991) Science 254:1643); CEA、 TRP-l、 TRP-2、 P-15和酪氨酸酶(Brichard等，(1993) J. Exp. Med. 178:489); HER-2/neu基因產(chǎn)物(美國專利No. 4,968,603)、 CA125、 LK26、 FB5 (內(nèi)皮唾液酸蛋白)、TAG 72、 AFP、 CA19-9、 NSE、 DU-PAN-2、 CA50、 SPan-l、 CA72-4、 HCG、 STN (sialyl Tn抗 原)、c-erbB-2蛋白、PSA、 L-CanAg、雌激素受體、乳脂球蛋白、p53 腫瘤抑制蛋白(Levine， (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623)、粘蛋白 抗原(國際專利公布WO卯/05142)、端粒酶；核基質(zhì)蛋白；前列腺酸 磷酸酶；乳頭狀瘤病毒抗原；以及與下列癌癥有關(guān)的抗原黑素瘤、轉(zhuǎn)移瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、非何 杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、白血病、子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌、胰腺癌等(參見例如Rosenberg, (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91)。異源性核苷酸序列可以編碼任何希望在體外、離體或體內(nèi)細胞中 產(chǎn)生的多肽。例如，病毒載體可以被導入到培養(yǎng)的細胞中，并從其分 離表達的基因產(chǎn)物。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員將會理解，目的異源核苷酸序列可以與適 當?shù)目刂菩蛄锌刹僮鞯剡B接。例如，異源核酸可以與表達控制元件可 操作地連接，例如轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號、復制起點、多聚腺苷化信號、 以及內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)、啟動子、增強子等。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員將會認識到，可以根據(jù)所需的水平和組織 特異性表達來使用各種不同的啟動子/增強子元件。啟動子/增強子可以 是組成型的或誘導型的，這依賴于所需的表達模式。啟動子/增強子可 以是固有的或外來的，可以是天然的或合成的序列。所謂外來的，其 意在指轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域在導入轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的野生型宿主中沒有被發(fā) 現(xiàn)。最優(yōu)選啟動子/增強子對于被處理的靶細胞或?qū)ο笫枪逃械?。也?yōu) 選啟動子/增強子元件對于轉(zhuǎn)基因來說是固有的。選擇啟動子/增強子使 得它可以在目的靶細胞中發(fā)揮作用。哺乳動物或昆蟲的啟動子/增強子 也是優(yōu)選的。啟動子/增強子元件可以是組成型或誘導型。在希望對轉(zhuǎn)基因的表達提供調(diào)控的那些應用中，誘導型表達控制 元件是優(yōu)選的。用于基因投送的誘導型啟動子/增強子元件優(yōu)選為組織 特異性啟動子/增強子元件，包括肌肉特異性(包括心肌、骨骼肌和/或 平滑肌)、神經(jīng)組織特異性(包括腦特異性)、肝特異性、骨髓特異性、胰腺特異性、脾臟特異性、視網(wǎng)膜特異性和肺特異性的啟動子/增 強子元件。其它的誘導型啟動子/增強子元件包括激素誘導的和金屬誘 導的元件。示例的誘導型啟動子/增強子元件包括但不限于Tet開/關(guān)元 件、RU486誘導型啟動子、蛻皮激素誘導型啟動子、雷帕霉素誘導型 啟動子以及金屬硫蛋白啟動子。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因在靶細胞中被轉(zhuǎn)錄然后翻譯的實施方案中，為 了有效地翻譯插入的編碼蛋白的序列， 一般需要特定的起始信號。這 些外源的翻譯控制序列可以包括ATG起始密碼子和相鄰序列，它們可 以是各種不同來源的，包括天然的和合成的。本發(fā)明的方法也提供了將異源核苷酸序列投送到廣范圍的細胞、 包括分裂的和不分裂的細胞中的方法。本發(fā)明可以用于將目的核苷酸 序列在體外投送到細胞中，用于例如在體外產(chǎn)生多肽或用于離體(ex vivo)基因治療。本發(fā)明的細胞、藥物制劑和方法也可以用于將核苷酸 序列投送到需要它的對象中用于例如表達免疫原性的或治療性多肽的 方法。通過這種方式，可以在對象中體內(nèi)生產(chǎn)多肽。對象可能因為對 象具有該多肽的缺陷、或者因為在對象中產(chǎn)生該多肽作為治療或其他方法可以給予某些治療效果、和象下面進一步解釋的那樣而需要這種 多肽。總的來說，本發(fā)明可以用于投送對治療或緩解與涉及基因表達的 任何病癥有關(guān)的癥狀具有生物學效應的任何外源核酸。說明性的疾病 狀態(tài)包括但不限于囊性纖維變性(以及其它的肺部疾病)、A型血 友病、B型血友病、地中海貧血、貧血癥和其它血液疾病、AID、阿茨 海默氏病、帕金森氏癥、亨廷頓氏病、肌蔞縮性側(cè)索硬化、癲癇、以 及其它的神經(jīng)性疾病、癌癥、糖尿病、肌營養(yǎng)不良(例如杜氏(Duchenne) 肌營養(yǎng)不良癥、貝克(Becker)肌肌營養(yǎng)不良癥)、高雪(Gauchers) 病、胡爾勒氏(Hurler's)病、腺嘌呤脫氨酶缺乏癥、糖原儲積病和其 它的代謝缺陷、視網(wǎng)膜退化病(以及其它的眼病)、實體器官(例如腦、肝、腎、心)的疾病等。基因轉(zhuǎn)移對于理解疾病狀態(tài)和為疾病狀態(tài)提供治療方法具有顯著 的潛在應用。有許多遺傳疾病，其中缺陷的基因已經(jīng)知道并被克隆。 總的來說，上述的疾病狀態(tài)分為兩類缺陷狀態(tài)，通常為酶，它們一 般以隱性方式遺傳；以及不平衡狀態(tài)，可以包括調(diào)控或結(jié)構(gòu)蛋白，它 們一般以顯性方式遺傳。對于缺陷狀態(tài)的疾病來說，基因轉(zhuǎn)移可以用 于將正常的基因帶入受影響的組織中進行替代療法，以及使用反義突 變?yōu)榧膊?chuàng)建動物模型。對于不平衡的疾病狀態(tài)來說，基因轉(zhuǎn)移可以 用于在模型系統(tǒng)中產(chǎn)生疾病狀態(tài)，然后可以被用于消除該疾病狀態(tài)的 嘗試中。因此，本發(fā)明的方法可以用于治療遺傳疾病。當用于本發(fā)明 時，疾病狀態(tài)通過部分或完全地治療了引起疾病或使疾病更加嚴重的 缺陷或不平衡而得以治療。使用核酸序列的位點特異性重組來引起突 變或校正缺陷也是可能的。本發(fā)明也可以用于為體外或體內(nèi)細胞提供反義核酸。反義核酸在 靶細胞中的表達減少細胞表達特定蛋白。因此，可以使用反義核酸來 降低需要它的對象中特定蛋白的表達。反義核酸也可以施用于給體外 細胞，以調(diào)節(jié)細胞生理，例如優(yōu)化細胞或組織培養(yǎng)系統(tǒng)。最后，本發(fā)明還在診斷和篩選方法中發(fā)現(xiàn)了應用，通過它使轉(zhuǎn)基 因在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因動物模型中短暫地或穩(wěn)定地表達?？偟膩碚f，本發(fā)明可以用于將任何異源核酸投送到體外、離體或 體內(nèi)細胞中。對象、藥物制劑、疫苗及給藥模式本發(fā)明可以用于獸醫(yī)和醫(yī)學應用。上面描述的離體基因投送方法 的適合對象包括鳥類(例如雞、鴨、鵝、鵪鶉、火雞和雉)和哺乳動 物(例如人類、牛、羊、山羊、馬、貓、狗和兔)，其中優(yōu)選為哺乳動物。人類對象是最優(yōu)選的。人類對象包括新生兒、嬰幼兒、青少年 和成人。在特定的實施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其在可藥用的 載體和/或其它醫(yī)用劑、藥劑、載體、佐劑、稀釋劑等中含有本發(fā)明的 病毒粒子。對于注射來說，載體一般為液體。對于其它給藥方法來說， 載體可以是固體或液體。對于吸入給藥來說，載體應該是可吸入的， 優(yōu)選為固體或液體顆粒形式。對于注射介質(zhì)來說，優(yōu)選使用含有通常 用于注射溶液的添加劑例如穩(wěn)定劑、鹽或鹽水、和/或緩沖液的水。示例的可藥用載體包括無菌無熱原的水和無菌無熱原的磷酸鹽緩 沖鹽水。生理可接受的載體包括可藥用的載體?？伤幱玫妮d體是指不 是生物或者其他上不需要的載體，即物質(zhì)可以給對象施用而不會引起 超過物質(zhì)的有利生物學效應的不需要的生物學效應。藥物組合物可以被用于例如細胞的離體轉(zhuǎn)染，或給對象直接施用 病毒粒子或細胞?？梢允┯帽景l(fā)明的細小病毒，以引發(fā)免疫原性反應(例如作為疫 苗)。典型情況下，本發(fā)明的疫苗含有免疫原性量的本發(fā)明公開的感 染性病毒粒子與可藥用載體的組合。"免疫原性量"是指足以在要給 藥藥物制劑的對象中喚起免疫反應的感染性病毒粒子的量。 一般來說，每劑的量大約103到大約1015個病毒粒子、優(yōu)選大約104到大約101()個 病毒粒子、更優(yōu)選大約104到106個病毒粒子是適合的，這依賴于被治 療的對象的年齡和種類以及免疫反應所需要針對的免疫原。對象和免 疫原如上所述。本發(fā)明還提供了將核酸投送到細胞的方法。典型情況下，對于體 外方法來說，病毒可以通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的標準的病毒轉(zhuǎn)導方法導 入到細胞中。優(yōu)選病毒粒子根據(jù)適合具體靶細胞的標準轉(zhuǎn)導方法，以適合的感染復數(shù)加入到細胞中。施用的病毒滴度可以根據(jù)靶細胞類型 和具體的病毒載體而變化，可以由本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員不用過多的實驗就可以確定。重組病毒載體優(yōu)選以生物學有效量施用于細胞。如果病毒施用于 體內(nèi)細胞(例如病毒按照下面的描述施用于對象)，則病毒載體的生 物學有效量是足以導致轉(zhuǎn)基因在靶細胞中的轉(zhuǎn)導和的表達的量。施用了本發(fā)明病毒載體的細胞可以是任何類型的，包括但不限于 神經(jīng)細胞(包括外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞，特別是腦細胞)、肺細 胞、視網(wǎng)膜細胞、上皮細胞(例如腸道和呼吸道上皮細胞)、肌肉細 胞、樹突狀細胞、胰腺細胞(包括胰島細胞)、肝細胞、心肌細胞、 骨細胞(例如骨髓干細胞)、造血干細胞、脾細胞、角質(zhì)細胞、成纖 維細胞、內(nèi)皮細胞、前列腺細胞、生殖細胞等?；蛘?，細胞也可以是 任何祖細胞。另外可選地，細胞可以是干細胞(例如神經(jīng)干細胞、肝 臟干細胞)。還可選細胞可以是癌癥或腫瘤細胞。此外，細胞可以來 自上面指明的任何物種來源。在本發(fā)明的特定實施方案中，細胞從對象中取出，將細小病毒載 體導入其中，然后將細胞放回到對象中。從對象取出用于離體治療的細胞，然后導入并送回到對象中的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的(參見，例如，美國專利No. 5，399，346;其公開內(nèi)容在此以其全文引為參 考)?；蛘?，rAAV載體也可以被導入到來自另一個對象的細胞中、培 養(yǎng)的細胞中、或來自任何其它適合來源的細胞中，并將細胞給需要它 的對象施用。用病毒載體轉(zhuǎn)導的細胞優(yōu)選以"治療有效量"與藥物載體一起施 用于對象。本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將會認識到，治療效果不必需是完 全的或治愈性的，只要給對象提供某些益處即可。在另一個實施方案中，已經(jīng)轉(zhuǎn)導有本發(fā)明的載體的細胞可以被施 用，以引發(fā)針對被投送的多肽的免疫原性反應。典型情況下，表達免 疫原性量的多肽的細胞量與可藥用載體組合在一起使用。"免疫原性 量"是指足以在施用藥物制劑的對象中喚起主動免疫反應的表達多肽 的量。主動免疫反應提供的保護程度不必需是完全的或永久的，只要 施用的免疫原性多肽的好處超過了它的任何不利之處就行。給對象施用的細胞劑量根據(jù)對象的年齡、狀態(tài)和種類、細胞的類 型、細胞所表達的核酸、給藥的方式等而變化。典型情況下，每劑施 用至少大約102到大約108、優(yōu)選大約103到大約108個細胞。優(yōu)選細胞 以治療有效量施用。本發(fā)明的另一個方面是用病毒粒子體內(nèi)治療對象的方法。給需要 的人類對象或動物施用本發(fā)明的細小病毒粒子可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中 任何已知的施用病毒載體的方法來進行。給藥方式的例子包括口服、直腸、經(jīng)粘膜、局部、經(jīng)皮、吸入、 腸胃外(例如靜脈內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、肌內(nèi)和動脈內(nèi))給藥等，以及 直接的組織或器官注射，或鞘內(nèi)、直接肌內(nèi)、心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜 內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。注射劑可以制備成常規(guī)的形式，作為液體溶液 或懸浮液、適合于在注射前制備成溶液或液體懸浮液的固體形式、或 作為乳液?；蛘?，病毒可以局部而不是全身方式施用，例如長效或緩 釋制劑。給對象施用的細小病毒載體可以轉(zhuǎn)導任何可感染的細胞或組織。 適合被本發(fā)明的細小病毒載體轉(zhuǎn)導的細胞如前所述。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，目的核苷酸序列被投送到對 象的肝臟。給藥肝臟可以通過本技術(shù)領(lǐng)域任何已知的方法來進行，包 括但不限于靜脈內(nèi)給藥、門靜脈內(nèi)給藥、膽內(nèi)給藥、動脈內(nèi)給藥、以及直接注射到肝實質(zhì)中。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的細小病毒粒子被肌肉內(nèi)給藥， 更有選通過肌肉內(nèi)注射或通過局部給藥(如上所定義的)。投送到腦 也是優(yōu)選的。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的細小病毒粒子被給 藥到肺臟。本文公開的細小病毒載體可以通過任何適合的方法給藥到對象的 肺臟，但是優(yōu)選通過使對象吸入含有本發(fā)明細小病毒載體的可吸入顆 粒的氣溶膠懸浮劑進行給藥。可吸入顆?？梢允且后w或固體。含有本 發(fā)明細小病毒載體的液體顆粒的氣溶膠可以通過任何適合的方法來產(chǎn) 生，例如本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員所熟知的壓力驅(qū)動的氣溶膠噴霧器或超聲噴霧器。參見例如美國專利No. 4,501,729。含有本發(fā)明的病毒載體的固體顆粒的氣溶膠同樣可以通過在制藥領(lǐng)域中已知的技術(shù)，使用 任何固體顆粒藥物氣溶膠發(fā)生器來產(chǎn)生。本發(fā)明細小病毒粒子的劑量依賴于給藥方式、要治療的疾病或病 癥、對象的個體情況、具體的病毒載體以及被投送的基因，可以按照 常規(guī)方式來確定。示例的達到治療效果的劑量是病毒滴度為至少大約105、 106、 107、 108、 109、 1010、 1011、 1012、 1013、 10"、 1015轉(zhuǎn)導單位 以上、優(yōu)選大約108-1013轉(zhuǎn)導單位、更優(yōu)選1012轉(zhuǎn)導單位。在特定的實施方案中，細小病毒粒子通過施用抗癌劑(例如細胞 因子)或癌癥或腫瘤抗原而作為治療癌癥或腫瘤的方法的一部分施用。 細小病毒粒子可以體外施用于細胞或通過使用離體方法體內(nèi)施用于對 象，正如本文描述的和本技術(shù)領(lǐng)域中已知的那樣。術(shù)語"癌癥"具有在其技術(shù)領(lǐng)域中被理解的含義，例如組織不受 控制的生長，具有擴展到身體的遠處位點的能力(即轉(zhuǎn)移)。癌癥的 例子包括但不限于白血病、淋巴瘤、結(jié)腸癌、直腸癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤等。優(yōu)選的是治療和預防形成腫瘤 的癌癥的方法。術(shù)語"腫瘤"在其技術(shù)領(lǐng)域中也被理解為例如多細胞 生物體中未分化的細胞的異常腫塊。腫瘤可以是惡性或良性的。優(yōu)選 本文公開的本發(fā)明方法被用于預防和治療惡性腫瘤。癌癥和腫瘤抗原已經(jīng)在本文的前面描述了。術(shù)語"治療癌癥"或 "癌癥的治療"意指降低了癌癥的嚴重性或至少部分消除了癌癥。優(yōu) 選這些術(shù)語表明減少了或至少被部分消除了癌癥的轉(zhuǎn)移。另外優(yōu)選這 些術(shù)語表明降低了或至少部分消除了轉(zhuǎn)移瘤的生長(例如在外科切除 原發(fā)腫瘤之后)。術(shù)語"癌癥的預防"或"預防癌癥"意指本發(fā)明的 方法至少部分消除或減少了癌癥的發(fā)病率或發(fā)生。另一種表述方法是 本發(fā)明的方法減緩、控制、減少了對象中癌癥發(fā)生的可能性或概率， 或延緩了癌癥的發(fā)生。同樣地，術(shù)語"治療腫瘤"或"腫瘤的治療"是指降低了腫瘤的 嚴重性或至少部分消除了腫瘤。優(yōu)選這些術(shù)語是為了表明減少或至少 部分消除腫瘤的轉(zhuǎn)移。還優(yōu)選這些術(shù)語表明降低了或至少部分被消除 了轉(zhuǎn)移瘤的生長(例如在外科切除原發(fā)腫瘤之后)。術(shù)語"腫瘤的預 防"或"預防腫瘤"是指本發(fā)明的方法至少部分消除或減少了腫瘤的 發(fā)病率或發(fā)生。另一種表述方法是本發(fā)明的方法減緩、控制、減少了 對象中腫瘤發(fā)生的可能性或概率，或延緩了癌癥的發(fā)生。在其它的實施方案中，可以從患有癌癥或腫瘤的對象取出細胞并 與本發(fā)明的細小病毒粒子相接觸。然后將修飾過的細胞施用于對象， 從而引發(fā)針對癌癥或腫瘤抗原的免疫反應。該方法用于不能在體內(nèi)建 立起充分免疫反應(即不能產(chǎn)生足夠量的增強抗體)的免疫受損對象 是特別有利的。在本技術(shù)領(lǐng)域中已經(jīng)知道免疫反應可以被免疫調(diào)節(jié)細胞因子所增 強(例如a-干擾素、/3-干擾素、7-干擾素、O-干擾素、T-干擾素、白介素-la、白介素-1/3、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介 素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介 素-12、白介素-13、白介素-14、白介素-18、 B細胞生長因子、CD40 配體、腫瘤壞死因子-/3、腫瘤壞死因子-a、單核細胞化學吸引蛋白-1、 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和淋巴毒素)。因此，在本發(fā)明的特定 實施方案中，免疫調(diào)節(jié)細胞因子(優(yōu)選為CTL誘導型細胞因子)結(jié)合 本文描述的方法給對象施用，以產(chǎn)生免疫反應或提供免疫治療。細胞因子可以通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的任何方法來給藥。外源細胞 因子可以給藥對象，或者可以施用適當?shù)妮d體將編碼細胞因子的核苷 酸序列投送給對象，并在體內(nèi)產(chǎn)生細胞因子?，F(xiàn)在已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，本發(fā)明將參考一些實施例進行說 明，本文中包含這些實施例僅僅是為了說明的目的，并不打算用它們 對本發(fā)明進行限制實施例材料與方法 桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建桿狀病毒穿梭質(zhì)粒LSR (表達Rep 78/52) 、 VPmll (表達VP1、 VP2和VP3)和GFPR (側(cè)翼帶有報告基因GFP的AAV ITR)由NIH 的Robert Kotin博士好意提供(參見Kotin等的美國專利公布No. 2004/0197895，其全文在此引為參考)。桿狀病毒穿梭質(zhì)粒pFB-2.5Cap 通過將來自pXR2.5的2.5Cap基因的EcoNI-NotI片段克隆到VPmll的 EcoNI-NotI位點中而構(gòu)建。質(zhì)粒pFB-2.5VPl通過將來自pxr2.5的 Swal-Notl片段克隆到VPmll的Notl和Klenow平端BamHI位點中 而構(gòu)建。重組桿狀病毒的產(chǎn)生按照Invitrogen的Bac-to-bac修改方案，產(chǎn)生了重組桿狀病毒。 簡單來說，將2ng穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到20/dDH10Bac感受態(tài)細胞中，經(jīng)過48小時孵育后挑取幾個白色菌落，制備小量制備的桿粒DNA。然后施 用CellFectine在6孔板中將小量制備的DNA轉(zhuǎn)染到Sf9細胞中，產(chǎn)生 重組的桿狀病毒。在經(jīng)過3天轉(zhuǎn)染期和擴增后，收獲重組桿狀病毒。 擴增的桿狀病毒被用于滴定和隨后的AAV生產(chǎn)。本研究中使用的重組 桿狀病毒圖示在圖1中。細胞培養(yǎng)293細胞被維持在補充了 10% FBS和100單位/ml青霉素和 100pig/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。細胞每星期傳代2次。HepG2細 胞被維持在補充了 10% FBS和100單位/ml青霉素和100/xg/ml鏈霉素 的MEME培養(yǎng)基(ATCC)中。細胞每星期傳代1次。Sf9細胞被維持 在補充了 100單位/ml青霉素和100/xg/ml鏈霉素的SF900II或ExCe11420 培養(yǎng)基中，在搖瓶中懸浮培養(yǎng)。細胞每星期傳代2次。桿狀病毒的滴定使用快速滴定試劑盒，按照制造商(BD BIOSCIENCES)的說明 對重組桿狀病毒進行滴定。簡單來說，將Sf9細胞以6.5^細胞/孔接種 到96孔板中1小時，并加入連續(xù)稀釋的桿狀病毒溶液感染細胞1小時。 然后移除桿狀病毒溶液，加入含有甲基纖維素的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時 后，感染的基因座通過用gp64抗體探測以顏色基質(zhì)反應進行檢測。AAV載體的生產(chǎn)、純化和滴定為了使用搖瓶或Wave生物反應器在Sf9細胞中生產(chǎn)AAV載體， 首先將細胞在補充了 100單位/ml青霉素和100jtig/ml鏈霉素的SF900II 或ExCell420培養(yǎng)基中生長到大約5E+6個細胞/ml。在感染之前即刻， 在細胞培養(yǎng)物中加入另一半混合有所需量重組桿狀病毒的新鮮培養(yǎng) 基，使細胞數(shù)量為大約2.5E+6個細胞/ml。感染進行3天，通過在 3,000rpm離心10分鐘來收獲細胞沉淀。將細胞沉淀在Sf9裂解緩沖液 (1% DOC， 0.5% CHAPS， 50 mM NaCl， 2 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl, pH8.0)中進行裂解。加入125單位/ml的Benzonase，在37°C孵育1小時消化基因組DNA。在孵育后將鹽濃度調(diào)整到400 mM，通過在8,000 rpm離心30分鐘除去細胞碎片。將澄清的裂解液上樣到步長CsCl梯度， 進行兩輪超速離心。收獲AAV載體，用100倍體積的含有5%山梨糖 醇的PBS進行透析，并用于后面的實驗。AAV滴度的斑點印跡分析首先將純化的AAV載體用DNase (10 mM Tris pH7.5， 10 mM MgCl2， 50單位/ ml DNase I)在37°C消化1小時，除去任何污染的 DNA，然后通過加入EDTA到20mM來終止消化。通過用等體積的蛋 白酶K ( 1M NaCl， 100/ig/ml蛋白酶K， 1% N-肌氨酰)在50°C消化2 小時并通過苯酚/氯仿抽提除去蛋白來釋放病毒DNA。然后將病毒DNA 沉淀，并重新懸浮在TE緩沖液中。通過使用斑點印跡裝置用放射性標 記的DNA探針進行雜交來確定病毒的拷貝數(shù)?？捡R斯亮藍染色將純化的AAV載體在樣品緩沖液中煮沸5分鐘，將殼體蛋白通過 SDS-PAGE進行分離。然后將凝膠在含有25%異丙醇、10%乙酸和65% milli-Q水的固定溶液中固定20分鐘，在含有0.01。/。考馬斯亮藍R-250 (BioRad)和10%乙酸的染色溶液中輕搖染色過夜。將凝膠在含有10% 乙酸的脫色溶液中脫色，更換幾次溶液直到背景透明。Western印跡和銀染細胞裂解液或AAV載體在IX SDS樣品緩沖液中煮沸5分鐘，將 煮沸過的樣品進行SDS-PAGE。對于Western印跡來說，在凝膠上分離 的蛋白被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜用5。/。脫脂奶封閉，用抗AAV VP 單克隆抗體(B1克隆)然后用HRP偶聯(lián)的抗小鼠單克隆抗體進行探測。 使用SuperSignal West Femto最大靈敏度底物(PIERCE)將信號捕獲 在膠片上。對于銀染來說，凝膠使用SilverXpress試劑盒(Invitrogen) 按照制造商說明書進行染色。293和HepG2細胞的轉(zhuǎn)導在轉(zhuǎn)導前一天，將細胞以1.5 x 105個細胞/孔接種到24孔板中。 將AAV載體在lml含有1.5/xM(對于293細胞)或(對于HepG2 細胞)表鬼臼毒素吡喃葡糖苷的培養(yǎng)基中稀釋到10"、 10-2、 10-3和10-4 倍。將舊的培養(yǎng)基從細胞中去除，加入0.5ml稀釋的AAV。將細胞培 養(yǎng)48小時，在熒光顯微鏡下對表達GFP的細胞進行計數(shù)。實施例結(jié)果Sf9細胞產(chǎn)生的AAV2.5-GFP載體比293細胞產(chǎn)生的具有較低的 VP1/VP3比率。通過yinji分析，將在Sf9細胞中產(chǎn)生的AAV2.5-GFP載體與其293 的對應物進行了比較，以檢査殼體的組成。圖2顯示了 Sf9細胞包裝的 病毒粒子與293細胞中包裝的病毒粒子相比具有較低的VP1/VP3比率， 這表明S 細胞可以包裝一些VP1病毒粒子。該結(jié)果也被考馬斯亮藍 染色和銀染分析所證實(數(shù)據(jù)未顯示)。Sf9細胞產(chǎn)生的AAV2.5-GFP載體比293細胞產(chǎn)生的具有低得多的 感染性為了比較Sf9和293細胞產(chǎn)生的AAV2.5-GFP載體的感染性，用 載體轉(zhuǎn)導HepG2細胞48小時，并對綠色的細胞數(shù)量進行計數(shù)。表1 中的結(jié)果顯示了在Sf9細胞中產(chǎn)生的AAV2.5-GFP載體與它們的293 對應體相比具有低得多的感染性。當施用293細胞進行轉(zhuǎn)導時也觀察 到了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。添加額外的2.5VP1增加了 Sf9細胞中產(chǎn)生的AAV載體的 VP1/VP3比率通過以0.1、 0.5和1.0感染復數(shù)的表達2.5VP1的桿狀病毒 (Bac-2.5VP1)與1感染復數(shù)的其它三種用于AAV包裝的桿狀病毒 (Bac-Rep、 Bac-2.5Cap和Bac-GFP)的每一種一起共感染Sf9細胞，導入了不同量的2.5VP1。感染3天后收獲細胞。將小部分細胞用于制備細胞裂解液，大部分的細胞沉淀被用于AAV純化。裂解液和純化的 AAV載體都進行SDS-PAGE，并通過Western印跡方法檢測殼體蛋白。 下面的表1中顯示的結(jié)果表明VP1表達水平增加了，并與VP1桿狀病 毒的增加量相關(guān)。AAV批次#載體類型細胞來源相對感染性(％)018AAV2.5-GFPSf90.0008019AAV2.5-GFPSf90.0072020AAV2.5-GFPSf90.0016293AAV2.5-GFP293100同時，觀察到了當VP1的表達越多時，降解的殼體蛋白越多。當 使用更多的Bac-2.5VP1時，純化的AAV粒子也含有更多的VPl(圖3)。VP1/VP3比率的增加提高了 Sf9細胞中產(chǎn)生的AAV載體的感染性 VP1/VP3比率的增加提高了 Sf9細胞中產(chǎn)生的AAV載體的感染 性。因為VP1含有AAV感染所需的磷脂酶結(jié)構(gòu)域，我們試驗了在載體 生產(chǎn)過程中加入額外的VP1是否能夠提高在Sf9細胞中產(chǎn)生的AAV載 體的感染性。使用AAV載體轉(zhuǎn)導HepG2細胞48小時，對綠色的細胞 進行計數(shù)和照相。圖4-6中的結(jié)果表明，通過加入額外的VP1， AAV2.5-GFP載體的感染性急劇增加了?？蛇x的重組桿狀病毒載體圖7-11顯示了用于生產(chǎn)感染性AAV病毒的可選Bac載體。例如， 復制組分可以組合在單種載體中或包含在分別的載體中。此外，表達 VP1、 VP2和VP3的基因可以包含在Cap載體中，含有或不含有額外 的用于增加VP1病毒粒子表達量的VP1基因。此外，側(cè)翼帶有TR的 轉(zhuǎn)基因可以專門包含在單個Bac載體中，或與其它的組分例如表達VP1 的基因、復制組分和/或表達VPl、 VP2和VP3的基因相組合。圖7顯示了其它四種可以一起用于產(chǎn)生感染性病毒粒子的重組桿狀病毒，其中的載體含有在細胞肥大病毒(CMV)立即早期啟動子/增 強子控制之下的GFP或轉(zhuǎn)基因，以及一般插入在轉(zhuǎn)入因序列之后和3' AAV ITR序列之前的poly-A序列。分開的Bac載體提供了額外的和必 需的基因，包括使用帶有polh啟動子的原始的ATG起始密碼子的VP1 基因，帶有Cap基因的載體和另一個含有Rep78和52基因的載體。值 得注意的是，所有的載體都含有至少一個多聚腺苷化序列(pA)。圖 8顯示了使用三個Bac載體的系統(tǒng)，其中一個Bac載體含有編碼VP1、 VP2和VP3的2.5 Cap基因以及AAV復制組分。其它載體包括一個用 于表達2.5 VP1和另一個由于表達轉(zhuǎn)基因的載體。圖9顯示了僅僅使用 兩種載體，其中編碼VP1、 VP2和VP3的2.5Cap基因與AAV復制組 分包含在同一種載體中，第二種載體含有GFP的基因(轉(zhuǎn)基因)和用 于表達額外量VP1的2.5 VP1基因。圖IO也包含了僅僅使用兩種載體 的系統(tǒng)，其中單個復制組分被包含在每個Bac載體中，有利的是，Rep 78與轉(zhuǎn)入基因位于不同的載體上，從而增加了載體和隨后表達的穩(wěn)定 性。此外，在一種載體中，轉(zhuǎn)基因和2.5VPl基因與Rep基因相組合。 圖ll也顯示了兩種載體，其中兩個復制組分包含在單個Bac載體中， 編碼VP1、 VP2和VP3的2.5 Cap基因與其它的2.5 VP1基因和轉(zhuǎn)基因 包含在相同的載體中。盡管已經(jīng)通過目的是為了闡明和理解的說明和實施例對上述的發(fā) 明進行了較為詳細的描述，但是顯然可以在隨附的權(quán)利要求及其等同 體的范圍內(nèi)進行改變和修改。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)包裝的細小病毒載體的方法，該方法包括(a)提供昆蟲細胞；(b)將一個或多個包含核苷酸序列的桿狀病毒載體導入昆蟲細胞，所述核苷酸序列編碼(i)側(cè)翼帶有TR的轉(zhuǎn)基因；以及(ii)足以導致感染性細小病毒粒子包裝的桿狀病毒包裝功能和細小病毒Rep和Cap組分，其中相對于VP2和VP3補充了足以提高感染性病毒粒子生產(chǎn)的VP1；以及(c)在昆蟲細胞中導入用于在昆蟲細胞中表達的桿狀病毒輔助功能的編碼核酸；以及(d)將昆蟲細胞在足以產(chǎn)生包裝的感染性細小病毒載體的條件下進行培養(yǎng)。
2. 權(quán)利要求l中的方法，其中所述補充通過下述來實現(xiàn)(a) 將包含表達VP1、 VP2和VP3的核苷酸序列的Cap載體和包 含表達VP1的核苷酸序列的VP1載體導入昆蟲細胞；或(b) 單一載體，包含表達VP1、 VP2和VP3的核苷酸序列以及表 達VPl的其他核苷酸序列。
3. 權(quán)利要求1中的方法，其中所述細小病毒是腺相關(guān)病毒(AAV)。
4. 權(quán)利要求2中的方法，其中VPl載體的表達控制序列與細小病 毒Cap載體的表達控制序列相比提供了相對較弱的表達。
5. 權(quán)利要求3中的方法，其中VPl載體的表達為細小病毒Cap 載體表達的大約1%到大約75%。
6. 權(quán)利要求4中的方法，其中VPl載體的表達為細小病毒Cap載體表達的大約1%到大約50%。
7. 權(quán)利要求l中的方法，其中所述補充通過下述來實現(xiàn)(a) 將包含用于在昆蟲細胞中表達VP1、 VP2和/或VP3的優(yōu)化核 苷酸序列的細小病毒Cap載體導入昆蟲細胞；和/或(b) 將包含用于在昆蟲細胞中表達VP1的優(yōu)化核苷酸序列的VP1 載體導入昆蟲細胞。
8. 權(quán)利要求4中的方法，其中VP1載體的表達來自突變的多角體 啟動子，提供了細小病毒Cap載體表達的大約1%到大約75%。
9. 權(quán)利要求4中的方法，其中VP1載體的表達來自突變的多角體 啟動子，提供了細小病毒Cap載體表達的大約1%到大約50%。
10. 權(quán)利要求4中的方法，其中VP1載體的表達來自突變的多角 體啟動子，提供了細小病毒Cap載體表達的大約1%到大約25%。
11. 權(quán)利要求1中的方法，其中補充VP1導致產(chǎn)生大約10:10:80 VP1:VP2:VP3的分子比例。
12. 權(quán)利要求1中的方法，其中補充VP1導致產(chǎn)生的包裝的感染 性細小病毒載體的量比不進行所述補充的相應方法高大約10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 15、 160、 170、 180、 190或200倍。
13. 權(quán)利要求3中的方法，其中補充VP1導致產(chǎn)生的包裝的感染 性細小病毒載體的量比不進行所述補充的相應方法高大約10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 15、 160、 170、 180、 190或200倍。
14. 權(quán)利要求l中的方法，其中所述核苷酸序列包含雙鏈體載體、 擴增子和/或質(zhì)粒。
15. 權(quán)利要求2中的方法，其中所述雙鏈體載體、擴增子和/或質(zhì) 粒包含側(cè)翼具有TR的轉(zhuǎn)基因。
16. 權(quán)利要求2中的方法，其中所述雙鏈體載體、擴增子和/或質(zhì) 粒包含一個或多個Rep組分和一個或多個細小病毒Cap組分。
17. 權(quán)利要求1中的方法，其中一個或多個細小病毒Rep功能和 細小病毒Cap功能被插入到同一種載體中。
18. 權(quán)利要求1中的方法，其中所述昆蟲細胞是鱗翅目昆蟲 (Lepidopteran)細胞或衍生自鱗翅目昆蟲細胞。
19. 權(quán)利要求1中的方法，其中所述昆蟲細胞是選自草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)和粉紋夜蛾(Trichopulsiani)的物種。
20. 權(quán)利要求1中的方法，其中所述昆蟲細胞選自SF9、 SF21、 High Five預細胞(BRI-TN-5B1-4) 、 Mimic-SF9以及從上述任何一種 衍生的細胞。
21. 權(quán)利要求2中的方法，其中所述細小病毒Cap載體和細小病 毒VP1載體各以至少為1的感染復數(shù)導入到昆蟲細胞中。
22. 權(quán)利要求1中的方法，其中所述細小病毒Cap功能是包含下 列突變的AAV-2Cap功能263 Q—A; ; 265插入T; 705 N—A; 708 V—A;以及716T—N (SEQIDNO: 13)。
23. 權(quán)利要求l中的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼治療性產(chǎn)物。
24. 權(quán)利要求1中的方法，其中第一種載體包含與啟動子可操作 地連接的側(cè)翼具有TR的轉(zhuǎn)基因和編碼AAV-VP1的基因。
25. 權(quán)利要求24中的方法，其中所述第一種載體還包含編碼AAV VP1、 VP2和VP3的基因。
26. 權(quán)利要求24中的方法，其中所述第一種載體還包含復制組分。
27. 權(quán)利要求1中的方法，其中第二種載體包含至少一個復制組分。
28. 權(quán)利要求27中的方法，其中所述第二種載體包含另外的復制 組分和編碼AAV-VP1、 VP2和VP3的基因。
29. 權(quán)利要求3中的方法，其中所述AAVCap組分包含用于在昆 蟲細胞中表達的優(yōu)化核苷酸序列，選自SEQBDNO:5、 SEQ ED NO: 6、 SEQ ID NO: 8和SEQ ED NO: 10。
30. 權(quán)利要求3中的方法，其中所述AAVRep組分包含用于在昆 蟲細胞中表達的優(yōu)化核苷酸序列，選自SEQ ED NO: 2和SEQ ED NO: 4。
31. 權(quán)利要求3中的方法，包含用于在昆蟲細胞中表達的優(yōu)化核 苷酸序列，選自SEQ ED NO: 5、 SEQ ED NO: 6、 SEQ ED NO: 8、 SEQ ED NO: 10、 SEQ ED NO: 2和SEQ ID NO: 4。
32. 權(quán)利要求3中的方法，其中所述AAV是AAV2、 AAV 2.5、 AAV 8或AAV 9。
33. 權(quán)利要求32中的方法，其中所述AAV包含選自下列的核苷 酸序列SEQEDNO:l、 SEQEDNO:3、 SEQEDNO:5、 SEQ ED NO: 11、 SEQ ED NO: 7和SEQ ED NO: 9。
34. 生產(chǎn)包裝的細小病毒載體的方法，該方法包括(a) 提供昆蟲細胞；(b) 將包含核苷酸序列的載體導入昆蟲細胞，所述核苷酸序列編碼(i) 側(cè)翼帶有TR的轉(zhuǎn)基因；以及(ii) 包含Rep組分和Cap組分、足以導致感染性細小病毒粒子包 裝的桿狀病毒包裝功能，其中相對于VP2和VP3補充了足以提高感染 性病毒粒子生產(chǎn)的VP1，并且其中的核苷酸序列分布在三種載體中； 以及(c) 將細胞在足以產(chǎn)生包裝的感染性細小病毒載體的條件下進行培養(yǎng)。
35. 權(quán)利要求34中的方法，其中第一種載體包含編碼VPl、 VP2 和VP3的基因以及至少一個復制組分，第二種載體包含側(cè)翼帶有TR 的轉(zhuǎn)基因，以及第三種載體包含編碼VPl的基因。
36. 權(quán)利要求34中的方法，還包含用于在昆蟲細胞中表達的桿狀 病毒輔助功能的編碼核酸。
37. 用于生產(chǎn)包裝的細小病毒載體的試劑盒，該試劑盒至少包含 第一種和第二種載體，其中所述載體包含的核苷酸序列編碼(i) 側(cè)翼帶有TR的轉(zhuǎn)基因；以及(ii) 包括細小病毒Rep組分和細小病毒Cap組分、足以導致感染 性細小病毒粒子包裝的桿狀病毒包裝功能，其中相對于VP2和VP3補 充了足以提高感染性病毒粒子生產(chǎn)的VPl。
38. 權(quán)利要求37中的試劑盒，其中所述第一種載體包含與啟動子 可操作地連接的側(cè)翼帶有TR的轉(zhuǎn)基因和編碼VP1的基因。
39. 權(quán)利要求38中的試劑盒，其中所述第一種載體還包含編碼 VP1、 VP2和VP3的基因。
40. 權(quán)利要求37中的試劑盒，其中所述第一種載體還包含復制組分。
41. 權(quán)利要求39中的試劑盒，其中所述第二種載體包含至少一個 復制組分。
42. 權(quán)利要求40中的試劑盒，其中所述第二種載體包含另外的復 制組分和編碼VP1、 VP2和VP3的基因。
43. 權(quán)利要求38中的試劑盒，其中所述第二種載體包含兩個分開 的復制組分和編碼VP1、 VP2和VP3的基因。
44. 權(quán)利要求37中的試劑盒，還包含用于在昆蟲細胞中表達的桿 狀病毒輔助功能的編碼核酸。
45. 權(quán)利要求37中的試劑盒，還包含第三種載體，其中第一種載 體包含編碼VP1、 VP2和VP3的基因以及至少一個復制組分，第二種 載體包含側(cè)翼帶有TR的轉(zhuǎn)基因，和第三種載體包含編碼VP1的基因。
46. 權(quán)利要求37中的試劑盒，還包含至少一種昆蟲細胞。
47. 權(quán)利要求46中的試劑盒，其中所述昆蟲細胞是鱗翅目昆蟲細 胞或衍生自鱗翅目昆蟲細胞。
48. 權(quán)利要求46中的試劑盒，其中所述昆蟲細胞是選自草地貪夜 蛾和粉紋夜蛾的物種。
49. 包含一種或多種載體的宿主細胞，所述載體包含的核苷酸序 列編碼(i) 側(cè)翼帶有TR的轉(zhuǎn)基因；以及(ii) 用于復制AAV Rep組分和AAV Cap組分以及包裝感染性細 小病毒粒子的桿狀病毒輔助功能，其中相對于VP2和VP3補充了足以 提高感染性病毒粒子生產(chǎn)的VP1。
50. 權(quán)利要求49中的宿主細胞，其中第一種載體包含表達VP1、 VP2和VP3的核苷酸序列，以及第二種載體包含表達VP的核苷酸序 列。
51. 權(quán)利要求49中的宿主細胞，其中單一載體包含AAV Cap組 分的核苷酸序列，還包含VP1組分的核苷酸序列。
全文摘要
生產(chǎn)包裝的細小病毒載體的方法，該方法包括(a)提供昆蟲細胞；(b)將含有核苷酸序列的一個或多種載體導入昆蟲細胞，所述核苷酸序列編碼(i)兩側(cè)含有TR的轉(zhuǎn)基因；以及(ii)含有Rep組分和Cap組分、足以導致感染性細小病毒粒子包裝的桿狀病毒包裝功能，其中相對于VP2和VP3補充了足以增加感染性病毒粒子的生產(chǎn)的VP1；以及(c)將編碼桿狀病毒輔助功能的核酸導入細胞以便在昆蟲細胞中進行表達；(d)在足以產(chǎn)生包裝的感染性細小病毒載體的條件下培養(yǎng)細胞。
文檔編號C12N15/861GK101405033SQ200780008898
公開日2009年4月8日 申請日期2007年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月20日
發(fā)明者海峰·E·陳, 理查德·J·薩姆爾斯基 申請人:北卡羅來納大學教堂山分校