專利名稱：：含激酶抑制劑的培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多能干細(xì)胞內(nèi)自我更新型的維持。所提供的方法和組分適于培養(yǎng)和分離多能干細(xì)胞，例如胚胎干(ES)細(xì)胞，特別是包括大鼠、小鼠、牛、綿羊、豬和人的哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞。特別地，本發(fā)明涉及大鼠、小鼠和人的多能細(xì)胞的自我更新培養(yǎng)基以及其配置方法和組成。技術(shù)背景在包含血清和白血病抑制因子(LIF)的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上如何配制和維持體外多能干細(xì)胞培養(yǎng)基已眾所周知(Smith等1988，Nature336:688-90)。這些方法曾用于維持來自經(jīng)許多次傳代的"受納"菌株的多能胚胎干細(xì)胞(ES)。如該干細(xì)胞通常是在小鼠成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層細(xì)胞及其提取物存在下培養(yǎng)，則還支持多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的維持和自我更新。在這些條件下，將人ES細(xì)胞在培養(yǎng)基中經(jīng)許多次傳代維持在多能狀態(tài)下是可行的。在許多實(shí)例中，只可以或最好使用包含血清或血清提取物的培養(yǎng)基維持ES細(xì)胞，但是這里不確定，或使用細(xì)胞培養(yǎng)條件維持，該細(xì)胞培養(yǎng)條件需要其它細(xì)胞存在，例如用于維持人ES細(xì)胞的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞。但無論是在該培養(yǎng)基中或通過例如飼養(yǎng)層細(xì)胞生產(chǎn)的任何不確定的組分都會(huì)潛在地干擾或阻礙對(duì)ES細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化的研究。這阻礙了ES細(xì)胞及其后代的治療和其它應(yīng)用的藥品好的生產(chǎn)實(shí)施的改善。一些確定的ES細(xì)胞培養(yǎng)基是已知的，但首選改善過的替代的確定培養(yǎng)基還是需要的。在本申請(qǐng)人以前的申請(qǐng)W0-A-03/095628和在后仍未公布的申請(qǐng)中，在包括(1)gpl30的拮抗劑(例如LIF)和(2)TGF-P超家族的拮抗劑(例如BMP4)或Id信號(hào)通道的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)例如ES細(xì)胞的多能干細(xì)胞以促進(jìn)干細(xì)胞自我更新用以多次傳代。在gpl30信號(hào)存在下，TGF-P超家族的拮抗劑或該Id信號(hào)通路令人驚奇地提供了自我更新刺激，而不是增殖分化(pro-differentiation)信號(hào)。因此，一直需要將多能細(xì)胞維持在自我更新狀態(tài)下的改善效率和用以將多能細(xì)胞由飼養(yǎng)層細(xì)胞或飼養(yǎng)層條件培養(yǎng)基遷移出的培養(yǎng)基。SatoN等在Nat.Med.2004，Jan10(1)pp55-63描述了糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制劑和6-溴靛紅-3'-月虧(6-b環(huán)oindirubin-3'-oxime)對(duì)包含培養(yǎng)基的血清中的小鼠和人ES細(xì)胞的效果。然而，僅在很短期限觀察到了這些效果，時(shí)間短得難以得出確定的結(jié)論，并且在該研究中使用的不確定培養(yǎng)基中的未知因子的影響可能很明顯。本發(fā)明的發(fā)明者曾嘗試，但未能重復(fù)出這些結(jié)果，事實(shí)上卻發(fā)現(xiàn)了與之相反的效果。制備ES細(xì)胞培養(yǎng)基需要盡可能純的單個(gè)培養(yǎng)基組分。然而，大多數(shù)培養(yǎng)基組分是細(xì)胞因子，其純度因在細(xì)胞系統(tǒng)中制備，還受到由該產(chǎn)品的培養(yǎng)基流體除去潛在的雜質(zhì)的影響。一些細(xì)胞因子的其它問題是它們有效且無毒的濃度范圍很窄。具有較寬范圍和/或在較高濃度下毒性較小的培養(yǎng)基組分的用處是很大的。細(xì)胞因子在儲(chǔ)存時(shí)具有有限穩(wěn)定性，因此還在尋找更穩(wěn)定的培養(yǎng)基組分。本發(fā)明的目標(biāo)是克服或至少改善本領(lǐng)域的一些問題，首選替代的，更首選的是改善了的適于多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基，該培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基能夠支持所述干細(xì)胞的多次傳代的自我更新。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供替代的培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)允許細(xì)胞分化前體外多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的維持通過可控制的方式引導(dǎo)。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供方法和組分，該方法和組分增強(qiáng)了多能干細(xì)胞的衍生和分離，且有助于它們由有機(jī)難溶物治愈處衍生分離至ES細(xì)胞分離，或由仍未分離的多能干細(xì)胞衍生分離。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明，如ES細(xì)胞的多能干細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基首選無血清，包括MEK抑制劑與GSK3抑制劑，或MEK抑制劑與FGF受體拮抗劑。首選地，該培養(yǎng)基包括MEK抑制劑、GSK3抑制劑和FGF受體拮抗劑(例如，小分子MEK抑制劑和小分子GSK3抑制劑以及小分子FGFR拮抗劑)。由此促進(jìn)該干細(xì)胞的多代自我更新。因此多能細(xì)胞中的GSK3和MEK的抑制作用、MEK和FGF受體信號(hào)發(fā)送的抑制作用、或GSK3、MEK和FGF受體信號(hào)發(fā)送的抑制作用提供了自我更新刺激。本發(fā)明可應(yīng)用在許多方面。GSK3與MEK、MEK與FGFR或GSK3，MEK與FGFR的抑制作用的組合可用于生長(zhǎng)多能細(xì)胞，特別是ES細(xì)胞，并且如果它們?cè)陲曫B(yǎng)層上衍生和生長(zhǎng)，則用以使多能細(xì)胞，特別是ES細(xì)胞適應(yīng)不需要飼養(yǎng)層細(xì)胞，通常稱作飼養(yǎng)層或飼養(yǎng)層細(xì)胞的飼養(yǎng)層細(xì)胞層的生長(zhǎng)。在培養(yǎng)基中擴(kuò)增干細(xì)胞的方法包括在GSK3抑制劑和MEK抑制劑的存在下，在MEK抑制劑和FGF受體拮抗劑的存在下，或首選在GSK3抑制劑、MEK抑制劑和FGF受體拮抗劑的存在下培養(yǎng)該細(xì)胞。制備的培養(yǎng)基可包含一種或多種GSK3抑制劑和MEK抑制劑、一種或多種MEK抑制劑和FGF受體拮抗劑，且可選地，一種或多種GSK3抑制劑、MEK抑制劑和FGFR拮抗劑?？墒褂肎SK3抑制劑和MEK抑制劑、使用MEK抑制劑和FGFR拮抗劑，或使用GSK3抑制劑、MEK抑制劑和FGFR拮抗劑衍生ES細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，在多能細(xì)胞中使用的GSK3和MEK的抑制作用，首選所有GSK3、MEK和FGF受體的抑制作用促進(jìn)該細(xì)胞的自我更新。對(duì)多能細(xì)胞的參考包括但不限于對(duì)胚胎干細(xì)胞(ES)的參考。包括ES細(xì)胞的多能細(xì)胞的特性，包括與多能發(fā)育階段相關(guān)的多基因表達(dá)、分化為代表源動(dòng)物中存在的所有任何組織類型的細(xì)胞的能力，對(duì)嵌合體(chimeras)的貢獻(xiàn)能力，特別是對(duì)嵌合體種系的貢獻(xiàn)能力。例如，真多功能細(xì)胞，例如ES細(xì)胞，表達(dá)許多的，或大部分的多能性相關(guān)基因Nanog、Oct4、FGF4，Sox-2和堿性磷酸酶。特別地，廣泛地將Nanog、Oct4和Sox-2的表達(dá)認(rèn)作提供了明確的初始指示細(xì)胞為ES細(xì)胞。還廣泛地將嵌合體中的種系傳遞和生成包括自所有三個(gè)原胚層(例如內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的分化細(xì)胞的畸胎瘤或畸胎癌的能力認(rèn)作細(xì)胞是ES細(xì)胞的明確指示。對(duì)于GSK3抑制參考指的是一種或多種GSK3酶的抑制作用。因此GSK3抑制劑可以抑制GSK3酶家族的一種、多種或所有的酶。眾所周知，GSK3酶家族包括但不限于GSK3-a和GSK3-(3。曾描述過許多變異體(例如Schaffer等；Gene2003;302(1-2):73-81)。在具體的GSK3-(3受抑制的實(shí)施方案中，GSK3-ct抑制劑也是適用的，并且本發(fā)明所用抑制劑可抑制兩者。很多GSK3抑制劑是己知的，例如抑制劑CHIR98014、CHIR99021、AR-A0144-18、TDZD-8、SB216763禾BSB415286。其它的抑制劑也是己知的并且適用于本發(fā)明。另外，曾表征過GSK3-p的活性部位的結(jié)構(gòu)，并且鑒別了與特異性的和非特異性抑制劑相互作用的關(guān)鍵殘基(Bertrand等；JMolBiol.2003;333(2):393-407)。可以利用該結(jié)構(gòu)特征輕松鑒別附加的GSK抑制劑。某些實(shí)施方案的抑制劑對(duì)GSK3-cx和GSK3-(3具有特異性，基本不抑制erk2和cdc2。優(yōu)選地，該抑制劑具有對(duì)人GSK3高于對(duì)小鼠erk2禾口/或人cdc2，至少100倍，更優(yōu)選至少200倍，很優(yōu)選至少400倍的選擇性，測(cè)定IC5。值的比率；在此，參考GSK3IC5。值指的是針對(duì)人GSK3-a和GSK3-卩的平均值。通過CHIR99021禾BCHIR98014曾得到過好的結(jié)果，它們都對(duì)GSK3具有特異性。在BennettC等，J.Biol.Chem.，277巻，第34，2002年9月23日，30998-31004頁禾P在RingDB等，Diabetes,52巻，2003年3月，588-595頁中，描述了GSK3抑制劑實(shí)例。CHIR99021的適宜使用濃度為0.01至100，優(yōu)選O.l至20，更優(yōu)選0.3至IO微摩爾。還可使用RNA介導(dǎo)干擾(RNAi)方便地抑制GSK3。通常，將與GSK3基因全部或部分互補(bǔ)的雙鏈RNA分子引入多能細(xì)胞，由此促進(jìn)GSK3編碼mRNA分子的特異性降解。該轉(zhuǎn)錄后機(jī)制導(dǎo)致減少或破壞了靶向GSK3基因的表達(dá)。已知使用RNAi抑制GSK3的合適技術(shù)和方案。參考MEK抑制劑在本說明中指的是通常的MEK抑制劑。因此參考MEK抑制劑指的是蛋白激酶的MEK家族的包括MEK1、MEK2禾nMEK3的任何成員的抑制劑。MEK抑制劑可以抑制MEK激酶家族一種、多種或所有。已為本領(lǐng)域所知的合適的MEK抑制劑實(shí)例包括但不限于MEK1抑制劑PD184352和PD98059、MEK1和MEK2的抑制劑U0126和SL327，和那些在Davies等(2000)中討論的(DaviesSP,ReddyH3CaivanoM,CohenP.Specificityandmechanismofactionofsomecommonlyusedproteinkinaseinhibitors.BiochemJ.351,95-105)。特別地，曾發(fā)現(xiàn)當(dāng)與其它已知MEK抑制劑相比較時(shí)，PD184352具有高度特異性和潛能。其它MEK抑制劑和MEK抑制劑類別在Zhang等(2000)Bioorganic&MedicinalChemistryLetters;10:2825-2828中有描述。還可使用RNA介導(dǎo)干擾(RNAi)方便地獲得MEK激酶的抑制作用。通常，將與MEK基因全部或部分互補(bǔ)的雙鏈RNA分子引入多能細(xì)胞，由此促進(jìn)MEK編碼mRNA分子的特異性降解。該后轉(zhuǎn)錄機(jī)理導(dǎo)致減少和破壞了耙向MEK基因的表達(dá)。已知使用RNAi獲得MEK抑制作用的合適技術(shù)和方案。已知許多識(shí)別包括GSK3抑制劑和MEK抑制劑的激酶抑制劑的實(shí)驗(yàn)。例如Davies等(2000)描述了激酶實(shí)驗(yàn)，激酶在多肽底物和放射性標(biāo)記ATP存在下培育。通過該激酶該底物的磷酸化導(dǎo)致該標(biāo)記并入該底物中。保持磷酸纖維紙上的每個(gè)反應(yīng)試樣量不變，并在磷酸中清洗以除去游離的ATP。隨后測(cè)定培育后的該底物的活性，且提供激酶活性指示。利用該實(shí)驗(yàn)可容易地確定在選用的激酶抑制劑存在和不存在下該激酶的相對(duì)活性。Downey等.(1996)JBiolChem.;271(35):21005-21011也描述了用于識(shí)別激酶抑制劑的激酶活性實(shí)驗(yàn)。參考成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)受體(FGFR)拮抗劑指的是FGF受體的多肽或小分子或其它拮抗劑，通常抑制FGFR1和/或FGFR2。因此，F(xiàn)GF受體拮抗劑可為FGF受體家族中的一種、多種或全部的拮抗劑，該FGF受體家族包括但不限于FGFR1、FGFR2、FGFR3禾卩FGFR4。FGF受體家族成員通常包括三個(gè)類免疫球蛋白轄區(qū)，并代表酸性氨基酸區(qū)(酸性單元—theacidicbox)，該區(qū)可參與FGF家族成員與FGF受體的結(jié)合。在一些例子中，僅包括兩個(gè)類免疫球蛋白轄區(qū)的分子也可起到FGF受體的功能。己知許多FGFR拮抗體，包括但不限于SU5402和PD173074。已知許多FGFR拮抗體，例如SU5402和PD173074。SU5402的適合濃度在微摩爾范圍內(nèi)，例如0.1-20pM，優(yōu)選0.5-10pM，特別地1-5pM。我們?cè)l(fā)現(xiàn)PD173074可代替SU5402，并且在低約1/100的濃度下達(dá)到全效，與其對(duì)FGF受體較高親合性相一致。因此，PD173074的適宜濃度為1-200nM,優(yōu)選5-100nM，特別地為10-50nM。還知道通過顯性失活突變體FGR受體的轉(zhuǎn)基因抑制FGR受體發(fā)送信號(hào)。然而，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，優(yōu)選使用小分子拮抗劑，而非轉(zhuǎn)基因基拮抗作用。已知識(shí)別FGF受體拮抗劑的合適實(shí)驗(yàn)。例如在通過FGF受體發(fā)送信號(hào)激活報(bào)告基因的細(xì)胞系可用于評(píng)價(jià)潛在的拮抗劑的活性。曾發(fā)現(xiàn)MEK抑制劑與GSK3抑制劑，且還優(yōu)選FGF受體拮抗劑的組合體的使用改善ES細(xì)胞的增殖是有優(yōu)勢(shì)的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用約0.1pM至約25pM的MEK抑制劑。還優(yōu)選使用約O.lpM至約5jiM的MEK抑制劑，更優(yōu)選0.2|iM至2jiM。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的培養(yǎng)基包括0.8pMPD184352、3pMCHIR99021和/或3^MSU5402。特別優(yōu)選的培養(yǎng)基包括0.8pMPD184352、3|xMCHIR99021和3jiMSU5402，優(yōu)選在N2B27培養(yǎng)基中?？蓛?yōu)化SU5402的濃度以適合不同的多能細(xì)胞系，通常為l-5)iM(例如2pM)。在下面的例子中，我們?cè)贕SK3抑制劑，連同MEK抑制劑和在特別實(shí)施例中，F(xiàn)GF受體拮抗劑的存在下培養(yǎng)了小鼠ES細(xì)胞以促進(jìn)自我更新。在其它具體實(shí)施例中，促進(jìn)培養(yǎng)基中的小鼠多能細(xì)胞自我更新的方法包括抑制GSK3和MEK，或抑制GSK3、MEK和FGF受體?？蛇x地，還可采用激活gpl30下游信號(hào)發(fā)送，通過抑制GSK3和MEK以進(jìn)一步促進(jìn)自我更新。激活gpl30下游信號(hào)發(fā)送的分子通常指的是gpl30活化劑或gpl30拮抗劑。一個(gè)或多個(gè)gpl30下游信號(hào)發(fā)送通路的激活可使用通過作用于gpl30的細(xì)胞因子獲得，例如細(xì)胞因子或其它LIF受體拮抗劑。能夠通過作用于gpl30，并因此能夠激活gpl30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞因子包括，但不限于LIF、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、心肌營(yíng)養(yǎng)素、抑瘤素M(oncostatinM)、IL畫6與sIL-6(IL-6plussIL-6)受體、hyperIL-6和IL畫ll。合適的細(xì)胞因子包括可結(jié)合和/或激活通過gp130的信號(hào)發(fā)送的模仿劑、融合蛋白或嵌合體。在血清存在下很好地確立了通過作用于gpl30的細(xì)胞因子的角色，但那些細(xì)胞因子在不存在血清下維持未分化細(xì)胞的能力是有限的。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)是在GSK3抑制劑、MEK抑制劑和可選地，F(xiàn)GF受體拮抗劑的存在下，多能細(xì)胞可以在確定的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。與使用GSK3抑制劑、MEK抑制劑和FGF受體拮抗劑的組合體相關(guān)的特別優(yōu)勢(shì)是不需要包含例如胰島素、N2B27或gpl30拮抗劑(例如LIF)的其它生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基。本發(fā)明因此使替代或改善ES細(xì)胞在無血清、血清提取物、飼養(yǎng)層細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞提取物的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)成為可能。曾報(bào)道過所述胚胎干細(xì)胞來自許多哺乳動(dòng)物源，包括小鼠(Bradley等1984，Nature309:255-56)、美洲水貂(MoIReprodDev1992，Dec;33(4):418-31)、豬和羊(JReprodFertilSuppl1991;43:255-60)、倉鼠(DevBiol1988，May;127(1):224-7)和牛(RouxArchDevBiol1992;201:134-141)。本文中的具體實(shí)施例使用原初生長(zhǎng)產(chǎn)物(primaryoutgrowth)的小鼠和人ES細(xì)胞以及大鼠細(xì)胞。將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的方法和組分適應(yīng)于培養(yǎng)其它哺乳動(dòng)物多能細(xì)胞培養(yǎng)基，因此包括特別是人的靈長(zhǎng)類、特別是小鼠和大鼠的嚙齒動(dòng)物，以及禽類的特別是ES細(xì)胞的多能干細(xì)胞。本發(fā)明的第二方面提供培養(yǎng)多能細(xì)胞，特別ES細(xì)胞，以便促進(jìn)自我更新的方法，包括將細(xì)胞維持在包括如下的培養(yǎng)基中(1)GSK3抑制劑；和(2)MEK抑制劑。優(yōu)選地，該方法包括將細(xì)胞維持在包含如下的培養(yǎng)基中(1)GSK3抑制劑；(2)MEK抑制劑；和(3)FGF受體的拮抗劑。本發(fā)明的方法通常用于生長(zhǎng)多能細(xì)胞，包括在無血清和無血清提取物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)ES細(xì)胞，該細(xì)胞之前已經(jīng)在血清或血清提取物存在下傳代。優(yōu)選地，該方法還在無飼養(yǎng)層細(xì)胞和/或飼養(yǎng)層細(xì)胞提取物存在下實(shí)施。例如實(shí)施的ES細(xì)胞培養(yǎng)包括如下步驟-維持ES細(xì)胞在培養(yǎng)基，或在飼養(yǎng)層上保持多能狀態(tài)；-使ES細(xì)胞傳代至少一次；-由該培養(yǎng)基提取該血清或該血清提取物并提取該詞養(yǎng)層(如果存在)，以便該培養(yǎng)基無飼養(yǎng)層、血清和血清提取物；和-隨后在GSK3抑制劑、MEK抑制劑和可選地，F(xiàn)GFR拮抗劑存在下，維持ES細(xì)胞處于多能狀態(tài)。另外優(yōu)選地，該細(xì)胞可在MEK抑制劑、GSK3抑制劑和gpl30下游信號(hào)發(fā)送通路活化劑的存在下維持在多能狀態(tài)下。本發(fā)明還提供了得到ES細(xì)胞的轉(zhuǎn)染群體的方法，包括-轉(zhuǎn)染具有編碼選擇性標(biāo)記的結(jié)構(gòu)的ES細(xì)胞。-將ES細(xì)胞放在培養(yǎng)板上；-在GSK3抑制劑、MEK抑制劑和可選的FGFR拮抗劑存在下培養(yǎng)ES細(xì)胞；和-選擇表達(dá)選擇性標(biāo)記的細(xì)胞。另外優(yōu)選地，該細(xì)胞可在MEK抑制劑、GSK3抑制劑和gpl30下游信號(hào)發(fā)送通路活化劑的存在下培養(yǎng)。選擇性標(biāo)記會(huì)編碼抗生素抗性、細(xì)胞表面標(biāo)記或例如在EP-A-0695351描述的其它選擇性標(biāo)記，并且優(yōu)選地包括核苷酸序列，該核苷酸序列編碼有效地鏈接到優(yōu)先在所需細(xì)胞中表達(dá)該選擇性標(biāo)記的促進(jìn)劑的選擇性標(biāo)記。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供培養(yǎng)多能的細(xì)胞(尤指ES)的方法，該方法包括將單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，例如培養(yǎng)板上的單個(gè)孔，并在MEK抑制劑、GSK3抑制劑，和優(yōu)選地FGFR拮抗劑存在下培養(yǎng)該細(xì)胞，以便到多能細(xì)胞(尤指ES)無性群體，它們中所有的都是單個(gè)細(xì)胞的后代?？蛇x地，還可在gpl30下游信號(hào)發(fā)送通路活化劑存在下培養(yǎng)該細(xì)胞。一旦得到穩(wěn)定均質(zhì)的ES細(xì)胞培養(yǎng)基，可改變培養(yǎng)基條件以指引該細(xì)胞分化為選自外胚層、中胚層或內(nèi)胚層的細(xì)胞命運(yùn)的一種或多種細(xì)胞類型。添加或提取細(xì)胞因子和信號(hào)發(fā)送因子使特異性分化細(xì)胞群體高效衍生成為可能。通過在通過作用于gp130的細(xì)胞因子、MEK抑制劑和GSK3抑制劑存在下維持ES細(xì)胞，隨后提取該細(xì)胞因子，同時(shí)維持GSK3抑制劑和MEK抑制劑和/或添加另外的能夠指引分化的信號(hào)發(fā)送分子，獲得細(xì)胞向非神經(jīng)外胚層命運(yùn)的分化。替代地，可在MEK抑制劑和GSK3抑制劑存在下維持細(xì)胞，并隨后通過提取一種或兩種抑制劑和/或添加能夠指引發(fā)化的信號(hào)發(fā)送分子指引分化。如上所述的方法全部可選地包括得到和/或分離該方法的產(chǎn)品的分化細(xì)胞。本發(fā)明的另外方面提供細(xì)胞培養(yǎng)基。一種用于多能，特別是ES細(xì)胞的自我更新的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括GSK3抑制劑、MEK抑制劑和可選地，F(xiàn)GFR拮抗劑。該培養(yǎng)基還可選地gpl30下游信號(hào)發(fā)送通路的活化劑。本發(fā)明的另一種培養(yǎng)基是干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括GSK3抑制劑、MEK抑制劑和可選地，F(xiàn)GFR拮抗劑。所有培養(yǎng)基優(yōu)選地還包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所有培養(yǎng)基不含gpl30拮抗劑，因此優(yōu)選不含LIF。本發(fā)明提供無血清和血清提取物的培養(yǎng)基，這樣的培養(yǎng)基包括-基礎(chǔ)培養(yǎng)基；-MEK抑制劑；-GSK3抑制劑；禾口-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體；該培養(yǎng)基可選地?zé)o血清和血清提取物。該培養(yǎng)基優(yōu)選地還包括FGFR拮抗劑。該培養(yǎng)基還可選地包括gp130下游信號(hào)發(fā)送通路的活化劑。多能干細(xì)胞，特別是大鼠或小鼠細(xì)胞用優(yōu)選培養(yǎng)基可不含血清和不含gp130拮抗劑，并且包括MEK抑制劑、GSK3抑制劑，和FGF受體拮抗劑?？扇绫疚乃枋龅闹谱髋囵B(yǎng)基組分替代物?；A(chǔ)培養(yǎng)基是提供細(xì)胞用碳和/或維生素和/或礦物質(zhì)的基本源的培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基通常不含蛋白質(zhì)并且不能支持細(xì)胞的自我更新。鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體提供鐵源或提供由培養(yǎng)基吸收鐵的能力。適宜的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體包括鐵傳遞蛋白和脫鐵運(yùn)鐵蛋白(apotransferrin)。優(yōu)選該培養(yǎng)基還包括一種或多種胰島素或類胰島素生長(zhǎng)因子和清蛋白(優(yōu)選重組體)或清蛋白替代物，并且不含飼養(yǎng)層細(xì)胞和飼養(yǎng)層層細(xì)胞提取物。該培養(yǎng)基還包括凋亡抑制劑或任何促進(jìn)多能細(xì)胞在培養(yǎng)基中的維持的其它組分。本發(fā)明的特別培養(yǎng)基包括MEK抑制劑、GSK3抑制劑、胰島素、清蛋白和鐵傳遞蛋白，具有或不具有另外的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在該培養(yǎng)基中，可可選地包括LIF，并用其它的gpl30信號(hào)發(fā)送活化劑替代，盡管優(yōu)選的培養(yǎng)基包括結(jié)合細(xì)胞因子的gpl30受體LIF，但其適合的濃度通常為10U/ml至1000U/ml，更優(yōu)選地為50U/ml至500U/ml，最好是在100U/ml左右。下文中更詳細(xì)地描述GSK3和MEK抑制劑。本發(fā)明還提供由胚泡衍生多能細(xì)胞的方法，包括(1)獲得胚泡；(2)在MEK抑制劑、GSK3抑制劑和可選地，F(xiàn)GF受體拮抗劑存在下，培養(yǎng)胚泡，以得到內(nèi)細(xì)胞群；(3)分離該內(nèi)細(xì)胞群；(4)由分離的內(nèi)細(xì)胞群分離一種或多種細(xì)胞；禾口(5)在MEK抑制劑、GSK3抑制劑和可選地，F(xiàn)GF受體拮抗劑存在下，培養(yǎng)該分離的一種或多種細(xì)胞?？蛇x地，該分離細(xì)胞可在MEK抑制劑、GSK3抑制劑和gpl30下游信號(hào)發(fā)送活化劑存在下培養(yǎng)，也可存在FGF受體拮抗劑。優(yōu)選地，該方法包括在LIF中培養(yǎng)胚泡，更優(yōu)選地為2至4天的期間。該分離的細(xì)胞優(yōu)選在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通常，作塊狀再培養(yǎng)這些細(xì)胞。該胚泡也優(yōu)選在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可選地不存在BMP受體拮抗劑。另外根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選地，在貼壁培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，可通過在培養(yǎng)基底物上加入細(xì)胞粘附蛋白來促進(jìn)。還優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明在單層培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能細(xì)胞，盡管細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，或作為前代細(xì)胞聚合體生長(zhǎng)是任選的；細(xì)胞還可在珠或在例如膜或其它3維結(jié)構(gòu)的其它適合的儲(chǔ)料支架上生長(zhǎng)。本發(fā)明的實(shí)例中使用的培養(yǎng)基優(yōu)選地還包括血清白蛋白。這可以純化的或優(yōu)選重組形式使用，并且如果以重組形式，這具有不含潛在污染因子，細(xì)胞因子等的優(yōu)勢(shì)。該培養(yǎng)基不需要包含血清白蛋白，并且該組分可忽略，或用其它批量的蛋白，或用如Wiles等所述的合成聚合物(聚乙烯醇)替代。本發(fā)明的特別優(yōu)選培養(yǎng)基為完全確定的一種。該培養(yǎng)基不包含任何未確定的組分，即含量未知或可能包含未確定的或非特異性的變化因子。使用完全確定的培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)是可得到高效且-致的培養(yǎng)和隨后操作多能細(xì)胞的方案。另外，發(fā)現(xiàn)通過較高的效率和更大的可預(yù)測(cè)性，維持細(xì)胞在多能狀態(tài)下是可獲得的，并且當(dāng)使用響應(yīng)分化信號(hào)的確定培養(yǎng)基在培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)引入分化時(shí)，比當(dāng)使用未確定培養(yǎng)基時(shí)更為均質(zhì)。本發(fā)明還提供作為培養(yǎng)基用添加劑的濃縮物和成套組分，用于培養(yǎng)基的制備，所得培養(yǎng)基符合本發(fā)明。本發(fā)明的.套組分包括第一和第二組合體(container),第一組合體包含MEK抑制劑，第二組合體包含GSK3抑制劑。優(yōu)選地，該成套材料包括含F(xiàn)GF受體拮抗劑的第三組合體。該成套材料還，可選地，包括含gpl30下游信號(hào)發(fā)送活化劑的另一個(gè)組合體。優(yōu)選配制成套材料，由此將每一種組合體的內(nèi)容物加到培養(yǎng)基，以便得到本發(fā)明的培養(yǎng)基。這些成套材料優(yōu)選包含它們各自組分濃縮的原液。本發(fā)明的方法還包括得到分化的細(xì)胞的方法，該方法包括培養(yǎng)所述多能細(xì)胞，并且允許或引起該細(xì)胞分化，該細(xì)胞包含選擇性標(biāo)記，比較其它細(xì)胞類型，該標(biāo)記能夠在所需的包括多能干細(xì)胞的分化細(xì)胞內(nèi)差異性表達(dá)，由此選擇性標(biāo)記的差異表達(dá)導(dǎo)致所需分化細(xì)胞的優(yōu)先分離和/或殘存和/或分裂。選擇性標(biāo)記可在所需的分化細(xì)胞屮表達(dá)，但不在其它細(xì)胞類型中表達(dá)，或表達(dá)水平會(huì)在所需分化細(xì)胞和其它細(xì)胞類型之間有所區(qū)別，由此允許對(duì)該選擇性標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行選擇。該分化細(xì)胞可以是組織干細(xì)胞或祖細(xì)胞，并且可以是終末分化細(xì)胞。通常本發(fā)明還延伸到通過本文所述的任何方法得到的細(xì)胞。可在毒品發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中使用本發(fā)明的細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞還用于細(xì)胞療法，因此本發(fā)明的方法包括使用MEK抑制作用和GSK3抑制作用，可選地，F(xiàn)GF發(fā)送拮抗劑信號(hào)的組合體，以衍生和/或維持多能細(xì)胞，由此衍生用于細(xì)胞療法的細(xì)胞，并在細(xì)胞療法中使用?？蛇x地，在不存在gpl30下游信號(hào)發(fā)送活化劑時(shí)使用該組分。本發(fā)明的另一些方面涉及使用MEK和FGF受體的抑制作用，可選地與GSK3抑制作用組合體用以促進(jìn)多能細(xì)胞的自我更新。我們?cè)l(fā)現(xiàn)MEK抑制劑和FGF受體拮抗劑的組合體在不存在添加的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子時(shí)，有效地支持多能細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供包括MEK抑制劑和FGF受體拮抗劑和培養(yǎng)基。MEK抑制劑和FGF受體拮抗體與本發(fā)明的其它方面所述相關(guān)。類似地，該培養(yǎng)基還包括與本發(fā)明其它方面相關(guān)的附加組分或因子。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供使用MEK抑制劑和FGF受體拮抗體制作多能細(xì)胞用培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供培養(yǎng)多能細(xì)胞和得到多能細(xì)胞轉(zhuǎn)染群體的方法，該方法可方便地如所述實(shí)施用于本發(fā)明的其它方面。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供培養(yǎng)多能細(xì)胞以促進(jìn)自我更新的方法，包括在含MEK抑制劑和FGF受體拮抗體的培養(yǎng)基中維持細(xì)胞。本發(fā)明提供培養(yǎng)多能細(xì)胞的相關(guān)方法，包括如下步驟-使ES細(xì)胞在培養(yǎng)基中維持多能狀態(tài)，可選地培養(yǎng)基有飼養(yǎng)層；-使ES細(xì)胞傳代至少一次；-自培養(yǎng)基提取血清或血清提取物(如果存在)并提取該飼養(yǎng)層(如果存在)，以便該培養(yǎng)基不含飼養(yǎng)基、血清和血清提取物；以及-隨后在MEK抑制劑和FGF受體拮抗體存在下使ES細(xì)胞維持在多能狀態(tài)。本發(fā)明的另一方面包括得到ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染群體的方法，包括-轉(zhuǎn)染具有編碼選擇懷標(biāo)記的結(jié)構(gòu)的ES細(xì)胞；-將ES細(xì)胞放在培養(yǎng)板上；-在MEK抑制劑和FGF受體拮抗體存在下培養(yǎng)ES細(xì)胞和-選擇表達(dá)選擇性標(biāo)記的細(xì)胞。還提供不含血清和血清提取物的細(xì)胞培養(yǎng)基和包括-基礎(chǔ)培養(yǎng)基；-MEK抑制劑；-FGF受體拮抗體；和-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體。MEK抑制劑和FGF受體拮抗劑的組合體還用于衍生新的多能細(xì)胞系。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供由胚泡衍生多能細(xì)胞的方法，包括(1)得到胚泡；(2)在MEK抑制劑和FGF受體拮抗體的存在下培養(yǎng)胚泡，以得到內(nèi)細(xì)胞群；(3)分離該內(nèi)細(xì)胞群；(4)分離自該分離的內(nèi)細(xì)胞群的寸或多個(gè)細(xì)胞；和(5)在MEK抑制劑和FGF受體坫抗體存在下培養(yǎng)該分離的細(xì)胞。本發(fā)明還包括含第一和第二組合體的成套材料，第一組合體包含MEK抑制劑，第二組合體包含F(xiàn)GF受體拈抗體。該成套材料還可包括如本文所述的其它組合體和/或組分。本發(fā)明的其它方面提供了MEK抑制劑和FGF受體拮抗體在促進(jìn)多能干細(xì)胞，特別是表達(dá)Nanog的多能千細(xì)胞的自我更新中的用途。相關(guān)方面提供擴(kuò)增干細(xì)胞群的方法，包括在MEK抑制劑和FGF受體拮抗體存在下培養(yǎng)干細(xì)胞。本發(fā)明的許多優(yōu)勢(shì)可參考上文或足VL而易見的。細(xì)胞培養(yǎng)基組分可以確定是相對(duì)來說無毒性，并有滲透性。特別地，即與蛋白細(xì)胞因子的純化相比較，用于本發(fā)明的具體實(shí)施方案的該MEK抑制劑、GSK3抑制劑和FGFR拮抗體更容易純化。制作重組蛋白成本很高，因此生產(chǎn)具有更寬的有效濃度范圍的小分子培養(yǎng)基組分成本更低，儲(chǔ)藏更穩(wěn)定。如下陳述的具體實(shí)施方案在無血沽的完全確定的培養(yǎng)基中使用CHIR99021、PD184352和可選SU5402的組合休，并使很少分化的小鼠ES細(xì)胞自我更新。偶爾會(huì)報(bào)道在BMP存在下培養(yǎng)ES細(xì)胞時(shí)有一些神經(jīng)形成。是在本發(fā)明的具體實(shí)施例中卻未發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)本發(fā)明在具體實(shí)施例中進(jìn)一歩通過下圖例證性描述圖1:在多能ES-NS雜種群生成的PD184352的效果分析。針對(duì)RHxNSTGFP融合的紅和綠熒光的(A-C)-FACS分析。(A)PEG處理后融合混合24小時(shí)；(B)對(duì)控制(gate)在A內(nèi)的FACS分類雜種的純度檢查；(C)將A內(nèi)的分類雜種放于培養(yǎng)皿，將所形成的群記錄為群百分比/培養(yǎng)雜種。這些記錄考慮了FACS分類細(xì)胞的純投；(D)數(shù)據(jù)匯總。(E)雜種群形態(tài)實(shí)例。圖2:根據(jù)本發(fā)明衍生和維持的小鼠ES細(xì)胞，表明通過這些ES細(xì)胞的嵌合體貢獻(xiàn)的高效率；圖3:根據(jù)本發(fā)明生長(zhǎng)的傳代4次的小鼠細(xì)胞；圖4:根據(jù)本發(fā)明生長(zhǎng)的小鼠ES細(xì)胞為Oct4陽性。在實(shí)施例中，術(shù)語2i培養(yǎng)基或2i川于表明包括MEK抑制劑和FGF受體拮抗體的培養(yǎng)基。術(shù)語3i培養(yǎng)基或3i川于農(nóng)明包括MEK抑制劑、GSK3抑制劑和FGF受體拮抗體的培養(yǎng)基。具體實(shí)施例方式GSK-3(3抑制劑、MEJC抑制劑、培養(yǎng)站和LiS細(xì)胞自我更新小鼠和人ES細(xì)胞在許多條件下生長(zhǎng)，除另有聲明外使用N2B27培養(yǎng)基，無論有無GSK-3P抑制劑、CHIR99021、AR-AO144-18、SB216763和SB415286以及MEK抑制劑PD184352的存在。制備N2B27培養(yǎng)基N2100x原液。10ml:將lml鵬島素(W終濃度2.5mg/ml)與lml轉(zhuǎn)鐵蛋白(最終濃度10mg/ml)、0.67mlBSAC設(shè)終濃度5mg/ml)、33jil孕酮(最終濃度2pg/ml)、100jil腐胺(最終濃度1.6mg/ml)、10pl亞硒酸鈉(最終濃度3jxM)和7.187mlDMEM/F12混合。在4。C下儲(chǔ)存并在一個(gè)月內(nèi)使用。DMEM/F12-N2培養(yǎng)基將lmlN2100x原液加至100mlDMEM/F12。DMEM/F12培養(yǎng)基中的N2的每一種組分的最終濃度胰島素，25pg/ml;轉(zhuǎn)鐵蛋白，100|_ig/ml;孕酮，16ng/ml;腐胺，16(ig/mh亞硒酸鈉，30nM;BSA，50嗎/ml。在4"C下儲(chǔ)存并在一個(gè)月內(nèi)使用。Neurolbasal/B27培養(yǎng)基將2mlB27禾U0.5-lmI的200mML-谷氨酰胺加入lOOmlNeurolbasal(TM)培養(yǎng)站。在4。C下儲(chǔ)存并在一個(gè)月內(nèi)使用。N2B27培養(yǎng)基按1:1比率將DM1':M/F12-N2培養(yǎng)基與Neurolbasal/B27培養(yǎng)基混合。加(3-巰基乙醇，至0.1M原液達(dá)O.lmM的最終濃度。在4。C下儲(chǔ)存并在一個(gè)月內(nèi)使用。實(shí)施例1在無血清培養(yǎng)基中，MEK抑制劑加GSK-3卩抑制劑足以支持小鼠ES細(xì)胞都在(1)N2B27培養(yǎng)基和(2)完企確定的培養(yǎng)基中的自我更新一數(shù)據(jù)未顯示。在包含MEK抑制劑、GSK-3[3抑制劑和LIF(數(shù)據(jù)未顯示)的培養(yǎng)基中進(jìn)一步改善ES細(xì)胞的自我史新。實(shí)施例2PD184352(MEK抑制劑)增加了ES細(xì)胞內(nèi)的Nanog級(jí)別(數(shù)據(jù)未顯示)。另夕卜，用PD184352處理的Nanog-/-ES細(xì)胞不能表現(xiàn)出增強(qiáng)了ES細(xì)胞的自我更新。事實(shí)上，這些細(xì)胞分化了(數(shù)據(jù)未顯示)。這表明通過PD184352增強(qiáng)ES自我更新表型是迪過Nanog介導(dǎo)的。PD184352在重編程中的作用還g^i過在細(xì)胞融合情況下確定NS細(xì)胞向多能性轉(zhuǎn)換來研究的。融合基本上表達(dá)dsRed熒光蛋白和潮霉素抗體的RHES細(xì)胞為胎兒衍生神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞(NSTGFP)，該NSTGFP表達(dá)了融合蛋白TauGFP經(jīng)IRES鏈接到嘌呤霉素抗體。在一種融合中，RH細(xì)胞在融合前和融合后用3pMPD184352處理3天。在該控制中，不添加PD184352。經(jīng)處理過和未處理過的原雜種在融合后24小時(shí)分類，并隨后放于培養(yǎng)皿(圖IA-C)。3天后向ES培養(yǎng)基添加潮霉素和嘌呤霉素選擇。記錄表達(dá)dsRed2和GFP熒光性并且顯示ES細(xì)胞形態(tài)的群(圖1D和E)。結(jié)果表明PD184352增強(qiáng)了45倍的ES-NS雜種群形成。另人感興趣的是，在經(jīng)PD184352處理的RH細(xì)胞內(nèi)，對(duì)應(yīng)培養(yǎng)雜種形成的雜種群百分比，與Nanog過表達(dá)ES細(xì)胞相比較剛好低了一半(2.25%比4%)。該結(jié)果表明PD184352不僅增強(qiáng)了ES細(xì)胞自我更新，還增強(qiáng)了該細(xì)胞融合情況下的重編程。該作用可能是通過處理過的RH細(xì)胞內(nèi)Nanog級(jí)別的增加而介導(dǎo)的。因此，如果內(nèi)源性地表達(dá)Nanog，則隨后MEK抑制劑可用于上調(diào)Nanog并獲得例如增強(qiáng)重編程的關(guān)聯(lián)作用。實(shí)施例3在通過GSK-3抑制劑CHIR99021和MEK抑制劑PD184352補(bǔ)充的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人ES細(xì)胞。向該培養(yǎng)基中加入LIF進(jìn)一步改善了細(xì)胞的增殖(數(shù)據(jù)未顯示)實(shí)施例4在通過GSK-3抑制劑CHIR99021和MEK抑制劑PD184352補(bǔ)充的培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠ES細(xì)胞。向該培養(yǎng)基中加入LIF進(jìn)一步改善了細(xì)胞的增殖(數(shù)據(jù)未顯示)實(shí)施例5在包含CHIR99021、PD184352和SU5402的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)小鼠ES細(xì)胞和人ES細(xì)胞，按如下制備三種抑制劑/拮抗劑的濃度:<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>制備DMEM/F12-N2培養(yǎng)基將lmlN2100x原液加至100mlDMEM/F12(Gibco42400-010)。DMEM/F12培養(yǎng)基中的每一種N2組分的最終濃度為<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>將2mlB27(Gibco17504-044)禾B1陽2ML-glutamine(TC儲(chǔ)存1:100)加入100mlNeurobasal培養(yǎng)基(Gibco21103-049)。制備N2B27培養(yǎng)基以1:1比率將DMEM/F12-N2培養(yǎng)基與Neurobasal/B27培養(yǎng)基混合。用該培養(yǎng)基稀釋所有化合物和生長(zhǎng)細(xì)胞。該培養(yǎng)基用于維持人ES細(xì)胞和自129株小鼠的ES細(xì)胞的衍生和維持，以及還用于非受納小鼠株CBA和C56/BL6的ES細(xì)胞的衍生。實(shí)施例6在FGF受體抑制劑和MEK抑制劑存在下培養(yǎng)小鼠ES細(xì)胞。分別使用選擇性藥理學(xué)抑制劑SU5402和PD184352抑制FGF受體酪氨酸激酶，且通過MEKl/2活化Erk1/2。發(fā)現(xiàn)在不提供BMP4時(shí)，加入任何一種抑制劑都足夠使含LIF的N2B27培養(yǎng)基內(nèi)的ES細(xì)胞繁殖力增強(qiáng)(數(shù)據(jù)未顯示)。未分化的培養(yǎng)基在這些條件下可連續(xù)傳代，同時(shí)維持多能性標(biāo)記Oct4、Nanog禾QRexl的表達(dá)。神經(jīng)約束(Neuralcommitment)未發(fā)生，盡管該ID基因的表達(dá)遠(yuǎn)低于在含LIF加BMP的培養(yǎng)基中維持的表達(dá)。表面皿培養(yǎng)的ES細(xì)胞在未加入LIF的N2B27培養(yǎng)基中，即通常引起有效的神經(jīng)約束的情況下，如果加入SU5402或PD184352，保持Oct4陽性和Soxl陰性達(dá)幾天(數(shù)據(jù)未顯示)。然而這些細(xì)胞總是傳代后分化和/或死亡。為減少潛在的毒性副作用，我們使用低2.5倍的劑量并將兩種抑制劑組合體在一起。在含0.8|iMPD184352和2(iMSU5402的N2B27中，最初觀察到一定程度的分化，但ES細(xì)胞繼續(xù)存在，并且傳代后擴(kuò)增(數(shù)據(jù)未顯示)。在這兩種抑制劑(20條件下，比LIF存在的條件下，生命力較低和群體倍增時(shí)間變慢，但有效地抑制了分化。該發(fā)現(xiàn)表明ES細(xì)胞自我更新的最低要求可以轉(zhuǎn)向自FGF受體發(fā)送的分化信號(hào)和Erk信號(hào)發(fā)送，同時(shí)避免損害細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育。實(shí)施例7我們推斷ES細(xì)胞在2i培養(yǎng)基中生長(zhǎng)減少歸于糖原合酶激酶3(GSK-3)活性增加，由此通過pErk的Rsk下游釋放了抑制性磷酸化作用。CHIR9卯21是經(jīng)充分表征的高選擇性小分子GSK-3抑制劑，其不與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)在完全阻止GSK-3活性的濃度下交叉反應(yīng)。當(dāng)在血清存在下將CHIR99021(3pM)加至培養(yǎng)基時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)其實(shí)際上促進(jìn)了分化，即使存在LIF。在無血清N2B27培養(yǎng)基中，該分化響應(yīng)減少，并且一些群幾天未出現(xiàn)形態(tài)分化。然而，傳代后未分化的細(xì)胞未繼續(xù)存在。通過兩種其它廣泛使用的GSK-3抑制劑SB216763和SB415286，得到相類似的結(jié)果，但兩者都表現(xiàn)出對(duì)ES細(xì)胞的一定程度的毒性。然而，當(dāng)將CHIR99021與2i組合體時(shí)，分化響應(yīng)完全消失。并且CHIR99021調(diào)控對(duì)2i的響應(yīng)，以便ES細(xì)胞呈緊密三維群體生產(chǎn)，而不是通常在LIF加血清/BMP或在2i中看到的平坦單層。在這三種抑制劑中的分化是可以忽略的并且ES細(xì)胞快速增殖。最重要的未分化群傳代后高效生長(zhǎng)。兩個(gè)獨(dú)立的親本品ES細(xì)胞系E14Tg2a和CGR8的衍生物表明了在3i中的長(zhǎng)時(shí)間強(qiáng)力擴(kuò)增，而很少或無明顯分化(數(shù)據(jù)未顯示)。它們表達(dá)Oct4、Nanog禾BRexl，并且不顯示譜系標(biāo)記Gata4、Soxl或brachyury的可察覺到的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。在大批培養(yǎng)基中，ES細(xì)胞在3i中如在LIF加BMP中一樣，以可比的倍增速度擴(kuò)增，并且該Oct4-GFP陽性未化細(xì)胞的比例保持高于卯％。因此，3i培養(yǎng)基可用于在無血清和不添加細(xì)胞因子時(shí)，培養(yǎng)ES細(xì)胞，無分化。實(shí)施例8對(duì)培養(yǎng)基培養(yǎng)方式是否充分支持ES細(xì)胞自我更新的嚴(yán)格測(cè)試是通過單個(gè)細(xì)胞形成未分化群進(jìn)行的。單個(gè)細(xì)胞沉積后，在N2B27和3i存在時(shí)的克隆效率為25%(98/384)，高于用LIF和BMP(11%,23/192)-數(shù)據(jù)未顯示。這些群表達(dá)Oct4-GFP，并且如未分化ES細(xì)胞一樣是可傳代的。因此，包含MEK抑制劑、FGF受體抑制劑和GSK3抑制劑的培養(yǎng)基能夠支持由單個(gè)細(xì)胞衍生的未分化ES細(xì)胞群的形成。實(shí)施例9我們檢查3i是否適合新的ES細(xì)胞直接由胚胎衍生，或反映己確立(細(xì)胞)株的變化。將自受納129株的胚泡直接置于涂布凝膠的塑料上的N2B27和3i中培養(yǎng)5天。隨后分裂和再培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞群，自12個(gè)胚胎中的7個(gè)得到ES細(xì)胞群體。擴(kuò)增三個(gè)并注入胚泡。它們都具有很高的嵌合性和種系傳遞性(表1)。隨后，由C57BL/6和非受納CBA和MFI株衍生了多個(gè)ES細(xì)胞，這表明了3i有助于由外胚層向ES細(xì)胞的傳遞。我們得出結(jié)論3i將ES細(xì)胞由對(duì)外源LIF和BMP/血清的無選擇地需要，或損害生長(zhǎng)潛力中解放出來。表1:在3i中衍生的ES細(xì)胞對(duì)嵌合體和幼體后代的貢獻(xiàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>*通過毛色檢測(cè)的129/01aES細(xì)胞基因組的嵌合性和傳遞性。#假定為XX的ES細(xì)胞。因此，ES細(xì)胞維持在GSK3抑制劑和MEK抑制劑的組合體、MEK抑制劑和FGF受體拮抗體，或可選GSK3抑制劑的組合體，MEK抑制劑和FGF受體拮抗體的組合體中，并且本發(fā)明還提供了培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基。權(quán)利要求1.一種培養(yǎng)基，其包括MEK抑制劑和GSK3抑制劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，還包括FGF受體拮抗體。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其中MEK抑制劑為MEK1抑制劑。4.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中MEK抑制劑選自PD184352和PD98059。5.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中GSK3抑制劑為GSK-33抑制劑。6.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中GSK3抑制劑對(duì)GSK3的選擇性高于cdc2和/或erk2。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基，其中GSK3抑制劑對(duì)GSK3的選擇性高于cdc2至少100倍。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基，其中GSK3抑制劑對(duì)GSK3的選擇性高于cdc2至少200倍。9.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中GSK3抑制劑為CHIR99021。10.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，還包括gpl30拮抗體。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的培養(yǎng)基，其中g(shù)pl30拮抗體為L(zhǎng)IF、CNTF、心肌營(yíng)養(yǎng)素、抑瘤素M、IL-6加sIL-6受體或hyperlL-6。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的培養(yǎng)基，其中g(shù)pl30拮抗體為(a)LIF，(b)sIL-6R和IL-6，或(c)hyperlL-6。13.根據(jù)權(quán)利要求2至12中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中FGF受體拮抗體為FGFR1拮抗體。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的培養(yǎng)基，其包括SU5402。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的培養(yǎng)基，其包括PD173074。16.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其包括細(xì)胞凋亡的抑制劑。17.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其包括N2培養(yǎng)基和/或B27培養(yǎng)18.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其包括PD184352、CHIR99021和SU5402。19.一種基于上述任一權(quán)利要求的人ES培養(yǎng)基。20.—種基于權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的小鼠ES培養(yǎng)基。21.MEK抑制劑和GSK3抑制劑在制作多能細(xì)胞用培養(yǎng)基中的應(yīng)用。22.MEK抑制劑、GSK3抑制劑和FGF受體拮抗體在制作多能細(xì)胞用培養(yǎng)基中的應(yīng)用。23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的應(yīng)用，所述培養(yǎng)基用于小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)。24.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的應(yīng)用，所述培養(yǎng)基用于人ES細(xì)胞的培養(yǎng)。25.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的應(yīng)用，所述培養(yǎng)基用于大鼠多能細(xì)胞的培養(yǎng)。26.—種以促進(jìn)自我更新的多能細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其包括將所述細(xì)胞維持在權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基中。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)基不含血清或血清提取物。28.根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的培養(yǎng)方法，所述細(xì)胞為小鼠細(xì)胞。29.根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的培養(yǎng)方法，所述細(xì)胞為人細(xì)胞。30.根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的培養(yǎng)方法，所述細(xì)胞為大鼠細(xì)胞。31.—種ES細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其包括如下步驟-維持ES細(xì)胞在培養(yǎng)基中處于多能狀態(tài)，可在培養(yǎng)基中設(shè)飼養(yǎng)層；-使ES細(xì)胞傳代至少一次；-由該培養(yǎng)基中提出血清或血清提取物(如果存在)和提取該飼養(yǎng)層(如果存在)，以便該培養(yǎng)基不含詞養(yǎng)層、血清和血清提取物；和-然后在MEK抑制劑和GSK3抑制劑存在的條件下使ES細(xì)胞維持在多能狀態(tài)下。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的培養(yǎng)方法，所述細(xì)胞在MEK抑制劑、GSK抑制劑和gpl30下游信號(hào)發(fā)送途徑活化劑的存在條件下維持在多能狀態(tài)。33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的培養(yǎng)方法，所述細(xì)胞在MEK抑制劑、GSK抑制劑和FGF受體拮抗體的存在下維持在多能狀態(tài)。34.根據(jù)權(quán)利要求31至33中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，所述細(xì)胞為小鼠細(xì)胞。35.根據(jù)權(quán)利要求31至33中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，所述細(xì)胞為人細(xì)胞。36.—種得到ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染群體的方法，包括-轉(zhuǎn)染具有編碼選擇性標(biāo)記的結(jié)構(gòu)的ES細(xì)胞；-將所述ES細(xì)胞放在培養(yǎng)板上；-在MEK抑制劑和GSK3抑制劑存在下培養(yǎng)所述ES細(xì)胞；和-選擇表達(dá)該選擇性標(biāo)記的細(xì)胞。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的得到ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染群體的方法，所述ES細(xì)胞在MEK抑制劑、GSK抑制劑和gpl30下游信號(hào)發(fā)送途徑活化劑的存在下培養(yǎng)。38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的得到ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染群體的方法，所述ES細(xì)胞在MEK抑制劑、GSK抑制劑和FGF受體拮抗體的存在下培養(yǎng)。39.根據(jù)權(quán)利要求36至38中任一項(xiàng)所述的得到ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染群體的方法，所述細(xì)胞為小鼠細(xì)胞。40.根據(jù)權(quán)利要求36至38中任一項(xiàng)所述的得到ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染群體的方法，所述細(xì)胞為人細(xì)胞。41.一種不含血清和血清提取物的細(xì)胞培養(yǎng)基，包括-基礎(chǔ)培養(yǎng)基；-MEK抑制劑；-GSK3抑制劑；和-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，還包括gpl30下游信號(hào)發(fā)送途徑的活化劑。43.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，還包括FGF受體拮抗體。44.根據(jù)權(quán)利要求41至43中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，還包括胰島素、清蛋白和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體。45.根據(jù)權(quán)利要求41至44中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，還包括細(xì)胞凋亡抑制劑。46.—種從胚泡衍生多能細(xì)胞的方法，包括(1)獲得胚泡；(2)在MEK抑制劑和GSK3抑制劑的存在下培養(yǎng)該胚泡，以得到內(nèi)細(xì)胞群；(3)分離所述內(nèi)細(xì)胞群；(4)由所述分離內(nèi)細(xì)胞群分離一個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞；和(5)在MEK抑制劑和GSK3抑制劑的存在下培養(yǎng)上一步驟中分離的細(xì)胞。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的從胚泡衍生多能細(xì)胞的方法，在gpl30下游信號(hào)發(fā)送活化劑、MEK抑制劑和GSK3抑制劑的存在下培養(yǎng)所述分離細(xì)胞。48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的從胚泡衍生多能細(xì)胞的方法，在FGF受體拮抗體、MEK抑制劑和GSK3抑制劑的存在下培養(yǎng)該分離細(xì)胞。49.根據(jù)權(quán)利要求46至48中任一項(xiàng)所述的從胚泡衍生多能細(xì)胞的方法，包括在LIF中培養(yǎng)該胚泡2天至4天的時(shí)間。50.—種成套材料，其包括第一和第二組合體，所述第一組合體包含GSK3抑制劑且所述第二組合體包含MEK抑制劑。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的成套材料，還包括含F(xiàn)GF受體拮抗體的第三組合體。52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的成套材料，其中的GSK3抑制劑、MEK抑制劑和FGFR拮抗體與權(quán)利要求3至9或13至15所定義的相同。53.根據(jù)權(quán)利要求50至52中任一項(xiàng)所述的成套材料，包括另一個(gè)含gpl30下游信號(hào)發(fā)送活化劑的組合體。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的成套材料，該gpl30拮抗體為(a)LIF，(b)sIL-6R和IL-6，或(c)hyperlL-6。55.MEK抑制劑和GSK3抑制劑在促進(jìn)多能干細(xì)胞自我更新中的應(yīng)用。56.MEK抑制劑、GSK3抑制劑和FGF受體拮抗體在促進(jìn)多能干細(xì)胞自我更新中的應(yīng)用。57.—種擴(kuò)增干細(xì)胞群體的方法，包括在MEK抑制劑和GSK3抑制劑的存在下培養(yǎng)該干細(xì)胞。58.—種擴(kuò)增干細(xì)胞群體的方法，其包括在MEK抑制劑、GSK3抑制劑和FGF受體拮抗體的存在下培養(yǎng)該干細(xì)胞。59.MEK抑制劑和GSK3抑制劑在促進(jìn)表達(dá)Nanog的多能干細(xì)胞自我更新中的應(yīng)用。60.MEK抑制劑、GSK3抑制劑和FGF受體拮抗體在促進(jìn)表達(dá)Nanog的多能干細(xì)胞自我更新中的應(yīng)用。61.—種培養(yǎng)基，其包括MEK抑制劑和FGF受體拮抗體。62.MEK抑制劑和FGF受體拮抗體在制作多能細(xì)胞用培養(yǎng)基中的應(yīng)用。63.—種促進(jìn)自我更新的多能細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括將細(xì)胞維持在含MEK抑制劑和FGF受體拮抗體的培養(yǎng)基中。64.—種培養(yǎng)ES細(xì)胞的方法，包括如下步驟-維持ES細(xì)胞在培養(yǎng)基中處于多能狀態(tài)，可在培養(yǎng)基中設(shè)飼養(yǎng)層；-使ES細(xì)胞傳代至少一次；-由該培養(yǎng)基中提取血清或血清提取物(如果存在)以及提取該飼養(yǎng)層(如果存在)，以便該培養(yǎng)基不含詞養(yǎng)層、血清和血清提取物；和-隨后在MEK抑制劑和FGF受體抑制劑的存在下使ES細(xì)胞維持在多能狀態(tài)下。65.—種得到ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染群體的方法，包括-轉(zhuǎn)染具有編碼選擇性標(biāo)記的結(jié)構(gòu)的ES細(xì)胞；-將上述ES細(xì)胞放在培養(yǎng)板上；-在MEK抑制劑和FGF受體抑制劑的存在下培養(yǎng)上述ES細(xì)胞；和-選擇表達(dá)該選擇性標(biāo)記的細(xì)胞。66.—種不含血清和血清提取物的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包括-基礎(chǔ)培養(yǎng)基；-MEK抑制劑；-FGF受體拮抗體；和-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體。67.—種自胚泡衍生多能細(xì)胞的方法，包括(1)獲得胚泡；(2)在MEK抑制劑和FGF受體拮抗體的存在下培養(yǎng)該胚泡，以得到內(nèi)細(xì)胞群；(3)分離該內(nèi)細(xì)胞群；(4)由該分離的內(nèi)細(xì)胞群分離一個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞；和(5)在MEK抑制劑和FGF受體拮抗體的存在下培養(yǎng)該分離的細(xì)胞。68.—種包括第一組合體和第二組合體的成套材料，第一組合體包含MEK抑制劑，第二組合體包含F(xiàn)GF受體拮抗體；所述成套材料還可包括本專利文件中所述的其它組合體和/或組分。69.MEK抑制劑和FGF受體拮抗體在促進(jìn)多能干細(xì)胞自我更新中的應(yīng)用。70.MEK抑制劑和FGF受體拮抗體在促進(jìn)表達(dá)Nanog的多能干細(xì)胞自我更新中的應(yīng)用。71.—種擴(kuò)增干細(xì)胞群體的方法，包括在MEK抑制劑和FGF受體拮抗體的存在下培養(yǎng)該干細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明公開了在包括MEK抑制劑、GSK3抑制劑，和可選FGF受體拮抗體的無血清培養(yǎng)基中維持多能細(xì)胞處于自我更新狀態(tài)；還在包括MEK抑制劑和FGF受體拮抗體的無血清培養(yǎng)基中維持多能細(xì)胞處于自我更新狀態(tài)。文檔編號(hào)C12N5/02GK101410510SQ200780011232公開日2009年4月15日申請(qǐng)日期2007年3月30日優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日發(fā)明者A·G·史密斯,應(yīng)其龍申請(qǐng)人:愛丁堡大學(xué)管理處