專利名稱：：表達系統(tǒng)的制作方法表達系統(tǒng)本發(fā)明涉及適用于重組多肽的微生物表達的表達系統(tǒng)。從美國專利US6537779知道了基于T7的以完全回文操縱基因序列為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。基于T7的系統(tǒng)存在缺點，因為T7系統(tǒng)的操作需要噬菌體聚合酶，它通常是通過將表達所需噬菌體聚合酶的人DE3原噬菌體插入到大腸桿菌宿主林中產(chǎn)生溶原宿主抹而提供的。也可通過用特異性X轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體進行侵染而將噬菌體聚合酶傳遞到細胞中，該特異性X轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體攜帶了噬菌體聚合酶(例如T7RNA聚合酶)的基因。入DE3原噬菌體缺少了用于切除原噬菌體以形成裂解噬菌體顆粒所需的遺傳元件。然而，已經(jīng)證明XDE3溶原宿主抹釋放了噬菌體顆粒從而引起了發(fā)酵裝置中不合需要的侵染。實際上，某些發(fā)酵裝置操縱基因是不允許使用入DE3菌株的。不希望在誘導(dǎo)之前就表達異源蛋白質(zhì)，因為一些異源蛋白質(zhì)對宿主細胞生長和質(zhì)粒穩(wěn)定性具有有害影響，這就降低了總產(chǎn)量。為避免這一點，基于T7的表達系統(tǒng)通常在兩種水平上控制異源蛋白質(zhì)表達。首先，驅(qū)動從T7啟動子的表達需要誘導(dǎo)T7RNA聚合酶基因的表達以產(chǎn)生T7RNA聚合酶。第二，T7啟動子本身也需要被誘導(dǎo)。這就增加了操作基于T7的表達系統(tǒng)的復(fù)雜性。有著大量的具有不同控制和誘導(dǎo)模式的異源蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)，這使得對感興趣的蛋白質(zhì)進行表達系統(tǒng)/發(fā)酵過程的選擇和優(yōu)化很大程度上成為了完全根據(jù)經(jīng)驗的過程。這是費時間的以及不合需要的。因此，就需要這樣的系統(tǒng)，它們能夠提供改善的表達控制和改善的蛋白質(zhì)表達水平，它們不使用噬菌體聚合酶和溶原宿主抹。也需要這樣的系統(tǒng)，它們能夠提供原核細胞以及真核細胞諸如哺乳動物和酵母細胞中的可誘導(dǎo)異源表達。根據(jù)本發(fā)明，提供了基于完全回文操縱基因序列的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)，包括a)啟動子；以及b)完全回文操縱基因序列；特征在于啟動子不是T7。本發(fā)明的表達系統(tǒng)中可采用的啟動子通常是基于宿主RNA聚合酶的啟動子系統(tǒng)，優(yōu)選基于大腸桿菌RNA聚合酶的啟動子系統(tǒng)?？刹捎玫膯幼拥睦影═7A1、T7A2、T7A3、XpL、XpR、lac、lacUV5、trp、tac、trc、phoA禾口rrnB。在根據(jù)本發(fā)明的表達系統(tǒng)中可采用的操縱基因序列包括lac、gal、deo和gln?？刹捎靡环N或多種完全回文操縱基因序列。在許多優(yōu)選的實施方案中，采用了兩種完全回文操縱基因序列，最有利的是一種操縱基因序列位于啟動子的下游，并且一種操縱基因序列位于啟動子的上游。當采用兩種操縱基因系統(tǒng)時，操縱基因序列優(yōu)選被間隔開，從而最大程度控制啟動子。在許多實施方案中，間隔85到150個石威基對，優(yōu)選間隔90到126個堿基對，最優(yōu)選間隔91或92個石成基對。在某些實施方案中，操縱基因序列與轉(zhuǎn)錄起始點重疊。將考慮到的是，操縱基因系統(tǒng)通常會采用合適的阻抑物序列。阻抑物序列產(chǎn)生阻抑蛋白，例如當使用lac操縱基因時的lacl基因序列。也可使用其它lac阻抑物序列，例如laclQ序列可用來增加lac阻抑蛋白的水平。粒i提供。土、"，-、、、、可將表達系統(tǒng)整合到宿主細胞基因組中，但是優(yōu)選將其包含在染色體外元件諸如質(zhì)粒之中。備選地，可將表達系統(tǒng)摻入到噬菌體或病毒載體中，使用這些載體將表達系統(tǒng)傳遞到宿主細胞系統(tǒng)中?？赏ㄟ^現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法裝配質(zhì)?；虮磉_載體。典型地，質(zhì)粒也包括如下之一或更多選擇標記，例如賦予抗生素抗性的序列，cer穩(wěn)定性序列和表達盒。如果需要所期望的蛋白質(zhì)分泌，表達系統(tǒng)也可摻入信號序列。表達的誘導(dǎo)可通過加入誘導(dǎo)物諸如異丙基-(3-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG),IPTG類似物諸如異丁基-C-吡喃半乳糖苷(IBCG),乳糖或者蜜二糖?？梢允褂闷渌T導(dǎo)物，在其它地方更充分地描述了所述其它資導(dǎo)物(例如參見《操縱基因》(TheOperon),Miller和Renzmkoff編輯(1978))。誘導(dǎo)物可單獨使用或者組合使用。合適質(zhì)粒或表達載體的構(gòu)建對于普通技術(shù)的科學(xué)家來說將是顯而易見的?？刹捎帽景l(fā)明的表達系統(tǒng)在宿主細胞特別是微生物中表達蛋白。如本文使用的，"蛋白質(zhì)"一般是指具有超過大約10個氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。宿主細胞可以是原核的或真核的。原核細胞的例子包括細菌細胞，例如革蘭氏陰性細菌細胞，包括大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、銅綠假單胞菌以及革蘭氏陽性細菌，包括枯草芽孢桿菌。真核細胞的例子包括酵母，諸如巴斯德畢赤酵母、啤酒糖酵母、多形漢遜酵母、乳克魯維酵母、粟酒裂殖酵母?？刹捎玫牟溉閯游锼拗骷毎ㄈ祟惣毎担T如人胚腎和PERC.6細胞；鼠細胞系，諸如NS0細胞；以及特別是倉鼠細胞系，諸如幼倉鼠腎細胞和特別是中國倉鼠卯巢細胞。也可以采用其它真核宿主細胞，諸如絲狀真菌、才直物、昆蟲、兩棲動物細月包或卵巢物質(zhì)。優(yōu)選的宿主細胞是細菌，特別是腸細菌科，優(yōu)選大腸桿菌，特別是其B或K12抹。本發(fā)明的表達載體通常采用質(zhì)粒形式，包括啟動子和完全回文操縱基因序列的質(zhì)粒形成了本發(fā)明的另一方面，其中啟動子不是T7。質(zhì)?？梢允亲灾鲝?fù)制質(zhì)?；蛘哒闲唾|(zhì)粒。對于通過培養(yǎng)重組細胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)特別是重組蛋白質(zhì)來說，采用本發(fā)明的表達系統(tǒng)是有利的。對于蛋白質(zhì)的表達來說，將考慮到的是將啟動子和操縱基因序列可操作地連接到編碼待表達蛋白質(zhì)的DNA上。因此，本發(fā)明也提供了生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其包括使表達系統(tǒng)表達，該表達系統(tǒng)包括a)啟動子；b)完全回文操縱基因序列；以及c)蛋白質(zhì)的表達盒；其特征在于啟動子不是T7。如果需要的話，也可以存在一種或多種啟動子、操縱基因序列和表達盒，它們可以是相同的或不同的。通過現(xiàn)有技術(shù)中公知的用于所采用細胞的方法來使表達系統(tǒng)表達。優(yōu)選的表達方法包括在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細胞，特別是通過發(fā)酵，然后回收所表達的蛋白質(zhì)。術(shù)語"生長培養(yǎng)基"是指用于生長重組細胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基。在許多實施方案中，采用營養(yǎng)液。用于特定重組細胞的合適的生長培養(yǎng)基是現(xiàn)有技術(shù)中公知的。通過下面的實施例<旦并不限制地說明本發(fā)明。1.pAVE系列載體的產(chǎn)生載體pAVE011、pAVE012和pAVE013產(chǎn)生pAVE011的起始載體是pZT7弁2.0,根據(jù)US6537779的描述進行制備。pZT7弁2.0具有pAT153載體骨架、cer穩(wěn)定性序列、tetA/R、感興趣基因上游的單一天然lac操縱基因序列以及上游T4轉(zhuǎn)錄終止子。使用合成的寡核苷酸接頭通過Nco1、EcoRI和Xba1限制酶位點將T7A3啟動子和雙完全回文lac操縱基因克隆到該質(zhì)粒中。通過退火寡核苷酸1和2.1,制備接頭12.1:寡核普酸l(SEQIDNOl)GCACG寡核苦酸2.1(SEQIDN02)VATCCCA然后將接頭作為Nco1/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pZT7弁2.0中，轉(zhuǎn)化到克隆宿主株XL-1BlueMR(Stratagene)中。通過使用NcoI限制酶切消化初步篩選轉(zhuǎn)化體。通過測序確認序列。將所得質(zhì)粒命名為pAVE012。然后通過退火寡核苷酸3和4,將T7A3啟動子盒克隆到pAVE012中寡核苷酸3(SEQIDN03)CGATGTACCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸4(SEQIDNO4)CCGTGTTTGCTTCGTGTTGTCGGCCGTTTTGTTTG將退火的寡核苷酸作為Xba1/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pAVE012中，轉(zhuǎn)化到克隆宿主抹XL-1BlueMR(Stratagene)中。通過質(zhì)粒DNA的限制酶切消化進行初步篩選。然后通過測序確認序列。將所得質(zhì)粒命名為pAVEOll。將人TNFot基因作為NdeI/XhoI片段克隆到該質(zhì)粒中以產(chǎn)生pAVE013。PAVE013的質(zhì)粒圖譜示于圖18中。這顯示了操縱基因和啟動子以及構(gòu)建中使用的限制酶位點的排列。兩個操縱基因都是完全回文lac操縱基因。RBS是核糖體識別位點。載體包括pAT153載體骨架、cer穩(wěn)定性序列、誘導(dǎo)型四環(huán)素抗性基因(tetA/R)以及上游T4轉(zhuǎn)錄終止子。載體pAVE038和pAVE041產(chǎn)生pAVE038的起始載體是pZT7存2.0,根據(jù)US6537779的描述進行制備。使用合成的寡核苷酸接頭通過EcoRI和Xbal限制酶位點將tac啟動子和單一天然lac操縱基因克隆到該質(zhì)粒中。通過退火寡核普酸11和12，制備接頭1112:寡核苷酸11(SEQIDNO5)ATACTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCA寡核苷酸12(SEQIDNO6)CGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAA然后將接頭作為Xba1/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pZT7弁2.0中，轉(zhuǎn)化到克隆宿主抹XL-lBlueMR(Stmtagene)中。通過使用NcoI限制酶切消化初步篩選轉(zhuǎn)化體。通過測序確認序列。將所得質(zhì)粒命名為pAVE038。將人TNFa基因作為NdeI/XhoI片段克隆到該質(zhì)粒中以產(chǎn)生質(zhì)粒pAVE041。載體pAVE037和pAVE040產(chǎn)生pAVE037的起始載體是pZT7弁2.0,根據(jù)US6537779的描述進行制備。使用合成的寡核苷酸接頭通過EcoRI和Xbal限制酶位點將tac啟動子和單一完全回文1ad喿縱基因克隆到該質(zhì)粒中。通過退火寡核苷酸13和14,制備接頭1314:寡核苷酸13(SEQIDNO7)ATACTGTGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸14(SEQIDNO8)GAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAA然后將接頭作為Xba1/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pZT7弁2.0中，轉(zhuǎn)化到克隆宿主抹XL-lBlueMR(Stmtagene)中。通過使用NcoI限制酶切消化初步篩選轉(zhuǎn)化體。通過測序確認序列。將所得質(zhì)粒命名為pAVE037。將人TNFa基因作為NdeI/XhoI片段克隆到該質(zhì)粒中以產(chǎn)生pAVE0做載體pAVE028和pAVE030產(chǎn)生pAVE028的起始載體是pAVE012。通過退火寡核香酸5和6，將T7A3啟動子盒克隆到pAVEO12中寡核苷酸5(SEQIDN09)ACGATGTACCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸6(SEQIDNO10)CCGTGTTTGCTTCGTGTTGTCGGCCGTTTTGTTTCG將退火的寡核苷酸作為Xba1/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pAVE012中，轉(zhuǎn)化到克隆宿主林XL-1BlueMR(Stratagene)中。通過限制酶切消化質(zhì)粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確i/v序列。將所得質(zhì)粒命名為pAVE028。將人TNFa基因作為NdeI/XhoI片段克隆到該質(zhì)粒中以產(chǎn)生pAVE030。載體pAVE007和pAVE031產(chǎn)生pAVE007的起始載體是pZT7弁2.0,根據(jù)US6537779的描述進行制備。使用合成的寡核普酸接頭通過EcoRI和Xba1限制酶位點將T7A3啟動子和單一完全回文lac操縱基因克隆到該質(zhì)粒中。含有T7A3啟動子的接頭由寡核苷酸3和4組成。寡核普酸3(SEQIDN03)CGATGTACCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸4(SEQIDNO4)CCGTGTTTGCTTCGTGTTGTCGGCCGTTTTGTTTG退火寡核苷酸3和4，然后將形成的接頭作為Xba1/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pZT7弁2.0中，轉(zhuǎn)化到克隆宿主抹XL-1BlueMR(Stratagene)中。通過限制酶切消化質(zhì)粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確認序列。將所得質(zhì)粒命名為pAVE007。將人TNFa基因作為NdeI/XhoI片段克隆到該質(zhì)粒中以產(chǎn)生pAVE031。載體pAVE029和pAVE027產(chǎn)生pAVE029的起始載體是pZT7#2.0,根據(jù)US6537779的充分描述進行制備。使用合成的寡核苷酸接頭通過EcoRI和XbaI限制酶位點將入pL啟動子和單一完全回文lac操縱基因克隆到該質(zhì)粒中。通過退火寡核苷酸7和8,制備接頭78:寡核苷酸7(SEQIDNO11)TACTGAGCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苦酸8(SEQIDNO12)CCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGAT然后將接頭作為Xba1/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pZT7弁2.0中，轉(zhuǎn)化到克隆宿主抹XL-1BlueMR(Stratagene)中。通過使用NcoI限制酶切消化初步篩選轉(zhuǎn)化體。通過測序確認序列。將所得質(zhì)粒命名為pAVE029。將人TNFa基因作為NdeI/XhoI片段克隆到該質(zhì)粒中以產(chǎn)生pAVE027。載體pAVE043和pAVE044產(chǎn)生pAVE043的起始載體是pAVE012。通過退火寡核苦酸17和18,將tac啟動子盒克隆到pAVE012中寡核苷酸17(SEQIDNO37)ATAATGTGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸18(SEQIDNO38)將退火的寡核苷酸作為Xba1/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pAVEO12中，轉(zhuǎn)化到克隆宿主林XL-lBlueMR(Stratagene)中。通過限制酶切消化質(zhì)粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確^人序列。將所得質(zhì)粒命名為pAVE043。將人TNFa基因作為NdeI/XhoI片段克隆到該質(zhì)粒中以產(chǎn)生pAVE044。載體pAVE034和pAVE035產(chǎn)生pAVE034的起始載體是pAVE012。通過退火寡核苷酸9和10,將入pL啟動子盒克隆到pAVE012中寡核苷酸9(SEQIDNO39)ATACTGAGCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸10(SEQIDNO40)CCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGATG將退火的寡核苷酸作為Xba1/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pAVEO12中，轉(zhuǎn)化到克隆宿主株XL-lBlueMR(Stmtagene)中。通過限制酶切消化質(zhì)粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確認序列。將所得質(zhì)粒命名為pAVE034。將人TNFa基因作為NdeI/XhoI片l殳克隆到該質(zhì)粒中以產(chǎn)生pAVE035。載體VE020和AVE021產(chǎn)生pAVE020的起始載體是pAVE012。通過退火寡核苷酸7和8，將入pL啟動子盒克隆到pAVE012中寡核香酸7(SEQIDNO11)TACTGAGCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸8(SEQIDNO12)CCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGAT將退火的寡核苷酸作為Xba1/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pAVE012中，轉(zhuǎn)化到克隆宿主4朱XL-1BlueMR(Stmtagene)中。通過限制酶切消化質(zhì)粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確^人序列。將所得質(zhì)粒命名為pAVE020。將人TNFa基因作為NdeI/XhoI片段克隆到該質(zhì)粒中以產(chǎn)生pAVE021。載體pAVEO16和pAVE017產(chǎn)生pAVE016的起始載體是pAVE012。通過退火寡核苷酸15和16,將tac啟動子盒克隆到pAVE012中寡核苷酸15(SEQIDNO13)TAATGTGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核香酸16(SEQIDNO14)GAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGG將退火的寡核苷酸作為Xba1/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pAVE012中，轉(zhuǎn)4t到克隆宿主抹XL-lBlueMR(Stratagene)中。通過限制酶切消4t質(zhì)粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確認序列。將所得質(zhì)粒命名為pAVE016。將人TNFot基因作為NdeI/XhoI片4炎克隆到該質(zhì)粒中以產(chǎn)生pAVE017。載體pAVE049產(chǎn)生pAVE049的起始載體是pAVE017。不改變tac啟動子盒。為增加兩個操縱基因之間91到124個堿基對的間隔，克隆進了EcoRI接頭。這是由寡核苷酸19和20組成的。寡核苷酸19(SEQIDNO15)5'AATTCACCGGTGTACAGTCATGTACAACCGGTG寡核苷酸20(SEQIDNO16)5'AATTCACCGGTTGTACATGACTGTACACCGGTG通過限制酶切消化質(zhì)粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確認序列。將所得質(zhì)粒命名為pAVE049。載體pAVE046產(chǎn)生分泌載體pAVE046的起始載體是pAVE027。將AD1.3Fab表達盒(圖1，SEQIDNO17)作為NdeI-BamHI片l爻進4亍克隆。通過限制酶切消化質(zhì)粒DNA進4亍初步篩選。然后通過測序確i人序列。將所得質(zhì)粒命名為pAVE046。表1:pAVE載體匯總質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.重組菌纟朱的產(chǎn)生通過用下面表2中描述的質(zhì)粒電穿孔，轉(zhuǎn)化大腸桿菌W3110(獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心菌抹ATCC27325)和BL21(獲自EMD生物科學(xué)公司(EMDBiosciencesInc),圣地亞哥，美國)。純化所得重組菌抹，保持在-80。C的甘油原液中。表2:所構(gòu)建的重組菌林<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>比舉交例1用于產(chǎn)生帶有T7A3啟動子而不帶任何操縱基因的質(zhì)粒的起始載體是pZT7#2.0。使用合成的寡核苷酸接頭通過EcoRI和XbaI限制酶位點將T7A3啟動子克隆到該質(zhì)粒中。通過退火寡核苷酸21和22,制備接頭2122:寡核苦酸21(SEQIDN018)ACGATGTACCACATGAAACGACAGTGAGTCA寡核苷酸22(SEQIDNO19)TACTTCATGTTGTCAACCGTTTTGTTTCG然后將接頭作為Xba1/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pZT7#2.0中，轉(zhuǎn)化到克隆宿主4朱XL-lBlueMR(Stratagene)中。通過限制酶切消化質(zhì)粒DNA進行初步篩選。然后通過測序確認序列。通過限制酶切消化和測序篩選到了82個克隆。用正確的T7A3啟動子序列沒有筌定到克隆(所有序列中都含有突變)。這表明含有這種強力組成型啟動子的質(zhì)粒的構(gòu)建是存在問題的。比舉吏例2用于產(chǎn)生帶有受單一天然lac操縱基因序列控制的T7A3啟動子的質(zhì)粒的起始載體是pZT7弁2.0。使用合成的寡核苷酸接頭通過EcoRI和XbaI限制酶位點將T7A3啟動子和天然lac操縱基因(LacO)序列克隆ACGATGTACCGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCA寡核普酸24(SEQIDNO21)ACCGTGTTTACTTCATGTTGTCAACCGTTTTGTTTCG然后將接頭作為Xba1/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pZT7#2.0中，轉(zhuǎn)化到克隆宿主4朱XL-lBlueMR(Stratagene)中。通過限制酶切消化質(zhì)粒DNA進4亍初步篩選。然后通過測序確i人序列。通過限制酶切消4匕和測序篩選到了94個克隆。用正確的序列再一次沒有鑒定到克隆。然而，發(fā)現(xiàn)了一個克隆具有接近完整的序列。這個克隆在序列的大約位置-37處含有額外的"G"。很難指定突變的確切位置，因為期望的序列在這個區(qū)域含有-GG-。將人TNFa基因作為NdeI/XhoI片段克隆到帶有接近完整序列的質(zhì)粒中。從克隆宿主抹抹XL-BlueMR(Stratagene)中篩選到了20個克隆。有一個是沒有突變(除了上述額外的"G")的陽性克隆。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到生產(chǎn)宿主(ATCC27325),再次測序質(zhì)粒。這表明質(zhì)粒在T7A3啟動子和人TNFa序列兩者中都含有嚴重突變，表明T7A3啟動子的使用即使在天然lac操縱基因序列的控制之下也導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定。從-80。C冷凍機中取出CLD032小瓶，讓它解凍。將10|iil的解凍甘實施例3油原液接種到補充四環(huán)素(10pg/ml)和葡萄糖(lg/L)的5mlLB培養(yǎng)液(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid),10g/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)中。在37。C的定軌搖床中溫育16小時。然后使用500|^1的該培養(yǎng)物接種含有50ml的LB培養(yǎng)液(組成如上所述)的兩個250ml錐形瓶。將錐形瓶在定軌搖床中37°C、200rpm進行溫育。監(jiān)測生長直到OD6。o=0.5-0.7。這時用0.05mM終濃度的IPTG(異丙基-P-D-l-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)一個錐形瓶，而第二個錐形瓶不誘導(dǎo)，留著監(jiān)測基礎(chǔ)表達。在上述條件下繼續(xù)溫育，在此期間取樣進行生長的測定、細菌細胞中hTNFa累積的測定。使用光密度掃描取樣細菌的全細胞溶胞產(chǎn)物的膠體藍染色的SDS-PAGE膠來確定hTNFot的累積水平。結(jié)果匯總在下面的表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(*):TCP二細胞總蛋白質(zhì)一并考慮比較例1和2以及實施例3提供的數(shù)據(jù)，證明使用單一完全回文操縱基因序列令人驚訝地實現(xiàn)了強力T7A3啟動子的有效控制。這是完全預(yù)料不到的，因為已知的是單一天然操縱基因的使用(比較例2)不會提供足夠的基礎(chǔ)控制來允許建立穩(wěn)定的重組生產(chǎn)菌抹。用單一完全回文控制系統(tǒng)在使用相當?shù)蜐舛鹊恼T導(dǎo)物進行誘導(dǎo)時就獲得了高的產(chǎn)物累積水平。盡管觀察到了基礎(chǔ)表達(沒有誘導(dǎo)物時)，但是顯然僅僅是在顯著延長溫育(24小時)之后的。實施例4從-80。C冷凍機中取出CLD018小瓶，讓它們解凍。將10|Lil的解凍甘油原液接種到補充四環(huán)素(lOpg/ml)和葡萄糖(lg/L)的5mlLB培養(yǎng)液(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid),10g/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)中。在37。C的定軌搖床中溫育種子培養(yǎng)物16小時。然后<吏用500W的種子培養(yǎng)物接種含有50ml的LB培養(yǎng)液(組成如上所述)的250ml錐形瓶。將錐形瓶在定軌搖床中37°C、200rpm進行溫育。監(jiān)測生長直到OD60o=0.5-0.7。這時用0.05mM和lmM終濃度的IPTG(異丙基-P-D-l-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)錐形瓶。也留下錐形瓶不誘導(dǎo)，在上述條件下繼續(xù)錐形瓶的溫育，在此期間取樣進行生長的測定、細菌細胞中hTNFa累積的測定。使用光密度掃描取樣細菌的全細胞溶胞產(chǎn)物的膠體藍染色的SDS-PAGE膠來確定hTNFa的累積水平。結(jié)果匯總在下面的表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>該數(shù)據(jù)證明，強力T7A3啟動子的進一步控制能夠使用間隔91bp的兩個完全回文操縱基因序列來實現(xiàn)。與使用單一完全回文操縱基因控制阻抑所獲得的相比，基礎(chǔ)表達(沒有誘導(dǎo)物時)已經(jīng)顯著降低了。與US6537779的T7系統(tǒng)相比，使用雙重完全回文序列所獲得的基礎(chǔ)表達的控制是預(yù)料不到的，所述T7系統(tǒng)的基礎(chǔ)表達控制需要兩種不同的控制元件。在本實施例中，基礎(chǔ)表達的控制是在大腸桿菌RNA聚合酶的高背景中實現(xiàn)的。實施例5從-80。C冷凍機中取出CLD026小瓶，讓它們解凍。將10|ul的解凍甘油原液接種到補充四環(huán)素(10)ug/ml)和葡萄糖(lg/L)的5mlLB培養(yǎng)液(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid),10g/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)中。在37。C的定軌搖床中溫育16小時。然后使用500|Lil的該培養(yǎng)物接種含有50ml的LB培養(yǎng)液(組成如上所述)的250ml錐形瓶。將錐形瓶在定4九搖床中37°C、200rpm進行溫育。監(jiān)測生長直到OD600=0.5-0.7。這時用0.05mM和0.005mM終濃度的IPTG(異丙基-P-D-l-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)錐形瓶。也留下錐形瓶不誘導(dǎo)，在上述條件下繼續(xù)溫育，在此期間取樣進行生長的測定、細菌細胞中hTNFot累積的測定。使用光密度掃描取樣細菌的全細胞溶胞產(chǎn)物的膠體藍染色的SDS-PAGE膠來確定hTNFa的累積水平。結(jié)果匯總在下面的表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>結(jié)果證明，兩個完全回文操縱基因序列之間1bp間隔的變化(從91到92bp)沒有不利影響所獲得的基礎(chǔ)表達和最終累積水平的表現(xiàn)。出乎意料的是，降低IPTG濃度10倍(從0.05mM到0.005mM)沒有顯著降低誘導(dǎo)的生產(chǎn)率。實施例6從-80。C冷凍機中取出CLD042和CLD043小瓶，讓它們解凍。將10|ul的每瓶解凍甘油原液分別接種到補充四環(huán)素(lOpg/ml)和葡萄糖(lg/L)的每份2x5mlLB培養(yǎng)液(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid),10g/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)中。在37。C的定軌搖床中溫育16小時。然后使用500|ul的這些培養(yǎng)物分別接種含有50ml的LB培養(yǎng)液(組成如上所述)的250ml錐形瓶。將錐形瓶在定軌搖床中37°C、200rpm進行溫育。監(jiān)測生長直到OD6CK)=0.5-0.7。這時用0.5mM終濃度的IPTG(異丙基-P-D-l-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)錐形瓶。也留下含有每種菌抹培養(yǎng)物的錐形瓶不誘導(dǎo)，在上述條件下繼續(xù)溫育，在此期間取樣進行生長的測定、細菌細胞中hTNFa累積的測定。使用光密度掃描取樣細菌的全細胞溶胞產(chǎn)物的膠體藍染色的SDS-PAGE膠來確定hTNFa的累積水平。在取樣細菌的SDS-PAGE之后，通過蛋白質(zhì)印跡(使用抗hTNFa抗體)比較溫育20小時后的CLD042和CLD043的未誘導(dǎo)培養(yǎng)物中hTNFa的基礎(chǔ)累積水平。結(jié)果匯總在下面的表6中。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>(*)=蛋白質(zhì)印跡上的hTNFa帶的掃描。將CLD042的強度掃描數(shù)據(jù)對CLD043的強度掃描數(shù)據(jù)進行標準化。結(jié)果證明，單一的完全回文操縱基因序列能夠用來降低基礎(chǔ)表達(沒有誘導(dǎo)物時)四倍，而沒有不利影響tac啟動子系統(tǒng)的誘導(dǎo)的生產(chǎn)率。實施例7從-80。C冷凍機中取出CLD019小瓶，讓它解凍。將10^1的解凍甘油原液接種到補充四環(huán)素(10|ug/ml)和葡萄糖(lg/L)的5mlLB培養(yǎng)液(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid),10g/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)中。在37。C的定軌搖床中溫育16小時。然后使用500]Lil的該培養(yǎng)物接種含有50ml的LB培養(yǎng)液(組成如上所述)的250ml錐形瓶。將錐形瓶在定4九搖床中37°C、200rpm進行溫育。監(jiān)測生長直到OD600=0.5-0.7。這時用0.5mM、O.lmM、0.05mM和0.005mM終濃度的IPTG(異丙基-P-D-l-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)錐形瓶。也留下錐形瓶不誘導(dǎo)，在上述條件下繼續(xù)溫育，在此期間取樣進行生長的測定、細菌細胞中hTNFoc累積的測定。使用光密度掃描取樣細菌的全細胞溶胞產(chǎn)物的膠體藍染色的SDS-PAGE膠來確定hTNFoc的累積水平。結(jié)果示于圖2中。圖2顯示的數(shù)據(jù)證明，tac啟動子與雙重完全回文操縱基因序列的組合產(chǎn)生了這樣一種系統(tǒng)，其中的表達速率可被用來誘導(dǎo)的IPTG的濃度直接調(diào)節(jié)?？刹捎眠@樣的系統(tǒng)來調(diào)節(jié)異源蛋白質(zhì)的表達，例如最大化可溶形式蛋白質(zhì)的累積或者避免異源蛋白質(zhì)分泌所可能具有的對重組細胞生長和生產(chǎn)率的有害影響這一問題。實施例8從-80。C冷凍機中取出小瓶CLD030,讓它解凍。將10|Ld的解凍甘油原液接種到補充四環(huán)素(10|ug/ml)和葡萄糖(lg/L)的5mlLB培養(yǎng)液(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid),10g/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)中。在37。C的定軌搖床中溫育16小時。然后使用500)^1的該培養(yǎng)物接種含有50ml的LB培養(yǎng)液(組成如上所述)的250ml錐形瓶。將錐形瓶在定軌搖床中37°C、200rpm進行溫育。監(jiān)測生長直到OD6Qo=0.5-0.7。這時用0.005mM終濃度的IPTG(異丙基-P-D-l-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)錐形瓶，同時留下另一個錐形瓶不誘導(dǎo)，在上述條件下繼續(xù)溫育，在此期間取樣進行生長的測定、細菌細胞中hTNFa累積的測定。使用光密度掃描取樣細菌的全細胞溶胞產(chǎn)物的膠體藍染色的SDS-PAGE膠來確定hTNFa的累積水平。結(jié)果匯總在下面的表7中。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表7所示數(shù)據(jù)清楚地顯示，使用單一的完全回文操縱基因序列可令人驚訝地獲得非常強力的入pL啟動子。使用單一的完全回文控制系統(tǒng)可獲得高的產(chǎn)物累積水平。實施例9從-8(TC冷凍機中取出CLD021和CLD038小瓶，讓它們解凍。將10^1的每并瓦解凍甘油原液分別4妻種到補充四環(huán)素(10|Lig/ml)和葡萄糖(lg/L)的5mlLB培養(yǎng)液(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid),10g/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)中。在37。C的定軌搖床中溫育16小時。然后使用500|il的該培養(yǎng)物接種含有50ml的LB培養(yǎng)液(組成如上所述)的250ml錐形瓶。將錐形并瓦在定軌搖床中37°C、200rpm進4亍溫育。監(jiān)測生長直到OD6(K)=0.5-0.7。這時用lmM終濃度的IPTG(異丙基-P-D—l-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)錐形瓶，同時留下第二個錐形瓶不誘導(dǎo)，在上述條件下繼續(xù)溫育，在此期間取樣進行生長的測定、細菌細胞中hTNFa累積的測定。在取樣細菌的全細胞溶胞產(chǎn)物的SDS-PAGE之后，使用膠體藍染色的SDS-PAGE膠和蛋白質(zhì)印跡分析(使用抗hTNFa抗體)確定hTNFa的累積。數(shù)據(jù)匯總在表8中。菌抹CLD038的蛋白質(zhì)印跡分析示于圖3中。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>這些結(jié)果證明，間隔91bp或92bp的帶有XpL啟動子的雙重完全回文操縱基因序列的組合產(chǎn)生了非常嚴重的阻抑。蛋白質(zhì)印跡表明，未檢測到靶蛋白的基礎(chǔ)表達。在誘導(dǎo)時獲得了低水平的表達水平。這些結(jié)果是完全預(yù)料不到的，因為已知的是XpL啟動子是極其強力的啟動子。這樣的系統(tǒng)可用于例如引導(dǎo)對宿主細胞有高毒性的蛋白質(zhì)的表達。當受控表達是有利的時候，它也可用于膜蛋白的表達和插入。實施例10從-80。C冷凍機中取出CLD028和CLD035小瓶，讓它們解凍。將10^1的每瓶解凍甘油原液分別接種到補充四環(huán)素(10|ug/ml)和葡萄糖(lg/L)的每份2x5mlLB培養(yǎng)液(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid)，10g/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)中。在37。C的定軌搖床中溫育16小時。然后使用500^1的這些培養(yǎng)物分別接種含有50ml的LB培養(yǎng)液(組成如上所述)的250ml錐形瓶。將錐形瓶在定4九搖床中37。C、200rpm進行溫育。監(jiān)測生長直到OD6oQ=0.5-0.7。這時用lmM終濃度的IPTG(異丙基-P-D-l-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)錐形瓶，在上述條件下繼續(xù)溫育，在此期間取樣進行生長的測定、細菌細胞中hTNFa累積的測定。使用光密度掃描取樣細菌的全細胞溶胞產(chǎn)物的膠體藍染色的SDS-PAGE膠來確定hTNFa的累積水平。結(jié)果匯總在下面的表9中。表9CLD035:T7A3啟動子，間隔91bp的雙重完全回文才喿縱基因<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>這些數(shù)據(jù)結(jié)合前面實施例4和5所示數(shù)據(jù)一起來看，表明能夠使用大腸桿菌K-12和B菌株兩者。實施例11通過將下面描述的每種菌抹的20(^1甘油原液加入到含有補充了15lug/ml四環(huán)素的200mLLB培養(yǎng)液(LB，5g/L酵母提取物(Oxoid),10g/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)的2.0L帶擋板的搖瓶中而產(chǎn)生發(fā)酵接種物。在帶有250rpm攪拌的搖床-培養(yǎng)箱中于37。C生長接種物12小時。使用200ml搖瓶接種物來接種含有IOL分批生長培養(yǎng)基的15L工作體積的發(fā)酵罐。在下面描述的工作條件下進行發(fā)酵。將溫度控制在37。C,通過35。/。(w/v)氳氧化銨的自動添加將pH控制在6.8。溶解氧張力(dOT)設(shè)定點是30%空氣飽和度，通過發(fā)酵罐攪拌器速度(從最小的250rpm直到最大的1500rpm)的自動調(diào)節(jié)來控制，氧氣自動補充到入口氣流中。到發(fā)酵罐容器的氣流始終是10L/min。發(fā)酵罐中的壓力保持在50和200毫巴之間。以分批^^莫式進行發(fā)酵，直到碳源(即甘油)耗盡，它發(fā)生在接種后大約10小時，特征在于dOT的急劇升高。在碳源耗盡時通過以每小時每升培養(yǎng)基llg甘油的進料速度加入甘油/氯化鎂進料來起始補料分批發(fā)酵。一旦發(fā)酵中的生物量水平達到OD6ocr50-60,就通過加入IPTG到0.5mM終濃度而進行誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)后繼續(xù)補料分批階段12小時。在收獲時取樣確定生物量水平(OD60。)和hTNFa累積(％TCPVhTNFa滴度(g/L)(膠體藍染色的SDS-PAGE膠)。分批生長培養(yǎng)基的組成提供在表10中。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>數(shù)據(jù)清楚地證明了系統(tǒng)用于制備異源蛋白質(zhì)的有用性。使用簡單的普通優(yōu)化的發(fā)酵和誘導(dǎo)工藝獲得了高的產(chǎn)物滴度。如圖4中例舉的生產(chǎn)率分布圖所證實的，可利用質(zhì)粒pAVE027的控制特征來最大化異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，特別是需要控制表達以最大化分泌的蛋白質(zhì)。實施例12從-80。C冷凍機中取出CLD050小瓶，讓它解凍。將10|ul的解凍甘油原液接種到補充四環(huán)素(10|ug/ml)和葡萄糖(lg/L)的5mlLB培養(yǎng)液(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid),1Og/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)中。在37。C的定軌搖床中溫育16小時。然后使用500|Lil的該培養(yǎng)物接種含有50ml的LB培養(yǎng)液(組成如上所述)的250ml錐形并瓦。將錐形瓶在定軌搖床中37°C、200rpm進4亍溫育。監(jiān)測生長直到OD6(K)=0.5-0.7。這時用0.05mM終濃度的IPTG(異丙基-P-D-l-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)錐形瓶，同時留下另一錐形瓶不誘導(dǎo)，在上述條件下繼續(xù)溫育，在此期間取樣進行生長的測定、細菌細胞中hTNFa累積的測定。使用光密度掃描取樣細菌的全細胞溶胞產(chǎn)物的膠體藍染色的SDS-PAGE膠來確定hTNFa的累積水平。結(jié)果匯總在下面的表13中。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>令人驚訝的是，當間隔增加時，雙重完全回文操縱基因序列是起作制。、p、s、、口-、'實施例13從-80。C冷凍機中取出CLD048小瓶，讓它解凍。將10|ul的解凍甘油原液接種到補充四環(huán)素(10|ug/ml)和葡萄糖(lg/L)的5mlLB培養(yǎng)液(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid),1Og/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)中。在37。C的定軌搖床中溫育16小時。然后使用500^1的該培養(yǎng)物接種含有50ml的LB培養(yǎng)液(組成如上所述)的250ml錐形并瓦。將錐形瓶在定軌搖床中37°C、200rpm進4亍溫育。監(jiān)測生長直到OD6QQ=0.5-0.7。這時用O.lmM終濃度的IPTG(異丙基-卩-D-l-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)錐形瓶，在上述條件下再繼續(xù)溫育2小時。然后收獲細胞和剩余的沒有細胞的生長培養(yǎng)基。進一步進行所收獲細胞的滲透壓休克細胞分級分離以分離含有蛋白質(zhì)的細胞組分，它們是分布在可溶性大腸桿菌周質(zhì)組分中的。參考用純化的活性D1.3Fab所制備的標準曲線，通過確定ELISA分析中D1.3Fab與溶菌酶(抗原)的結(jié)合來評估可溶性周質(zhì)提取物和殘余生長培養(yǎng)基中生物活性D1.3Fab的累積。大腸桿菌周質(zhì)和殘余生長培養(yǎng)基(因為物質(zhì)從周質(zhì)泄漏到了生長培養(yǎng)基中)中生物活性D1.3Fab的累積示于表14中。將周質(zhì)和殘余生長培養(yǎng)基中的D1.3Fab的累積標準化為"每單位生物量每升培養(yǎng)物的pg活性物質(zhì)(OD,)"。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>該系統(tǒng)所提供的控制使得能夠高水平分泌異源蛋白質(zhì)，特別是需要復(fù)雜的二硫鍵形成的那些蛋白質(zhì)的，有用性被大腸桿菌周質(zhì)中高水平生物活性D1.3Fab的分泌和累積清楚地例證。此外，如何才能使用補料分批發(fā)酵(例如前面實施例ll或下面的實施例14中所描述的)來高產(chǎn)率地制備這樣的蛋白質(zhì)，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是明確的。實施例14使用CLD048重復(fù)實施例11所描述的發(fā)酵過程。一旦發(fā)酵物中的生物量水平達到OD6Q(T大約50,就通過加入IPTG到0.15mM終濃度進行誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)后繼續(xù)補料分批階段35-45小時。然后收獲細胞和剩余的不含細胞的生長培養(yǎng)基。進一步進行所收獲細胞的滲透壓休克細胞分級分離以分離含者蛋白質(zhì)的細胞組分，它們是分布在可溶性大腸桿菌周質(zhì)組分中的。參考用純化的活性D1.3Fab所制備的標準曲線，通過確定ELISA分析中D1.3Fab與溶菌酶(抗原)的結(jié)合來評估可溶性周質(zhì)提取物和殘余生長培養(yǎng)基中生物活性D1.3Fab的累積。將周質(zhì)和殘余生長培養(yǎng)基中的D1.3Fab的累積標準化為"每升培養(yǎng)物的mg活性物質(zhì)"。大腸桿菌周質(zhì)和殘余生長培養(yǎng)基(因為物質(zhì)從周質(zhì)泄漏到了生長培養(yǎng)基中)中生物活性D1.3Fab的累積示于表15中。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>使用表達系統(tǒng)證明生物活性D1.3Fab的高水平分泌。實施例15設(shè)計了合成的雙特異性單鏈四價雙抗體(diabody)(bsctDb),其中將來自D1.3(抗溶菌酶)和A5B7(抗-CEA(癌胚抗原))的輕《連可變區(qū)和重鏈可變區(qū)連接在單一的多肽鏈上。該分子的DNA序列示于圖5中(SEQIDN022)。將它作為NdeI/NotI片段克隆到已經(jīng)用NdeI和Notl消化過的pAVE046中。通過限制酶切消化篩選重組質(zhì)粒，通過測序確認。將所得質(zhì)粒命名為pAVE078。將pAVE078轉(zhuǎn)化到大腸桿菌W3110中以制備CLD073,將它純化并保藏在-80。C的甘油原液中。從-80。C冷凍機中取出CLD073小瓶，讓它解凍。將10|Lil的解凍甘油原液接種到補充四環(huán)素(10貼/ml)和葡萄糖(lg/L)的5mlLB培養(yǎng)液(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid),10g/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)中。在37。C的定4九搖床中溫育16小時。然后使用500|iil的該培養(yǎng)物接種含有50ml的LB培養(yǎng)液(組成如上所述)的兩個250ml錐形瓶。將錐形瓶在定勒d審床中37°C、200rpm進4亍溫育。監(jiān)測生長直到OD600=0.5-0.7。這時用0.5mM或O.lmM終濃度的IPTG(異丙基-p-D-l-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)錐形瓶，在上述條件下再繼續(xù)溫育20小時。然后收獲細胞和剩余的沒有細胞的生長培養(yǎng)基。進一步進行所收獲細胞的滲透壓休克細胞分級分離以分離含有蛋白質(zhì)的細胞組分，它們是分布在可溶性大腸桿菌周質(zhì)組分中的。通過確定竟爭性ELISA分析中抗-CEA單克隆抗體與CEA(抗原)的結(jié)合抑制以及通過竟爭性ELISA分析中抗溶菌酶Fab抗體片段與溶菌酶(抗原)的結(jié)合來評估周質(zhì)提取物和殘余生長培養(yǎng)基中生物活性Dl3-A5B7bsctDb的表達、分泌、折疊和累積。獲得的數(shù)據(jù)表明，在誘導(dǎo)結(jié)束時大多數(shù)的Dl3-A5B7bsctDb分布在殘余生長培養(yǎng)基中(從周質(zhì)泄漏)。該數(shù)據(jù)(竟爭性ELISA中bsctDb的結(jié)合)示于表16中。獲得的數(shù)據(jù)證明，來自0.5mMIPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的殘余生長培養(yǎng)基樣品就完全抑制了竟爭性ELISA分析中抗-CEA和抗溶菌酶抗體兩者的結(jié)合。來自0lmMIPTGi秀導(dǎo)的培養(yǎng)物的殘余生長培養(yǎng)基樣品顯示了降低的抑制水平，這表明該樣品中生物活性D1.3-A5B7bsctDb的累積水平更低。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>使用新表達系統(tǒng)就可以生產(chǎn)使用大腸桿菌^f艮難生產(chǎn)的復(fù)雜的多鏈異源蛋白質(zhì)。通過證明使用新表達系統(tǒng)在大腸桿菌中能夠生產(chǎn)生物活性形式的雙特異性單鏈四價雙抗體，已經(jīng)例證了這一點。這進一步例證了表達系統(tǒng)的有用性。實施例16將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-3C蛋白酶融合物(GST-3C)作為Ndel/Xho1片l爻克隆到用NdeI和XhoI消化過的pAVEOl1中。插入片l殳的序列示于圖6中(SEQIDN023)。通過限制酶切消^i篩選重組質(zhì)粒，通過測序確認。將所得質(zhì)粒命名為pAVE052。將pAVE052轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中以制備CLD054,將它純化并保存在-80。C的甘油原液中。將人干擾素a2(IFNoc2)基因作為NdeI/XhoI片段克隆到用NdeI和XhoI消化過的pAVEOl1中。插入片l殳的DNA序列示于圖7中(SEQIDNO24)。通過限制酶切消化碎選重組質(zhì)粒，通過測序確認。將所得質(zhì)粒命名為pAVE058。將pAVE058轉(zhuǎn)化到大腸桿菌W3110中以制備CLD059,將它純化并保存在-80。C的甘油原液中。將已經(jīng)進行適于大腸桿菌表達的密碼子優(yōu)化的人促紅細胞生成素(EPO)基因作為NdeI/XhoI片段克隆到用NdeI和XhoI消化過的pAVE011中。插入序列的DNA序列示于圖8中(SEQIDNO25)。通過限制酶切消化篩選重組質(zhì)粒，通過測序確^人。將所得質(zhì)粒命名為pAVE061。將pAVE061轉(zhuǎn)化到大腸桿菌W3110中以制備CLD060,將它純化并保存在-80°C的甘油原液中。使用實施例11中描述的培養(yǎng)基和工藝條件進行使用CLD054、CLD059和CLD060的補料分批發(fā)酵。如表19中所述將發(fā)酵保持在3(TC或37°C。以分批;^莫式進行發(fā)酵，直到碳源(即甘油)耗盡。這時通過加入含有甘油(714g/L)和硫酸鎂(30g/L)的進料來起始補料分批發(fā)酵。一旦發(fā)酵中的生物量水平達到OD6(K)=50-60,就通過加入IPTG進行誘導(dǎo)。使用的IPTG濃度如表17中所述。在誘導(dǎo)后繼續(xù)補樸分批階段12-15小時。在發(fā)酵期間取樣確定生物量水平(OD,)和蛋白質(zhì)產(chǎn)物((GST-3C、IFNa2和EPO)滴度(g/L),使用取樣細菌的全細胞溶胞產(chǎn)物的膠體藍染色的SDS-PAGE膠)。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表17中提供的數(shù)據(jù)進一步證明了系統(tǒng)用于廣范圍的異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)的有用性。使用簡單的普通發(fā)酵工藝加上僅僅控制用于誘導(dǎo)的IPTG濃度就獲得了高的產(chǎn)物滴度。降低工藝過程開發(fā)的時間界限對于治療上有用的異源蛋白質(zhì)來說是特別有利的。實施例17使用已經(jīng)用PCR改造過的NdeI和SpeI位點克隆了來自惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的L-2-卣代鏈烷酸脫卣素酶(hadL)基因。基因序列示于圖9中(SEQIDNO26)。用NdeI和SpeI消4b質(zhì)粒pAVEOll,對帶進行凝膠提取。用NdeI和Spel消化hadL,對hadL基因進行凝膠提取，連接到pAVEOll中產(chǎn)生pAVE075。使用PCR從質(zhì)粒pCN60(ATCC77101;NietoC,etal.(1990)基因(Gene)87:145-149)中拷貝了薩氏假單胞菌(Pseudomonassavastanoi)的復(fù)制起點。使用的引物是27),以及28)。將PCR產(chǎn)物首先克隆到TOPOTApCR2.1(Invitrogen)中，然后通過BglII消化克隆到pAVE075中。通過電穿孔將所得質(zhì)粒pAVE086轉(zhuǎn)化到惡臭假單胞菌NCIMB12018中以制備CLD075,將它純化并保存在-8(TC的甘油原液中。從-8(TC冷凍機中取出CLD075小瓶，讓它解凍。將10^1的解凍甘油原液接種到補充四環(huán)素(10|ug/ml)的5mlLB培養(yǎng)液(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid),10g/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)中。在37。C的定軌搖床中溫育16小時。然后使用500^1的該培養(yǎng)物接種含有50ml的LB培養(yǎng)液(組成如上所述)的兩個250ml錐形瓶。將錐形瓶在定軌搖床中30°C、200rpm進行溫育。監(jiān)測生長直到OD6o()=0.5-0.7。這時用0.5mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)一個錐形瓶，而留下第二個錐形瓶不誘導(dǎo)以檢測基礎(chǔ)表達。在上述條件下繼續(xù)溫育，在此期間取樣進行生長的測定和細菌細胞中HadL蛋白質(zhì)累積的測定。使用光密度掃描取樣細菌的全細胞溶胞產(chǎn)物的膠體藍染色的SDS-PAGE膠來確定HadL的累積水平。HadL蛋白質(zhì)的表達和累積示于圖10中。數(shù)據(jù)表明，T7A3:DPPS91表達系統(tǒng)在另一種原核宿主系統(tǒng)中起作用。令人驚訝的是，表達系統(tǒng)在惡臭假單胞菌中的生產(chǎn)效率與使用大腸桿菌作為宿主系統(tǒng)所觀察到的生產(chǎn)效率是相同的。甚至在沒有誘導(dǎo)物的23小時溫育之后也未檢測到基礎(chǔ)表達。在使用IPTG誘導(dǎo)后獲得了惡臭假單胞菌中的高水平蛋白質(zhì)表達和累積。實施例18使用實施例11中描述的普通大腸桿菌培養(yǎng)基和工藝條件進行使用惡臭假單胞菌CLD075的補料分批發(fā)酵。將發(fā)酵保持在30。C和pH7.0(用25%氪氧化銨和10%磷酸控制)。以分批模式進行發(fā)酵，直到碳源(即甘油)耗盡。這時通過加入含有甘油(714g/L)和硫酸鎂(30g/L)的進料來起始補料分批發(fā)酵。一旦發(fā)酵中的生物量水平達到OD6(K)=50,就通過加入1mMIPTG(終濃度)進行誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)后繼續(xù)補料分批階革殳12-15小時。在發(fā)酵期間取樣確定生物量水平(OD6[)。)和HadL蛋白質(zhì)累積((。/。TCP)取樣細菌的全細胞溶胞產(chǎn)物的膠體藍染色的SDS-PAGE膠)。誘導(dǎo)之后CLD075的生長和HadL蛋白質(zhì)的表達/累積示于圖11中。使用表達系統(tǒng)在惡臭假單胞菌中獲得了高水平的蛋白質(zhì)表達和累積(〉40%TCP),甚至通過僅僅使用設(shè)計來用于大腸桿菌的普通生長培養(yǎng)基也是如此。實施例19將合成的Gal阻抑物基因(大腸桿菌)作為Pstl片段克隆到載體pZen042(如EP0502637所述)的Pstl位點中。鑒別具有順時4十方向和反時針方向Gal阻抑物基因的克隆。選擇具有反時針方向的克隆以產(chǎn)生pAVE071。在質(zhì)粒pZT7#2.0中開始構(gòu)建Gal啟動子和操縱基因序列，所述質(zhì)粒根據(jù)US6537779所述進行制備。pZT7#2.0具有pAT153載體骨架、cer穩(wěn)定性序列、tetA/R、感興趣基因上游的單一天然lac操縱基因序列以及上游T4轉(zhuǎn)錄終止子。修飾天然Gal操縱基因序列以產(chǎn)生完全回文操縱基因序列。使用合成的寡核苦酸接頭通過EcoRI和XbaI限制酶位點將它克隆到上述質(zhì)粒中。通過退火寡核苷酸GdBl和GalB2來制備接頭GdB:GalBl(SEQIDN029)VAATT「ATA「「ATAA廠GGTTACCGGTGTAAGCGCTTACACTGTGalB2(SEQIDNO30)V「TA廠A「A廣T廣TAA廣rAATTCGTAGAATTAGGCTTATGGTATG然后將接頭連接到質(zhì)粒pZT7存2.0中，作為EcoRI/XbaI片段轉(zhuǎn)化到克隆宿主株XL-lBlueMR(Stratagene)中。使用Agel通過限制酶切消化初步篩選轉(zhuǎn)化體。通過測序確認序列。將hTNFa基因作為Ndel/XhoI片段克隆到該質(zhì)粒中。通過用Xmal和Mscl消化并連接到用Xmnl和Xmal消化過的pAVE071中來克隆hTNFa基因和部分的Gal完全回文操縱基因序列。通過限制酶切消化來篩選克隆中hTNFa基因的存在。使用合成接頭通過StuI和EcoRI位點將每個上游完全回文Gal操縱基因和Gal啟動子克隆到該質(zhì)粒中。通過退火寡核苷酸GalAl和GalA2來制備接頭GalA:GalAl(SEQIDN031):TTTCGCATCTTTGTTATGCTATGGTGGalA2(SEQIDNO32)GAATAAAGTTGTGTAAGCGCTTACACAATTG用Mfel消化來檢測接頭的存在，通過測序確認。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌抹W3110中以產(chǎn)生CLD085,將它純化并保存在-8(TC的甘油原液中。從-80。C冷凍機中取出CLD085小瓶，讓它解凍。將10|iil的解凍甘油原液接種到補充四環(huán)素(10jug/ml)的5mlLB培養(yǎng)液(LB，5g/L酵母提取物(Oxoid),10g/L胰化蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化鈉)中。在37。C的定軌搖床中溫育16小時。然后使用500^1的該培養(yǎng)物接種含有50ml的LB培養(yǎng)液(組成如上所述)的250ml錐形瓶。將錐形瓶在定專九搖床中37°C、200rpm進行溫育。監(jiān)測生長直到OD6oo=0.5-0.7。這時用10.0mM終濃度的半乳糖誘導(dǎo)錐形瓶。在上述條件下繼續(xù)溫育，在此期間取樣進行生長的測定和細菌細胞中hTNFa累積的測定。在取樣細菌的SDS-PAGE之后，使用蛋白質(zhì)印跡分析(使用抗-hTNFa抗體)來確定hTNFa的累積水平。數(shù)據(jù)提供在圖17中。這證明使用完全回文的gal操縱基因序列結(jié)合gal阻抑物基因會導(dǎo)致沒有誘導(dǎo)物時的gal啟動子的非常嚴重的阻抑，同時令人驚訝的是，在加入半乳糖時，仍然保持了誘導(dǎo)能力。實施例20如下構(gòu)建非整合型酵母載體1)將序列1(啤酒糖酵母CYC1啟動子的大腸桿菌lacI下游)作為XhoI片段克隆到XhoI消化的pCR2.1(I廳trogen)中。克隆序列1示于圖15中(SEQIDN035)。2)將序列2(由啤酒糖酵母MF-od基因啟動子組成，在MF-al啟動子區(qū)的任意一側(cè)帶有完全回文lac操縱基因序列，帶有蛋白質(zhì)-抑彈性蛋白酶蛋白的基因序列，c-myc標記(抑彈性蛋白酶蛋白-cmyc)位于下游)作為HindIII片段(通過PCR制備)克隆到HmdIII消化的步驟l所構(gòu)建的質(zhì)粒中以產(chǎn)生質(zhì)粒2?？寺⌒蛄?示于圖16中(SEQIDN036)。3)從YEpl3(ATCC37115)克隆含有LEU2(選擇標記基因)和酵母2p復(fù)制起點的SpeI片段到SpeI消化的質(zhì)粒2中以產(chǎn)生pAVE091。通過電穿孔將pAVE091質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到啤酒糖酵母XS95-6C(ATCC204688)中，在沒有亮氨酸的酵母缺陷培養(yǎng)基上篩選陽性菌落(KaiserC,MichaelisS和MitchelA,酵母遺傳學(xué)方法，冷泉港實-瞼手冊(MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryManual,1994))。使用同樣的培養(yǎng)基進行搖瓶生長研究以確定抑彈性蛋白酶蛋白-cmyc蛋白質(zhì)表達。將錐形瓶在定軌搖床中30°C、200rpm進4亍溫育。將克隆生長到約3的OD,用0.5mMIPTG(終濃度)誘導(dǎo)。在上述條件下再繼續(xù)溫育16小時，在此期間取樣測定生長和分泌到生長培養(yǎng)基中的抑彈性蛋白酶蛋白-cmyc蛋白質(zhì)。按照WiedowO,etal,JBiolChem.(1990)265(25):14791-5所述，使用彈性蛋白酶抑制酶試驗來確定分泌到殘余生長培養(yǎng)基中的抑彈性蛋白酶蛋白-cmyc。IPTG誘導(dǎo)后4小時，生長培養(yǎng)基中有30mg/L的活性抑彈性蛋白酶蛋白蛋白質(zhì)。這證明本發(fā)明的表達系統(tǒng)在酵母中是有效的。實施例21合成含有組成型人巨細胞病毒(hCMV)啟動子的DNA片段，啟動子側(cè)接雙重的完全回文lac操縱基因序列。將它克隆到表達IgGFc蛋白質(zhì)的表達載體中。將所得質(zhì)粒命名為pAVE081,它源自pCMV-Script(Stmtagene),含有hCMV啟動子，啟動子側(cè)接NdeI/NheI片段上的雙重的完全回文lac操縱基因序列，載體的多克隆位點中帶有IgGFcDNA序列。HCMV啟動子和雙重的完全回文lac操縱基因的DNA序列示于圖12中(SEQIDNO33)。IgGFc蛋白質(zhì)的DNA序列示于圖13中(SEQIDNO34)。如現(xiàn)有技術(shù)中所充分描述的那樣進行了表達IgGFc蛋白質(zhì)的pAVE081和表達lac阻抑物的pCMVlacI(Stmtagene)的瞬時共轉(zhuǎn)染，以確定在IPTG誘導(dǎo)型hCMV啟動子-雙重的完全回文lac才喿縱基因表達系統(tǒng)的控制之下能否表達IgGFc蛋白質(zhì)。將2ml的每毫升1.5x105個活細胞的中國倉鼠卯巢(CHO細胞系ECACC85050302,適于在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長)懸浮培養(yǎng)物加入到6孔組織培養(yǎng)平板的每個孔中。然后將6孔組織培養(yǎng)平板在5%C〇2的37。C濕潤培養(yǎng)箱中溫育過夜(16小時)，然后制備轉(zhuǎn)染混合物，每孔含有2|ug的pAVE081DNA與等量pCMVlacI(Stmtagene)DNA、6|ul的轉(zhuǎn)染試劑和94pl的生長培養(yǎng)基。將100|Lil的轉(zhuǎn)染混合物加入到含有CHO細胞的每個孔中。然后將6孔組織培養(yǎng)平板在5%C02的37°C濕潤培養(yǎng)箱中溫育。為確定表達/分泌進入生長培養(yǎng)基中的IgGFc的水平，用5mMIPTG(終濃度)誘導(dǎo)一組孔(第2天)，留下一組孔不誘導(dǎo)。在第三天，對用IPTG誘導(dǎo)的一組孔和留下未誘導(dǎo)的那些孔進行取樣(IPTG誘導(dǎo)后和未誘導(dǎo)的)。如現(xiàn)有技術(shù)中所公知的那樣通過ELISA確定由CHO細胞所表達和分泌到生長培養(yǎng)基中的IgGFc蛋白質(zhì)。所獲得的數(shù)據(jù)示于圖14中。數(shù)據(jù)清楚地證明了表達系統(tǒng)的廣泛有用性。表達系統(tǒng)可用于控制典型地用在哺乳動物表達系統(tǒng)中的強力組成型啟動子諸如hCMV啟動子，以便在哺乳動物細胞中以可控制的、可誘導(dǎo)的方式來表達蛋白質(zhì)。權(quán)利要求1.基于完全回文操縱基因序列的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)，包括a)啟動子；以及b)完全回文操縱基因序列；特征在于啟動子不是T7。2.質(zhì)粒，包括a)啟動子；以及b)完全回文操縱基因序列；特征在于啟動子不是T7。3.根據(jù)權(quán)利要求2的質(zhì)粒，進一步包括蛋白質(zhì)的表達盒。4.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的質(zhì)粒，其中質(zhì)粒是自主復(fù)制質(zhì)粒。5.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的質(zhì)粒，其中質(zhì)粒是整合型質(zhì)粒。6.由權(quán)利要求2到5任一項的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的宿主細胞。7.生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其包括使表達系統(tǒng)表達，該表達系統(tǒng)包括a)啟動子；b)完全回文操縱基因序列；以及c)蛋白質(zhì)的表達盒；其特征在于啟動子不是T7。8.根據(jù)權(quán)利要求1到7任一項的表達系統(tǒng)、質(zhì)粒、宿主細胞或方法，其中啟動子是宿主細胞聚合酶啟動子。9.根據(jù)權(quán)利要求8的表達系統(tǒng)、質(zhì)粒、宿主細月包或方法，其中啟動子是大腸桿菌RNA聚合酶啟動子。10.根據(jù)權(quán)利要求1到7任一項的表達系統(tǒng)、質(zhì)粒、宿主細胞或方法，其中啟動子是T7A1、T7A2、T7A3、入pL、XpR、lac、lacUV5、trp、tac、trc、phoA或rrnB。11.根據(jù)權(quán)利要求1到IO任一項的表達系統(tǒng)、質(zhì)粒、宿主細i包或方法，其中操縱基因系統(tǒng)是lac、gal、deo或gln。12.根據(jù)權(quán)利要求1到11任一項的表達系統(tǒng)、質(zhì)粒、宿主細胞或方法，其中采用了兩種完全回文操縱基因序列，優(yōu)選一種操縱基因序列位于啟動子的下游，并且一種操縱基因序列位于啟動子的上游。13.根據(jù)權(quán)利要求12的表達系統(tǒng)、質(zhì)粒、宿主細胞或方法，其中操縱基因序列間隔85到150個堿基對，優(yōu)選間隔90到126個堿基對，最優(yōu)選間隔91或92個石咸基對。14.生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其包括a)培養(yǎng)用權(quán)利要求3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過的宿主細胞；以及b)回收蛋白質(zhì)。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中宿主細胞是大腸桿菌。16.根據(jù)權(quán)利要求14和15之一的方法，其中質(zhì)粒是如權(quán)利要求8到13任一項的質(zhì)粒。全文摘要提供了基于完全回文操縱基因序列的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。表達系統(tǒng)包括啟動子；以及完全回文操縱基因序列，其中啟動子不是T7。優(yōu)選采用表達系統(tǒng)來通過發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。文檔編號C12N15/70GK101410523SQ200780011276公開日2009年4月15日申請日期2007年2月1日優(yōu)先權(quán)日2006年2月3日發(fā)明者B·V·卡拉,C·D·J·倫農(nóng),I·J·霍奇森申請人:艾夫西亞生物有限公司