專利名稱：：具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物和用于產(chǎn)生該植物的方法具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物和用于產(chǎn)生該植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于通過(guò)調(diào)節(jié)編碼GRP(生長(zhǎng)相關(guān)蛋白)的核酸在植物中表達(dá)而改進(jìn)多種植物生長(zhǎng)特征的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼GRP的核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物，其中所述植物相對(duì)于對(duì)應(yīng)野生型植物或其它對(duì)照植物具有改良的生長(zhǎng)特征。本發(fā)明還提供用于本發(fā)明方法中的構(gòu)建體。持續(xù)增長(zhǎng)的世界人口和農(nóng)業(yè)用可耕地供應(yīng)萎縮刺激了有關(guān)增加農(nóng)業(yè)效率的研究。常規(guī)的作物及園藝學(xué)改良手段利用選擇育種技術(shù)以鑒定具有受歡迎特性的植物。然而，此類選擇育種技術(shù)具有幾個(gè)缺陷，即這些技術(shù)一般耗費(fèi)很多勞動(dòng)并且產(chǎn)生這樣的植物，其經(jīng)常含有異源性遺傳組分，其可能不總是導(dǎo)致從親代植物中傳遞的所希望性狀。分子生物學(xué)進(jìn)展已經(jīng)允許人類改良動(dòng)物及植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程使得可以分離和操作遺傳物質(zhì)(一般處于DNA或RNA形式)并且隨后導(dǎo)入該遺傳物質(zhì)至植物中。此類技術(shù)具有產(chǎn)生具備多種經(jīng)濟(jì)學(xué)、農(nóng)學(xué)或園藝學(xué)改良性狀的作物或植物的能力。具有特殊經(jīng)濟(jì)意義的性狀是增加的產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為來(lái)自作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的可測(cè)量結(jié)果。該結(jié)果可以就數(shù)量和/或品質(zhì)方面進(jìn)行定義。產(chǎn)量直接取決于幾個(gè)因素，例如器官的數(shù)目和大小、植物構(gòu)造(例如枝的數(shù)目)、種子產(chǎn)生、葉衰老等。根發(fā)育、養(yǎng)分?jǐn)z入量、脅迫耐受性和早期萌發(fā)勢(shì)(earlyvigor)也可以是決定產(chǎn)量的重要因素。優(yōu)化前述因素因而可以對(duì)增加作物產(chǎn)量有貢獻(xiàn)。種子產(chǎn)量是特別重要的性狀，因?yàn)楸姸嘀参锏姆N子對(duì)人與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)是重要的。作物如玉米、稻、小麥、油菜和大豆占超過(guò)一半的人類總熱量攝入，無(wú)論通過(guò)直接消費(fèi)種子本身或通過(guò)消費(fèi)基于加工的種子而產(chǎn)生的肉產(chǎn)品。作物也是糖、油及工業(yè)加工中所用眾多類型代謝物的來(lái)源。種子含有胚(新苗和新根的起源)和胚乳(萌發(fā)期間及幼苗早期生長(zhǎng)期間用于胚生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源)。種子發(fā)育涉及多種基因并且需要代謝物從根、葉和莖轉(zhuǎn)移至正在生長(zhǎng)的種子中。胚乳尤其同化糖類、油和蛋白質(zhì)的代謝前體并且將它們合成為貯藏大分子以灌滿籽粒。對(duì)于眾多作物的另一個(gè)重要性狀是早期萌發(fā)勢(shì)。改進(jìn)早期萌發(fā)勢(shì)是現(xiàn)代稻育種計(jì)劃在溫帶和熱帶稻品種上的重要目標(biāo)。長(zhǎng)根在水栽稻中對(duì)于正確土壤固定是重要的。在將稻直接播種至被淹沒(méi)田地的情況下，以及在植物必須從水中迅速出苗的情況下，較長(zhǎng)的苗與萌發(fā)勢(shì)相關(guān)。在實(shí)施條播的情況下，較長(zhǎng)的中胚軸和胚芽鞘對(duì)于良好出苗是重要的。將早期萌發(fā)勢(shì)人工改造到植物內(nèi)的能力將在農(nóng)業(yè)中是極其重要的。例如，不良的早期萌發(fā)勢(shì)已經(jīng)限制了基于玉米帶種質(zhì)(CornBeltgermplasm)的玉米(ZeamayesL.)雜種在歐洲大西洋地區(qū)的引種。又一個(gè)重要性狀是改進(jìn)的非生物脅迫耐受性。非生物脅迫是世界范圍作物損失的主要原因，對(duì)于大多數(shù)主要作物植物而言降低平均產(chǎn)量超過(guò)50。/。(Wang等、Planta(2003)218:1-14)。非生物脅迫可以由干旱、鹽度、極端溫度、化學(xué)毒性和氧化脅迫引起。提高植物對(duì)非生物脅迫耐受性的能力將在世界范圍對(duì)農(nóng)民是極大經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)并且會(huì)允許在不利條件期間及在作物栽培否則是不可能的陸地上栽培作物。作物產(chǎn)量因而可以通過(guò)優(yōu)化前述因素之一而增加。取決于最終用途，對(duì)某些產(chǎn)量性狀的改良可能優(yōu)先于其它產(chǎn)量性狀。例如對(duì)于應(yīng)用如飼料或木材生產(chǎn)或生物燃料資源而言，增加植物營(yíng)養(yǎng)體部分可能是希望的，而對(duì)于應(yīng)用如面粉、淀粉或油生產(chǎn)而言，增加種子參數(shù)可能是尤其希望的。即便在種子參數(shù)當(dāng)中，某些參數(shù)可以更優(yōu)先于其它參數(shù)，這取決于應(yīng)用。多種機(jī)制可以對(duì)增加種子產(chǎn)量有貢獻(xiàn)，無(wú)論形式為增加的種子大小或是增加的種子數(shù)目。增加植物中產(chǎn)量(種子產(chǎn)量和/或生物量)的一種方法可以是通過(guò)調(diào)節(jié)植物的內(nèi)在生長(zhǎng)機(jī)制如細(xì)胞周期或參與植物生長(zhǎng)或參與防御機(jī)制的多種信號(hào)途徑?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)調(diào)節(jié)植物中的編碼GRP(生長(zhǎng)相關(guān)蛋白)的核酸在植物中表達(dá)而改進(jìn)植物中的多種生長(zhǎng)特征。GRP可以是如下蛋白之一MADS盒轉(zhuǎn)錄因子(OsMADS15)、PLT轉(zhuǎn)錄因子、bHLH轉(zhuǎn)錄因子、SPL15轉(zhuǎn)錄因子和耐鹽蛋白(HAL3)。背景耐鹽蛋白細(xì)胞中的眾多酶過(guò)程需要輔酶A(CoA或CoASH)的參與。輔酶A(CoASH)本身是高度極性的分子，由與t磷酸泛酸(4-phosphopantethenicacid)(維生素B5)連接并因此與(5-巰基乙胺連接的腺苷3'，5，-二磷酸構(gòu)成。游離SH基可以被酯化，這取決于CoA參與的過(guò)程。已經(jīng)在細(xì)菌、動(dòng)物和植物中闡明CoA合成的途徑。在植物中，CoA前體4'-磷酸泛酰半胱氨酸(PPC)至4'-磷酸泛酰巰基乙胺的轉(zhuǎn)化由黃素蛋白4'-磷酸泛酰半胱氨酸脫羧酶(PPCDC或HAL3,Kupke等J.Biol.Chem.276，191卯-19196，2001)催化。編碼HAL3蛋白質(zhì)的基因可以是一個(gè)小基因家族的部分?jǐn)M南芥(Arabidopsis)基因組包含2個(gè)同種型(AtHAL3a和AtHAL3b;Espinoza-Ruiz等PlantJ.20，529-539，1999)，在煙草中存在3種HAL3基因(Yonamine等丄Exp.Bot.55，387-395,2004)，而在稻中HAL3是單拷貝基因。有人提出AtHAL3和其它HAL3蛋白質(zhì)作為三聚體發(fā)揮作用，每個(gè)單體具有結(jié)合的黃素單核苷酸(FMN)(Albert等Structure8，％1-%9，2000)。推測(cè)FMN輔因子在產(chǎn)生4'-磷酸泛酰巰基乙胺的氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮作用。然而HAL3蛋白質(zhì)的分子功能沒(méi)有得到充分闡述。HAL3蛋白質(zhì)顯示與涉及耐鹽性的酵母SIS2蛋白質(zhì)(Ferrando等，Mol.Cell.Biol.15，5470-5481)的同源性。異位表達(dá)HAL3的植物或植物細(xì)胞顯示改進(jìn)的鹽、滲透壓或鋰脅迫耐受性(Espinoza-Ruiz等，1999;Yonamine等，2004)。報(bào)道稱BY2細(xì)胞中的煙草HAL3a過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致胞內(nèi)脯氨酸含量增加，這可能對(duì)耐鹽表型有貢獻(xiàn)(Yonamine等，2004)。此外，過(guò)量表達(dá)AtHAL3a的擬南芥植物比野生型植物表現(xiàn)更快的生長(zhǎng)速率(Espinoza-Riiiz等，1999)。證實(shí)AtHAL3b蛋白質(zhì)與細(xì)胞周期蛋白CDKB1:1相互作用(WO00/36124),因而推測(cè)AtHAL3b對(duì)于賦予植物鹽脅迫耐受性并對(duì)于鹽脅迫條件下增加植物生長(zhǎng)速率有用?，F(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)優(yōu)先增加編碼HAL3多肽的核酸在擴(kuò)展組織中表達(dá)產(chǎn)生了相對(duì)于對(duì)照植物而具有增加的產(chǎn)量的植物，其中所述產(chǎn)量增加與對(duì)照植物相比至少是10%。轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子通常定義為與順式調(diào)節(jié)元件(例如增強(qiáng)子，TATA盒)結(jié)合并且與RNA聚合酶結(jié)合下能夠激活和/或抑制轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。擬南芥基因組編碼至少1533種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，這占其估計(jì)基因總數(shù)的5.9Vo(Riechmaim等，2000(Science笫290巻，2105-2109))。MADS15MADS盒基因構(gòu)成參與酵母、植物和動(dòng)物發(fā)育的多個(gè)方面的真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的大基因家族。MADS盒基因編碼負(fù)責(zé)與其靶基因調(diào)節(jié)區(qū)中特定盒的DNA結(jié)合作用的強(qiáng)烈保守的MADS結(jié)構(gòu)域。該基因家族可以劃分成兩個(gè)主要系，I型和II型。II型基因又名MIKC型蛋白質(zhì)，指它們擁有的以下4個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域(圖5，(Jack，PlantMol.Biol.46,515-520，2001)):用于DNA結(jié)合的MADS，約60個(gè)氨基酸(高度保守)，位于蛋白質(zhì)的氨基末端；間插結(jié)構(gòu)域I(保守性較低)，參與MAI)S二聚體的選擇性形成；角蛋白結(jié)構(gòu)域K(很保守)，負(fù)責(zé)二聚化；羧基端區(qū)C(序列和長(zhǎng)度可變)，參與轉(zhuǎn)錄激活或參與形成多聚轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體。已經(jīng)在擬南芥中鑒定超過(guò)100個(gè)MADS盒基因，并且已經(jīng)將它們以系統(tǒng)發(fā)生方式歸類成12種進(jìn)化枝，每種進(jìn)化枝具有與MADS共有序列的特定偏離(Thiessen等JMol.Evol.43，484-516，1996).OsMADS15屬于SQUA進(jìn)化枝(就SQUAMOSA而言，其來(lái)自金魚草(Antirrhinummajus))。參考由Coen和Meyerowitz在1991年提出的ABC花器官身份特化模型(Nature353，31-7)而將SQUA進(jìn)化枝的基因歸類為A功能器官身份基因。除OsMADS15之外，稻OsMADS14、OsMADS18和OsMADS20也是SQUA進(jìn)化枝的部分。SQUA進(jìn)化枝在雙子葉植物被細(xì)分成2個(gè)亞組，即API和FUL亞進(jìn)化枝(在其中OsMADS15聚簇)。這些亞進(jìn)化枝基本上在它們各自蛋白質(zhì)的羧基端處的特定氨基酸基序上是趨異的(Litt和Irish,Genetics165，821-833，2003)。除了存在特定的API氨基酸基序之外，雙子葉植物API進(jìn)化枝相關(guān)性蛋白質(zhì)通常在其羧基端包含法尼基化基序(這個(gè)基序是CAAX,其中C是半胱氨酸，A通常是脂族氨基酸并且X是曱硫氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、半胱氨酸或丙氨酸)。在單子葉植物中，SQUA進(jìn)化枝蛋白質(zhì)被細(xì)分成兩個(gè)主要的組，其可以基于該蛋白質(zhì)最后15個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的保守羧基端基序區(qū)分LPPWMLS(例如OsMADS15、SEQIDNO:117)和LPPWMLR(例如OsMADS18)。與SQUA進(jìn)化枝的雙子葉植物序列相反，SQUA進(jìn)化枝的單子葉植物序列在其羧基端沒(méi)有法尼基化基序。推測(cè)OsMADS15與其它蛋白質(zhì)復(fù)合發(fā)揮作用以控制器官形成。然而，迄今沒(méi)有鑒定到具有可見(jiàn)表型的突變體；除在WO01/14559(EP1209232,US6，995,302)中提供的數(shù)據(jù)之外，沒(méi)有提供涉及OsMADS15的異位表達(dá)或下調(diào)表達(dá)的實(shí)-驗(yàn)數(shù)據(jù)。在本公開(kāi)中，以有義方向表達(dá)OsMADS15的轉(zhuǎn)基因蕎麥(Fagopyrumesculentum)才直物顯示增力口的分才支，而表達(dá)反義構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物具有減少的生長(zhǎng)和受抑制的分枝。用有義構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大葉落地生根(Kalanchogdaigremontiana)在根周圍存在葉發(fā)育，這被視為分枝增加的指標(biāo)。作者聲稱就花發(fā)育和這些花的結(jié)構(gòu)而言沒(méi)有觀察到變化。OsMADS15在擬南芥中的直向同源物是無(wú)APETALA1(AP1)。API的異位表達(dá)導(dǎo)致開(kāi)花時(shí)間減少，并且API突變體顯示延遲的開(kāi)花并具有異?；?。PLTAP2(apetala2)/ERF(乙烯應(yīng)答性應(yīng)答元件結(jié)合因子)家族包含了具有至少一個(gè)高度保守性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域-AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。AP2結(jié)構(gòu)域最初在APETALA2(AP2)(—種參與發(fā)育程序如分生組織身份調(diào)節(jié)和花器官特化的擬南芥蛋白質(zhì)(Jofuku等，(1994)PlantCell6，1211-1225))中描述。將AP2/ERF蛋白質(zhì)基于它們是否含有一個(gè)(ERF亞家族)或2個(gè)(AP2亞家族)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域而劃分成亞家族(圖12)。已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組中鑒定到超過(guò)140種AP2/ERF基因(Reichmann等(2000)Science2卯2105-2110)，其中高達(dá)18種AP2/ERF基因?qū)儆贏P2亞家族(Kim等(2006)MolBioEvol23(1):107-120)。已經(jīng)^正實(shí)由Plethora1(PLT1)和Plethora2(PLT2)基因(統(tǒng)稱為PLT基因)編碼的兩種擬南芥AP2亞家族轉(zhuǎn)錄因子多肽對(duì)于干細(xì)胞特別在根分生組織中的特化及維持是必需的。在RT-PCR分析中，PLT轉(zhuǎn)錄物主要在根內(nèi)檢測(cè)到，表明PLT表達(dá)與根身份密切相關(guān)。在擬南芥胚內(nèi)的異位性PLT表達(dá)誘導(dǎo)頂端域同源異型轉(zhuǎn)換成根干細(xì)胞、根或下胚軸(Aida等(2004)Cell119:109-120)。美國(guó)專利申請(qǐng)2004/0045049和國(guó)際專利申請(qǐng)WO03/013227提供了編碼擬南芥PLT1轉(zhuǎn)錄因子(在該申請(qǐng)中稱作G1793)的核酸序列。與野生型對(duì)照相比，報(bào)道稱G1793(使用CaMV35S啟動(dòng)子)在擬南芥中的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致子葉形態(tài)改變、植物整體尺寸輕微減少和瘦花序(可能具有異常花)。G1793過(guò)量表達(dá)者比對(duì)照植物產(chǎn)生更多的種子油。提供了編碼潛在的大豆(Glycinemax)直向同源物、稻(Oryzasativa)直向同源物和玉蜀黍(Zeamays)直向同源物的核,列。國(guó)際專利申請(qǐng)WO03/002751提供了編碼PLT多肽的大豆核酸序列，其與通過(guò)基因概括分析(由DNA微陣列)鑒定的玉米核酸序列具有序列相似性。國(guó)際專利申請(qǐng)WO05/075655提供與擬南芥PLT基因具有序列相似性的稻及玉蜀黍核酸序列。b肌H堿性/螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)蛋白質(zhì)是作為二聚體與特定DNA靶位點(diǎn)結(jié)合并且已經(jīng)在非植物性真核生物中充分表征為多種生物學(xué)過(guò)程中重要調(diào)節(jié)成分的轉(zhuǎn)錄因子超家族。bHLH家族的區(qū)別性特征是由大約60個(gè)氨基酸構(gòu)成的二分結(jié)構(gòu)域。這種二分結(jié)構(gòu)域由與共有的六核苷酸E盒相結(jié)合的DNA結(jié)合基本區(qū)域和與由可變環(huán)區(qū)隔開(kāi)的兩個(gè)a-螺旋構(gòu)成。所述兩個(gè)a-螺旋促進(jìn)二聚化，允許不同家族成員間形成同二聚體和異二聚體。盡管bHLH結(jié)構(gòu)域是進(jìn)化保守的，然而除這個(gè)結(jié)構(gòu)域之外，進(jìn)化枝之間存在4艮少序列相似性。Bailey等，2003(ThePlantCell,第15巻，2497-2501)報(bào)道在擬南芥中檢測(cè)到的bHLH基因總數(shù)是162種，這使得bHLH基因成為擬南芥中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族；報(bào)道稱稻基因組含有131種bHLH基因(Buck和Atchley，2003(J.Mol.E第56巻:742-750))。Hdm等，2003(Mol.Biol.E第20巻(5):735-747)從擬南芥中基于結(jié)構(gòu)相似性鑒定了bHLH基因的12個(gè)亞家族。報(bào)道稱已經(jīng)表征的來(lái)自植物的bHLH蛋白質(zhì)在花色素苷生物合成、植物光敏素信號(hào)作用、球蛋白表達(dá)、果實(shí)開(kāi)裂、心皮及表皮發(fā)育中有作用(Buck和Atchley,2003)。SPL鱗部啟動(dòng)子結(jié)合蛋白樣(SPL)轉(zhuǎn)錄因子多肽是共有長(zhǎng)度約80個(gè)氨基酸殘基的高度保守性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)的結(jié)構(gòu)多樣的蛋白質(zhì)(Kldn等(1996)MolGenGenet259:7-16;Cardon等(1999)Gene237:91-104)。革巴基因啟動(dòng)子內(nèi)的SPL轉(zhuǎn)錄因子DNA共有序列結(jié)合位點(diǎn)是5，-TNCGTACAA-3，，其中N代表任意堿基。在SPLDBD內(nèi)部存在10個(gè)保守的半胱氨酸(Cys)或組氨酸(His)殘基(見(jiàn)圖23)，其中8個(gè)殘基是結(jié)合對(duì)于SPL特異性鋅指三級(jí)結(jié)構(gòu)形成所必需的2個(gè)鋅離子的鋅配位殘基(Yamasaki等(2004)JMolBiol337:49-63)。SPLDBD內(nèi)的第二個(gè)保守性特征是二分核定位信號(hào)。在DBD之外，在整個(gè)植物界內(nèi)大多數(shù)編碼SPL轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸序列中找到一個(gè)微RNA(miRNA)輩巴基序(miRl56)(在編碼區(qū)中或在3，UTR)(Rhoades等(2002)Cell110:513-520)。miRNA通過(guò)引導(dǎo)編碼SPL的mRNA降解或通過(guò)翻譯抑制以轉(zhuǎn)錄后方式調(diào)控SPL基因表達(dá)。Riechmami等(Science290:2105-2109，2000)報(bào)道了擬南芥中的16種SPL轉(zhuǎn)錄因子多肽，它們自身之間的序列相似性很低(除了前述特征之外)，推導(dǎo)的SPL多肽的大小是131-927個(gè)氨基酸。不過(guò)，在這種植物的SPL家族中檢測(cè)到共有更高序列同源性的SPL轉(zhuǎn)錄因子多肽對(duì)(Cardon等(1999))。已經(jīng)證實(shí)迄今表征的SPL轉(zhuǎn)錄因子多肽(僅存在于植物中)在植物發(fā)育、尤其在花發(fā)育中發(fā)揮作用。報(bào)道稱過(guò)量表達(dá)SPL3轉(zhuǎn)錄因子多肽的轉(zhuǎn)基因植物開(kāi)花更早(Cardon等(1997)PlantJ12:367-377)。在歐洲專利申請(qǐng)EP1033405中，提供了SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸序列和推導(dǎo)的多肽序列。在國(guó)際專利申請(qǐng)WO03013227中，提供了核酸序列(和推導(dǎo)的多肽序列；內(nèi)部參考號(hào)G2346),其編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的部分，然而距離SPL15轉(zhuǎn)錄因子的羧基末端38個(gè)氨基酸。組成型過(guò)量表達(dá)修飾的SPL15轉(zhuǎn)錄因子(或G2346)多肽的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物具有輕微擴(kuò)大的子葉。在發(fā)育晚期，報(bào)道稱這種植物沒(méi)有顯示與對(duì)照植物一致的差異。發(fā)明簡(jiǎn)述現(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)優(yōu)先增加編碼HAL3多肽的核酸在擴(kuò)張組織中表達(dá)產(chǎn)生了相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀、尤其增加的早期萌發(fā)勢(shì)和增加的種子產(chǎn)量的植物，其中種子產(chǎn)量增加與對(duì)照植物相比至少是10%。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀、尤其增加才直物早期萌發(fā)勢(shì)和增加植物的種子產(chǎn)量的方法，其包括優(yōu)先增加編碼HAL3多肽的核酸在植物擴(kuò)張組織中的表達(dá)?，F(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)編碼MADS15多肽的核酸的表達(dá)產(chǎn)生了相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀、尤其增加的產(chǎn)量的植物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供相對(duì)于對(duì)照植物增加植物產(chǎn)量的方法，其包括增加編碼MADS15多肽的核酸在植物中表達(dá)。增加的產(chǎn)量包含增加的營(yíng)養(yǎng)性生物量，4旦不包含增加的種子產(chǎn)量。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供相對(duì)于對(duì)照植物增加植物產(chǎn)量的方法，包括降低內(nèi)源性MADS15多肽的水平和/或活性。增加的產(chǎn)量包含更高的種子產(chǎn)量，^L不包含增加的營(yíng)養(yǎng)性生物量?，F(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)增加編碼PLT轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸表達(dá)產(chǎn)生了相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀、尤其增加的產(chǎn)量的植物。根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方案，提供相對(duì)于對(duì)照植物增加植物產(chǎn)量的方法，包括增加編碼PLT轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸在植物中的表達(dá)。的表達(dá)產(chǎn)生了相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。適于增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的特定類的bHLH轉(zhuǎn)錄因子在下文詳細(xì)描述。才艮據(jù)又一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，包括調(diào)節(jié)編碼特定類的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的核酸在植物中的表達(dá)?，F(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)增加編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸在植物中的表達(dá)產(chǎn)生了相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀、尤其增加的產(chǎn)量的植物。根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供相對(duì)于對(duì)照植物增加植物中產(chǎn)量的方法，包括增加編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸在植物中的表達(dá)。定義多肽/蛋白質(zhì)術(shù)語(yǔ)"多肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用并且指處于任意長(zhǎng)度聚合形式中的氨基酸。多核苷*核^V核酸序列/核苷酸序列術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"、"核酸"在本文中可互換使用并且指處于任意長(zhǎng)度聚合形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這二者組合。對(duì)照植物選擇合適的對(duì)照植物是實(shí)驗(yàn)設(shè)置的慣用部分并且可以包括對(duì)應(yīng)的野生型植物或無(wú)目的基因的對(duì)應(yīng)植物。對(duì)照植物一般是與待評(píng)估植物相同的植物物種或甚至是相同的變種。對(duì)照植物也可以是待評(píng)估植物的失效合子。如本文中所用的"對(duì)照植物"不僅指整林植物，還指植物部分，包括種子及種子部分。同源物蛋白質(zhì)的"同源物"包括這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)及酶，它們相對(duì)于非修飾的上述蛋白質(zhì)具有氨基酸置換、缺失和/或插入并且與所述肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)及酶來(lái)源的非修飾蛋白質(zhì)具有相似生物學(xué)活性和功能活性。缺失指從蛋白質(zhì)中移除一個(gè)或多個(gè)氨基酸。插入指一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)中預(yù)定位點(diǎn)內(nèi)的導(dǎo)入。插入可以包含單個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列內(nèi)插入。通常，在氨基酸序列內(nèi)部的插入會(huì)比氨基端融合或羧基端融合更小，約i-io個(gè)殘基級(jí)別。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的實(shí)例包括如酵母雙雜交系統(tǒng)中所用轉(zhuǎn)錄激活物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)-6-標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、蛋白A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag'lOO表位、c-myc表位、FLAG⑧-表位、lacZ、CMP(4丐調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。置換指以具有相似特性(如相似疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞a-螺旋結(jié)構(gòu)或P-折疊結(jié)構(gòu)的傾向)的其它氨基酸替換蛋白質(zhì)的氨基酸。氨基酸置換一般是單個(gè)殘基的，不過(guò)可以是簇集性的，這取決于置于多肽的功能性約束；插入通常會(huì)是約l-10個(gè)氨基酸殘基級(jí)別。氨基酸置換優(yōu)選地是保守性氨基酸置換。保守性置換表是本領(lǐng)域眾所周知的(見(jiàn)例如Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany和下表1)。表l:保守性氨基酸置換的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>A<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>氨基酸置換、缺失和/或插入可以使用本領(lǐng)域眾所周知的肽合成技術(shù)如固相肽合成法等或通過(guò)重組DNA操作而輕易地進(jìn)行。用于操作DNA序列以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的置換、插入或缺失變體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，用于在DNA中的預(yù)定位點(diǎn)處產(chǎn)生置換突變的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并且包4舌M13誘變法、T7-Gen體外誘變法(USB，Clevdaand，OH)、QuickChange位點(diǎn)定向誘變法(Stratagene，SanDiego,CA)、PCR-介導(dǎo)的位點(diǎn)定向誘變或其它位點(diǎn)定向誘變法。衍生物"衍生物"包括這樣的肽、寡肽、多肽，其中與天然存在形式的蛋白質(zhì)(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它們包含以非天然存在的氨基酸殘基對(duì)氨基酸的置換或非天然存在的氨基酸殘基的添加。蛋白質(zhì)的"衍生物"也包含這樣的肽、寡肽、多肽，其中與多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它們包含天然存在的改變(糖基化、?；愇於┗?、磷酸化、肉豆蔻?；?、硫酸鹽化等)氨基酸殘基或非天然的改變氨基酸殘基。與衍生物所來(lái)源的氨基酸序列相比，該衍生物可以也包含與所述氨基酸序列共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)非氨基酸取代基或添加(例如報(bào)道分子或其它配體)，如為促進(jìn)檢測(cè)該衍生物而結(jié)合的報(bào)道分子，和與天然存在的蛋白質(zhì)的氨基酸序列相對(duì)比的非天然存在的氨基酸殘基。直向同源物/旁系同源物直向同源物和旁系同源物包含用來(lái)描述基因祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。旁系同源物是相同物種內(nèi)起源于先祖基因復(fù)制的基因，而直向同源物是來(lái)自不同生物的起源于物種形成的基因。結(jié)構(gòu)域術(shù)語(yǔ)，，結(jié)構(gòu)域"指沿進(jìn)化相關(guān)蛋白質(zhì)的序列比對(duì)結(jié)果而在特定位置處保守的一組氨基酸。盡管在其它位置處的氨基酸可以在同源物之間變動(dòng)，然而在特定位置處的高度保守的氨基酸指示在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或功能方面可能是必需的氨基酸。結(jié)構(gòu)域因通過(guò)在蛋白質(zhì)同源物家族的比對(duì)序列中的高保守程度而被鑒定，它們可以用作鑒定物以確定任意的所討論多肽是否屬于先前已鑒定的多肽家族。基序/共有序列/標(biāo)簽術(shù)語(yǔ)"基序"或"共有序列"或"標(biāo)簽"指在進(jìn)化相關(guān)蛋白質(zhì)的序列中的短保守區(qū)。基序往往是結(jié)構(gòu)域的高度保守部分，不過(guò)也可以僅包括結(jié)構(gòu)域的部分，或可以位于保守結(jié)構(gòu)域之外(若基序的全部氨基酸位于定義的結(jié)構(gòu)域之外)。雜交如本文中所定義的術(shù)語(yǔ)"雜交"是其中基本上同源的互補(bǔ)核苷酸序列相互復(fù)性的過(guò)程。雜交過(guò)程可以完全在溶液中進(jìn)行，即兩種互補(bǔ)性核酸均處于溶液中。雜交過(guò)程也可以在互補(bǔ)性核酸之一固定到基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖(Sepharose)珠或任何其他樹(shù)脂的情況下發(fā)生。雜交過(guò)程也可以在互補(bǔ)性核酸之一固定至固相支持體如硝酸纖維素膜或尼龍膜上或通過(guò)例如照相平版印刷術(shù)固定至例如硅酸玻璃支持物(后者稱作核酸陣列或微陣列或稱作核酸芯片)上的情況下進(jìn)行。為使雜交發(fā)生，通常將核酸分子熱變性或化學(xué)級(jí)結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格性"指在其中發(fā)生雜交的條件。雜交的嚴(yán)格性受條件如溫度、鹽濃度、離子強(qiáng)度和雜交緩沖液組成影響。通常，將低嚴(yán)格性條件選擇為在確定的離子強(qiáng)度及pH時(shí)低于特定序列熱解鏈溫度(Tm)約30。C。中等嚴(yán)格性條件是此時(shí)溫度低于Tm約20。C并且高嚴(yán)格性條件是此時(shí)溫度低于Tm約10°C。高嚴(yán)格性雜交條件一般用于分離與靶核酸序列具有高序列相似性的雜交序列。然而，核酸可以在序列上偏離并且因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而依舊編碼基本上相同的多肽。因而有時(shí)候可能需要中等嚴(yán)格性雜交條件以鑒定此類核酸分子。Tm是在確定的離子強(qiáng)度及pH時(shí)的溫度，在所述溫度下50%的靶序列與完全匹配的一笨針雜交。Tm取決于溶液條件和探針的堿基組成及長(zhǎng)度。例如，較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性地雜交。從低于Tm約16。C直至32。C獲得最大雜交速率。一價(jià)陽(yáng)離子在溶液中的存在降低了兩條核酸鏈間的靜電排斥，因而促進(jìn)雜交分子形成；這種作用對(duì)于高達(dá)0.4M的鈉濃度是明顯的(對(duì)于更高濃度，這種效應(yīng)可以忽略)。曱酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度，每百分?jǐn)?shù)曱酰胺降低0.6-0.7。C，并且添加50%曱酰胺允許在30-45°C進(jìn)行雜交，雖然雜交速率會(huì)降低。堿基對(duì)錯(cuò)配降低了雜交速率及雙鏈體的熱穩(wěn)定性。平均而言并且對(duì)于大的探針來(lái)說(shuō)，每％堿基錯(cuò)配Tm下降約1。C。取決于雜交分子的類型，Tm可以使用下列等式計(jì)算1)DNA-DNA雜交分子(Meinkoth和Wahl,Anal.Biochem.，138:267-284，1984):Tm=81.5。C+16.6xloglONa+ja+0.41x%G/Cbl—500xLc卜l—0,61x%甲酰胺2)DNA-RNA或RNA-RNA雜交分子Tm=79.8+18.5(loglO[Na+ja)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2胃820/Lc3)寡DNA或寡RNAd雜交分子對(duì)于<20個(gè)核苷酸Tnv=2(ln)對(duì)于20-35個(gè)核苷酸Tm=22+1.46(ln)a或?qū)τ谄渌粌r(jià)陽(yáng)離子，但是僅在0.01-0.4M范圍內(nèi)是精確的。b僅對(duì)于。/oGC在30%-75%范圍內(nèi)是精確的。cL=雙鏈體的長(zhǎng)度(以堿基對(duì)計(jì))。說(shuō)dOligo，寡核苷酸；ln，引物的有效長(zhǎng)度-2x(G/C數(shù))+(A/T數(shù))?？梢员姸嘁阎夹g(shù)的任何一種控制非特異性結(jié)合，例如用含蛋白質(zhì)的溶液封閉薄膜、添加異源性RNA、異源性DNA及SDS至雜交緩沖液并且用RNA酶處理。對(duì)于非同源性探針，一系列雜交可以通過(guò)改變以下條件之一進(jìn)行(i)漸進(jìn)地降低復(fù)性溫度(例如從68。C至42。C)或(ii)漸進(jìn)地降低甲酰胺濃度(例如從50%至0%)。技術(shù)人員了解雜交期間可以加以改變和將維持或改變嚴(yán)格性條件的多種參數(shù)。除雜交條件之外，雜交特異性一般還取決于雜交后洗滌的功能。為除去因非特異性雜交所致的背景，樣品用稀釋的鹽溶液洗滌。此類洗滌的關(guān)鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度及溫度鹽濃度越低并且洗滌溫度越高，則洗滌的嚴(yán)格性越高。洗滌條件一般在雜交嚴(yán)格性上或低于雜交嚴(yán)格性而進(jìn)行。陽(yáng)性雜交產(chǎn)生至少兩倍于背景信號(hào)的信號(hào)。通常，用于核酸雜交分析法或基因擴(kuò)增檢測(cè)方法的合適嚴(yán)格性條件如上所述。也可以選擇更嚴(yán)格或更不嚴(yán)格的條件。技術(shù)人員了解洗滌期間可以加以改變和將維持或改變嚴(yán)格性條件的多種參數(shù)。例如，用于長(zhǎng)度大于50個(gè)核苷酸的DNA雜交分子的常見(jiàn)高嚴(yán)格性雜交條件包括在65。C于lxSSC中或在42。C于lxSSC和50%曱酰胺中雜交，隨后在65°C于0.3xSSC中洗滌。用于長(zhǎng)度大于50個(gè)核苷酸的DNA雜交分子的中等嚴(yán)格性雜交條件的實(shí)例包括在55°C于4xSSC中或在40。C于6xSSC和50。/。甲酰胺中雜交，隨后在50。C于2xSSC中洗滌。雜交分子的長(zhǎng)度是雜交核酸的預(yù)期長(zhǎng)度。當(dāng)序列已知的核酸雜交時(shí)，可以通過(guò)比NaCl和15mM檸檬酸鈉；雜交溶液和洗滌溶液可以額外地包含5xDenhardt試劑、0.5-1.0%SDS、100jig/ml變性的片段化鮭精DNA、0.5%焦磷酸鈉。為了定義嚴(yán)格性水平的目的，可以參考Sambrook等(2001)MolecularCloning:alaboratorymanual,第三版ColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH,NewYork或參考CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989和每年更新版本)。剪接變體如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"剪接變體"包含其中已經(jīng)切除、替換、移位或添加所選內(nèi)含子和/或外顯子或其中內(nèi)含子已經(jīng)縮短或加長(zhǎng)的核酸序列的變體。此類變體將是其中基本上保留了蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的一種變體；這可以通過(guò)選擇性保留蛋白質(zhì)的功能性片段而實(shí)現(xiàn)。此類剪接變體可以在自然界中找到或可以人工制造。用于預(yù)測(cè)和分離此類剪接變體的方法是本領(lǐng)^戈眾所周知的(見(jiàn)例如Foissac和Schiex,BMCBioinformatics.2005;6:25)。等位變體等位基因或等位變體是給定基因的替代形式，位于相同染色體位置內(nèi)。等位變體包含單核苷酸多態(tài)性(SNP)和小插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在性多態(tài)性林系中序列變體的最大集合?；蚋慕M/定向進(jìn)化基因改組或定向進(jìn)化的組成為反復(fù)DNA改組，隨后適當(dāng)篩選和/或選擇以產(chǎn)生編碼具有改良生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的核酸或其部分的變體(Castle等，(2004)Science304(5674):1151-4;美國(guó)專利5，811，238和6,395,547)。調(diào)節(jié)元件/調(diào)控序列/啟動(dòng)子術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)元件"、"調(diào)控序列，，和"啟動(dòng)子，，均在本文中可互換使用并且在廣義上意指能夠?qū)崿F(xiàn)與之連接的序列表達(dá)的調(diào)節(jié)性核酸序列。術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子，，一般指位于基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游并參與識(shí)別及結(jié)合RNA聚合酶和其它蛋白質(zhì)，因而指導(dǎo)有效連接的核酸轉(zhuǎn)錄的核酸調(diào)控序列。前述術(shù)語(yǔ)包括從典型的真核基因組基因(包括對(duì)于精確轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)所需的TATA盒，具有或沒(méi)或以組織特異性方式改變基因表達(dá)的額外調(diào)節(jié)元件(如，上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)。本術(shù)語(yǔ)還包括典型的原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，在此情況下它可以包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)元件，，也包含賦予、激活或增強(qiáng)核酸分子在細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)的合成的融合分子或衍生物。"植物啟動(dòng)子"包含介導(dǎo)編碼序列區(qū)段在植物細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。因此，植物啟動(dòng)子不需要是植物來(lái)源的，而是可以源自病毒或微生物，例如來(lái)自侵襲植物細(xì)胞的病毒。"植物啟動(dòng)子，，也可以源自植物細(xì)胞，例如來(lái)自用待于本發(fā)明方法中表達(dá)及在本文中描述的核酸序列所轉(zhuǎn)化的植物。這也適用于其它"植物"調(diào)節(jié)性信號(hào)，如"植物"終止子。用于本發(fā)明方法中的核苷酸序列的啟動(dòng)子上游可以由一個(gè)或多個(gè)核苦酸置換、插入和/或缺失而受到修飾，但不干擾啟動(dòng)子、可讀框(ORF)或3'調(diào)節(jié)區(qū)如終止子或遠(yuǎn)離ORF的其它3'調(diào)節(jié)區(qū)的功能性或活性。啟動(dòng)子的活性還有可能因^務(wù)飾該啟動(dòng)子的序列或由更活躍的啟動(dòng)子、甚至來(lái)自異源生物的啟動(dòng)子徹底替換該啟動(dòng)子而增加。為在植物中表達(dá)，如上所述，核酸分子必須有效連接至或包含合適的啟動(dòng)子，其中所述的啟動(dòng)子在正確時(shí)間點(diǎn)上并以所需要的空間表達(dá)模式表達(dá)基因。為鑒定功能性等效啟動(dòng)子，候選啟動(dòng)子的啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá)模式可以通過(guò)將該啟動(dòng)子與報(bào)道基因有效連接并分析該報(bào)道基因在植物多種組織的表達(dá)水平和才莫式而進(jìn)行分析。合適的公知報(bào)道基因包括例如P-葡糖醛酸糖苷酶或ji-半乳糖苷酶。啟動(dòng)子活性通過(guò)測(cè)量p-葡糖醛酸糖苷酶或P-半乳糖苷酶的酶活性進(jìn)行分析。啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá)模式隨后可以與參考啟動(dòng)子(如本發(fā)明方法中所用的一種啟動(dòng)子)的啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá)模式比較。備選地，啟動(dòng)子強(qiáng)度可以使用本領(lǐng)域已知方法如Northern印跡法及放射自顯影圖的密度計(jì)分析法、定量實(shí)時(shí)PCR或RT-PCR(Heid等，1996GenomeMethods6:986-994)，通過(guò)定量mRNA水平或通過(guò)將本發(fā)明方法中所用核酸的mRNA水平與持家基因(如18SrRNA)的mRNA水平比較而分析。通常"弱啟動(dòng)子"意指驅(qū)動(dòng)編碼序列在低水平上表達(dá)的啟動(dòng)子。"低水平"意指在每個(gè)細(xì)胞約1/10,000轉(zhuǎn)錄物至約1/100,000轉(zhuǎn)錄物、至約1/500,0000轉(zhuǎn)錄物的水平上。相反，"強(qiáng)啟動(dòng)子"驅(qū)動(dòng)編碼序列在高水平、或在每個(gè)細(xì)胞約1/10轉(zhuǎn)錄物至約1/100轉(zhuǎn)錄物、至約1/1,000轉(zhuǎn)錄物上表達(dá)。有效連接如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"有效連接"指啟動(dòng)子序列與目的基因之間功能性地連接，以至于啟動(dòng)子序列能夠啟動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄。組成型啟動(dòng)子"組成型啟動(dòng)子"指在生長(zhǎng)和發(fā)育的大部分、但不必全部階段期間和在大部分環(huán)境條件下在至少一個(gè)細(xì)胞、組織或器官內(nèi)有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。下表2給出組成型啟動(dòng)子的實(shí)例。表2:組成型啟動(dòng)子的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>超級(jí)啟動(dòng)子WO95/14098G盒蛋白質(zhì)WO94/12015遍在啟動(dòng)子遍在啟動(dòng)子在生物基本上所有組織或細(xì)胞內(nèi)有活性。發(fā)育調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子有活性。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在應(yīng)答化學(xué)品(綜述見(jiàn)Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，48:89-108)、環(huán)境刺激或物理刺激時(shí)具有受誘導(dǎo)或增加的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，或可以是"脅迫誘導(dǎo)性的"，即當(dāng)植物暴露于多種脅迫條件時(shí)受到激活，或是"病原體誘導(dǎo)性的"，即當(dāng)植物暴露于多種病原體時(shí)受到激活。器官特異性/組織特異性啟動(dòng)子器官特異性或組織特異性啟動(dòng)子是能夠優(yōu)先在某些器官官或組織如葉、根、種子組織等內(nèi)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。例如，"根特異性啟動(dòng)子"是在植物根中優(yōu)勢(shì)地具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，在植物的任何其它部分內(nèi)基本上無(wú)活性，盡管在植物的這些其它部分內(nèi)允許任何泄露表達(dá)。能夠僅在某些細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子在本文中稱作"細(xì)胞特異的"。如本文中所定義的綠色組織特異性啟動(dòng)子是主要在綠色組織中具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，在植物的任何其它部分內(nèi)基本上無(wú)活性，盡管在植物的這些其它部分內(nèi)允許任何泄露表達(dá)。顯示。表3:綠色組織特異性啟動(dòng)的實(shí)例基因表達(dá)參考文獻(xiàn)玉米正磷酸二激酶葉特異性Fukavama等，2001(orthophosphatedikinase)玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶葉特異性Kausch等，2001稻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶葉特異性Liu等,2003稻Rubisco小亞基葉特異性Nomura等，2000稻P擴(kuò)展蛋白EXBP9苗特異性WO2004/070039木豆(Pigeonpea)Rubisco小亞基葉特異性Panguluri等，2005豌豆RBCS3A葉特異性組織特異性啟動(dòng)子的另一個(gè)實(shí)例是分生組織特異性啟動(dòng)子，其主要在分生性組織中具有轉(zhuǎn)錄活性，在植物的任何其它部分內(nèi)基本上無(wú)活性，盡管在植物的這些其它部分內(nèi)允許任何泄露表達(dá)。終止子術(shù)語(yǔ)"終止子"包括這樣的調(diào)控序列，其是在轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，發(fā)出對(duì)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行3，加工并多聚腺苷化以及終止轉(zhuǎn)錄的信號(hào)。終止子可以衍生自天然基因、來(lái)自多種其它植物基因或來(lái)自T-DNA。待添加的終止子可以來(lái)自例如胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因或備選地來(lái)自其它植物基因或較不優(yōu)選地來(lái)自任何其它真核基因。調(diào)節(jié)術(shù)語(yǔ)，，調(diào)節(jié)"就表達(dá)或基因表達(dá)而言意指這樣的過(guò)程，其中表達(dá)水平與對(duì)照植物相比因所述基因的表達(dá)而改變，優(yōu)選地，表達(dá)水平增加。原先未受調(diào)節(jié)的表達(dá)可以是結(jié)構(gòu)RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何類型表達(dá)，隨后是翻譯。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)活性"應(yīng)當(dāng)意指本發(fā)明核酸序列或所編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)的任何變化，這導(dǎo)致植物增加的產(chǎn)量和/或增加的生長(zhǎng)。增力口的表達(dá)/過(guò)量表達(dá)如本文中所用的術(shù)語(yǔ)，，增加的表達(dá)"或"過(guò)量表達(dá)"意指對(duì)于原有野生型表達(dá)水平是額外的任何形式表達(dá)。在本領(lǐng)域內(nèi)詳細(xì)記載了用于增加基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法并且它們包括例如，由適宜啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)量表達(dá)、使用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子?？梢栽诜钱愒葱问降亩嗪塑账岬倪m宜位置(一般是上游)內(nèi)導(dǎo)入作為啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件的分離核酸，以便上調(diào)編碼目的多肽的核酸的表達(dá)。例如，內(nèi)源性啟動(dòng)子可以通過(guò)突變、缺失和/或置換而在體內(nèi)改變(見(jiàn)Kmiec，美國(guó)專利號(hào)5，565，350;Zarling等,PCT/US93/03868),或可以將分離的啟動(dòng)子以相對(duì)于本發(fā)明基因的正確方向及距離導(dǎo)入植物細(xì)胞，以便控制基因表達(dá)。若需要多肽表達(dá)，通常希望在多核苷酸編碼區(qū)的3，末端包括多聚腺苷化區(qū)。多聚腺苷化區(qū)可以來(lái)自天然基因、來(lái)自多種其它植物基因或來(lái)自T-DNA。待添加的3，末端序列可以來(lái)自例如胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因或備選地來(lái)自另一植物基因或更不優(yōu)選來(lái)自任何其它真核基因。內(nèi)含子序列也可以添加至5'非翻譯區(qū)(UTR)或部分編碼性序列的編碼序列上，以增加在胞漿內(nèi)積累的成熟信息的量。已經(jīng)證實(shí)可剪接內(nèi)含子在植物表達(dá)構(gòu)建體和動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體中轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的包含在mRNA水平及蛋白質(zhì)水平上增加基因表達(dá)至多達(dá)1000倍(Buchman和Berg(l卵8)Mol.Cellbiol.8:4395-4405;Callis等(1987)GensDev1:1183-1200)?；虮磉_(dá)的此類內(nèi)含子增強(qiáng)作用一般在位于轉(zhuǎn)錄單位5'末端附近時(shí)最強(qiáng)烈。使用玉米內(nèi)含子Adhl-S內(nèi)含子1、2和6、Bronze-l內(nèi)含子是本領(lǐng)域已知的。對(duì)于一般信息，見(jiàn)《玉米手冊(cè)》，第116章，編者Freding和Walbot，Springer,N，Y.(1994)。內(nèi)源基因本文中提及的"內(nèi)源"基因不僅僅指如在植物中以其天然形式(即沒(méi)有任何人類干預(yù))存在的所討論基因，還指處于分離形式的隨后(再)導(dǎo)入植物(轉(zhuǎn)基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有這種轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物可以遭遇轉(zhuǎn)基因表達(dá)大幅降低和/或內(nèi)源基因表達(dá)的大幅降低。降低的表達(dá)本文中提及的"降低或基本去除，，意指內(nèi)源基因表達(dá)和/或多肽水平和/或多肽活性相對(duì)于對(duì)照植物的降低。與對(duì)照植物相比，降低或基本去除以遞增優(yōu)選順序是至少10%、20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、85%、90%，或95%、96%、97%、98%、99%或更多的降低。為了降低或基本去除內(nèi)源基因在植物中的表達(dá)，需要核酸序列的足夠長(zhǎng)度的基本上連續(xù)的核苷酸。為了開(kāi)展基因沉默，這個(gè)長(zhǎng)度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、IO個(gè)或更少的核苷酸，或者該長(zhǎng)度可以多至整個(gè)基因(包括5，和/或3，UTR,部分或全體)?；旧线B續(xù)的核苷酸片段可以來(lái)自編碼目的蛋白的核酸(靶基因)或來(lái)自能夠編碼目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。優(yōu)選地，基本上連續(xù)的核苷酸片段能夠與靶基因(有義鏈或反義鏈)形成氫鍵，更優(yōu)選地，基本上連續(xù)的核苷酸片段以遞增優(yōu)選順序與靶基因(有義鏈或反義鏈)具有50%、60%、70%、80%、85%、卯％、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性。編碼(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所討論用于降低或基本去除內(nèi)源基因表達(dá)的多種方法所需的。表達(dá)的這種降低或基本去除可以使用常規(guī)工具和技術(shù)完成。用于降低或基本去除內(nèi)源基因表達(dá)的優(yōu)選方法是在植物中導(dǎo)入并表達(dá)這樣的遺傳構(gòu)建體，其中核酸(在此情況下是來(lái)自目的基因或任何核酸的一段基本上連續(xù)的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能夠編碼任何一種目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)克隆至所述的遺傳構(gòu)建體內(nèi)作為由間隔區(qū)(非編碼性DNA)隔開(kāi)的(部分或完全的)反向重復(fù)序列。在這種優(yōu)選的方法中，使用核酸或其部分(在此情況下是從目的基因或從任何核酸中^t生的一段基本上連續(xù)的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能夠編碼目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)的反向重復(fù)序列(優(yōu)選能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu))，通過(guò)RNA介導(dǎo)的沉默作用而降低或基本上去除內(nèi)源基因的表達(dá)。反向重復(fù)序列在包含調(diào)控序列的表達(dá)載體中克隆。非編碼性DNA核酸序列(間隔序列，例如基質(zhì)附著區(qū)片段(MAR)、內(nèi)含子、多接頭等)位于形成反向重復(fù)序列的兩個(gè)反向核酸之間。在反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄后，形成具有(部分或完全)自身互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的嵌合RNA。這種雙鏈RNA結(jié)構(gòu)稱作發(fā)夾RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成為siRNA,其被摻入RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合物(RISC)中。RISC進(jìn)一步切開(kāi)mRNA轉(zhuǎn)錄物，因而大幅度降低待翻譯成多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目。對(duì)于其它一般細(xì)節(jié)，見(jiàn)例如Grierson等(1998)WO98/53083;Waterhouse等(1999)WO99/53050)。本發(fā)明方法的實(shí)施不依賴在植物中導(dǎo)入并表達(dá)其中克隆入核酸作為反向重復(fù)序列的遺傳構(gòu)建體，而是幾種公知"基因沉默，，方法的任何一種或多種可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)相同的效果。一種用于降低內(nèi)源基因表達(dá)的如此方法是RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)沉默(下調(diào))。沉默作用在這種情況下由基本上與內(nèi)源性靶基因相似的雙鏈RNA序歹'J(dsRNA)在植物中觸發(fā)。這種dsRNA被植物進(jìn)一步加工成約20到約26個(gè)核苷酸，稱作短干擾性RNA(siRNA)。siRNA被摻入RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合物(RISC)內(nèi)，其中所述的RISC進(jìn)一步切割內(nèi)源性靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物，因而大幅度降低待翻譯成多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目。優(yōu)選地，雙鏈RNA序列對(duì)應(yīng)于耙基因。RNA沉默方法的另一個(gè)實(shí)例包括以有義方向?qū)牒怂嵝蛄谢蚱洳糠?在此情況下是從目的基因或從任何核酸中衍生的一段基本上連續(xù)的核苷酸，其中所述的任何核酸能夠編碼目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)至;f直物內(nèi)。"有義方向"指與其mRNA轉(zhuǎn)錄物同源的DNA序列。因而將向植物中導(dǎo)入該核酸序列的至少一個(gè)拷貝。這種額外的核酸序列會(huì)降低內(nèi)源基因表達(dá)，產(chǎn)生已知為共抑制作用的現(xiàn)象。當(dāng)核酸序列的幾個(gè)額外拷貝導(dǎo)入植物時(shí)，基因表達(dá)的降低將更明顯，因?yàn)楦咿D(zhuǎn)錄物水平與共抑制作用的觸發(fā)之間存在正相關(guān)。RNA沉默方法的另一個(gè)實(shí)例包括使用反義核酸序列。"反義"核酸序列包含與編碼蛋白質(zhì)的"有義"核酸序列互補(bǔ)，即與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補(bǔ)，或與mRNA轉(zhuǎn)錄物序列互補(bǔ)的核苷酸序列。反義核酸序列優(yōu)選地與待沉默的內(nèi)源基因互補(bǔ)?；パa(bǔ)性可以位于基因的"編碼區(qū)"和/或"非編碼區(qū)"內(nèi)。術(shù)語(yǔ)"編碼區(qū)"指包含被翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(qū)。術(shù)語(yǔ)"非編碼區(qū)"指分布在編碼區(qū)兩側(cè)的被轉(zhuǎn)錄但不翻譯成氨基酸的5，和3，序列(也稱作5'和3'非翻譯區(qū))。反義核酸序列可以根據(jù)Watson和Crick堿基配對(duì)規(guī)則設(shè)計(jì)。反義核酸序列可以與整個(gè)核酸序列互補(bǔ)(在此情況下是從目的基因或從任何核酸中衍生的一段基本上連續(xù)的核苷酸，其中所述的任何核酸能夠編碼目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)，不過(guò)也可以是僅與核^列的一部分(包括mRNA5，和3，UTR)反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸序列可以與圍繞編碼多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯起點(diǎn)周圍的區(qū)域互補(bǔ)。合適的反義寡核苷酸序列的長(zhǎng)度是本領(lǐng)域已知的并且可以從長(zhǎng)度約50、45、40、35、30、25、20、15或10個(gè)核苷酸或更少的核苷酸開(kāi)始。本發(fā)明的反義核酸序列可以利用本領(lǐng)域已知方法，使用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)而構(gòu)建。例如，反義核酸序列(例如反義寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或多種修飾的核苷酸化學(xué)地合成，其中所述修飾的核苷酸被設(shè)計(jì)旨在增加分子的生物學(xué)穩(wěn)定性或增加反義核酸序列與有義核酸序列之間所形成雙鏈體的物理穩(wěn)定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖咬取代的核苷酸。知的核普酸修飾包括甲基化、環(huán)化和'加帽'及用類似物(如肌苷)取代一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸。其它的核苷酸修飾是本領(lǐng)域眾所周知的。(即從插入的核酸中轉(zhuǎn)錄的RNA將與目的靶核酸呈反義方向)的表達(dá)載體以生物學(xué)方式產(chǎn)生。優(yōu)選地，反義核酸序列在植物中的產(chǎn)生借助穩(wěn)定整合的核酸構(gòu)建體進(jìn)行，其中所述的核酸構(gòu)建體包含啟動(dòng)子、有效連接的反義寡核苷酸和終止子。(insitu)產(chǎn)生)與編碼多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，以便例如通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯而抑制蛋白質(zhì)表達(dá)。雜交可以通過(guò)形成穩(wěn)定雙鏈體的常夫見(jiàn)核苷酸互補(bǔ)性所致，或在結(jié)合于DNA雙鏈體的反義核酸序列的情況下，因雙螺旋大溝內(nèi)特異性相互作用所致。反義核酸序列可以通過(guò)轉(zhuǎn)化或在特定組織部位直接注射而導(dǎo)入植物。備選地，反義核酸序列可以為了革巴向所選擇的細(xì)胞而受到修飾并且隨后系統(tǒng)性施用。例如，對(duì)于系統(tǒng)性施用，細(xì)胞表面上的受體或抗原，例如通過(guò)連接反義核酸序列至與細(xì)胞表面受體或抗原結(jié)合的肽或抗體。反義核酸序列也可以使用本文中所述的載體送遞至細(xì)月包內(nèi)。根據(jù)又一個(gè)方面，反義核酸序列是a-異頭核酸序列。a異頭核酸序列與互補(bǔ)性RNA形成特定雙鏈雜交分子，其中與慣常b-單元相反，所述鏈相互平行(Gaultier等(1987)NuclAcRes15:6625-6641)。反義核酸序列也可以包含2'-o-曱基核糖核香酸(Inoue等(1987)NuclAcRes15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等(1987)FEBSLett.215，327-330)。內(nèi)源基因表達(dá)的降低或基本去除也可以使用核酶而進(jìn)行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能夠切割與其具有互補(bǔ)區(qū)域的單鏈核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如錘頭核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334,585-591中描述)可以用來(lái)催化性地切割編碼多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物，因而大幅度降低待翻譯成多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目?？梢栽O(shè)計(jì)對(duì)核酸序列具特異性的核酶(見(jiàn)例如Cech等美國(guó)專利號(hào)4,987,071;和Cech等美國(guó)專利號(hào)5,116,742)。備選地，對(duì)應(yīng)于核酸序列的mRNA轉(zhuǎn)錄物可以用來(lái)從RNA分子庫(kù)中選出具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science261，1411-1418)。核酶用于才直物中基因沉默的用途是本領(lǐng)域已知的(例如Atkins等(1994)WO94/00012;Lenne等(1995)WO95/03404;Lutziger等(2000)WO00/00619;Prinsen等(1997)WO97/13865和Scott等(1997)WO97/38116)?；虺聊部梢酝ㄟ^(guò)插入誘變(例如T-DNA插入或轉(zhuǎn)座子插入)或通過(guò)如Angell和Baulcombe((1999)PlantJ.20(3):357-62)、(AmpliconVIGSWO98/36083)或Baulcombe(WO99/15682)及其它人描述的策略而實(shí)現(xiàn)。當(dāng)在內(nèi)源基因上存在突變和/或在隨后導(dǎo)入植物的分離的基因/核酸上存在突變時(shí)，基因沉默也可以發(fā)生。降低或基本去除可以由無(wú)功能的多肽引起。例如，多肽可以與多種相互作用性蛋白質(zhì)結(jié)合；一個(gè)或多個(gè)突變和/或截短因而可以提供仍能夠結(jié)合相互作用性蛋白質(zhì)(如受體蛋白質(zhì))但不能表現(xiàn)其正常功能的多肽(如起信號(hào)作用的配體)。另一種基因沉默的方法是靶定與基因調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的核^^列以形成阻止基因在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的三螺旋結(jié)構(gòu)。見(jiàn)Helene,C.,AnticancerDrugRes.6，569-84，1991;Helene等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660,27-361992和Maher，L.J.Bioassays14，807-15，1992。其它方法，如使用針對(duì)內(nèi)源性多肽的抗體以抑制此多肽在植物中的功能，或干擾所述多肽參與的信號(hào)途徑，對(duì)于技術(shù)人員將是眾所周知的。尤其，可以構(gòu)思的是人造分子可以用于抑制靶多肽的生物學(xué)功能，或用于干擾乾多肽參與其中的信號(hào)途徑。備選地，可以建立篩選程序以鑒定在植物群體中基因的天然變體，其中所述的變體編碼具有降低活性的多肽。此類天然變體也可以用于例如進(jìn)行同源重組。人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用來(lái)敲除基因表達(dá)和/或mRNA翻譯。內(nèi)源性miRNA是通常19-24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈小RNA。它們的主要功能是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和/或mRNA翻譯。大多數(shù)的植物微RNA(miRNA)與其靶序列具有完全的或接近完全的互補(bǔ)性。然而，存在具有多達(dá)5個(gè)錯(cuò)配的天然靶標(biāo)。它們由切酶家族的雙鏈特異性RNA酶從具有特征性折回結(jié)構(gòu)的較長(zhǎng)的非編碼性RNA中加工而來(lái)。在加工時(shí)，它們通過(guò)與RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白質(zhì)結(jié)合而摻入該復(fù)合體。MiRNA充當(dāng)RISC的特異性成分，因此它們與細(xì)胞質(zhì)中的靶核酸(大多是mRNA)堿基配對(duì)。后續(xù)的調(diào)節(jié)事件包括靶mRNA切割和破壞和/或翻譯抑制。miRNA過(guò)量表達(dá)的作用因此在靶基因降低的mRNA水平上得到反映。通常21個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的人工微RNA(amiRNAs)可以遺傳改造以特異性地負(fù)調(diào)節(jié)單個(gè)或多個(gè)目的基因的基因表達(dá)。植物微RNA靶的選擇的決定因素是本領(lǐng)域眾所周知的。用于靶識(shí)別的經(jīng)驗(yàn)參數(shù)已經(jīng)確定并且可以用來(lái)輔助設(shè)計(jì)特定的amiRNA,SchwabR，2005。用于設(shè)計(jì)并產(chǎn)生amiRNA及其前體的便利工具也是公眾可獲得的，Schwab等，2006。為最佳性能，用于降低內(nèi)源基因在植物中表達(dá)的基因沉默技術(shù)需要使用來(lái)自單子葉才直物的核酸序列以轉(zhuǎn)化單子葉植物，和使用來(lái)自雙子葉植物的核酸序列以轉(zhuǎn)化雙子葉植物。優(yōu)選地，將來(lái)自任何給定植物物種的核酸序列導(dǎo)入同一個(gè)物種內(nèi)。例如，將來(lái)自稻的核酸序列轉(zhuǎn)化至稻植物。然而，的植物物種。只要內(nèi)源性靶基因與待導(dǎo)入的核酸之間存在相當(dāng)大的同源性就足夠了。上文描述的是用于降低或基本去除內(nèi)源基因在植物中表達(dá)的多種方法的實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)輕易地能夠調(diào)整前述用于沉默的方法以至于例如通過(guò)利用合適啟動(dòng)子而實(shí)現(xiàn)降低內(nèi)源基因在整林植物或在其部分中的表達(dá)。選擇標(biāo)記(基因)/報(bào)道基因"選擇標(biāo)記"、"選擇標(biāo)記基因"或"報(bào)道基因"包括向細(xì)胞賦予表型的任何基因，其中在所述的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述基因以促進(jìn)鑒定和/或選擇用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體所轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這些標(biāo)記基因能夠通過(guò)一系列不同原理鑒定核酸分子的成功轉(zhuǎn)移。合適的標(biāo)記可以選自賦予抗生素耐藥性或除草劑抗性、導(dǎo)入新代謝性狀或允許目視選擇的標(biāo)記。選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括賦予抗生素耐藥性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的叩tll或使潮霉素磷酸化的hpt或賦予對(duì)例如博來(lái)霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、氨節(jié)青霉素、慶大霉素、遺傳霉素(Geneticin)(G418)、壯觀霉素或殺稻瘟素的抗性的基因)、賦予除草劑抗性的基因(例如提供Basta⑧抗性的bar;提供草甘膦抗性的ar0A或gox或賦予對(duì)例如咪唑啉酮、膦絲菌素或磺脲類的抗性的基因)或提供代謝性狀的基因(如允許植物使用甘露糖作為唯一碳源的manA或利用木糖的木糖異構(gòu)酶或抗?fàn)I養(yǎng)標(biāo)記如2-脫氧葡萄糖抗性)。目視標(biāo)記基因的表達(dá)導(dǎo)致形成顏色(例如j5-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或P-半乳糖苷酶與其有色底物例如X-Gal)、發(fā)光(如縈光素/螢光素酶系統(tǒng))或熒光(綠色熒光蛋白GFP及其衍生物)。這個(gè)名單僅代表少數(shù)的可能標(biāo)記。技術(shù)人員熟悉此類標(biāo)記。取決于生物和選擇方法，優(yōu)選不同的標(biāo)記。已知當(dāng)核酸穩(wěn)定或瞬時(shí)整合至植物細(xì)胞時(shí)，僅小部分的細(xì)胞攝取外來(lái)DNA并且根據(jù)需要將其整合至細(xì)胞基因組，這取決于所用表達(dá)載體和使用的轉(zhuǎn)染技術(shù)。為鑒定并選擇這些整合子，通常將編碼選擇標(biāo)記(如上文所述之一)的基因連同目的基因一起導(dǎo)入宿主細(xì)胞。這些標(biāo)記可以在其中這些基因因例如常規(guī)方法所致的缺失而無(wú)功能的突變體中使用。此外，編碼選擇標(biāo)記的核酸分子可以導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，與在包含編碼本發(fā)明多肽或本發(fā)明方法中所用多肽的序列在同一載體上，或在單獨(dú)的載體上。已經(jīng)用導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以通過(guò)選擇進(jìn)行鑒定(例如具有整合的選擇標(biāo)記的細(xì)月包存活而其它細(xì)l包死亡)。因?yàn)橐坏┮呀?jīng)成功導(dǎo)入了核酸，則轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中不再需要或不希望有標(biāo)記基因，尤其抗生素耐藥性基因和除草劑抗性基因，因此用于導(dǎo)入核酸的本發(fā)明方法有利地使用能夠去掉或切除這些標(biāo)記基因的技術(shù)。一種如此方法稱作共轉(zhuǎn)化法。共轉(zhuǎn)化法使用同時(shí)用于轉(zhuǎn)化的兩種載體，一種載體攜帶本發(fā)明的核酸而另一種載體攜帶標(biāo)記基因。高比例的轉(zhuǎn)化體接受，或在植物的情況下，包含(高達(dá)40%或更多的轉(zhuǎn)化體)這兩種載體。在用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化的情況下，轉(zhuǎn)化體通常僅接受載體的一部分，即側(cè)翼有T-DNA的序列，它通常代表表達(dá)盒。標(biāo)記基因隨后可以通過(guò)進(jìn)行雜交而從轉(zhuǎn)化的植物中去掉。在另一種方法中，整合至轉(zhuǎn)座子的標(biāo)記基因用來(lái)與想要的核酸一起進(jìn)行轉(zhuǎn)化(稱作Ac/Ds技術(shù))。轉(zhuǎn)化體可以與轉(zhuǎn)座酶來(lái)源植物雜交或轉(zhuǎn)化體用導(dǎo)致轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的核酸構(gòu)建體瞬時(shí)或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化。在一些情況下(大約10%)，轉(zhuǎn)座子在已經(jīng)成功發(fā)生轉(zhuǎn)化時(shí)跳出宿主細(xì)胞的基因組并丟失。在其它更多情況下，轉(zhuǎn)座子跳至不同位置。在這些情況下，標(biāo)記基因必須通過(guò)進(jìn)行雜交而去除。在微生物學(xué)中，開(kāi)發(fā)了實(shí)現(xiàn)或促進(jìn)檢測(cè)這類事件的技術(shù)。又一個(gè)有利的方法依賴于重組系統(tǒng)；此方法的優(yōu)勢(shì)在于不必通過(guò)雜交去除。該類型的最知名系統(tǒng)稱作Cre/lox系統(tǒng)。Crel是去掉位于loxP序列之間序列的重組酶。若標(biāo)記基因整合于loxP序列之間，則通過(guò)重組酶表達(dá)已經(jīng)成功發(fā)生轉(zhuǎn)化時(shí)，標(biāo)記基因被去除。其它重組系統(tǒng)是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系統(tǒng)(Tribble等，丄Biol.Chem.,275，2000:22255-22267;Velmurugan等，J.CellBiol.，149,2000:553-566)。有可能將本發(fā)明核酸序列以位點(diǎn)特異性方式整合至植物基因組。這些方法自然也可以應(yīng)用至微生物如酵母、真菌或細(xì)菌。轉(zhuǎn)基因的/轉(zhuǎn)基因/重組為本發(fā)明目的，"轉(zhuǎn)基因的"、"轉(zhuǎn)基因"或"重組"就核酸序列而言意指包含此核酸序列的表達(dá)盒、基因構(gòu)建體或載體或用本發(fā)明的核酸序列、表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化的生物，這些構(gòu)建均通過(guò)重組方法產(chǎn)生，其中編碼用于本發(fā)明方法中的蛋白質(zhì)的核*列，或與本發(fā)明核酸序列有效連接的遺傳調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子，或a)和b)不處于其天然遺傳環(huán)境中或已經(jīng)通過(guò)遺傳操作方法修飾，修飾有可能采用例如置換、添加、缺失、倒位或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的形式。天然遺傳環(huán)境理解為意指來(lái)源植物中的天然基因組基因座或染色體基因座或在基因組文;^中存在。在基因組文庫(kù)的情況下，核酸序列的天然遺傳環(huán)境優(yōu)選地得到l呆留，至少部分地得以保留。該環(huán)境分布在核酸序列的至少一側(cè)并且具有至少50bp，優(yōu)選至少500bp,特別優(yōu)選至少1000bp，最優(yōu)選至少5000bp的序列長(zhǎng)度。天然存在的表達(dá)盒-例如核酸序列的天然啟動(dòng)子與編碼本發(fā)明方法中所用多肽的對(duì)應(yīng)核酸序列的天然存在的組合，如上文所定義-在這種表達(dá)盒通過(guò)非天然的合成("人工")方法(如誘變處理)而受到修飾時(shí)，變成轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。合適方法例如在US5,565,350或WO00/15815中描述。為本發(fā)明目的，轉(zhuǎn)基因植物因此如上理解為意指本發(fā)明方法中所用的核酸不位于所述植物基因組中該核酸的天然基因座內(nèi)，所述核酸有可能同源或異源地表達(dá)。然而如所提及，轉(zhuǎn)基因還意指盡管本發(fā)明核酸或在本發(fā)明方法中所用核酸處于植物基因組中該核酸的天然位置內(nèi)，然而其序列相對(duì)于天然序列而言已經(jīng)受到修飾，和/或所述天然序列的調(diào)節(jié)序列已經(jīng)受到修飾。轉(zhuǎn)基因^f尤選地理解為意指本發(fā)明核酸在基因組中的非天然基因座內(nèi)表達(dá)，即發(fā)生核酸的同源表達(dá)或優(yōu)選異源表達(dá)。在本文中提到了優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)化如本文中所提及的術(shù)語(yǔ)"導(dǎo)入"或"轉(zhuǎn)化"包括外源性多核苷酸轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞內(nèi)，無(wú)論用于轉(zhuǎn)化的方法是什么。能夠后續(xù)克隆性增殖(無(wú)論通過(guò)器官發(fā)生或胚胎發(fā)生)的植物組織可以用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化并且可以從中再生整林植物。選擇的具體組織將取決于可用于并且最適于正進(jìn)行轉(zhuǎn)化的具體物種的克隆性增殖系統(tǒng)。示例性組織靶包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、大配子體、愈傷組織、現(xiàn)存分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)和誘導(dǎo)的分生組織(例如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以瞬時(shí)或穩(wěn)定地導(dǎo)入宿主細(xì)胞并且可以非整合地維持，例如作為質(zhì)粒。備選地，多核苷酸可以整合至宿主基因組內(nèi)。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞隨后可以用來(lái)以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式再生出轉(zhuǎn)化植物。外來(lái)基因轉(zhuǎn)化至植物基因組內(nèi)稱作轉(zhuǎn)化。植物物種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在是相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利地，幾種轉(zhuǎn)化方法中的任一方法可以用來(lái)將目的基因?qū)牒线m的祖先細(xì)胞。用于從植物組織或植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)化并再生出植物所述的方法可以用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化或用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔法、增加游離DNA攝入的化學(xué)品、DNA直接注射至植物、粒子槍轟擊法、使用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化法和顯微投射法(microprojection)。轉(zhuǎn)化方法可以選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇法(Krens，F(xiàn).A.等，(1982)Nature296，72-74;NegrutiuI等(1987)PlantMolBiol8:363-373);原生質(zhì)體的電穿孔法(ShillitoR,D.等(1985)Bio/Techno13，1099-1102);對(duì)植物材料的微量注射法(OosswayA等，(1986)Mol.GenGenet202:179-185);DNA或RNA涂布的粒子轟擊法(KleinTM等，(1987)Nature327:70)、(非整合性)病毒感染法等。轉(zhuǎn)基因植物，包括轉(zhuǎn)基因作物植物，優(yōu)選地通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法產(chǎn)生。有利的轉(zhuǎn)化方法是在植物中(inplanta)的轉(zhuǎn)化法。為此目的，例如有可能使農(nóng)桿菌作用于植物種子或有可能用農(nóng)桿菌接種植物的分生組織。根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)證明使轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌混懸液作用于完整植物或至少作用于花原基是特別有利的。植物隨后繼續(xù)培育直至獲得所處理植物的種子(Clough和Bent，PlantJ.(1998)16，735-743)。用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻轉(zhuǎn)化的方法包括用于稻轉(zhuǎn)化的公知方法，如在任一以下文獻(xiàn)中描述的那些方法歐洲專利申請(qǐng)EP1198985Al，Aldemita和Hodges(Planta199:612-617，1996);Chan等(PlantMolBiol22(3):491-506,1993)，Hiei等(PlantJ6(2):271-282，1994)，其公開(kāi)內(nèi)容在本文中引入作為參考，如同完全給出那樣。在玉米轉(zhuǎn)化的情況下，優(yōu)選的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol14(6):745-50,1996)或Frame等(PlantPhysiol129(1):13-22,2002)描述，其^〉開(kāi)內(nèi)容在本文中如充分所述那樣引入作為參考。所述方法通過(guò)舉例方式進(jìn)一步由B.Jenes等,TechniquesforGeneTransfer,在TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,編者S.D.Kung和R.Wu，AcademicP腦(1993)128畫143及在PotrykusAnnu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表達(dá)的核酸或構(gòu)建體優(yōu)選地克隆至適于轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的載體，例如pBinl9(Bevan等，Nud.AcidsRes.12(1984)8711)。由這種載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌隨后可以按照已知方式用于轉(zhuǎn)化植物，例如作為才莫型使用的植物，如擬南芥(擬南芥屬于本發(fā)明的范圍，不視為作物植物)或作物植物，例如煙草植物，通過(guò)在農(nóng)桿菌溶液中浸泡擦傷的葉或切碎的葉并隨后將它們?cè)诤线m的培養(yǎng)基內(nèi)培育。植物通過(guò)根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化例如由HM"gen和Willmitzer在Nucl.AcidRes.(1988)16，9877中描述或尤其從F.F,White,VectorsforGeneTransferinHigherPlants;在TransgenicPlants,第1巻,EngineeringandUtilization,編者S.D.Kung和R.Wu,AcademicPress,1993,第15-38頁(yè)中獲知。除了轉(zhuǎn)化體細(xì)胞(其隨后必須再生成完整植物)之外，還有可能轉(zhuǎn)化植物分生組織的細(xì)胞及特別轉(zhuǎn)化發(fā)育成配子的那些細(xì)胞。在這種情況下，轉(zhuǎn)化的配子遵循天然的植物發(fā)育過(guò)程，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。因此，例如擬南芥種子用農(nóng)桿菌處理并且從發(fā)育植物中獲得種子，其中一定比例的所述植物受到轉(zhuǎn)化并且因此是轉(zhuǎn)基因的Feldman，KA和MarksMD(1987)MolGenGenet208:274-289;FeldmamiK(1992)。在編者CKoncz,N-HChua和JShell,MethodsinArabidopsisResearch.WordScientific,Singapore,第274-289頁(yè)j。替代性方法基于反復(fù)去掉花序并使蓮座葉叢中心中的切除部位與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌溫育，因而轉(zhuǎn)化的種子同樣可以在較晚的時(shí)間點(diǎn)獲得(Chang(1994)PlantJ.5:551-558;Katavic(1994)MolGenGenet,245:363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空滲入法，如"花浸染"法。在擬南芥真空滲入法的情況下，完整植物在減壓下用農(nóng)桿菌混懸液處理、燕麥、野燕麥、比贊燕麥、Avenafatuavar.sativa、雜種燕麥[oat]、兩色蜀黍高粱、粟j、稻、闊葉稻[稻j、玉蜀黍玉米、玉米j、普通小麥、硬粒小麥、圓柱小麥、Triticumhybernum、馬卡小麥、普通小麥(Triticumsativum)或普通小麥(Triticumvulgare)[小麥、面包小麥、普通小麥l;茄科(Solanaceae)如茄屬(Solanum)、番茄屬(Lycopersicon)例如馬鈴薯[馬鈴薯、番癡(Lycopersiconesculentum、Lycopersiconlycopersicum、Lycopersiconpyriforme、Solariumintegrifolium或Solanumlycopersicum)[西紅柿(tomato)j。如本文中所定義地術(shù)語(yǔ)"HAL3多肽"指屬于超家族HFCD(同源寡聚體含黃素的Cys脫羧酶；Kupke丄Biol.Chem.276，27597-27604，2001)的黃素蛋白。這些蛋白質(zhì)共有黃素結(jié)合基序、保守的活性部位殘基，并且是三聚體酶或十二聚體酶。HAL3蛋白質(zhì)優(yōu)選地從氨基端至羧基端包含(i)底物結(jié)合螺旋、(ii)插入性His基序、(iii)PXMNXXMW基序和(iv)底物識(shí)別夾(圖1)。預(yù)測(cè)這四個(gè)結(jié)構(gòu)域參與底物結(jié)合，插入性ffis基序包含參與活性部位的保守His殘基，而底物識(shí)別夾內(nèi)的序列可以在序列和長(zhǎng)度方面一定程度可變(Blaesse等，EMBOJ.19，6299-6310，2000)。結(jié)構(gòu)特征(i)-(iv)也在Kupke等(2001)中描述，其公開(kāi)內(nèi)容在本文中引入作為參考。一般，HAL3多肽能夠結(jié)合FMN輔因子。底物結(jié)合螺旋一般包含于具有以下共有序列(SEQIDNO:6)的序列基序1內(nèi)(k/R)pr(v/I)(I/l)laa(s/T)gsva(a/S)(畫/V)kf(g/E/A/S)(n/S/I)l(c/V/A)(h/R/G)(c/S/I)(f/L)(t/S/C)(e/D/Q)wa(e/D)v(r/K)av(v/A/S)。插入性His基序、PXMNXXMW基序和底物識(shí)別夾是具有以下共有序列(SEQIDNO:7)的序列基序2的部分vlhielr(r/K/Q)wad(WI/A)(l/M)(v/I)iaplsantl(g/A)kiagg(l/M)cdnlltc(i/V)(i/V),d(y/F)(t/S/N/D/K)kp(l/F/M/I)f(WA)apamnt(l/F)mw(n/s/T)npft(e/S/Q/A)(r/k)h(l/F/I)(xl)(X2)(l/i/m)(d/n/s)(e/l/q)(l/m)g(i/v/L)(t/s/a/i)l(i/v)pp(i/v/t)(k/t/s)k(r/t/k)lacgd(y/h)g(n/t)gam(a/s)e其中Xl可以是任一的氨基酸，優(yōu)選地XI是l、V、E、H、D、M、I或Q之一，并且其中X2可以是任一氨基酸，優(yōu)選X2是S、L、T、A或V之一。這些基序形成蛋白質(zhì)中一個(gè)更大保守區(qū)的部分，作為實(shí)例，擬南芥HAL3a的保守區(qū)作為SEQIDNO:8給出。用于本發(fā)明方法中的HAL3多肽以遞增優(yōu)選順序與由SEQIDNO:8代表的保守區(qū)具有至少65%、70%、75%、80%、85%、卯％或95%的序列同一性。HAL3蛋白質(zhì)中如在SEQIDNO:8中例舉并包含上文所述特征(i)至(iv)的保守區(qū)包括可以使用專門的數(shù)據(jù)庫(kù)加以鑒定的黃素蛋白結(jié)構(gòu)域，所述數(shù)據(jù)庫(kù)為例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864;Letunic等(2002)NucleicAcidsRes30,242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子序列基序的廣義圖譜語(yǔ)法及其在自動(dòng)化序列解釋中的功能.(在)ISMB-94;第二屆分子生物學(xué)智能系統(tǒng)國(guó)際會(huì)議文集.AltmanR.,BrutlagD.，KarpP.，LathropR.,SearlsD.編輯，第53-61頁(yè),AAAIPress,MenloPark;Hulo等，Nucl.Acids.Res.32:D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等，NucleicAcidsResearch30(1):276-280(2002))。這種FMN結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Pfam條目PF02441,InterPro條目IPR003382)—般存在于黃素蛋白酶內(nèi)。術(shù)語(yǔ)"結(jié)構(gòu)域"和"基序"在上文的"定義"部分內(nèi)定義。SEQIDNO:2中如SEQIDNO:8所代表的保守區(qū)也可以使用如本文中以上所述的用于比對(duì)序列用于比較的方法在其它HAL3蛋白質(zhì)中鑒定出來(lái)。在一些情況下，可以調(diào)整默認(rèn)參數(shù)以調(diào)節(jié)搜索的嚴(yán)格性。例如使用BLAST，可以提高用于報(bào)告針對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)序列的匹配的統(tǒng)計(jì)顯著性閾值(稱作"期望，，值)以顯示嚴(yán)格性較低的匹配。以這種方式，可以鑒定幾乎精確的短匹配，包括^床守基序1和2(SEQIDNO:6和7)，或任何位置上具有一個(gè)或多個(gè)保守性改變的匹配。HAL3多肽(至少以其天然形式)及它們的同源物通常催化4'-磷酸泛酰半胱氨酸脫羧為4'-磷酸泛酰巰基乙胺，這是輔酶A生物合成中的一個(gè)步驟，該反應(yīng)可以在生物化學(xué)分析法中測(cè)試；備選地，HAL3活性可以通過(guò)用dfp突變大腸桿菌(E.coli)菌抹的互補(bǔ)試驗(yàn)測(cè)定(K叩ke等2001;Yonamine等2004)。該酶也能夠使泛酰半胱氨酸脫羧成為泛酰半胱胺(pantothenoylcysteamine)。此夕卜，該蛋白質(zhì)參與對(duì)才直物賦予鹽脅迫耐受性和滲透脅迫耐受性，其中所述特性可以用于HAL3的生物測(cè)定法。(由SEQIDNO:l編碼的)SEQIDNO:2是HAL3多肽的實(shí)例，其中所述的HAL3多肽從氨基端至羧基端包含以下特征(i)底物結(jié)合螺旋、(ii)插入性His基序、(iii)PXMNXXMW基序和(iv)底物識(shí)別夾；并且以遞增優(yōu)選順序與SEQIDN():8所代表的保守區(qū)具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%或95。/。序列同一性。包含特征(i)至(iv)的HAL3多肽的其它實(shí)例在下文實(shí)施例部分的表A中給出。HAL3多肽的同源物也可以用來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法。同源物(或同源蛋白質(zhì))可以使用本領(lǐng)域眾所周知的慣用技術(shù)如通過(guò)序列比對(duì)輕易地鑒定。用于比對(duì)序列用于比較的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，此類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)JMolBioi48:443-453)以找到使匹配數(shù)最大化并使空位數(shù)最小化的兩個(gè)完整序列的比對(duì)。BLAST算法(Altschul等(1990)JMolBiol215:403-10)計(jì)算序列同一性百分?jǐn)?shù)并執(zhí)行對(duì)兩個(gè)序列間相似性的統(tǒng)計(jì)分6析。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件是公眾通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心可獲得的。同源物可以使用ClustaFW多重序列比對(duì)算法(1.83版本)例如以默認(rèn)配對(duì)比對(duì)參數(shù)和以百分?jǐn)?shù)計(jì)的評(píng)分方法輕易地鑒定。相似性和同一性的全局百分?jǐn)?shù)也可以使用在MatGAT軟件包中可獲得的方法之一而確定(Campanella等，BMCBioinfo醒tics.2003Jul10;4:29,MatGAT:使用蛋白質(zhì)或DNA序列而產(chǎn)生相似性/同一性矩陣的應(yīng)用)?？梢赃M(jìn)行細(xì)微手工編輯以優(yōu)化保守基序之間的比對(duì)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)。序列同一性值可以使用上文提及的程序，使用默認(rèn)參數(shù)在整個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(如上文所述)或在全長(zhǎng)的核酸或氨基酸序列上確定。同源物也包括直向同源物和旁系同源物。直向同源物和旁系同源物可以通過(guò)開(kāi)展所謂交互性blast搜索而容易地找到。這可以通過(guò)第一BLAST進(jìn)行，其中所述的第一BLAST包括提交查詢序列(例如SEQIDNO:l或SEQIDNO:2)用于針對(duì)任何序列數(shù)據(jù)庫(kù)(如公眾可用的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù))的BLAST搜索。當(dāng)從核苷酸序列開(kāi)始時(shí)，可以使用BLASTN或TBLASTX(使用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值)，并且當(dāng)從蛋白質(zhì)序列開(kāi)始時(shí)，可以使用BLASTP或TBLASTN(使用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值)。任選地可以篩選BLAST結(jié)果。隨后提交篩選結(jié)果和非篩選結(jié)果的全長(zhǎng)序列以針對(duì)來(lái)自生物的序列進(jìn)行第二次BLAST搜索(反向BLAST),其中查詢序列來(lái)自所述的生物(其中在查詢序列是SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的情況下，第二次BLAST因而將針對(duì)擬南芥序列)。隨后比較第一和第二BLAST搜索的結(jié)果。若來(lái)自第一次BLAST的高階位命中源自與衍生查詢序列的物種相同的物種，則鑒定到旁系同源物；若高階位命中不源自與查詢序列衍生的物種相同的物種，則鑒定到直向同源物。優(yōu)選的直向同源物是AtHAL3a(SEQIDNO:2)，A沮AL3b(SEQIDNO:10)的直向同源物或A但AL3b的長(zhǎng)形式(SEQIDNO:40)。高階位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，評(píng)分越顯著(或換句話說(shuō)，此命中被偶然發(fā)現(xiàn)的幾率越低)。E-值的計(jì)算是本領(lǐng)域眾所周知的。在大家族的情況下，可以使用ClustalW，隨后使用鄰接樹(shù)法以便幫助顯示相關(guān)基因的聚類和以便鑒定直向同源物和旁系同源物。除了E-值外，比較結(jié)杲也由同一性百分?jǐn)?shù)記分。同一性百分?jǐn)?shù)指兩個(gè)所比較的核酸(或多肽)序列之間在特定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的相同核苷酸(或氨基酸)數(shù)目。優(yōu)選地，HAL3多肽同源物與如SEQIDNO:2所代表的未修飾HAL3多肽以遞增優(yōu)選順序具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性或相似性(功能同一性)。優(yōu)選地，HAL3多肽同源物由如表A中提及的序列代表。用于本發(fā)明方法中的HAL3多肽可以是SEQIDNO:2的衍生物。"衍生物"包括這樣的肽、寡肽、多肽，其與蛋白質(zhì)的天然存在形式的氨基^列(如在SEQIDNO:2中所述的氨基酸序列)相比，包含非天然存在的氨基酸殘基對(duì)氨基酸的置換或非天然存在的氨基酸殘基的添加。如由表A中所列序列代表的蛋白質(zhì)衍生物是適用于本發(fā)明方法中的其他實(shí)例。編碼HAL3多肽的核酸的實(shí)例包括但不限于由表A中列出的序列所代表的那些核酸。編碼HAL3多肽的核酸的變體可以適用于本發(fā)明方法中。合適的變體包括編碼HAL3多肽的核酸和/或能夠與編碼HAL3多肽的核酸/基因雜交的核酸的部分。其它變體包括編碼HAL3多肽的核酸的剪接變體和等位變體。如本文中所定義的術(shù)語(yǔ)"部分"指編碼多肽的一段DNA,其中所述的多肽從氨基端至羧基端包含下列特征(i)底物結(jié)合螺旋、(ii)插入性His基序、(iii)PXMNXXMW基序和(iv)底物識(shí)別夾；并且與由SEQIDNO:8代表的保守區(qū)以遞增優(yōu)選順序具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的序列同一性。部分可以例如通過(guò)對(duì)編碼HAL3多肽的核酸產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)缺失而制備。所述的部分可以以分離的形式加以使用或它們可以與其它編碼性(或非編碼性)序列融合，以便例如產(chǎn)生結(jié)合幾種活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)與其它編碼序列融合時(shí)，翻譯時(shí)產(chǎn)生的所得多肽可以比對(duì)HAL3部分所預(yù)測(cè)的多肽更大。優(yōu)選地，所述的部分編碼這樣的多肽，其具有與SEQIDNO:2的HAL3多肽基本上相同的生物學(xué)活性。該部分一般是至少50、100、150或200個(gè)核苦酸長(zhǎng)度、優(yōu)選至少250、300、350或400個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、更優(yōu)選至少450、500、550、600或650個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。優(yōu)選地，所述的部分是由表A中列出的序列所代表的核酸的部分。最優(yōu)選地，此部分是如SEQIDNO:l所代表的核酸的部分。術(shù)語(yǔ)"片段"、"序列的片段"或"序列的部分"、"部分"或"其部分"意指所提及的原始序列的截短序列。截短序列(核酸序列或蛋白質(zhì)序列)可以在長(zhǎng)度上大幅地變化；最小尺寸是具有足夠尺寸的序列以對(duì)序列提供所提及的原始序列的至少相當(dāng)功能和/或活性或與本發(fā)明的或本發(fā)明方法中所用的核酸分子在嚴(yán)格條件下雜交，而最大尺寸并非關(guān)鍵的。在一些應(yīng)用中，最大尺寸通?；旧喜淮笥趯?duì)原始序列提供想要的活性和/或功能而需要的尺寸。相當(dāng)?shù)墓δ芤庵冈夹蛄兄辽?0%、45%或50%、優(yōu)選至少60%、70%、80%或90%或更高的功能。編碼用于本發(fā)明方法中的HAL3多肽的核酸的另一種變體是能夠在降低的嚴(yán)格性條件下、優(yōu)選在嚴(yán)格條件下與從如本文中先前所定義核酸中衍生的探針雜交的核酸，其中雜交序列編碼從氨基端至羧基端包含下列特征的多肽(i)底物結(jié)合螺旋、(ii)插入性His基序、(iii)PXMNXXMW基序和(iv)底物識(shí)別夾；并且與由SEQIDNO:8代表的保守區(qū)以遞增優(yōu)選順序具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的序列同一性。優(yōu)選地，雜交序列是能夠與如由表A中列出的序列所代表的核酸(或與從其中衍生的揮:針)或與任一種這些序列(靶序列)的一部分雜交的序列。最優(yōu)選地，雜交序列能夠與SEQIDNO:l(或與從其中衍生的探針)雜交。探針通常小于700bp或600bp長(zhǎng)度、優(yōu)選小于500、400bp、300bp、200bp或100bp長(zhǎng)度。通常，用于DNA-DNA雜交(如DNA印跡)的探針長(zhǎng)度在100與50bp之間變化，而在用于DNA-DNA雜交(如在PCR擴(kuò)增中)的探針中的雜交區(qū)域通常少于50個(gè)核苷酸但超過(guò)10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，它們優(yōu)選地是15、20、25、30、35、40、45或50bp長(zhǎng)度。HAL3多肽可以由剪接變體編碼。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"剪接變體"包含如此核酸序列的變體，在所述的核酸序列中已經(jīng)切下、替換、移位或添加所選擇的內(nèi)含子和/或外顯子，或其中內(nèi)含子已經(jīng)被縮短或加長(zhǎng)。此類變體將是其中保留蛋白質(zhì)的基本生物學(xué)活性的變體，這可以通過(guò)選擇性地保留蛋白質(zhì)的功能性區(qū)段而實(shí)現(xiàn)。此類剪接變體可以在自然界中找到或可以人工產(chǎn)生。用于產(chǎn)生此類剪接變體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。優(yōu)選的剪接變體是編碼HAL3多肽的核酸的剪接變體，其中所述的HAL3多肽從氨基端至羧基端包含(i)底物結(jié)合螺旋、(ii)插入性His基序、(iii)PXMNXXMW基序和(iv)底物識(shí)別夾；并且與由SEQIDNO:8代表的保守區(qū)以遞增優(yōu)選順序具有至少65%、70%、75%、80%、85%、卯％或95%的序列同一性。編碼包含如本文中以上所定義特征的HAL3多肽的核酸的其它優(yōu)選剪接變體是如表A中列出的任何一種序列所代表的核酸的剪接變體。最優(yōu)選是如SEQIDN():l所代表的核酸序列的剪接變體。HAL3多肽也可以由編碼多肽的核酸的等位變體編碼，其中所述的多肽從氨基端至羧基端包含(i)底物結(jié)合螺旋、(ii)插入性His基序、(iii)PXMNXXMW基序和(iv)底物識(shí)別夾；并且與由SEQIDNO:8代表的保守區(qū)以遞增優(yōu)選順序具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的序列同一性。編碼包含如本文中以上所定義特征的HAL3多肽的核酸的優(yōu)選等位變體是如表A中列出的任何一種序列所代表的核酸的等位變體。最優(yōu)選是如SEQIDNO:l所代表的核酸序列的等位變體。定向進(jìn)化(或基因改組作用)也可以用來(lái)產(chǎn)生編碼HAL3多肽的核酸的變體。位點(diǎn)定向誘變可以用來(lái)產(chǎn)生編碼HAL3多肽的核酸的變體。幾種方法可用于實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)定向誘變，最常見(jiàn)的是基于PCR的方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley編輯)。編碼HAL3多肽的核酸可以來(lái)自任何自然來(lái)源或人工來(lái)源。核酸可以根據(jù)其天然形式就組成和/或基因組環(huán)境方面通過(guò)人類有意操作而加以修飾。HAL3核酸優(yōu)選地來(lái)自植物，還優(yōu)選來(lái)自雙子葉植物，更優(yōu)選來(lái)自十字花科，該核酸最優(yōu)選地來(lái)自擬南芥。編碼HAL3多肽的核酸的增加的表達(dá)、優(yōu)先在植物苗中增加的表達(dá)可通過(guò)導(dǎo)入遺傳修飾(優(yōu)選地在HAL3基因的基因座中)而實(shí)施。如本文中所定義的基因的基因座意指這樣的基因組區(qū)域，其包括目的基因和編碼區(qū)上游或下游IOKB。遺傳修飾可以例如通過(guò)以下方法的任一種(多種)導(dǎo)入T-DNA激活法、TILLING和同源重組法(如在"定義"部分中描述)或通過(guò)引入并且優(yōu)先增加編碼HAL3多肽的核酸在植物的擴(kuò)張組織中表達(dá)而導(dǎo)入。在導(dǎo)入遺傳修飾后，隨后進(jìn)行任選步驟，即選擇編碼HAL3因子多肽的核酸優(yōu)先在擴(kuò)張組織中增加的表達(dá)，其中增加的表達(dá)產(chǎn)生具有增加的產(chǎn)量的植物。T-DNA激活標(biāo)簽化產(chǎn)生因靠近所導(dǎo)入啟動(dòng)子的基因的改良表達(dá)而表現(xiàn)顯性表型的轉(zhuǎn)基因植物。待導(dǎo)入的啟動(dòng)子可以是能夠增加編碼HAL3多肽的核酸優(yōu)先在植物的擴(kuò)張組織中表達(dá)的任一啟動(dòng)子。也可以使用TILLING(基因組內(nèi)定向誘導(dǎo)的局部損傷)技術(shù)在編碼HAL3多肽的基因的基因座內(nèi)導(dǎo)入遺傳修飾。攜帶此類突變變體的植物優(yōu)先在擴(kuò)張性植物組織中具有編碼HAL3多肽的核酸的增加的表達(dá)。T-DNA激活法和TILLING是能夠產(chǎn)生遺傳修飾(包括優(yōu)先增加編碼HAL3多肽的核酸在植物的擴(kuò)張組織中表達(dá))的技術(shù)實(shí)例。本發(fā)明的作用也可以使用同源重組法再現(xiàn)。待靶向的核酸優(yōu)選地是控制編碼HAL3多肽的核酸在植物中天然表達(dá)的區(qū)域。對(duì)于苗中表達(dá)特異性的弱啟動(dòng)子被導(dǎo)入這個(gè)區(qū)域，部分地替換該區(qū)域或基本上完全替換它。用于導(dǎo)入遺傳修飾(所述遺傳修飾在這種情況下不需要位于HAL3基因的基因座內(nèi))的優(yōu)選方法是導(dǎo)入并在植物苗中優(yōu)先表達(dá)編碼如本文中以上所定義的HAL3多肽的核酸。待導(dǎo)入植物的核酸可以是全長(zhǎng)核酸或可以是如本文中前述定義的部分或雜交序列或另一種核酸變體。本發(fā)明方法依賴于編碼HAL3多肽的核酸優(yōu)先在植物苗組織中、優(yōu)選在營(yíng)養(yǎng)枝的細(xì)胞擴(kuò)張帶中增加的表達(dá)。本發(fā)明還提供遺傳構(gòu)建體和載體以促進(jìn)導(dǎo)入和/或在苗中、優(yōu)選在植物苗的擴(kuò)張組織中優(yōu)先表達(dá)用于本發(fā)明方法中的核酸序列。因而，提供基因構(gòu)建體，其包含編碼如上文所定義的HAL3多肽的核酸；與(i)的核酸有效連接的一種或多種調(diào)控序列，其中至少一種是苗特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明方法中所用的構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建。該基因構(gòu)建體可以插入適于轉(zhuǎn)化至植物內(nèi)并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因的可以商購(gòu)的載體。本發(fā)明因而提供如上文所定義的基因構(gòu)建體在本發(fā)明方法中的用途。植物用包含目的序列(即編碼HAL3多肽的核酸)的載體轉(zhuǎn)化。技術(shù)人員非常了解為成功轉(zhuǎn)化、選擇和增殖含有目的序列的宿主細(xì)胞而必須于載體上存在的遺傳元件。目的序列與一種或多種調(diào)控序列(至少與啟動(dòng)子)有效連接。通常已知在植物中有功能的合適啟動(dòng)子。它們可以采取組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的形式。合適的啟動(dòng)子可以使多細(xì)胞真核生物中的發(fā)育特異性和/或組織特異性表達(dá)成為可能；因此可以在植物中有利地使用葉-、根-、花-、種子-、氣孔-、塊莖-或果實(shí)特異性啟動(dòng)子。可用于植物中的不同植物啟動(dòng)子是這樣的啟動(dòng)子，例如USP、LegB4-、DC3啟動(dòng)子或來(lái)自芽菜(parsley)的遍在蛋白啟動(dòng)子。為在植物中表達(dá)，如上所述，核酸分子必須與合適啟動(dòng)子有效連接或包含此啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子使基因在正確的時(shí)間點(diǎn)上并以細(xì)胞或組織特異性方式表達(dá)?？捎玫膯?dòng)子是組成型啟動(dòng)子(Benfey等，EMBOJ.8(1989)2195-2202),如源自植物病毒的那些組成型啟動(dòng)子，如35SCAMV(Franck等，Cell21(1980)285-294)、19SCaMV(見(jiàn)alsoUS5352605和WO84/02913)、34SFMV(Sanger等，Plant.Mol.Biol.,14,1990:433-443)、,菜遍在蛋白啟動(dòng)子或如在US4,962,028中描述的植物啟動(dòng)子如Rubisco小亞基啟動(dòng)子或植物啟動(dòng)子PRPl[Ward等，Plant.Mol,Biol.22(1993)、SSU、PGELl、OCSLeisner(1988)ProcNatlAcadSciUSA85(5):2553-2557]、lib4、usp、masComai(1990)PlantMolBiol15(3):373-381]、STLS1、ScBV(Schenk(1999)PlantMolBiol39(6):1221-1230)、B33、SAD1或SAD2(flax啟動(dòng)子，ain等，CropScience,39(6)、1999:1696-1701)或nosShaw等(1984)NucleicAcidsRes.12(20):7831-7846j。組成型植物啟動(dòng)子的其它實(shí)例是甜菜V-ATP酶啟動(dòng)子(WO01/14572)。合成的組成型啟動(dòng)子實(shí)例是超級(jí)啟動(dòng)子(WO95/14098)和從G-盒中衍生的啟動(dòng)子(WO94/12015)。根據(jù)需要，還可以進(jìn)一步使用化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，比較EP-A388186、EP-A335528、WO97/06268。本發(fā)明蛋白質(zhì)在植物中的穩(wěn)定組成型表達(dá)可以是有利的。然而若在收獲前的晚期表達(dá)是有利的，則本發(fā)明多肽的誘導(dǎo)型表達(dá)是有利的，因?yàn)榇x性操作可以導(dǎo)致植物生長(zhǎng)遲緩。也可以通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子促進(jìn)植物基因的表達(dá)(綜述，見(jiàn)Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.,48:89-108)。當(dāng)需要以時(shí)間特異性方式表達(dá)基因時(shí)，化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是特別適用的。此類啟動(dòng)子的實(shí)例是水楊酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO95/19443)和脫落酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(EP335528)、四環(huán)素-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz等(1992)PlantJ.2，397-404)、環(huán)己醇-或乙醇-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO93/21334)或如本文中所述的其它化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。其它的合適啟動(dòng)子是對(duì)生物性脅迫或非生物性脅迫條件反應(yīng)的那些啟動(dòng)子，例如病原體資導(dǎo)型PRP1基因啟動(dòng)子(Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、番茄熱誘導(dǎo)型hsp80啟動(dòng)子(US5,187,267)、馬鈴薯寒冷誘導(dǎo)型a-淀粉酶啟動(dòng)子(WO96/12814)或傷口誘導(dǎo)型pinll啟動(dòng)子(EP-A-O375091)或如本文中所述的其它啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子尤其是在組織及器官中、在種子細(xì)胞如胚乳細(xì)胞及發(fā)育胚的細(xì)胞中引起基因表達(dá)的那些啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子是油菜的油菜籽蛋白基因啟動(dòng)子(US5,608,152)、蠶豆(Viciafaba)USP啟動(dòng)子(Baeumlein等，MolGenGenet，1991，225(3):459-67)、擬南芥油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(WO98/45461)、菜豆(Phaseolusvulgaris)菜豆蛋白啟動(dòng)子(US5，504，200)、蕓莒屬植物(Brassica)Bce4啟動(dòng)子(WO91/13980)、豆類arc5啟動(dòng)子、胡蘿卜DcG3啟動(dòng)子或豆科植物(Legumin)B4啟動(dòng)子(LeB4;Baeumlein等，1992,PlantJournal,2(2):233-9)和導(dǎo)致在單子葉植物如玉米、大麥、小麥、黑麥、稻等內(nèi)的種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。有利的種子特異性啟動(dòng)子是蔗糖結(jié)合蛋白啟動(dòng)子(WO00/26388)、菜豆蛋白啟動(dòng)子和油菜籽蛋白啟動(dòng)子。必須加以考慮的合適啟動(dòng)子是大麥lpt2或lptl基因啟動(dòng)子(WO95/15389和WO95/23230)和在WO99/16890中描述的啟動(dòng)子(來(lái)自大麥的大麥醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麥的麥醇溶蛋白基因、小麥的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麥的谷蛋白基因、高粱kasirin基因和黑麥的棵麥醇溶蛋白基因的啟動(dòng)子)。其它合適的啟動(dòng)子是Amy32b、Amy6-6和Aleurain[US5,677,474、Bce4(油菜)[US5，530，149j、大豆球蛋白(大豆)[EP571741J、磚酸烯醇式丙酮酸羧化酶(大豆)JP06/62870j、ADR12-2(大豆)WO98/08962j、異檸檬酸裂合酶(油菜)[US5，689，040j或a-淀粉酶(大麥)EP781849j?？捎糜谠谥参镏斜磉_(dá)基因的其它啟動(dòng)子是葉特異性啟動(dòng)子，如在DE-A19644478中描述的那些啟動(dòng)子或光調(diào)節(jié)啟動(dòng)子如，例如豌豆petE啟動(dòng)子。其它合適的植物啟動(dòng)子是胞質(zhì)溶膠FBP酶啟動(dòng)子或馬鈴薯ST-LSI啟動(dòng)子(Stockhaus等，EMBOJ.8,1989,2445)、大豆磷酸核糖基焦磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子(GenBank登錄號(hào)U87999)或在EP-A-0249676中描述的節(jié)特異性啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼HAL3多肽的核酸序列與苗特異性啟動(dòng)子有效連接。苗特異性啟動(dòng)子指能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在植物營(yíng)養(yǎng)枝組織中表達(dá)的任一啟動(dòng)子。優(yōu)選地，苗特異性啟動(dòng)子能夠優(yōu)先驅(qū)動(dòng)目的基因在營(yíng)養(yǎng)枝的擴(kuò)張組織中，即在營(yíng)養(yǎng)枝的細(xì)胞擴(kuò)張帶中表達(dá)。在本文中對(duì)"優(yōu)先"驅(qū)動(dòng)在苗中表達(dá)的引用意指驅(qū)動(dòng)與苗特異性啟動(dòng)子有效連接的任一序列在營(yíng)養(yǎng)枝的細(xì)胞擴(kuò)張帶中表達(dá)，以至于基本上排除在植物內(nèi)其它部位中驅(qū)動(dòng)表達(dá),除了因泄露性啟動(dòng)子表達(dá)所致的任何殘留表達(dá)之外。苗特異性啟動(dòng)子可以天然啟動(dòng)子或合成的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，苗特異性啟動(dòng)子是從p-擴(kuò)展蛋白基因中分離的啟動(dòng)子，如稻P擴(kuò)展蛋白EXBP9啟動(dòng)子(WO2004/070039)，如SEQIDNO:5代表，或與稻卩擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子具有相似強(qiáng)度的啟動(dòng)子和/或與稻|3擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子具有相似表達(dá)模式的啟動(dòng)子(即功能等效的啟動(dòng)子)。應(yīng)當(dāng)明白本發(fā)明的適用性不限于編碼由SEQIDNO:l代表的HAL3多肽的核酸，同時(shí)本發(fā)明的適用性也不限于由p擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)編碼HAL3多肽的核酸的表達(dá)。任選地，一種或多種終止子序列(也是調(diào)控序列)可以在導(dǎo)入植物的構(gòu)建體中使用。額外的調(diào)節(jié)元件可以包括轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子以及翻譯增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道可以在實(shí)施本發(fā)明中適用的終止子序列和增強(qiáng)子序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道或可以輕易地獲得此類序列。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括需要用于在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制的復(fù)制序列起點(diǎn)。一個(gè)實(shí)例是當(dāng)需要將遺傳構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中維持為附加型遺傳元件(例如質(zhì)?；蛘沉７肿?時(shí)。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括，但不限于fl-ori和colEl。其它調(diào)控序列(除啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、內(nèi)含子序列、3，UTR和/或5，UTR區(qū)之夕卜)可以是蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定元件。為檢測(cè)和/或選擇如在序列方案中描述及在本發(fā)明方法中使用的核酸序列的成功轉(zhuǎn)移，使用標(biāo)記基因(二報(bào)道基因)是有利的。這些標(biāo)記基因能夠通過(guò)一系列不同原理而鑒定核酸分子的成功轉(zhuǎn)移，例如借助熒光、發(fā)光或在人眼睛可覺(jué)察的光的波長(zhǎng)范圍內(nèi)通過(guò)目測(cè)鑒定、通過(guò)除草劑抗性或抗生素耐藥性、通過(guò)所謂營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記(營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記)或抗?fàn)I養(yǎng)性標(biāo)記、通過(guò)酶分析法或通過(guò)植物激素。可以提及的此類標(biāo)記的實(shí)例是GFP(=綠色熒光蛋白)；螢光素/螢光素酶系統(tǒng)、p-半乳糖苷酶與其有色底物例如X-Gal、對(duì)例如咪唑啉酮、草甘膦、膦絲菌素或磺脲類的除草劑抗性、對(duì)例如博來(lái)霉素、潮霉素、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、遺傳霉素(G418)、壯觀霉素或殺稻瘟素等的抗生素耐藥性、營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記如對(duì)甘露糖或木糖的利用或抗?fàn)I養(yǎng)性標(biāo)記如對(duì)2-脫氧葡萄糖的抗性。這個(gè)名單僅代表少數(shù)的可能標(biāo)記。技術(shù)人員非常熟悉此類標(biāo)記。取決于生物和選擇方法，優(yōu)選不同的標(biāo)記。本發(fā)明也包括通過(guò)本發(fā)明方法可獲得的植物。本發(fā)明因而提供通過(guò)本發(fā)明方法可獲得的植物、植物部分或其植物細(xì)胞，其中植物或其部分或細(xì)胞包含在苗特異性啟動(dòng)子控制下的編碼HAL3多肽的核酸轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明也提供用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增加產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在^1物苗中導(dǎo)入并優(yōu)先表達(dá)編碼HAL3多肽的核酸。宿主植物對(duì)于本發(fā)明方法中所用的核酸或載體、表達(dá)盒或構(gòu)建體或載體而言原則上有利地是能夠合成本發(fā)明方法中所用多肽的所有植物。更具體地，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生具有增加產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括在植物苗中導(dǎo)入并優(yōu)先表達(dá)編碼HAL3多肽的核酸；和在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。核酸可以直接導(dǎo)入植物細(xì)胞或?qū)胫参锉旧?包括導(dǎo)入組織、器官或植物的任何其它部分)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，核酸優(yōu)選地通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入植物。外來(lái)基因至#_物基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)移稱作轉(zhuǎn)化。在進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，用于轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化。為了選^轉(zhuǎn)化的植物，在轉(zhuǎn)化中獲得的植物材料原則上接受i擇條件處理，以至于轉(zhuǎn)化的植物可以與未轉(zhuǎn)化的植物區(qū)分。例如，以上文所述方式獲得的種子可以播種，在初始培育時(shí)期后，通過(guò)噴霧進(jìn)行合適的選擇。又一種可能性包括在使用合適選擇劑的瓊脂平板上生長(zhǎng)種子(根據(jù)需要在消毒之后)，使得僅轉(zhuǎn)化的種子可以生長(zhǎng)成植物。其它有利的轉(zhuǎn)化方法(尤其用于植物)是技術(shù)人員已知的并且在下文中描述。通常在轉(zhuǎn)^^后，對(duì)植物細(xì)胞或細(xì)胞群體選擇一種或多種標(biāo)記的存在，其中所述的標(biāo)i己由與目的基因一起共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)的基因編碼，隨后將轉(zhuǎn)化的材料再生成整林植物。如所提及，用本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌也可以以本身已知的方式用于轉(zhuǎn)化植物如實(shí)驗(yàn)植物例如擬南芥或作物植物，例如谷物、玉米、燕麥、黑麥、大麥、小麥、大豆、稻、棉花、甜菜、油菜、向日葵、亞麻(flax)、大麻(hemp)、馬鈴薯、煙草、番茄、胡蘿卜、燈籠椒(bellpepper)、油菜、木薯(tapioca、cassava)、竹芋(arrowroot)、萬(wàn)壽菊、苜莆、萵苣(Iettuce)和多種樹(shù)、堅(jiān)果植物和藤本植物物種，特別是含油的作物植物如大豆、花生(peanut)、蓖麻(castor-oilPlant)、向曰葵、玉米、棉花、亞麻、油菜、椰子、油椰、紅花或可可豆，例如通過(guò)在農(nóng)桿菌溶液中浸泡擦傷的葉或葉段并且隨后在合適培養(yǎng)基內(nèi)培育它們。除了轉(zhuǎn)化體細(xì)胞(隨后必須再生成完整植物)之外，還有可能轉(zhuǎn)化植物分生組織的細(xì)胞及特別轉(zhuǎn)化發(fā)育成配子的那些細(xì)胞。在這種情況下，轉(zhuǎn)化的配子遵循天然的植物發(fā)育過(guò)程，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。因此，例如擬南芥種子用農(nóng)桿菌處理并且從發(fā)育植物中獲得種子，其中一定比例的所述植物受到轉(zhuǎn)化并且因此是轉(zhuǎn)基因的IFeldman，KA和MarksMD(1987)MolGenGenet208:274-289;FeldmannK(1992)。在編者CKoncz，N-HChua和JShell,MethodsinArabidopsisResearch.WordScientific,Singapore,第274-289頁(yè)j。替代性方法基于反復(fù)去掉花序并使蓮座葉叢中心中的切除部位與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌溫育，因而轉(zhuǎn)化的種子同樣可以在較晚的時(shí)間點(diǎn)獲得(Chang(1994)PlantJ.5:551-558;Katavic(1994)MolGenGenet，245:363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空滲入法，如"花浸染"法。在擬南芥真空滲入法的情況下，完整植物在減壓下用農(nóng)桿菌混懸液處理XM—549862.11稻(日本栽培種-gro247le-105gi|58530787|dbj|AP008207.1|稻(日本栽培種-g…2632e-68gi|17385651|dbj|AP002845.3|稻(日本栽培種-g...2632e-68gi|32980356|dbj|AK070332.1|稻(日本栽培種-g,.,2519e-65gi|34894135|ref|NM—183504.1|稻(日本栽培種-gro1373e-30gi|15293050|gb|AY050959.1|擬南芥未知蛋白質(zhì)80.16e-16gi|79340923|ref|NM_100934.2|擬南芥轉(zhuǎn)錄…87.82e-15gi|58531195|dbj|AP008214.1|稻(日本栽培種-g…51.64e-13gi|42408246|dbj|AP004557.3|稻(日本栽培種-g…51.64e-13gi|42408168|dbj|AP004376.3|稻(日本栽培種-g...51.64e-13gi|22328837|ref]NM_118215.2|擬南芥DNA結(jié)合...78.2le-12gi)7268888|emb(AL1615542|ATCHWV54擬南芥DNAchr77.82e-12gi|5262774|emb|AL080282.1|ATT13K14擬南芥DNAc…77.82e-12gi|50906596|ref|XM—464787.11稻(日本栽培種-gro77.03e-12實(shí)施例34:確定bHLH轉(zhuǎn)錄因子之間的全局相似性和同一性bHLH多肽之間的全局相似性百分?jǐn)?shù)和同一性百分?jǐn)?shù)使用本領(lǐng)域可MatGAT軟件(BMCBioinformatics,20034:29.MatGAT:使用蛋白質(zhì)序列或DNA序列產(chǎn)生相似性/同一性矩陣的應(yīng)用.CampanellaJJ,BitinckaL,SmalleyJ)加以確定。MatGAT軟件產(chǎn)生針對(duì)DNA序列或蛋白質(zhì)序列的相似性/同一性矩陣，無(wú)需數(shù)據(jù)的預(yù)比對(duì)。該程序執(zhí)行一系列配對(duì)比對(duì)，計(jì)算相似性和同一性并且隨后將結(jié)果置于距離矩陣中。比較中所用的參數(shù)是記分矩陣Blosum62第一空位12延伸性空位2結(jié)果在圖19a中顯示。實(shí)施例35:確定在bHLH多肽中的bHLH結(jié)構(gòu)域之間的全局相似性和同一性bHLH結(jié)構(gòu)域使用SMART軟件(Schultz等(1998)iVoc7Vfl"tAS^95,5857-5864;Letunic等(2006)Nucl"V34，D257-D260)作圖。Smart軟件可通過(guò)EMBL研究所(歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL)獲得。下文給出所用bHLH結(jié)構(gòu)域的序列。hv一bh:lhos—np—908393—bhlh〇S—NP_908397.1BHLHKGRIDE〇s_XP—464787.1BHLHAEYIRQTQERVDMAT1G10585—bHLHnlrekdrrmrmkhlfsilsshvsptrklpvphlidqatsymiqlkenvnyAt4g20970—bHLH在bHLH多肽的bHLH結(jié)構(gòu)域之間全局相似性百分?jǐn)?shù)和同一性百分?jǐn)?shù)使用在實(shí)施例34中描述的軟件和參數(shù)確定。結(jié)果在圖19b中顯示。實(shí)施例36:克隆本發(fā)明方法中所用核酸序列本發(fā)明方法中所用的核酸序列通過(guò)PCR，使用定制的稻幼苗cDNA文庫(kù)(Invitrogen,Paisley,UK)作為模板而擴(kuò)增。在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用HifiTaqDNA聚合酶，利用在50plPCR混合物中的200ng模板進(jìn)行PCR。所用的引物是prm06808(SEQIDNO:231;有義，起始密碼子為粗體字，AttBl位點(diǎn)是斜體字5，-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaagagcaggaagaacagc3，)和prm06809(SEQIDNO:232;反義，互補(bǔ)，AttB2位點(diǎn)是斜體字5，ggggaccactttgt織agaaagctgggtgcagagtg纖gagtggtgtg3，)，其中所述的《1物包括用于Gateway重組的AttB位點(diǎn)。擴(kuò)增的PCR片段也使用標(biāo)準(zhǔn)方法予以純化。隨后實(shí)施Gateway方法的第一步驟，即BP反應(yīng)，在此期間PCR片段與pDONR201質(zhì)粒發(fā)生體內(nèi)重組以產(chǎn)生根據(jù)Gateway命名的"進(jìn)入克隆"，pbHLH。質(zhì)粒pDONR201作為Gateway⑧技術(shù)的構(gòu)成部分從Invitrogen購(gòu)買。實(shí)施例37:表達(dá)載體構(gòu)建進(jìn)入克隆p076隨后在LR反應(yīng)中與pGOS2(—種用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體)使用。這種載體在T-DNA邊界內(nèi)含有作為功能性元件的植物選擇標(biāo)記；篩選標(biāo)記表達(dá)盒和意圖與已經(jīng)克隆于所述進(jìn)入克隆中的目的核^列發(fā)生LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于組成型表達(dá)的稻GOS2啟動(dòng)子(SEQIDNO:233,備選地，SEQIDNO:230是同樣有用的)(內(nèi)部參考號(hào)PR0129)位于這種Gateway盒的上游。在LR重組步驟后，將產(chǎn)生的表達(dá)載體pGOS2::bHLH(圖20)轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌林LBA4044并隨后轉(zhuǎn)化至稻植物。實(shí)施例38:植物轉(zhuǎn)化稻轉(zhuǎn)化含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌獨(dú)立地用來(lái)轉(zhuǎn)化稻植物。將稻的日本栽培種Nipponbare的成熟干燥種子脫殼。通過(guò)在70%乙醇中溫育一分鐘，隨后在2%HgCl2中30分鐘，隨后用無(wú)菌蒸餾水洗滌6次15分鐘而實(shí)施消毒。消毒的種子隨后在含有2，4-D的培養(yǎng)基(愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上萌發(fā)。在黑暗中溫育4周后，將來(lái)自小盾片的愈傷組織切下并在同一種培養(yǎng)基上增殖。2周后，愈傷組織通過(guò)在同一種培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)另外2周而繁殖或增殖。胚發(fā)生性愈傷組織片在新鮮培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)3日，之后共培育(以增強(qiáng)細(xì)胞分裂活性)。含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌林LBA4404用于共培育。農(nóng)桿菌接種在含有適宜抗生素的AB培養(yǎng)基上并在28°C培養(yǎng)3日。隨后將細(xì)菌收集并重懸在液體共培育培養(yǎng)基中至密度(OD6。o)約1。將混懸液隨后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)m并將愈傷組織在該混懸液內(nèi)浸泡15分鐘。愈傷組織組織隨后在濾紙上吸干并轉(zhuǎn)移至固化的共培育培養(yǎng)基上并且在黑暗中于25。C溫育3日。共培育的愈傷組織在黑暗中于28°C在選擇劑存在下于含有2，4-D的培養(yǎng)基上培育4周。在此時(shí)段期間，形成迅速生長(zhǎng)的抗性愈傷組織島。在這種材料轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基并在光線下溫育后，胚發(fā)生潛力釋放并且苗在隨后4-5周發(fā)育。將苗從愈傷組織中切下并且在含有植物生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上溫育2-3周，其中將苗從所述的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移至土壤。硬化的苗在高濕度和短日照下于溫室中培育。對(duì)于一個(gè)構(gòu)建體，產(chǎn)生大約30個(gè)獨(dú)立T0稻轉(zhuǎn)化體。將原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至溫室。在定量PCR分析以驗(yàn)證T-DNA插入物的拷貝數(shù)后，僅保留表現(xiàn)選擇劑耐受性的單拷貝轉(zhuǎn)基因植物用于收獲Tl種子。種子隨后在移植后3-5月收獲。本方法以超過(guò)50%的比率產(chǎn)生單一基因座轉(zhuǎn)化體(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。玉米轉(zhuǎn)化玉米的轉(zhuǎn)化才艮據(jù)對(duì)hhida等(1996,NatureBiotech14745-50)描述方法的改良方法進(jìn)行。在玉米中的轉(zhuǎn)化是基因型依賴的并且僅特定的基因型可操作用于轉(zhuǎn)化和再生。近交系A(chǔ)188(明尼蘇達(dá)大學(xué))或以A188作為親本的雜種是用于轉(zhuǎn)化的供體材料的良好來(lái)源，但是其它基因型也可以成功地使用。玉米穗從玉米植物中在授粉后大約11日(DAP)收獲，此時(shí)不成熟胚的長(zhǎng)度是大約1至1.2mm。不成熟胚與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培育并且轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)器官發(fā)生而恢復(fù)。切下的胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上、隨后在玉米再生培養(yǎng)基上培育，其中所述的再生培養(yǎng)基含有選擇劑(例如咪唑啉酮，但可以使用多種選擇標(biāo)記)。培養(yǎng)板在25。C于光照下培養(yǎng)2-3周，或直至苗發(fā)育。將綠色苗從每個(gè)胚轉(zhuǎn)移至玉米生根培養(yǎng)基并在25°C培養(yǎng)2-3周，直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝的T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生Tl種子。小麥轉(zhuǎn)化小麥的轉(zhuǎn)化用Ishida等Ishida等(1996)NatureBiotech14(6):745-50描述的方法進(jìn)行。通常在轉(zhuǎn)化中使用(可從墨西哥CIMMYT獲得的)栽培品種Bobwhite。不成熟胚與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培育并且轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)器官發(fā)生而恢復(fù)。在與農(nóng)桿菌溫育后，胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上、隨后在再生培養(yǎng)基上體外培育，其中所述的再生培養(yǎng)基含有選擇劑(例如咪唑啉酮，但可以使用多種選擇標(biāo)記)。培養(yǎng)平板在25。C于光照下培養(yǎng)2-3周，或直至苗發(fā)育。將綠色苗從每個(gè)胚轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基并在25。C培養(yǎng)2-3周，直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝的T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生Tl種子。大豆轉(zhuǎn)化根據(jù)對(duì)TexasA&M美國(guó)專利5,164,310中所述方法的改良方法轉(zhuǎn)化大豆。幾個(gè)商業(yè)大豆品種對(duì)于通過(guò)這種方法的轉(zhuǎn)化是可行的。栽培品種Jack(從Illinois種子基金會(huì)可獲得)通常用于轉(zhuǎn)化。對(duì)大豆種子消毒以便體外播種。從7日齡幼苗中切下下胚軸、胚根和一片子葉。進(jìn)一步培育上胚軸和余下的子葉以發(fā)育腋生節(jié)。將這些腋生節(jié)切下并與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌溫育。在共培育處理之后，將外植體洗滌并轉(zhuǎn)移至逸擇培養(yǎng)基。將再生的苗切下并置于苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上。將長(zhǎng)度不超過(guò)lcm的苗置于生根培養(yǎng)基上直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有羊拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生Tl種子。油菜籽/卡諾拉油菜轉(zhuǎn)化使用5-6日齡幼苗的子葉柄和下胚軸作為用于組織培養(yǎng)的外植體并且根據(jù)Babic等(1998，PlantCellRep17:183-188)轉(zhuǎn)化。商業(yè)栽培品種Westar(AgricultureCanada)是用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)品種，但是也可以使用其它品種。對(duì)卡諾拉油菜種子作表面消毒以便體外播種。從體外幼苗中切下具有附著子葉的子葉柄外植體，并以(含有表達(dá)載體的)農(nóng)桿菌通過(guò)葉柄外植體的切口端浸入細(xì)菌混懸液而接種。外植體隨后在含有3mg/1BAP、3%蔗糖、0.7。/。植物瓊脂(Phytagar)的MSBAP-3培養(yǎng)基上在23。C，16小時(shí)光照下培養(yǎng)2天。在與農(nóng)桿菌共培育2日后，將葉柄外植體轉(zhuǎn)移至含有的3mg/lBAP、頭孢噻肟、羧節(jié)青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培養(yǎng)基上持續(xù)7日，并且隨后在含頭孢噻肟、羧千青霉素或特美汀和選擇劑的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至苗再生。當(dāng)苗具有5-10mm長(zhǎng)度時(shí)，將苗切下并轉(zhuǎn)移至苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(含0.5mg/1BAP的MSBAP-0.5)。將長(zhǎng)度大約2cm的苗轉(zhuǎn)移至用于根誘導(dǎo)的生根培養(yǎng)基(MSO)。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受性并含有單拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生Tl種子。苜蓿轉(zhuǎn)化苜贛的再生性克隆使用(McKersie等，1999PlantPhysiol119:839—847)的方法加以轉(zhuǎn)化。苜蓿的再生和轉(zhuǎn)化是基因型依賴性的并且因而需要再生植物。已經(jīng)描述了獲得再生性植物的方法。例如，這些再生性植物可以選自栽培品種Rangelander(AgricultureCanada)或如BrownDCW與AAtanassov(1985.PlantCellTissueCulture4:111-112)描述的任何其它商業(yè)苜蓿品種。備選地，RA3品種(威斯康星大學(xué))已經(jīng)被選擇用于組織培養(yǎng)中(Walker等，1978AmJBot65:654-659)。將葉柄外植體與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌C58C1pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol119:839—847)或LBA4404的過(guò)夜培養(yǎng)物共培育。外植體在黑暗中在含有288mg/LPro、53mg/L碌u代脯氨酸、4.35g/LK2S04和100乙酰丁香酮的SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培育3天.外植體在半濃縮Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)中洗滌并平板接種在不含乙酰丁香酮而含有合適選擇劑和合適抗生素以抑止農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的相同SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。在數(shù)周后，將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y發(fā)育培養(yǎng)基中。體細(xì)胞胚隨后在半濃縮Murashige-Skoog培養(yǎng)基上萌發(fā)。將生根的幼苗移植至花缽內(nèi)并且在溫室中培育。從表現(xiàn)選擇劑耐受性并含有單拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生Tl種子。實(shí)施例39:評(píng)價(jià)方法39.1評(píng)價(jià)準(zhǔn)備產(chǎn)生大約30個(gè)獨(dú)立的T0稻轉(zhuǎn)化體。原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至溫室用于生長(zhǎng)和收獲T1種子。留下7個(gè)事件，其中所述事件的T1后代對(duì)轉(zhuǎn)基因的存在/不存在以3:1比例分離。對(duì)于這些事件中的每一事件，通過(guò)監(jiān)測(cè)目視標(biāo)記表達(dá)而選擇含有轉(zhuǎn)基因的大約10林T1幼苗(雜合子和純合子)和缺少轉(zhuǎn)基因的大約10林T1幼苗(失效合子)。轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的失效合子在隨機(jī)位置上并排培育。溫室條件是短日照(12小時(shí)光照)，在光線下28。C和在黑暗中22。C以及相對(duì)濕度70%。4個(gè)Tl事件在T2世代中按照如用于Tl世代的相同評(píng)價(jià)方法作進(jìn)一步評(píng)估，但每個(gè)事件采用更多的個(gè)體。使植物從播種期直至成熟期通過(guò)數(shù)字成像箱數(shù)次。在每一時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)每林植物從至少6個(gè)不同角度拍攝數(shù)字圖像(2048xl536像素，1600萬(wàn)顏色)。39.2統(tǒng)計(jì)分4斤t檢驗(yàn)和F-檢驗(yàn)使用雙因子ANOVA(方差分析)作為統(tǒng)計(jì)模型用于植物表型特征的整體評(píng)價(jià)。對(duì)用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的全部事件的全部植物的所有測(cè)量參數(shù)實(shí)施F檢驗(yàn)。實(shí)施F檢驗(yàn)以檢查基因?qū)τ谌哭D(zhuǎn)化事件的作用并驗(yàn)證基因的整體作用(又稱作全局基因作用)。用于真實(shí)全局基因作用的顯著性的閾值對(duì)于.F檢驗(yàn)設(shè)置在5%概率水平上。顯著性F檢驗(yàn)值標(biāo)示基因作用，—意味著不僅僅基因的存在或位置才造成表型上的差異。為檢查基因在事件中的作用，即林系特異性作用，使用來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的無(wú)效植物的數(shù)據(jù)集在每個(gè)事件內(nèi)進(jìn)行t檢驗(yàn)。"無(wú)效植物"或"無(wú)效分離子"或"失效合子"是以與轉(zhuǎn)基因植物相同的方式受到處理，但是轉(zhuǎn)基因已經(jīng)從中發(fā)生分離的植物。無(wú)效植物也可以描述為純合陰性轉(zhuǎn)化植物。用于t檢驗(yàn)的顯著性的閾值設(shè)置在10。/。概率水平上。一些事件的結(jié)果可以高于或低于這個(gè)閾值。這基于如此假設(shè)，即基因可能僅在基因組中某些位置內(nèi)具有作用，并且這種位置依賴性作用的出現(xiàn)并非罕見(jiàn)。這種基因作用在本文中又稱作"基因的林系作用"。p-值通過(guò)t-值與t-分布比較或備選地通過(guò)F-值與F-分布比較而獲得。該p-值隨后給出無(wú)效假設(shè)(即轉(zhuǎn)基因的作用不存在)是正確的概率。實(shí)施例40:評(píng)價(jià)結(jié)果早期萌發(fā)勢(shì)通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)自地上植物部分中區(qū)別于背景的像素總數(shù)而確定。該值對(duì)在相同時(shí)間點(diǎn)上從不同角度拍攝的畫面進(jìn)行平均化并且通過(guò)校正轉(zhuǎn)化成由平方mm表示的物理表面值。下文所述的結(jié)果針對(duì)萌發(fā)后3周的植物。在Tl世代7個(gè)事件中的6個(gè)事件中見(jiàn)到植物早期萌發(fā)勢(shì)(如由地上部分面積確定)，同時(shí)與對(duì)照植物相比，轉(zhuǎn)基因幼苗的地上部分面積總體增加22%。在T2世代中進(jìn)一步評(píng)估這些Tl事件中的4個(gè)事件，并且與對(duì)照植物相比，全部這四個(gè)事件均引起轉(zhuǎn)基因幼苗的地上部分面積增加，與對(duì)照植物相比，轉(zhuǎn)基因幼苗的地上部分面積總體增加13%。還證實(shí)所述結(jié)果是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，來(lái)自F-檢驗(yàn)的p-值是0.0007(T2世代)，表明所見(jiàn)的效果可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因而不是因基因的位置或林系作用所致。實(shí)施例部分F:SPL15實(shí)施例41:鑒定與本發(fā)明方法中所用核酸序列相關(guān)的序列使用數(shù)據(jù)庫(kù)序列搜索工具，如基本局部比對(duì)工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410;和Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25;3389-3402)在國(guó)家生物技術(shù)信息中心的EntrezL核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中所維護(hù)的那些序列內(nèi)鑒定到與本發(fā)明方法中所用核酸序列相關(guān)的(全長(zhǎng)cDNA、EST或基因組)序列。該程序用來(lái)通過(guò)核酸序列或多肽序列與序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較并通過(guò)計(jì)算匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性而找到序列間具有局部相似性的區(qū)域。對(duì)本發(fā)明核酸所編碼的多肽使用TBLASTN算法，采用默認(rèn)設(shè)置和過(guò)濾以忽略低復(fù)雜性序列抵消。分析的結(jié)果通過(guò)配對(duì)性比較顯示，并根據(jù)幾率評(píng)分(E-值)排序，其中該評(píng)分反映特定比對(duì)結(jié)果因偶然而發(fā)生的概率(E-值越低，命中的顯著性越高)。除了E-值外，比較還通過(guò)同一性百分?jǐn)?shù)進(jìn)行記分。同一性百分?jǐn)?shù)指兩個(gè)所比較核酸(或多肽)序列之間在特定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的相同核苷酸(或氨基酸)數(shù)目。在一些情況下，可以調(diào)整默認(rèn)參數(shù)以調(diào)節(jié)搜索法的嚴(yán)格性。表N:與用于本發(fā)明方法中的核酸序列(SEQIDNO:234)相關(guān)的核酸序<table>tableseeoriginaldocumentpage222</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage223</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage224</column></row><table>實(shí)施例42:確定SPL15轉(zhuǎn)錄因子之間的全局相似性和同一性，及SPL15轉(zhuǎn)錄因子的SPLDBD。SPL15轉(zhuǎn)錄因子之間的全局相似性百分?jǐn)?shù)和同一性百分?jǐn)?shù)4吏用本領(lǐng)域可獲得的方法之一MatGAT(矩陣全局比對(duì)工具)軟件(BMCBioinformatics.20034:29.MatGAT:使用蛋白質(zhì)序列或DNA序列產(chǎn)生相似性/同一性矩P車的應(yīng)用.CampanellaJJ,BitinckaL，SmalleyJ;軟件由LedionBitincka所有)加以確定。MatGAT軟件產(chǎn)生針對(duì)DNA序列或蛋白質(zhì)序列的相似性/同一性矩陣，無(wú)需數(shù)據(jù)的預(yù)比對(duì)。使用Myers和Miller全局比對(duì)算法(空位開(kāi)口罰分12和空位延伸罰分2),該程序執(zhí)行一系列配對(duì)比對(duì)，使用例如Blosum62(對(duì)于多肽)計(jì)算相似性和同一性并且隨后將結(jié)果置于距離矩陣中。序列相似性在分界線的下半部分中顯示，序列同一性在對(duì)角分界線的上半部分中顯示。SEQIDNO:235的序列在矩陣中顯示為第5號(hào)。比較中所用的參數(shù)是記分矩陣Blosum62第一空位12延伸性空位2在表O中顯示針對(duì)SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽全長(zhǎng)的全局相似性和同一性的軟件分析結(jié)果。同一性百分?jǐn)?shù)在對(duì)角線之上給出并且相似性百分?jǐn)?shù)在對(duì)角線之下給出。在SPL15轉(zhuǎn)錄因子旁系同源物和直向同源物間的同一性百分?jǐn)?shù)范圍是30-70%，反映所述旁系同源物和直向同源物間在SPLDBD之外的相對(duì)低的序列同一性保守。表O:用于在SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽全長(zhǎng)上的全局相似性和同一性的MatGAT結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage225</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage226</column></row><table>表P:針對(duì)SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的SPLDBD的全局相似性和同一性的MatGAT結(jié)果。針對(duì)SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的SPLDBD的全局相似性和同一性<table>tableseeoriginaldocumentpage227</column></row><table>實(shí)施例43:克隆本發(fā)明方法中所用核酸序列DNA操作除非另外聲明，重組DNA技術(shù)根據(jù)(Sambrook(2001)MolecularCloning:alaboratorymanual,第三版ColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH，NewYork)中或Ausubel等(1994)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols第1和2巻中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。用于4直物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法在由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications(UK)出版的R.D.D.Croy的PlantMolecularBiologyLabfax(1993)中描述。本發(fā)明方法中所用的核酸序列通過(guò)PCR，使用定制的擬南芥混合組織cDNA文庫(kù)(在MVSport6.0內(nèi)；Invitrogen，Paisley,UK)作為模板而擴(kuò)增。在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用HifiTaqDNA聚合酶，利用在50^tlPCR混合物中的200ng模板進(jìn)行PCR。所用引物是prm07277(SEQIDNO:280;有義，起始密碼子為粗體字，AttBl位點(diǎn)是小寫字體5，-和prm07278(SEQIDNO:281;反義，互補(bǔ)AttB2位點(diǎn)是小寫字體5，ggggaccactttgtacaagaaagctgggtTGATGAAGATCTTAAAAGGTGA3，)，其包括用于Gateway重組的AttB位點(diǎn)。擴(kuò)增的PCR片段也使用標(biāo)準(zhǔn)方法予以純化。隨后實(shí)施Gateway方法的第一步驟，即BP反應(yīng)，在此期間PCR片段與pDONR201質(zhì)粒發(fā)生體內(nèi)重組以產(chǎn)生根據(jù)Gateway命名的"進(jìn)入克隆"，pSPL15。質(zhì)粒pDONR201作為Gateway⑧技術(shù)的構(gòu)成部分從Invitrogen購(gòu)買。實(shí)施例44:表達(dá)載體構(gòu)建進(jìn)入克隆p13075隨后在LR反應(yīng)中與p06659(—種用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體)一起使用。這種載體在T-DNA邊界內(nèi)含有作為功能性元件的植物選擇標(biāo)記；篩選標(biāo)記表達(dá)盒和意圖與已經(jīng)克隆于所述進(jìn)入克隆內(nèi)的目的核酸序列發(fā)生LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于組成型表達(dá)的稻HMGB啟動(dòng)子(SEQIDNO:294)位于這種Gateway盒的上游。備選地，由SEQIDNO:46代表HMGB啟動(dòng)子是同樣有用的。相似的構(gòu)建體用在組成型的GOS2啟動(dòng)子(SEQIDNO:295)控制下的SPL15編碼序列產(chǎn)生。在LR重組步驟后，將產(chǎn)生的表達(dá)載體pHMGB::SPL15(圖26)或pGOS2::SPL15轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌林LBA4044并且隨后轉(zhuǎn)化至稻植物。實(shí)施例45:植物轉(zhuǎn)化稻轉(zhuǎn)化含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌用來(lái)轉(zhuǎn)化稻植物。將稻的日本栽培種Nipponbare的成熟干燥種子脫殼。通過(guò)在70%乙醇中溫育一分鐘，隨后在2%HgCl2中30分鐘，隨后用無(wú)菌蒸餾水洗滌6次15分鐘而實(shí)施消毒。消毒的種子隨后在含有2，4-D的培養(yǎng)基(愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上萌發(fā)。在黑暗中溫育4周后，將來(lái)自小盾片的愈傷組織切下并在同一種培養(yǎng)基上增殖。2周后，愈傷組織通過(guò)在同一種培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)另外2周而繁殖或增殖。胚發(fā)生性愈傷組織片在新鮮培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)3日，之后共培育(以增強(qiáng)細(xì)胞分裂活性)。含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌林LBA4404用于共培育。農(nóng)桿菌接種在含有適宜抗生素的AB培養(yǎng)基上并在28。C培養(yǎng)3日。隨后將細(xì)菌收集并重懸在液體共培育培養(yǎng)基中至密度(OD6QG)約1。將混懸液隨后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿并將愈傷組織在該混懸液內(nèi)浸泡15分鐘。愈傷組織組織隨后在濾紙上吸干并轉(zhuǎn)移至固化的共培育培養(yǎng)基上并且在黑暗中于25。C溫育3日。共培育的愈傷組織在黑暗中于28。C在選擇劑存在下于含有2，4-D的培養(yǎng)基上培育4周。在此時(shí)段期間，形成迅速生長(zhǎng)的抗性愈傷組織島。在這種材料轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基并在光線下溫育后，胚發(fā)生潛力釋放并且苗在隨后4-5周發(fā)育。將苗從愈傷組織中切下并且在含有植物生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上溫育2-3周，其中將苗從所述的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移至土壤。硬化的苗在高濕度和短日照下于溫室中培育。對(duì)于一個(gè)構(gòu)建體，產(chǎn)生大約35個(gè)獨(dú)立T0稻轉(zhuǎn)化體。將原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至溫室。在定量PCR分析以驗(yàn)證T-DNA插入物的拷貝數(shù)后，僅保留表現(xiàn)選擇劑耐受性的單拷貝轉(zhuǎn)基因植物用于收獲Tl種子。種子隨后在移植后3-5月收獲。本方法以超過(guò)50。/。的比率產(chǎn)生單一基因座轉(zhuǎn)化體(Aldemita和Hodges1996,Chan等1993,Hid等1994)。玉米轉(zhuǎn)化玉米的轉(zhuǎn)化根據(jù)對(duì)Ishida等(1996.NatureBiotech14745-50)描述方法的改良方法進(jìn)行。在玉米中的轉(zhuǎn)化是基因型依賴的并且僅特定的基因型可操作用于轉(zhuǎn)化和再生。近交系A(chǔ)188(明尼蘇達(dá)大學(xué))或以A188作為親本的雜種是用于轉(zhuǎn)化的供體材料的良好來(lái)源，但是其它基因型也可以成功地使用。玉米穗從玉米植物中在授粉后大約11日(DAP)收獲，此時(shí)不成熟胚的長(zhǎng)度是大約1至1.2mm。不成熟胚與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培育并且轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)器官發(fā)生而恢復(fù)。切下的胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上、隨后在玉米再生培養(yǎng)基上培育，其中所述的再生培養(yǎng)基含有選擇劑(例如咪唑啉酮，但可以使用多種選擇標(biāo)記)。培養(yǎng)板在25。C于光照下培養(yǎng)2-3周，或直至苗發(fā)育。將綠色苗從每個(gè)胚轉(zhuǎn)移至玉米生根培養(yǎng)基并在25。C培養(yǎng)2-3周，直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝的T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生Tl種子。小麥轉(zhuǎn)化小麥的轉(zhuǎn)化用Ishida等Ishida等(1996)NatureBiotech14(6):745-50描述的方法進(jìn)行。通常在轉(zhuǎn)化中使用(可從墨西哥CIMMYT獲得的)栽培品種Bobwhite。不成熟胚與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌共培育并且轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)器官發(fā)生而恢復(fù)。在與農(nóng)桿菌溫育后，胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上、隨后在再生培養(yǎng)基上體外培育，其中所述的再生培養(yǎng)基含有選擇劑(例如咪唑啉酮，但可以使用多種選擇標(biāo)記)。培養(yǎng)平板在25。C于光照下培養(yǎng)2-3周，或直至苗發(fā)育。將綠色苗從每個(gè)胚轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基并在25。C培養(yǎng)2-3周，直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝的T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生Tl種子。大豆轉(zhuǎn)化才艮據(jù)對(duì)TexasA&M美國(guó)專利5,164,310中所述方法的改良方法轉(zhuǎn)化大豆。幾個(gè)商業(yè)大豆品種對(duì)于通過(guò)這種方法的轉(zhuǎn)化是可行的。栽培品種Jack(從Illinois種子基金會(huì)可獲得)通常用于轉(zhuǎn)化。對(duì)大豆種子消毒以便體外播種。從7日齡幼苗中切下下胚軸、胚根和一片子葉。進(jìn)一步培育上胚軸和余下的子葉以發(fā)育腋生節(jié)。將這些腋生節(jié)切下并與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌溫育。在共培育處理之后，將外植體洗滌并轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基。將再生的苗切下并置于苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上。將長(zhǎng)度不超過(guò)lcm的苗置于生根培養(yǎng)基上直至根發(fā)育。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受的并含有單拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生Tl種子。油菜籽/卡諾拉油菜轉(zhuǎn)化使用5-6日齡幼苗的子葉柄和下胚軸作為用于組織培養(yǎng)的外植體并且根據(jù)Babic等(1998，PlantCellRep17:183-188)轉(zhuǎn)化。商業(yè)栽培品種Westar(AgricultureCanada)是用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)品種，但是也可以使用其它品種。對(duì)卡諾拉油菜種子作表面消毒以便體外播種。從體外幼苗中切下具有附著子葉的子葉柄外植體，并以(含有表達(dá)載體的)農(nóng)桿菌通過(guò)葉柄外植體的切口端浸入細(xì)菌混懸液而接種。外植體隨后在含有3mg/1BAP、3%蔗糖、0.7。/。植物瓊脂(Phytagar)的MSBAP-3培養(yǎng)基上在23。C，16小時(shí)光照下培養(yǎng)2天。在與農(nóng)桿菌共培育2日后，將葉柄外植體轉(zhuǎn)移至含有的3mg/lBAP、頭孢噻肟、羧節(jié)青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培養(yǎng)基上持續(xù)7日，并且隨后在含頭孢噻肟、羧節(jié)青霉素或特美汀和選擇劑的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至苗再生。當(dāng)苗具有5-10mm長(zhǎng)度時(shí)，將苗切下并轉(zhuǎn)移至苗伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(含0.5mg/1BAP的MSBAP-0.5)。將長(zhǎng)度大約2cm的苗轉(zhuǎn)移至用于根誘導(dǎo)的生根培養(yǎng)基(MSO)。將生根的苗移植至溫室的土壤中。從表現(xiàn)選擇劑耐受性并含有單拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生T1種子。苜蓿轉(zhuǎn)化苜蓿的再生性克隆使用(McKersie等，1999PlantPhysiol119:839—847)的方法加以轉(zhuǎn)化。苜蓿的再生和轉(zhuǎn)化是基因型依賴性的并且因而需要再生植物。已經(jīng)描述了獲得再生性植物的方法。例如，這些再生性植物可以選自栽培品種Rangelander(AgricultureCanada)或如BrownDCW與AAtanassov(1985.PlantCellTissueCulture4:111-112)描述的任何其它商業(yè)苜蓿品種。備選地，RA3品種(威斯康星大學(xué))已經(jīng)被選擇用于組織培養(yǎng)中(Walker等，1978AmJBot65:654-659)。將葉柄外植體與含有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌C58C1pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol119:839—847)或LBA4404的過(guò)夜培養(yǎng)物共培育。外植體在黑暗中在含有288mg/LPro、53mg/L石危代脯氨酸、4.35g/LK2S04和100乙酰丁香酮的SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培育3天.外植體在半濃縮Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)中洗滌并平板接種在不含乙酰丁香酮而含有合適選擇劑和合適抗生素以抑止農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的相同SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。在數(shù)周后，將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y發(fā)育培養(yǎng)基中。體細(xì)胞胚隨后在半濃縮Murashige-Skoog培養(yǎng)基上萌發(fā)。將生根的幼苗移植至花缽內(nèi)并且在溫室中培育。從表現(xiàn)選擇劑耐受性并含有單拷貝T-DNA插入物的植物中產(chǎn)生Tl種子。實(shí)施例46:評(píng)價(jià)方法46.1評(píng)價(jià)準(zhǔn)備產(chǎn)生大約35個(gè)獨(dú)立的T0稻轉(zhuǎn)化體。原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至溫室用于生長(zhǎng)和收獲T1種子。留下7個(gè)事件，其中所述事件的T1后代對(duì)轉(zhuǎn)基因的存在/不存在以3:1比例分離。對(duì)于這些事件中的每一事件，通過(guò)監(jiān)測(cè)目視標(biāo)記表達(dá)而選擇含有轉(zhuǎn)基因的大約10林T1幼苗(雜合子和純合子)和缺少轉(zhuǎn)基因的大約10林T1幼苗(失效合子)。轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的失效合子在隨機(jī)位置上并排培育。溫室條件是短日照(12小時(shí)光照)，在光線下28。C和在黑暗中22。C以及相對(duì)濕度70%。5個(gè)Tl事件在T2世代中按照如用于Tl世代的相同評(píng)價(jià)方法作進(jìn)一步評(píng)估，但每個(gè)事件采用更多的個(gè)體。使植物從播種期直至成熟期通過(guò)數(shù)字成像箱數(shù)次。在每一時(shí)間點(diǎn)上，對(duì)每林植物從至少6個(gè)不同角度拍攝數(shù)字圖像(2048xl536像素，1600萬(wàn)顏色)。早期萌發(fā)勢(shì)是萌發(fā)后3周的植物(幼苗)地上部分面積。根生物量的增加表達(dá)為根總生物量(測(cè)量為在植物壽命期間所觀察到的根最大生物量)的增加；或表述為根/苗指數(shù)(測(cè)量為根和苗的活躍生長(zhǎng)時(shí)期中根質(zhì)量和苗質(zhì)量之間的比例)的增加。46.2統(tǒng)計(jì)分沖斤F-檢-驗(yàn)使用雙因子ANOVA(方差分析)作為統(tǒng)計(jì)模型用于植物表型特征的整體評(píng)價(jià)。對(duì)用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的全部事件的全部植物的所有測(cè)量參數(shù)實(shí)施F檢驗(yàn)。實(shí)施F檢驗(yàn)以檢查基因?qū)τ谌哭D(zhuǎn)化事件的作用并驗(yàn)證基因的整體作用(又稱作全局基因作用)。用于真實(shí)全局基因作用的顯著性的閾值對(duì)于F檢驗(yàn)設(shè)置在5。/。概率水平上。顯著性F檢驗(yàn)值標(biāo)示基因作用，意味著不僅僅基因的存在或位置才造成表型上的差異。為檢查基因在事件中的作用，即林系特異性作用，使用來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的無(wú)效植物的數(shù)據(jù)集在每個(gè)事件內(nèi)進(jìn)行t檢驗(yàn)。"無(wú)效植物"或"無(wú)效分離子"或"失效合子"是以與轉(zhuǎn)基因植物相同的方式受到處理，但是轉(zhuǎn)基因已經(jīng)從中發(fā)生分離的植物。無(wú)效植物也可以描述為純合陰性轉(zhuǎn)化植物。用于t檢驗(yàn)的顯著性的閾值設(shè)置在10%概率水平上。一些事件的結(jié)果可以高于或低于這個(gè)闊值。這基于如此假設(shè)，即基因可能僅在基因組中某些位置內(nèi)具有作用，并且這種位置依賴性作用的出現(xiàn)并非罕見(jiàn)。這種基因作用在本文中又稱作"基因的抹系作用"。p-值通過(guò)t-值與t-分布比較或備選地通過(guò)F-值與F-分布比較而獲得。該p-值隨后給出無(wú)效假設(shè)(即轉(zhuǎn)基因的作用不存在)是正確的概率。實(shí)施例47:評(píng)價(jià)結(jié)果植物地上部分面積(或葉生物量)通過(guò)計(jì)數(shù)在來(lái)自植物地上部分的數(shù)字圖像上區(qū)別于背景的像素的總數(shù)而測(cè)定。該值對(duì)在相同時(shí)間點(diǎn)上從不同角度拍攝的畫面進(jìn)行平均化并且通過(guò)校正轉(zhuǎn)化成以平方mm表達(dá)的物理表面值。實(shí)驗(yàn)證實(shí)以這種方式測(cè)量的地上部分植物面積與地上植物部分的生物量相關(guān)。地上部分面積是在植物已經(jīng)達(dá)到其最大葉生物量的時(shí)間點(diǎn)。將成熟的主圓錐花序收獲、計(jì)數(shù)、裝袋、加條形碼標(biāo)記并且隨后在干燥箱內(nèi)在37。干燥3日。隨后將圓錐花序脫粒并且收集及計(jì)數(shù)全部種子。使用吹氣裝置分開(kāi)飽滿粒與空粒。棄去空粒并再次對(duì)剩余部分計(jì)數(shù)。飽滿粒在分析天平上稱重。飽滿種子數(shù)通過(guò)計(jì)數(shù)分離步驟后的飽滿粒數(shù)而確定。種子總產(chǎn)量通過(guò)稱量從植物中收獲的全部飽滿粒而測(cè)量。每林植物種子總數(shù)通過(guò)計(jì)數(shù)從植物中收獲的殼粒數(shù)目而測(cè)量。從計(jì)數(shù)的飽滿種子數(shù)及其總重量外推出千粒重(TKW)。收獲指數(shù)(HI)在本發(fā)明中定義為種子總產(chǎn)量與地上部分面積(mm"之間的比，乘以系數(shù)106。如本發(fā)明中定義的每圓錐花序的總花數(shù)是種子總數(shù)與成熟主圓錐花序的數(shù)目之間的比率。如本發(fā)明中定義的種子飽滿率是飽滿種子數(shù)對(duì)種子(或小花)總數(shù)的比例(表述為％)。如在表Q至表W中所示，與合適的對(duì)照植物相比，地上部分生物量、每個(gè)圓錐花序的花數(shù)、種子產(chǎn)量、種子總數(shù)、飽滿種子數(shù)、千粒重(TKW)和收獲指數(shù)在編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸的表達(dá)增加的轉(zhuǎn)基因植物中增加。顯示了來(lái)自T1和T2世代的結(jié)果。表Q顯示具有地上部分生物量增加的轉(zhuǎn)基因事件的數(shù)目、這種增加的百分?jǐn)?shù)以及這種增加根據(jù)F-檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)性。表Q:在編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸表達(dá)增加的轉(zhuǎn)基因稻的Tl和T2世代中具有地上部分生物量增加的轉(zhuǎn)基因事件的數(shù)目、這種增加的百分?jǐn)?shù)和F-檢驗(yàn)的P值。<table>tableseeoriginaldocumentpage234</column></row><table>表R顯示具有每個(gè)圓錐花序花總數(shù)增加的轉(zhuǎn)基因事件的數(shù)目、這種增加的百分?jǐn)?shù)以及這種增加根據(jù)F-檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)性。表R:在編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸表達(dá)增加的轉(zhuǎn)基因稻的Tl和T2世代中具有每個(gè)圓錐花序花數(shù)增加的轉(zhuǎn)基因事件的數(shù)目、這種增加的百分?jǐn)?shù)和F-檢l^的P值。<table>tableseeoriginaldocumentpage234</column></row><table>表s顯示具有種子總產(chǎn)量(種子總重量)增加的轉(zhuǎn)基因事件的數(shù)目、這種增加的百分?jǐn)?shù)以及這種增加根據(jù)F-檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)性。表S:在編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸表達(dá)增加的轉(zhuǎn)基因稻的Tl和T2世代中具有種子產(chǎn)量增加的轉(zhuǎn)基因事件的數(shù)目、這種增加的百分?jǐn)?shù)和F-檢-驗(yàn)的P值。<table>tableseeoriginaldocumentpage235</column></row><table>表V在編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸表達(dá)增加的轉(zhuǎn)基因稻的Tl和T2世代中具有收獲指數(shù)增加的轉(zhuǎn)基因事件的數(shù)目、這種增加的百分?jǐn)?shù)和F-檢驗(yàn)的P值。<table>tableseeoriginaldocumentpage236</column></row><table>表W顯示具有千粒重(TKW)增加的轉(zhuǎn)基因事件的數(shù)目、這種增加的百分?jǐn)?shù)以及這種增加根據(jù)F-檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)性。表W:在編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸表達(dá)增加的轉(zhuǎn)基因稻的Tl和T2世代中具有千粒重(TKW)增加的轉(zhuǎn)基因事件數(shù)、這種增加的百分?jǐn)?shù)和F-檢-驗(yàn)的P值。<table>tableseeoriginaldocumentpage236</column></row><table>實(shí)施例48:對(duì)組成型啟動(dòng)子控制下表達(dá)SEQIDNO:234的轉(zhuǎn)基因植物的表型評(píng)價(jià)結(jié)果表X中給出了對(duì)表達(dá)組成型GOS2啟動(dòng)子控制下的用于實(shí)施本發(fā)明方法中的核列的轉(zhuǎn)基因稻植物的評(píng)價(jià)結(jié)果。還顯示轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)應(yīng)的失效合子之間的差異百分?jǐn)?shù)。與對(duì)照植物(在這種情況下，失效合子)相比，表達(dá)用于實(shí)施本發(fā)明方法中的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的早期萌發(fā)勢(shì)和增加的TKW。表X:對(duì)表達(dá)強(qiáng)組成型GOS2啟動(dòng)子控制下的用于實(shí)施本發(fā)明方法的核酸序列的Tl世代轉(zhuǎn)基因稻植物的評(píng)價(jià)結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage237</column></row><table>權(quán)利要求1.用于相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括優(yōu)先增加編碼HAL3多肽的核酸在植物苗中的表達(dá)，和任選地選擇具有增加的產(chǎn)量的植物。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述增加的表達(dá)通過(guò)導(dǎo)入遺傳修飾，優(yōu)選在編碼HAL3多肽的基因的基因座內(nèi)導(dǎo)入遺傳修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述遺傳修飾通過(guò)T-DNA激活、TILLING和同源重組的任何一種或多種方法實(shí)現(xiàn)。4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述遺傳修飾通過(guò)T-DNA激活、TILLING和同源重組的任何一種或多種方法實(shí)現(xiàn)。5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述增加的表達(dá)通過(guò)導(dǎo)入并在植物中表達(dá)編碼HAL3多肽的核酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述編碼HAL3蛋白質(zhì)的核酸由在表A中給出的任何一種核酸SEQIDNO或其部分，或能夠與在表A中給出的任何一種核酸SEQIDNO雜交的序列代表。7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述編碼HAL3蛋白質(zhì)的核酸編碼在表A中給出的任一核酸SEQIDNO的直向同源物或旁系同源物。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀包含增加的產(chǎn)量和/或早期萌發(fā)勢(shì)。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述增加的產(chǎn)量是增加的種子產(chǎn)量。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述增加的種子產(chǎn)量是下列一種或多種a)增加的種子生物量；b)增加的收獲指數(shù)；和c)增加的(飽滿)種子數(shù)。11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述種子產(chǎn)量的增加相對(duì)于對(duì)照植物是至少10%。12.根據(jù)權(quán)利要求5至11任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼HAL3蛋白質(zhì)的核酸有效連接苗特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選有效連接p擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子。13.根據(jù)權(quán)利要求5至12任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼HAL3蛋白質(zhì)的核酸是植物來(lái)源的，優(yōu)選來(lái)自雙子葉植物，還優(yōu)選來(lái)自十字花科植物，更優(yōu)選來(lái)自擬南芥屬，最優(yōu)選來(lái)自擬南芥。14.通過(guò)根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法可獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼HAL3多肽的重組核酸。15.構(gòu)建體，其包含(a)編碼HAL3多肽的核酸；(b)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列優(yōu)先在植物的苗組織中表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列；和任選地(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。16.根據(jù)權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述一種或多種調(diào)控序列至少是苗特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選是p擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子。17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的構(gòu)建體的用途，用于相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀，優(yōu)選地用于增加產(chǎn)量和/或萌發(fā)勢(shì)。18.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其中所述產(chǎn)量是增加的種子產(chǎn)量。19.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其中所述萌發(fā)勢(shì)是早期萌發(fā)勢(shì)。20.用根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。21.用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)導(dǎo)入并優(yōu)先增加編碼HAL3多肽的核酸在植物的苗組織中的表達(dá)；和(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。22.相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物，所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀由于優(yōu)先增加HAL3多肽在苗中的表達(dá)而產(chǎn)生。23.根據(jù)權(quán)利要求14、20或22的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是作物植物或單子葉#_物或谷物，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、高粱和燕麥。24.根據(jù)權(quán)利要求14、20、22或23任一項(xiàng)的植物的可收獲部分，其中所迷可收獲部分優(yōu)選地是種子，25.獲部分的產(chǎn)物。26.編碼HAL3多肽的核酸用于增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的用途，其中所述核酸有效連接苗特異性啟動(dòng)子。27.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其中所述產(chǎn)量相關(guān)性狀包含種子產(chǎn)量和/或早期萌發(fā)勢(shì)。28.用于增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括調(diào)節(jié)、優(yōu)選增加編碼MADS15蛋白質(zhì)的核酸在植物中的表達(dá)。29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述MADS15蛋白質(zhì)包含任何一種或多種以下基序SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQID脆51。30.根據(jù)權(quán)利要求28至29的方法，其中所述受調(diào)節(jié)的表達(dá)通過(guò)T-DNA激活標(biāo)簽、TILLING、位點(diǎn)定向誘變、定向進(jìn)化或同源重組的任何一種或多種方法實(shí)現(xiàn)。31.根據(jù)權(quán)利要求28至29任一項(xiàng)的方法，其中所述受調(diào)節(jié)的表達(dá)通過(guò)導(dǎo)入并在植物中表達(dá)編碼MADS15蛋白質(zhì)的核酸而實(shí)現(xiàn)，并且其中所述MADS15蛋白質(zhì)的氨基酸序列包含任何一種或多種以下基序SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51。32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述編碼MADS15蛋白質(zhì)的核酸是在表D中給出的任何一種核酸SEQIDNO或其部分，或是能夠與在表D中給出的任何一種核酸SEQIDNO雜交的序列。33.根據(jù)外又利要求31的方法，其中所述編碼MADS15蛋白質(zhì)的核酸編碼在表D中給出的任一核酸SEQIDNO的直向同源物或旁系同源物。34.根據(jù)權(quán)利要求28至33任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀是根生物量。35.根據(jù)權(quán)利要求31至34任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼MADS15蛋白質(zhì)的核酸有效連接組成型啟動(dòng)子、優(yōu)選GOS2啟動(dòng)子。36.根據(jù)杈利要求31至35任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼MADS15蛋白質(zhì)的核酸是^:物來(lái)源的，優(yōu)選來(lái)自單子葉植物，還優(yōu)選來(lái)自禾本科，更優(yōu)選來(lái)自稻屬，最優(yōu)選來(lái)自稻。37.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求28至36任一項(xiàng)的方法可獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼MADS15蛋白質(zhì)的重組核酸。38.構(gòu)建體，其包含(a)編碼MADS15蛋白質(zhì)的核酸，其中所述MADS15蛋白質(zhì)的氨基絲列包含任何一種或多種以下基序SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51;(b)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列；和任選地(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。39.根據(jù)3又利要求38的構(gòu)建體，其中所述一種或多種調(diào)控序列至少是組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選GOS2啟動(dòng)子。40.根據(jù)權(quán)利要求38或39的構(gòu)建體的用途，用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀、尤其增加的根產(chǎn)量的植物。41.用根據(jù)權(quán)利要求38或39的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。42.用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)導(dǎo)入并在植物中表達(dá)編碼MADS15蛋白質(zhì)的核酸，其中所述MADS15蛋白質(zhì)的氨基酸序列包含任何一種或多種以下基序SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51;和(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。43.相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述增加的產(chǎn)量因編碼MADS15蛋白質(zhì)的核酸的增加的表達(dá)而產(chǎn)生，其中所述MADS15蛋白質(zhì)的氨基酸序列包含任何一種或多種以下基序SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51。44.<image>imageseeoriginaldocumentpage6</image>45.根據(jù)權(quán)利要求37、41或43的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷物，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、高粱和燕麥，或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。46.根據(jù)權(quán)利要求44的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選是根。獲部分的產(chǎn)物。47.編碼MADS15蛋白質(zhì)的核酸在增強(qiáng)植物內(nèi)產(chǎn)量相關(guān)性狀中的用途，其中所述MADS15蛋白質(zhì)的氨基酸序列包含任何一種或多種以下基序SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51。48.根據(jù)權(quán)利要求47的用途，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀是相對(duì)于對(duì)照植物增加的根生物量。49.用于相對(duì)于合適的對(duì)照植物增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括優(yōu)先降低內(nèi)源性MADS15基因在所述植物中的表達(dá)。50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述MADS15蛋白質(zhì)包含任何一種或多種以下基序SEQIDNO:114、SEQIDNO:115、SEQIDNO:116、SEQIDNO:117。51.根據(jù)權(quán)利要求49或50的方法，其中所述降低的表達(dá)通過(guò)基因表達(dá)的RNA介導(dǎo)的下調(diào)實(shí)現(xiàn)。52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述RNA介導(dǎo)的下調(diào)通過(guò)共抑制實(shí)現(xiàn)。53.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述RNA介導(dǎo)的下調(diào)通過(guò)使用反義MADS15核酸序列實(shí)現(xiàn)。54.根據(jù)權(quán)利要求49或50的方法，其中所述降低的表達(dá)使用MADS15基因或其片段的反向重復(fù)序列實(shí)現(xiàn)，所述反向重復(fù)序列優(yōu)選能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。55.根據(jù)權(quán)利要求49或50的方法，其中使用對(duì)MADS15核酸有特異性的核酶實(shí)現(xiàn)所述降低的表達(dá)。56.根據(jù)權(quán)利要求49或50的方法，其中通過(guò)插入誘變實(shí)現(xiàn)所述降低的表達(dá)。57.根據(jù)權(quán)利要求49至56任一項(xiàng)的方法，其中所述內(nèi)源性MADS15基因是如植物中以其天然形式發(fā)現(xiàn)的MADS15基因或是隨后導(dǎo)入植物的分離的MADS15核酸。58.才艮據(jù)權(quán)利要求57的方法，其中所述導(dǎo)入的MADS15核酸有效連接組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選GOS2啟動(dòng)子。59.根據(jù)權(quán)利要求57或58的方法，其中所述導(dǎo)入的MADS15核酸來(lái)自植物來(lái)源或人工來(lái)源，優(yōu)選其中用與內(nèi)源性MADS15基因同源的MADS15核酸轉(zhuǎn)化植物，更優(yōu)選地其中來(lái)自單子葉植物的MADS15核酸序列用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，還更優(yōu)選地其中來(lái)自禾本科的MADS15序列用于轉(zhuǎn)化至禾本科植物內(nèi)，最優(yōu)選地其中來(lái)自稻的MADS15核酸序列用于轉(zhuǎn)化稻植物。60.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中所述來(lái)自稻的MADS15核酸序列包含SEQIDNO:109(OsMADS15)的足夠長(zhǎng)度的基本上連續(xù)的核苷酸，或包含編碼OsMADS15(SEQIDNO:110)的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的足夠長(zhǎng)度基本上連續(xù)的核苷酸。61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中OsMADS15的所述直向同源物或旁系同源物由SEQIDNO:147、SEQIDNO:149、SEQIDNO:151、SEQIDNO:153、SEQIDNO:155、SEQIDNO:157、SEQIDNO:159和SEQIDNO:161代表。62.根據(jù)權(quán)利要求60或61的方法，其中編碼OsMADS15(SEQIDNO:110)的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的所述基本上連續(xù)的核苷酸是來(lái)自由SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、SEQIDNO:150、SEQIDNO:152、SEQIDNO:154、SEQIDNO:156、SEQIDNO:158和SEQIDNO:160所代表的核酸序列的基本上連續(xù)的核苷酸。63.根據(jù)權(quán)利要求49至62任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀包含增加的產(chǎn)量，優(yōu)選增加的種子產(chǎn)量和/或增加的生物量。64.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述增加的種子產(chǎn)量選自下列一種或多種a)增加的種子生物量(種子重量)；b)增加的每林植物花數(shù)；和c)增加的(飽滿)種子數(shù)。65.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求49至64任一項(xiàng)的方法可獲得的植物或其部分，包4舌種子，其中所述才直物或其部分包含重組MADS15核酸。66.構(gòu)建體，其包含(i)能夠使內(nèi)源性MADS15基因沉默的MADS15核酸；(ii)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列；和任選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。67.根據(jù)權(quán)利要求66的構(gòu)建體，其中所述一種或多種調(diào)控序列至少是組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選GOS2啟動(dòng)子。68.根據(jù)權(quán)利要求66或67的構(gòu)建體的用途，用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀、尤其增加的種子產(chǎn)量和/或生物量的植物。69.用根據(jù)權(quán)利要求66或67的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。70.用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包才舌(i)導(dǎo)入并在植物中表達(dá)能夠使內(nèi)源性MADS15基因沉默的MADS15(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。71.相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀因編碼MADS15蛋白質(zhì)的核酸的降低的表達(dá)而引起，其中所述MADS15蛋白質(zhì)的氨基酸序列包含任何一種或多種以下基序SEQIDNO:114、SEQIDNO:115、SEQIDNO:116、SEQIDNO:117。72.根據(jù)權(quán)利要求65、69或71的轉(zhuǎn)基因植物，或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷物，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、高粱和燕麥。73.根據(jù)權(quán)利要求72的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選是種子。獲部分的產(chǎn)物。÷74.75.編碼MADS15的核酸用于增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的用途，其中所述MADS15蛋白質(zhì)的氨基酸序列包含任何一種或多種以下基序SEQIDNO:114、SEQIDNO:115、SEQIDNO:116、SEQIDNO:117。76.根據(jù)權(quán)利要求75的用途，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀包含增加的種子產(chǎn)量。77.用于相對(duì)于合適的對(duì)照植物增加植物產(chǎn)量的方法，其包括增加編碼PLT轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸在植物中的表達(dá)，和任選地選擇具有增加的產(chǎn)量的植物。78.用于相對(duì)于對(duì)照植物增加植物中非生物脅迫抗性的方法，其包括增加編碼PLT轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸在植物中的表達(dá)，和任選地選擇具有增加的非生物脅迫抗性的植物。79.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述增加的非生物脅迫抗性是相對(duì)于對(duì)照植物增加的營(yíng)養(yǎng)攝取效率。80.根據(jù)權(quán)利要求77至79任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)導(dǎo)入并在植物、植物部分或植物細(xì)胞中表達(dá)編碼PLT轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸來(lái)實(shí)現(xiàn)所述增力口的表達(dá)。81.根據(jù)權(quán)利要求80的方法，其中所述編碼PLT轉(zhuǎn)錄因子的核酸是在表l中給出的任何一種核酸SEQIDNO或其部分或是能夠與在表l中給出的任何一種核酸SEQIDNO雜交的序列。82.根據(jù)權(quán)利要求80的方法，其中所述編碼PLT轉(zhuǎn)錄因子的核酸編碼在表D中給出的任一核酸SEQIDNO的直向同源物或旁系同源物。83.根據(jù)權(quán)利要求77、80、81和82任一項(xiàng)的方法，其中所述增加的產(chǎn)量是增加的種子產(chǎn)量。84.根據(jù)權(quán)利要求83的方法，其中所述種子產(chǎn)量選自以下一種或多種a)增加的種子生物量；b)增加的每林植物花數(shù)；c)增加的(飽滿)種子數(shù)；d)增加的種子飽滿率；e)增加的收獲指數(shù)；f)增加的千粒重(TKW);g)增加的種子面積；h)增加的種子長(zhǎng)度；和i)增加的種子寬度。85.根據(jù)權(quán)利要求80至84任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸有效連接組成型啟動(dòng)子、優(yōu)選GOS2啟動(dòng)子。86.根據(jù)權(quán)利要求80至84任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼PLT轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸是植物來(lái)源的，優(yōu)選來(lái)自雙子葉植物，還優(yōu)選來(lái)自十字花科，更優(yōu)選來(lái)自擬南芥屬，最優(yōu)選來(lái)自擬南芥。87.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求77至86任一項(xiàng)的方法可獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼PLT轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸，其中所述核酸有效連接組成型啟動(dòng)子。88.構(gòu)建體，其包含(i)編碼PLT轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸；(ii)能夠驅(qū)動(dòng)(i)的核酸序列表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列；和任選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。89.根據(jù)權(quán)利要求88的構(gòu)建體，其中所述組成型啟動(dòng)子是GOS2啟動(dòng)子。90.根據(jù)權(quán)利要求88或89的構(gòu)建體的用途，用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量、尤其增加的種子產(chǎn)量和/或增加的非生物脅迫抗性的植物。91.用根據(jù)權(quán)利要求88或89的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。92.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)量和/或增加的非生物脅迫抗性，其中所述方法包括(i)導(dǎo)入并在植物細(xì)胞中表達(dá)編碼PLT轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸；和(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。93.相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量和/或增加的非生物脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因植物或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的植物細(xì)胞，所述增加的產(chǎn)量和/或增加的非生物脅迫抗性由編碼PLT轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸的增加的表達(dá)產(chǎn)生。94.根據(jù)權(quán)利要求87、91或93的轉(zhuǎn)基因植物，或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷物，如稻、玉米、小麥、大麥、栗、黑麥、黑小麥、高粱和燕麥。95.根據(jù)權(quán)利要求94的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選是種子。獲部分的產(chǎn)物。96<image>imageseeoriginaldocumentpage11</image>97.編碼PLT轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸的用途，或PLT轉(zhuǎn)錄因子多肽的用途，用于相對(duì)于對(duì)照植物增加非生物脅迫抗性和/或用于提高植物產(chǎn)量、尤其種子產(chǎn)量。98.用于增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包含調(diào)節(jié)植物中編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的核酸的表達(dá)，其中所述bHLH轉(zhuǎn)錄因子由SEQIDNO213、SEQIDNO215、SEQIDNO:217、SEQIDNO:219、SEQIDNO225、SEQIDNO:297、SEQIDNO:299、SEQIDNO:301的任一種或前述任一種的直向同源物或旁系同源物代表。99.根據(jù)權(quán)利要求98的方法，其中所述受調(diào)節(jié)的表達(dá)通過(guò)T-DNA激活標(biāo)簽、TILLING或同源重組的任何一種或多種方法實(shí)現(xiàn)。100.根據(jù)權(quán)利要求98的方法，其中所述受調(diào)節(jié)的表達(dá)通過(guò)導(dǎo)入并在植物中表達(dá)編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的核酸實(shí)現(xiàn)，其中所述bHLH轉(zhuǎn)錄因子由SEQIDNO213、SEQIDNO215、SEQIDNO:217、SEQIDNO:219、SEQIDNO225、SEQIDNO:297、SEQIDNO:299、SEQIDNO:301的任一種或前述SEQIDNO任一種的直向同源物或旁系同源物代表。101.才艮據(jù)外又利要求98至100任一項(xiàng)的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀是早期萌發(fā)勢(shì)。102.根據(jù)才又利要求100的方法，其中所述核酸有效連接組成型啟動(dòng)子、優(yōu)選GOS2啟動(dòng)子。103.根據(jù)權(quán)利要求100至102任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸是根據(jù)SEQIDNO:212、SEQIDNO:214、SEQIDNO:216、SEQIDNO:218、SEQIDNO:220、SEQIDNO:222、SEQIDNO:224、SEQIDNO:226和SEQIDNO:228、SEQIDNO:296、SEQIDNO:298、SEQIDNO:300的任一種核酸序列的部分或等位變體或剪接變體或能夠與根據(jù)SEQIDNO:212、SEQIDNO:214、SEQIDNO:216、SEQIDNO:218、SEQIDNO:220、SEQIDNO:222、SEQIDNO:224、SEQIDNO:226和SEQIDNO:228、SEQIDNO:296、SEQIDNO:298、SEQIDNO:300的任一種的核酸序列雜交的序列，其中所述部分、等位變體、剪接變體或雜交序列編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子。104.根據(jù)權(quán)利要求98至103任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的核酸是;f直物來(lái)源的，優(yōu)選來(lái)自單子葉植物，還優(yōu)選來(lái)自禾本科，更優(yōu)選來(lái)自稻屬，最優(yōu)選來(lái)自稻。105.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求98至104任一項(xiàng)的方法可獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分包舍編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的核酸。106.分離的多肽，其包含(i)由SEQIDNO:297、SEQIDNO:299和SEQIDNO:301的任一種所代表的氨基酸序列；(ii)氨基酸序列，其(a)以遞增優(yōu)選順序與由SEQIDNO:297、SEQIDNO:299和SEQIDNO:301代表的任何一種氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，和(b)具有bHLH結(jié)構(gòu)域；(iii)在以上(i)或(ii)中給出的任一氨基,列的衍生物。107.分離的核酸分子，其包含(i)由SEQIDNO:296、SEQIDNO:298和SEQIDNO:300的任一種所代表的核酸；(ii)由SEQIDNO:296、SEQIDNO:298和SEQIDNO:300的任一種所代表的核酸的互補(bǔ)序列；(iii)編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的核酸，所述bHLH轉(zhuǎn)錄因子(a)以遞增優(yōu)選的順序與由SEQIDNO:297、SEQIDNO:299和SEQIDNO:301的任何一種所代表的氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，并具有(b)bHLH結(jié)構(gòu)域。108.構(gòu)建體，其包含(a)編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的核酸，所述bHLH轉(zhuǎn)錄因子由SEQIDNO213、SEQIDNO215、SEQIDNO:217、SEQIDNO:219、SEQIDNO225、SEQIDNO:297、SEQIDNO:299、SEQIDNO:301的任一種或任一前述SEQIDNO的直向同源物或旁系同源物代表；(b)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列；和任選地(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。109.根據(jù)^5C利要求108的構(gòu)建體，其中所述一種或多種調(diào)控序列至少是組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選GOS2啟動(dòng)子。110.根據(jù)^l利要求108或109的構(gòu)建體的用途，用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀、尤其增強(qiáng)的早期萌發(fā)勢(shì)的植物。111.用根據(jù)權(quán)利要求108或109的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。112.用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(a)導(dǎo)入并在植物中表達(dá)編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的核酸，所述bHLH轉(zhuǎn)錄因子由SEQIDNO213、SEQIDNO215、SEQIDNO:217、SEQIDNO:219、SEQIDNO225、SEQIDNO:297、SEQIDNO:299、SEQIDNO:301的任一種或任一前述SEQIDNO的直向同源物或旁系同源物代表；和(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。113.相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述增加的產(chǎn)量由編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的核酸的增加的表達(dá)產(chǎn)生，其中所述bHLH轉(zhuǎn)錄因子由SEQIDNO213、SEQIDNO215、SEQIDNO:217、SEQIDNO:219、SEQIDNO225、SEQIDNO:297、SEQIDNO:299、SEQIDNO:301的任一種或任一前述SEQIDNO的直向同源物或旁系同源物代表。114.根據(jù)權(quán)利要求105、111或113的轉(zhuǎn)基因植物，或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷物，如稻、玉米、小麥、大麥、栗、黑麥、黑小麥、高粱和燕麥。115.根據(jù)權(quán)利要求114的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選是種子。收獲部分的產(chǎn)物。116.根據(jù)權(quán)利要求114的植物和/或根據(jù)權(quán)利要求115的植物的收獲部分的產(chǎn)物。117.編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的核酸在增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀中的用途，其中所述bHLH轉(zhuǎn)錄因子由SEQIDN0213、SEQIDNO215、SEQIDNO:217、SEQIDNO:219、SEQIDNO225、SEQIDNO:297、SEQIDNO:299、SEQIDNO:301的任一種或任一前述SEQIDNO的直向同源物或旁系同源物代表。118.根據(jù)權(quán)利要求117的用途，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀是早期萌發(fā)勢(shì)。119.用于相對(duì)于合適的對(duì)照植物增加植物中產(chǎn)量的方法，其包括增加編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸在植物中的表達(dá)，和任選地選擇具有增加的產(chǎn)量的植物。120.根據(jù)權(quán)利要求119的方法，其中通過(guò)T-DNA激活、TILLING、位點(diǎn)定向誘變、定向進(jìn)化和同源重組的任何一種或多種方法實(shí)現(xiàn)所述增加的表達(dá)。121.根據(jù)權(quán)利要求119的方法，其中通過(guò)導(dǎo)入并在植物中表達(dá)編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸實(shí)現(xiàn)所述增加的表達(dá)。122.根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中所述編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子的核酸是在表N中給出的任何一種核酸SEQIDNO或其部分，或是能夠與在表N中給出的任何一種核酸SEQIDNO雜交的序列。123.根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中所述編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子的核酸編碼在表N中給出的任一核酸SEQIDNO的直向同源物或旁系同源物。124.根據(jù)權(quán)利要求119至123任一項(xiàng)的方法，其中所述增加的產(chǎn)量是增加的種子產(chǎn)量。125.權(quán)利要求124的方法，其中所述增加的種子產(chǎn)量包含下列一種或多種a)增加的地上部分生物量b)增加的每林植物花數(shù)；c)增加的種子產(chǎn)量；d)增加的(飽滿)種子數(shù)；e)增加的千粒重(TKW);和f)增加的收獲指數(shù)。126.根據(jù)權(quán)利要求121至125任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸有效連接組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選連接HMGB(高速泳動(dòng)族B)啟動(dòng)子或GOS2啟動(dòng)子，進(jìn)一步優(yōu)選地連4妾稻HMGB啟動(dòng)子或稻GOS2啟動(dòng)子。127.才艮據(jù)4又利要求121至126任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸是植物來(lái)源的，優(yōu)選來(lái)自雙子葉植物，進(jìn)一步優(yōu)選來(lái)自十字花科，最優(yōu)選來(lái)自擬南芥。128.通過(guò)^^艮據(jù)權(quán)利要求119至127任一項(xiàng)的方法可獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子的重組核酸。129.構(gòu)建體，其包含(a)編碼SPL1S轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸；(b)能夠驅(qū)動(dòng)(a)的核酸序列表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列；和任選地(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。130.根據(jù)權(quán)利要求129的構(gòu)建體，其中所迷一種或多種調(diào)控序列至少是組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選HMGB啟動(dòng)子或GOS2啟動(dòng)子。131.根據(jù)權(quán)利要求129或130的構(gòu)建體的用途，用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量的植物。132.用根據(jù)權(quán)利要求129或130的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)月包。133.用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包4舌(a)導(dǎo)入并在植物細(xì)胞中表達(dá)編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸；和(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育植物細(xì)胞。134.相對(duì)于對(duì)照植物具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，所述增加的產(chǎn)量由編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子的核酸的增加的表達(dá)產(chǎn)生。135.根據(jù)權(quán)利要求128、132或134的轉(zhuǎn)基因植物，或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷物，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、高粱和燕麥。136.才艮據(jù)權(quán)利要求135的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選是種子。137.來(lái)自根據(jù)權(quán)利要求135的植物和/或根據(jù)權(quán)利要求136的植物的可收獲部分的產(chǎn)物。138.編碼SPL15轉(zhuǎn)錄因子多肽的核酸的用途，用于相對(duì)于對(duì)照植物增加植物中的產(chǎn)量。139.根據(jù)權(quán)利要求138的用途，其中所述增加的產(chǎn)量是增加的種子產(chǎn)量。全文摘要本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并涉及用于相對(duì)于對(duì)照植物增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀、尤其用于增加植物產(chǎn)量和/或早期萌發(fā)勢(shì)的方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括修飾編碼HAL3多肽、MADS15多肽、PLT轉(zhuǎn)錄因子多肽、基本/螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子或SPL15轉(zhuǎn)錄因子的核酸的表達(dá)。本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體。文檔編號(hào)C12N15/82GK101415829SQ200780011307公開(kāi)日2009年4月22日申請(qǐng)日期2007年3月30日優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日發(fā)明者A·I·桑茲莫林納羅,C·勒佐,V·弗蘭卡德申請(qǐng)人:巴斯福植物科學(xué)有限公司