專利名稱：：飲食用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含丁酸菌和纖維寡糖(cello-oligosaccharide)的飲食用組合物(用于飲料或食品的組合物)。更詳細而言，涉及含有產(chǎn)生丁酸且整腸作用優(yōu)異的丁酸菌和作為丁酸菌的基質(zhì)并助長丁酸產(chǎn)生的纖維寡糖、提高腸內(nèi)的丁酸產(chǎn)生量、改善腸內(nèi)環(huán)境、防御感染癥功能等優(yōu)異的飲食用組合物及其用途。
背景技術(shù)：
：腸道除了具有消化、吸收維持生命所必需的營養(yǎng)素的作用以外，還具有保護身體以防有害細菌或病毒、異物等外敵入侵的作用(腸道免疫功能)，是維持健康非常重要的器官。近年來通過有關(guān)生理功能的研究，解明以腸內(nèi)菌群為首的腸內(nèi)環(huán)境的改善與預(yù)防疾病(預(yù)防消化系統(tǒng)疾病、降低致癌危險度等)、健康的維持增進密切相關(guān)。已知腸道中常駐100種以上、ioo兆個細菌，大致分為雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌、擬桿菌(fiacten9Wes)、大腸桿菌等腐敗菌。作為促進有益菌增殖并具有抑制腐敗菌作用的調(diào)節(jié)腸內(nèi)細菌的原料，各種益生菌(probiotics)(通過改善腸內(nèi)菌群的平衡而對宿主動物發(fā)揮有益作用的活菌劑)和益生元(prebiotics)(使腸內(nèi)有益菌增殖的因子寡糖、食物纖維等)已經(jīng)上市。作為使原來生存在體內(nèi)的雙歧桿菌等有益菌顯著增殖的物質(zhì)有益生元，使用各種寡糖或食物纖維等。寡糖的例子有果寡糖、異麥芽寡糖、半乳寡糖、木寡糖、甜菜寡糖等難消化性寡糖。難消化性寡糖不被胃和小腸分解而到達大腸，被大腸內(nèi)的腸內(nèi)細菌利用，生成乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等短鏈脂肪酸。這些短鏈脂肪酸具有增加消化道血流粘膜血液量、使消化道粘膜上皮細胞增殖、抑制膽固醇合成等生理活性。即使在短鏈脂肪酸中，當(dāng)乳酸過剩蓄積時，也會引起粘膜障礙，對大腸上皮細胞的新陳代謝產(chǎn)生不良影響。另一方面，大部分丁酸在進入全身的能量庫之前被大腸上皮細胞攝取，使新陳代謝活躍。另夕卜，丁酸也具有修復(fù)DNA和預(yù)防大腸癌的效果。并且，乙酸、丙酸、丁酸除了參與由于腸內(nèi)pH降低而引起的有害菌的增殖抑制外，還被用作能源，并且具有促進腸蠕動的作用。寡糖中，代表性的益生元一果寡糖是果糖與蔗糖經(jīng)1,4-鍵連接而成的寡糖。果寡糖被腸內(nèi)的有益細菌、特別是雙歧桿菌選擇性地利用，由于為難消化性，因此可謂是非常有助于腸內(nèi)菌群的改善。但果寡糖的穩(wěn)定性不充分，特別是在酸性溶液中長期保存時轉(zhuǎn)化成葡萄糖、果糖、蔗糖，存在其生理活性也降低的問題。至于其他寡糖，也具有同樣的缺點。另外，雖然雙歧桿菌的增殖使曱基吲咪、巧l哚等腐敗物質(zhì)減少，但由雙歧桿菌生成的短鏈脂肪酸主要是乳酸和乙酸，當(dāng)大腸內(nèi)的菌群顯著偏向于雙歧桿菌時，丁酸濃度下降。從上述背景考慮，希望開發(fā)被丁酸菌選擇性利用的寡糖。然而，僅使用益生元時，當(dāng)腸內(nèi)菌群的平衡偏向于腐敗菌時存在效果非常小的問題。因此，為有效增加腸內(nèi)有益菌而混合有具益生菌功能的活菌劑和具益生元功能的寡糖的協(xié)同物質(zhì)已經(jīng)商品化。在曰本特開2003-93019號公報(專利文獻l)中，有人公開了含有雙歧桿菌作為益生菌、含有木寡糖作為益生元的經(jīng)口攝取用組合物，提供了小型、保存性優(yōu)異的經(jīng)口攝取用組合物。在日本特開2005-34135號公報(專利文獻2)中，有人還公開了包含益生菌、益生元、生機食物(biogenics)中的1種或2種以上的提高食品有效成分的機體內(nèi)利用效率的功能增強組合物。另外，在日本特開2004-357505號公報(專利文獻3)中，有人公開了含有啤酒酵母、活菌劑、寡糖、茶提取物的用于預(yù)防、輕減犬的胃腸疾病的添加劑。但在上述現(xiàn)有技術(shù)中，主要著眼于雙歧桿菌增殖因子，還不存在著眼于丁酸生成的產(chǎn)品，不能十分滿足改善腸內(nèi)環(huán)境的需要。另外，在日本特開平7-145號公報(專利文獻4)中，有人公開了包含丁酸菌和葡甘露聚糖的丁酸菌組合物。丁酸菌雖然利用葡甘露聚糖，但丁酸的產(chǎn)生量對改善腸內(nèi)環(huán)境并不充分。專利文獻1:日本特開2003-93019號公報專利文獻2:日本特開2005-34135號公報專利文獻3:日本特開2004-357505號公報專利文獻4:日本特開平7-145號公報
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的課題在于提供可以顯著改善腸內(nèi)環(huán)境的飲食用組合物。解決課題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明人等為了解決上述i果題進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使在多種活菌劑中，通過將產(chǎn)生丁酸且整腸作用優(yōu)異的丁酸菌和纖維寡糖組合，纖維寡糖成為丁酸菌的基質(zhì)，在腸內(nèi)可以顯著提高丁酸菌的丁酸產(chǎn)生。而且同時發(fā)現(xiàn)可以實現(xiàn)有效增加腸內(nèi)的有益菌、減少腐敗物質(zhì)的量等腸內(nèi)環(huán)境的改善。本發(fā)明人等基于上述知識，完成了本發(fā)明，作為具體化的方案，提供下述發(fā)明?！?〕飲食用組合物，該組合物含有丁酸菌和纖維寡糖，并具有改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和/或防雄p感染癥的功能?！?〕〔1〕的飲食用組合物，其中丁酸菌為丁酸梭菌(C/o^7'W"附〔3〕飼料，該飼料含有丁酸菌和纖維寡糖，并具有改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和/或防御感染癥的功能。〔4〕食品，該食品含有丁酸菌和纖維寡糖，并具有改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和/或防雄卩感染癥的功能?！?〕丁酸菌和纖維寡糖在作為具有改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和/或防御感染癥的功能的飲食用組合物中的應(yīng)用?！?〕丁酸菌和纖維寡糖在作為具有改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和/或防御感染癥的功能的飼料或食品中的應(yīng)用。發(fā)明效果本發(fā)明的飲食用組合物，纖維寡糖不僅成為丁酸菌的基質(zhì)，其在腸內(nèi)還可以顯著提高丁酸菌的丁酸產(chǎn)生能。并且，不僅使腐敗菌減少、使有益菌增加，還可以減少腐敗物質(zhì)等，改善腸內(nèi)環(huán)境。因此，將本發(fā)明的飲食用組合物給予人或動物時，可以增加大腸部位的丁酸菌、提高丁酸含量，可以將大腸上皮細胞維持在健全的狀態(tài)。其結(jié)果，對各種感染癥的防御功能提高，還與大腸癌或大腸疾病的預(yù)防相關(guān)，可以維持、增進健康。另外，將本發(fā)明的飲食用組合物供給畜產(chǎn)用動物時，疾病率降低、增體重效果優(yōu)異，因此可以縮短出欄天數(shù)，可以降低成本，在經(jīng)濟上也有優(yōu)點。附圖簡述圖1是顯示實施例3中的斷奶30天后的仔豬的糞便中菌群的圖。圖2是顯示實施例3中的斷奶30天后的仔豬的糞便中曱基巧l咪(SKT)量的圖。圖3是顯示實施例3中的斷奶30天后的仔豬的糞便中有機酸組成的圖。圖4是顯示實施例3中的斷奶30天后的仔豬的糞便中氨量的圖。圖5是顯示實施例3中的斷奶時和斷奶30天后的仔豬的血清中氨量的圖。圖6是顯示實施例4中的初生雛雞(18日齡、42日齡)的盲腸內(nèi)容物中的有機酸組成的圖。實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的飲食用組合物含有丁酸菌和纖維寡糖。即，本發(fā)明的飲食用組合物含有丁酸菌作為益生菌、含有纖維寡糖作為益生元，具有在腸內(nèi)、特別是在大腸中提高丁酸濃度、維持健全狀態(tài)的效果。即，本發(fā)明的飲食用組合物具有在才幾體內(nèi)發(fā)揮改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和防御感染癥的功能這兩種功能、或者至少發(fā)揮一種功能。本發(fā)明的飲食用組合物的第一有效成分為丁酸菌。作為益生菌，通常4吏用只又卩支4干菌(Bzyfifo6acfe〃'ww)、浮L酸菌(丄acto6ac/〃wjs;.)等。幼兒的腸內(nèi)菌群中雙歧桿菌等有益菌占優(yōu)勢，但隨著年齡的增加有益菌減少、腐敗菌的比例增加。因此，為了抑制腐敗菌或增加有益菌，雙歧桿菌或乳酸菌等多種活菌劑被用作益生菌。但雙歧桿菌或乳酸菌即使經(jīng)口攝取，對胃液或膽汁等酸也不具耐性，活著達到腸內(nèi)的不過微乎其微。另外，即使一部分固定，但若中止攝取則存在著腸內(nèi)菌群恢復(fù)為腐敗菌優(yōu)勢的菌群的問題。相對于此，本發(fā)明中使用的丁酸菌在需氧下形成芽胞，經(jīng)口給予后在胃內(nèi)暴露在蛋白消化液胃蛋白酶和胃酸形成的低pH環(huán)境中，作為芽胞而具抵抗性的丁酸菌在不死亡的情況下通過此處，達到十二指腸。此處pH上升至中性附近，食物被各種消化液消化形成營養(yǎng)豐富的環(huán)境后，丁酸菌得到發(fā)芽增殖的機會。即使經(jīng)口攝取，也不會被胃液或膽汁消化，保持胞子狀態(tài)到達大腸，可以在大腸內(nèi)發(fā)芽增殖產(chǎn)生丁酸。本發(fā)明中使用的丁酸菌只要是生成丁酸的菌即可，可以是任何菌種。其中優(yōu)選梭菌屬，特別優(yōu)選丁酸梭菌種。并且如下所述，丁酸梭菌的優(yōu)選菌林的代表性例子有丁酸梭菌MIYAIRI"!i)林。丁酸梭菌呈偏性厭氧性的芽胞形成性。該菌抹于1933年由千葉醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生學(xué)教室(現(xiàn)千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部)宮入近治博士從人腸道內(nèi)取得，作為對腐敗菌具有強拮抗作用的丁酸菌進行了報道。本菌抹對腐敗菌為首的各種消化道病原體具有拮抗作用，通過與雙歧桿菌或乳桿菌等所有腸內(nèi)有益菌共生而發(fā)揮整腸效果。還有報道稱，本菌林為芽胞形成細菌，因此其在制劑中的穩(wěn)定性和對胃酸的抵抗性比乳酸菌群高。作為本發(fā)明中使用的丁酸菌，具體例子有乳酸菌.:T""，7夕，厶、丁酸梭菌NIP1006、丁酸4復(fù)菌MP1015、丁酸梭菌NIP1017、丁酸#_菌MIYAIRI588(C7o^Www6"0t/cwwMIYAIRI588)，其中特別優(yōu)選丁酸產(chǎn)生能高的丁酸梭菌MIYAIRI588(FERMBP-2789)。丁酸梭菌MIYAIRI588于1981年(昭和56年)5月1日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院微生物工業(yè)技術(shù)研究所(日本國茨城縣筑波市東l丁目l番3號(郵政編碼305))[現(xiàn)在改稱為獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(郵政編碼305-8566日本國茨城縣筑波市東1-1-1中央第6)],其保藏號為FERMBP-2789(由昭和47年5月16日寄托的微工研菌寄第-P1467號移管)。在本發(fā)明的飲食用組合物中，丁酸菌可以使用市售的活菌劑、例如;、X卩廿^片(;、\y廿>(抹)制)等，將丁酸菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進行液體培養(yǎng)后，可以分離菌體直接使用，也可以進行干燥以干燥菌體的形式使用。使用市售的活菌劑時，考慮所含丁酸菌的純度或含量等，調(diào)整混合量使含有下述菌數(shù)。在本發(fā)明的飲食用組合物中，使用纖維寡糖作為第2有效成分。與果寡糖等相比，纖維寡糖被腸內(nèi)的丁酸菌特別選擇性地利用，對丁酸菌的增殖效果大，因此與丁酸的生成量增加有關(guān)。另外，纖維寡糖在酸性下的穩(wěn)定性也高。因此，在本發(fā)明的飲食用組合物中，纖維寡糖作為益生元而有效發(fā)揮作用。在本發(fā)明中，纖維寡糖是2糖以上葡萄糖經(jīng)(3-1,4鍵連接而成的寡糖。纖維寡糖通常是各種聚合度的寡糖的混合物，可被純化成單一或特定范圍的聚合度的寡糖。在本發(fā)明中，上述寡糖中優(yōu)選富含葡萄糖聚合度為2-6的纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖、纖維六糖中的至少一種；特別優(yōu)選富含纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖中的至少一種；進一步優(yōu)選富含纖維二糖和纖維三糖中的至少一種。具體而言，葡萄糖聚合度為2~6的纖維寡糖的含有率為50%(重量)以上、特別是80%(重量)以上，其中^尤選為90%(重量)以上。而且，纖維二糖的含有率為70%(重量)以上，優(yōu)選85%(重量)以上，更優(yōu)選90%%(重量)以上，進一步優(yōu)選95%(重量)以上。尚需說明的是，雖然對纖維寡糖的立體異構(gòu)沒有特別說明，^旦通常多為D異構(gòu)體。本發(fā)明中使用的纖維寡糖可以按照公知的方法進行制造。例如，作為化學(xué)方法，已知有將纖維素用發(fā)煙鹽酸-濃硫酸進行酸水解后，利用碳柱等分級分取纖維寡糖的方法(Miller,G丄，MethodsinCarbohydrateChemistryIII(AcademicPress)，134(1963》等。作為酶法，已知有使屬于纖維弧菌屬(0/"/^/0)屬的微生物所產(chǎn)生的纖維素酶與非結(jié)晶纖維素作用，通過組合超濾反應(yīng)器來解除產(chǎn)物阻害，生成纖維寡糖的方法(參照日本特開平1-256394號公報)；使選擇性地除去了纖維素酶中的p-葡糖苦酶的纖維素酶與纖維素作用來制造纖維寡糖的方法(參照日本特開平5-115293號公報)；在以濕潤狀態(tài)的未漂白亞硫酸紙漿為原料并使其與纖維素酶作用的系統(tǒng)中組合超濾裝置，制作包含纖維二糖的纖維寡糖的方法(參照特公平8-2312號公報)等。還已知以下方法利用糖質(zhì)加磷酸分解酶(纖維糊精磷酸化酶)的逆反應(yīng)，以葡萄糖l磷酸作為葡萄糖供體，在纖維二糖的存在下制造纖維寡糖的制造方法(JournalofFermentationandBioengineering,77巻，3號，239-242(1994))。作為本發(fā)明的飲食品組合物中的纖維寡糖，除了使用利用上述任一種方法制造的寡糖外，還可以使用市售的寡糖(CMSChemicals社等)。在本發(fā)明中，優(yōu)選以下方法使用纖維素酶將纖維素分解成纖維寡糖，經(jīng)過晶析步驟等提高葡萄糖聚合度為2~4的纖維寡糖的純度的方法。并且，纖維寡糖不僅作為丁酸菌的基質(zhì)，此外還具有特有的生理作用。例如關(guān)于其對脂質(zhì)代謝的影響，有報道稱將大鼠用添加有纖維二糖的高蔗糖食物飼養(yǎng)4周時，與對照組相比體脂肪率下降、總膽固醇或中性脂肪也降低(渡邊隆司，CelluloseCommun.，5，91(1998))。還有"t艮道稱通過對肉食雞或產(chǎn)蛋雞給予添加了纖維二糖的飼料，脂肪酸合成酶活性得到抑制，脂肪酸分解酶活性上升(石田藍子、村上齊、山崎誠、大塚誠、真許勝弘、本間秀彌、金井幸雄、高田良三，曰本畜產(chǎn)學(xué)會第103次大會講演要旨集，52(2004);石田藍子、大塚誠、勝俁昌也、高田良三、金井幸雄，日本畜產(chǎn)學(xué)會第104回大會講演要旨集，69(2005))。如上所述，認(rèn)為纖維二糖不僅作為丁酸菌的基質(zhì)，對丁酸的生成發(fā)揮效果，而且其本身也對機體內(nèi)的脂質(zhì)代謝產(chǎn)生有利影響，有助于預(yù)防生活方式病。推測在本發(fā)明的飲食品組合物中，還一并發(fā)揮上述纖維二糖所特有的優(yōu)異的生理作用。另外，本發(fā)明人等確認(rèn)在各種腸內(nèi)細菌中，作為丁酸菌的梭菌屬的細菌能夠良好地利用纖維寡糖，特別是丁酸梭菌，其在可以良好地利用纖維寡糖的同時，丁酸產(chǎn)生能也高。實際上，為了觀察在人糞便中添加纖維寡糖時，丁酸菌是否選擇性地增殖，制備糞便懸浮液，向其中添加玉米淀粉或纖維寡糖，接種、培養(yǎng)丁酸菌，結(jié)果確認(rèn)與對照的玉米淀粉添加液相比，纖維寡糖添加液的pH顯著降低，丁酸菌增殖。并且，對自由攝取纖維寡糖3天的大鼠給予丁酸菌，研究其腸道內(nèi)容物中的丁酸菌的菌數(shù)時，確認(rèn)纖維寡糖攝取大鼠比非攝取大鼠的腸內(nèi)丁酸菌的菌數(shù)多。上述實驗結(jié)果暗示在消化道內(nèi)纖維寡糖不被常駐的腸內(nèi)細菌利用，而僅被結(jié)合使用的丁酸菌選擇性地利用，象本發(fā)明這樣混合有纖維寡糖和丁酸菌的組合物可以增加其菌數(shù)。在本發(fā)明的飲食用組合物中，丁酸菌和纖維寡糖的混合量，當(dāng)用于醫(yī)療時，可以根據(jù)患者的年齡、疾病的癥狀而適當(dāng)增減；當(dāng)用于功能性食品、用于動物時，可以^4居各自的目的而適宜增減。對丁酸菌的量沒有特別限定，典型的是，以菌數(shù)計每天lxl05~lxl01GCFU(菌落形成單位)的范圍;優(yōu)選為lxl06~lxio8CFU的范圍。只要以該給予量為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)給予量與每天給予次數(shù)的關(guān)系來適當(dāng)調(diào)整本發(fā)明的飲食用組合物中的丁酸菌的量即可。另一方面，纖維寡糖的混合量可以為成為丁酸菌的基質(zhì)、作為益生元助長整腸作用所必需的量的范圍，但必需還考慮到若過剩攝取纖維寡糖則有可能引起軟便。纖維寡糖的1日最大攝取量優(yōu)選為每Kg體重0.36g左右。通常，在本發(fā)明的飲食用組合物中，可以含有0.1~50%(重量)的纖維寡糖，優(yōu)選為1.0~30%(重量)。本發(fā)明的飲食用組合物的給予方法為作為藥品時，優(yōu)選1日1次3次、飯后服用，但也可適當(dāng)服用；用于功能性食品、用于動物時，可以1日1次~數(shù)次、自由攝取。本發(fā)明的飲食用組合物的制造例如可以按照以下方法來進行。將利用公知的CS培養(yǎng)基(參照日本特開昭59-187784號公報)培養(yǎng)的丁酸菌通過離心進行固液分離，將所得菌糊干燥，向得到的干燥菌粉末中添加纖維寡糖，使用混合機混合至均勻。接下來進行真空干燥。真空干燥的條件例如具體可以為使用棚式真空干燥機在50°C、10mmHg下干燥5小時。將所得干燥物用粉碎機4分碎，得到該組合物。如此操作，可以得到乳白色、均質(zhì)細粒狀、幾乎無味無臭的組合物。本發(fā)明的飲食用組合物可以適用于包括人在內(nèi)的所有動物。另外，可以沒有限制地用于幼年期至高齡期的所有年齡的動物，同時對健康狀態(tài)、體格等也沒有特別限定。作為除人以外的動物，除大鼠、小鼠、兔等實驗動物外，還包括豬、牛、綿羊、山羊、馬等家畜；雞、鴨、鶉、火雞等家禽；狗、貓等寵物等。對本發(fā)明的飲食用組合物的給予方法沒有特別限定，可以將丁酸菌和纖維寡糖混合制成片劑、小塊(tablet)等經(jīng)口給予；也可以制成粉狀或顆粒狀，添加在飲食物中給予。還可以將丁酸菌和纖維寡糖的各自粉末分別制成制劑，制成在添加或給予時同時利用的形式。將本發(fā)明的飲食用組合物例如用作藥品時，其劑型可以是將各成分的粉末無需制成制劑而直接〗吏用，還可以制成散劑、顆粒劑、細粒劑、片劑、糖衣片劑、膠嚢劑、小塊(tablet)、腸溶衣劑等制劑。稀釋劑中使用普通藥品制劑中使用的賦形劑、粘合劑、崩解劑等，除此之外，還可以添加著色劑、矯味劑、穩(wěn)定化劑、保存劑、潤滑劑等。將本發(fā)明的飲食用組合物用作食品時，各成分的粉末可以無需制成制劑而直接使用，還可以添加其他食物纖維、寡糖、谷物類、維生素類等，進一步添加香料、著色劑、矯味劑等，形成加工成適于食用的形式。還可以作為食品添加劑添加混合在其他食品中使用。作為動物用飼料，可以將丁酸菌和纖維寡糖無需制成制劑而以粉末狀態(tài)進行混合使用，但與用于食品時一樣可以添加各種賦形劑、添加劑。形狀可以直接是壽分狀，也可以制成劑型后使用。還可以和作為飼料成分的玉米粉、豆餅、大麥粉、棵麥粉、大豆粉、米糠、脫脂米糠、稻皮、馬鈴薯粉、甘蔗粉、豆腐渣、淀粉、酵母、魚粉等混合使用。實施例以下，通過實施例來詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受限于此。[丁酸的測定方法J在150mg盲腸內(nèi)容物中添加350^L蒸餾水，用;K'J卜口xR(《才T千力社制)進行勻漿(Lebe130，30秒,4。C)后,在通過離心(15，000rpm、15分鐘、4。C)得到的0.5mL上清中添加0.5mL氯仿。該上清用VortexR混合器攪拌1分鐘后離心(15,000rpm、15分鐘、4°C),所得上層用MILLIPORER(MILLIPORE社制)進行濾器過濾，將10//L添加到HPLC中。"HPLC條件"溶液轉(zhuǎn)運系統(tǒng)島津LC-1OAD(島津制作所制)柱Shim-packSCR-102(H)檢測器CDD-10A流動相5mM對曱苯^黃酸反應(yīng)相20mMBis-Tris(含有5mM的對甲苯磺酸、100mM的EDTA)溫度45。C在給水中混合5%(重量)的纖維寡糖(96%(重量)的纖維二糖、2%(重量)的葡萄糖、2%(重量)的纖維三糖)，對自由攝取3天上述食物的ICR系小鼠(體重約30g)4安每只1.0x108個經(jīng)口給予丁酸梭菌MIYAIRI588(FERMBP-2789)。給予3小時、6小時后宰殺動物，摘出全部消化道，在厭氧性手套箱內(nèi)使用GAM平板培養(yǎng)基測定其內(nèi)容物中的丁酸梭菌MIYAIRI588的活菌數(shù)。需要說明的是，對作為對照的未攝取纖維寡糖的系統(tǒng)也進行同樣的操作。結(jié)果見表1。使用Wistar系雄性大鼠(7周齡)，用以玉米淀粉作為碳水化合物源的標(biāo)準(zhǔn)飼料(參照表2的對照)預(yù)飼養(yǎng)7天，使其適應(yīng)實驗環(huán)境，選出無異常的個體，l組8只供給實驗。使用表2記載的組成的飼料，按照纖維寡糖(96%(重量)的纖維二糖、2%(重量)的葡萄糖、2%(重量)的纖維三糖)單獨給予區(qū)(9%(重量))、丁酸菌和纖維寡糖結(jié)合使用給予區(qū)(9%(重量)的纖維寡糖+0.03%(重量)、0.1%(重量)或0.3%(重量)的丁酸菌粉末)進行試驗。丁酸菌4吏用丁酸梭菌MIYAIRI588(FERMBP-2789)。丁酸菌粉末中丁酸菌的菌數(shù)為4.1xl01QCFU/g?？瞻诪榻o予標(biāo)準(zhǔn)飼料(參照表2的對照)的區(qū)。自由攝取銅料，飼養(yǎng)14天后宰殺，利用HPLC測定盲腸內(nèi)容物的丁酸含量。另外，有關(guān)丁酸菌粉末的攝取，除混鉺使之自由攝取外，還設(shè)定l日l次胃內(nèi)強制給予丁酸菌粉末(給予量為6.2xl09CFU/200g體重)的區(qū)。強制給予區(qū)在何中添加9%(重量)的纖維寡糖。各區(qū)的盲腸內(nèi)容物的丁酸含量的結(jié)果見表3。[表21飼料組成(表中的數(shù)字為1Kg飼料中的各組合物的含量(g))<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(表2的腳注)*維生素混合物/礦物混合物一艮據(jù)AIN-76組成(JournalofNutrition107,1340(1977))來制備。[表3丁酸含量<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>由本實施例的結(jié)果判明通過將纖維寡糖和丁酸菌結(jié)合使用，在丁酸產(chǎn)生上可見協(xié)同效果，并且通過將丁酸菌給予法由混斜變?yōu)槲竷?nèi)強制給予，進一步提高了協(xié)同效果。特別是與參考例的結(jié)果一并考察時，與增加纖維寡糖的添加量時相比，增加丁酸菌添加量的本實施例中丁酸含量飛躍增加，因此判明通過將纖維寡糖和丁酸菌結(jié)合使用，發(fā)揮了協(xié)同效果，可以飛躍性提高腸內(nèi)的丁酸含量。有關(guān)宮入菌(丁酸菌)的纖維寡糖利用性，與其他腸內(nèi)細菌進行比較。供試菌抹為宮入菌(丁酸梭菌MIYAIRI588(FERMBP-2789),C7o^nWw附6w(yn'cwwMIYAIRI588)、枯草菌(枯草芽孢桿菌JCM2499,J5a"7/wsTO^'fcJCM2499)、雙歧桿菌(青春雙岐桿菌JCM1275，^ykfokz"ehwwcwfo/esce"feJCM1275)、乳酸菌(干酪乳桿菌JCM1134,丄acto6a"7/wscose/JCM1134)四種菌林。供試培養(yǎng)基使用在下述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1%(重量)纖維寡糖(96%(重量)的纖維二糖、2%(重量)的葡萄糖、2%(重量)的纖維三糖)、將進行了前培養(yǎng)的各菌抹接種在PYC培養(yǎng)基中，使初始菌數(shù)為約105CFU/ml。作為對照，將上述菌林接種在PY培養(yǎng)基中。宮入菌、并調(diào)整至pH7.0的培養(yǎng)基(PYC培養(yǎng)基)。(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)PY培養(yǎng)基氯高鐵血紅素溶液1.0ml維生素K,0.02ml半胱氨酸HC1-H200.05g雙歧桿菌、乳酸菌進行厭氧培養(yǎng)，枯草菌進行需氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為37。C。尚需說明的是，各菌的前培養(yǎng)如下。宮入菌接種在GAM肉湯培養(yǎng)基(GAMbroth)中后在37。C下培養(yǎng)6小時。枯草菌、雙歧桿菌、乳酸菌接種在GAM肉湯培養(yǎng)基中后在37"C下培養(yǎng)16小時。通過代謝纖維寡糖時所產(chǎn)生的有機酸的產(chǎn)生量來比較各菌林的利用性。從開始培養(yǎng)起0、6、12、24、48小時后采取樣品，利用HPLC測定有機酸。算出從PYC培養(yǎng)基中的有機酸減去相同培養(yǎng)時間的PY培養(yǎng)基中的有機酸的值，作為有機酸的產(chǎn)生量。表4中顯示出從各培養(yǎng)開始起一定時間(6小時、12小肘、24小時、48小時)后的各細菌的有機酸產(chǎn)生量(mM)。[表4有機酸的產(chǎn)生量<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>200780012320.7轉(zhuǎn)溢*被18/255t由表4可知與其他細菌相比，宮入菌從4交早的時間起就確認(rèn)到有機酸的產(chǎn)生，產(chǎn)生量也多。另外，產(chǎn)生丁酸的細菌只有宮入菌。就下述項目來研究評價本發(fā)明品對豬的有效性。首先，從對照區(qū)和給予了本發(fā)明品的本發(fā)明品給予區(qū)(MGC區(qū))群養(yǎng)各3腹母豬進行試驗。在各母豬產(chǎn)出的仔豬中，對10頭進行取樣。集合出產(chǎn)日附近的母豬開始以下試驗。試驗期間為出產(chǎn)前起斷奶后30天，取樣日為斷奶后和試驗最終日(斷奶30天后)。給予的伺料組成4艮據(jù)豬的成長如下調(diào)整。(給予的飼料)a)授乳期仔豬；給予在基本詞料(牛奶)中添加了0.5%(重量)本發(fā)明品的飼料直至斷奶。b)斷奶后仔豬；給予在基本祠料中添加了0.2%(重量)本發(fā)明品的伺料約30天。c)母豬；給予在基本飼料中添加了0.2%(重量)本發(fā)明品的詞料。(本發(fā)明品)-組成丁酸菌粉末10%(重量)纖維寡糖20%(重量)淀粉20%(重量)葡萄糖20%(重量)硅酸鋁20%(重量)碳酸鉤10%(重量)-纖維寡糖-使用含96%(重量)的纖維二糖、2%(重量)的葡萄糖、2%(重量)的纖維三糖的寡糖。'丁酸菌粉末為每1g本發(fā)明品中含有107個以上的宮入菌(丁酸梭菌MIYAIRI588(FERMBP-2789))的活菌體(芽胞)的比例。對于對照區(qū)的豬(母豬和仔豬)，在基本伺料中未添加任何物質(zhì)直接給予、祠養(yǎng)。尚需說明的是，基本飼料為混合有抗生素(阿維霉素、硫酸粘桿菌素、枸櫞酸莫侖太爾)的市售伺料。當(dāng)為仔豬時，市售飼料是指以下混合飼料。(混合飼料)-授乳期"圓圈中印哺乳期仔豬育成用混合飼料primerI"(中部伺料林式會社制)'授乳斷奶期"圓圏中印哺乳期仔豬育成用混合飼料pron，，(中部飼料抹式會社制)'斷奶后"圓圏中印哺乳期仔豬育成用混合飼料welcomeII"(中部祠料林式會社制)以斷奶30天后的MGC區(qū)和對照區(qū)的仔豬的糞便為對象，測定糞便中菌群和糞便中的有機酸和曱基吲咮(SKT)的量以及糞便中和血清中的氨量?！布S便中菌群〕如下測定糞便中的宮入菌(丁酸梭菌，C7o^Wiw2Z^0^7'cw附)、產(chǎn)氣莢膜桿菌(C.perfringens)、腸內(nèi)細菌科(腸桿菌科，Enterobacteriaceae)、腸3求菌、浮L酸菌的菌凄t。將從對照區(qū)和MGC區(qū)的斷奶30天后的仔豬中采取的糞便放入輸送培養(yǎng)基中懸浮。使用稀釋液100倍階段稀釋后，涂抹在各選擇培養(yǎng)基上。測定菌數(shù)時，宮入菌中使用MIM培養(yǎng)基、產(chǎn)氣莢膜桿菌中使用NN培養(yǎng)基、腸內(nèi)細菌科中使用DHL培養(yǎng)基。另外，腸球菌使用TATAC培養(yǎng)基、乳酸菌使用變法LBS培養(yǎng)基。當(dāng)為DHL培養(yǎng)基時培養(yǎng)1天，當(dāng)為TATAC培養(yǎng)基、TS培養(yǎng)基、MIM培養(yǎng)基和NN培養(yǎng)基時培養(yǎng)2天，當(dāng)為BL培養(yǎng)基和LBS培養(yǎng)基時培養(yǎng)3天，計測形成的菌落，算出菌數(shù)(logCFU/g)。尚需說明的是，在腸內(nèi)細菌科細菌中，大腸桿菌以DHL培養(yǎng)基上形成的淺粉色菌落數(shù)作為菌數(shù)進行計數(shù)。并且在腸內(nèi)細菌中，還測定大腸桿菌毒素產(chǎn)生林的菌數(shù)。在大腸桿菌毒素產(chǎn)生林的檢測中，利用VTEC-RPLA(r7力生研(林))來進行DHL培養(yǎng)基上的大腸桿菌的毒素產(chǎn)生。差表示，各區(qū)間的有效檢驗通過t檢驗和曼-懷二氏U檢驗(Mann-WhitneyU-test)法來進行。另外，算出各菌種所檢測到的個體數(shù)相對于構(gòu)成各試驗區(qū)的個體數(shù)的比例作為檢測率。另外，對于對照區(qū)，也以斷奶30天后的糞便為對象進行同樣的測定和檢驗。MGC區(qū)和對照區(qū)中斷奶30天后的糞便中菌群見圖1。如圖1所示，從對照區(qū)的4個檢體中檢測到宮入菌(對照區(qū)=2.3士0.221ogCFU/g,MGC區(qū)=4,0±0.551ogCFU/g)。在所有區(qū)中均未才企測到產(chǎn)氣莢膜桿菌。腸內(nèi)細菌科和大腸桿菌的菌數(shù)在MGC區(qū)明顯低(腸內(nèi)細菌科對照區(qū)=7.1±1.381ogCFU/g，MGC區(qū)-4.1±0.731ogCFU/g;大腸桿菌對照區(qū)=7.0±1.39logCFU/g，MGC區(qū)=3.4±1.041ogCFU/g)。腸球菌和乳酸菌未確認(rèn)到差別(腸球菌對照區(qū)=2.6±0.501ogCFU/g，MGC區(qū)=2.6±0.351ogCFU/g;乳酸菌對照區(qū)=8.9±0.511ogCFU/g，MGC區(qū)=9.0±0.591ogCFU/g)。另外，在此時分離的大腸桿菌的所有菌林中均未確認(rèn)到毒素產(chǎn)生。〔糞便中SKT〕將對照區(qū)和MGC區(qū)的斷奶30天后的糞便用0.03M磷酸緩沖液(pH7.4)稀釋4倍后，將其中的0.3ml作為SKT測定用樣品分別注入到另外的管中。向其中添加等量的乙腈，充分混合后，在-20。C下靜置15分鐘。以6000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，上清用0.45,1的過濾器(商品名Minisart、制造商名sartorius)過濾后供給HPLC。HPLC的條件如下。(HPLC條件)島津制作所、LC-10系列柱phennomenexODS-C18柱溫40。C流動相0.02M乙酸60%(v/v)2-丙醇15%(v/v)乙腈25%(v/v)流速lml/分鐘檢測器紫外分光光度計(島津制作所)波長280nm分析時間15分鐘如此操作，測定1g糞便中所含的SKT量Cwg/g)。實驗成績以構(gòu)成各試驗區(qū)的個體的測定值的平均值和其標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，各區(qū)間的有效檢驗通過t檢驗和曼-懷二氏U檢驗法來進行。另外，算出SKT陽果見圖2。由圖2可知糞便中SKT在MGC區(qū)明顯低(對照區(qū)=13.1±5.76^g/g，MGC區(qū)=7,3±4.93/^g/g)?！布S便中的有機酸〕將斷奶30天后的糞便用0.03M的磷酸緩沖液(pH7.4)稀釋4倍后，以6000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘。上清用0.45〃L的過濾器(商品名Minisart、^>司名sartorius)過濾后供給HPLC。(HPLC條件)島津制作所、LC-10系列柱2根Shin-packSCR-102H柱溫40。C流動相5mM的對曱苯^黃酸水溶液萃取相5mM的對曱恭璜酸水溶液含100的甲苯二胺四乙酸的20mM的Bis-Tris流速0.8ml/分鐘檢測器導(dǎo)電度^r測器CDD-6A(島津制作所)分析時間60分鐘貝Jv鳴戰(zhàn)差表示，各區(qū)間的有效檢驗通過t檢驗和曼-懷二氏u檢驗法來進行。測定結(jié)果見圖3。如圖3所示，MGC區(qū)的乙S臾、丙酸和丁酸顯著高于對照區(qū)(乙酸對照區(qū)=50.7±9.27mM,MGC區(qū)=63.1±5.55mM;丙酸對照區(qū)=26.4土4.02mM,MGC區(qū)=32.1±6.53mM;丁酸對照區(qū)=8.6±3.03mM,MGC區(qū)=13.1士4.16mM)。如上所述，糞便中的有機酸中乙酸、丙酸、丁酸在MGC區(qū)明顯高，因此認(rèn)為通過攝取混合有纖維寡糖和宮入菌的本發(fā)明品，發(fā)揮了協(xié)同的效果?！布S便中的氨〕采取各試驗區(qū)的個體的斷奶30天后的糞便裝人生化學(xué)試驗用管中，使用ammonia-testWako進行氨的測定。實驗成績以構(gòu)成各試驗區(qū)的個體的測定值的平均值表示。測定結(jié)果見圖4?！惭逯械陌薄吃谀c道內(nèi)由腸內(nèi)細菌產(chǎn)生的氨中的一部分自腸道吸收進入到血液中。即，血清中的氨量的減少意味著腸道內(nèi)氨產(chǎn)生菌減少、腸道內(nèi)的氨量減少，表明腸內(nèi)環(huán)境得到改善。另一方面，血清中的氨量增加意味著腸道內(nèi)氨產(chǎn)生菌增力口、腸道內(nèi)的氨量增加，表明腸內(nèi)環(huán)境惡化。這樣，以斷奶時和斷奶30天后的仔豬為對象，如下測定可作為腸內(nèi)環(huán)境的變化指標(biāo)的血清中的氨量。即，從各個體中采血，將該血液用鴿酸鈉除去蛋白。采取所得上清裝人生化學(xué)試驗用管中，使用ammonia-testWako進行氨的測定。實驗成績以構(gòu)成各試驗區(qū)的個體的測定值的平均值表示。測定結(jié)果見圖5。由圖4可知在MGC區(qū)，與對照區(qū)相比確認(rèn)到糞便中的氨濃度減少的傾向。由此表明利用纖維寡糖和丁酸菌的組合，使腸內(nèi)環(huán)境得到改善，以及糞便的惡臭得到抑制。另外，由圖5可知在MGC區(qū)，與對照區(qū)相比在血清中也確認(rèn)到氨濃度減少的傾向。由此表明利用纖維寡糖和丁酸菌的組合，腸道內(nèi)的氨量減少，腸內(nèi)環(huán)境得到改善。[實施例4]就下述項目來研究評價本發(fā)明品對家禽的有效性。準(zhǔn)備2組肉食雞的初生雛雞，每組20000只，作為對照區(qū)和本發(fā)明品給予區(qū)(試驗區(qū))。對試驗區(qū)的個體給予在市售肉食雞用飼料(未添加抗生素)中添加了0.2%(重量)本發(fā)明品的伺料，上述本發(fā)明品中含有兩成(20%(重量))的宮入菌(丁酸4炎菌MIYAIRI588(FERMBP-2789))的芽胞、lx108CFU/g、纖維寡糖(96%(重量)的纖維二糖、2%(重量)的葡萄糖、2%(重量)的纖維三糖)。另一方面，對于對照區(qū)的個體僅給予市售肉食雞用飼料(未添加抗生素)(未添加本發(fā)明品)。當(dāng)各個個體達到18日齡、42日齡時，從各區(qū)中隨機選出5只宰殺，采取腸道(盲腸)內(nèi)容物。同時從各區(qū)的雞舍內(nèi)分別采取5份新鮮便?！诧曫B(yǎng)試驗〕測定各區(qū)的個體的體重增力口(各區(qū)的平均體重)、飼料要求率(增加1kg體重所必需的飼料量)、商品化率(未廢棄的個體的比例(％))。結(jié)果見表5。[表5對照本發(fā)明品平均體重(kg)2.592.75飼料要求率(％)2.092.07商品化率(％)92.496.8由表5可知與對照區(qū)相比，使用了本發(fā)明品的區(qū)的平均體重、祠料要求率、商品化率、廢棄率(被廢棄的個體的比例)均有所改善?！材c道內(nèi)的有機酸〕將盲腸內(nèi)容物用0.03M的磷酸緩沖液(pH7.4)稀釋4倍后，以10000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘。上清用0.45的過濾器(商品名Minisart、公司名sartorius)過濾后供給HPLC。HPLC的條件如下。(HPLC條件)島津制作所、LC-10系列柱2根Shin-packSCR-102H柱溫40°C流動相5mM的對曱苯磺酸水溶液萃取相5mM的對曱苯磺酸水溶液含100〃M的曱苯二胺四乙酸的20mM的Bis-Tris流速0.8ml/分鐘檢測器導(dǎo)電度檢測器CDD^A(島津制作所)分析時間60分鐘實驗成績以構(gòu)成各試驗區(qū)的個體的測定值的平均值和其標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，各區(qū)間的有效檢驗通過t檢驗和曼-懷二氏U檢驗法來進行。測定結(jié)果見圖6。其結(jié)果，由圖6可知盲腸內(nèi)有機酸中乙酸最多。另外，有關(guān)各有機酸的相對于構(gòu)成各試驗區(qū)的個體數(shù)的檢測率，除丙酸和丁酸的檢測率為100%外，其他各有機酸的檢測率也為100%。在從18曰齡、42曰齡的個體采取的盲腸內(nèi)容物中均確認(rèn)到試驗區(qū)的乙酸、丙酸、丁酸的比例較對照區(qū)有所增加的傾向，該傾向特別是在乙酸量上明顯(18日齡的乙酸量對照區(qū)=42.8±10.18，試驗區(qū)=57.2±7.66〃mol/g;42日齡的乙酸量對照區(qū)=32.4±11.62，試驗區(qū)=46.7±3.82/miol/g)。乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸除參與腸內(nèi)pH降低所引起的有害菌的增殖抑制外，還被用作能源，進一步發(fā)揮促進腸蠕動的作用。因此，在本試驗中試驗區(qū)的腸內(nèi)的上述短鏈脂肪酸較對照區(qū)有所增加，這表明利用纖維寡糖和丁酸菌的組合，使腸內(nèi)環(huán)境得到改善。權(quán)利要求1.飲食用組合物，該組合物含有丁酸菌和纖維寡糖，并具有改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和/或防御感染癥的功能。2.權(quán)利要求l的飲食用組合物，其中丁酸菌為丁酸梭菌3.飼料，該飼料含有丁酸菌和纖維寡糖，并具有改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和/或防雄卩感染癥的功能。4.食品，該食品含有丁酸菌和纖維寡糖，并具有改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和/或防御感染癥的功能。5.丁酸菌和纖維寡糖在作為具有改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和/或防御感染癥的功能的々大食用組合物中的應(yīng)用。6.丁酸菌和纖維寡糖在作為具有改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和/或防御感染癥的功能的飼料或食品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明的課題在于提供飲食用組合物，該組合物中含有產(chǎn)生丁酸且整腸作用優(yōu)異的丁酸菌和作為丁酸菌的基質(zhì)并助長丁酸產(chǎn)生的纖維寡糖，該組合物可以提高腸內(nèi)的丁酸產(chǎn)生量，而且改善腸內(nèi)環(huán)境、防御感染癥的功能等優(yōu)異。即，本發(fā)明提供含有丁酸菌和纖維寡糖的、具有改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和/或防御感染癥的功能的飲食用組合物；上述丁酸菌為丁酸梭菌的上述飲食用組合物；含有丁酸菌和纖維寡糖的、具有改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和/或防御感染癥的功能的飼料；以及含有丁酸菌和纖維寡糖的、具有改善腸內(nèi)環(huán)境的功能和/或防御感染癥的功能的食品。文檔編號A23L1/30GK101415342SQ200780012320公開日2009年4月22日申請日期2007年3月30日優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日發(fā)明者把田雅彥,高橋志達申請人:日本制紙化學(xué)株式會社;米雅利桑制藥株式會社