專利名稱：淋病奈瑟氏球菌特異性寡核苷酸序列的制作方法
淋病奈瑟氏球菌特異性寡核苦酸序列
相關申請本申請要求2006年4月7日申請的，題目是"淋病奈瑟 氏球菌特異性寡核苷酸序列"的臨時申請U.S.S.N. 60/790,197的優(yōu)先 權。該臨時申請在此以其整體引入作為參考。
背景技術：
淋病是一種由人類病原體，淋病奈瑟氏球菌(We&en'a (淋球菌)所引起的性傳播疾病(STD)，淋病奈瑟氏 球菌是一種可在粘膜內(nèi)生長和迅速繁殖的革蘭氏陰性、胞內(nèi)寄生的需 氧雙球菌。由于每年全世界^^告的病例超過六千萬(A.C. Gerbase等， Lancet, 1998, 351 (Suppl. 3) : 2-4)，因此淋球菌感染仍然是一個 主要的全球性健康問題。根據(jù)疾病控制和預防中心(CDC)的統(tǒng)計， 淋病在美國是第二種最常報告的STD,每年有幾乎400,000個新報告 的病例(CDC, "5Wnmao; o/Aro^^a6/e J5/seose-C/m7ecf S^^es. 200/，，， Morb. Mortal. Wkly Rep.， 2001, 50: 1-108; CDC, "Se;cwa/(y 7Va"s聰"ed Z)&ease 5Wve"/a"ce, 2卯7" , U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, GA， 2002; CDC,"Se;cwa^y 7>a 57m'"^/Zfeease Swrve腸"ce, 2卯2" , U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, GA, 2003 )。象衣原體，美國最普遍的細菌性STD—樣， 淋病實際上被低估了 ，估計每年發(fā)生的新感染大約是所報告的兩倍(H. Weinstock等，Persp. Sex. Reprod. Health, 2004, 36: 6-10)。低估的 事實至少是部分地因為淋病在30-60%-故感染的婦女和達10%被感染 的男性中是無癥狀的。由于未被識別和未被治療，淋病奈瑟氏球菌可 能在宿主中持續(xù)幾個月仍然有感染性，這可能便于其傳播和促進傳染 的蓄積。當他們存在時，婦女中淋球菌感染的最期初癥狀包括排尿 困難、陰道分泌物、月經(jīng)周期之間的陰道出血，以及腹痛。如果未被 治療，患有淋病的婦女在癥狀的存在或者癥狀的嚴重性方面均有由感 染發(fā)展成嚴重并發(fā)癥的風險。特別地，淋病可導致伴有輸卵管和卵巢
14炎癥的、嚴重的、痛性盆腔感染，稱作盆腔炎(PID) (E.W.HookIII 和H.H. Handsfield,在"/Sex;w<2〃_y rraws肌'"ed Z)^osW , K.K. Holmes 等(編輯),第3版，1999,第451-466頁，McGraw-Hill: New York, NY) 。 PID可導致對輸卵管、子宮和周圍組織的永久性損傷，這可導 致慢性盆腔痛、不孕，以及潛在地致命的異位妊娠(W. Cates Jr.等， Am. J. Obstet. Gynecol.， 1991, 164: 1771-1781; J. Coste等,Fertil. Steril.， 1994, 62: 289-295; L. Westr6m和P. Wolner-Hansen， Genitourin. Med.， 1993， 69: 9-17)。在男性中，最常見的初期癥狀是排尿困難 和尿道的膿性分泌物。淋病的平均潛伏期是與患病伴侶性接觸后大約 2到5天；然而，癥狀可能直到30天才出現(xiàn)。淋病奈瑟氏球菌可能從 尿道傳播到男性生殖道的其它部分，導致附睪炎、前列腺炎，以及多 種其它疾病如尿道周圍膿腫。未被治療的淋病可能導致尿道狹窄，這 可能導致尿流降低、膀胱不完全排空、尿路感染，以及最終導致腎衰 竭。罕見地(占感染婦女的1-3%,在感染男性中的百分率更低)，細 菌通過血液傳播，導致關節(jié)炎、菌血癥或者心內(nèi)膜炎(E.W. Hook III 和H.H. Handsfield,在"5^xwa〃y JhmsTm'"efi Z^easW , K.K.Holmes 等(編輯)，第3版，1999，第451-466頁，McGraw-Hill: New York, NY)。盡管已知淋病主要是一種性傳播感染，但是其也可能在分娩 過程中通過被感染的產(chǎn)道傳染給新生兒。這可能導致嬰兒失明、關節(jié) 感染或者危急嬰兒生命的血液感染。盡管患有任何性傳播疾病的患者具有提高的與其它STD 共感染的風險，但是衣原體和淋病的共感染最常見(多達40%患淋病 的婦女和多達20%患淋病的男性也感染衣原體)。流行病學和生物學 研究提供了強有利的證據(jù)，淋球菌感染增加了對人類免疫缺陷病毒 (HIV)的易感性并且便于其在男性和婦女中的傳播(M. S. Cohen等， Lancet, 1997， 349: 1868-1873; D.T. Fleming和J.N. Wasserheit, Sex. Transm. Infect, 1999, 75: 3畫17; K.A. Workowski和W,C. Levine， Morb. Mortal. Wkly Rep.， 2002， 51 ( RR06 ) : 1-80; T.A. Farley等， J. Acquir. Immun. Defic. Syndr., 2003, 33: 642-648 )。早期檢測是控制淋球菌感染的公共健康計劃的重要部分。 早期檢測和早期治療的目的包括中斷傳播鏈、預防長期后遺癥，以及 降低傳染性的持續(xù)時間以限制共感染的風險。由于普遍的淋病奈瑟氏
15球菌抗生素抗性，早期檢測也可以預防過度的治療，這是主要的擔心
方面(CDC,"F/woro拜'wo/owe- 57'5tawceA^wen,a gowo^r/ioeae， //<2>vYn7, 7^9^ ， decrease^/ 5^scep"6z7/^y fo azaAromyc/w AA.
gowo^7^oeae, Af/5^own'， 7^99" , Morb. Mortal. Wkly Rep.， 2000, 49: 833-837; CDC,"/"creases y7wora拜'wo/owe-ms7'加wf JVe&m'a gowon7weae-//awaz'Z awd Ca/z/o，'a, 20W ， Morb. Mortal. Wkly Rep.，
2002, 51: 1041-1044; CDC， "/wcmzye"'w/ZMoro,7zo/owe-ms7'5tawf 臉^m.a gowo^r^oeae amowg膨w wAo Aave 膨w-C/""ec/ 5Vato"，
2003, awd revved recomwewda"ows/or gowc^r/jea "eafmew/， 2004", Morb. Mortal. WklyRep.， 2004， 53: 335-338 )。細胞培養(yǎng)物中分離淋病奈瑟氏球菌一直是實驗室診斷的 傳統(tǒng)方法，并且因其特異性仍然作為選擇法醫(yī)學樣品的方法。然而， 該方法需要嚴格的運輸條件以保持樣品的生存力，并且具有2到3天 的回旋(turnaround)時間。在許多情況中，細胞培養(yǎng)被基于通過直 接的熒光抗體染色、酶免疫測定和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測 抗原的更迅速的檢驗所取代，這對運輸條件要求較少并且可在同 一天 提供結果。然而，這些方法仍然是費力和耗時的并且，更重要地，缺 乏與篩選測定 一 樣的靈敏度，尤其對于無癥狀的患者。最近，已經(jīng)發(fā)展了用于直接檢測淋病奈瑟氏球菌的、基于 核酸雜交探針的檢驗。這些檢驗提供更高的特異性但是在靈敏度上基 本上沒有提高。此外，這些檢驗中的絕大部分在使用侵害性的取樣方 法獲得的子宮頸內(nèi)的、或尿道的樣品上進行。現(xiàn)在可利用基于聚合酶 鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)，或 轉錄介導的擴增(TMA )技術的核酸擴增測定。除了在常溫樣品運輸、 批量自動化，以及快速的加工時間方面提供非培養(yǎng)物檢驗的所有優(yōu)點 外，這些測定提供更高的特異性和接近100%的靈每文度。此外，它們 可在具有較小侵害性的臨床樣品，如尿中進行。所有這些優(yōu)點使得核具。然而，現(xiàn)有的用于淋病檢測的核酸擴增測定仍然顯示某些 缺點和局限性。主要包括由某些樣品中存在擴增抑制劑所致的假陰性 結果以及如果沒有應用嚴格的質量控制程序，會由于交叉污染所致的假陽性結果。顯然，仍然非常期望發(fā)展用于檢測淋球菌感染的改良的 核酸擴增測定。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于快速、選擇性和特異性檢測生物樣品中淋 病奈瑟氏球菌的系統(tǒng)和方法。特別地，本發(fā)明包括可用于開發(fā)用于淋 球菌感染的檢測和診斷的核酸擴增檢驗的試劑。更具體地，本發(fā)明提 供可用作擴增引物和/或檢測探針的寡核苷酸序列，其可檢測淋病奈瑟 氏球菌的可讀框-1 (Oi F7)基因、胞嘧啶曱基轉移酶(&mG)基因 和菌毛蛋白反向(inverting )蛋白同系物(； /v7VC )基因內(nèi)輩巴核酸序列 的任一鏈。更具體地，本發(fā)明提供包括選自SEQ ID Nos.l-52的核酸 序列(見表1)的、經(jīng)分離的寡核苷酸，它們的任何活性片段，以及 它們的<壬<可組合。在某些實施方案中，提供本發(fā)明的寡核苷酸序列作為可在 多種核酸擴增測定中使用的引物組或者引物/探針組，所述測定包括涉 及實時和/或多重檢測等的任何一種方法。本發(fā)明也提供用于檢測生物試驗樣品中淋病奈瑟氏球菌 的方法。通常，這種方法包括將懷疑含有淋病奈瑟氏球菌核酸的試驗 樣品與至少 一種本發(fā)明的寡核普酸接觸，使得寡核苷酸能與淋病奈瑟 氏球菌核酸(如果樣品中存在的話)雜交；以及檢測與淋病奈瑟氏球 菌核酸雜交的任何寡核苷酸。檢測到寡核苷酸與淋病奈瑟氏球菌核酸 的雜交表明樣品中存在淋病奈瑟氏球菌。本發(fā)明的其它方法包括將懷疑含有淋病奈瑟氏球菌核酸 的試驗樣品與本發(fā)明所述的至少 一種引物組或引物/探針組以及擴增 反應試劑接觸以形成反應混合物。然后將反應混合物置于擴增條件下 以便擴增出淋病奈瑟氏球菌核酸(如果試驗樣品中存在的話)的全部 或部分，使用引物組或引物/探針組的引物以產(chǎn)生淋病奈瑟氏球菌擴增 子?？墒褂枚喾N檢測技術中的任何一種檢測所得到的淋病奈瑟氏球菌 擴增子。在某些實施方案中，在淋病奈瑟氏球菌擴增子和引物/探針組 的檢測探針之間形成雜合體并且被檢測出，作為試驗樣品中存在淋病 奈瑟氏^求菌的指4正。
在核酸擴增方式中，本發(fā)明的寡核苷酸序列可與其它特異 性引物和探針聯(lián)合使用，用于同時檢測淋病奈瑟氏球菌和其它靶生 物。在某些實施方案中，本發(fā)明的擴增引物和檢測探針與砂眼衣原體 (C/ /a附3;^a rac/ oma^ )特異性引物和探針聯(lián)合使用，用于同時檢 測生物樣品中的淋病奈瑟氏球菌和砂眼衣原體。本發(fā)明也提供包括擴增引物、檢測探針、引物組或者引物 /探針組，如這里所公開的以及任選地，擴增反應試劑的試劑盒。本發(fā)明的這些和其它目的，優(yōu)點和特征對于本領域那些已 經(jīng)閱讀下面詳細描述的普通技術人員來說將是顯而易見的。
附圖
簡述表1 ( 1和2部分)顯示來自淋病奈瑟氏球菌的可讀框-1 (ORF1)基因、胞嘧啶曱基轉移酶(dcmG)基因和菌毛蛋白反向蛋 白同系物(pivNG)基因序列的本發(fā)明特異性寡核苷酸序列的實例。 在表中指出了每個寡核苷酸的圖譜位置和序列號。表2顯示使用表1所述9個擴增引物和檢測探針組的單一 TaqMan kPCR測定的結果。發(fā)現(xiàn)所有引物/探針組在一企測淋病奈瑟氏 菌(GC)時都是有效的，并且顯示與砂眼衣原體(CT)耙DNA沒有 交叉反應。表3是與淋病奈瑟氏菌緊密相關的74個生物體的列表， 這些生物體用于檢驗本發(fā)明的 一 些引物/探針組的交叉反應性。表4顯示用于檢驗十五(15)個不同砂眼衣原體(CT) 血清變型和四十六(46)個不同淋病奈瑟氏菌分離物的多重TaqMan kPCR測定的結果。
定義在整個說明書中，使用在下列段落中所定義的術語。
術語"個體"、"受試者"和"患者"在這里可交替使用。 它們指人，其可能是淋病奈瑟氏菌的宿主，但是可能被也可能不被該 細菌感染。該術語不表示特定的年齡，因此包括成人、兒童、新生兒， 以及胎兒。術語"試驗樣品"，如這里所使用的，指任何被懷疑含有 淋病奈瑟氏菌核酸的液體或固體材料。試驗樣品可以是，或者可以來
18自可能含有淋病奈瑟氏菌核酸的任何生物組織或體液。常常地，樣品 將是"臨床樣品"，即，從患者中獲得或分離的將用于檢驗淋球菌感 染的樣品。這種樣品包括，但不限于，含有細胞材料并且可能含有也 可能不含有細胞的體液，例如，血液、血漿、血清、尿液、精液、唾
液、眼球晶狀體液(ocular lens fluid)、淋巴液、羊水等等；子宮頸 內(nèi)的、尿道的、直腸的、陰道的、外陰-陰道的、鼻咽部和肺部的樣品； 以及具有已知診斷結果的存檔樣品。試驗樣品也可以是組織的切片， 如冷凍切片。術語"試驗樣品"也包括通過加工生物樣品獲得的任何 材料。衍生的材料包括，但不限于，從樣品中分離的細胞(或者它們 的后代)、細胞組分，以及從樣品中所提取的核酸分子。為了獲得試 驗樣品，生物樣品的加工可能包括下列步驟中的一個或多個過濾、 蒸餾、離心、提取、濃縮、稀釋、純化、干擾組分的失活、試劑的添
加等等。術語"核酸"、"核酸分子"和"多核普酸"在這里可交 替使用。它們指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合 物，除非有特殊說明，包括能以與天然存在的核苷酸相似的方式起作 用的天然核普酸的已知類似物。這些術語包括具有合成的主鏈的核酸 樣結構，以及擴增產(chǎn)物。術語"寡核苷酸"，如這里所使用的，指脫氧核糖核苷酸 或核糖核苷酸聚合物的短片段。寡核普酸可用作擴增引物和/或檢測探 針。這種核酸序列的短片段通常通過化學合成。本領域技術人員了解， 寡核普酸的長度(即，其含有的核香酸的數(shù)量)可能變化很大，常常 取決于其期望的功能或用途。 一般地，寡核普酸包括約5個到約150 個之間的核苷酸，優(yōu)選地在約15個到約100個核苷酸之間，更優(yōu)選 地，在約15個到約50個核普酸之間。術語"分離的"當指寡核苷酸時，意思是一段寡核苷酸， 其就來源或者操作而言從至少一些與其天然相連或者當最初獲得或 制備時與其相連的成分中分離。術語"分離的"，可選擇地或者還意 味著目的寡核苷酸是通過人工生產(chǎn)或合成的。如這里所使用的，當提到寡核苷酸(例如，這里所提供的 寡核苷酸序列)時，術語"活性片段"指包括與寡核苷酸的核苷酸序 列高度同源、或者從其衍生的核苷酸序列的任何核酸分子，其包括比
19全長寡核苷酸少的核苷酸，并且保留全長序列的至少一種生物學特 性。 一般活性片段包含具備全長寡核苷酸的至少一種活性的序列。本 發(fā)明的寡核苷酸序列的活性片段或部分可以是一種核酸分子，其長度
是例如10、 15、 20、 25、 30或更多個核香酸，并且可用作檢測生物 樣品中淋病奈瑟氏菌的擴增引物和/或檢測探針。本申請中涉及寡核苷酸的活性片段時使用的術語"高度同 源"，指與寡核苷酸具有至少35%的序列同源性的核酸分子。在某些 實施方案中，序列同源性是至少40%,至少60%,至少80%，至少 90%,至少95%或者更高。術語"同源性"和"同一性"在這里可交替使用，指兩個 核酸分子之間的序列相似性?？赏ㄟ^將兩個序列按照最佳比較目的進 行比對(例如，為了最佳比對，可在第一和第二核酸序列中的一個或 兩個中引物缺口，以及為了比對目的，可忽視非同源序列)，進行兩 個核酸序列的同源性或同一性百分率的計算。在某些實施方案中，用 于比較目的的所比對序列的長度是參考序列長度的至少30%、至少 40%、至少60%、至少80%、至少90%、至少95%或者100%。然后 比較相應核苷酸位置上的核苷酸。當?shù)谝粋€序列中的位置被與第二個 序列中相應位置上的相同核苷酸占據(jù)時，那么這兩個分子在該位置上 是相同的(或者同源的)。兩個序列之間的同一性百分比是序列共有 的相同位置數(shù)量的函數(shù)，其中考慮為了兩個序列的最佳比對的需要所 引入的缺口的數(shù)量，以及每個缺口的長度?？墒褂脭?shù)學算法完成序列的比較和確定兩個序列之間的 同一性百分率。例如，可使用Meyers和Miller算法(CABIOS， 1989, 4: 11-17)確定兩個核香酸序列之間的同一性百分率，其已經(jīng)被引入 到ALIGN程序中(2.0版)，使用PAM 120權重殘基表，缺口長度 罰分為12以及缺口罰分為4?？蛇x擇地，可使用GCC軟件包中的GAP 程序(可在http:〃www.gcg.com中獲得)應用NWS gapdna.CMP矩陣 確定兩個核苷酸序列之間的同 一 性百分比。術語"雜交"指核苷酸序列之間形成復合物，這些序列高 度互補以致于通過Watson-Crick堿基配對或非經(jīng)典的堿基配對形成復 合物。當引物與靶序列(模板)"雜交"時，這種復合物(或者雜合 體)十分穩(wěn)定足以起著例如，DNA聚合酶所需的引發(fā)功能，引起DNA合成。本領域技術人員了解雜交序列不需要具有完美的互補性以提供
穩(wěn)定的雜合體。在許多情況中，形成的穩(wěn)定的雜合體中少于約10%的
堿基是錯配的。因此，如這里所使用的，術語"互補的"指在測定條 件下與其互補物形成穩(wěn)定雙螺旋的寡核苷酸， 一般地其中有約90%或
更高的同源性。本領域的那些技術人員懂得如何估計和調整雜交條件 的嚴謹性，以便使得具有至少期望互補性水平的序列將穩(wěn)定地雜交， 而具有更低互補性的那些將不能穩(wěn)定地雜交。對于雜交條件和參數(shù)的
實例見，例^t口, J. Sambrook等,"Afo/ecw/ar C7om,wg; 丄a6o^Y7Zo^y Mawwa/" ， 1989，第二版，Cold Spring Harbor Press; Plainview, NY; F.M. Ausubel, "CMrrewf尸ro^ co/51Afo/ecw/ar 5/0/0gy" , 1994, John Wiley & Sons: Secaucus, NJ。如這里所使用的，術語"擴增"指增加樣品中特異性核酸 序列群的存在量的方法或過程。擴增方法(如聚合酶鏈反應或PCR) 在現(xiàn)有技術中是已知的并將在下面更詳細地討論。術語"靶序列"和"耙核酸"在這里可交替使用。他們指 核酸序列，期望檢測到其存在或缺乏。在本申請的上下文中，靶序列 優(yōu)選地包括將與寡核普酸引物形成復合物的核酸序列。耙序列也可能 包括探針-雜交區(qū)，具有該區(qū)的探針將在期望的條件下形成穩(wěn)定的雜合 體。本領域普通技術人員了解，靶序列可以是單鏈或雙鏈的。在本發(fā) 明的上下文中，所關注的靶序列位于淋病奈瑟氏球菌的可讀框-l (ORF1)基因、胞嘧啶曱基轉移酶(dcmG)基因或菌毛蛋白反向蛋 白同系物(pivNG)基因內(nèi)。術語"引物"和"擴增引物"在這里可交替使用，它們指 當在置于適當?shù)臈l件下(例如，緩沖液、鹽、穩(wěn)定和pH),在存在 核香酸和用于核酸聚合的試劑時，用作是DNA的互補鏈的引物延伸 產(chǎn)物合成起始點的寡核苷酸。引物優(yōu)選地是在擴增中具有最大效率的 單鏈，但可選擇地，可以是雙鏈。如果是雙鏈，那么可首先處理引物 (例如，變性)以便在用于制備延伸產(chǎn)物前允許其鏈的分離。這種變 性步驟一般通過加熱進行，但是可選擇地可使用堿實現(xiàn)，隨后進行中 和。典型的引物含有基本上與靶序列互補的長約10-約35個核苷酸的 序列。然而，引物也可含有另外的序列。例如，在鏈置換擴增(SDA) 中使用的擴增引物優(yōu)選地包括位于靶結合序列5 ，端的限制性內(nèi)切酶識別位點(參見,例如，美國專利Nos. 5,270,184和5,455,166)?；?于核酸序列的擴增(NASBA)，和轉錄介導的擴增(TMA)引物優(yōu) 選地包括與引物的靶結合序列相連的RNA聚合酶啟動子。用于在所 選的擴增反應中將這種特異性序列連接到結合靶序列的方法是現(xiàn)有 技術中公知的。術語"正向引物，，和"正向擴增引物"在這里可交替使用， 指與靶(模板鏈)雜交(或退火)的引物。術語"反向引物"和"反 向擴增引物"在這里可交替使用，指與互補靶鏈雜交(或退火)的引 物。相對于反向引物，正向引物與靶序列的5'端雜交。術語"擴增條件"，如在這里所使用的，指促進引物序列 的退火和/或延伸的條件。這種條件是本領域公知的并且取決于所選的 擴增方法。因此，例如，在PCR反應中，擴增條件通常包括熱循環(huán)， 即，反應混合物在兩個或更多溫度之間的循環(huán)。在等溫擴增反應中， 盡管可能需要提高起始溫度以便開始反應，但是擴增發(fā)生不需要熱循 環(huán)。擴增條件包括所有反應條件包括但不限于，溫度和溫度循環(huán)、緩 沖液、鹽、離子強度、pH等等。如這里所使用的，術語"擴增反應試劑"，指在核酸擴增 反應中所使用的試劑，可能包括但不限于，緩沖液、試劑、具有反轉 錄酶和/或聚合酶活性或者核酸外切酶活性的酶；酶輔助因子如鎂或 錳；鹽；以及脫氧核香酸三磷酸(dNTPs)如脫氧腺苷三磷酸(dTAP)、 脫氧鳥苦三磷酸(dGTP)、脫氧胞苷三磷酸(dCTP)、脫氧胸苷三 磷酸(dTTP)和脫氧尿苷三磷酸(dUTP)。本領域技術人員可很容 易地根據(jù)所用擴增方法選擇擴增反應試劑。術語"探針"和"檢測探針，，在這里可交替使用并且指能 在適當條件下選擇性地與至少 一部分靶序列雜交的寡核苷酸(例如， 已被擴增的靶序列的一部分)。通常，將探針序列確定為"互補的" (即，與編碼鏈或有義鏈(+ )互補)或者"反向互補的"(即，與 反義鏈(-)互補)。在某些實施方案中，檢測探針用可檢測的元件 (moiety)進行標記。術語"標記的"和"用可檢測的試劑(或者元件)標記的" 在這里可交替使用以說明可被顯像的實體(例如，寡核苷酸檢測探 針)，例如結合到另一個實體(例如，擴增反應產(chǎn)物或擴增子)后。
22的試劑或元件使得其產(chǎn)生可被測量的信號，并且 該信號的強度與結合的實體的量相關(例如，成比例)。用于標記和 /或檢測核酸分子的多種系統(tǒng)是本領域公知的?？赏ㄟ^標記的摻入、或 者共軛制備標記的核酸，其中該標記可通過分光鏡、光化學、生物化 學、免疫化學、電、光學、化學或者其它方式直接或間接檢測。適當 的檢測劑包括但不限于，放射性核素、焚光團、化學發(fā)光試劑、微粒、 酶、比色標記、/磁標記、半抗原、分子信標以及適體信標。術語"熒光團"、"熒光部分"和"熒光染料，，在這里可 交替使用。他們指在一個波長上吸收電磁輻射的量子，并且在不同的、 一般是更長的響應波長上放射一個或多個光子的分子。許多具有多種 結構和特性的熒光染料適于實施本發(fā)明。通過熒光標記核酸分子的方
法和材泮+是已知的(見，例如，R.P. Haugland,"Mo/ec"/ar /Vo6m. //awd6ooA: o/F/womyc械尸n to awd i e5"earc/ CAeww'ca/s , 第5版，1994, Molecular Probes, Inc.)。優(yōu)選地，焚光元件吸收并 放射具有高效能的光(即，在所用激發(fā)波長上具有高摩爾吸收系數(shù)， 以及高熒光量子產(chǎn)率)，并且是光穩(wěn)定的(即， 一旦光激發(fā)，在進行 分析所需的時間內(nèi)不經(jīng)歷顯著降解)。 一些熒光染料本身不能被直接 檢測到，而是在稱作熒光共振能量轉移(FRET)的過程中將能量轉 移到另一個熒光染料，第二種染料產(chǎn)生檢測信號。術語"焚光元件" 也涵蓋這種FRET熒光染料對。使用物理連接的熒光報道分子/猝滅劑 部分也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在這些實施方案中，當使熒光報道分子和 猝滅劑部分極接近時，如在核酸探針的末端，猝滅劑部分阻止報道分 子元件的熒光信號的檢測。當兩個元件物理上分離時，如，例如，用 DN A聚合酶裂解后，報道分子元件的焚光信號就可得以檢測。本申請中所涉及的標記或可檢測元件，所用的術語"可直 接檢測"，意思是標記或可檢測的元件不需要另外的反應或者操作即 可被檢測到。例如，焚光元件可通過熒光光譜學法直接檢測到。本申 請中所涉及的標記或可檢測元件所用的術語"間接檢測"，意思是標 記或可一企測部分在另外的反應或操作后可被4企測到。例如，半抗原在 與連接報告分子，如熒光染料在與適當抗體反應后可被檢測到。
優(yōu)選實施方案的描述如上面所提到的，本發(fā)明涉及檢測生物樣品中淋病奈瑟氏
23菌的方法和試劑。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法使用淋病奈瑟氏 菌特異性寡核苷酸序列和靈敏的、基于核酸擴增的技術，其允許在含 有很少量細菌細胞的樣本中檢測淋病奈瑟氏菌。
I-用于擴增引物和檢測探針的寡核苷酸序列
本發(fā)明的寡核苷酸序列在一個方面，本發(fā)明提供可在核酸擴增試驗中使用的、用 于特異性檢測淋病奈瑟氏球菌的可讀框-1 (OW尸/)基因、胞嘧啶甲基 轉移酶(&wG0基因或者菌毛蛋白反向蛋白同系物(/7zWG)基因中 靶序列的任 一鏈的寡核苷酸序列。已將Oi 尸/基因描述為含有可用于區(qū)分淋病奈瑟氏球菌與 其它奈瑟氏菌屬細菌的序列的基因組區(qū)域(CG. Miyada和T丄.Born， Mol. Cell Probes, 1991, 5: 327-335 )。已報道，淋病奈瑟氏球菌的 (9i^P/基因與胞嘧啶DNA甲基轉移酶具有顯著的同源性(CG. Miyada 和T丄.Born, Mol. Cell Probes, 1991， 5: 327-335 ),如胞嘧啶甲基 轉移酶(dcwG)基因(J.F. Dempsey等，J. Bacterid., 1991, 173: 5476-5486; J.A.F. Dempsey和J.G. Cannon， J. Bacteriol.， 1994, 176: 2055-2060)。發(fā)現(xiàn)在淋病奈瑟氏球菌染色體上p/WVG基因有多個拷 貝。經(jīng)完全測序的淋病奈瑟氏球菌FA 1090才朱基因組的硅分析和 Southern印跡分析已經(jīng)證明，有八個拷貝的該基因簇位于淋病奈瑟氏 球菌染色體的三個分離的區(qū)域中(E.P. Skaar等，J. Bacteriol., 2005,187: 1276-1286 )。將這些多拷貝稱作轉化酶相關基因(z>g/， NCBI基因座連鎖(locuslink) ID: 3282015; NCBI基因座連鎖 ID: 3282236; ^g3, NCBI基因座連鎖ID: 3281824;〖rg4, NCBI基 因座連鎖ID: 3281830; z>g5, NCBI基因座連鎖ID: 3281859; &g<5， NCBI基因座連鎖ID: 3281314; !>g7, NCBI基因座連鎖ID: 3281292; ^gS， NCBI基因座連鎖ID: 3282553 )。已報道貝WG基因含有可用 于區(qū)分淋病奈瑟氏球菌與其它奈瑟氏菌屬菌林的序歹'](CS. Carrick等， Gene, 1998, 220: 21-29)。如上面所提到的，本發(fā)明提供識別淋病奈瑟氏球菌的 0/ F/基因、c/cmG基因和；nWG基因內(nèi)區(qū)域的寡核苦酸序列。在表1 中描述了本發(fā)明的示例性的寡核苷酸序列(SEQIDNos.1-52),以及 它們相應的圖鐠位置。本發(fā)明的申請人使用載體NTI ( Invitrogen
24引物表達(Applied Biosystems, Foster City， CA )，以及01igo6引物分牙斤(Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CA)軟件程序，通過與O^F7基因序列、dcm( 基因序列和/ !WG基 因序列的序列比對鑒定了這些序列。本領域技術人員可以了解這里所公開的、用于淋病奈瑟氏 球菌的擴增、檢測或定量的寡核普酸序列中的任何 一 種都可用作檢測 探針或者擴增引物，其取決于期望的用途和/或測定形式。例如，在一 種測定中用作擴增引物的本發(fā)明的寡核普酸序列可在另外的測定中 用作檢測探針?？蓪o定的本發(fā)明的寡核苷酸序列進行修飾，例如， 通過連接到下列序列上，所述序列指所選擴增方法所必須的特異性序 列(例如，啟動子序列)，或者通過附著標記(例如，熒光染料)以 便于檢測。因此，應當理解的是，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可包括一種 或多種序列，其可用作間隔區(qū)、接頭、用于標記或結合酶的序列，這 可賦予寡核苷酸額外的穩(wěn)定性或對降解過程的敏感性或者其它期望 的特性。根據(jù)本發(fā)明所提供的寡核苷酸序列，可制備一種或多種寡 核苷酸類似物(見下)。這種類似物可含有可選擇的結構，如肽核酸 或"PNAs"(即，具有肽樣主鏈而非天然存在的核酸的磷酸糖主鏈的 分子)等等。這些可選擇的結構，代表本發(fā)明的序列，同樣也是本發(fā) 明的一部分。類似地，應當理解的是，由本發(fā)明的序列構成的寡核苷 酸在不對本發(fā)明的核酸分子的特性起到負面作用的范圍，可含有核酸 堿基的缺失、添加和/或取代。特別地，所述改變不應當導致寡核苷酸 雜交特性的顯著降低。
引物組和引物/探針組另一方面，本發(fā)明涉及所公開的、用于檢測生物樣品中淋 病奈瑟氏球菌的寡核苷酸序列的組合。更具體地，本發(fā)明提供引物組 和引物/探針組。如這里所使用的，術語"引物組"指兩個或多個引物，它 們在一起能引發(fā)目的核苷酸序列(例如，在淋病奈瑟氏球菌的(9i^F7 基因、dcmG基因或/7hWG基因內(nèi)的靶序列)的擴增。在某些實施方 案中，術語"引物組"指引物對，其包括與待擴增的核酸序列的5， 端雜交的5，(上游)引物(或者正向引物)和與待擴增的序列的互補序列雜交的3，(下游)引物(或者反向引物)。這種引物組或引物對
在PCR擴增反應中特別有用。包括正向擴增引物和反向擴增引物的引物組的實例包括
引 物 組 1 , 其 包 括 包 含 SEQ. ID NO. 1 (5，-GCGGATTCCCTTGTCAAGATT-3，)或其 <壬4可活性片,殳的正
向引物，和包含SEQ. ID NO. 2 (5'-GCCGCGCTCACCCTCTA-3')或其/f壬/f可活 性片段的反向引物；
引 物 組 2 ， 其 包 括 包 含 犯Q. IDNO. 5 (5，-AGTACGTTTGGATACAGGATTTGATTT-3，)或其4壬<可活性片謬更的正向引 物，和包含SEQ. ID NO. 6 (5，-AGCCGTTTTCGCCAGTTTC-3，)或其4壬4可活性
片段的反向引物；
引 物 組 3 , 其 包 括 包含 犯Q. EDNO. 8 (5'-GGAACGAGCCATCAAAAACAA-3')或其任何活性片#殳的正向引物，和 包含SEQ. ID NO. 9 (5，-GCGGTTCAGGGAAGTGATAGC-3，)或其^f壬《可活性片
段的反向引物；
引 物 組 4 ， 其 包 括 包 含 SEQ. ID NO. 12 (5，-AAGGTATGATTAGCCACGTTTATCG-3，)或其4壬<可活性片
#殳的正向引物，和包含SEQ. ID NO. 13 (5，-CGCCACCTGCTGCAATAATT-3，)
或其任何活性片段的反向引物；
引 物 組 5 , 其 包 括 包 含 SEQ. ID NO. 15 (5，-GCCTTTTTTCCTTTCGGGATT-3，)或其 <壬^可活性片孚殳的正 向引物，和包含SEQ- ID NO. 16 (5'-GTACATAAGAAAGGCGGAGATTACG-3，)或 其任何活性片段的反向引物；
引物組6,其包4舌包含犯Q. idno. I9(5，-GACGCTTCACGCCTTCCTT-3，)
或其任何活性片段的正向引物，和包含 SEQ. ID NO. 20 (5，-CCATGAATGAACAGCTTGAAGTTT-3，)或其/f壬/f可活性片革更
的反向引物；
引 物 組 7 ， 其 包 括 包 含
SEQ. ID NO. 22 (5，-GCATCCTGTTTGTCTGTTTTGG-3，)或其 <壬<可活性片#殳的正 向引物和包含SEQ. ID NO' 23 (5'-TTACGTAGTGAATCCGCTGAAAATA-3')或
其任何活性片段的反向引物；
引物組8,其包4舌包含SEQ. ID NO. 25 (5'-CCGAATGCTCCGTTTTGC-3')或其任何活性片段的正向引物，和包含 SEQ. ID NO. 26 (5'-GTAACGCCGTAGGATTGGATATAT03，)或其/f壬/f可活性片
段的反向引物；
引 物 組 9 ， 其 包 括 包 含
SEQ. ID NO. 29 (5，-TGATCTAAACCTTTTGAATCGTTGTC-3')或其4壬<可活性片 |殳的正向引物，和包含SEQ. 10 NO' 30 (5'-AACGCATCCGCCATGGT-3，)或其
任何活性片段的反向引物；
引物組 10 , 其包括包含 SEQ ID NO. 32(S'-GACGCTTCACGCCTTCCTTM')或其任何活性片段的正向引物，和包
含SEQ. ED. NO. 33 (5，-CCATGAATGAACAGCTTGAAGTTT-3，)或其^f壬^f可活，〖生
片段的反向引物；
引 物 組 11 ，其 包 括 包 含
SEQ. ID NO. 35 (5'-TCTGCCTATTGCCGGTATGGT-3，)或其/[壬<可活性片#殳的正 向引物，和包含SEQ. ID NO. 36 (5'-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3，)或其/f壬 何活性片段的反向引物；
引 物 組 12 , 其 包 括 包 含 SEQ. ID NO. 38 (5，-ATTGCCGGTATGGTTTCAA-3，)或其4壬<可活性片#更的正向 引物，和包含SEQ. ID NO. 39 (5'-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3，)或其/f壬/f可
活性片段的反向引物；
引 物 組 13 ， 其 包 括 包 含 SEQ. ID NO. 41 (5，-GTCATTCTGCCTATTGCCGGT-3，)或其任j可活性片革殳的正 向引物，和包含SEQ. ID NO. 42 (5'-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3')或其/f壬
何活性片段的反向引物；
引 物 組14 , 其 包 括 包 含
SEQ. ID NO. 44 (5，-TCTGCCTATTGCCGGTATGGT-3，)或其4壬4可活性片,殳的正 向引物，和包含SEQ. ID NO. 45 (5'-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3，)或其/f壬
何活性片段的反向引物；
引物組 15 , 其包括包含 SEQID NO.
47 (5'-TCTGCCTATTGCCGGTATGGT-3')或其任何活性片段的正向引物，和 包含SEQ. ID NO. 48 (5，-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3，)或其/f壬/f可活性片
段的反向引物；
引 物 組 16 ,其 包 括 包 含SEQ. ID NO. 50 (5，-TGATCTAAACCTTTTGAATCGTTGTC-3，)或其4壬何活性片
段的正向 引 物 ， 和 包 含
SEQ. ID NO. 51(5，-GTAACGCCGTAGGATTGGATATATC-3，)或其/f壬4可活性片^爻
的反向引物；可根據(jù)應用兩個或多個寡核苷酸擴增輩巴序列的任何核酸 擴增技術使用這些引物組(如下面所討論的)。可使用本領域公知的 多種檢測方法中的任何一種檢測使用本發(fā)明的引物組所產(chǎn)生的擴增 產(chǎn)物。例如，可使用瓊脂糖凝結電泳和通過溴化乙錠染色的顯影以及 暴露于紫外(UV)光或者通過用于證實淋病奈瑟氏球菌身份的擴增 產(chǎn)物的序列分析來檢測擴增產(chǎn)物?？蛇x擇地，可使用探針序列，使用多種同源或異源方法學 檢測擴增產(chǎn)物。通常在這種方法中，探針與擴增產(chǎn)物(或者擴增子) 的 一條鏈雜交以形成擴增產(chǎn)物/探針雜合體。然后可直接地或間接地檢 測該雜合體，例如，使用探針、引物，或者探針和引物兩者上的標記。因此，本發(fā)明提供用于檢測生物樣品中淋病奈瑟氏球菌的 引物/探針組。如這里所使用的，術語"引物/探針組，，指包括在一起 能引發(fā)目的核苷酸序列(例如，淋病奈瑟氏球菌的Oi^7基因、dc7nG 基因或內(nèi)WVG基因內(nèi)的把序列)的擴增的兩個或多個引物，以及至少 一種能檢測靶序列的探針的組合。該探針通常與擴增產(chǎn)物(或者擴增 子)的一條鏈雜交以形成可被檢測到的擴增產(chǎn)物/探針雜合體。本發(fā)明提供可根據(jù)核酸擴增方法使用的、用于特異性擴增 和檢測試驗樣品中淋病奈瑟氏球菌靶序列的引物/探針組。本發(fā)明的引 物/探針組通常包括引物組，如上所述，以及至少一種檢測探針，其與 通過引物組所產(chǎn)生的擴增子雜交。檢測探針可包括可檢測的元件。在 某些實施方案中，檢測探針包括附著在5'末端的熒光元件和附著在3， 末端的猝滅劑元件(見下面)。引物/探針組的實例包括
引 物/探針組 1, 其包括包 含 SEQ. ID NO. 1 (5，-GCGGATTCCCTTGTCAAGATT-3，)或其活性片萃殳的正向 引物，包含SEQ' ID NO. 2 (5'-GCCGCGCTCACCCTCTA-3')或其活性片^史的 反向引物；包含SEQ. ID N0. 3 (5，-TTCCATGATTTGGAAACAGCCGGG-3，)
或其活性片段的互補檢測探針；以及包含
28SEQ.IDNO.4 (5，-CCCGGCTGTTTCCAAATCATGGAA-3，)或其活性片
段的反向互補檢測探針；
引物/ 探針組 2， 其包括包 含
SEQ. ID NO. 5 (5，-AGTACGTTTGGATACAGGATTTGATTT-3')或其活性片^殳 的正向引物，包含SEQ. 10 no. 6 (5，-AGCCGTTTTCGCCAGTTTC-3，)或其活性
片 段的反向 引 物 ； 以 及 包 含
SEQ. ID NO. 7 (5，-CCATCCGGAACCGACGCACAA-3，)或其活性片#爻的互補沖全
測探針；
引物/ 探針組 3， 其包括包 含
SEQ. ID NO. 8 (5'-GGAACGAGCCATCAAAAACAA-3')或其活性片革更的正 向引物.包含SEQ- ro no. 9 (5，-GCGGTTCAGGGAAGTGATAGC-3')或其活,f生
片 段 的 反 向 引 物 ；包 含
SEQ. ID NO. 10 (5，-TTGCAGCAGGTGGCGGTGGTACTT-3，)或其活性片革更的互
補 #r 測 探 針 ； 以 及 包 含
SEQ.IDNO.11 (5，-AAGTACCACCGCCACCTGCTGCAA-3，)或其活性片
段的反向互補檢測探針；
引物/ 探針組 4， 其包括包 含
SEQ. ED NO. 12 (5，-AAGGTATGATTAGCCACGTTTATCG-3，)或其活性片,更 的正向引物；包含SEQ' ID NO. 13 (5'-CGCCACCTGCTGCAATAATT-3')或其
活性 片 段的反向 引 物； 以及包含 SEQ. ID NO. 14 (5，-CGTATGCATCGGAACGAGCCATCAAA-3，)或其活性片
段的互補檢測探針；
引 物 / 探針組 5 ， 其 包括 包 含 SEQ. ID NO. 15 (5，-GCCTTTTTTCCTTTCGGGATT-3，)或其活性片羊殳的正向 引物.包含SEQ' ID NO- 16 (5'-GTACATAAGAAAGGCGGAGATTACG-3')或其活
性 片 段 的 反 向 引 物 ； 包 含
SEQ. ID NO. 17 (5，-ACGCCGATTTGTAACGCGATGGA-3，)或其活性片|^的互
補 檢 測 探 針 ； 以 及 包 含
SEQ.IDNO.18 (5'-TCCATCGCGTTACAAATCGGCGT-3,)或其活性片^殳
的反向互補檢測探針；
引物/探針組 6, 其包括包 含
SEQ. ID. NO. 19 (5'-GACGCTTCACGCCTTCCTT-3，)或其活性片#爻的正向引物包含SEQ. ID NO. 20 (5'-CCATGAATGAACAGCTTGAAGTTT-3，)或其活性
片 段的反向 引 物 ； 以 及包 含
SEQ. ID NO. 21 (5，-AGGCTTCTCCGTCTGCTCTTTTATCTTCTCCTT-3，)或其
活性片段的互補檢測探針；
引 物 / 探針組 7 , 其 包 括 包 含 SEQ. ID NO. 22 (5，-GCATCCTGTTTGTCTGTTTTGG-3')或其活性片,史的正
向 引 物 ； 包 含
SEQ.IDNO.23(5，- TTACGTAGTGAATCCGCTGAAAATA-3,)
或其活性片段的反向引物；以及包含
SEQ. ID NO. 24 (5，-CGCTTGAACCTGCTTTCTGCATACTTGC-3')或其
活性片段的互補檢測探針；
引物/探針組 8, 其包括包 含
SEQ. ID NO. 25 (5，-CCGAATGCTCCGTTTTGC-3，)或其活性片,殳的正向引 物；包含SEQ' ID NO. 26 (5，-GTAACGCCGTAGGATTGGATATATC-3，)或其活'〖生
片 段 的 反 向 引 物 ；包 含
SEQ. ID NO. 27 (5，-CCATGGCGGATGCGTTAAAGGTCAG-3，))或其活性片孚殳
的 互 補 檢 測 探 針 ； 以 及 包 含 SEQ.IDNO.28 (5，-CTGACCTTTAACGCATCCGCCATGG-3，)或其活性片
段的反向互補檢測探針；
引物/ 探針組 9， 其包括包 含
SEQ. ID NO. 29 (5，-TGATCTAAACCTTTTGAATCGTTGTC-3，)或其活性片萃殳 的正向引物；包含SEQ. ID NO. 30 (5'-AACGCATCCGCCATGGT-3')或其活性
片 段 的 反 向 引 物 ； 以 及 包 含
SEQ. ID NO. 31 (5，-AACTTTGCCGAATGCTCCGTTTTGC-3')或其活性片^殳的互
補才企測纟罙針；
引物/ 探針組 10, 其包括包 含
SEQ. ID NO. 32 (5，-GACGCTTCACGCCTTCCTT-3，)或其活性片,殳的正向引 物.包含SEQ. ID NO. 33 (5，-CCATGAATGAACAGCTTGAAGTTT-3，)或其活,〖生
片 段的反向 引 物； 以及包 含
SEQ. ID NO. 34 (5'-AGGCTTCTCCGTCTGCTCT-3')或其活性片段的檢測探
針；
引 物 / 探針組li , 其 包括 包含SEQ. ID NO. 35 (5，-TCTGCCTATTGCCGGTATGGT-3，)或其活性片革史的正向 引物；包含SEQ. ID NO. 36 (5，-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3,〉或其活性片
段 的 反 向 引 物 ； 以 及 包 含
SEQ. ID NO. 37 (5'-AGGCTTCTCCGTCTGCTCT-3，)或其活性片段的檢測探
針；
引 物 / 探針組 12 ， 其 包 括 包 含 SEQ. ID NO. 38 (5，-ATTGCCGGTATGGTTTCAA-3，)或其活性片,爻的正向引 物；包含SEQ. ID NO. 39 (5,-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3，)或其活性片
段 的 反 向 引 物 ； 以 及 包 含
SEQ. ID NO. 40 (5'-AGGCTTCTCCGTCTGCTCT3，)或其活性片^史的;f全測凈果
針；
引物/探針組 13, 其包括包 含
S￡Q. ID NO. 41 (5'-GTCATTCTGCCTATTGCCGGT-3，)或其活性片,史的正向 引物；包含SEQ. ID NO. 42 (5，-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3，)或其活性
片 段的反向 引 物 ； 以 及 包 含
SEQ. ID NO. 43 (5，-TGCATCCAATCAGATTTCCTTTCG-3，)或其活性片,爻的
檢測探針；
引 物 / 探針 組 14 , 其 包 括 包 含 SEQ. ID NO. 44 (5，-TCTGCCTATTGCCGGTATGGT-3，)或其活性片^殳的正
向引物；包含SEQ.ID N0. 45 (5，-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3,)或其活'f生
片 段 的 反向 引 物 ； 以 及 包 含
SEQ. ID No. 46 (5'-GCTTCACGCCTTCCTTGCAGTTA-3，)或其活性片l殳的斗全
測探針；
引物 / 探針 組 15 , 其 包 括 包 含
SEQ. ID NO. 47 (5，-TCTGCCTATTGCCGGTATGGT-3，)或其活性片^殳的正向
引物；包含SEQ.10 N0. 48 (5'-GAAGCGGCCAAAGCATATGC-3')或其活性片
段 的 反 向引物 ； 以 及 包 含
SEQ. ED No, .49 (5，-TCACGCCTTCCTTGCAGTTA-3，)或其活性片革殳的沖全測
探針；以及
引 物 / 探針 組 16 , 其 包 括 包 含 SEQ. ID NO. 50 (5，-TGATCTAAACCTTTTGAATCGTTGTC-3，)或其活性片,殳的
正 向 引 物 ； 包 含
31SEQ. ID NO. 51 (5，- GTAACGCCGTAGGATTGGATATATC-3')或
其活性片段的反向引物； 以及包含
SEQ. ID No. 52 (5，-CCATGGCGGATGCGTTAAAGGTCAG-3,)
或其活性片段的檢測探針。 寡核苷酸制備可通過本領域公知的多種方法中的任何一種制備本發(fā)明 的寡4亥苷酸(見，例3口， J. Sambrook等，"A/o/ecw/ar C7om'"g.'爿 Z^oraZory Mawwa/" ， 1989, 第2版，Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, NY; "尸CA /V齒c0/5v爿GWde M"/ o<^ 4p/ /zca"oW , 1990， M.A. Innis (編輯),Academic Press: New York, NY; P. Tijssen "外6nVfea"'ow 7Vwc/e/c爿"W iV0Z^-丄"60ra^ ^y
recAw/^wes5ZocAem/5t^y aw<i Afo/ecw/ar 5Zo/ogy f _PaWs / a打d // j ，，， 1993， Elsevier Science;"尸CW 5Vra吻b ", 1995， M.A. Innis (編輯)， Academic Press: New York, NY; 以及"57ioW/Vofoco/s z>z Mo/ecw/ar 5/o/og/， ， 2002， F.M. Ausubel (編輯)，第5版，John Wiley & Sons: Secaucus, NJ )。例^t口,可通過例i口，在S. A. Narang等，Meth. Enzymol. 1979, 68: 90-98; E丄.Brown等，Meth. Enzymol. 1979， 68: 109-151; E.S. Belo勵v等，Nucleic Acids Res. 1997, 25: 3440-3444; D. Guschin 等，Anal. Biochem. 1997,250: 203-211; MJ. Blommers等，Biochemistry, 1994， 33: 7886-7896;和K.Frenkel等，F(xiàn)ree Radic. Biol. Med. 1995， 19: 373-380;以及美國專利No. 4,458,066中的所述的化學合成和基 于模板的聚合反應制備寡核苷酸。例如，可使用基于亞磷酰胺法的自動化的、固相法制備寡 核普酸。在這種方法中，將每個核苷酸單獨地添加到正在增長的寡核 苷酸鏈的5，末端，其3'末端附著于固相支持物。所添加的核苷酸是以 三價3'-亞磷酰胺的形式，其在5'端位置被二甲氧基三苯甲基(或者 DMT)保護。堿基誘導的亞磷酰胺偶聯(lián)后，溫和氧化形成五價磷酸三 酯中間體，并且除去DMT，為寡核苦酸延長提供了新的位點。然后 將寡核苷酸從固體支持物上裂解下來，用氫氧化銨去除磷酸二酯和環(huán) 外氨基基團的保護。這些合成可在，如可從Perkin Elmer/Applied Biosystems， Inc. (Foster City， CA) , DuPont ( Wilmington, DE)或 者Milligen (Bedford, MA)購買到的那些寡核普酸合成儀上進行。
32可選擇地，寡核苷酸可以是委托制備的和從本領域公知的多種商業(yè)來
源包括，例如，Midland Certified Reagent Company ( Midland, TX )， ExpressGen, Inc.( Chicago, IL ), Operon Technologies, Inc.( Huntsville, AL) ， BioSearch Technologies, Inc. (Novato, CA)，以及許多其它 〃>司定購的。本發(fā)明的寡核苷酸的純化，無論必須的還是期望的，均可 通過本領域多種公知方法中的任何一種來完成。寡核苷酸的純化一般 通過非變性的丙婦酰胺凝結電泳，或者通過如例如，J.D. Pearson和 F.E. Regnier( J. Chrom.， 1983,255: 137-149 )所述的陰離子交換HPLC， 或者通過反向HPLC (G.D. McFarland和P.N. Borer, Nucleic Acids Res., 1979, 7: 1067-1080 )進行。可使用任何適當?shù)臏y序法確認寡核苷酸的序列，包括但不 限于，化學降解(A.M. Maxam和W. Gilbert, Methods of Enzymology， 1980, 65: 499-560 )、襯質輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF ) 質譜分析法(U. Pieles等，Nucleic Acids Res., 1993, 21: 3191-3196 )、 堿性磷酸酶和核酸外切酶聯(lián)合消化后的質譜分析法(H. Wu和H. Aboleneen, Anal. Biochem., 2001， 290: 347-352)，等等。如上面已經(jīng)提到的，可使用本領域中已知的幾種方法中的 任何一種制備修飾的寡核苷酸。這種修飾的非限制性的實例包括甲基 化、"加帽"、用類似物取代天然存在的核苷酸中的一個或多個，以 及核香酸間修飾，例如，具有不帶電荷的鍵(例如，甲基磷酸酯，磷 酸三酯、亞磷酰胺、氨基曱酸酯等)，或者帶電荷的鍵(例如，硫代 磷酸酯、二硫代磷酸酯，等)的那些。寡核苦酸可含有一種或多種另 外共價連接的元件，如，例如，蛋白質(例如，核酸酶、毒素、抗體、 信號肽、聚L-賴氨酸等)、嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂素，等)、 螯合劑(例如，鰲合金屬、放射性金屬、氧化性金屬等)，以及烷化 劑(alkylator)。寡核香酸也可通過形成曱基或乙基磷酸三酯或者烷 基氨基磷酸酯鍵衍生。此外，本發(fā)明的寡核苷酸序列也可用標記物進 行修飾。
寡核苷酸序列的標記在某些實施方案中，在擴增/檢測測定中所述檢測探針或 擴增引物或者探針和引物兩者在應用前用可檢測的試劑或者元件進
33行標記。在一些實施方案中，檢測探針用檢測試劑進行標記。檢測試 劑的作用是允許所擴增的靶序列(擴增子)顯影和檢測。優(yōu)選地，選 擇檢測試劑，使得其產(chǎn)生可測量的、并且其強度與正在分析的樣品中 擴增產(chǎn)物的量相關(例如，成比例的)的信號。寡核苷酸(例如，檢測探針)和檢測試劑之間的關系可以 是共價的或者是非共價的?？赏ㄟ^可檢測元件的整合、或者共軛制備 經(jīng)標記的檢測探針。標記可直接地或者間接地(例如，通過接頭)附 著到核酸序列上。各種長度的接頭或者間隔臂是本領域已知且可買到 的，并且可以選擇以減少空間位阻，或者賦予所得標記分子其它有用 的或者期望的特性(見，例如，E.S. Mansfield等，Mol. Cell Probes， 1995， 9: 145-156)。用于標記核酸分子的方法是本領域公知的。對于標記方 案、標記;f企測技術，以及該領域中的最近發(fā)展狀況的綜述，見，例如， LJ. Kricka, Ann. Clin. Biochem. 2002, 39: 114-129; R.P. van Gijlswijk 等，Expert Rev. Mol. Diagn. 2001， 1: 81-91;以及S. Joos等，J. Biotechnol. 1994， 35: 135-153。常規(guī)的核酸標記方法包括放射性試 劑的摻入，熒光染料(L.M. Smith等，Nucl. Acids Res.， 1985， 13: 2399-2412 )或者酶(B.A. Connoly和O. Rider, Nucl. Acids. Res., 1985, 13: 4485-4502)的直接附著；核酸分子的化學修飾，使得它們可通過 免疫化學或者通過其它親和反應被檢測到(T.R. Broker等，Nucl. Acids Res. 1978, 5: 363-384; E.A. Bayer等，Methods of Biochem. Analysis, 1980, 26: l隱45; R. Langer等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981， 78: 6633-6637; R. W. Richardson等，Nucl. Acids Res. 1983， 11: 6167-6184; DJ.Brigati等，Virol. 1983， 126: 32-50; P. Tchen等，Proc. Natl Acad. Sci. USA， 1984， 81: 3466-3470; J.E. Landegent等，Exp. Cell Res. 1984, 15: 61-72;以及A.H. Hopman等，Exp. Cell Res. 1987， 169: 357-368 ); 以及酶介導的標記法，如隨機引發(fā)、切口平移、PCR和用末端轉移酶 的加尾(對于酶促標記的綜述，見，例如J. Temsamani和S. Agrawal， Mol. Biotechnol. 1996, 5: 223-232 )。最近發(fā)展的核酸標記系統(tǒng)包括 但不限于ULS(通用連接系統(tǒng))，其基于單反應性順式鉑氨衍生物 與DNA中鳥噪呤的N7位置的反應(RJ. Heetebrij等，Cytogenet. Cell. Genet. 1999， 87: 47-52 )，補骨脂素-生物素，其插入到核酸內(nèi)并且一旦UV照射便共價連接到核苷酸堿基上(C. Levenson等，Methods Enzymol. 1990， 184: 577-583;和C. Pfa畫chmidt等，Nucleic Acids Res. 1996, 24: 1702-1709)，光敏疊氮衍生物(C. Neves等，Bioconjugate Chem. 2000, 11: 51-55 )，以及DNA烷化劑(M.G. Sebestyen等， Nat. Biotechnol. 1998, 16: 568-576)?？稍诒景l(fā)明的實踐中使用多種檢測劑中的任何一種。適當 的檢測劑包括但不限于，各種配體、放射性核素(如，例如，32P、 35S、 3H、 14C、 125I、 131I,等等)；熒光染料(特異性示范性的熒光染料， 見下面)；化學發(fā)光劑(如，例如，吖啶酯、穩(wěn)定的二氧雜環(huán)丁烷， 等等)；可光譜解離的無機熒光半導體微晶體(即，量子點)、金屬 納米顆粒(例如，金、銀、銅和柏)或者納米蔟；酶(如，例如，在 ELISA中使用的辣根過氧化物酶、p-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷 酸酶)；比色標記(如，例如，染料、膠體金，等等)；磁性標記(如， 例如，Dynabeads );以及生物素、地高辛或者其它半抗原和可得到 的用于抗血清或單克隆抗體的蛋白質。在某些實施方案中，本發(fā)明的檢測探針是用熒光標記的。 具有多種化學結構和物理特征的多種已知熒光標記元件適用于本發(fā) 明。適當?shù)臒晒馊玖习ǖ幌抻?，熒光素和熒光素染?例如，異 硫氰酸熒光素或FITC、萘熒光素(naphthofluorescein )、 4',5'-二氯-2'，7，-二曱氧熒光素、6-羧基熒光素或者FAM),羰花青、部花青、苯乙烯 基染料(styryldye)、雜氧菁(oxonol)染料、藻紅素、赤蘚紅，曙 紅、羅丹明染料(例如，羧基四曱基羅丹明或TAMRA、羧基羅丹明 6G、羧基-X-羅丹明(ROX)、麗絲胺羅丹明B、羅丹明6G、羅丹明 綠、羅丹明紅、四曱基羅丹明或TMR)、香豆素和香豆素染料(例如， 曱氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羥基香豆素和氨基甲基香豆素或 AMCA) 、 Oregon綠染料(例如，Oregon綠488、 Oregon綠500、 Oregon 綠514)、德克薩斯紅、德克薩斯紅-X、 Spectrum Red 、 Spectrum Green ,花青染料(例如,Cy-3TM、 Cy-5TM、 Cy-3.5TM、 Cy-5.5TM)、 Alexa Fl雨染料(例如，Alexa Fluor 350、 Alexa Fluor 488、 Alexa Fluor 532、 Alexa Fluor 546、 Alexa Fluor 568、 Alexa Fluor 594、 Alexa Fluor 633 、 Alexa Fluor 660和Alexa Fluor 680 )、 BODIPY染料(例如，BODIPY FL、 BODIPY R6G、 BODIPY TMR、 BODIPY TR、 BODIPY 530/550、
35BODIPY 558/568 、 BODIPY 564/570、 BODIPY 576/589、 BODIPY 581/591、 BODIPY 630/650、 BODIPY 650/665 ) 、 IRDyes(例如，IRD40, IRD 700， IRD 800),等等。對于更多的適當?shù)姆俟馊玖弦约坝糜趯?br> 熒光染料連接或摻入到核酸分子中的方法的實例，見，例如，"rAe
//aw必ooA: o/F/womycewf尸roZ)e51 i e"an:A iVc^wcW , 第9版， Molecular Probes, Inc., Eugene, OR。焚光染料以及標記試劑盒可/人 例^口， Amersham Biosciences, Inc. ( Piscataway, NJ ), Molecular Probes Inc. ( Eugene, OR ), 和New England Biolabs Inc. ( Berverly， MA )
購買到。 —些熒光基團(供體)染料本身不能被直接檢測到，而是 在熒光共振能量轉移(FRET)的過程中將能量轉移到另一個熒光基 團(受體)，第二種基團產(chǎn)生可檢測的熒光信號。在這些實施方案中， 寡核普酸檢測探針可能，例如，當與所擴增的把序列雜交時可被檢測 到。適于在本發(fā)明中使用的FRET受體/供體對的實例包括但不限于， 焚光素/四曱基羅丹明、IAEDANS/FITC 、 IAEDANS/5-碘乙酰胺 (iodoacetomido )焚光素、B-藻紅蛋白/Cy-5，以及EDANS/Dabcyl。
明的范圍內(nèi)。在TaqMan 測定中使用這種系統(tǒng)'(如例如^在美國專 利Nos. 5,210,015; 5,804,375; 5487,792和6214,979中所描述的)或 者作為分子信標(如，例如在S. Tyagi和F.R. Kramer,Nature Biotechnol. 1996, 14: 303-308; S. Tyagi等，Nature Biotechnol. 1998， 16: 49-53; L.G. Kostrikis等，Science, 1998, 279: 1228-1229; D丄.Sokol等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA5 1998, 95: 11538-11543; S.A. Marras等, Genet. Anal. 1999， 14: 151-156;以及美國專利Nos. 5,846,726、 5,925,517、 6,277,581和6，235，504中所描述的)是本領域公知的。當 它們以所謂的"實時"方式形成時，可用TaqManTM測定形式4企測擴 增反應的產(chǎn)物。結果，當反應混合物在擴增條件下時，形成擴增產(chǎn)物 /探針雜合體并進行檢測。在本發(fā)明的一些實施方案中，PCIU全測:深針是在5'末端用 熒光元件和在3'末端用猝滅劑元件標記的TaqManTM樣探針。在美國 專利5,210,015; 5，804，375; 5,487,792;和6，214,979;以及WO 01/86001 (其中的每一個在此以其整體引入作為參考)中公開了用于與
36TaqMan 樣探針一起使用的適當?shù)臒晒鈭F和猝滅劑。猝滅劑的實例 包括，但不限于，DABCYL(即，4-(4，-二甲氨基苯偶氮基)-苯甲酸) 琥珀酰亞胺酯、二芳基羅丹明羧酸、琥珀酰亞胺酯(或者QSY-7)、 以及4',5'-二硝基熒光素羧酸、琥珀酰亞胺酯(或者QSY-33 )(所有 都可從，例如Molecular Probes中獲得)、猝滅劑1 ( Ql;可從Epoch Biosciences, Bothell, WA中獲得),或者"黑洞猝滅劑(Black Hole Quencher ) ，， BHQ-1 、 BHQ-2,和BHQ-3 (可從BioSearch Technologies, Inc., Novato, CA中獲得)。在某些實施方案中，PCR^r測:探針是在 5'末端用FAM和在3'末端用黑洞猝滅劑標記的TaqManTM樣:探針。也可將正?；蛐揎椀暮塑账岬?尾"添加到用于檢測性目 的的寡核苷酸探針上。和與該尾互補并且含有一個或多個檢測標記 (如，例如，熒光團、酶或者已用放射性標記的石成基)的核酸的第二 次雜交允許擴增子/探針雜合體的顯像(見，例如，可從Enzo Biochem. Inc., New York, NY購買到的系統(tǒng))?？蓱帽景l(fā)明的寡核苷酸實施 測定的另 一個實例是如在美國專利No. 5，124，246 (其在此以其整體引 入作為參考)中所述的信號擴增法。在該方法中，通過使用擴增多聚 體對信號進行擴增，構建多核苷酸使得其含有與添加到寡核苷酸探針 的"尾"特異性雜交的第一節(jié)段，以及與標記的探針特異性雜交的同 一第二節(jié)段的多重性。擴增的程度理論上與第二節(jié)段的重復數(shù)成比
例。多聚體可以是線性的或者是分支的。分支的多聚體可以是叉或梳 子的形狀。特定的核酸標記技術的選擇將取決于當時的情況，并且將 受幾種因素影響，如標記方法的難易和成本、期望標記的樣品的質量、 可檢測元件對雜交反應的影響(例如，對雜交過程的速度和/或效率的 影響)、所用擴增方法的性質、檢測系統(tǒng)的性質、由檢測標記所產(chǎn)生 的信號的性質和強度，等等。
使用本發(fā)明的引物擴增淋病奈瑟氏球菌靶序列本發(fā)明的寡核普酸序列用于擴增試驗樣品中淋病奈瑟氏 球菌靶序列的用途不限于任何特定的核酸擴增技術或其任何特定的 擴增。事實上，可在本領域公知的多種核酸擴增方法(見，例如，A.R. Kimmel和S丄.Berger， Methods Enzymol. 1987, 152: 307-316; J. Sambrook等，"Mo/ecw/ar C7om7zgv j丄a6orafo^y Mawwa/" , 1989，
37第2版,Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, NY; "5^oW /W歸/"w Mo/簡/w 5油gy" ， F.M. A應bel (編輯)，2002,第5 版，John Wiley & Sons: Secaucus， NJ)中的任何一種中使用本發(fā)明 的寡核苷酸序列。這種核酸擴增法包括但不限于聚合酶鏈反應(或者PCR，
M.A. Innis(編輯)，1990， Academic Press: New York;"尸Ci ， M. A. Innis (編輯),1995， Academic Press: New York;"尸o/戸era"
4p; 簡c力"，McPherson等(編輯)，1991, IRL Press: Oxford; Saiki 等，Nature, 1986, 324: 163;以及美國專利Nos. 4,683,195、 4，683，202 和4,889,818中所描述的，其中的每一個在此以其整體引入作為參考)； 和其包括基于TaqManTM測定的改變(Holland等，Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, 88: 7276-7280 )，以及反轉錄酶聚合酶鏈式反應(或者 RT陽PCR,例如，在美國專利Nos. 5,322,770和5,310,652中所描述的， 其中的每一個在此以其整體引入作為參考)。在PCR中，過量使用引物對與靶核酸的互補鏈雜交。使 用耙序列作為模板，各引物通過DNA聚合酶延伸。從最初的耙鏈中 解離(變性)后，延伸產(chǎn)物本身成為靶。新引物隨即與之雜交并通過 聚合酶延伸，使該循環(huán)重復進行，以指數(shù)形式增加擴增子的拷貝數(shù)。 在PCR反應中能產(chǎn)生引物延伸產(chǎn)物的DNA聚合酶的實例包括但不限 于大腸桿菌(五.co//) DNA聚合酶I、聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、從水生棲熱菌(7T^ 7m^ ^wa"cws)中分離的耐熱的 DNA聚合酶(Taq),可從多種來源中獲得(例如，Perkin Elmer), 從嗜熱棲熱菌(7T^r聽51 "er歸/7/H7/c51) ( United States Biochemicals )、 5ac"/ws 5terec^/^r附o/ Az7w51 ( Bio畫Rad ) 或者 77 er附ococcw51 /"ora/Zs ("Vent"聚合酶，New England Biolabs )中分離的耐熱的DNA聚合 酶?？蓪NA靶序列進行擴增，通過將mRNA逆轉錄成cDNA，然 后如上所述進行PCR(RT-PCR)?？蛇x擇地，可在美國專利No. 5,322,770 (其在此以其整體引入作為參考)所述，在兩個步驟中都使 用單獨的酶。除了上述酶促熱擴增法，可使用本發(fā)明的寡核苷酸引物通過等溫酶促擴增反應擴增淋病奈瑟氏球菌靶序列(S.C. Andras等， Mol. Biotechnol., 2001, 19: 29-44)。這些方法包括但不限于，轉錄 介導的擴增(或者TMA,例如，如在D.Y. Kwoh等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1989, 86: 1173-1177; C. Giachetti等，J. Clin. Microbiol.， 2002， 40: 2408-2419;和美國專利No. 5,399,491中所述)；自動維 持序列擴增(或者3SR,例如，如在J.C. Guatelli等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990， 87: 1874-1848;和E. Fahy等，PCR Methods and Applications, 1991, 1: 25-33中所述)；基于核酸序列的擴增(或者 NASBA,例如，如在T. Kievits等，J. Virol.， Methods, 1991， 35: 273-286;和美國專利No. 5,130,238中所述)以及鏈置換擴增(或者 SDA,例如，如在G.T. Walker等，PNAS, 1992, 89: 392-396; EP 0 500 224 A2中所述)。在本段中所引用的參考文獻中的每一個在此以 其整體引入作為參考。鏈置換擴增(SDA)將限制性內(nèi)切酶切割其靶DNA的未 修飾鏈的能力和缺乏核酸外切酶活性的DNA聚合酶的作用相結合， 在固定的溫度下延伸切口處的3，末端并置換下游DNA鏈(G.T. Walker 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992， 89: 392-396)。在SDA中所 用的引物包括靶結合序列5'端的限制性內(nèi)切酶識別位點(美國專利 Nos. 5,270,184和5，344，166，其中的每一個在此以其整體引入作為參 考)?；诤怂嵝蛄械臄U增(NASBA)使用在低等溫溫度，通 常41。C共同工作的三種酶(例如，核糖核酸酶H、禽類成髓細胞白血 病病毒(AMV)反轉錄酶和T7 RNA聚合酶)(J. Compton， Nature, 1991, 350: 91-92; A.B. Chan和J.D. Fox, Rev. Med. Microbiol.， 1999， 10: 185-196) 。 NASBA反應的產(chǎn)物主要是單鏈RNA。自動維持序列 擴增(3SR)反應對于耙DNA或RNA序列的等溫擴增是非常有效的 方法。3SR系統(tǒng)包括AMV逆轉錄酶、大腸桿菌核糖核酸酶H和依賴 DNA的RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶)的綜合活性。轉錄介 導的擴增(TMA)使用RNA聚合酶由引物區(qū)被改造的啟動子制備 RNA，使用逆轉錄酶從RNA模板中產(chǎn)生互補DNA,以及使用核糖核 酸酶H從cDNA中除去RNA ( J.C. Guatelli等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1990， 87: 1874-1878 )。
NASBA、 3SR和TMA引物需要與引物的靶結合序列連接 的RNA聚合酶啟動子。在引物中摻入的啟動子或啟動子序列是RNA 聚合酶特異性識別的核酸序列(天然存在的，通過合成產(chǎn)生的或者是 限制性消化的產(chǎn)物)，其中RNA聚合酶識別和結合該序列并且起動 產(chǎn)生RNA轉錄本的轉錄過程。有用的啟動子的實例包括由某些噬菌 體聚合酶識別的，如來自噬菌體T3、 T7或SP6的那些或者大腸桿菌 的啟動子。
擴增的淋病奈瑟氏球菌靶序列的檢測在本發(fā)明的某些實施方案中，使用寡核苷酸探針序列檢測 由擴增反應所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物(即，擴增的淋病奈瑟氏球菌靶序列)。 可使用本發(fā)明的探針序列，使用多種公知的同源或異源方法。同源檢測方法包括但不限于，使用附著到探針上并且在靶 序列存在時發(fā)射信號的FRET標記、分子信標(S. Tyagi和F.R. Kramer， Nature Biotechnol. 1996, 14: 303-308; S. Tyagi等，Nature Biotechnol. 1998， 16: 49-53; L.G. Kostrikis等，Science, 1998， 279: 1228-1229; DX.Sokol等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998， 95: 11538-11543; S.A.Marras等，Genet. Anal. 1999, 14: 151-156;以及美國專利Nos. 5,846,726、 5，925，517、 6,277,581和6,235,504),以及所謂的TaqMan 測定(美國專利Nos. 5,210,015; 5,804,375; 5487,792和6214，979以 及W001/86001 )。使用這些檢測技術檢測所形成的產(chǎn)物，即，以所 謂實時方式檢測擴增反應的產(chǎn)物。結果，當反應混合物處于擴增條件 下時，可形成并檢測擴增產(chǎn)物/探針雜合體。在某些實施方案中，在TaqMan 測定中使用本發(fā)明的檢 測探針。TaqMan 測定，也稱作熒光團5'核酸酶測定，是一種用于 核酸靶的、基于PCR的特效且通用的檢測系統(tǒng)。通過監(jiān)測焚光信號的 產(chǎn)生，與熱循環(huán)一道進行分析。測定系統(tǒng)具有產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)的能力， 可由此確定靶拷貝數(shù)。例如，可使用以前定量的淋病奈瑟氏球菌懸液 的系列稀釋液制備標準曲線，可將未知樣品與其進行比較。使用例如， 如上所述的具有內(nèi)源性5，核酸酶活性的AmpliTaq Gold DNA聚合酶 消化用熒光報道分子染料和猝滅劑元件標記的寡核苷酸探針，便于進 行TaqMan 測定。通過測量在擴增循環(huán)期間當探針被消化，熒光和 猝滅劑元件的偶聯(lián)解除以及導致與靶序列的擴增成比例的熒光信號增加時所發(fā)生的熒光的變化，獲得測定結果。同源檢測法的其它實例包括雜交保護測定(HPA)。在這 種測定中，使用基于非核苷酸的接頭臂化學(美國專利Nos. 5,585,481 和5,185,439 )將探針用 一種高化學發(fā)光分子，吖啶酯(AE )標記(Weeks 等，Clin. Chem., 1983， 29: 1474-1479; Berry等，Clin. Chem.， 1988, 34: 2087-2090)?；瘜W發(fā)光通過用堿性過氧化氫的AE水解觸發(fā)，產(chǎn) 生被激發(fā)的N-曱基吖啶酮，其隨后發(fā)射光子而失活。在缺乏靶序列時， AE迅速水解。然而，當探針與把序列結合時，AE水解的速度通常降 低。因此，不需要物理分離即可直接檢測溶液中雜交的和未雜交的 AE標記的4笨4十。異源檢測系統(tǒng)是本領域公知的，通常使用捕獲劑從反應混 合物中的其它材料中分離所擴增的序列。捕獲劑 一般包括用 一種或多 種特異性結合序列包被的固體支持材料(例如，微量滴定孔、珠、芯 片，等等)。結合序列可以與添加到本發(fā)明的寡核苷酸探針上的尾序 列互補。可選擇地，結合序列可以與捕獲寡核苷酸的序列互補，其本 身包括與本發(fā)明寡核苷酸探針的尾序列互補的序列。與捕獲劑結合的 擴增產(chǎn)物/探針雜合體從剩余的反應混合物中分離后，可使用任何檢測 法，如這里所描述的那些，檢測擴增產(chǎn)物/探針雜合體。
II-檢測試驗樣品中淋病奈瑟氏球菌的方法在另一個方面，本發(fā)明提供檢測試驗樣品中是否存在淋病 奈瑟氏球菌的方法。本發(fā)明的方法可用于檢驗表現(xiàn)或者不表現(xiàn)淋球菌 感染癥狀或其后遺癥的患者，和/或用于篩選危險人群。 —般地，本發(fā)明的方法包括下列步驟提供懷疑含有淋病 奈瑟氏球菌核酸(例如，包括淋病奈瑟氏球菌的可讀框-1 (Oi i^)基 因、胞嘧啶甲基轉移酶(&mG)基因或菌毛蛋白反向蛋白同系物 (p/WVG)基因內(nèi)的序列的核酸)的試驗樣品；將試驗樣品與至少一 種這里所公開的寡核苷酸接觸，使得寡核苷酸能與淋病奈瑟氏球菌核 酸(如果試驗樣品中存在的話)雜交；以及^r測與淋病奈瑟氏球菌核 酸雜交的任何寡核苷酸，其中檢測到寡核苷酸與淋病奈瑟氏球菌核酸 的雜交表明試驗樣品中存在淋病奈瑟氏球菌。本發(fā)明的另 一個方法包括將懷疑含有淋病奈瑟氏球菌核 酸的試驗樣品與這里所公開的至少 一種引物組或引物/探針組以及擴
41增反應試劑接觸以形成反應混合物。然后將該反應混合物置于擴增條 件下以便擴增淋病奈瑟氏球菌核酸(如果試驗樣品中存在的話)，產(chǎn) 生擴增產(chǎn)物?？墒褂枚喾N檢測技術檢測所得到的擴增產(chǎn)物。在某些實 施方案中，使用本發(fā)明的檢測探針形成擴增產(chǎn)物/探針雜合體，檢測到 這種雜合體表明試驗樣品中存在淋病奈瑟氏球菌。 樣品制備根據(jù)本發(fā)明的方法，可通過檢測包括淋病奈瑟氏球菌的可 讀框-1 (Oi ^7)基因、胞嘧啶曱基轉移酶(^twG)基因或菌毛蛋白 反向蛋白同系物(p/viVG)基因內(nèi)的序列的任何淋病奈瑟氏球菌核酸， 確定試驗樣品中是否存在淋病奈瑟氏球菌。因此，懷疑包括這種淋病 奈瑟氏球菌靶序列的任何液體或固體生物學材料都可能是適當?shù)脑?驗樣品。在某些實施方案中，優(yōu)選的試驗樣品包括尿(例如，首次排 尿(first void urine))、精液、唾液、眼球晶狀體液、淋巴液、子宮 頸內(nèi)的、尿道的、直腸的、陰道的、外陰-陰道的以及來自鼻咽部樣品。 其它優(yōu)選的試驗樣品包括PAPS-涂片樣品。試驗樣品將常常從懷疑被淋病奈瑟氏球菌感染的患者中 獲得或分離。如已提到的，試驗樣品可以在分離后不需要進一步處理 便可使用，或者，可選擇地，可在分析前對其進行加工。例如，可處 理試驗樣品以便從含有它們的細胞中釋放淋病奈瑟氏球菌核酸。核酸 提取的方法是本領域公知的并且包括化方法、溫度法，以及機械法 (見，侈寸^口, J. Sambrook等， "Afo/ecw/ar C7owz7zg.. yl Z^60na^or7 她wwa/" ， 1989, 第2版,Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, NY)。也有許多不同的和通用的試劑盒，可用于從生物樣品 中提耳又核酸,它們可從例如，Amersham Biosciences ( Piscataway, NJ)、 BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA) 、 Epicentre Technologies (Madison, WI) 、 Gentra Systems, Inc.( Minneapolis, MN ) 、 MicroProbe Corp. ( Bothell, WA) 、 Organon Teknika ( Durham, NC )，和Qiagen Inc. (Valencia, CA)中購買到。在所有這些試劑盒中通常都包括使 用者指南，其更詳細地描述了應當遵循的方案。 一種試劑盒和另一種 試劑盒之間的靈敏度、加工時間和成本可能不同。本領域普通技術人 員能很容易地選擇最適合特定情況的試劑盒。 4是取前，可純化、濃縮或者從原始生物樣品的其它成分中分離含有淋病奈瑟氏球菌核酸的細胞，例如，通過過濾或離心。 樣品分析本領域技術人員了解根據(jù)本發(fā)明的方法，可使用任何擴增 /檢測方法學，如這里所描述的那些，進行淋病奈瑟氏球菌靶序列的擴 增和對所擴增的淋病奈瑟氏球菌核酸進行檢測。在某些實施方案中， 使用TaqManTM測定進行試驗樣品中淋病奈瑟氏球菌的^r測，以及通 過熒光以實時方式監(jiān)測形成的擴增產(chǎn)物。在這些實施方案中，如這里 所述，將使用在5'末端用焚光報道分子和在3'末端用幹滅劑元件標記 的探針。擴增條件的最佳化和適于TaqManTM測定形式的擴增反應試 劑的選擇都在本領域技術人員的能力范圍內(nèi)。在某些實施方案中，向生物樣品(或者向從生物樣品中提 取的純化的核酸)中添加內(nèi)部對照或者內(nèi)部標準以作為提取和/或靶擴 增的對照。內(nèi)部對照通常包括與靶序列不同并且能通過用于擴增靶淋 病奈瑟氏球菌核酸的引物擴增的序列。使用內(nèi)部對照可監(jiān)測提取過 程、擴增反應、4企測，以及測定進行的控制。所擴增的對照和所擴增 的耙 一 般在檢測步驟中通過使用用于檢測對照和耙的不同探針(例 如，用不同檢測劑標記)進行區(qū)分?？墒褂猛簧飿悠返牟煌确衷嚇踊蛘呤褂貌煌脑?驗樣品(例如，如果第一次所分析的樣品是尿樣品的話，使用子宮頸 內(nèi)拭子，或者在不同時間收集的尿樣品)，通過重復本發(fā)明的測定來 證實試驗樣品中存在靶淋病奈瑟氏球菌。也可使用本發(fā)明引物的不同 組，通過耙定淋病奈瑟氏球菌染色體的不同區(qū)域進行確定檢驗。可選 擇地或另外地，可通過進行不同的測定(即，基于不同方法學的測定) 確定試驗樣品中存在淋病奈瑟氏球菌。例如，如果使用TaqManTM測 定進行第一次分析，那么可使用轉錄介導的擴增(TMA)反應進行第 二次分析?？梢輷竦鼗蛄硗獾?可通過不同的測定(例如，從細胞培
養(yǎng)物中分離)確定試驗樣品中存在淋病奈瑟氏球菌。
III-同時檢測淋病奈瑟氏球菌和其它生物體的多重測定如上所述本發(fā)明的引物/探針組對淋病奈瑟氏球菌是特異
性的。因此，本發(fā)明也提供使用至少兩個引物組或引物/探針組的組合 (即， 一種選自這里所公開的淋病奈瑟氏球菌特異性集合以及另一種
43選自對將要檢驗的其它生物體特異的集合)，同時檢測試驗樣品中是 否存在淋病奈瑟氏球菌和待檢的其它生物體的方法?？膳c淋病奈瑟氏球菌同時檢測的其它生物體包括但不限 于，在表4中所列生物體中的任何一種。在某些實施方案中，將要與 淋病奈瑟氏球菌同時被檢驗的其它生物體是砂眼衣原體。特別地，本發(fā)明提供用于檢測試驗樣品中淋病奈瑟氏球菌 和/或砂眼衣原體的方法，其包括下列步驟提供懷疑含有淋病奈瑟氏 球菌核酸和/或砂眼衣原體核酸的試驗樣品；在用于擴增全部或部分淋 病奈瑟氏球菌核酸(如果樣品中存在的話)的條件下，將試驗樣品與 這里所公開的引物/探針組接觸，以產(chǎn)生淋病奈瑟氏球菌擴增子；在用 于擴增全部或部分砂眼衣原體核酸(如果樣品中存在的話)的條件下， 將試驗樣品與至少一種砂眼衣原體特異的引物/探針組接觸，以產(chǎn)生砂 眼衣原體擴增子；檢測任何淋病奈瑟氏球菌擴增子和任何砂眼衣原體 擴增子，其中檢測到淋病奈瑟氏球菌擴增子表明試驗樣品中存在淋病 奈瑟氏球菌，檢測到砂眼衣原體擴增子表明試驗樣品中存在砂眼衣原 體。在某些優(yōu)選的實施方案中，砂眼衣原體特異的引物/探針 組是在國際申請No. PCT/US2006/43394 (Siemens Medical Solutions Diagnostics申請的)(其在此以其整體引入作為參考)中所述的一種。
IV-試劑盒在另一個方面，本發(fā)明提供試劑盒，包括用于根據(jù)這里所 述的方法檢測淋球菌感染的材料。診斷實驗室、試驗實驗室或者醫(yī)師 均可使用本發(fā)明的試劑盒。可在試劑盒中將根據(jù)本發(fā)明的、用于檢測淋病奈瑟氏球菌 的基本材料和試劑集中在一起。在某些實施方案中，試劑盒包括至少 一種本發(fā)明的引物組或者引物/探針組，以及可選擇地包含擴增反應試 劑。每個試劑盒優(yōu)選地包括賦予該方法特異性的試劑。因此，適于 NASBA的試劑盒優(yōu)選地包括具有與靶結合序列相連的RNA聚合酶啟 動子的引物，而適于SDA的試劑盒優(yōu)選地含有包括靶結合序列5，端 的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的引物。類似地，當試劑盒適于在5， 核酸酶測定，如TaqManTM測定中使用時，檢測探針優(yōu)選地含有至少 一個熒光報道分子元件和至少一個猝滅劑元件。
適當?shù)臄U增反應劑包括，例如，下列中的一種或多種緩 沖液、試劑、具有逆轉錄酶和/或聚合酶活性或者核酸外切酶活性的酶、 酶輔助因子如鎂或錳；鹽；適于進行擴增反應的脫氧核苷酸三磷酸 (dNTPs)如脫氧腺苷三磷酸(dTAP)、脫氧鳥普三磷酸(dGTP)、 脫氧胞苷三磷酸(dCTP)、脫氧胸苷三磷酸(dTTP)和脫氧尿苷三 磷酸(dUTP)。例如，適于與NASBA—起使用的試劑盒可含有適當 量的逆轉錄酶、核糖核酸酶H和T7RNA聚合酶。在適于轉錄擴增反 應，如NASBA的試劑盒中，可包括含有例如，已知能提高擴增反應 的DMSO的緩沖液。根據(jù)所用的方法，試劑盒可進一步包括下列中的一種或多 種洗滌緩沖液和/或試劑、雜交緩沖液和/或試劑、標記緩沖液和/或 試劑，以及檢測方法。優(yōu)選地，為了使試劑盒可應用于特定擴增/檢測 技術，對緩沖液和/或試劑進行優(yōu)化。試劑盒中也可包括使用這些緩沖 液和試劑用于進行該方法中的不同步驟的方案。此外，試劑盒可提供內(nèi)部對照來檢查擴增過程并且防止發(fā) 生由于擴增過程失敗所導致的假陰性檢驗結果。選擇不與擴增反應中 的耙核酸序列竟爭的最優(yōu)化的對照序列(如上所述)。試劑盒也可含有用于在擴增前從生物樣品中分離核酸和/ 或用于在核酸提取前純化或者分離淋病奈瑟氏球菌細胞的試劑。試劑可以固體(例如，凍干的)或者液體形式提供。本發(fā) 明的試劑盒可以任選地包括用于每個單個緩沖液和/或試劑的不同的 容器(例如，小瓶、安瓿、試管、燒瓶或瓶子)。每個成分通常將是 適當?shù)?，如等分在其各自容器中，或者以濃縮的形式提供。也可提供 適于進行擴增/檢測測定的某些步驟的其它容器。優(yōu)選地將單個容器維 持在極封閉狀態(tài)用于商業(yè)銷售。試劑也可包括使用擴增反應試劑和這里所述的引物組或 虧1物/探針的說明書。使用根據(jù)本發(fā)明的 一 個或多個方法的試劑盒的說
明書可包括用于加工生物樣品、提取核酸分子，和/或進行檢驗的說明； 用于解釋所得結果的說明以及以管理醫(yī)藥品或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用
或銷售的政府才幾構(例如，F(xiàn)DA)所失見定的形式的通知。 實施例
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下列實施例描述了一些制備和實踐本發(fā)明的優(yōu)選方式。然 而，應當理解的是，本實施例僅用于說明的目的，而不意味著限制本 發(fā)明的范圍。此外，除非實施例中的描述使用(英文)過去式，否則 如說明書的其它部分一樣，并非指下述實驗實際在過去進行或者數(shù)據(jù) 實際在過去獲得。
實施例1:砂眼衣原體/淋病奈瑟氏球菌多重測定的特異性
使用多重TaqMan kPCR測定檢驗十五(15)個不同砂眼 衣原體(CT)血清變型(即，A、 B、 Ba、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 J、 K、 Ll、 L2和L3)和四十六(46)個不同淋病奈瑟氏球菌(GC) 分離物。使用Stratagene的Mx3000pTM實時PCR系統(tǒng)(Stratagene Inc., SanDiego, CA)在單個、密封的反應孔中進行擴增和檢測。在 這些實驗中所使用的測定主混合物(master mix )含有Applied Biosystems ( Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA )或 QIAGEN (Hilden, Germany)提供的Taq DNA聚合酶、緩沖液、參 考染料(ROX)、以及MgCh、 AmpErase UNG ( 1單位/^L );本 發(fā)明的TaqMan⑧寡核苷酸引物和探針通過內(nèi)部合成或者從BioSearch Inc.購買。kPCR反應混合物由25 主混合物和25 |iL純化的DNA 組成。所得的結果如表4所示，顯示出CT/GC多重測定可^r測 廣范的CT血清變型和GC分離物。 CT/GC多重PCR主混合物也經(jīng)受了 74個非常相關生物(表 3中所示)的107拷貝的基因組DNA的挑戰(zhàn)，并且沒有顯示交叉反應性。
其它實施方案考慮到說明書2這里所公開的本發(fā)明的實施內(nèi)容，本發(fā)明 的其它實施方案對于本領域技術人員來說將是顯而易見的。說明書和 實施例被認為僅僅是示例性的，下列權利要求顯示本發(fā)明的真正范圍。
權利要求
1. 分離的寡核苷酸，其包含選自SEQ ID NOs.1-52的核酸序列，其活性片段，以及它們的組合。
2. 權利要求1的分離的寡核苷酸，進一步包括檢測標記。
3. 權利要求2的分離的寡核普酸，其中檢測標記包括附著于寡核 苷酸的5'末端的熒光元件。
4. 權利要求3的分離的寡核普酸，其中所述寡核苷酸進一步包括 附著于其3'末端的猝滅劑元件。
5. 權利要求4的分離的寡核苷酸，其中熒光元件包括6-羧基熒光 素，猝滅劑元件包括黑洞猝滅劑。
6. 用于4企測試,驗樣品中淋病奈瑟氏球菌(A^/^en'a gowwr/ioeae ) 的引物組的集合，該集合包括至少一種選自引物組1、引物組2、引 物組3、引物組4、引物組5、引物組6、引物組7、引物組8、引物 組9、引物組IO、引物組ll、引物組12、引物組13、引物組14、引 物組15和引物組16的引物組，其中引物組1包括包含SEQIDNO.l或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID NO.2或其任何活性片段的反向引物；引物組2包括包含SEQ IDN0.5或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID NO.6或其任何活性片段的反向引物；引物組3包括包含SEQ ID NO.8或其任何活性片段的正向引物， 和包含S EQ ID NO. 9或其任何活性片段的反向引物；引物組4包括包含SEQ ID NO.12或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID NO.13或其任何活性片段的反向引物；引物組5包括包含SEQ ID NO.15或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID NO.16或其任何活性片段的反向引物；引物組6包括包含SEQ ID NO.19或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID NO.20或其任何活性片段的反向引物；引物組7包括包含SEQ ID N0.22或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID N0.23或其任何活性片段的反向引物；引物組8包括包含SEQ ID N0.25或其任何活性片,殳的正向引物， 和包含SEQ ID NO.26或其任何活性片段的反向引物；引物組9包括包含SEQ ID N0.29或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQ ID NO.30或其任何活性片段的反向引物；引物組10包括包含SEQ ID NO.32或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQIDNO.33或其任何活性片>^殳的反向引物；引物組11包括包含SEQ ID N0.35或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQ ID N0.36或其任何活性片4殳的反向引物；引物組12包括包含SEQ ID N0.38或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQ ID N0.39或其任何活性片,殳的反向引物；引物組13包括包含SEQ ID N0.41或其任Y可活性片段的正向引 物，和包含SEQ ID NO.42或其任何活性片段的反向引物；引物組14包括包含SEQ ID N0.44或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQ ID NO.45或其任何活性片段的反向引物；引物組15包括包含SEQ ID N0.47或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQ IDN0.48或其任何活性片段的反向引物；引物組16包括包含SEQ ID NO.50或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQIDN0.51或其任何活性片段的反向引物。
7.用于檢測試驗樣品中淋病奈瑟氏球菌的寡核苷酸的集合，該集 合包括至少一種選自引物/探針組1、引物/探針組2、引物/探針組3、 引物/探針組4、引物/探針組5、引物/探針組6、引物/探針組7、引物 /探針組8、引物/探針組9、引物/探針組10、引物/探針組11、引物/ 探針組12、引物/探針組13、引物/探針組14、引物/探針組15和引物 /探針組16的引物/探針組，其中引物/探針組1包括包含SEQIDNO.l或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.2或其活性片段的反向引物，包含SEQ ID N0.3或其 活性片段的互補檢測探針；以及包含SEQ IDNO.4或其活性片段的反 向互補檢測探針；引物/探針組2包括包含SEQ IDN0.5或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.6或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID N0.7 或其活性片段的互補檢測探針；引物/探針組3包括包含SEQ IDN0.8或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.9或其活性片段的反向引物，包含SEQ ID NO.10或 其活性片段的互補檢測探針；以及包含SEQ ID NO.11或其活性片段 的反向互補檢測探針；引物/探針組4包括包含S E Q ID N0.12或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.13或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID NO. 14或其活性片段的互補檢測探針；引物/探針組5包括包含SEQ ID N0.15或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID NO.16或其活性片段的反向引物，包含SEQ ID NO.17或 其活性片段的互補檢測探針；以及包含SEQ IDN0.18或其活性片段 的反向互補檢測探針；引物/探針組6包括包含SEQ ID NO.19或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID NO.20或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID N0.21或其活性片段的互補檢測探針；引物/探針組7包括包含SEQ ID N0.22或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.23或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID N0.24或其活性片段的互補檢測探針；包含SEQ I N0.26或其活性片段的反向引;勿，、包含SEQ ID N^).27或 其活性片段的互補檢測探針；以及包含SEQ ID N0.28或其活性片段 的反向互補檢測探針；包含SEQ ID NO.30或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID N0.31或其活性片段的互補檢測探針；引物A笨針組10包括包含SEQ ID NO.32或其活性片^:的正向引 物，包含SEQIDN0.33或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID N0.34或其活性片段的檢測探針；引物/探針組11包括包含SEQ ID N0.35或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.36或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID N0.37或其活性片段的檢測探針；引物/探針組12包括包含SEQ ID N0.38或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.39或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID NO.40或其活性片段的檢測探針；引物/探針組13包括包含SEQ ID N0.41或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.42或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID N0.43或其活性片段的檢測探針；4引物/探針組14包括包含SEQ ID N0.44或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.45或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID N0.46或其活性片段的檢測探針；引物/探針組15包括包含SEQ ID NO.47或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.48或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID N0.49或其活性片段的檢測探針；引物/探針組16包括包含SEQ ID NO.50或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDNO,51或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID NO.52或其活性片段的檢測探針。
8. 權利要求7的寡核苷酸集合，其中至少一個檢測探針包含檢測 標記。
9. 權利要求8的寡核苷酸集合，其中所述檢測標記直接附著于至 少一個檢測探針上。
10. 權利要求8的寡核苷酸集合，其中所述檢測標記間接附著于 至少一個檢測探針上。
11. 權利要求8的寡核苷酸集合，其中所述檢測標記是可直接檢 測的。
12. 權利要求8的寡核苦酸集合，其中所述檢測標記是可間接檢 測的。
13. 權利要求8的寡核苷酸集合，其中所述檢測標記包含附著于 至少一個檢測探針的5'末端的焚光元件。
14. 權利要求13的寡核苷酸集合，其中所述至少一個檢測探針進 一步包含附著于其3，末端的猝滅劑元件。
15. 權利要求14的寡核苷酸集合，其中所述熒光元件包括6-羧基 熒光素，所述猝滅劑元件包括黑洞猝滅劑。
16. 用于檢測試驗樣品中淋病奈瑟氏球菌的試劑盒，包括 擴增反應試劑；和至少一種選自引物組l、引物組2、引物組3、引物組4、引物組 5、引物組6、引物組7、引物組8、引物組9、引物組IO、引物組ll、 引物組12、引物組13、引物組14、引物組15和引物組16的引物組， 其中引物組1包括包含SEQIDNO.l或其任何活性片段的正向引物，和包含SEQ ID N0.2或其任何活性片段的反向引物；引物組2包括包含SEQ IDN0.5或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID NO.6或其任何活性片段的反向引物；引物組3包括包含SEQ ID N0.8或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID N0.9或其任何活性片段的反向引物；引物組4包括包含SEQ ID NO. 12或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ IDN0.13或其任何活性片段的反向引物；引物組5包括包含SEQ IDN0.15或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID N0.16或其任何活性片段的反向引物；引物組6包括包含SEQ ID N0.19或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID NO.20或其任何活性片段的反向引物；引物組7包括包含SEQ ID N0.22或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID N0.23或其任何活性片段的反向引物；引物組8包括包含SEQ ID NO.25或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID N0.26或其任何活性片段的反向引物；和包含SEQ IDNO.30或其任何活性片^殳的反;引物； ^引物組10包括包含SEQ ID N0.32或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQIDNO.33或其任何活性片^:的反向引物；引物組11包括包含SEQ ID N0.35或其任何活性片^a的正向引 物，和包含SEQIDN0.36或其任何活性片段的反向引物；引物組12包括包含SEQ ID NO.38或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQ IDNO,39或其任何活性片段的反向引物；引物組13包括包含SEQ ID N0.41或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQ ID N0.42或其任何活性片段的反向引物；引物組14包括包含SEQ ID N0.44或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQIDNO.45或其任何活性片^:的反向引物；引物組15包括包含SEQ ID N0.47或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQ ID N0.48或其任何活性片段的反向引物；引物組16包括包含SEQ ID NO.50或其任何活性片卓爻的正向引 物，和包含SEQIDN0.5或其任何活性片段51的反向引物。
17.用于檢測試驗樣品中淋病奈瑟氏球菌的試劑盒，包括擴增反應試劑；和至少一種選自引物/探針組1、引物/探針組2、引物/探針組3、引 物/探針組4、引物/探針組5、引物/探針組6、引物/探針組7、引物/ 探針組8、引物/探針組9、引物/探針組10、引物/探針組11、引物/ 探針組12、引物/探針組13、引物/探針組14、引物/探針組15和引物 /探針組16的引物/探針組，其中引物/探針組1包括包含SEQIDNO.l或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID NO.2或其活性片段的反向引物，包含SEQ ID NO.3或其 活性片段的互補檢測探針；以及包含SEQ ID N0.4或其活性片段的反 向互補4企測揮:針；引物/探針組2包括包含SEQ ID N0.5或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.6或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID NO.7 或其活性片段的互補檢測探針；引物/探針組3包括包含SEQ ID N0.8或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.9或其活性片段的反向引物，包含SEQ ID NO.10或 其活性片段的互補檢測探針；以及包含SEQ ID NO.11或其活性片段 的反向互補檢測:寐針；引物/探針組4包括包含SEQ ID NO. 12或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID NO.13或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID NO. 14或其活性片段的互補檢測探針；引物/探針組5包括包含SEQ ID NO. 15或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID NO. 16或其活性片段的反向引物，包含SEQ ID NO.17或 其活性片段的互補檢測探針；以及包含SEQ ID NO.18或其活性片段 的反向互補檢測探針；引物/探針組6包括包含S EQ ID N0.19或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID NO.20或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID NO.21或其活性片段的互補檢測探針； 1物/探針組7包括包含SEQ ID NO.22或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.23或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID N0.24或其活性片段的互補檢測探針；引物/探針組8包括包含SEQ ID N0.25或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.26或其活性片段的反向引物，包含SEQ ID N0.27或其活性片段的互補檢測探針；以及包含SEQ ID N0.28或其活性片段 的反向互補檢測探針；引物/探針組9包括包含SEQ ID NO.29或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID NO.30或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID NO.31或其活性片段的互補檢測探針；引物/探針組10包括包含SEQ ID N0.32或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDNO.33或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID N0.34或其活性片段的檢測探針；引物/探針組11包括包含SEQ ID N0.35或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.36或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID NO.37或其活性片段的檢測探針；引物/探針組12包括包含SEQ ID N0.38或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.39或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID NO.40或其活性片段的檢測探針；引物/探針組13包括包含SEQ ID NO.41或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.42或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID NO.43或其活性片段的檢測探針；引物/探針組14包括包含SEQ ID N0.44或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.45或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID N0.46或其活性片段的檢測探針；引物/探針組15包括包含SEQ ID NO.47或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.48或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID N0.49或其活性片段的檢測探針；引物/探針組16包括包含SEQ ID NO.50或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.51或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID N0.52或其活性片段的檢測探針。
18. 權利要求17的試劑盒，其中至少一個檢測探針包含檢測標記。
19. 權利要求18的試劑盒，其中所述檢測標記直接附著于至少一 個檢測探針上。
20. 權利要求18的試劑盒，其中所述的檢測標記間接附著于至少 一個檢測探針上。
21. 權利要求18的試劑盒，其中所述的檢測標記是可直接檢測的。
22. 權利要求18的試劑盒，其中所述的檢測標記是可間接檢測的。
23. 權利要求18的試劑盒，其中所述的檢測標記包括附著于至少 一個檢測探針的5'末端的熒光元件。
24. 權利要求23的試劑盒，其中所述的至少一個檢測探針進一步 包含附著于其3'末端的猝滅劑元件。
25. 權利要求24的試劑盒，其中所述的焚光元件包括6-羧基熒光 素，猝滅劑元件包括黑洞猝滅劑。
26. 用于檢測試驗樣品中淋病奈瑟氏球菌的方法，該方法包括下 列步驟提供懷疑含有淋病奈瑟氏球菌核酸的試驗樣品；將試驗樣品與至少 一種分離的寡核苷酸接觸，使得至少 一種寡核 苷酸能與淋病奈瑟氏球菌核酸(如果試驗樣品中存在的話)雜交；和檢測與淋病奈瑟氏球菌核酸雜交的任何寡核苷酸，其中檢測到與 淋病奈瑟氏球菌核酸雜交的寡核苷酸表明試驗樣品中存在淋病奈瑟 氏球菌,其中，分離的寡核苷酸包括選自SEQIDN0.1-52的核酸序列，其 活性片段，及其組合。
27. 用于4企測試-驗樣品中'淋病奈瑟氏J求菌的方法，該方法包括下 列步驟提供懷疑含有淋病奈瑟氏球菌核酸的試驗樣品；在可擴增全部或部分淋病奈瑟氏球菌核酸(如果試驗樣品中存在 的話)的條件下，將試驗樣品與至少一種引物組接觸，產(chǎn)生淋病奈瑟 氏球菌擴增子；和檢測任何淋病奈瑟氏球菌擴增子，其中檢測到淋病奈瑟氏球菌擴 增子表明試驗樣品中存在淋病奈瑟氏球菌，其中，至少一種引物組選自引物組1、引物組2、引物組3、引物 組4、引物組5、引物組6、引物組7、引物組8、引物組9、引物組 10、引物組ll、引物組12、引物組13、引物組14、引物組15和引 物組16，其中引物組1包括包含SEQ ID NO.1或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID N0.2或其任何活性片段的反向引物；引物組2包括包含SEQ IDN0.5或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID NO.6或其任何活性片段的反向引物；引物組3包括包含SEQ ID N0.8或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID N0.9或其任何活性片,炎的反向引物；和包含SEQ ID NO.13或其任何活性片段的反向引物；引物組5包括包含SEQ ID N0.15或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID N0.16或其任何活性片段的反向引物；引物組6包括包含SEQ ID NO. 19或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID NO.20或其任何活性片段的反向引物；引物組7包括包含SEQ ID N0.22或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID NO.23或其任何活性片段的反向引物；引物組8包括包含SEQ ID N0.25或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID N0.26或其任何活性片段的反向引物；引物組9包括包含SEQ ID N0.29或其任何活性片段的正向引物， 和包含SEQ ID NO.30或其任何活性片段的反向引物；引物組10包括包含SEQ ID N0.32或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQ ID NO.3 3或其任何活性片段的反向引物；引物組11包括包含SEQ ID N0.35或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQ ID N0.36或其任何活性片段的反向引物；引物組12包括包含SEQ ID N0.38或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQ ID N0.39或其任何活性片段的反向引物；引物組13包括包含SEQ ID N0.41或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQ ID NO.42或其任何活性片段的反向引物；引物組14包括包含SEQ ID N0.44或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQ IDN0.45或其任何活性片段的反向引物；引物組15包括包含SEQ ID N0.47或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQIDN0.48或其任何活性片段的反向引物；和引物組16包括包含SEQ ID NO.50或其任何活性片段的正向引 物，和包含SEQIDN0.51或其任何活性片,更的反向引物。
28.用于檢測試驗樣品中淋病奈瑟氏球菌的方法，該方法包括下 列步驟提供懷疑含有淋病奈瑟氏球菌核酸的試驗樣品；在可擴增全部或部分淋病奈瑟氏球菌核酸(如果試驗樣品中存在 的話)的條件下，將試驗樣品與至少一種引物/探針組接觸，產(chǎn)生淋病 奈瑟氏球菌擴增子；和檢觀'J任何淋病奈瑟氏球菌擴增子，其中檢測到淋病奈瑟氏球菌擴 增子表明試驗樣品中存在淋病奈瑟氏球菌，其中，至少一種引物/探針組選自引物/探針組1、引物/探針組2、 引物/探針組3、引物/探針組4、引物/探針組5、引物/探針組6、引物 /探針組7、引物/探針組8、引物/探針組9、引物/探針組10、引物/探 針組11、引物/探針組12、引物/探針組13、引物/探針組14、引物/ 探針組15和引物/探針組16,其中引物/探針組1包括包含SEQIDNO.l或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.2或其活性片段的反向引物，包含SEQ ID N0.3或其 活性片段的互補檢測探針；以及包含SEQ ID N0.4或其活性片段的反 向互補檢測探針；引物/探針組2包括包含SEQ IDN0.5或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.6或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID NO.7 或其活性片段的互補檢測探針；引物/探針組3包括包含SEQIDN0.8或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.9或其活性片段的反向引物，包含SEQ ID NO.10或 其活性片段的互補檢測探針；以及包含SEQ ID NO.ll或其活性片段 的反向互補檢測探針；引物/探針組4包括包含S E Q ID N 0.12或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID NO.13或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID N0.14或其活性片段的互補檢測探針；引物/探針組5包括包含S E Q ID N 0.15或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.16或其活性片段的反向引物，包含SEQ ID N0.17或 其活性片段的互補檢測探針；以及包含SEQ ID NO,18或其活性片段 的反向互補檢測探針；引物/探針組6包括包含SEQ ID NO. 19或其活性片段的正向引物，包含SEQ ID NO.20或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID N0.21或其活性片段的互補檢測探針；虧1物/探針組7包括包含SEQ ID NO.22或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID N0.23或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID N0.24或其活性片段的互補檢測探針；包含SEQ I N0.26或其活性片段的反向引;勿，、包含SEQ ID N^).27或 其活性片段的互補檢測探針；以及包含SEQ ID N0.28或其活性片段 的反向互補檢測探針；引物/探針組9包括包含SEQ ID N0.29或其活性片段的正向引物， 包含SEQ ID NO.30或其活性片段的反向引物，以及包含SEQ ID N0.31或其活性片段的互補檢測探針；引物/探針組10包括包含SEQ ID N0.32或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.33或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID N0.34或其活性片段的檢測探針；引物/探針組11包括包含SEQ ID N0.35或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.36或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID NO.37或其活性片段的檢測探針；引物/探針組12包括包含SEQ ID NO.38或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.39或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID NO.40或其活性片段的檢測探針； 引物/探針組13包括包含SEQ ID NO.41或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.42或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID N0.43或其活性片段的檢測探針；引物/探針組14包括包含SEQ ID N0.44或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.45或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID N0.46或其活性片段的檢測探針；引物/探針組15包括包含SEQ ID N0.47或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.48或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID NO.49或其活性片段的互測探針；引物/探針組16包括包含SEQ ID NO.50或其活性片段的正向引 物，包含SEQIDN0.51或其活性片段的反向引物，以及包含SEQID12N0.52或其活性片段的檢測探針。
29. 權利要求27或28的方法，其中在可擴增全部或部分淋病奈 瑟氏球菌核酸的條件下接觸試驗樣品包括，使試驗樣品參與在適當?shù)?擴增條件并存在適當?shù)臄U增反應試劑的條件下進行的核酸擴增反應。
30. 權利要求29的方法，其中使用聚合酶鏈反應(PCR)、逆轉 錄酶PCR，即RT-PCR，或者Taq-ManTM試驗進行擴增反應。
31. 權利要求26、 27或28的方法，其中試驗樣品包括選自尿、 精液、唾液、眼球晶狀體液、淋巴液、子宮頸內(nèi)的、尿道的、直腸的、 陰道的、陰門-陰道的以及鼻咽部的樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及擴增引物和檢測探針的寡核苷酸序列以及它們在選擇性和特異性檢測生物樣品中的淋病奈瑟氏球菌的核酸擴增方法中的用途。本發(fā)明也提供試劑盒形式的用于檢測和診斷淋病感染的寡核苷酸引物組和引物/探針組。本發(fā)明的寡核苷酸引物和探針也可與其它特異性寡核苷酸引物和探針聯(lián)合用于同時檢測淋病奈瑟氏球菌和其它靶生物體，如砂眼衣原體。
文檔編號C12Q1/68GK101490275SQ200780012624
公開日2009年7月22日 申請日期2007年4月6日 優(yōu)先權日2006年4月7日
發(fā)明者C·布什-多諾文, D·舍爾曼, L·庫, Q·孟 申請人:西門子醫(yī)療保健診斷公司