專利名稱：：用醇脫氫酶使光學(xué)活性仲醇外消旋化的方法用醇脫氫酶^f吏光學(xué)活性仲醇外消旋化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種酶催外消旋化光學(xué)活性仲醇的方法?，F(xiàn)有技術(shù)仲醇脫氫酶催化仲醇氧化及對應(yīng)酮還原成醇。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>本發(fā)明涉及一種通過采用至少一種E.C.1.1.1.類醇脫氫酶誘導(dǎo)光學(xué)活性仲醇而使這些醇外消旋化的方法?？捎糜诒景l(fā)明方法中的光學(xué)活性仲醇包括大量含有仲醇基團的結(jié)構(gòu)不同的醇和化合物。具有4-約20個碳原子鏈長的脂族醇適用，該脂族基團可能是支化的或未支化的，單-或多不飽和的或環(huán)狀的或形成環(huán)狀體系的一部分，所述環(huán)狀體系例如為雜環(huán)體系如嗎啉、吡咯、噻吩、吡唑、咪唑、？悉唑、噻唑、吡啶、吡喃、嘧啶、鈦噪、吡嗪、苯并吹喃、吲哚及喹啉。優(yōu)選的脂族醇為2-丁醇、2-戊醇、2-己醇、3-己醇、2-庚醇、3-庚醇、2-辛醇、3-辛醇、2-壬醇及2-癸醇。進一步適用的仲醇為具有芳基-烷基結(jié)構(gòu)的那些，該芳族結(jié)構(gòu)部分可能為同芳香性的或雜芳香性的。優(yōu)選的醇為具有任選取代的苯基、萘基或吡^作為芳族結(jié)構(gòu)部分的那些。特別優(yōu)選的仲醇為任選取代的2-苯乙醇、2-苯丙醇、2-苯丁醇、2-苯戊醇及2-苯己醇。這些醇也可被取代一次或多次，即一個或多個氫原子可凈皮諸如F、a、Br、I、NH2、NHR、NR2、SH、CN、COOH、COOR、CO、CS、CNH、N02的基團取代，其中R可為烷基或烷芳基。適合作為醇脫氫酶的為E，C丄1.1.酶分類的NAD-或NADP-依賴型氧化還原酶，特別是醇脫氫酶，優(yōu)選依靠基因操作方法已從微生物中分離的或已分離的和/或改性的那些。改性可采用所謂的隨機誘變方法或所謂的位點特異性^"變進行。優(yōu)選使用的醇脫氫酶為來自乳桿菌(Lactobacillus)屬微生物，特別是克菲爾乳桿菌(Lactobacilluskefir)的那些以及來自紅球菌(Rhodococcus)屬微生物，特別是紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)的那些。這些醇脫氬酶可由商業(yè)獲得(例如從Fhika)或可從向公眾開放的菌林收藏庫取得并采用已知方法分離。例如克菲爾乳桿菌DSM20587，ATCC35411;紅平紅球菌DSM43066，ATCC25544。在優(yōu)選實施方案中，將多種不同的醇脫氫酶用作醇脫氫酶，優(yōu)選普雷洛格(Prelog)特異性不同的那些，特別優(yōu)選具有普雷洛格特異性的醇脫氫酶和具有反普雷洛格(anti-Prelog)特異性的第二醇脫氫酶。對于普雷洛格特異性的定義，參考文獻KurtFaber，PureAppl,Chem.69，1613-1632，1997，特別是關(guān)于氧化還原反應(yīng)的部分，該文獻特意引入本文供參考。熱力學(xué)研究顯示出采用任何醇脫氫酶都可能進行外消旋化。為了取得最大外消旋化率，外消旋化采用的醇脫氫酶應(yīng)該對于氧化和還原具有最小對映/立體選擇性。因為選擇性尤其是溫度的函數(shù)，所以采用在"正常，，條件下具有選擇性的酶(例如克菲爾乳桿菌醇脫氫酶)同樣可能在高溫進行外消旋化，如果其在這些條件下不會失去活性的話。具有高對映和立體選擇性(E〉200)的醇脫氫酶顯示低的外消旋化活性。在兩種或多種酶體系中，醇脫氫酶體系的選擇性由所用酶的選擇性組成。當(dāng)同時使用'普雷洛格，酶(紅平紅球菌醇脫氫酶)和反'普雷洛格，酶(菲爾乳桿菌醇脫氬酶)時，每一個都有與底物相關(guān)的高對映或立體選擇性但是具有相反的立體優(yōu)選性，體系的總選擇性是1且外消旋化被加速。按照本發(fā)明所采用的具有脫氫酶活性的酶在本發(fā)明方法中可用作游離或固定化酶。本發(fā)明方法有利地在0-95°C，優(yōu)選10-85。C，特別優(yōu)選15-75°C的溫度下進行。本發(fā)明方法中的pH值有利地維持在4-12，優(yōu)選4.5-9,特別優(yōu)選5-8。本發(fā)明方法可在額外溶劑中進行或在本身作為溶劑的底物中進行，視底物而定。適合的溶劑為所有允許i^氧化還原反應(yīng)的慣用有機溶劑，特別是醇類、酮類、醚類、烴類或這些物質(zhì)的混合物。選擇的溶劑有利地允許外消旋仲醇易于去除。光學(xué)活性醇在本發(fā)明方法中是指顯示出對映體富集的對映體。該方法優(yōu)選使用的對映體純度至少為70%ee，優(yōu)選最小80%ee,特別優(yōu)選最小90%ee，非常特別優(yōu)選最小98%ee。與起始醇(底物)相比，光學(xué)活性醇的外消旋化在這里意味著對映體純度的減少，特別是對映體純度減少了10%、20%、25%及30%。外消旋化不應(yīng)理解為指對映體之比必須達到50:50，但該完全外消旋化代表了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。所用輔助因素(NAD/NADH或NADP/NADPH)的量對外消旋化并不重要，只要確保每摩爾酶存在至少l摩爾的NAD+或NADP,以確保酶-輔助因素復(fù)合體的完全形成。作為中間體形成的酮的濃度由所用NAD+/NADH比率和醇/酮氧化還原電勢控制。本發(fā)明方法也可有利地與輔助因素再生系統(tǒng)結(jié)合。本發(fā)明方法可連續(xù)和分批操作。試驗部分所用醇(底物)編號名稱結(jié)構(gòu)12-辛醇OH22-庚醇OH32-壬醇H;jCCgH11OH<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>b:反應(yīng)48小時后的e，e,值雙酶體系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>a:正負e.e.值與各(S)和(R)對映體的過量有關(guān)b:反應(yīng)48小時后的e.e,值分析氣相色鐠分析氣相色鐠儀Variant3900氣相色語儀(FID)柱ChrompackChirasil-DEXCB(25mx0.32mmx0.25/mi，1.0巴H2)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>:。C/保留時間[minl/加熱速率[。C/minl/。C/保留時間/加熱速率/。C/保留時間[minb:正負e.e.值與各(S)和(R)對映體的過量有關(guān)n.d.:不可測醇的乙?；?通常方法)通過加入100/*1乙酸酐/DMAP溶液并在30。C/130rpm條件下誘導(dǎo)60分鐘進行衍生化。加入0,5ml水。取出有機相并用疏酸鈉干燥。權(quán)利要求1.一種通過采用至少一種E.C.1.1.1.類醇脫氫酶誘導(dǎo)光學(xué)活性仲醇而使這些醇外消旋化的方法。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中微生物醇脫氫酶用作醇脫氬酶。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中來自乳桿菌(LactobadHus)屬或紅球菌(Rhodococcus)屬微生物的醇脫氫酶用作醇脫氫酶。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其中兩種醇脫氫酶的混合物用作醇脫氫酵。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中一種醇脫氫酶具有普雷洛格特異性，另一種醇脫氫酶具有反普雷洛格特異性。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述誘導(dǎo)在不存在有機溶劑下或者在MTBE、曱苯、己烷或類似有機溶劑存在下進行。全文摘要通過采用至少一類E.C.1.1.1.醇脫氫酶誘導(dǎo)光學(xué)活性仲醇而使這些醇外消旋化的方法。文檔編號C12P7/02GK101426921SQ200780013890公開日2009年5月6日申請日期2007年4月19日優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日發(fā)明者C·格魯伯爾,K·費伯,R·施蒂默爾,W·克魯提爾申請人:巴斯夫歐洲公司