專利名稱：：通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)探測(cè)和同時(shí)進(jìn)行多重量化病原體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：從其本質(zhì)上講，這項(xiàng)新的發(fā)明是一項(xiàng)用來(lái)對(duì)于病原體進(jìn)行多量化實(shí)時(shí)檢測(cè)、鑒定的新技術(shù)。特別值得一提的是，本項(xiàng)發(fā)明提供的這種技術(shù)通過(guò)使用多聚酶鏈實(shí)時(shí)反應(yīng)，進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)展增殖，可以對(duì)所有病原體進(jìn)行多量化實(shí)時(shí)檢測(cè)鑒定，比如李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌、大腸桿菌0157:H7，以及可以檢測(cè)出這四種病原體在樣品中組合出現(xiàn)的情況。
背景技術(shù)：
：實(shí)際上，針對(duì)這些容易通過(guò)飲食傳播的這些病原體，(比如說(shuō)李斯特菌，金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌0157:H7)的檢測(cè)，是醫(yī)學(xué)界和公共衛(wèi)生學(xué)界長(zhǎng)期以來(lái)的一項(xiàng)重大任務(wù)。不但如此，農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)的原材料以及初級(jí)產(chǎn)品的生產(chǎn)商、經(jīng)銷商對(duì)于這些病原體的檢測(cè)也非常關(guān)注，同樣顯示出濃厚的興趣。基于這個(gè)原因，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多對(duì)于這些病原體進(jìn)行檢測(cè)和鑒定的技術(shù)。目前在使用的諸多檢測(cè)這些病原體的技術(shù)中，比較有效的一種方法是以分子技術(shù)為基礎(chǔ)的。這種技術(shù)使用多聚酶鏈反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)，這項(xiàng)技術(shù)就是目前為人們所熟知的PCR技術(shù)。特別是在對(duì)于很多送檢驗(yàn)樣品的檢測(cè)和鑒定中，這項(xiàng)技術(shù)是被認(rèn)為是一種可以以最快的速度并且最靈敏的精度的檢測(cè)出病原體核酸的技術(shù)。我們可以在凱瑞-比-慕伊斯的在美國(guó)專利部門申請(qǐng)的一系列專利美國(guó)專利-4683195，美國(guó)專利-4683202，美國(guó)專利-4800159,美國(guó)專利-4889818,美國(guó)專利-4965188,美國(guó)專利-5008182,美國(guó)專利-5038852,美國(guó)專利-5079352,美國(guó)專利-5176995,美國(guó)專利-5310652,美國(guó)專利-5310893,美國(guó)專利-5322770,美國(guó)專利-5333675,美8國(guó)專利-5352600,美國(guó)專利-5374553,美國(guó)專利-5386022,美國(guó)專利-5405774,美國(guó)專利-5407800,美國(guó)專利-5418149,美國(guó)專利-5420029中找到對(duì)于這項(xiàng)技術(shù)的這些描述。為了利用PCR技術(shù)針對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)，就必須在在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核普酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶來(lái)進(jìn)行酶促合成反應(yīng)。在這個(gè)反應(yīng)中，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)合成，通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3'-OH末端，并以此為起始點(diǎn)，沿模板5'—3'方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。這就是PCR技術(shù)的基本才支術(shù)流程。由于使用PCR技術(shù)可以迅速而敏銳地在樣品中才企測(cè)出病原體個(gè)體的存在，同時(shí)使用這種4支術(shù)也可以才全測(cè)出樣品中大量病原體的具體數(shù)量。但是毫無(wú)疑問(wèn)，使用PCR技術(shù)來(lái)同時(shí)對(duì)于同一份樣品中存在的多種病原體進(jìn)行檢測(cè)仍然有很大的疑惑和困難。因?yàn)槔肞CR技術(shù)同時(shí)進(jìn)行一份樣品中多種病原體的檢測(cè)的障礙在于，由于使用了多種核苷酸序列，除了出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果需要的反應(yīng)外，還會(huì)出現(xiàn)其他多個(gè)交叉的反應(yīng)，從而影響檢測(cè)的結(jié)果精度。利用PCR技術(shù)，對(duì)于樣品中存在的病原體進(jìn)行檢測(cè)和鑒定的相關(guān)敘述可以在下列的文件中找到約|#-維-司4敎卡的WO-0314704號(hào)國(guó)際專利申請(qǐng)，以及林曉沃等在美國(guó)的一系列專利美國(guó)專利-5612473,美國(guó)專利-5738995,美國(guó)專利-5753444,美國(guó)專利-5756701和美國(guó)專利-5846783.根據(jù)已經(jīng)公布的WO-0314704號(hào)國(guó)際專利申請(qǐng)中所做的相關(guān)技術(shù)流程敘述，這份專利申請(qǐng)涉及到了一種比較獨(dú)特的技術(shù)方法。通過(guò)這種技術(shù)方法，可以在一份樣品同時(shí)檢測(cè)出不同的彎曲桿菌屬的多種細(xì)菌。包括空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌在內(nèi)都可以^皮檢測(cè)出來(lái)。送^r的這些樣品可以是食物的樣品，也可以是水樣品，或者是一系列從送檢樣品的表層再次提取的樣品。這種方法使用擴(kuò)展的PCR技術(shù)，并對(duì)寡核核苷酸的氣勢(shì)序列部分進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?。大量不同種類的病原體可以在同一次反應(yīng)中被檢測(cè)出來(lái)。在其它的一系列美國(guó)專利中美國(guó)專利-5612473,美國(guó)專利-5738995,美國(guó)專利-5753444,美國(guó)專利-5756701，美國(guó)專利-5846783描述了另外一種技術(shù)。通過(guò)這種技術(shù)，可以在同一份樣品中通過(guò)一次反應(yīng)，迅速的檢測(cè)出多種易傳染的病原體。這些可以被檢測(cè)出的易傳染的病原體包括沙門氏菌，痢疾桿菌，彎曲桿菌，大腸埃希氏菌和耶爾森氏菌以及大腸桿菌0157:H7.上述的這些專利中所敘述的這種技術(shù)的缺陷和限制在于，在寡核核苷酸和其他的核酸序列的擴(kuò)展增殖過(guò)程中，允許寡核核苷酸和探針發(fā)生最少的交叉反應(yīng)。在現(xiàn)在已經(jīng)得到使用的，所有的這些分子技術(shù)中，有的技術(shù)已經(jīng)在檢測(cè)食品樣品中的病原體方面得到了商業(yè)化的應(yīng)用。有的技術(shù)通過(guò)DNA(基因單向追蹤技術(shù))，也可以得到非常靈敏的結(jié)果，但是整個(gè)過(guò)程要耗費(fèi)將近50個(gè)小時(shí)。有的通過(guò)核酸擴(kuò)展技術(shù)(巴克斯，佛慕斯-杜邦，布諾波利亞，賽諾菲巴斯德診斷)需要24個(gè)小時(shí)。上述的任何一種技術(shù)都不能在送出食品樣品的同一天得出檢測(cè)結(jié)果，也不能得出實(shí)時(shí)的鑒定報(bào)告。在上述的所有技術(shù)中，針對(duì)一些特定的病原體進(jìn)行檢測(cè)，需要增加上述技術(shù)的靈敏度，以便得出迅速和可靠的檢測(cè)結(jié)果。由于食品中存在的病原體會(huì)對(duì)消費(fèi)者的身體健康構(gòu)成威脅，為了界定食品中病原體的數(shù)量和濃度，所以在有的檢測(cè)中需要對(duì)于樣品中的病原體進(jìn)行多量化的檢測(cè)。根據(jù)以上的這些敘述可以看出，無(wú)論是從食品工業(yè)的角度出發(fā)，還是從人類食品健康安全的角度出發(fā)，擁有一種可以在五個(gè)小時(shí)以內(nèi)，并且快速的檢測(cè)出樣品中是否存在病原體的技術(shù)是非常重要的。可以檢測(cè)出的病原體，應(yīng)該包括最重要的四種容易通過(guò)飲食或是公共場(chǎng)所傳播的病原體，比如說(shuō)李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H。這種實(shí)時(shí)的多量化檢測(cè)技術(shù)是通過(guò)對(duì)于多聚酶鏈反應(yīng)來(lái)進(jìn)行大量擴(kuò)展應(yīng)用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這種技術(shù)擁有檢測(cè)成本低，耗時(shí)短，由于食品工業(yè)對(duì)于食品生產(chǎn)時(shí)間段有著嚴(yán)格的要求，因此這項(xiàng)技術(shù)對(duì)于食品工業(yè)也有著極其關(guān)鍵的意義和價(jià)值。發(fā)明概述上面已經(jīng)提到了多項(xiàng)技術(shù)，但是都存在著不足之處，為了找到改善上述技術(shù)的不足的方法，本發(fā)明提供了一種可以在同一份樣品或是多份混合樣品中，通過(guò)多聚酶鏈的反應(yīng)多量化實(shí)時(shí)檢測(cè)病原體的技術(shù)?？梢詸z測(cè)出的這些病原體包括最重要的李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H。本技術(shù)的整個(gè)流程是這樣的1,提取出樣本和測(cè)試樣本中的出現(xiàn)的DNA。2,準(zhǔn)備需要多量化檢測(cè)的多種病原體的特殊反應(yīng)，也包括為了提取和識(shí)別病原體的而進(jìn)行量化檢測(cè)而對(duì)DNA擴(kuò)展酶進(jìn)行激活。3，DNA擴(kuò)展，通過(guò)使用PCR技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)展從而獲得不同的病原體所獨(dú)有的不同特殊反應(yīng)。4，實(shí)時(shí)的檢測(cè)出送檢樣品中是否有病原體的存在。5，為了提耳又和識(shí)別病原體的量化檢測(cè)，利用DNA擴(kuò)展酶進(jìn)行進(jìn)行混合反應(yīng)，來(lái)鑒定李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H在樣品中存在的任何組合形式。(而這一步驟又包括如下的部分a,需要準(zhǔn)備將要鑒定的寡核核苷酸的起始部分，標(biāo)記為序列編號(hào)1和序列編號(hào)2以及序列編號(hào)3的探針，這個(gè)纟笨針是第一個(gè)目標(biāo)核酸比如說(shuō)李斯特菌核酸的起始序列進(jìn)行反應(yīng)的。b,需要準(zhǔn)備將要鑒定的寡核核苷酸的第二部分部分，標(biāo)記為序列編號(hào)4和序列編號(hào)5以及序列編號(hào)6的探針，這個(gè)探針是和第二個(gè)目標(biāo)核酸金黃色葡萄球菌核酸進(jìn)行反應(yīng)的。C,需要準(zhǔn)備將要鑒定的寡核核苷酸的第三部分部分，標(biāo)記為序列編號(hào)7和序列編號(hào)8以及序列編號(hào)9的探針，這個(gè)探針是和第三個(gè)目標(biāo)核酸空腸彎曲菌核酸進(jìn)行反應(yīng)的。d,需要準(zhǔn)備將要鑒定的寡核核苷酸的第四部分部分，標(biāo)記為序列編號(hào)IO和序列編號(hào)11以及序列編號(hào)12的探針，這個(gè)4果針是和第四個(gè)目標(biāo)核酸大腸桿菌0157:H核酸進(jìn)行反應(yīng)的。)6，李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H在送檢樣品中會(huì)有很多組合存在形式。通過(guò)每個(gè)擴(kuò)展產(chǎn)物中的熒光或是放射性特殊標(biāo)示，每一種上述四種病原體的組合存在形式在送檢樣品中是否存在，就可以一皮4企測(cè)出來(lái)。我們的這項(xiàng)技術(shù)的另外一個(gè)目的是，可以提供這樣一種寡核核苷酸，它包含由順序編號(hào)1,序列編號(hào)2和序列編號(hào)3所形成的核苷酸序列，而這個(gè)核苷酸序列已經(jīng)被選定而且得到識(shí)別。li我們的技術(shù)的目的之一是可以提供這樣一種寡核核苷酸，它包含由順序編號(hào)4,序列編號(hào)5和NO的序列編號(hào)6所形成的核苷酸序列，而這個(gè)核苷酸序列也已經(jīng)凈皮選定而且得到識(shí)別。我們的技術(shù)的目的之一是可以提供這樣一種寡核核苷酸，它包含由順序編號(hào)7，序列編號(hào)8和NO的序列編號(hào)9所形成的核苷酸序列，而這個(gè)核苷酸序列也已經(jīng)被選定而且得到識(shí)別。我們的技術(shù)的目的之一是可以提供這樣一種寡核核苷酸，它包含由順序編號(hào)10，序列編號(hào)ll和NO的序列編號(hào)12所形成的核苷酸序列，而這個(gè)核苷酸序列也已經(jīng)被選定而且得到識(shí)別。同上述的目標(biāo)聯(lián)系在一起，本技術(shù)也可以提供一個(gè)已經(jīng)被識(shí)別的探針，這個(gè)探針包括序列編號(hào)3的寡核核苷酸，這個(gè)探針至少可以被用作一個(gè)標(biāo)記。本技術(shù)也可以提供另外一個(gè)已經(jīng)被識(shí)別的探針，這個(gè)探針包括序列編號(hào)6的寡核核苷酸，這個(gè)探針至少可以被用作一個(gè)標(biāo)記。本技術(shù)也可以提供另外一個(gè)已經(jīng)被識(shí)別的探針，這個(gè)探針包括序列編號(hào)9的寡核核苷酸，這個(gè)探針至少可以被用作一個(gè)標(biāo)記。本技術(shù)也可以提供另外一個(gè)已經(jīng)被識(shí)別的探針，這個(gè)探針包括序列編號(hào)12的寡核核苷酸，這個(gè)探針至少可以被用作一個(gè)標(biāo)記。最后，我們的這項(xiàng)技術(shù)發(fā)明也可以被用作是對(duì)一個(gè)送檢樣品的檢測(cè)做出最終的檢測(cè)結(jié)果。這項(xiàng)技術(shù)是通過(guò)多聚酶鏈的反應(yīng)，多量化實(shí)時(shí)檢測(cè)出李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H,以及這四種病原體在一份或是多份送檢樣品中的每一種組合存在形式。檢測(cè)結(jié)果包括1，根據(jù)已經(jīng)被識(shí)別的由順序編號(hào)1，序列編號(hào)2和序列編號(hào)3所形成的核苷酸序列，由順序編號(hào)4,序列編號(hào)5和NO的序列編號(hào)6所形成的核苷酸序列，順序編號(hào)7,序列編號(hào)8和NO的序列編號(hào)9所形成的核苷酸序列，來(lái)檢測(cè)一種或多種寡核核香酸的存在。2,根據(jù)已被識(shí)別的序列編號(hào)3所形成的核苷酸序列，序列編號(hào)6所形成的核苷酸序列，序列編號(hào)9所形成的核普酸序列，序列編號(hào)12所形成的核苷酸序列，來(lái)檢測(cè)擁有以上序列的寡核核苷酸所形成的探針。3，為了進(jìn)行;險(xiǎn)測(cè)，所需的其他成分和試劑。關(guān)于本技術(shù)發(fā)明的一些詳細(xì)特征，將在下面的段落里進(jìn)行詳細(xì)的闡述。而且還有一些圖像作為佐證一并呈現(xiàn)出來(lái)。拿出這些圖像的目的是為了給本項(xiàng)發(fā)明做出一個(gè)清晰地界定，但是這些圖像的作用并不局限于此。圖像一展示了一條根據(jù)本項(xiàng)技術(shù)得出的，擁有刻度并且可以用于測(cè)算李斯特菌的曲線。在這張圖像上，Al是一個(gè)高濃度條件下得出的可供參考的曲線，A4是在一個(gè)低濃度條件下得出的可供參考的曲線。而為了更好地了解UFC/ml,在對(duì)一個(gè)樣品的數(shù)據(jù)圖像閱讀的時(shí)候，插入了其它可供參考樣品的數(shù)據(jù)圖像。圖像二展示了一條根據(jù)本項(xiàng)技術(shù)得出的、擁有刻度并且可以用于測(cè)算金黃色葡萄球菌的曲線。在這張圖像上，Al是一個(gè)高濃度條件下得出的可供參考的結(jié)果，A4是在一個(gè)低濃度條件得出的下可供參考的結(jié)果。而為了更好的了解UFC/ml，在對(duì)一個(gè)樣品的數(shù)據(jù)圖的閱讀的時(shí)候，插入了其它可供參考樣品的數(shù)據(jù)圖像。圖像三展示了一條根據(jù)本項(xiàng)技術(shù)得出的、擁有刻度并且可以用于測(cè)算空腸彎曲菌的曲線。在這張圖像上，Al是在一個(gè)高濃度條件下得出的可供參考的結(jié)果，A2是在一個(gè)低濃度條件下得出的可供參考的結(jié)果。而為了更好的了解UFC/ml，在對(duì)一個(gè)樣品的數(shù)據(jù)圖像閱讀的時(shí)候，插入了其它可供參考樣品的數(shù)據(jù)圖像。圖像四展示了一條根據(jù)本項(xiàng)技術(shù)得出的、擁有刻度并且可以用于測(cè)算大腸桿菌0157:H7的曲線。在這張圖像上，Al是在一個(gè)高濃度條件下得出的可供參考的結(jié)果，A3是在一個(gè)低濃度條件下得出的可供參考的結(jié)果。而為了更好的了解UFC/ml，在對(duì)一個(gè)樣品的數(shù)據(jù)圖像閱讀的時(shí)候，插入了其它可供參考樣品的數(shù)據(jù)圖像。發(fā)明詳述DNA擴(kuò)展酶應(yīng)用這個(gè)術(shù)語(yǔ)，正如在本文現(xiàn)在的描述中所使用的一樣，這個(gè)術(shù)語(yǔ)指的是通過(guò)利用多聚酶鏈的反應(yīng)(PCR),在很多混合的DNA的序列中，對(duì)某一個(gè)DNA中的特定序列進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。而這個(gè)DNA的特定序列就是我們所說(shuō)的目標(biāo)序列，被大規(guī)模的擴(kuò)展放大。起始部分這個(gè)術(shù)語(yǔ)，僅僅是局限的指寡核核苦酸的起始序列部分。而寡核核苷酸的這部分起始序列正是和目標(biāo)序列互補(bǔ)連接的。寡核核苷酸的起始序列里包括了一個(gè)上游序列，而這個(gè)上游序列里的核酸和目標(biāo)序列里的上游序列形成互補(bǔ)連接。而寡核核苷酸的起始序列也包括了一個(gè)下游序列，這個(gè)下游序列里的核酸也和目標(biāo)序列里的下游序列形成了互補(bǔ)連接。大量擴(kuò)增反應(yīng)這個(gè)術(shù)語(yǔ)的的意思，正如在本文現(xiàn)在的描述中所使用的一樣，是一種基于PCR技術(shù)而進(jìn)行的擴(kuò)增過(guò)程。這個(gè)擴(kuò)增過(guò)程是對(duì)于某個(gè)特定的送檢樣品中的許多目標(biāo)DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。在本項(xiàng)新的技術(shù)發(fā)明中，通過(guò)利用PCR技術(shù)，利用多聚酶鏈的反應(yīng)，多量化可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)才企測(cè)到四種病原體。同其他的技術(shù)相比，本項(xiàng)4支術(shù)不需要對(duì)于要檢測(cè)的病原體預(yù)先進(jìn)行增殖培養(yǎng)，也不需要為每個(gè)要檢測(cè)的病原體準(zhǔn)備許多具有它們各自特殊反應(yīng)的試管。需要特別強(qiáng)調(diào)的是，本項(xiàng)技術(shù)發(fā)明在實(shí)時(shí)檢測(cè)四種病原體方面實(shí)現(xiàn)了巨大的突破，遠(yuǎn)遠(yuǎn)的超越了其他技術(shù)，而且大大的節(jié)省了化驗(yàn)分析的時(shí)間，最短只需2.5個(gè)小時(shí)，就可得出檢測(cè)結(jié)果。本技術(shù)只需要一份混合的特殊反應(yīng)試劑，而不像其他技術(shù)，需要很多份這樣的試劑。除了使用本技術(shù)檢測(cè)的靈敏度非常高以外，對(duì)于樣品的準(zhǔn)備(已經(jīng)包括在2.5個(gè)小時(shí)以內(nèi))也有助于獲得更好地檢測(cè)結(jié)果，因?yàn)椴淮嬖谀切┛赡軐?duì)擴(kuò)展過(guò)程產(chǎn)生不利影響的因素，這些因素已經(jīng)被消除。本項(xiàng)技術(shù)發(fā)明提供的這種方法，能夠?qū)τ谶@些容易通過(guò)飲食傳播和公共場(chǎng)所環(huán)境傳播的這些病原體(比如說(shuō)李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌以及大腸桿菌0157:H7),在一份或是多份送檢的食物樣品，水樣品或是其他樣品中，通過(guò)利用多聚酶鏈的反應(yīng)進(jìn)行大規(guī)模的擴(kuò)展增殖，從而對(duì)送檢樣品進(jìn)行多量化實(shí)時(shí)檢測(cè)和鑒定。送檢的樣品可以是任何類型的樣品，只要想知道這份樣品是否被上述四種病原體所污染，就可以進(jìn)行檢測(cè)。在特定的情況下，我們所提到的樣品一般是指食物樣品，比如說(shuō)，肉制品和乳制品，或是表層材料和收到污染的環(huán)境空氣材料。寡核核香酸序列的模本和信息庫(kù)本項(xiàng)技術(shù)發(fā)明里提到的寡核核香酸，它們被使用的目的是在鑒別一份送檢樣品中，檢測(cè)出李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌以及大腸桿菌0157:H7的特異性存在。免除可能出現(xiàn)的，在一份送檢樣品中還有其他的病原體，測(cè)驗(yàn)結(jié)果被其他病原體的存在而被干擾的情況。首先需要掌握將要進(jìn)行檢測(cè)的四種病原體(李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌以及大腸桿菌0157:H7),每一種病原體的寡核核苷酸起始序列。而這些寡核核香酸起始序列都擁有一個(gè)它們本身所形成的一個(gè)上游序列，而這個(gè)特意強(qiáng)調(diào)出來(lái)的上游序列是和目標(biāo)核酸的5，頂端序列所形成互補(bǔ)鏈接的。而這些起始序列也擁有一個(gè)它們本身所有的下游序列，而這個(gè)特別需要強(qiáng)調(diào)的下游序列是和目標(biāo)核酸的3，頂端序列形成互補(bǔ)鏈接的。這些核酸的序列應(yīng)該擁有所要檢測(cè)的這些病原體所各自擁有的寡核核香酸的起始序列部分。因此，對(duì)于每個(gè)要檢測(cè)的病原體，經(jīng)過(guò)這些過(guò)程，它們所擁有的這些寡核核苷酸都已經(jīng)在測(cè)驗(yàn)中形成了一條新的合成鏈接。合成的這些寡核核苷酸詳細(xì)的見于圖表1:識(shí)別類型類型病原體種類核香酸序列序列編號(hào)1"上游"起始序列F#膽#CTTGACATCCTTTGACCACTCTG序列編號(hào)2"下游"起始序列RGACTTAACCCAACATCTCACGAC序列編號(hào)P試驗(yàn)，麟謬AGCTGACGACAACCATGCACCACC序列編號(hào)4"上游"起始序列FAACAAAACAGACCATCTTTAAGCG序列編號(hào)6P試驗(yàn)會(huì)#惑葡萄諒^"ACTCAACCGACGACACCGAACCCT序列編號(hào)"上游"起始序列FGCAGCAGTAGGGAATATTGCG15<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>圖表l在本技術(shù)發(fā)明中所推薦使用的是序列編號(hào)3,序列編號(hào)6,序列編號(hào):9，序列編號(hào)12的序列，它們是被用作檢測(cè)探針。它們的5'序列頂端被做了熒光處理，或是被一種可以放射能量的染料做處理。它們的3，序捕獲列頂端被去掉了熒光，或是#皮一種可以捕獲焚光放出的能量的染料處理。為了檢測(cè)和鑒定出李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌以及大腸桿菌0157:H7，這些具有熒光的和沒(méi)有熒光的序列是^t用作標(biāo)記，他們之間是沒(méi)有交叉反應(yīng)的。而其他的組成部分，在表2里都清楚的顯示了出來(lái)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>圖表2一份或多份送檢樣品中DNA材料的準(zhǔn)備為了按照本項(xiàng)技術(shù)發(fā)明創(chuàng)造的方法進(jìn)行檢測(cè)，需要按照如下的步驟對(duì)于送4企樣品進(jìn)行進(jìn)行準(zhǔn)備首先取一段待檢測(cè)的樣品，食物樣品或是其它的樣品，隨后把待檢樣品浸入鹽水溶液中，讓樣品懸浮其中。隨后將對(duì)于樣品進(jìn)行離心處理，從而獲得第一層的沉積物。不過(guò)為了后續(xù)的步驟，要除去這層沉積物里所帶的溶液里的水分。在得到送纟企樣品的沉積物之后，用溶菌酶對(duì)于這些沉積物中進(jìn)行處理，從而破壞沉積物中的細(xì)胞的細(xì)胞壁，在隨后的步驟里，用蛋白酶K來(lái)對(duì)加過(guò)溶菌酶的沉積物進(jìn)行處理，從而使蛋白質(zhì)成分完全水解成氨基酸，包括前一步使用的溶菌酶也會(huì)被蛋白酶水解掉。在除去蛋白質(zhì)成分和其他脂溶性化合物之后，應(yīng)該通過(guò)氯仿-酒精-苯酚處理的溶劑進(jìn)行處理。在取出來(lái)經(jīng)過(guò)處理的樣品之后，就立即的噴灑乙醇溶液。然后加入乙醇溶液迅速攪拌，隨后需要的DNA就從溶液中析出，而這樣得出大量的DNA應(yīng)該做靜置處理。最后，把得到的大量DNA在大約65攝氏度的溫度條件下進(jìn)行加熱處理，使在樣品中得到的這些DNA能夠迅速的溶解。在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的有關(guān)聯(lián)的因素，都被相關(guān)的試驗(yàn)所反復(fù)證實(shí)。比如加入試劑的數(shù)量，自旋孵化的時(shí)間，反復(fù)洗滌，這次因素都被反復(fù)試驗(yàn)，直到找到一個(gè)最好的條件。在準(zhǔn)備樣品的整個(gè)過(guò)程中，應(yīng)該考慮到這樣的一個(gè)要求所有的試劑和樣品在整個(gè)過(guò)程中必須在冷卻的條件下存放。下面的部分將敘述準(zhǔn)備一份或是多份樣品的示例步驟示例一在一份或是多份肉類制品或奶酪制品待檢樣品中提取所需DNA的全部過(guò)禾呈1.在一個(gè)容積是50ml的無(wú)菌的錐形管內(nèi)放置25g的待檢測(cè)食物樣品，同時(shí)加入40ml的無(wú)菌生理鹽水，鹽水的溫度保持在室溫條件下。2.把試管垂直放置10分鐘，以便使試管里的樣品充分沉淀3.處理樣品，用離心機(jī)以每分鐘3500轉(zhuǎn)速(min-1)離心處理樣品15分鐘，并且小心的取出上層清液，不要^s並到下面的沉積物。4.左右搖晃震蕩沉積物10秒鐘5.把全部的沉積物轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積為2ml的無(wú)菌試管內(nèi)，用lml的無(wú)菌生理鹽水沖洗錐形試管，并把沖洗后的液體與沉積物合并在同一個(gè)無(wú)菌試管內(nèi)。6.以每分鐘14000轉(zhuǎn)(14000min")的速度，離心處理8分鐘。7.用自動(dòng)吸量管吸取所有的上層清液。8.添加100pl，100mmol的Tris-HCl溶液，和30pg，pH=8的溶菌酶，震蕩混合10秒鐘。9.在37攝氏度的水溫中，水浴加熱30分鐘。10.添加100pl的TEIX溶液，和1%SDS溶液，以及3fd的K蛋白酶(20mg/ml)。11.混合均勻，并且在55攝氏度的水溫條件下，水浴加熱30分鐘。12.添加500^1苯酚-氯仿-酒精異戊溶液(配置比例為24:24:1)，再加入100TEIX，并且倒置震蕩5分鐘。13.以13500轉(zhuǎn)每分鐘的速度(min")離心處理8分鐘，并且從末層向另外的一個(gè)試管轉(zhuǎn)移250^。14.添加582.5(il的無(wú)水乙醇，并且在冰箱里冷藏j呆存10分鐘。15.以13500轉(zhuǎn)每分鐘的速度進(jìn)行離心處理，時(shí)間是8分鐘。16.進(jìn)行澄清和干燥處理。H.再次加入25^11的TE1X,確保底部的DNA也溶解掉。18.加熱15分鐘，溫度為65攝氏度。19.在室溫下靜置處理三十分鐘。示例二從空氣樣品和待檢物質(zhì)表層樣品中提取所需DNA的全部步驟。1.用一塊20cmx20cm無(wú)菌紗布在待檢測(cè)的樣品表面擦過(guò)，以便完成測(cè)-險(xiǎn)的取樣過(guò)程。2.在無(wú)菌亞里積壓這塊紗布，-使里面的液體流出。4巴流出的液體倒入一個(gè)50ml的無(wú)菌錐形試管里，并且加入40ml的無(wú)菌生理鹽水。3.處理樣品，用離心機(jī)以每分鐘3500轉(zhuǎn)速(min")離心處理樣品15分鐘，并且小心的耳又出上層清液，不要石並到下面的沉積物。4.左右震蕩晃動(dòng)沉積物IO秒鐘5.把全部的沉積物轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積為2ml的無(wú)菌試管內(nèi)，用lml的無(wú)菌生理鹽水沖洗錐形試管，并4巴沖洗后的液體與沉積物合并在同一個(gè)無(wú)菌試管內(nèi)。6.以每分鐘14000轉(zhuǎn)(14000min-1)的速度，離心處理8分鐘。7.用1.5ml的無(wú)菌生理鹽水再清洗兩遍。8.用自動(dòng)吸量管吸取所有的上層清液。9.添加100nl，100mmol的Tris隱HCl溶液，和30pg，pH=8的溶菌酶，震蕩混合]O秒鐘。10.在37:攝氏度的水溫條件下，水浴加熱30分鐘。11.添加100pl的TE1X溶液，和P/oSDS溶液，以及3pl的K蛋白酶(20mg/ml)。12.混合均勻，并且在55攝氏度的水溫條件下，水浴加熱30分鐘。13.添加50(^1苯酚-氯仿-酒精異戊溶液(配置比例為24:24:1)，再加入lOO^lTElX,并且倒置震蕩5分鐘。14以13500轉(zhuǎn)每分鐘的速度(min-1)離心處理8分鐘，并且從末層向另外的一個(gè)試管轉(zhuǎn)移250pl。15.添加582.5的無(wú)水乙醇，并且在冰箱里冷藏保存10分鐘。16.以13500轉(zhuǎn)每分鐘的速度進(jìn)行離心處理，時(shí)間是8分鐘。1917.進(jìn)行澄清和千燥處理。18.再次加入25pl的TEIX，確保底部的DNA也溶解掉。19.加熱15分鐘，溫度為65攝氏度。20.在室溫下靜置處理三十分鐘。混合反應(yīng)的準(zhǔn)備過(guò)程在取得一份或者多份DNA樣本之后，就開始準(zhǔn)備混合反應(yīng)所需要的各種試劑，需要用到的試劑見于表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>圖表3隨后的步驟，開始準(zhǔn)備一個(gè)有100種成分參與的混合反應(yīng)，反應(yīng)所需的試劑見于表格四4:混合反應(yīng)將會(huì)用到的試劑每種反應(yīng)需要添加的試劑的量(jil)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表格4應(yīng)該通過(guò)將試劑倒置震蕩的方法，使試劑混合均勻。并且利用多種方法配置19.75^的溶劑。其中有0.5ml的試劑應(yīng)該在避光的條件下冷藏保存。利用PCR大規(guī)模擴(kuò)展增殖技術(shù)實(shí)時(shí)多量化檢測(cè)鑒定多種病原體本項(xiàng)技術(shù)發(fā)明提供的方法，即使用PCR實(shí)時(shí)大規(guī)模擴(kuò)展增殖技術(shù)，和其它的只對(duì)一種目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)的常規(guī)PCR技術(shù)相比，擁有極其明顯的優(yōu)勢(shì)。利用PCR大規(guī)模擴(kuò)展增殖技術(shù)進(jìn)行反應(yīng)，需要對(duì)于寡核核苷酸的起始序列進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，而對(duì)于和要檢測(cè)的病原體的目標(biāo)序列有特殊反應(yīng)的探針，也同樣要進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。通過(guò)這種方法，在40攝氏度到65攝氏度的這個(gè)溫度區(qū)間，寡核核苷酸的起始序列和探針是可以兼容存在的，也可以在相同的條件下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，最后允許出現(xiàn)雜交或是聯(lián)結(jié)。通過(guò)這種雜交，兩段互補(bǔ)的核酸序列聯(lián)結(jié)在了一起。于此同時(shí)，在整個(gè)擴(kuò)展增殖過(guò)程中，寡核核苷酸的起始序列和探針卻不能夠和其他任何別的的核酸序列，發(fā)生任何類型的交叉反應(yīng)或是聯(lián)結(jié)反應(yīng)。綜上所述，接下來(lái)所有別的寡核核普酸的起始序列，都被用來(lái)和其它的，要檢測(cè)的目標(biāo)病原體的核酸進(jìn)行反應(yīng)。一對(duì)用來(lái)鑒定李斯特菌的寡核核苷酸序列，即所知的序列編號(hào)1和序列編號(hào)2，這組寡核核苦酸會(huì)被用來(lái)和李斯特菌的基因組中的序列進(jìn)行雜交反應(yīng)和聯(lián)結(jié)反應(yīng)。一對(duì)用來(lái)鑒定金黃色葡萄球菌的寡核核苷酸序列，即所知的序列編號(hào)4和序列編號(hào)5，這組寡核核香酸會(huì)被用來(lái)和金黃色葡萄球菌的基因組中的序列進(jìn)行雜交反應(yīng)和聯(lián)結(jié)反應(yīng)。一對(duì)用來(lái)鑒定空腸彎曲菌的寡核核普酸序列，即所知的序列編號(hào)7和序列編號(hào)8，這組寡核核香酸會(huì)被用來(lái)和空腸彎曲菌的基因組中的序列進(jìn)行雜交反應(yīng)和聯(lián)結(jié)反應(yīng)。一對(duì)用來(lái)鑒定大腸桿菌0157:H7的寡核核苷酸序列，即所知的序列編號(hào)7和序列編號(hào)8,這組寡核核苷酸會(huì)被用來(lái)和大腸桿菌0157:H7的基因組中的序列進(jìn)行雜交反應(yīng)和聯(lián)結(jié)反應(yīng)。在利用PCR技術(shù)大規(guī)模實(shí)時(shí)擴(kuò)展增殖技術(shù)中所使用的鑒定探針，即序列編號(hào)3,序列編號(hào)6,序列編號(hào)9，序列編號(hào)12。這些核酸序列是被雙重標(biāo)示的寡核核苷酸。這些寡核核苷酸和經(jīng)過(guò)大規(guī)模擴(kuò)展后的核酸序列——互補(bǔ)對(duì)應(yīng)，形成新的鏈接。每個(gè)探針的在它的5'頂端被熒光，或是能夠放射能量的染料標(biāo)示，而每個(gè)探針的3，頂端都被暗淡的，或是能夠吸收上述染料放出能量的另外一種染料所標(biāo)示。對(duì)于這一點(diǎn)，納撒倫科在他的美國(guó)專利5866336號(hào)里有提及到。他在專利里寫到了能夠轉(zhuǎn)移能量的熒光物質(zhì)，以及在核酸大規(guī)3莫擴(kuò)展技術(shù)里，這種物質(zhì)怎么樣在寡核核香酸里得到應(yīng)用的。在本技術(shù)發(fā)明提供的方法里，使用的熒光物質(zhì)是TET,TxR,Cy5,FAM，而在這個(gè)測(cè)驗(yàn)過(guò)程中使用的吸收能量的物質(zhì)是BHQ-l,BHQ-2yBHQ-3.在檢測(cè)過(guò)程中被用作探針的寡核核苷酸序列(序列編號(hào)3，序列編號(hào)6,序列編號(hào)9，序列編號(hào)12)都根據(jù)上文所提到的表格二中的組合，在它們的3'和5'頂端做了標(biāo)示。在本技術(shù)發(fā)明提供的方法里，用作大規(guī)模擴(kuò)展的DNA樣本是在下列的條件下準(zhǔn)備的乳制品樣品和空氣的送檢樣品:解凍小瓶溶液需用預(yù)先準(zhǔn)備19.75^的混合溶液，并且添加0.25pi的嗜熱DNA聚合酶，4pl的水和1^待檢測(cè)分析的DNA。肉制品和奶酪制品的送檢樣品:解凍小瓶溶液需用預(yù)先準(zhǔn)備19.75pl的混合溶液，0.25nl的嗜熱DNA聚合酶，和5pl待檢測(cè)分析的DNA。利用PCR大規(guī)才莫擴(kuò)展增殖技術(shù)進(jìn)行反應(yīng)的時(shí)候，需要有一種儀器來(lái)控制實(shí)時(shí)的大規(guī)模擴(kuò)展增殖過(guò)程。羅塞爾-沃斯頓在他已經(jīng)公布的歐盟專利EP-640828里對(duì)于這種儀器有所有所描述。這個(gè)儀器的主要構(gòu)成是一個(gè)可以把大量進(jìn)行待檢測(cè)病原體DNA擴(kuò)增的試管放入其中的儀器架。儀器架上的專用光源，為儀器架上的多個(gè)試管提供光源，以及一個(gè)熒光探測(cè)器，可以實(shí)時(shí)纟全測(cè)釋^:的萸光。為了多量化檢測(cè)樣品里存在的微生物，需要制出每種待檢測(cè)病原體(李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H)在溶液中的存在數(shù)量的曲線。通過(guò)對(duì)試管的渾濁度調(diào)整0.5個(gè)McFarland單位，并且將溶液稀釋為10",10-2,l(T3，104,105,106,107y108的倍數(shù)，隨后用25g的待檢食物樣品加入到每份溶液中，每份溶液都加入同樣份額的樣品。接著進(jìn)行DNA樣本的提取，并且記錄下每瓶不同溶液的反應(yīng)，確定不同的溶液里相對(duì)應(yīng)的病原體的數(shù)量。最后在圖像上加上單位cT和ug/g,最后就得到了一條溶液中病原體數(shù)量的曲線。李斯特菌的曲線見于圖像一，金黃色葡萄球菌的曲線見于圖像二，空腸彎曲菌的曲線見于圖像三，大腸桿菌0157:H的曲線見于圖像四。在本技術(shù)提供的方法里，使用到的儀器包括實(shí)時(shí)檢測(cè)焚光的焚光探測(cè)儀，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)大規(guī)^莫擴(kuò)展增殖過(guò)程的儀器。在這個(gè)流程中使用到的一種儀器是賽普伊德公司生產(chǎn)的"靈敏循環(huán)儀"。通過(guò)DNA多量化實(shí)時(shí)^r測(cè)鑒定樣品中的病原體這四種病原體(李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H)可能在樣品中出現(xiàn)的所有組合形式，存在與否都能夠^皮檢測(cè)出來(lái)。檢測(cè)的結(jié)果很直觀的由樣品里的DNA所具有的不同熒光或是放射性的焚光標(biāo)志顯現(xiàn)出來(lái)。因此要確定不同熒光的波長(zhǎng)，這樣就可以容易得辨別出哪種熒光是由哪種DNA所發(fā)射出的。檢測(cè)結(jié)果根據(jù)本技術(shù)提供的方法，圖表五顯示了結(jié)束整個(gè)大規(guī)模擴(kuò)展步驟的條件，圖表六顯示了檢測(cè)可以達(dá)到的水平，圖表七顯示了讀取出的檢測(cè)結(jié)果里的四種病原體(李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H)的濃度，檢測(cè)結(jié)果分別來(lái)自冷肉，乳制品和從表層獲取的樣品，通過(guò)利用一種單一的混合試劑，在相同溫度下四種來(lái)自不同病原體的寡核核苷酸在擴(kuò)增的過(guò)程中進(jìn)行混合。當(dāng)然，圖像一二三四也顯示了多量化檢測(cè)結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>特定的四種病原體中的每一個(gè)病原體進(jìn)行多量化實(shí)時(shí)檢測(cè)。根據(jù)不同情況量化實(shí)時(shí)檢測(cè)(僅僅使用寡核核苷酸起始序列部分和對(duì)應(yīng)的探針)。本技術(shù)所提供的方法所使用的相關(guān)的試劑，包括可以裝在盒子里的核酸序列，或是前面提到過(guò)的一些裝有寡核核苷酸起始部分序列或是探針的器皿。為了完成檢測(cè)，應(yīng)該擁有下列的條件一些裝有全部或是部分試劑的容器，以及純凈無(wú)菌水，NTPs(dATP,dCTP,dGTP,ydTTP),擴(kuò)展酶法適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充和儲(chǔ)備，一種嗜熱DNA聚合酶(比如說(shuō),DNA聚合酶Taq),—種鎂鹽(比如MgCl2)。上述的這些都應(yīng)該根據(jù)需要進(jìn)行相關(guān)的配置和補(bǔ)充。此外根據(jù)本技術(shù)的提供的方法所使用的試劑，還包括盛有李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H的器皿，來(lái)作為陽(yáng)性對(duì)照的比對(duì)。根據(jù)上文所述，為了進(jìn)行上述的檢測(cè)，已經(jīng)敘述了很多檢測(cè)的步驟和程序。在這些檢測(cè)過(guò)程中，應(yīng)該對(duì)于所有需要的這些條件進(jìn)行最大的改善，以期得到最好的檢測(cè)結(jié)果。包括上文所敘述的這些檢測(cè)的步驟和檢測(cè)的條件，這些都不是不會(huì)發(fā)生變化的。以上的這些敘述，都可能會(huì)有改正的余地，這些由我們負(fù)責(zé)，這一點(diǎn)需要格外的注意。權(quán)利要求1.對(duì)于檢測(cè)和同時(shí)進(jìn)行的多重量化任何病原體(這些病原體是從由李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌O157H7組成的小組中選擇的)在一個(gè)或多個(gè)測(cè)試樣品中，通過(guò)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)作用于聚合酶鏈反應(yīng)的方法，包括以下幾個(gè)步驟a)現(xiàn)場(chǎng)提取上述樣品或試驗(yàn)樣品的DNA；b)準(zhǔn)備上述病原體的特有反應(yīng)混合物來(lái)檢測(cè)和量化，該反應(yīng)混合物包括對(duì)于提取的DNA的酶的擴(kuò)增的必要試劑和對(duì)這些病原體的檢測(cè)和量化的鑒定；c)通過(guò)作用于聚合酶的復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)，增強(qiáng)該混合物的反應(yīng)；d)同時(shí)確定這些病原體在上述樣品或檢驗(yàn)樣品的存在與否和量化；其中i)該反應(yīng)混合物對(duì)于提取的DNA酶的擴(kuò)增和任何李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和/或大腸桿菌O157H7的組合的檢測(cè)和量化包括第一對(duì)寡核苷酸序列確定為標(biāo)識(shí)符編號(hào)1和編號(hào)2，探針確定為順序編號(hào)3，這些是越過(guò)或捆綁第一個(gè)目標(biāo)的核酸序列的李斯特桿菌；第二對(duì)寡核苷酸序列確定為標(biāo)識(shí)符編號(hào)4和編號(hào)5，探針確定為順序編號(hào)6，這些是越過(guò)或捆綁第二個(gè)目標(biāo)的核酸序列的金黃色葡萄球菌；第三對(duì)寡核苷酸序列確定為標(biāo)識(shí)符編號(hào)7和編號(hào)8，探針確定為順序編號(hào)9，這些是越過(guò)或捆綁第三個(gè)目標(biāo)的核酸序列的空腸彎曲菌；第四對(duì)寡核苷酸序列確定為標(biāo)識(shí)符編號(hào)10和編號(hào)11，探針確定為順序編號(hào)12，這些是越過(guò)或捆綁第四個(gè)目標(biāo)的核酸序列的大腸桿菌O157H7；ii)這些病原體在上述樣品或檢驗(yàn)樣品中的李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌O157H7的任一組合的存在與否和量化是由一種熒光信號(hào)或每個(gè)病原體特有熒光的發(fā)射決定的。2.如權(quán)利要求i所述的方法，其特征在于上述樣品或試驗(yàn)樣品是一種加工食品的纟羊品或環(huán)境^羊品。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于現(xiàn)場(chǎng)從上述樣品或試驗(yàn)樣品中提取DNA的過(guò)程包括這幾個(gè)步驟把試驗(yàn)樣品放置于生理鹽水中；清除水溶性分子，并獲取濃縮物。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于反應(yīng)混合物包括至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號(hào)1;至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號(hào)2;至少有50皮摩爾的寡核苷酸探測(cè)確定為序列編號(hào)3;至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號(hào)4;至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號(hào)5;至少有50皮摩爾的寡核苷酸探測(cè)確定為序列編號(hào)6;至少有300皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號(hào)7;至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號(hào)8;至少有350皮摩爾的寡核苷酸探測(cè)確定為序列編號(hào)9;至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號(hào)10;至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號(hào)11;和\或至少有50皮摩爾的寡核苷酸探測(cè)確定為序列編號(hào)12。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于它列入了一次或多次探測(cè)來(lái)檢測(cè)產(chǎn)品或聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)的產(chǎn)品，其中每個(gè)探頭是和檢測(cè)李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和/或大腸桿菌0157:H7的任一組合的序列內(nèi)的序列相輔相成的。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于第一個(gè)探針包括一個(gè)確定為序列編號(hào)3的寡核香酸，和至少一個(gè)才示j己。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于第一個(gè)探針在它的端點(diǎn)5'用熒光或能發(fā)射能量的染料標(biāo)記，在它的端點(diǎn)3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動(dòng)發(fā)出的能量的染料標(biāo)記。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于上述熒光是四環(huán)素。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于上述阻尼器是BHQ-1。10.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于第二個(gè)探針包括一個(gè)確定為序列編號(hào)6的寡核香酸，和至少一個(gè)標(biāo)記。11.如權(quán)利要求l0所述的方法，其特征在于第二個(gè)探針在它的端點(diǎn)5'用熒光或能發(fā)射能量的染料標(biāo)記，在它的端點(diǎn)3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動(dòng)發(fā)出的能量的染料標(biāo)記。12.如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于上述熒光是TxR。13.如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于上述阻尼器是BHQ-2。14.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于第三個(gè)探針包括一個(gè)確定為序列編號(hào)9的寡核香酸，和至少一個(gè)標(biāo)記。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于第三個(gè)探針在它的端點(diǎn)5'用熒光或能發(fā)射能量的染料標(biāo)記，在它的端點(diǎn)3'用阻尼器或能捕獲該焚光振動(dòng)發(fā)出的能量的染料標(biāo)記。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于上述熒光是Cy5。17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于上述阻尼器是BHQ-3。18.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于第四個(gè)探針包括一個(gè)確定為序列編號(hào)12的寡核苷酸，和至少一個(gè)標(biāo)i己。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于第四個(gè)探針在它的端點(diǎn)5'用熒光或能發(fā)射能量的染料標(biāo)記，在它的端點(diǎn)3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動(dòng)發(fā)出的能量的染料標(biāo)記。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于上述熒光是FAM。21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于上述阻尼器是BHQ-1。22.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于上述這些探針都是在它的端點(diǎn)5'用熒光或能發(fā)射能量的染料標(biāo)記，在它的端點(diǎn)3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動(dòng)發(fā)出的能量的染料標(biāo)記。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于上述熒光是從由TET,TxR，Cy5和FAM組成的小組中選出的。24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于上述阻尼器是從由BHQ-l,BHQ-2和BHQ-3組成的小組中選出的。25.—個(gè)寡核苷酸，其特征在于擁有一系列核苷酸，其中這系列核苷酸是^v那些確定為序列編號(hào)1，序列編號(hào)2和序列編號(hào)3的系列組成的小組中選出的。26.—個(gè)寡核苷酸，其特征在于擁有一系列核苷酸，其中這系列核香酸是乂人那些確定為序列編號(hào)4,序列編號(hào)5和序列編號(hào)6的系列組成的小組中選出的。27.—個(gè)寡核苷酸，其特征在于擁有一系列核苷酸，其中這系列核苷酸是>^人那些確定為序列編號(hào)7，序列編號(hào)8和序列編號(hào)9的系列組成的小組中選出的。28.—個(gè)寡核苷酸，其特征在于擁有一系列核苷酸，其中這系列核苦酸是^v那些確定為序列編號(hào)10,序列編號(hào)11和序列編號(hào)12的系列組成的小組中選出的。529.—次有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于包括一個(gè)確定為序列編號(hào)3的寡核普酸和至少一個(gè)標(biāo)記。30.如權(quán)利要求29所述的有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于該探測(cè)在它的端點(diǎn)5'用熒光或能量射能量的染料標(biāo)記，在它的端點(diǎn)3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動(dòng)發(fā)出的能量的染料標(biāo)記。31.如權(quán)利要求30所述的有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于上述熒光是TET。32.如權(quán)利要求30所述的有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于上述阻尼器是BHQ-1。33.—次有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于包括一個(gè)確定為序列編號(hào)6的寡核香酸和至少一個(gè)標(biāo)^己。34.如權(quán)利要求33所述的有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于該探測(cè)在它的端點(diǎn)5'用熒光或能量射能量的染料標(biāo)記，在它的端點(diǎn)3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動(dòng)發(fā)出的能量的染料標(biāo)記。35.如權(quán)利要求34所述的有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于上述熒光是TxR。36.如權(quán)利要求34所述的有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于上述阻尼器是BHQ曙2。37.—次有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于包括一個(gè)確定為序列編號(hào)9的寡核苷酸和至少一個(gè)標(biāo)記。38.如權(quán)利要求37所述的有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于該探測(cè)在它的端點(diǎn)5'用熒光或能量射能量的染料標(biāo)記，在它的端點(diǎn)3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動(dòng)發(fā)出的能量的染料標(biāo)記。39.如權(quán)利要求38所述的有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于上述熒光是Cy5。40.如權(quán)利要求38所述的有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于上述阻尼器是BHQ-3。41.一次有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于包括一個(gè)確定為序列編號(hào)12的寡核苷酸和至少一個(gè)標(biāo)記。42.如權(quán)利要求4l所述的有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于該探測(cè)在它的端點(diǎn)5'用熒光或能量射能量的染料標(biāo)記，在它的端點(diǎn)3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動(dòng)發(fā)出的能量的染料標(biāo)記。43.如權(quán)利要求42所述的有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于上述熒光是FAM。44.如權(quán)利要求42所述的有標(biāo)記的探測(cè)，其特征在于上述阻尼器是BHQ-1。45.用于檢測(cè)和同時(shí)進(jìn)行的多重量化任何病原體(這些病原體是從由李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H7組成的小組中選擇的)在一個(gè)或多個(gè)測(cè)試樣品中，通過(guò)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)作用于聚合酶鏈反應(yīng)的診斷試劑盒，其特征在于包含以下幾點(diǎn)根據(jù)權(quán)利要求25到權(quán)利要求28中的任何一個(gè)的情況而定的一個(gè)或多個(gè)核香酸；根據(jù)權(quán)利要求29到權(quán)利要求44中的任何一個(gè)的情況而定的一個(gè)或多個(gè)有標(biāo)記的探測(cè)；用來(lái)完成試驗(yàn)的其他試劑或所需成分。全文摘要李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和/或大腸桿菌O157∶H7的任一組合在一個(gè)或多個(gè)測(cè)試樣品中，通過(guò)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)作用于聚合酶鏈反應(yīng)的檢測(cè)和同時(shí)進(jìn)行的多重量化的方法步驟是(a)從試驗(yàn)樣品中現(xiàn)場(chǎng)提取DNA；(b)準(zhǔn)備病原體的特有反應(yīng)混合物來(lái)檢測(cè)和量化，這樣，該反應(yīng)混合物包括對(duì)于提取的DNA的酶的擴(kuò)增的必要試劑和對(duì)這些病原體的檢測(cè)和量化的鑒定；(c)通過(guò)作用于聚合酶的復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)，發(fā)揮反應(yīng)混合物；(d)同時(shí)確定這些病原體在上述樣品或檢驗(yàn)樣品的存在與否和量化，這個(gè)方法有其特殊性(i)對(duì)于DNA酶的擴(kuò)增，此反應(yīng)混合物有幾對(duì)確定序列編號(hào)為1和2，序列編號(hào)4和5，序列編號(hào)7和8，序列編號(hào)10和11的寡核苷酸發(fā)端及確定序列編號(hào)為3，6，9，12的寡核苷酸序列探針；(ii)上述病原體在任何組合的存在與否和量化由一種熒光信號(hào)或每個(gè)病原體特有的熒光發(fā)射決定的。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101432440SQ20078001476公開日2009年5月13日申請(qǐng)日期2007年4月19日優(yōu)先權(quán)日2006年4月24日發(fā)明者埃爾維拉·加爾薩·岡薩雷斯,弗朗西斯科·哈維爾·博格斯·帕迪拉,維克托·曼努埃爾·莫雷諾·卡帕娜申請(qǐng)人:西格馬食品可變資本有限公司