專利名稱：：分離胎兒滋養(yǎng)層的制作方法分離胎兒滋養(yǎng)層發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分離從懷孕雌性哺乳動(dòng)物獲得的胎兒滋養(yǎng)層(胎盤)細(xì)胞的方法，更具體地說，涉及用釋放滋養(yǎng)層的試劑處理宮頸粘液樣品，再更具體地說，涉及在實(shí)驗(yàn)室機(jī)構(gòu)接受從懷孕雌性獲得的樣品后約8小時(shí)內(nèi)，提供對(duì)符合FISH等檢驗(yàn)要求的胎兒滋養(yǎng)層樣品的方法。
背景技術(shù)：
：衍生自胎兒的細(xì)胞可獲得有關(guān)胎兒的遺傳學(xué)和/或生物化學(xué)信息。通過分離妊娠早期的滋養(yǎng)層細(xì)胞，可利用這些細(xì)胞獲得胎兒遺傳學(xué)和/或生物化學(xué)信息，特別是可用于檢測人類胎兒異常。多年來，一直利用通過羊膜穿刺術(shù)或絨毛膜取樣(CVS)獲得的胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前檢驗(yàn)。羊膜穿刺術(shù)通常在妊娠約16周時(shí)進(jìn)行，需要熟練人員將針頭插入胎兒的羊膜囊，取出20-30ml的羊水。隨后可對(duì)羊水含有的胎兒細(xì)胞實(shí)施檢驗(yàn)。然而，這種獲得胎兒細(xì)胞的方法伴有誘導(dǎo)自發(fā)流產(chǎn)的危險(xiǎn)。此外，如果根據(jù)該16-周方法的胎兒細(xì)胞遺傳學(xué)診斷顯示異常，而在妊娠中期三個(gè)月時(shí)終止妊娠(mid-trimesterpregnancytermination)不僅在心理上令人緊張還對(duì)母體有一定危險(xiǎn)。絨毛膜取樣也要求熟練人員取得8-12周胎兒胎盤的少量生物活檢樣品，類似地，這也有誘導(dǎo)自發(fā)流產(chǎn)的危險(xiǎn)。然而，能更早地診斷任何染色體異常使得CVS比羊膜穿刺術(shù)更有吸引力。這兩種方法需要熟練人員和可能誘導(dǎo)自發(fā)流產(chǎn)通常意味著只能對(duì)認(rèn)為攜帶染色體異常胎兒的風(fēng)險(xiǎn)相當(dāng)高的懷孕婦女實(shí)施這種產(chǎn)前遺傳學(xué)評(píng)估。提供較簡單方法的嘗試包括獲得從懷孕婦女的手臂靜脈或子宮壁獲得血液，提取通常從胎盤脫落的目前一致認(rèn)為存在于母體血流中的胎兒細(xì)胞。這種非侵入性分離胎兒細(xì)胞消除了誘導(dǎo)自發(fā)流產(chǎn)的任何風(fēng)險(xiǎn)。美國專利號(hào)5,503,981提供使懷孕哺乳動(dòng)物的血液樣品與有效量的絨毛膜合胞體滋養(yǎng)層和非絨毛膜細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的特異性抗體接觸而分離血液樣品中的滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法。將該抗體結(jié)合的細(xì)胞與樣品分開，利用分離的細(xì)胞獲得遺傳學(xué)和/或生物化學(xué)信息。雖然從母體血流鑒定和分離胎兒細(xì)胞似乎提供了理想的非侵入性替代方法從而能獲得用于產(chǎn)前遺傳學(xué)檢驗(yàn)的胎兒遺傳材料，實(shí)際上，其主要的缺陷在于母體血流中的胎兒細(xì)胞極其稀少?，F(xiàn)已測定母體血流中存在的滋養(yǎng)層細(xì)胞濃度非常低；因此，從母體血液中分離(細(xì)胞)的方法存在問題而且耗時(shí)。雖然已開發(fā)了幾種改進(jìn)的檢測方法，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和熒光原位雜交(FISH)，但將母體血液常規(guī)用于產(chǎn)前診斷依然存在主要問題；即不能合理地富集和/或分離與母體細(xì)胞相混合的非常少量胎兒細(xì)胞，從而不能獲得真實(shí)可靠的診斷結(jié)果。這種分離的必需的，因?yàn)樵谠S多診斷幾乎不容許(存在)含母體DNA的細(xì)胞；例如分子診斷中，通?；旧鲜橇闳菰S。因此，母體血液中胎兒細(xì)胞的極端稀少導(dǎo)致設(shè)計(jì)了許多專門技術(shù)以圖從母體血液中富集和/或分離胎兒細(xì)胞組分或胎兒遺傳材料。美國專利號(hào)5,432,054披露采用梯度離心分離胎兒細(xì)胞的富集方法。這種方法通常不夠靈敏，從而不能有效分離可用于高度可靠遺傳學(xué)檢驗(yàn)(例如，基本上零容許)的胎兒細(xì)胞組分。還采用美國專利號(hào)4,675,286披露的標(biāo)記抗體方法嘗試從母體血液樣品中分離胎兒細(xì)胞，該方法釆用流式細(xì)胞術(shù)將胎兒細(xì)胞與母體細(xì)胞組分分開。然而，流式細(xì)胞術(shù)分選的固有局限性也阻礙了這些方法更廣泛地應(yīng)用于該目的。這些流式細(xì)胞技術(shù)的主要局限性在于這些技術(shù)所用的抗體。雖然產(chǎn)生的這些抗體是細(xì)胞特異性的，但它們常與樣品中存在的濃度非常高的其它不需要的細(xì)胞類型交叉反應(yīng)。因此，雖然這些方法足以按胎兒細(xì)胞類型富集混合物，但它們常不能用于可靠、零容許的胎兒細(xì)胞分離。美國專利號(hào)5,580,724披露了從母體血液樣品中獲得胎兒來源細(xì)胞的方法，其采用離心法首先分離單核的細(xì)胞(MNC)。除去血漿和培養(yǎng)基后，洗滌MNC層，在含5%二氧化碳的高濕度氣氛中，在含有干細(xì)胞因子(SCF)、促紅細(xì)胞生成素和11-3及11-16的的專門培養(yǎng)基中培育7天。通過抽吸回收不粘附的細(xì)胞，然后在有助于胎兒干細(xì)胞生長的條件下將細(xì)胞重新接種并培養(yǎng)14天。21天后，計(jì)數(shù)細(xì)胞，接種并檢查。長時(shí)間的滯后和花費(fèi)妨礙其采納用于臨床實(shí)踐。美國專利號(hào)6,221,596指導(dǎo)從包含混合細(xì)胞群的母體血液樣品中分離稀少細(xì)胞類型，例如滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法，該方法首先提供樣品一部分的放大圖像。形態(tài)學(xué)鑒定細(xì)胞群內(nèi)的稀少細(xì)胞類型，利用顯微操作儀回收鑒定的稀少細(xì)胞類型。該方法需要技術(shù)和專用設(shè)備，而且耗時(shí)。因?yàn)檫@些(至少感覺到的)缺點(diǎn)，現(xiàn)已開發(fā)了其它方法，其中特別感興趣的是獲得存在于子宮腔中的細(xì)胞。美國專利號(hào)4,675,286指導(dǎo)了從宮頸腔獲得分離細(xì)胞樣品，該樣品含有與源自子宮內(nèi)膜和胎盤的母體細(xì)胞相混合的源自胎盤的胎兒細(xì)胞。將拭子或其它收集工具插入子宮管的粘液栓(mucusplug)中通過子宮管獲得子宮腔的這些細(xì)胞。然后利用攜帶胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞特異性抗體的微球處理細(xì)胞混合物以圖將混合物中的胎兒細(xì)胞與母體細(xì)胞分開。然后用培養(yǎng)基增殖捕獲在微球上的胎兒細(xì)胞，隨后通過攪動(dòng)使之脫離微球用于檢測。早在1987年便公開的該通用方法未能廣泛應(yīng)用，人們已在探尋其改進(jìn)方法。PCT申請(qǐng)WO2004/087863提出通過獲得懷孕婦女子宮頸內(nèi)細(xì)胞(transcervicalcell)來診斷性別和潛在的染色體異常，例如通過利用巴氏涂片細(xì)胞刷(Papsmearcytobrush)，經(jīng)該刷在含幾毫升組織培養(yǎng)基(含有青霉素/鏈霉素抗生素)的試管中振蕩。然后將樣品進(jìn)行細(xì)胞離心，將得到的細(xì)胞離心載玻片(cytospinslide)保存在95。/。乙醇中直至利用針對(duì)滋養(yǎng)層抗原的抗體(許多這樣的抗體已有描述)進(jìn)行免疫學(xué)染色。該染色后復(fù)染細(xì)胞，例如將載玻片浸在合適的溶液中，并標(biāo)記滋養(yǎng)層細(xì)胞。一旦標(biāo)記了所需細(xì)胞，可結(jié)束染色，采用雙色技術(shù)(twocolortechnique)和直接標(biāo)記的探針進(jìn)行FISH分析?？衫脽晒怙@微鏡觀察這些細(xì)胞的FISH信號(hào)。該項(xiàng)工作基本上能單獨(dú)分析胎兒滋養(yǎng)層，同時(shí)這些滋養(yǎng)層仍然是胎兒和母體細(xì)胞接種混合物的一部分。這要求非常精密的儀器和訓(xùn)練有素的操作者，因此不是優(yōu)選的。公布的美國申請(qǐng)2005/0123914還發(fā)現(xiàn)獲得宮頸粘液樣品有希望成為非侵入性、產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常的基礎(chǔ)。其描述道首先獲得妊娠頭三個(gè)月的宮頸粘液樣品，例如利用經(jīng)宮頸拭子。然后用粘液溶解劑處理該粘液，隨后用膠原酶和蛋白酶處理，這表明用可商品化購得的酶混合物可使細(xì)胞與粘液物質(zhì)脫離。洗滌回收這些細(xì)胞，然后通過離心將它們與上清液分開。利用胎兒特異性抗體處理從洗滌后剩余的胎兒和母體細(xì)胞的混合物中分離胎兒細(xì)胞。有人提議用熒光標(biāo)記的三種抗體，即NDOGl、NDOG5和FT1.41.1的混合物處理來鑒定胎兒細(xì)胞。然后采用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)、磁珠分離、顯微操作和/或激光捕獲及氟免疫組織化學(xué)方法分離胎兒細(xì)胞，據(jù)稱優(yōu)選顯微操作。一旦獲得胎兒細(xì)胞，可采用描述的許多方法進(jìn)行診斷。雖然，該申請(qǐng)所述的總體方法基本上為產(chǎn)前診斷潛在遺傳疾病提供了有吸引力的方法，但在各步驟中依舊有改善的空間。因此，仍需要尋求提供分離的滋養(yǎng)層細(xì)胞樣品，特別是與多核滋養(yǎng)層細(xì)胞相對(duì)的單核滋養(yǎng)層細(xì)胞(因?yàn)楝F(xiàn)已證實(shí)進(jìn)行染色體分析，例如FISH時(shí)，單核滋養(yǎng)層細(xì)胞能產(chǎn)生更可靠且一致的數(shù)據(jù))的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供從獲自懷孕婦女的含滋養(yǎng)層細(xì)胞和母體細(xì)胞的樣品中分離和純化胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法。將從子宮腔獲得的粘液樣品加入轉(zhuǎn)運(yùn)試管中的選擇性維持培養(yǎng)基中，維持于約4'C-2(TC之間的溫度下；可任選處理該培養(yǎng)基從而使得該試管內(nèi)的氣氛含氧量不超過約4%。該培養(yǎng)基如此的特征使得粘液樣品中的滋養(yǎng)層細(xì)胞維持于存活狀態(tài)，因而能從臨床收集機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)至為分析而配置的實(shí)驗(yàn)室。轉(zhuǎn)運(yùn)后，粘液樣品經(jīng)過精確的加工步驟，包括用酶，例如粘液溶解劑或粘蛋白酶、糖水解酶、核酸酶和蛋白酶處理。結(jié)果是獲得胎兒和母體細(xì)胞產(chǎn)物，這些細(xì)胞的外表面基本上完全不含附著的粘液生物物質(zhì)，從而使得分離的胎兒細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)大于以前從這種樣品可能獲得的，這些細(xì)胞基本上完全不含母體材料，可立即有效地進(jìn)行FISH或其它分子診斷。在一具體方面，本發(fā)明提供對(duì)從懷孕雌性哺乳動(dòng)物獲得的樣品中胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行快速而精確染色體分析的方法，所述樣品含有這種細(xì)胞和其它細(xì)胞，該方法包括以下步驟(a)獲得含有胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞和母體細(xì)胞的懷孕雌性哺乳動(dòng)物的宮頸粘液，用收集器收集該樣品并保存于有利于保存滋養(yǎng)層細(xì)胞而不利于母體細(xì)胞的選擇性保存培養(yǎng)基中；(b)從所述保存培養(yǎng)基中取出所述收集器，用粘液溶解劑和糖水解酶聯(lián)合處理所述樣品和收集器，35-4(TC培育；(c)用核酸酶和蛋白酶聯(lián)合處理所述樣品，35-40。C培育；(d)取出所述收集器，任選加入EDTA或解離酶(detachmentenzyme)，離心濃縮所述樣品中的細(xì)胞和/或其它生物材料；(e)離心后除去上清液；(f)加入適于培養(yǎng)CHO細(xì)胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基并混合；(g)再次離心濃縮所述細(xì)胞和其它生物材料并除去上清液；(h)在含疊氮鈉的水性緩沖液中制備步驟(g)所述產(chǎn)物的懸液，使其流過具有收集區(qū)的微型通道裝置，所述收集區(qū)表面包被有對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞具有特異性而對(duì)母體細(xì)胞不具特異性的螯合劑，從而能有效捕獲滋養(yǎng)層細(xì)胞而基本上排除母體細(xì)胞；和(i)鑒定所述捕獲的滋養(yǎng)層細(xì)胞并分析所述鑒定的細(xì)胞。在另一具體方面，本發(fā)明提供對(duì)樣品的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行快速而精確的染色體分析的方法，所述樣品從懷孕的雌性哺乳動(dòng)物獲得并含有滋養(yǎng)層細(xì)胞和其它細(xì)胞，該方法包括以下步驟(a)獲得含有胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞和母體細(xì)胞的懷孕雌性哺乳動(dòng)物的宮頸粘液，用收集器收集該樣品；(b)用粘液溶解劑和糖水解酶聯(lián)合處理所述樣品，35-40。C培育；(c)用核酸酶和蛋白酶聯(lián)合處理所述樣品，35-40'C培育；(d)離心濃縮所述樣品中的細(xì)胞和/或其它生物材料；(e)將所述細(xì)胞重懸在任選含有穩(wěn)定劑的水性緩沖液中，和(f)利用螯合劑分離所述滋養(yǎng)層細(xì)胞與所述母體細(xì)胞，所述螯合劑對(duì)所述滋養(yǎng)層細(xì)胞外表面上的抗原具有特異性。在另一具體方面，本發(fā)明提供對(duì)懷孕雌性哺乳動(dòng)物的宮頸粘液樣品的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行快速而精確的染色體分析的方法，該方法包括以下步驟(a)用收集器獲得含有胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞和母體細(xì)胞的懷孕雌性哺乳動(dòng)物的宮頸粘液樣品；(b)將含所述粘液的所述收集器加入轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的特征在于能維持所述滋養(yǎng)層細(xì)胞于健康狀態(tài)而使一些母體細(xì)胞死亡，從而能提高胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的百分比；(c)從所述轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基中取出攜帶所述粘液的所述收集器，在試管中用粘液溶解劑、糖水解酶、核酸酶和蛋白酶處理所述收集器和所述粘液，35-40'C培育，從而能使所述粘液的外源性生物組分從滋養(yǎng)層細(xì)胞的外表面脫離；(d)所述培育后從所述試管中取出所述收集器，將所述收集器保存在第二試管中；(e)在所述第二試管中用粘液溶解劑、糖水解酶、核酸酶和蛋白酶處理所述收集器和剩余的所述粘液，35-4(TC培育，除去所述第一和第二試管中的所述處理培養(yǎng)基，將所述樣品的所述細(xì)胞重懸在適合培養(yǎng)CHO細(xì)胞的培養(yǎng)基中，洗滌所述細(xì)胞并除去源自所述粘液的外來生物材料；(e)將所述細(xì)胞重懸在含穩(wěn)定劑和疊氮鈉的水性緩沖液中以提供適合流過微流體分離裝置(microflowseparationdevice)的液體；(f)在所述微流體裝置中利用結(jié)合滋養(yǎng)層細(xì)胞外表面抗原的螯合劑分離所述滋養(yǎng)層細(xì)胞與剩余的所述母體細(xì)胞；和(g)然后對(duì)所述分離的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行染色體分析，從而能在將攜帶所述粘液的所述收集器自所述轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基中取出之時(shí)起8小時(shí)內(nèi)完成所述分析。優(yōu)選實(shí)施方式詳述宮頸粘液樣品主要從懷孕雌性哺乳動(dòng)物中收集，分離其中的滋養(yǎng)層(胎盤)細(xì)胞。下文描述了所用的步驟和用于實(shí)施這些步驟的培養(yǎng)基及試劑。專門描述了獲得懷孕雌性哺乳動(dòng)物的宮頸粘液樣品的胎兒細(xì)胞以及從該宮頸粘液樣品中有效分離胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的某些優(yōu)選方法，從而獲得能用FISH或其它分子診斷分析的滋養(yǎng)層細(xì)胞。臨床醫(yī)師常在不同地點(diǎn)獲得含胎兒和母體細(xì)胞的宮頸粘液樣品，必須將這些樣品轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行加工，優(yōu)選將這些樣品保存在封端小瓶或試管的水性保存培養(yǎng)基中，例如將宮頸粘液收集裝置(例如，細(xì)胞刷、細(xì)胞帝(cytobroom)或拭子)的相應(yīng)部分保存在其中。為使大多數(shù)細(xì)胞維持存活以供隨后的加工，運(yùn)輸期間不應(yīng)冷凍滋養(yǎng)層細(xì)胞，而是優(yōu)選將它們維持在約4'C且不能高于約20。C。因?yàn)樽甜B(yǎng)層細(xì)胞至少部分包埋在由稱為粘多糖(也稱為葡糖胺聚糖)的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物和其它大分子構(gòu)成的宮頸粘液中，用細(xì)胞刷等獲得的宮頸粘液樣品需要小心處理以除去細(xì)胞外表面的所有這種粘液生物材料。下文所述的粘膜樣品處理方法有效除去基本上所有非細(xì)胞組分，同時(shí)選出了存活的滋養(yǎng)層細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)利用富集滋養(yǎng)層細(xì)胞的原始轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基，然后在隨后的加工中利用其它培養(yǎng)基可保存柔弱的滋養(yǎng)層細(xì)胞。同時(shí)，下文所述的處理方法能區(qū)別性地除去非滋養(yǎng)層細(xì)胞組分，同時(shí)使粘性生物材料從脆弱的滋養(yǎng)層細(xì)胞表面分開。下文描述了從宮頸粘液樣品到達(dá)分析實(shí)驗(yàn)室后從中純化滋養(yǎng)層細(xì)胞的通用處理方法。這只是對(duì)處理粘液結(jié)合細(xì)胞的方法的說明，而不是以任何方式作出限制。含宮頸粘液樣品、收集裝置和轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基的封端收集試管運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室，將其記入實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)。所用的代表性專運(yùn)培養(yǎng)基包含低鈣基礎(chǔ)培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和必需的文書工作后，將試管交付遵從安全指南的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員，包括在下述處理流程中利用生物安全柜(biohazardhood)操作這種人生物材料。將收集刷從轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基中取出，置于15ml試管中，例如含有配制用于培養(yǎng)中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的培養(yǎng)基類型，例如HamsF-12培養(yǎng)基的15ml試管中。下文將該試管稱為樣品處理試管。首先，將含有收集刷和粘液樣品的試管在37'C水浴中培育30分鐘，使該試管到達(dá)該溫度，然后用特定的化學(xué)試劑處理。發(fā)現(xiàn)初步處理應(yīng)利用粘液溶解劑或粘蛋白酶和糖水解酶的組合。在樣品試管中用粘蛋白酶和糖水解酶進(jìn)行這種初步處理能從粘液的一些組分中有效釋放滋養(yǎng)層細(xì)胞和糖殘基。N-乙酰基-L-半胱氨酸是用于降低宮頸粘液粘度的粘液溶解劑；因此，它有助于將粘蛋白從收集裝置物理釋放入處理試管的培養(yǎng)基中，并在該處進(jìn)行加工。N-乙酰基-L-半胱氨酸通過將粘多糖(也稱為葡糖胺聚糖)降解成小分子亞單位而能液化粘液。雖然N-乙酰基-L-半胱氨酸是優(yōu)選的粘液溶解劑，但還可利用其它已知的粘蛋白酶水解宮頸粘液，包括二硫蘇糖醇(DTT)、鹽酸溴,環(huán)已烷(bromhexinehydrochloride)、L-半胱氨酸和透明質(zhì)酸酶，如透明質(zhì)酸裂解酶、透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酶(hyaluronoglucosaminidase)和透明質(zhì)酸葡糖苷酸酶(hyaluronglucuronidase)。(3-半乳糖苷酶是優(yōu)選的糖水解酶；其用于切割粘液中圍繞滋養(yǎng)層細(xì)胞的碳水化合物鏈。(3-半乳糖苷酶水解葡萄糖和半乳糖之間的P-半乳糖苷酶鍵，使粘液中的細(xì)胞與糖蛋白分離。還可利用其它糖水解酶，例如轉(zhuǎn)化酶水解糖殘基。向樣品處理試管中加入至少一種粘蛋白酶和至少一種糖水解酶后，加入氯化鈣水溶液，將樣品在試管搖動(dòng)器上以35-4(TC，優(yōu)選37'C培育合適的時(shí)間，即至少約10分鐘，優(yōu)選約30分鐘，而活化諸酶。與粘液溶解劑和糖水解酶培育后，向試管中加入酶混合物，然后在試管搖動(dòng)器上培育幾分鐘；所用的酶混合物包含核酸酶、蛋白酶，優(yōu)選額外量的糖水解酶，優(yōu)選(3-半乳糖苷酶。核酸酶用于酶促切割胞外的單鏈和/或雙鏈DNA和RNA。如Duplantier等(USPharmacist,17:34-52(1992))所述，利用核酸酶水解胞外DNA顯示能降解粘膜分泌物。核酸內(nèi)切酶優(yōu)于核酸外切酶，因?yàn)樗鼈兡茉趲讉€(gè)內(nèi)部位置切割DNA，而核酸外切酶只能從DNA鏈的末端消化核苷酸。因此，與核酸外切酶相比，核酸內(nèi)切酶能提供更徹底的消化。然而，在某些條件下，可使用核酸外切酶替代核酸內(nèi)切酶，或除核酸內(nèi)切酶外還可使用核酸外切酶。還可利用在特定區(qū)域進(jìn)行切割的限制酶，其是核酸內(nèi)切酶；優(yōu)選非特異性核酸內(nèi)切酶或切口酶。優(yōu)選利用能降解單鏈和雙鏈DNA的DNA酶，更優(yōu)選將DNA酶I(切口酶)加入樣品處理試管以消化胞外DNA?？捎玫钠渌锌诿傅睦影ňG豆核酸酶(消化單鏈DNA和RNA)和Benzonase(將多種形式的DNA和RNA降解成小的寡核苷酸，促進(jìn)細(xì)胞裂解液粘度快速降低，從而可用于超速離心)。加利福尼亞州圣迭戈市的優(yōu)洛金泰美國公司(EurogentecUSA，SanDiego，CA)提供上述各種核酸內(nèi)切酶。因?yàn)樵醋詫m頸的粘液樣品含有生物材料的異質(zhì)收集物，其包含完整細(xì)胞(母體和胎兒的)、裂解細(xì)胞的裂解物、胞外蛋白和胞外DNA，故認(rèn)為核酸酶是降解外源性DNA最有用的，這些外源性DNA如果存在會(huì)不利地影響測試結(jié)果和/或?qū)е码y以加工樣品。降解外源性DNA還使得感興趣的細(xì)胞，即滋養(yǎng)層細(xì)胞沒有表面污染。蛋白酶水解粘液的蛋白質(zhì)部分。因?yàn)閷m頸粘膜樣品含有胞外蛋白質(zhì)，通過將滋養(yǎng)層細(xì)胞與它們的原始異質(zhì)環(huán)境進(jìn)一步分離并釋放表面抗原從而能采取它們天然的3-D構(gòu)型，進(jìn)行胞外蛋白質(zhì)的蛋白水解切割產(chǎn)生了更干凈的樣品。在一個(gè)實(shí)例中，利用酶混合物，例如切割幾乎任何肽鍵的鏈霉蛋白酶來消化樣品試管中的胞外蛋白質(zhì)。鏈霉蛋白酶包括內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶。本領(lǐng)域已知可用于水解蛋白質(zhì)的許多蛋白水解化合物。除鏈霉蛋白酶外，還可利用這些化合物中諸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等許多化合物?，F(xiàn)己發(fā)現(xiàn)利用核酸酶(優(yōu)選DNA酶1)、蛋白酶(優(yōu)選鏈霉蛋白酶)和(3-半乳糖苷酶的混合物同時(shí)處理對(duì)于從宮頸粘液的粘性附著生物材料中完全釋放滋養(yǎng)層細(xì)胞極其有效。除用于加工粘液樣品的上述粘液溶解劑、糖水解酶、核酸酶和蛋白酶外，還可包含其它補(bǔ)充性化學(xué)試劑，但這些化學(xué)試劑不是必需的。然而，應(yīng)該知道某些酶(如果包含的話)可能需要在略高的溫度下培育以活化，某些酶如果未受抑制的話，可能會(huì)過度降解某些生物組分。因此，優(yōu)選通過猝滅，例如通過與第二試劑接觸或顯著降低反應(yīng)溫度來停止某些酶的消化。在優(yōu)選的工藝中，約2分鐘后將收集刷自第一處理試管中取出，置于作標(biāo)記的第二處理試管中。然而，取出后繼續(xù)溫育該第一試管約十多分鐘。保存收集刷的第二樣品處理試管含有類似含量的HamsF-12培養(yǎng)基、粘液溶解劑、糖水解酶和優(yōu)選的氯化鈣，該試管及其內(nèi)含物在37'C水浴中預(yù)熱至少IO分鐘。然后類似于所述處理第二試管中的收集刷。用酶混合物處理并培育至少約3分鐘后，將收集刷自第二樣品處理試管中取出，置于第三樣品處理試管中(其內(nèi)含物與第二處理試管類似)，重復(fù)上述處理。在第三樣品處理試管中溫育約5分鐘后，取出收集刷，保存并作標(biāo)記。一旦將收集刷從各自三個(gè)處理試管中取出并完成進(jìn)一步溫育后，按照下文所述的相同方式處理各試管的內(nèi)含物。在該整個(gè)處理過程中，發(fā)現(xiàn)如果將溫度范圍持續(xù)維持在35X:-40'C可獲得極佳的結(jié)果。取出收集刷完成溫育后，將EDTA或EGTA和/或解離酶，例如AccumaxA7089加入試管。雖然可利用合適的解離酶，但一優(yōu)選實(shí)施方式利用EDTA。與細(xì)胞懸液混合后，含EDTA的試管在約37'C離心約5分鐘。加入EDTA并離心后，真空抽吸3個(gè)試管中各自的培養(yǎng)基，在試管中留下約1/2ml培養(yǎng)基和沉淀物。此時(shí)，細(xì)胞已非常有效地與最初粘附于細(xì)胞表面的粘性粘膜組分相分離。然后將細(xì)胞沉淀物分別重懸于HamsF-12培養(yǎng)基中兩次，離心作為洗滌操作。該第二次洗滌后，將沉淀物重懸在特征性的5ml緩沖液中，所述緩沖液可用于使用微流體裝置的后續(xù)細(xì)胞分離步驟，所述裝置利用滋養(yǎng)層-選擇性抗體。這種洗滌將滋養(yǎng)層細(xì)胞與消化或部分消化的生物分子分開，后續(xù)的離心將位于試管底部的細(xì)胞和含有培養(yǎng)基及小分子量生物分子的上清液分開。雖然本申請(qǐng)采用術(shù)語"滋養(yǎng)層細(xì)胞"，但應(yīng)該知道包括可能攜帶對(duì)螯合劑具有特異性的表面配體的細(xì)胞片段和/或殘留物。離心后應(yīng)小心不要打散沉淀物，真空抽吸除去大部分上清液(例如80%或更多)，然后重懸剩下的沉淀物用于下一步驟。如上所述，在約37'C的理想溫度下進(jìn)行所有這些步驟。如上所述，加入EDTA后，離心并真空抽吸3個(gè)試管中各自的大部分培養(yǎng)基，將細(xì)胞沉淀物分別重懸于HamsF-12培養(yǎng)基中兩次，離心作為進(jìn)一步洗漆操作。該第二次洗滌后，將沉淀物重懸在特征性的5ml緩沖液中，所述緩沖液可用于使用微流體裝置的后續(xù)細(xì)胞分離步驟，所述裝置利用滋養(yǎng)層-選擇性抗體。所用分離緩沖液的組成可依據(jù)加工樣品以選擇性分離滋養(yǎng)層細(xì)胞的下一步驟的特征而有所不同。分離緩沖液可包含試劑的例子包括組織培養(yǎng)基、酶和穩(wěn)定劑。例如，可將牛血清白蛋白(BSA)用作穩(wěn)定劑?；蛘撸衫锰ヅＱ?FBS)、牛血清、小牛血清、新生小牛血清、山羊血清、馬血清、人血清、雞血清、豬血清、綿羊血清、胚胎牛血清、家兔血清等(所有上述試劑可購自普羅蘭特生物公司(ProliantBiologicals))。可合并從第一試管、第二試管和第三試管收集的滋養(yǎng)層細(xì)胞，將其重懸于總共約1ml緩沖液中。發(fā)現(xiàn)先在重懸細(xì)胞的水性緩沖液中包含少量疊氮鈉，再進(jìn)行最后的分離步驟能改進(jìn)結(jié)果。發(fā)現(xiàn)包含約0.05-約0.2重量％的疊氮鈉能克服滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原通?？赡馨l(fā)生內(nèi)在化的任何傾向；因此，如果與螯合劑結(jié)合，表明胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的這些抗原依然是明顯的。優(yōu)選用微型通道裝置(例如2005年1月18提交的待批美國專利申請(qǐng)序列號(hào)11/038,920披露的)將現(xiàn)已與粘液的其它生物組分相分離的滋養(yǎng)層細(xì)胞與剩余的母體細(xì)胞相分離。該微型通道裝置內(nèi)部包含具有橫向桿狀體(transversepost)圖案的收集區(qū)。整個(gè)區(qū)域的表面經(jīng)衍生化，優(yōu)選具有涂層以促進(jìn)直接或間接結(jié)合感興趣耙生物分子的特異性螯合劑。術(shù)語"螯合劑"指能以特異性模式與靶細(xì)胞相互作用從而物理螯合該細(xì)胞的物質(zhì)。滋養(yǎng)層細(xì)胞的優(yōu)選螯合劑是直接針對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原的免疫球蛋白(具體是抗體)。然而，還可利用復(fù)雜的碳水化合物或合成分子。在整個(gè)收集區(qū)結(jié)合螯合劑的方式應(yīng)使得該螯合劑能有效執(zhí)行(其作用)；優(yōu)選用特定親水性水凝膠物質(zhì)薄層(至少約1pm厚)包被分離表面來實(shí)現(xiàn)，該物質(zhì)是分子量為約3,000-6,000道爾頓，含PEG、PPG的異氰酸酯功能化聚合物或其共聚物，其通過氨基甲酸酯鍵聚合并含有反應(yīng)性異氰酸酯基團(tuán)。配制這種包被材料的細(xì)節(jié)見2004年12月23日提交的待批美國專利申請(qǐng)序列號(hào)11/021,304?？蓪Ⅱ蟿┲苯踊蜷g接結(jié)合在水凝膠包被層上，然而優(yōu)選間接固定。這種方法考慮使用與包被層直接結(jié)合的中間試劑或物質(zhì)；例如，可將偶聯(lián)配對(duì)的一個(gè)成員結(jié)合于水凝膠包被層作為中間試劑。可以如此結(jié)合鏈霉親和素或直接針對(duì)另一物種抗體的抗體(Ab);然后將這種中間體偶聯(lián)于生物素化Ab或所述其它物種的Ab。例如，可包含親和素作為用于實(shí)施包被的聚氨酯預(yù)聚物(prepolymer)水性組合物的一部分。因此，親和素變成與包被層中的異氰酸酯基團(tuán)共價(jià)相連，然后其有助于對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞具有特異性的所需生物素化抗體的結(jié)合。優(yōu)選用Ab作為滋養(yǎng)層細(xì)胞分離的螯合劑，還可通過在施加的包被材料中摻入Ab而直接結(jié)合這種抗體。例如，可將抗體水溶液與具有游離異氰酸酯或等價(jià)基團(tuán)的聚氨酯預(yù)聚物，例如聚醚異氰酸酯混合，從而在收集區(qū)表面包被這種Ab層。特別優(yōu)選利用具有游離異氰酸酯基團(tuán)的預(yù)聚物，從而能在聚合后提供親水性、基于聚氨酯的水凝膠層。除了在分離表面上利用水凝膠層，還可，例如首先用2-氨基硫垸(aminothiolane)處理Ab使其硫醇化，然后可將硫醇化Ab與已用PEG-馬來酰亞胺處理的各桿狀體偶聯(lián)?；蛘?，可將所需Ab直接共價(jià)結(jié)合于各桿狀體上具有反應(yīng)性異氰酸酯基團(tuán)或硫氰酸酯基團(tuán)的合適親水性包被層?？贵w結(jié)合于微型通道裝置的整個(gè)圖案化桿狀體收集區(qū)后，使含有靶細(xì)胞群的緩沖懸液流過該收集區(qū)，例如用標(biāo)準(zhǔn)注射器泵小心地注入入口通道或者利用真空泵等從入口處的樣品儲(chǔ)器引入。液體樣品流過該裝置完成后，滋養(yǎng)層細(xì)胞捕獲在收集區(qū)內(nèi)。然后用緩沖液洗滌以除去非特異性結(jié)合的細(xì)胞和任何剩余的生物材料。用有效緩沖液洗滌沖洗該區(qū)域，從而除去這種非特異性結(jié)合的物質(zhì)，只留下粘附在該收集區(qū)中的所需耙細(xì)胞。一旦完成緩沖液洗滌，優(yōu)選將能適當(dāng)?shù)蒯尫挪东@細(xì)胞的化學(xué)試劑注入收集區(qū)。可通過本領(lǐng)域已知的方法實(shí)現(xiàn)釋放，例如化學(xué)方法(如改變pH)或利用酶切割試劑等。例如，可應(yīng)用某種試劑切割螯合劑或切割這種螯合劑與細(xì)胞之間的連接鍵，從而釋放收集區(qū)中與表面連接或偶聯(lián)的靶細(xì)胞。例如，如果利用對(duì)靶細(xì)胞的特征性表面具有特異性的抗體螯合細(xì)胞，可通過用含有胰蛋白酶或另一種合適蛋白酶，例如蛋白酶K的溶液處理來實(shí)現(xiàn)釋放?；蛘?，可利用膠原酶實(shí)現(xiàn)從其它螯合劑的(細(xì)胞)釋放，或者可利用特異性可切割接頭將螯合劑與收集表面結(jié)合。在所述切割期間，優(yōu)選用簡單的塞子塞住微型通道裝置的入口和出口，然后在所述釋放后離心該裝置?？梢约s等于500g的轉(zhuǎn)速離心約5分鐘，塞子位置適當(dāng)，裝置安置方向應(yīng)使離心力能將靶生物分子壓在構(gòu)成收集區(qū)一個(gè)表面的載玻片表面上。離心結(jié)束時(shí)，收集區(qū)中收集的基本上所有靶滋養(yǎng)層細(xì)胞粘附于該載玻片的上表面。然后小心拆開該裝置，獲得其上表面沉積有滋養(yǎng)層細(xì)胞的載玻片。如果決定對(duì)分離的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行FISH分析，首先應(yīng)用甲醇處理該滋養(yǎng)層細(xì)胞。用對(duì)滋養(yǎng)層來源的細(xì)胞具有特異性的細(xì)胞角蛋白-7和細(xì)胞角蛋白-17染色粘附于載玻片表面的細(xì)胞。如此鑒定為滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞隨后不難采用FISH技術(shù)分析。然而，還可對(duì)采用本文所述方式分離的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行其它類型的遺傳學(xué)篩選、分析和測試。本文所述的富集培養(yǎng)基和方法有助于宮頸粘液樣品收集后立即以及運(yùn)輸至臨床實(shí)驗(yàn)室期間的胎兒細(xì)胞保存和存活，在臨床實(shí)驗(yàn)室的所述加工順序中使用的化學(xué)試劑一起導(dǎo)致從一份樣品中獲得純化的、分離的胎兒細(xì)胞數(shù)量增加。在適于FISH或分子分析的條件中，這證明對(duì)于提供高質(zhì)量、高產(chǎn)量的滋養(yǎng)層細(xì)胞來源是明顯的進(jìn)步。通過以下實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明的實(shí)施方式和許多優(yōu)點(diǎn)，這些實(shí)施例應(yīng)理解為說明性而絕非限制性的。實(shí)施例優(yōu)選利用以下基礎(chǔ)材料含BSA的磷酸緩沖鹽水(PBS)，pH7.4，(西格瑪公司(Sigma)P-3688);lMTris-HCl，pH7.5，賽爾格羅公司(Cellgro)(VWR45001-066);1M氯化鎂(西格瑪公司M-1028);磷酸氫二鈉二水合物(西格瑪公司71637);磷酸二氫鈉二水合物(西格瑪公司71505);鏈霉蛋白酶(50,000U)，(卡爾生物化學(xué)公司(Calbiochem)VWR80601-406);卩-半乳糖苷酶(1,500U)，(羅氏公司(Roche)O105031);N-乙?；?L-半胱氨酸，(西格瑪公司A9165-25g);DNA酶I(150,000U)(西格瑪公司D-5033);疊氮鈉(西格瑪公司S-8032);和HamsF-12培養(yǎng)基，?？寺」?HyClone)(VWR16777-488)。制備具體試劑A.磷酸緩沖液(0.2M磷酸鹽/1.5MNaCl，PH8.0):將7.8g磷酸二氫鈉二水合物，8.9磷酸氫二鈉二水合物，43.83g氯化鈉，和450ml無菌水加入500ml無菌瓶中。用磁力攪拌棒攪拌該混合物直至完全溶解。用5M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至8.0，用無菌水將體積調(diào)節(jié)至500ml。經(jīng)0.22pm濾膜過濾后，終濃度是0.2M磷酸鹽和1.5MNaCl。B.N-乙?；?L-半胱氨酸(300mg/mD:將18.0gN-乙?；?L-半胱氨酸和50ml磷酸緩沖液(0.2M磷酸鹽/1.5MNaCl，pH8.0)加入100ml無菌瓶中。用磁力攪拌棒攪拌該混合物直至完全溶解。將4.44g氫氧化鈉緩慢加入100ml瓶中。用5M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至8.0，用磷酸緩沖液(0.2M磷酸鹽/1.5MNaCl，pH8.0)將體積調(diào)節(jié)至60ml。經(jīng)0.22pm濾膜過濾后，將6ml等份試樣分配入無菌的15ml錐形試管中。C.DNA酶I保存緩沖液:將19.58ml無菌水，400pl1MTris-HCl和20pl1MMgCh加入無菌試管。將混合物經(jīng)0.22nm濾膜過濾入新的無菌試管從而獲得終濃度為20mMTris-HCl和1mMMgCl2，冷藏保存(2°C-8°C)。D.DNA酶UIOO單位/ixl):將DNA酶I(150,000U)溶解于1.5mlDNA酶I保存緩沖液中，冷藏保存(2°C-8°C)。E.鏈霉蛋白酶(2500單位/mFh將鏈霉蛋白酶(50,000U)溶解于20ml無菌水中，獲得終濃度為2500單位/ml，冷藏保存(2°C-8°C)。F.B-半乳糖苷酶:將(3-半乳糖苷酶(1,500U)溶解于3ml無菌水中，獲得終濃度為0.5單位~1，冷藏保存(2°C-8°C)。G.酶混合物(足夠用于80次反應(yīng)):將200plDNA酶(100單位小l);1040W，P-半乳糖苷酶(0.5單位；l);和3200pl鏈霉蛋白酶(2500單位/ml)加入無菌的15ml錐形試管中。該混合物每日在冰上新鮮制備，顛倒混合，保存于冰上待用。H.200x疊氮鈉:每日在無菌的15ml錐形試管中將200mg疊氮鈉溶解于10ml無菌水中新鮮制備。I.含1。/。BSA的PBS:將PBS溶于1升無菌水，經(jīng)0.45nm濾膜過濾，加入BSA至終濃度為0.01MPBS，1%BSA。冷藏保存(2°C-8°C)。J.MEMS緩沖液:將含1%BSA的100mlPBS，400mlHamsF-12培養(yǎng)基，10^DNA酶I(100單位/pl)和2.5ml疊氮鈉加入500ml無菌瓶中，顛倒混合，從而獲得終濃度為2單位/mlDNA酶I和lx疊氮鈉，冷藏保存(2°C-8°C)。典型的從宮頸粘液分離滋養(yǎng)層細(xì)胞所有操作在裝有真空組件(vacuumhookup)的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。如上所述制備酶混合物，保存在冰上待用。加工原始(第一)組樣品試管將原始(第一)組樣品試管在37"C水浴中溫育30分鐘，這些試管各包含攜帶粘液樣品的收集刷。從水浴中取出這些樣品試管，將以下試劑加入各樣品試管22piN-乙?；?L-半胱氨酸溶液(300mg/ml)，pH8.0，獲得終濃度為0.5mg/ml;39nl卩-半乳糖苷酶溶液(0.5單位1)獲得終濃度為1.5單位/ml;和28pi1MCaCl2。將試管置于37'C培育箱中的試管搖動(dòng)器上30分鐘以混合這些試劑。然后從培育箱中取出第一組樣品試管，將55.5h1冷藏的酵混合物加入各試管。再次將試管置于37t培育箱中的試管搖動(dòng)器上2分鐘。2分鐘后，用無菌鑷子將第一組樣品試管中各自的細(xì)胞刷取出，放入如下所述制備的第二組預(yù)熱的樣品試管中a.給一組無菌的15ml錐形試管標(biāo)上樣品ID號(hào)。b.將13mlHamsF-12培養(yǎng)基等份加入各試管。c.將22piN-乙?；?L-半胱氨酸溶液(300mg/ml)，pH8.0加入各試管至終濃度為0.5mg/ml。d.將39^p-半乳糖苷酶溶液(0.5單位/pl)加入各試管至終濃度為1.5單位/ml。e.將28pi1MCaCh加入各試管。f.在37。C水浴中培育各試管至少IO分鐘。同時(shí)進(jìn)行現(xiàn)已包含細(xì)胞刷的第二組樣品試管的加工與第一組樣品試管中上清液的加工。加工第一組樣品試管的上清液取出細(xì)胞刷后，將含有上清液的第一組樣品試管置于37'C培育箱中的試管搖動(dòng)器上10.5分鐘。然后，將13pl0.5MEDTA加入各樣品試管，37r以500g(1466rpm)離心各樣品試管5分鐘。然后在37"C，真空吸出各試管的上清液，剩下的沉淀物和培養(yǎng)基體積約500pl，隨后用HamsF-12培養(yǎng)基將體積調(diào)節(jié)至約13ml。37°C，以500g(1466rpm)離心各試管5分鐘。37t:,再次真空吸出各試管的上清液，剩下的沉淀物和培養(yǎng)基體積約500^d，用HamsF-12培養(yǎng)基再次將體積調(diào)節(jié)至約13ml。37。C再次以500g(1466rpm)離心各樣品試管5分鐘。真空吸出各試管的上清液，剩下的沉淀物和培養(yǎng)基體積約500pl。37°C，將細(xì)胞重懸在5ml微型通道緩沖液中，以500g(1466rpm)離心各試管5分鐘。真空吸出第一組樣品試管中各自的上清液，剩下的洗滌細(xì)胞的體積約300^通道緩沖液。加工第二組樣品試管將包含細(xì)胞刷的第二組樣品試管置于37。C培育箱中的試管搖動(dòng)器上15分鐘。然后將55.5pl冷藏的酶混合物加入各試管，將試管置于37"C培育箱中的試管搖動(dòng)器上3分鐘。用無菌鑷子將第二組樣品試管中各自的細(xì)胞刷取出，放入如下所述制備的第三組預(yù)熱的樣品試管中a.給一組無菌的15ml錐形試管標(biāo)上樣品ID號(hào)。b.將13mlHamsF-12培養(yǎng)基等份加入各試管。c.將22piN-乙?；?L-半胱氨酸溶液(300mg/ml)，pH8.0加入各試管至終濃度為0.5mg/ml。d.將39pi卩-半乳糖苷酶溶液(0.5單位^1)加入各試管至終濃度為1.5單位/ml。e.將28jillMCaCl2加入各試管。f.在37'C水浴中培育各試管至少IO分鐘。同時(shí)進(jìn)行包含細(xì)胞刷的第三組樣品試管的加工與第二組樣品試管中上清液的加工。加工第二組樣品試管的上清液取出細(xì)胞刷后，將含有上清液的第二組樣品試管置于37'C培育箱中的試管搖動(dòng)器上9.5分鐘。然后，將13pl0.5MEDTA加入各樣品試管，37t;以500g(1466rpm)離心各樣品試管5分鐘。然后在37'C，真空吸出各試管的上清液，剩下的沉淀物和培養(yǎng)基體積約500pl，隨后用HamsF-12培養(yǎng)基將體積調(diào)節(jié)至約13ml。37°C，以500g(1466rpm)離心各試管5分鐘。37'C，再次真空吸出各試管的上清液，剩下的沉淀物和培養(yǎng)基體積約500pl，用HamsF-12培養(yǎng)基再次將體積調(diào)節(jié)至約13ml。37°C，以500g(1466rpm)離心各樣品試管5分鐘，真空吸出各試管的上清液，剩下的沉淀物和培養(yǎng)基體積約500pl。37'C，將細(xì)胞重懸在5ml微型通道緩沖液中，以500g(1466rpm)離心各試管5分鐘。真空吸出第二組樣品試管中各自的上清液，剩下的洗滌細(xì)胞的體積約300|il通道緩沖液。加工第三組樣品試管將包含細(xì)胞刷的第三組樣品試管置于37。C培育箱中的試管搖動(dòng)器上15分鐘。然后將55.5pl冷藏的酶混合物加入各試管，將試管置于37'C培育箱中的試管搖動(dòng)器上5分鐘。用無菌鑷子將第三組樣品試管中各自的細(xì)胞刷取出，放入標(biāo)記有樣品ID號(hào)的15ml無菌試管中。將取出的細(xì)胞刷保存于4。C。取出細(xì)胞刷后，將含有上清液的第三組樣品試管置于37。C培育箱中的試管搖動(dòng)器上9.5分鐘。然后，將13pl0.5MEDTA加入各樣品試管，37'C以500g(1466rpm)離心各樣品試管5分鐘。然后真空吸出各試管的上清液，剩下的沉淀物和培養(yǎng)基體積約500^。隨后在37"C用HamsF-12培養(yǎng)基將體積調(diào)節(jié)至約13ml，37。C以500g(1466rpm)再次離心各試管5分鐘。再次真空吸出各試管的上清液，剩下的沉淀物和培養(yǎng)基體積約500pl。37°C，用HamsF-12培養(yǎng)基再次將各樣品試管中的體積調(diào)節(jié)至約13ml，37°C以500g(1466rpm)再次離心各試管5分鐘。真空吸出各試管的上清液，剩下的沉淀物和培養(yǎng)基體積約500^。37°C,將細(xì)胞重懸在5ml微型通道緩沖液中，37。C以500g(1466rpm)離心各試管5分鐘。真空吸出各樣品試管中的上清液，剩下的洗滌細(xì)胞的體積約300pl通道緩沖液。利用針對(duì)Trop-l和Trop-2的抗體從宮頸粘液樣品分離剩余的滋養(yǎng)層細(xì)胞。首先通過在室溫下與10體積％的DowCorningZ-6020溶液溫育30分鐘來衍生化微型通道裝置的整個(gè)收集區(qū)的內(nèi)表面。用乙醇洗滌后，室溫下用脫脂奶處理內(nèi)表面約1小時(shí)以產(chǎn)生酪蛋白薄包被層。用10%乙醇水溶液洗滌后，用水凝膠包被此內(nèi)表面，所述水凝膠基于平均分子量約6000的異氰酸酯-封端的PEG三醇。當(dāng)準(zhǔn)備包被時(shí)，將以重量計(jì)1份聚合物與6份有機(jī)溶劑(即乙腈(Acn)和DMF)制備的水凝膠預(yù)聚物溶液與1mg/ml抗體溶液(含BSA的100mM硼酸鈉，pH8.0配制)混合。具體的包被制劑包含Acn/DMF配制的100mg預(yù)聚物；水性硼酸緩沖液配制的350pL0.25mg/ml抗體混合物；和水性硼酸緩沖液配制的3501mg/mlBSA;以重量計(jì)，所述包被制劑含有約2%預(yù)聚物?？偣矊⒓s5微克硫醇化的抗-Trop-l和-2以這種水溶液(濃度約0.5mg/ml)施加于微型通道裝置，該溶液在25'C溫育2小時(shí)。該溫育期后，用1%PBS/BSA沖洗該微型通道裝置，從而獲得設(shè)計(jì)用于螯合胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的包被抗體的表面。優(yōu)選平行使用3臺(tái)這樣的微流體分離裝置，如果這樣，通過將該裝置出口連接管與真空泵相連從而將該細(xì)胞懸液供給垂直方向的入口使得約300^流過Trop-l和Trop-2包被的每臺(tái)微型通道裝置。室溫下操作泵以使樣品液體緩慢而連續(xù)地流過該裝置，優(yōu)選約3-5pl/分鐘的速度。在該期間，Trop-l和Trop-2Ab捕捉樣品中存在的滋養(yǎng)層細(xì)胞。所有樣品遞送給每臺(tái)裝置后，用1。/。PBS/BSA水性緩沖液緩慢沖洗。在約IO分鐘期間將約100^1該水性緩沖液加入該裝置，從而將所有非特異性結(jié)合的生物材料從裝置的流動(dòng)通道中除去。各用約100pl的1%PBS加1%BSA再進(jìn)行兩次洗滌，約IO分鐘以確保完全除去。洗滌完成后，用0.25%胰蛋白酶溶液沖洗該裝置的內(nèi)部，用塞子塞住裝置的入口和出口。27°C，將該裝置以水平方向溫育約20分鐘。該時(shí)期結(jié)束時(shí)，將該裝置裝在離心機(jī)上，以500g離心約5分鐘，離心力迫使現(xiàn)已解離的細(xì)胞粘附于水凝膠包被的平載玻片的表面。離心結(jié)束時(shí)，將胰蛋白酶水溶液排出該裝置并干燥該裝置。小心地分開該裝置的主體與下面的平載玻片。用對(duì)滋養(yǎng)層來源細(xì)胞具有特異性的細(xì)胞角蛋白-7和細(xì)胞角蛋白-17染色粘附于該載玻片表面的細(xì)胞，因而鑒定了隨后采用FISH技術(shù)不難分析的滋養(yǎng)層細(xì)胞。雖然描述了本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方式，這些實(shí)施方式構(gòu)成發(fā)明人目前已知的實(shí)施本發(fā)明的最佳方式，但應(yīng)該知道該領(lǐng)域的普通技術(shù)人員明顯可作出各種改變和改進(jìn)而不脫離隨附的權(quán)利要求書中限定的本發(fā)明范圍。例如，雖然描述了用于純化樣品的某些優(yōu)選試劑，但該領(lǐng)域也熟知適合于這些目的的其它材料。雖然通常強(qiáng)調(diào)的是通過螯合滋養(yǎng)層細(xì)胞而將胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞與宮頸粘液提取物分離，但應(yīng)該知道可以通過反富集(negativeenrichment)耙向隨后被捕捉的不需要細(xì)胞群體來處理這種樣品。本文具體述及的所有美國專利和申請(qǐng)的內(nèi)容專門納入本文以供參考。隨附的權(quán)利要求書強(qiáng)調(diào)了本發(fā)明的具體特征。權(quán)利要求1.一種從宮頸粘液中分離胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法，該方法包括(a)將含有獲自宮頸粘液的樣品的混合物與核酸酶和蛋白酶溫育；和(b)從該混合物分離胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括先將該混合物與粘液溶解劑和糖水解酶溫育，再將該混合物與核酸酶和蛋白酶溫育。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在約35"C-約4(TC之間的溫度溫育該混合物。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，在約37i:溫育該混合物。5.如權(quán)利要求3或4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，將該混合物溫育約2分鐘-約5分鐘之間。6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在約35。C-約4(TC之間的溫度將該混合物與粘液溶解劑和糖水解酶溫育。7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在約37X:的溫度將該混合物與粘液溶解劑和糖水解酶溫育。8.如權(quán)利要求6或7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，將該混合物與核酸酶和蛋白酶溫育約10分鐘-約15分鐘之間。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸酶是核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、限制酶、DNA酶、DNA酶I、綠豆核酸酶或Benzonase⑧。10.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是分散酶、鏈霉蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或木瓜蛋白酶。11.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述核酸酶是DNA酶I，所述蛋白酶是鏈霉蛋白酶。12.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述粘液溶解劑是N-乙?；腚装彼帷⒍蛱K糖醇、鹽酸溴芐環(huán)已烷、L-半胱氨酸、透明質(zhì)酸裂解酶、透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酶、透明質(zhì)酸葡糖苷酸酶或透明質(zhì)酸酶。13.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述粘液溶解劑是N-乙?；腚装彼?，所述糖水解酶是卩-半乳糖苷酶。14.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸酶是DNA酶I，所述蛋白酶是鏈霉蛋白酶，所述粘液溶解劑是N-乙?；腚装彼?，所述糖水解酶是13-半乳糖苷酶。15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括使所述混合物與EDTA、EGTA或解離酶接觸。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，該方法還包括(a)離心所述混合物以濃縮所述細(xì)胞；(b)重懸所述細(xì)胞；(C)離心所述細(xì)胞；(d)重懸所述細(xì)胞；和(e)離心所述細(xì)胞。17.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，該方法還包括用固體表面上的結(jié)合實(shí)體分離胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞與母體細(xì)胞。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合實(shí)體在微型通道裝置的表面上。19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合實(shí)體是抗體。20.—種從宮頸粘液中分離胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒裝有核酸酶；和蛋白酶；和描述使用該試劑盒從宮頸粘液中分離胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的一套書面使用說明書。21.如權(quán)利要求20所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還裝有粘液溶解劑；和糖水解酶。22.如權(quán)利要求20或21所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還裝有結(jié)合實(shí)體；其中所述結(jié)合實(shí)體與胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞特異性結(jié)合。23.—種從宮頸粘液中分離胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法，該方法包括(a)將從子宮粘液獲得的樣品保存在選擇性維持胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞但不利于母體細(xì)胞的培養(yǎng)基中；(b)從所述培養(yǎng)基中取出所述樣品；(c)在約35。C-約4(TC之間的溫度，將含有獲自宮頸粘液的樣品的混合物與粘液溶解劑和糖水解酶溫育約10-約15分鐘；(d)在約35"-約4(TC之間的溫度，將所述混合物與核酸酶和蛋白酶溫育約2-約5分鐘；(e)使所述混合物與EDTA接觸；(i)離心所述混合物以濃縮細(xì)胞；和(g)將細(xì)胞重懸在配制用于培養(yǎng)CHO細(xì)胞的培養(yǎng)基中。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，該方法還包括(a)離心細(xì)胞；(b)將細(xì)胞重懸在含疊氮鈉的水性緩沖液中；和(c)用微型通道裝置表面上的抗體分離胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞與母體細(xì)胞，其中所述抗體與胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞特異性結(jié)合。全文摘要從獲自懷孕女性子宮腔的粘液樣品分離和純化胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法。將所述粘液樣品置于轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基中從臨床收集機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，從而維持細(xì)胞存活。然后對(duì)粘液樣品實(shí)施精確的加工步驟，包括用粘液溶解劑或粘蛋白酶、糖水解酶、核酸酶和蛋白酶處理以提供胎兒細(xì)胞，該胎兒細(xì)胞的外表面基本上除去了粘附的粘膜生物材料，因而分離的數(shù)量高于以前可能得到的。分離的細(xì)胞處于合適的條件中，從而能立即有效進(jìn)行FISH或其它分子診斷。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101432441SQ200780015162公開日2009年5月13日申請(qǐng)日期2007年3月22日優(yōu)先權(quán)日2006年3月23日發(fā)明者R·法戈納尼,R·皮切爾申請(qǐng)人:生物概念股份有限公司