專利名稱：蝦和對蝦的性別特異性標記的制作方法
蟲下和對蝦的性別特異性標記
本發(fā)明涉及蝦(shrimp)和對蝦(prawn)的性別特異性標記。更特別 地，本發(fā)明涉及衍生自斑節(jié)對蝦(尸e"^M mom^o")的性別特異性的基于 PCR的分子標記，其可用于確定蝦和對蝦的性別，并且可用于需要確定 蟲下和對蟲下的遺傳性別的任何及所有需求中，包括但不限于非常幼小的動 物的性別確定、對任何動物進行的遺傳性別確定及單性培養(yǎng)物的建立。
蝦和對蝦的養(yǎng)殖和貿易在全世界均是非常重要的活動。目前養(yǎng)殖的 主要品種是斑節(jié)X寸蟲下尸ewae^ wcwocfo"(珍王節(jié)對蝦(Giant tiger prawn)、 墨吉對蟲下 (Jumbo tiger prawn ) 、 Jumbo tiger shrimp 、 Black tiger prawn、 Blue tiger prawn、 草蟲下(Grass shrimp)…)，主要在亞洲養(yǎng)殖， 2003年水產養(yǎng)殖產量為大約600,000噸；va""awe/ (Whiteleg shrimp、南美白對蝦)，主要在美國、中國及泰國養(yǎng)殖，其水產養(yǎng)殖產量 與斑節(jié)對蝦(P. wo"o&")相當。對于這些品種，水產養(yǎng)殖比捕獲更具重 要性。
對水產養(yǎng)殖的日益增加的需求意味著日益增加的開發(fā)更有效的生產 系統(tǒng)的緊迫性。現(xiàn)代遺傳學越來越多地用于支持原種改良和育種程序 (Hulata, 2001)。近年來，基因組研究和基因作圖發(fā)展迅速。已經鑒定了 DNA標記用于建立系譜、連鎖圖譜及鑒別數量性狀基因座(QTL)。
由于大多數對蝦種CPe"aew )是性二態(tài)性的(sexually dimorphic) (Hansford and Hewitt, 1994)，因此進行了許多嘗試試圖發(fā)現(xiàn)可有助于建 立和維持單性培養(yǎng)物的可靠的性別標記。 一些研究小組開發(fā)了連鎖圖 譜，主要基于使用AFLP標記(Moore et al., 1999; Wilson et al., 2002)。 P&ez et al. (2004)公布了南美白對蟲下(尸e"ae^ va朋ame/)的性別特異性 連鎖圖譜。然而，他們未鑒別性別相關的標記或連鎖群。Li et al. (2003) 揭示了日本對蝦CPem^M^pom'cw)的性別特異性連鎖圖譜，在母體連鎖(maternal linkage)圖譜上具有推定的性別標記。Zhang et al. (2006)公布了 南美白對蝦fP. v"""ame/)的連鎖圖譜，在雌性連鎖圖譜上存在性別相關 的微衛(wèi)星標記。然而，在后兩種情況中，性別-標記關聯(lián)在遺傳學不相關 的個體中未被質疑。應強調的是設計的群體(例如半同胞家系)內相對較 低數量的樣品減數分裂導致相對較長的染色體節(jié)段處于連鎖不平衡(LD)
中。因此，在這種連鎖研究中，在標記與性別二態(tài)性之間觀測到的高 LD得自群體的性質而不是得自緊密的物理連鎖。因此，通過連鎖分析 發(fā)現(xiàn)的處于與性別LD中的標記通常不能在不相關個體群中區(qū)分兩種性 別。實際上，Li etal. (2003)承認推定的標記與性別特異性序列非必然相 連鎖，并且未揭示序列數據。此外，Zhang et al. (2004)使用AFLP方法 未能在中國對蝦(尸e"^w dm'eraW中鑒別性別特異性標記。同樣， Khamnamtong et al. (2006)未能在f鬼節(jié)對蟲下(尸e"aez^ mow cfow)中鑒另lJ'性另U 特異性標記。
令人驚訝地，使用AFLP技術，我們能分離對蝦或蝦性別特異性序 列，由此可以明確進行雄性和雌性的性別確定。為了鑒別性別特異性標 記，使用AFLP技術在斑節(jié)對蝦CPewaews /w "o&")中進行了大規(guī)模的混 合分組分析(bulked segregant analysis, BSA)。最初的篩選在一個實驗性 作圖群體中進行。候選的性別特異性標記在三個額外的實驗性作圖群體 及在不相關的野捕成體的一個大集合中證實。兩個標記在所有這些情況 中始終是性別特異性的。隨后將這兩個AFLP標記之一轉變?yōu)榛赑CR 的共顯性標記。
本發(fā)明的第一方面是對蝦或蝦性別特異性序列。如本文所用，性別 特異性序列是指可用于明確辨別雄性和雌性的序列。優(yōu)選地，所述性別 特異性序列長度是有限制的，以便于鑒別雄性和雌性序列之間的小差 異。更優(yōu)選地，所述性別特異性序列長度不超過2000個核苷酸，更優(yōu) 選不超過1000個核苷酸，還更優(yōu)選不超過500個核苷酸，還更優(yōu)選不 超過400個核苷酸。最優(yōu)選地，所述性別特異性序列包含SEQ ID N° 3禾口/或SEQ IDN。4或其功能片段。 一個優(yōu)選的實施方案是由SEQ ID N°3 組成的雌性特異性序列。另一個優(yōu)選的實施方案是由SEQ ID N° 4組成 的序列，雄性針對該序列是純合的。如本文所用，功能片段是指攜帶性 別特異性單核苷酸多態(tài)性(SNP)和/或插入缺失(INDEL)的片段，和/或允 許這種性別特異性SNP和/或INDEL擴增的片段。非限制性例子為，所 述特異性片段包含位于SEQ ID N° 3的第106、 121、 161、 191、 198和/ 或291位的SNP，和/或位于SEQ ID N。 3的第62、 111-117、 216和/或 272位的INDEL。優(yōu)選地，所述功能片段是引物，其包含、優(yōu)選地由 SEQ ID N°l或SEQ ID N° 2組成。所述引物可用于擴增位于SEQ ID N° 3的第111-117位的性別特異性INDEL。優(yōu)選地所述對蝦或蝦屬于對蝦 科(尸e"ae/Jae)。更優(yōu)選地，所述對蟲下或蟲下是對蟲下種(尸e朋ew ^ .)，包 括但不限于斑節(jié)對蟲下CP. mo"o^9")、南美白對蝦(尸.va""awe/)、日本對蟲下 CP.力;xw/cws)、印度對蟲下CP. z>wfcw)、墨吉對蟲下(尸.wergw/eraz》、許氏對 蟲下(尸.sc/7m/m')和南美藍對奸(P. ^0^>oy/n'"。最優(yōu)選地，所述對4下或蟲下是 斑節(jié)對蟲下(尸."謂f^/o")。
本發(fā)明的另一方面是基于PCR的標記在確定對蝦和奸的性別中的應 用。如本文所用，基于PCR的標記可以是使得在PCR擴增時能夠無疑 義確定性別的任何核酸序列。優(yōu)選地，所述標記的長度是有限的，以便 于鑒別小的缺失。更優(yōu)選地，所述標記的長度不超過2000個核苷酸， 更優(yōu)選不超過1000個核苷酸，還更優(yōu)選不超過500個核苷酸，最優(yōu)選 不超過400個核苷酸。如本文所用，核酸序列可以是任何核酸序列，包 括但非限于DNA、 cDNA禾卩RNA。所用的PCR技術可以是本領域技術 人員已知的任何基于PCR的技術。優(yōu)選地，擴增的序列選自如下組，所 述組包含、更優(yōu)選地由SEQ ID N° 3和SEQ ID N° 4或其攜帶性別特異 性SNP和/或INDEL的功能片段組成。優(yōu)選地，所述標記使用選自由 SEQ ID N° 1和SEQ ID N° 2組成的組的引物擴增。優(yōu)選所述對蝦或蝦屬 于對蝦科(Pe"ae/^^)。更優(yōu)選地，所述對蝦或蝦是對蝦種(戶^aew5 ^ .)，包括不限于斑節(jié)對蟲下CP. wo"oA")、南美白對蟲下(P. vaw7"we/)、日本對蟲下 (P. j'a/ om'cw》、印度對蟲下(尸./m^'cw力、墨吉對蟲下(P. we,'gw/e"w力、許氏對 蟲下(尸.sc/w7/m:)和南美藍對奸(尸.s(y//ms^;0。最優(yōu)選地，所述對奸或蟲下是 斑節(jié)對蝦(尸.wo"oJo")。盡管基于PCR的標記的檢測優(yōu)選使用基于PCR 的技術進行，但是本領域技術人員已知其它技術例如但非限于DNA-DNA雜交、微陣列技術或者DNA解鏈曲線圖可單獨或者與PCR擴增組 合，用于檢測所述標記序列。
本發(fā)明的再一方面是在對蝦和蝦中建立單性培養(yǎng)物的方法，所述方 法包括本發(fā)明的基于PCR的性別確定?；赑CR的性別確定可用于區(qū) 分雄性和雌性，并選擇進行培養(yǎng)的生物體。然而，如本文所用，建立單 性培養(yǎng)物不是暗示著本發(fā)明的基于PCR的性別確定應該用于每個培養(yǎng)周 期中。事實上，作為一個非限制性實例，本發(fā)明的基于PCR的性別確定 可以用于選擇同配雌性，其在與同配雄性雜交時產生完全一致的和異配 的雌性子代，因而獲得單性培養(yǎng)物。優(yōu)選所述方法包括使用選自由SEQ ID N° 1和SEQ ID N° 2組成的組的引物。更優(yōu)選地，通過基于PCR的 性別確定擴增的序列選自由SEQ ID N° 3和SEQ ID N° 4組成的組或其 攜帶性別特異性SNP禾n/或INDEL的功能片段。優(yōu)選地，所述對蝦或蝦 屬于對蝦科CPe"fleWfle)。更優(yōu)選地，所述對蝦或蝦是對奸種OPe"aeiw W.)，包括但不限于斑節(jié)對蝦CP. wow cfo")、南美白對蝦(P. va""ame/)、 日本對蟲下CP. )opo"/cMS)、印度對蟲下(尸./"cfews)、墨吉對蟲下(P. mergw/era&)、 i午氏X寸蟲下(尸.sc/zw,"/)禾口南美藍X寸蟲下(尸.^0^VoszW力。最{尤選 地，所述對蝦或蝦是斑節(jié)對蝦(P. mowxfo")。
附圖簡述


圖1:使用INDEL-標記對52個親蝦(broodstock)動物的基因分型。 圖2:雌性特異性AFLP片段(A)和用于獲得這個片段的完整序列的 PCR片段(B-D)的示意圖。圖3:雌性和雄性斑節(jié)對蟲下的RT-PCR擴增的SNP的解鏈曲線。
實施例
實施例的材料和方法
動激
通過將兩個雌性動物(IC100與IC67)與兩個雄性動物(AL91和AL99)
以所有四種可能的組合方式雜交產生的四個半同胞作圖群體(見表1)。
表h本研究中使用的四個半同胞作圖群體的親代和后代數目
群體雌性雄性后代數目雌性數目雄性數目疑問*數目
AIC100AL91111554511
BIC67AL9111362456
C1C100AL9912059610
DIC67AL9912056577
*這些個體的表型性別不能無疑義確定。
所有四個親代均是新近野外捕獲的。所有雜交均在Moana Technologies公司進行。當每個個體的性別可以以可接受程度的確定性 被記錄吋，在幼體后期(PL) 120收獲作圖群體。另外，在Moana Technologies公司可獲得一組52個不相關的野捕動物。這些個體用于評 價性別基因座與在作圖群體中鑒別的潛在的性別標記之間的物理連鎖的 緊密性。
H戶嚴遂
使用針對蝦組織優(yōu)化的CTAB方法從速凍的腹肢組織中制備 DNA。 AFLP分析如Vos et al (Vos et al. 1995)所述進行。親代和后代的 基因組DNA用EcoRI和Msel限制消化。雙鏈銜接子(adaptor)連接在限制片段的末端。稀釋所述消化產物，并使用在每個引物上具有單個選擇 性核苷酸的銜接子特異性引物預擴增。在預擴增水平產生了群體A的5
個個體的兩個集合或組(bulk)。在每個集合或組中，個體的性別是相同 的，但是它們對于所有其它基因座是任意的。使用含有2個額外的選擇 性核苷酸的AFLP-引物擴增了限制片段的所選亞集。擴增反應在AFLP 測序凝膠上分離，并使用LI-CORlW技術觀測。
對群體A進行混合分組分析(BSA)鑒別的性別特異性AFLP標記(即 在兩個雌性組中存在，但是在兩個雄性組中不存在)被認為是候選的性別 特異性標記。隨后，對三個剩余的作圖群體的成組樣品進行這些候選的 性別特異性標記的檢測。然后檢測了在三個額外BSA分析中被證實與 性別相關的標記與四個作圖群體中的每一個群體中的性別基因座的連 鎖。
為了通過連鎖最終評價所鑒別的標記-性狀-關聯(lián)性的強度，我們用 發(fā)現(xiàn)與性別連鎖的AFLP標記對52個不相關的野捕(親蝦)動物(來自作圖 群體的4個親代及48個額外的樣品)進行了基因分型。
靜
為了從AFLP標記中獲得序列信息，將EcoRI-特異性引物使用33P-ATP放射性標記，并將擴增產物在5%變性測序凝膠上分離。使所述凝 膠干燥，并通過放射自顯影法顯現(xiàn)。在顯現(xiàn)之后，從凝膠中切離條帶， 對洗脫的片段進行擴增和測序。
大多數PCR反應均在1XPCR緩沖液中進行，該緩沖液中補加了 1.5 ng/pl每種引物、0.2 mM每種dNTP、 2.5 mM MgCl2、 0.025 U的Taq 聚合酶及100 ng模板DNA。使用引物ATTGCA-1禾卩ATTGCA-2的PCR在20 pl總體積中進 行，使用100 ng的基因組DNA作為模板。將反應混合物加熱至95 °C 4 分鐘，隨后進行35次如下循環(huán)95'C變性30秒，52。C退火30秒及72 。C延伸30秒。最后，在72。C進行2分鐘的額外延伸步驟。
使用引物ATTGCA-1組合引物Msel+GCA或Msel+AAA的PCR以 及使用引物ATTGCA-2組合引物EcoRI+ATT的PCR在50 pl總體積中 進行，使用5 ^的1/20稀釋的預擴增反應。PCR反應如下35次如下 循環(huán)95 。C變性30秒，適當退火溫度(對于ATTGCA-1為55 。C，對于 ATTGCA-2為53 。C)退火30秒及72 。C延伸30秒；隨后在72 。C進行2 分鐘的額外延伸步驟。
對于INDEL-標記的PCR使用放射性標記的引物或熒光標記的引物 INDEL-4進行。反應在1XPCR緩沖液中進行，該緩沖液中補加了 0.3 ng/|il每種引物、0.2 mM每種dNTP、 2.5 mM MgCl2、 0.025 U的Taq聚 合酶及50 ng基因組DNA。將反應混合物加熱至95 。C 4分鐘，隨后進 行35次如下循環(huán)95 。C變性30秒，55 °C退火30秒及72 °C延伸30 秒。最后，在72 。C進行2分鐘的額外延伸步驟。對于熒光分析，進行 的反應基本與放射性分析一樣，不同之處是加入0.03 mM的IRD700-標 記的INDEL-4引物以及加入0.3 mM的INDEL-5引物。引物序列在表2 中示出。
表2:本研究中使用的引物序列
;i物名稱
引物序列(5'-3')
EcoRI-特異性AFLP弓!物
Msel-特異性AFLP引物
ATTGCA-1
ATTGCA-2
INDEL-4
INDEL-5
GAC TGC GTA CCA ATT C
TGA GTC CTG AGT AA
TCT AAC AGT TCA TAA AGC ATC CTA T
TTA AGC ATA TAC TAA GAA TCC AT
GGG GTC GCG AAT GTA AAA TA
TTT TCA AAT GCA TAA CTG TTA GCT G基因組DNA通過在75 (il堿性裂解緩沖液(25 mM NaOH， 0.2 mM EDTA， pH = 12)中于95'C加熱30分鐘而從小組織樣品(例如5 mm的步 行足尖端)中制備。樣品在冰上冷卻，加入75 ^ll中和緩沖液(40mMTriS-HCl， pH = 5)。對5 )il的1/20稀釋的DNA進行PCR。
使用Platinum sybr green qPCR supermix-UDG i式齊ll盒(Invitrogen)進 行PCR，使用引物FemaleForward_2、 MaleForward—2禾CI Reverse_2。初 始的變性步驟(5分鐘，95。C)之后進行40次如下循環(huán)95°C 20秒， 55°C 30秒，及72°C 20秒。隨后進行變性(l分鐘，95。C)和復性(1分 鐘，40°C)。解鏈曲線分析在iCycler系統(tǒng)(Bio-Rad)上進行。
引物序列
FemaleForward—2: GCGGGCGTTAGCTGATATTCATAATTCATGCTC MaleForward—2: GCGGGCAGGGCGGCGTTAGCTGATATTCATAATCCATGCAA Reverse—2 : AAGGGGTCGCGAATGTAAAATA
實施例l:標記鑒別
在第一次篩選中，我們在來自作圖群體A的混合樣品(bulked samples)上分析了大約1,408禾中AFLP引物組合。AFLP EcoRI+3/MseI+3 引物組合產生50-80個AFLP片段。因此，所述混合樣品用超過70,400 個AFLP片段進行了指紋分析。在這些片段中，13個片段經BSA分析 鑒別為性別特異性的。為了證實這個結果，將來自其它三個作圖群體 (B、 C和D)的混合樣品(bulked samples)針對這13個性別特異性標記進 行指紋分析。在9例中可以證實所述標記-性別關聯(lián)性。所有這些標記均 存在于雌性組(bulk)中，但是在雄性組中不存在。
為了確定這九個標記與性別基因座連鎖的緊密性，在四個作圖群體 的所有后代中對標記進行評分。表3中示出了重組頻率(即以作為分析的 個體總數的百分比表示的未示出條帶的雌性數目和示出條帶的雄性數 目)。表3:在四個作圖群體的每個群體中性別基因座與9個性別連鎖的 AFLP標記的每一個標記之間的重組頻率
標記(*)POPAPOPBPOPCPOPD
IC100XAL911C67XAL911C100XAL991C67XAL99
E+AAG/M+CGC-72.80/1000/%0/1200/109
E+ACC/M+GGG-183.80/990Z890/1150/111
E+AAC/M+TAG-200.71/996Z942/1184/110
E+AGA/M+CAG-333.00/991Z920/1171/雨
E+CAG/M+GAG-148.20/980Z970/1160/112
E+ACT/M+GTC-284.40/980/980/1190/112
E+AAA/M+GTG-125.40/980/910/H90/112
E+CGG/M+TTG-柳.31/965/920/1190/1U
E+ATTZM;GCA-347.00細0/%0/1200/109
(*) E: EcoRI; M: Msel -表示出用適用的選擇性核苷酸延伸的表2 的特異性引物的序列。
為了評價遺傳學不相關的個體群體中AFLP標記單元型與性二態(tài)性 的LD程度，對4個親代動物和在太平洋一些區(qū)域新近野捕的48個額外 的親蝦動物在九個性別連鎖的AFLP標記基因座進行了基因分型。在兩 個基因座，AFLP *示記等4立基因(EcoRI+AAG/Msel+CGC-72.8和 EcoRI+ATT/MseI+GCA-347.0)與斑節(jié)對蟲下0P.Ano"c^o")的性別呈完全 LD。
實施例2:標記測序
對相應的EcoRl-特異性引物進行放射性標記。在變性聚丙烯酰胺測 序凝膠上分離AFLP擴增產物，并使用放射自顯影法觀測。雌性 EcoRI+AAG/MseI+CGC-72.8禾G EcoRI+ATT/MseI+GCA-347.0標記等位 基因從AFLP凝膠中切離、洗脫、擴增并測序。由于我們獲得多個可能 的序列，因此我們通過兩個額外的選擇性核苷酸增加了 AFLP反應的選 皆性(+3/+3 AFLP反應今+4/+4 AFLP反應)?，F(xiàn)在獲得的雌性特異性片段為 EcoRI+AAGT/MseI+CGCT-72.8禾P EcoRI+ATTA/Msel+GCAT-347.0。對EcoRI+ATTA/MseI+GCAT-347.0標記條帶的分離及隨后的測 序獲得唯一的序列。非特異性條帶妨礙了 EcoRI+AAGT/Msel+CGCT-72.8片段的分離及其隨后唯一序列的產生。另外，該序列較短，使得更 難以設計針對這個片段的特異性PCR 。因此，選擇標記 EcoRI+ATTA/MseI+GCAT-347.0進一步開發(fā)成共顯性PCR-標記。
對于標記EcoRI+ATTA/Msel+GCAT-347.0，我們設計了 PCR引物 以在雌性和雄性個體中擴增所述標記。使用引物ATTGCA-1和 ATTGCA-2，我們能在雌性和雄性個體的基因組DNA上擴增出大約285 個堿基對(bp)的片段。從凝膠中分離這些PCR片段并測序。這樣獲得這 個標記的雌性和雄性特異性序列。對這些序列進行仔細檢査揭示了這些 序列中的9個性別特異性多態(tài)性6個單核苷酸多態(tài)性(SNP)和3個插入/ 缺失(INDEL)多態(tài)性。其中一個INDEL導致雄性中存在額外的Msel限 制位點。這是最可能導致在雄性中不存在EcoRI+ATTA/Msel+GCAT-347.0 AFLP片段的多態(tài)性。為了獲得AFLP片段部分側翼區(qū)的序列信 息，使用引物ATTGCA-1和相應的Msel-特異性AFLP引物(對于雌性為 M+GCA，對于雄性為M+AAA)以及使用引物ATTGCA-2和相應的 EcoRI-特異性AFLP引物(對于雌性和雄性均為EcoRI+ATT)進行了 PCR(見圖2)。對所得PCR片段進行測序，使用這個額外的序列信息校 正先前獲得的序列(SEQ ID N。 3和4)。結果，檢測到雄性與雌性序列之 間的額外的序列多態(tài)性(INDEL)，該多態(tài)性在先前未被鑒別，因為其位 于引物ATTGCA-1耙向的序列中。
實施例3: AFLP標記E+ATTA/M+GCAT-347.0轉化為基于PCR 的共顯性INDEL-標記
為了將E+ATTA/M+GCAT-347.0 AFLP標記轉化為簡單的單基因座 標記，我們設計了引物以特異性擴增攜帶被鑒別為性別特異性的INDEL多態(tài)性的基因組基因座。使用引物INDEL-4和INDEL-5，在來自群體A 的5個雄性和5個雌性動物中擴增了 76bp的等位基因片段，并僅在5個 雌性動物中擴增了 82bp的等位基因片段。這個結果證實在斑節(jié)對蟲下中 (尸e"^w "w"oA")雌性是異配性別。針對一組52個不相關的親奸動物 獲得相似結果，表明INDEL多態(tài)性與性別呈完全LD(見圖1)。用這個 標記對另一組33個不相關的親蝦動物進行了基因分型，再次發(fā)現(xiàn)該 INDEL多態(tài)性與性別呈完全LD。
本文描述的PCR擴增的標記等位基因在斑節(jié)對蝦CPe"flew mo朋&") 中與與性二態(tài)性呈完全LD。這個標記使得可以確定任何斑節(jié)對蝦個體 的遺傳性別，而不管其發(fā)育階段如何。
實施例4:針對斑節(jié)對蟲下(尸.w緒o^")性別的基于RT-PCR的SNP
基因分型測定法的開發(fā)
為了便于篩選大量的蝦，我們開發(fā)了針對性別標記的基于RT-PCR 的SNP基因分型測定法。針對雄性和雌性等位基因設計特異性正向引 物，并與通用的反向引物組合用于PCR中。在擴增后，進行解鏈曲線分 析。在雄性中僅觀測到一個峰，而在雌性中觀測到相應于兩個等位基因 的兩個峰(圖3)。參考文獻
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權利要求
1. 對蝦或蝦性別特異性序列。
2. 對蟲下或奸性別特異性序列，其包含SEQ ID N°3或SEQ ID N。 4或其功能片段。
3. 權利要求2的對蝦或蝦性別特異性序列的功能片段，其包含SEQ IDN。 1禾口/或SEQ IDN。2。
4. 前述任一項權利要求的對蝦或蝦性別特異性序列或其功能片段， 其中所述對蟲下或蝦屬于對奸科(尸e"ae/^^)。
5. 權利要求4的對蝦或蝦性別特異性序列或其功能片段，其中所述 對蟲下或蟲下是斑節(jié)對蟲下(尸醒醋w畫fifo")。
6. 基于PCR的標記在確定對蟲下和蝦的性別中的應用。
7. 權利要求6的基于PCR的標記的應用，其中擴增的序列選自 SEQ ID N°3-SEQ ID N°4或其功能片段。
8. 權利要求6或7的基于PCR的標記的應用，其中使用選自SEQ ID N° 1至SEQ ID N° 2的引物擴增所述標記。
9. 權利要求6-8任一項的基于PCR的標記的應用，其中所述對奸或 蝦是對蝦種(Pe"aeiw w.)。
10. 權利要求9的基于PCR的標記的應用，其中所述對蝦或奸是斑 節(jié)X寸蟲下(尸ewaews附owocfo")。
11. 在對奸或蝦中建立單性培養(yǎng)物的方法，包括基于PCR的性別確定。
12. 權利要求11的方法，其中所述基于PCR的性別確定包括使用選 自SEQIDN。1至SEQIDN。2的引物。
13. 權利要求11或12的方法，其中所述基于PCR的性別確定包括 使用選自SEQ ID N°3至SEQ ID N°4或其功能片段的序列。
14. 權利要求11-13任一項的方法，其中所述對蝦或蝦是對蝦種
15. 權利要求14的方法，其中所述對蝦或蝦是斑節(jié)對蝦(尸e"ae附
全文摘要
本發(fā)明涉及蝦和對蝦的性別特異性標記。更特別地，本發(fā)明涉及衍生自斑節(jié)對蝦的性別特異性的基于PCR的分子標記，其可用于確定蝦和對蝦的性別，并可用于需要確定蝦和對蝦的遺傳性別的任何及所有需求中，包括但不限于非常幼小的動物的性別確定、任何動物遺傳性別的確定及單性培養(yǎng)物建立。
文檔編號C12Q1/68GK101432442SQ200780015173
公開日2009年5月13日 申請日期2007年4月25日 優(yōu)先權日2006年4月25日
發(fā)明者F·范布羅賽格姆, J·斯塔埃郎, M·維爾斯特克 申請人:福拉姆斯大學生物技術研究所;根特大學;比利時穆阿納股份有限公司