專利名稱：具有增強的抗炎性和降低的細(xì)胞毒性特性的多肽以及相關(guān)方法
具有增強的抗炎性和降低的細(xì)胞毒性特性的多肽以及相關(guān)方法
相關(guān)申請的交叉參考
本申請要求2006年4月5日遞交的申請?zhí)枮?0/789, 383的美國臨時專利申請的優(yōu) 先權(quán)。
聯(lián)邦資助研究相關(guān)的陳述
導(dǎo)向本發(fā)明的研究部分地由國立衛(wèi)生研究院基金，編號AI034662資助。因此，美國
政府可以享有本發(fā)明的一定權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于設(shè)計治療炎癥性疾病的治療性多肽的新方法。
背景技術(shù)：
盡管最早鑒定免疫球蛋白的細(xì)胞受體是在將近40年以前，但在過去的十年中才發(fā)現(xiàn) 其在免疫應(yīng)答中的核心作用。他們在免疫應(yīng)答的傳入期和傳出期(both the afferent and efferent phase)都是非常關(guān)鍵的設(shè)定B細(xì)胞激活和抗體生成的閾值，調(diào)節(jié)樹突狀細(xì) 胞的成熟并偶聯(lián)抗體響應(yīng)效應(yīng)器途徑的精細(xì)的特異性，這些效應(yīng)器途徑諸如巨噬細(xì)胞吞 噬、抗體依賴性細(xì)胞毒性作用以及炎癥細(xì)胞的募集和激活。他們的核心作用將人類免疫 系統(tǒng)和天然效應(yīng)器細(xì)胞聯(lián)系起來，使得他們成為用于增強或限制體內(nèi)抗體活性的有吸引 力的免疫治療的靶標(biāo)。
抗體和抗體-抗原復(fù)合物與免疫系統(tǒng)中細(xì)胞的相互作用影響多種反應(yīng)，包括抗體依賴
性細(xì)胞毒性作用(ADCC)和補體依賴性細(xì)胞毒性作用(CDC)、巨噬細(xì)胞吞噬、炎癥介質(zhì)的釋 放、抗原的清除，以及抗體的半衰期(綜述見Daron,舶/ 〃 ZteK /腳"/ o, 15, 203-234 (1997) ; Ward和Ghetie， 7T era/3e〃^z'c/卿ww厶2， 77—94 (1995) ; Ravetch和Kinet， ^7ffly/y er 7mb脂W， 9， 457-492 (1991)，分別以參考文獻形式并入本文)。
抗體的恒定區(qū)不直接參與抗體對于抗原的結(jié)合，但呈現(xiàn)多種效應(yīng)器功能。抗體或免 疫球蛋白根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列可被分為不同的類別。有五個主要的免疫球蛋 白種類IgA、 IgD、 IgE、 IgG，和IgM，其中幾種可以進一歩分為亞類(同種型)，例如， IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4; IgAl和IgA2。與不同種類的免疫球蛋白對應(yīng)的重鏈恒定區(qū) 分別被稱為a 、 S 、 e 、 y ，禾n u 。在各種人類免疫球蛋白種類中，人IgGl和IgG3比 IgG2和IgG4更有效地介導(dǎo)ADCC。
抗體經(jīng)木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生被稱為Fab片段的兩個相同的抗原結(jié)合片段，分別含有一個單一的抗原結(jié)合位點；以及一個剩余的"Fc"片段，其命名反映出其容易結(jié)晶的能 力。Fc區(qū)與抗體的效應(yīng)器功能密切相關(guān)。已確定人類IgG Fc區(qū)的晶體結(jié)構(gòu)(Deisenhofer， 5ioc/ e啦'"/y, 20， 2361-2370 (1981),其以參考文獻形式并入本文)。在人類IgG分 子中，F(xiàn)c區(qū)由木瓜蛋白酶裂解的N-末端至第226位的半胱氨酸(Cys226)而產(chǎn)生。
長期以來， 一直認(rèn)為IgG通過其Fc片段介導(dǎo)的相互作用既能介導(dǎo)促炎癥作用，又能 介導(dǎo)抗炎癥作用。因此，雖然Fc-Fcy受體(Fc-FcyR)相互作用負(fù)責(zé)免疫復(fù)合物與細(xì) 胞毒性抗體的促炎癥特性，靜脈注射丙種球蛋白(IVIG)及其Fc片段是抗炎癥的并被廣泛 用于抑制炎癥性疾病。這種荒謬特性的精細(xì)機制尚不清楚，但有人提出IgG的糖基化對 于調(diào)控IgG的細(xì)胞毒性和炎性的潛能是至關(guān)重要的。
IgG在其兩條重鏈的CH2區(qū)分別含有一個連在天冬酰胺297 (Asn297)上的單，N-連 接聚糖。共價-連接的復(fù)合糖由--個核心的，含有N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和甘露糖 (man)的雙分支的五-多糖組成。在血清抗體中觀察到的核心糖結(jié)構(gòu)的進一步修飾發(fā)現(xiàn)有 巖藻糖、分支GlcNAc、半乳糖(gal)以及末端的唾液酸(sa)等不同的配基。已經(jīng)檢測到這 個單一的糖基化位點上共價地連接有超過40種不同的糖型。Fujii等人.，J.6T 柳 265， 6009 (1990)。顯示IgG的糖基化通過維持兩條重鏈的開放式構(gòu)象而對所有的Fc y R 的結(jié)合都是必要的。Jefferis and Lund， T/ffl7Hy/ e. J 82， 57 (2002)， Sondermann
等人.，，/ 309， 737 (2001)。這種Fc y R結(jié)合對于IgG糖基化的絕對需求
證實去糖基化的IgG抗體無法介導(dǎo)體內(nèi)觸發(fā)的炎癥反應(yīng)，諸如ADCC、巨噬細(xì)胞吞噬以及 炎癥介質(zhì)的釋放。Nimmerjahn和Ravetch, /腳w/^'f/24， 19 (2006).報道的含有或缺 少巖藻糖的IgG抗體的個體Fc y R的親和性的改變，以及其隨后對于細(xì)胞毒性的影響提 示個體IgG的糖基化可能有助于調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，這可進一歩觀察到。Shields等人.， 5j'o丄O e瓜211， 26133 (2002)， Nimmerjahn和Ravetch， 5bie"ce 310， 1510 (2005)。 已經(jīng)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和一些自身免疫性脈管炎患者中觀察到自身免疫狀態(tài)和IgG抗體 的特定糖基化模式的聯(lián)系，有報道這些患者中IgG抗體的半乳糖苷化和唾液酸化減少。 Parekh等人.，〃s tore 316, 452 (1985)， Rademacher等人.，尸roc. 〃a〃. 5"c/.
〃54 91, 6123 (1994)， Matsumoto等人.，128, 621 (2000)， Holland等人.，5ioc力i瓜 5j'op/ j^s . ^cta Dec 27; [Epub ahead of print] 2005.己經(jīng)報道IgG糖形的變化與年 齡和免疫相關(guān)，盡管這些改變在體內(nèi)的意義還沒有確定。Shikata等人.，67ycocwu'. J. 15， 683 (1998)， Lastra，等人.，^/toi腳朋jYy 28, 25 (1998)。
因此，需要丌發(fā)產(chǎn)生多肽的方法，其可以解釋體內(nèi)IgG性質(zhì)的不同的觀察結(jié)果。
發(fā)明概述
本發(fā)明通過提供這些方法和分子填補上述需要。在一方面，本發(fā)明提供含有至少一 個IgG Fc區(qū)的多肽，所述多肽與未純化抗體相比具有較高的抗炎活性和較低的細(xì)胞毒性 活性。在本發(fā)明的不同實施方式中，該多肽含有人類IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4Fc區(qū)，所 述多肽與非純化抗體相比，具有較高的唾液酸含量。
在另一方面，本發(fā)明提供一種藥物制劑，該制劑含有一種多肽和適當(dāng)?shù)妮d體或稀釋 齊U，該多肽含有至少一個Fc區(qū)，具有較高的抗炎活性以及較低的細(xì)胞毒性活性。
在還有另一方面，本發(fā)明提供制備含有至少一個Fc區(qū)的多肽的方法，所述多肽具有 比未純化抗體較高的抗炎活性和較低的細(xì)胞毒性活性，該方法包括提供含有至少一個 Fc區(qū)的非純化來源的多肽，該含有至少一個Fc區(qū)的非純化來源的多肽包含多個含有 至少一個帶唾液酸的Fc區(qū)的多肽，以及多個含有至少一個缺乏唾液酸的Fc區(qū)的多 肽；并且提高多個含有至少一個帶唾液酸的Fc區(qū)的多肽相對于多個含有至少一個缺 乏唾液酸的Fc區(qū)的多肽的比率。在本發(fā)明不同的實施方案中，該多個含有至少一個 帶唾液酸的Fc區(qū)的多肽相對于多個含有至少一個缺乏唾液酸的Fc區(qū)的多肽的比率 通過去除含有至少一個缺乏唾液酸的Fc區(qū)的多肽，或者通過唾液酸化含有至少一個 Fc區(qū)的非純化來源的多肽而實現(xiàn)。
附圖簡要說明


圖1表明6A6-IgG抗體同種型糖譜。用基體輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 (MALDI-T0F MS)分析來源于6A6-IgGl、 IgG2a和IgG2b的N-糖鏈。含有唾液酸殘基的 峰用方括號標(biāo)出。由瞬時轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞產(chǎn)生的重組6A6抗體轉(zhuǎn)換變異體(switch variant)在其Asn-297連接的糖中含有最低水平的唾液酸殘基。
圖2顯示唾液酸化降低IgG的細(xì)胞毒性。(A)附著在抗體Fc-片段中天冬酰胺 297(N297)上的充分加工的糖配基的結(jié)構(gòu)。粗體顯示核心糖結(jié)構(gòu)。諸如末端的和平分型的 糖的可變殘基加下劃線，并標(biāo)出特異的連接。也標(biāo)出糖酰胺酶和神經(jīng)氨酸酶的切割位點。 該充分加工的糖結(jié)構(gòu)在總血清IgG池(pool)中的大約占5。/。。 (1).縮略語GlcNAc=N-乙 酰氨基葡萄糖，man二甘露糖，gah半乳糖，s^唾液酸。(B)用西洋接骨木凝集素(SNA)親 和層析富集高唾液酸含量的6A6-IgGl和gG2b抗體。(C)富集唾液酸的(SA)或經(jīng)神經(jīng)氨酸 酶處理去除唾液酸的(NA)6A6-IgGl和-IgG2b抗體的體內(nèi)活性。各組小鼠分別注射4"g 每種抗體(^4，平均值+/-平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(3￡1\1)); *表示p〈0.0001， **表示p〈0.01。 (D) Fc Y RIIB、Fc Y RIII和Fc Y RIV結(jié)合帶有高水平或低水平唾液酸化的抗體的結(jié)合常數(shù) (Ka) ; n. b.表示沒有結(jié)合。粗體數(shù)字表示負(fù)責(zé)介導(dǎo)抗體體內(nèi)活性的同種型特異的Fc受體。 所有這些測定的標(biāo)準(zhǔn)差都低于5 %。
圖3表明抗體的體內(nèi)活性是由唾液酸調(diào)節(jié)的。6A6-IgGl通過SNA-瓊脂糖進行親和層 析以富集唾液酸。這種SNA-富集制備物的一部分用神經(jīng)氨酸酶處理(SNA-富集+神經(jīng)氨酸 酶)。(A)用SNA的凝集素印跡檢測抗體制備物中的唾液酸含量。(B)通過監(jiān)測由分別注射 4n g抗體制備物誘導(dǎo)的血小板減少檢測體內(nèi)抗體活性(n二4-5只小鼠每組)。
圖4說明IVIG的抗炎癥活性需要唾液酸。(A)用磷酸緩沖液(PBS) 、 IVIG，以及糖酰胺酶PNGaseF-處理的IVIG (PNGaseF IVIG)治療小鼠K/BxN血清-誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的臨床評 分。(B)除了如圖4(A)中顯示的治療之外，用神經(jīng)氨酸酶-處理的IVIG(NA IVIG)或SNA-富集的IVIG (SNA IVIG)治療小鼠。(C)用IVIG的Fc片段、神經(jīng)氨酸酶-處理的Fc (NA Fc)， 或SNA-富集的Fc (SNAFc)治療小鼠的臨床評分(^4，平均值+/_平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEM))。
(D) IVIG制備物的糖譜。顯示來自未處理的或神經(jīng)氨酸酶-處理的IVIG的N-糖鏈 MALDI-TOF-MS譜。含有唾液酸殘基的峰用方括號標(biāo)出，并且各峰的糖組成在圖5呈現(xiàn)。
(E) 代表性的用或不用SNA-富集的IVIG(O. 1克/千克)處理的對照小鼠或K/N誘導(dǎo)的關(guān)節(jié) 炎小鼠的踝關(guān)節(jié)蘇木精/伊紅染色。在IVIG-SNA(O. 1克/千克)治療小鼠中不存在K/N處 理小鼠中觀察到的廣泛的中性粒細(xì)胞浸潤。(F) IVIG的對照Fc片段、神經(jīng)氨酸酶-處理 的Fc (NA Fc)以及經(jīng)過西洋接骨木凝集素(SNA)親和層析處理的具有高唾液酸含量的Fc (SNA Fc)的凝集素印跡。(G) IVIG中2, 3和2， 6連接的唾液酸殘基的分析。IVIG不經(jīng)處 理(第2道)，或用特異作用于2，3連接的唾液酸殘基的神經(jīng)氨酸酶處理(第3道)，或 用特異作用于2， 3連接和2， 6連接的唾液酸殘基的神經(jīng)氨酸酶處理(第4道)。用SNA (其 識別2, 6連接的唾液酸殘基)和MAL-1 (其識別2， 3連接的唾液酸殘基)進行凝集素印跡以 檢測唾液酸的去除。用胎球蛋白(第l道)作為富含2，3連接的唾液酸殘基的糖蛋白對 照。考馬斯染色的膠作為上樣對照(考馬斯)。(H)減少2， 3或者2, 3和2, 6連接的唾液 酸殘基的IVIG的抗炎癥活性。小鼠注射KRN血清以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，未治療(KRN)，或者用 IVIG (薩+IVIG)、減少2, 3連接的唾液酸殘基的IVIG ( a 2-3唾液酸酶處理的IVIG +KRN) 或減少2, 3和2， 6連接的唾液酸殘基的IVIG ( a 2-3， 6唾液酸酶處理的IVIG +KRN)治療。 給小鼠注射PBS以作為陰性對照(未處理)。
圖5說明從IgG Fc的N297釋放的糖配基的組成。連接于抗體重鏈天冬酰胺殘基297 的核心糖結(jié)構(gòu)由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和甘露糖(Man)組成。個體的糖形隨著附著一 個或兩個末端的半乳糖(Gal)殘基，附著末端唾液酸-(人類中是N-乙酰神經(jīng)氨酸或 Neu5Ac，小鼠中是N-羥乙酰神經(jīng)氨酸或Neu5Gc)殘基，和/或附著平分型GlcNAc或巖藻 糖(Fuc)而變化。數(shù)字表示根據(jù)MALDI-TOFMS測定的不同糖組成的分子量。標(biāo)出人類和 鼠(加下劃線)的聚糖結(jié)構(gòu)的質(zhì)量。
圖6說明去唾液酸的IVIG的血清半衰期和蛋白質(zhì)完整性。(A)酶聯(lián)免疫吸附劑測定 (ELISA)檢測指定R期IVIG治療的小鼠血清中的人類IgG水平(N 二 4,平均值+/- SEM)。 IVIG和去唾液酸的IVIG的半衰期沒有顯著性差異。顯著性由重復(fù)測量的方差分析檢驗計 算。(B)在非-還原性條件下用8%聚丙烯酰胺凝膠通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 電泳(SDS-PAGE)分析IO微克IVIG或去唾液酸的IVIG，并用考馬斯亮藍(lán)染色。IVIG的 單體組成和結(jié)構(gòu)完整性未受神經(jīng)氨酸酶處理影響。
圖7說明SNA-富集的IVIG的血清半衰期和亞類組成。(A) ELISA檢測指定日期IVIG 治療的小鼠血清中的人類IgG水平^=4，平均值+/-SEM) 。 IVIG和SNA-富集的IVIG組分 的半衰期沒有顯著性差異。顯著性由重復(fù)測量的方差分析檢驗計算。(B) ELISA檢測未處理的和SNA-富集的IVIG中的IgG亞類。未觀察到差異。
圖8說明具有相似糖結(jié)構(gòu)的唾液酸化蛋白質(zhì)不能保護小鼠免患K/BxN血清誘導(dǎo)的關(guān) 節(jié)炎。在注射K/BxN血清前1小時施用等價摩爾數(shù)量(6. 7微摩爾/千克)或相同重量(1克 /千克)的IVIG或唾液酸蛋白胎球蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白，并在第4天檢測臨床評分(N = 4， 平均值+Z-SEM)。使用PBS作為額外的對照。與IgG相比，胎球蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白在等價摩 爾濃度時沒有具有統(tǒng)計學(xué)顯著性的抗炎癥作用。顯著性用曼-惠特尼(Mann-Whitney) U 檢驗計算。
圖9說明SNA富集的IVIG的抗炎癥活性需要Fc Y RIIB。 (A)未分級(unfractionated) 的IVIG (l克/千克小鼠體重)、SNA-富集的IVIG (0. 1克/千克小鼠體重)，或作為對照 的PBS在注射K/BxN血清前1小時注射Fc Y RIIB-缺陷的小鼠，在第4天檢測臨床評分(N=4， 平均值+/-SEM)。關(guān)節(jié)炎的臨床評分沒有顯著差異。顯著性用Mann-Whitney的U檢驗計 算。(B)用SNA-富集的IVIG體內(nèi)富集Fc YRIIB+的單核細(xì)胞。野生型小鼠注射1克/千克、 0. 1克/千克IVIG或0. 1克/千克SNA-富集的IVIG，或作為對照的PBS。注射后1天收集 骨髓(左圖)和脾細(xì)胞(右圖)并用流式細(xì)胞術(shù)分析(^4)。用1克/千克IVIG或0. 1克/千 克SNA-富集的IVIG治療后，F(xiàn)4/80+ Fc Y RIIB+細(xì)胞顯著地積累。顯著性用Student's t 檢驗計算。
圖10說明主動免疫導(dǎo)致IgG唾液酸化減少。(A)用西洋接骨木凝集素(SNA)進行印跡 (見方法)鑒定取自未處理的(免疫甜)或患有通過免疫綿羊IgG和腎毒性血清(NTS)誘導(dǎo)的 腎毒性腎炎(NTN)的小鼠的血清IgG中的唾液酸含量。(B)用光密度法對未處理小鼠以及 NTN小鼠中總血清IgG和IgM抗體以及綿羊IgG-特異的IgG抗體中唾液酸化水平定量(平 均值+Z-SEM)。在小鼠抗體制備物中不存在可檢測的綿羊IgG (數(shù)據(jù)未顯示)。(C)連接于 取自未處理小鼠或NTN小鼠的IgG抗體上的糖殘基的MALDI-TOF分析。含有唾液酸的部 分用方括號標(biāo)出。單個峰的詳細(xì)糖配基顯示于圖5。 (D)沉積于注射腎毒性血清，有 (NTS+CFA)或沒有(只有NTS)用混合在完全弗氏佐劑(CFA)中的綿羊IgG預(yù)先免疫的小鼠 的腎小球中抗體的唾液酸含量的檢測。
發(fā)明的詳細(xì)描述
本發(fā)明出乎意料地發(fā)現(xiàn)IgG Fc區(qū)的細(xì)胞毒性和抗炎癥反應(yīng)由Fc-連接的核心多糖不 同的唾液酸化而造成。IgG抗體的細(xì)胞毒性因唾液酸化而降低；相反地，IVIG的抗炎癥 活性增強。顯示IgG的唾液酸化由抗原-特異的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)調(diào)控，從而提供將IgG從 先天性的穩(wěn)定狀態(tài)的抗-炎癥分子轉(zhuǎn)變成抗原激發(fā)下的適應(yīng)性的促炎癥的種類的新手段。
因此，本發(fā)明提供產(chǎn)生和選取具有理想的細(xì)胞毒性和抗-炎癥潛能的IgG的具有優(yōu)勢 的策略。定義
貫穿本說明書與權(quán)利要求地，免疫球蛋白重鏈中殘基的編號是如Kabat等人，為疫 ,^天歪^^/^/"e( i/e/7ces (9/尸roto'/751 0//腳〃/7o/柳'ca7 /"terestA 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)的EU index 編號，其以參考文獻形式特別地并入本文。"如Kabat中的EU index"指人類IgGl EU抗 體的殘基編號。
術(shù)語"天然的"或"親本的"指含有Fc氨基酸序列的非修飾多肽。親本多肽可以包 含天然序列的Fc區(qū)，或帶有預(yù)先存在的氨基酸序列修飾(諸如加入、缺少和/或替換) 的Fc區(qū)。
術(shù)語"多肽"指任一含有至少一個IgGFc區(qū)的蛋白質(zhì)的片段，包括，但不限于，全 功能蛋白質(zhì)，諸如，例如抗體，例如，IgG抗體。
術(shù)語"Fc區(qū)"用于定義免疫球蛋白重鏈的C-末端區(qū)域。"Fc區(qū)"可以是天然序列 Fc區(qū)，或變異的Fc區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)的邊界可能各有不同，人類IgG重鏈 Fc區(qū)通常定義為從氨基酸殘基Cys226或Pro230延伸至其羧基端的區(qū)域。
人類IgG Fc區(qū)的"CH2區(qū)"(也被稱為"Cy2"區(qū))通常從氨基酸231延伸至約氨基 酸340。 CH2區(qū)的獨特之處在于其與另一個區(qū)并不緊密地配對。更確切地說，完整的天然 IgG分子的兩個CH2區(qū)之間插著兩個N-連接的分支糖鏈。推測糖可以提供用于區(qū)-區(qū)配對 的替代物，并協(xié)助穩(wěn)定CH2區(qū)(Burton, #W i/z冊i/朋7， 22， 161- 206 (1985)，其以參考 文獻形式并入本文)。
"CH3區(qū)"包含F(xiàn)c區(qū)中從C-末端延伸至CH2區(qū)的殘基(g卩，從IgG的氨基酸殘基341 至氨基酸殘基447)。
術(shù)i吾"鉸鏈區(qū)"在人類IgGl中通常定義為Glu216延伸至Pro230 (Burton(1985))。 其他IgG同種型的鉸鏈區(qū)可以通過設(shè)定在同樣的位置形成重鏈間S—S鍵的第一個和最后 一個半胱氨酸殘基而與IgGl的序列匹配。
術(shù)語"結(jié)合域"指多肽中與其他分子結(jié)合的區(qū)域。對FcR而言，結(jié)合域可以包含其 多肽鏈負(fù)責(zé)結(jié)合Fc區(qū)的那一部分(例如，其a鏈)。 一個示例性的結(jié)合域是FcR鏈的 胞外區(qū)。
功能性"Fc區(qū)"擁有天然序列的Fc區(qū)的至少一部分"效應(yīng)器功能"。示例性的"效 應(yīng)器功能"包括Clq結(jié)合；補體依賴性細(xì)胞毒性作用；Fc受體結(jié)合；抗體-依賴性細(xì)胞介 導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);巨噬細(xì)胞吞噬；細(xì)胞表面受體下調(diào)(例如，B細(xì)胞受體；BCR)， 等等。這些效應(yīng)器功能通常需要Fc區(qū)與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，抗體的可變區(qū))結(jié)合，并且可 以用多種檢測來進行評定，例如，如本文公開的檢測。
"天然序列的Fc區(qū)"含有與自然界中發(fā)現(xiàn)的Fc區(qū)氨基酸序列相同的氨基酸序列。 如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的"變異的Fc區(qū)"含有憑借至少一個"氨基酸修飾"而與 天然序列Fc區(qū)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。優(yōu)選地，變異的Fc區(qū)與天然序列的Fc區(qū)或親本多肽(parent polyp印tide)的Fc區(qū)相比，含有至少一個氨基酸替換，例如， 天然序列的Fc區(qū)或親本多肽(parent polyp印tide)的Fc區(qū)中含有大約一個至大約十 個氨基酸替換，并且，優(yōu)選地，含有大約一個至大約五個氨基酸替換。本文中變異的Fc 區(qū)優(yōu)選擁有與天然序列Fc區(qū)和/或親本多肽Fc區(qū)至少約80%的同源性，并更優(yōu)選與其至 少90%同源性，更優(yōu)選與其至少95%同源性，甚至更加優(yōu)選地，與其至少99%同源性。
術(shù)語"改變的糖基化"指如上面所定義的多肽，可以是天然的或是修飾的，通過操 作使其附著在重鏈恒定區(qū)的糖增加或減少特定的糖組分。例如，多肽，諸如，舉例來說， 特定的細(xì)胞系中制備的抗體，諸如，舉例來說，Lec2或Lec3，可以在附著的糖部分中缺 乏諸如巖藻糖和唾液酸。
術(shù)語"Fc受體"或"FcR"用來描述結(jié)合于抗體Fc區(qū)的受體。在本發(fā)明的一個實施 方案中，F(xiàn)cR是人類FcR的天然序列。在另一個實施方案中，F(xiàn)cR，包括人類FcR，結(jié)合 于IgG抗體(y受體)并包括FcyR、 Fc yRII和Fc yRIII亞類的受體，包括這些受體的 等位基因變體和選擇性的剪切形式。FcyRII受體包括Fc . RIIA("激活性受體")和 FcyRIIB("抑制性受體")，二者的氨基酸序列相似，區(qū)別主要在于其胞漿區(qū)。激活性 受體FcyRIIA在其胞漿區(qū)含有免疫受體酪氨酸-依賴的激活模體(ITAM)。抑制性受體 FcYRIIB其胞漿區(qū)含有免疫受體酪氨酸-依賴的抑制模體(IT頂)。(參見Daron, ^7/Ji/ytey /腳u/ o7， 15， 203-234 (1997)的綜述；FcR的綜述見Ravetch和Kinet， 4/7/7〃 AfeK/腳w oJ, 9， 457-92 (1991); Capel等人.，/歷/腳et/w(/s， 4， 25-34 (1994);和de Haas等人.，/
6Vi" i/eo; 126, 330-41(1995)， Ni隱erjahn和Ravetch 2006, Ravetch Fc受體， 基礎(chǔ)免疫學(xué)，William Paul主編，第五版。以上皆以參考文獻形式并入本文。)
"抗體-依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用"和"ADCC"指細(xì)胞在體外或體內(nèi)介導(dǎo)的 反應(yīng)，其中表達(dá)FcR的細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如單核細(xì)胞，諸如天然殺傷(NK)細(xì)胞和巨噬細(xì) 胞)識別耙細(xì)胞上結(jié)合的抗體，并隨后導(dǎo)致耙細(xì)胞的裂解。原則上，可以觸發(fā)任何帶有 激活的FcYR的效應(yīng)器細(xì)胞以介導(dǎo)ADCC。 一種這樣的細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)FcYRIII， 而單核細(xì)胞，取決于其活化狀態(tài)、定位或分化，可以表達(dá)FcYRI、 FcyRII和FcYRIII。 Ravetch and Bolland, J/7/w 7fflff w o厶(2001)中總結(jié)了造血細(xì)胞上FcR的表達(dá)，其 以參考文獻形式并入本文。
"人類效應(yīng)器細(xì)胞"是表達(dá)一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。優(yōu)選地， 這些細(xì)胞表達(dá)至少一種激活的Fc受體，諸如，舉例來說，F(xiàn)cyRIII，并執(zhí)行ADCC效應(yīng) 器功能。介導(dǎo)ADCC的人類白細(xì)胞的實例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、 單核細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞，其中優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)器細(xì)胞可以從其天然來源中 分離，例如，從如本文描述的血液或PBMC中。
術(shù)語"抗體"使用其最寬泛的含義，并特別包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、 多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，以及抗體片段，只要他們呈現(xiàn)期望 的生物活性。術(shù)語抗體的"唾液酸含量"既指抗體重鏈Fc區(qū)中唾液酸殘基的總量，也指在非純化 抗體制備物中唾液酸化抗體與非唾液酸化抗體的比例，除非該術(shù)語在上下文中明確地提 示意指另一種含義。
為了本發(fā)明所定義的"抗體片段"包含完整抗體的一部分，通常包括完整抗體的抗 原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)，或者保留FcR結(jié)合能力的抗體的Fc區(qū)?？贵w片段的實例包括線性抗 體；單-鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體?？贵w片段優(yōu)選保留IgG重鏈 的至少部分鉸鏈區(qū)并且可選地，CHI區(qū)。更優(yōu)選地，抗體片段保留IgG重鏈的全部恒定區(qū)， 并包括IgG輕鏈。
本發(fā)明使用的術(shù)語"單克隆抗體"指從基本同質(zhì)的抗體群中獲得的一種抗體，艮P， 即構(gòu)成該群抗體的單個抗體是相同的，除了可以少量存在的可能自然發(fā)生的變異。單克 隆抗體具有高度特異性，針對單一抗原位點。并且，與典型地包含針對不同決定簇(表位) 的不同抗體的傳統(tǒng)的(多克隆)抗體制備物相比，每一種單克隆抗體針對抗原上的單一決 定簇。修飾語"單克隆的"指從基本同質(zhì)的抗體群中獲得的抗體的特征，而不能解釋為 需要通過任何特別的方法來制備該抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過 由Kohler和Milstein, 7fetwre, 256， 495-497 (1975)首次描述的并以參考文獻形式并 入本文的雜交瘤方法制備，或可以通過重組DNA方法(見美國專利號4,816，567，其以參 考文獻形式并入本文)制備。單克隆抗體也可以使用在例如分別以參考文獻形式并入本文 的Clackson等人.，淑〃re, 352, 624-628 (1991)和Marks等人.，/ ifo/ ^W， 222, 581-597 (1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離。
在本發(fā)明的其他實施方式中，含有至少一個IgGFc區(qū)的多肽可以與其他的蛋白質(zhì)片 段融合，包括，但不限于，全蛋白。許多蛋白質(zhì)可以與本發(fā)明的多肽融合，包括，但不 限于，其他免疫球蛋白，特別是，缺少Fc區(qū)的免疫球蛋白；這些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將 可以毋庸置疑地領(lǐng)會。作為選擇，其他的生物活性蛋白質(zhì)或其片段可以與本發(fā)明的多肽 融合，例如，如美國專利6,660,843中所描述的，其以參考文獻形式并入本文。該實施 方式特別有利于這些生物活性蛋白質(zhì)或其片段對于表達(dá)Fc受體的細(xì)胞的遞送。進一歩地， 可以使用不同的標(biāo)記，諸如，舉例來說，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽或綠色熒光蛋白， 或GFP。
本文中的單克隆抗體特別包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其重鏈和/或輕鏈的一部
分與來源于特定種屬或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體的對應(yīng)序列相同或同源，同時鏈 上的其余序列與來源于另一種屬或?qū)儆诹硪环N類或亞類的抗體的對應(yīng)序列相同或同源，
此外還指這些抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物活性(見美國專利4,816,567; Morrison等人.，尸roc 〃a〃 Jcs^ 5bi 〃5^, 81, 6851-6855 (1984); Neuberger等人.， yVat"re, 312， 604-608 (1984); Takeda等人.，/fe&re, 314， 452-454 (1985);國際 專利申請PCT/GB85/00392，其分別以參考文獻形式并入本文。)
非人類(例如，鼠的)抗體的"人源化"形式指含有最少序列的來源于非人類免疫球蛋白的嵌合抗體。在大多數(shù)情況下，人源化抗體是人類免疫球蛋白(受者抗體)，其中， 來自受者高變區(qū)的殘基被具有所需的特異性、親和力和容量的來自諸如小鼠、大鼠、兔 或非人靈長類的非人類種屬(供著抗體)的高變區(qū)的殘基取代。在一些情況下，人類免 疫球蛋白的Fv骨架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人類殘基取代。此外，人源化抗體可以含有既 不存在于受者抗體中，也不存在于供者抗體中的殘基。這些修飾進一步優(yōu)化抗體的性能。 通常，人源化抗體包含至少一個，通常是兩個可變區(qū)的幾乎所有部分，其中所有或幾乎 所有的高變環(huán)對應(yīng)非人類免疫球蛋白的高變環(huán)區(qū)，并且所有或幾乎所有FR殘基是人類免 疫球蛋白序列的FR殘基。人源化抗體也可以任選的含有免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一 部分，通常是人類免疫球蛋白的序列。進一步的細(xì)節(jié)見Jones等人.，泡tore， 321， 522-525(1986); Riechma皿等人.，7fef〃re， 332， 323-329 (1988); Presta， Qo Str""折o/, 2, 593-596 (1992);美國專利5， 225， 539，其分別以參考文獻形式并入本 文。
含有至少一個IgG Fc區(qū)的多肽包括那些通過利用重組DNA技術(shù)以修飾編碼重鏈恒定 區(qū)的基因?qū)⑻囟ò被崽鎿Q、插入或缺失引入親本序列的多肽。這些修飾的引入采用如 諸如分子克隆(Sambrook和Russel， (2001))的操作手冊中所描述的分子生物學(xué)中的廣 為采用的技術(shù)。此外，至少一個IgGFc區(qū)的多肽可以包括那些被選擇具有特定的糖修飾 的的多肽，這些多肽可以通過在已知糖基化特異性的細(xì)胞系中表達(dá)而獲得(Stanley P., 等人.，67/cM&A^7， 6， 695-9 (1996); Weikert S.,等人.，船"/re fo'otec/moA^.K, 17, 1116—1121 (1999); Andresen DC禾Q Kru酬en L. ， C"iT"e/ ^ Q9i/ /cw i/ i ic^ec力/ oJci《K' 13， 117-123 (2002))，或者通過在特異的凝集素上的富集或消耗，或者酶處理而獲得 (Hirabayashi等人.，/ CAro/agJ/ s7/t JecAooZ 5io歷e(^ yLi/e 5"ci， 771, 67—87 (2002); Robertson和Kennedy, A'osepara"o/ , 6, 1-15 (1996))。抗體糖基化的質(zhì)量 和程度根據(jù)細(xì)胞的類型和培養(yǎng)的條件的不同而有所差異，這在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。(舉例 來說，Patel等人.，5ioc力柳乂 285, 839-845 (1992)報道如果抗體以腹水的形式，或 在無血清或含血清的培養(yǎng)基中產(chǎn)生，則連接于抗體的糖側(cè)鏈中的唾液酸含量會有很大的 差別。此外，Kunkel等人.，A'otec力/ W /^o私16， 462-470 (2000)顯示使用用于細(xì)胞 生長的不同的生物反應(yīng)器，以及培養(yǎng)基中溶解氧的量都會影響連接于抗體的糖配基中半 乳糖和唾液酸的數(shù)量。然而，這些研究并沒有指出不同水平的唾液酸殘基如何影響抗體 的體內(nèi)活性。
宿主表達(dá)系統(tǒng)
本發(fā)明的多肽可以在宿主表達(dá)系統(tǒng)，即，可以進行N-連接的糖基化的宿主細(xì)胞中表 達(dá)。典型地，該宿主表達(dá)系統(tǒng)可以包含真菌、植物、脊椎動物或無脊椎動物表達(dá)系統(tǒng)。 在一個實施方式中，宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，諸如中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞系，(例如 CH0—Kl; ATCC CCL-61)，綠猴細(xì)胞系(COS)(例如COS 1 (ATCC CRL-1650) ， COS 7 (ATCCCRL-1651));小鼠細(xì)胞(例如NS/0)，幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞系(例如ATCCCRL-1632或ATCC CCL-IO)，或人類細(xì)胞(例如HEK293(ATCCCRL-1573))，或任何其他合適的細(xì)胞系，例如， 可以從諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(羅克維爾，馬里蘭州，Rockville， Md.)的公眾 保藏中心獲得的細(xì)胞系，諸如鱗翅目細(xì)胞系的昆蟲細(xì)胞系，例如Sf9;植物細(xì)胞系；真菌 細(xì)胞系，例如酵母諸如，舉例來說，釀酒酵母、畢赤酵母、漢遜酵母。本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員可以領(lǐng)會，在一些情況下，宿主細(xì)胞的修飾可能需要保證產(chǎn)生N-連接的糖基化和聚 糖成熟以造成通常在人類IgG的Fc區(qū)中出現(xiàn)的復(fù)雜的，二天線糖(biante皿ary sugar)。 (見例如Hamilton, SR，等人.5，ci朋ce, 313,1441 (2006); Li， H，等人.，〃store ^'otec/ / t^Qgr 24, 210 (2006); Wildt， S禾卩 Grengross, TU 〃store yfew'e^ 臉raZ^W柳3, 119 (2005)。)
治療性第(J齊U (Therapeutic Formulation)
治療性制劑含有具有所需純度的含有至少包含一個Fc區(qū)的本發(fā)明的多肽，可以通過 與可選的生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(見，例如，雷氏藥學(xué)大全，16版，Osol， A. Ed. (1980))混合，并以凍干制劑或水溶液的形式制備用于貯存?？山邮艿妮d體、賦 形劑或穩(wěn)定劑在使用的劑量和濃度對受者無毒，并包括緩沖液諸如磷酸、檸檬酸以及其 他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基芐基氯化銨； 氯化六烴季銨；苯扎氯銨；石炭酸、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯諸如對羥基苯 甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；雷瑣辛；環(huán)己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量 (少于約10個殘基)的多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合 物諸如聚乙烯吡咯垸酮；氨基酸諸如甘氨酸、谷氨酰氨、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸， 或賴氨酸；單糖、雙糖，或其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖，或糊精；螯合劑諸如 乙二胺四乙酸；糖諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子諸如鈉離子；金屬 復(fù)合物(例如，Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非-離子型表面活性劑，諸如TWEEN ， PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。
本文的制劑也包含超過一種對于治療的特定的適應(yīng)癥必要的活性化合物，優(yōu)選那些 具有對彼此不造成相反影響的互補活性的化合物。這類分子適合以對預(yù)期目標(biāo)有效的數(shù) 量聯(lián)合使用。
活性成分也可以，例如，通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合，包裹于制備的微膠囊中， 舉例來說，分別處于膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒 和納米膠囊)或在粗乳狀液中的羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚甲基丙烯酸甲酯微膠 囊。這些技術(shù)公布于雷氏藥學(xué)大全，16版，A. Ed. (1980)。
在優(yōu)選的實施方案中，將在體內(nèi)施用的該制劑是無菌的。本發(fā)明的配方可以很容易 地滅菌，例如，經(jīng)通過無菌的過濾膜而過濾除菌。
也可以制備緩釋的制備物。緩釋制備物的合適的實例包括含有修飾的抗體的固態(tài)疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)以有形物體的形式存在，例如，薄膜或微膠囊。緩釋 基質(zhì)的實例包括聚酯類、水凝膠類(例如，聚(甲基丙烯酸-2-羥乙酯)，或聚(乙烯醇))， 聚乳酸類(見，例如，美國專利3， 773， 919) ， L-谷氨酸和L-谷氨酸-y乙基酯的共聚物， 不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPR0N DEPOT (由乳 酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射的微球)，和多聚-D-(-)-3-羥基丁酸。諸 如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的多聚物能夠釋放分子超過100天，而某些水凝膠釋 放蛋白的時間比之較短。當(dāng)裝入膠囊的抗體在體內(nèi)長時間維持時，他們可能因為暴露于 37。C的水分中而變性或者聚集，因此導(dǎo)致其生物活性的損失以及可能的免疫原性的改變。 根據(jù)涉及的機理，可以設(shè)計合理的策略以穩(wěn)定之。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集的原理是通過硫 代-二硫交換的分子間S—S鍵的形成，則可以通過修飾巰基殘基、在酸性溶液中凍干、 控制含水量、使用合適的添加劑，以及開發(fā)特異的多聚物基質(zhì)組分而實現(xiàn)穩(wěn)定化。
產(chǎn)生含有至少一個IgG Fc區(qū)的唾液酸化的多肽
可以進一歩地純化或修飾本發(fā)明的多肽，使其與未修飾的和/或未純化的抗體相比， 具有提高的唾液酸數(shù)量。存在多種方法達(dá)到這個目標(biāo)。在一種方法中，非純化來源的多 肽，諸如，舉例來說，將常規(guī)地從中純化IVIG的含有IgG的血漿組分通過帶有已知可以 結(jié)合唾液酸的凝集素的柱子。在一個實施方式中，凝集素分離自西洋接骨木。于是，含 有至少一個IgG Fc區(qū)的多肽的唾液酸化組分將保留在柱子上，而非唾液酸化的組分則流 過柱子。含有至少一個IgGFc區(qū)的多肽的唾液酸化組分可以用不同的嚴(yán)謹(jǐn)條件的另一次 洗脫洗下。因此，獲得其唾液酸含量與正常含量相比提高的本發(fā)明的多肽制備物是可能 的。另外，可以如，例如，在美國專利20060030521中描述的，用唾液酸轉(zhuǎn)移酶和供體 唾液酸進行酶促反應(yīng)。
在要求保護的方法中使用的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的合適的非限制性示例是ST3Gal III,其 也被稱為a-(2,3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.99,6)，以及a-(2， 6)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.99.1)。 a-(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶催化唾液酸轉(zhuǎn)移至半乳糖-e-1，3-N乙酰葡萄糖胺 (Gal-e-1,3GlcNAc)或半乳糖-e-1，3-N乙酰葡萄糖胺(Gal-P-1, 4GlcNAc)糖苷的半 乳糖(Gal)(見，例如，Wen等人.，/ ^'o丄67 e瓜267: 21011 (1992); Van den Ei jnden 等人.，/. C/ e瓜256: 3159 (1991))，并負(fù)責(zé)糖肽中天冬酰胺-連接的寡糖的唾
液酸化。唾液酸連接到Gal上，在兩個糖之間形成a連接。糖之間的鍵合(連接)發(fā)生于 N乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的2-位和Gal的3-位。已知這種特定的酶可以分離自大鼠肝臟 (Weinstein等人.，/,腸義C力e瓜257: 13845 (1982));人類cDNA(Sasaki等人.(1993) / 5io丄268: 22782—22787; Kitagawa & Paulson (1994) /. 5A 丄C力e瓜269: 1394-1401)和基因組的(Kitagawa等人.(1996) /. &'。丄C力e瓜271: 931-938) DNA序列， 這使得以重組表達(dá)的方式生產(chǎn)該酶變得很容易。
a-(2，6)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的活性造成6-唾液酸化的寡糖，包括6-唾液酸化半乳糖。名稱"a-(2，6)唾液酸轉(zhuǎn)移酶"指將唾液酸連接到受體多糖第六個原子上的唾液酸轉(zhuǎn)移酶 家族。從不同的組織中可以分離出不同的a-(2，6)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的形式。例如，這種酶 的一種特異的形式，ST6Gal 11，可以分離自腦和胎兒組織。Krzewinski-Recchi等人，^/r. / &'oc/ em 270, 950 (2003)。
另外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以領(lǐng)會，可以利用細(xì)胞培養(yǎng)條件來改變唾液酸化的水 平。例如，為了提高唾液酸含量，會減少產(chǎn)率，并通常將滲透壓維持在適于特定宿主細(xì) 胞培養(yǎng)的下邊界。在從約250毫滲量(m0sm)至約450毫滲量范圍內(nèi)的滲透壓適于提高唾液 酸含量。在例如，美國專利6，656,466中描述了該條件以及另一個適宜的細(xì)胞培養(yǎng)條件。 Patel等人.，^'oc/ 柳乂 285， 839-845 (1992)報道如果抗體以腹水的形式，或在無 血清或含血清的培養(yǎng)基中產(chǎn)生，則連接于抗體的糖側(cè)鏈中的唾液酸含量會有很大的差別。 此外，Kunkel等人.，份otec/ /j^尸rog, 16， 462-470 (2000)顯示使用用于細(xì)胞生長的 不同的生物反應(yīng)器，以及培養(yǎng)基中溶解氧的數(shù)量都會影響連接于抗體的糖配基中半乳糖 和唾液酸的數(shù)量。
在另一個實施方式中，宿主細(xì)胞，諸如，舉例來說，永生化的人類胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞， 可以通過引入編碼唾液酸轉(zhuǎn)移酶諸如，舉例來說，a -2， 3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶或a-2, 6_唾液 酸轉(zhuǎn)移酶的核酸修飾，可操作地與啟動子連接，諸如，舉例來說，CMV啟動子。a-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以是人a-2, 3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，或稱為SIAT4C或STZ (GenBank登錄號 L23767)，以及，舉例來說，如美國專利20050181359中描述的序列。
編碼唾液酸轉(zhuǎn)移酶的核酸可以用任一本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的方法引入宿主細(xì) 胞。合適的引入外源性核酸序列的方法也描述于Sambrook和Russel，分子克隆實驗室 手冊(第三版)，冷泉港出版社，NY， 2000。這些方法包括，但不局限于，物理轉(zhuǎn)移技術(shù)， 諸如，舉例來說，顯微注射或電穿孔；轉(zhuǎn)染，諸如，舉例來說，磷酸鈣轉(zhuǎn)染；膜融合轉(zhuǎn) 移，使用，例如，脂質(zhì)體；以及病毒轉(zhuǎn)移，諸如，舉例來說，使用DNA或逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體的轉(zhuǎn)移。
含有至少一個IgGFc區(qū)的多肽可以從培養(yǎng)上清中回收，并且，如果需要的話，可以 經(jīng)過一個或多個純化歩驟，諸如，舉例來說，離子交換或親和層析。合適的純化方法對 于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以領(lǐng)會，上面公開的唾液酸化方法的不同組合可以導(dǎo)致產(chǎn)生 出具有特別高的唾液酸化水平的含有至少一個IgGFc區(qū)的多肽。例如，如上面所描述的， 可以在過表達(dá)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的宿主細(xì)胞中表達(dá)含有至少一個IgG Fc區(qū)的多肽，并且隨后 通過，例如在酶促反應(yīng)中使這些多肽唾液酸化，然后利用含有凝集素的柱子進行親和層 析來進一步富集這些多肽的唾液酸化的組分。相似地，對于含有至少一個IgGFc區(qū)的多 肽的IVIG來源也可以使用酶促反應(yīng)緊接親和層析。
為了檢測含有至少一個IgG Fc區(qū)的多肽的糖基化程度，可以純化這些多肽并在還原 條件下進行SDS-PAGE分析。可以通過將分離的多肽與特異的親和素發(fā)生相互作用鑒定糖基化，或者，可選擇地，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以領(lǐng)會的，可以用HPLC接連質(zhì)譜以鑒 定糖形。(Wormald， MR等人，腸c力柳36:1370 (1997))。
為了更詳細(xì)地描述本發(fā)明，以下給出幾個示例性的實施例。
實施例
實施例1.提高唾液酸含量的IVIG呈現(xiàn)降低的細(xì)胞毒性
為了檢測IgG特異的糖形是否參與調(diào)節(jié)抗體的效應(yīng)器功能，研究了特異的Asn297-連接糖在介導(dǎo)特定的IgG單克隆抗體的細(xì)胞毒性中的作用。用質(zhì)譜分析檢測來源于6A6 雜交瘤的抗血小板抗體的特異性糖組成和結(jié)構(gòu)(圖1)，如前面Nitnmerjahn等人在 Immunity 23， 41 (2005)中描述的，該抗體由293細(xì)胞表達(dá)，為IgGl 2a或2b轉(zhuǎn)換變異 體。這些抗體含有最少的唾液酸殘基。通過西洋接骨木凝集素親和層析富集含有唾液酸 的種類收獲唾液酸含量富集60-80倍的抗體圖2B和圖3)。唾液酸化和非唾液酸化的 6A6- IgGl和2b抗體介導(dǎo)血小板清除的能力的對比顯示，抗體的唾液酸化與其體內(nèi)活性 呈負(fù)相關(guān)。6A6 IgG抗體的唾液酸化造成其生物活性下降40-80。/。(圖2C和圖3)。
為了確定這種活性下降的機制，進行這些抗體針對每一種小鼠FcYRs以及其同源抗 原的表面等離子體共振結(jié)合試驗。
根據(jù)Ni誦er jahn和Ravetch， 5bie/ ce 310, 1510 (2005)中的描述進行表面等離子 體共振分析。簡言之，將其糖側(cè)鏈上含有高或低水平的唾液酸殘基的6A6抗體變異體固 定于CM5傳感芯片表面。室溫下通過流通池(flow cells)以流速30 u 1/分鐘注入在HBS-EP 運行緩沖液(10mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7. 4， 150 raM NaCl, 3. 4 mM EDTA，以及0. 005% 的表面活性劑P20)中不同濃度的可溶性的Fc y -受體。可溶性Fc-受體注入3分鐘，觀察 結(jié)合的分子解離7分鐘。對于對照流通池的背景結(jié)合被自動扣除。進行對照試驗以排除 傳質(zhì)限制。利用對結(jié)合相和解離相的感應(yīng)圖的同時擬合以及對組中所有的曲線的整體擬 合，從感應(yīng)圖數(shù)據(jù)中得到親和常數(shù)。l:l朗格繆爾(Langt皿ir)結(jié)合模型密切擬合觀察 到的感應(yīng)圖數(shù)據(jù)，在所有試驗中都使用此模型。
觀察到這些抗體的唾液酸化形式對其相應(yīng)的活化FcyR的親和力與其非相應(yīng)的唾液 酸化形式相比降低5-10倍，而未觀察到二者對抗原的親和力的差別(圖2D)。因此，IgG 的Asn297連接的糖鏈結(jié)構(gòu)的唾液酸化造成其對于亞類-限制的活化Fc YR的親和力降低并 因而降低其體內(nèi)細(xì)胞毒性。
為了確定觀察到的N-連接糖的唾液酸化參與調(diào)節(jié)其體內(nèi)抗炎癥活性的一般性，進一 步研究了 N-連接糖在IVIG抗炎癥活性中的作用。用從5-10, 000位供體的血清池中純化 的IgG組分，以高劑量(l-2克/千克)靜脈施用來治療炎癥性疾病，是廣為采用的治療方 法。Dwyer, N. ￡>^丄,326， 107 (1992).該抗炎癥活性是Fc片段的特性，并且 在特發(fā)性血小板減少性紫癲(ITP)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)以及腎毒性腎炎小鼠模型中具 有保護性。Imbach等人.，力a/ cet 二 1228 (1981)， Samuelsson等人.，5We/ ce 291，484 (2001)， Bruhns等人.，i"鵬朋yt/18, 573 (2003)， Kaneko等人.，,#ed 203， 789 (2006)。
提出的這種抗炎癥活性的一個共有機制涉及效應(yīng)器巨噬細(xì)胞上抑制性FcYRIIB分子 表面表達(dá)的誘導(dǎo)，其因此提高細(xì)胞毒性IgG抗體或免疫復(fù)合物通過Fc y R觸發(fā)誘導(dǎo)效應(yīng) 器細(xì)胞響應(yīng)所需的閾值。Niramerjahn和Ravetch, 24, 19 (2006)。
實施例2. IVIG去唾液酸化降低其在小鼠關(guān)節(jié)炎模型中的抗炎癥效果 小鼠
C57BL/6和NOD小鼠購自Jackson實驗室(Bar Harbor, ME) 。 Fc y RIIB—A小鼠產(chǎn)生自 發(fā)明人所在的實驗室，并與C57BL/6背景回交12代。C57BL/6背景的KRNTCR轉(zhuǎn)基因小 鼠(K/B)為D. Mathis和C. Benoist (哈佛醫(yī)學(xué)院，波士頓，MA)惠贈，并與NOD小鼠繁 殖以產(chǎn)生K/BxN小鼠。在所有試驗中都使用8-IO周齡的雌性小鼠，并在洛克菲勒大學(xué)的 動物設(shè)施中維持。所有試驗都依照聯(lián)邦法律和機構(gòu)指南進行，并獲得洛克菲勒大學(xué)(紐 約，NY)的批準(zhǔn)。
抗體和可溶性Fc受體
由瞬時轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞制備6A6抗體的轉(zhuǎn)換變異體(switch variant),隨后根據(jù) Ni匿rjahn等人.，/卿脂化k 23, 41 (2005)禾口 Ni誦erjahn禾口 Ravetch, 6W置e 310， 1510 (2005)用蛋白G純化。用接骨木凝集素(SNA)瓊脂糖(Vector Laboratories, Burlingame, CA)進行凝集素親和層析以從這些抗體制備物中分離富含唾液酸的抗體變異 體。唾液酸含量的富集由凝集素印跡(見下)證實。人靜脈注射的免疫球蛋白(5。/。IVIG于 10%麥芽糖中，質(zhì)譜純化)購自O(shè)ctapharma (Hemdon, VA)。根據(jù)中的Kaneko Y.等人.， f早#ed 203 ，789 (2006)描述對IVIG進行消化。簡言之，IVIG用0. 5毫克/毫升木瓜 蛋白酶于37。C消化1小時，加入2. 5毫克/毫升碘代乙酰胺終止反應(yīng)。用HiPr印26/60 S-200HR柱(GE醫(yī)療集團，Piscataway, NJ)將得到的Fab片段和Fc片段與未-消化的IVIG 分離，隨后用蛋白G柱(GE醫(yī)療集團)和蛋白L柱(Pierce， Rockford， IL)純化Fc片段 和Fab片段。用抗-人IgG Fab或Fc-特異的抗體(Jackson I咖unoResearch， West Grove, PA)進行免疫印跡以檢測片段純度。得到的純度大于99%。F4/80抗體來自Serotec (Oxford, UK)。 Ly 17.2抗體來自Caltag (Burlingame, CA)。綿羊抗-腎小球基底膜(GBM)抗血清 (腎毒性血清，NTS)由M. P. Madaio (賓夕法尼亞大學(xué)，Philadelphia, PA)惠贈。C-水 端含有六組氨酸標(biāo)簽的可溶性Fc受體由瞬時轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞產(chǎn)生，并用鎳-氨基三乙酸 (Ni-NTA)瓊脂糖根據(jù)說明書(Qiagen)從細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化。
用神經(jīng)氨酸酶處理IVIG，用質(zhì)譜分析其制備物的組成和結(jié)構(gòu)。神經(jīng)氨酸酶處理后沒 有檢測到含殘留的唾液酸的寡糖(圖4D， F和5).隨后檢測IgG制備物保護小鼠免患由 被動輸入Kxn血清誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥的能力，該關(guān)節(jié)炎癥是IgG 1免疫復(fù)合物介導(dǎo)的炎癥 性疾病模型。用神經(jīng)氨酸酶去除唾液酸使得IVIG制備物在KxN血清誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中的保護效果喪失(Figure 4B， C, E)。這種活性的喪失不是因為非唾液酸化IgG血清半衰期 的降低(圖6A)，或是IgG單體組成或結(jié)構(gòu)完整性的改變(圖6B)所造成的。用糖苷酶去除 所有的聚糖得到相似的結(jié)果，且使得IVIG的體內(nèi)保護作用喪失(圖4A)。選擇性地去除 2，6唾液酸連接使IVIG活性喪失，而去除2，3唾液酸連接則沒有顯著的效果(圖4G， H)。
實施例3.具有富集的唾液酸含量的IVIG組分減輕小鼠關(guān)節(jié)炎模型中的炎癥 制備含有增加的唾液酸含量的IVIG
由于顯示IVIG的抗炎癥活性需要唾液酸，這種抗炎癥活性的高劑量(l克/千克)需求 的基礎(chǔ)可能是總IVIG制備物中有限的唾液酸化IgG濃度。在SNA-凝集素親和柱對IVIG 分級，以獲得富含唾液酸修飾的聚糖結(jié)構(gòu)的IgG分子。
在KxN血清輸入性關(guān)節(jié)炎模型上檢測富含唾液酸的部分對比于未分級IVIG的保護效 果。觀察到SNA-結(jié)合部分的保護效果增強10倍，以致0. 1克/千克SNA-富集的IVIG與1 克/千克未分級IVIG相比，獲得等效的保護結(jié)果(圖4B，C) 。 SNA富集部分IgG亞型血 清半衰期的分布和未分級的IVIG相當(dāng)(圖7A， B)。唾液酸化的效果是IgG特異的；諸如胎 球蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白的具有相似的二天線復(fù)雜糖結(jié)構(gòu)的唾液酸化的N-連接糖蛋白，與等摩 爾濃度的IgG相比，無統(tǒng)計學(xué)顯著性抗炎癥活性(圖8)。最后，唾液酸化IVIG制備物的 保護機制與非分級的IVIG相似，都依棘于FcyRIIB的表達(dá)并造成這種效應(yīng)器巨噬細(xì)胞 上的抑制性受體表達(dá)的增加(圖9)。
實施例4.帶有增加的唾液酸含量的IVIG的增強的抗炎癥性反應(yīng)由Fc區(qū)中N-連接糖的 唾液酸化介導(dǎo)
由于IVIG中的多克隆IgG在其輕鏈或重鏈可變區(qū)同樣可以含有唾液酸化的0連接和 N連接的糖，我們證實SNA富集的IgG制備物增加的抗-炎癥活性是由Fc中N-連接的糖 基化位點中增加的唾液酸化造成的。Fc片段產(chǎn)生自未分級的和SNA分級的IVIG，并檢測 其體內(nèi)活性。正如在完整的IgG中觀察到的，SNA-純化的Fc片段與產(chǎn)生自未分級的IVIG 的Fc片段相比，其體內(nèi)保護效果增強(圖4C)。相反，F(xiàn)ab片段在體內(nèi)試驗中則未呈現(xiàn)出 抗炎癥活性。因此，IVIG抗炎癥活性的高劑量需求可以歸因于在唾液酸化IgG總制備物 中的貢獻是微小的。通過唾液酸結(jié)合的凝集素層析富集這些組分因而可以提高其抗炎癥 活性。
這些使用IgG抗體被動免疫的結(jié)果表明，從促炎癥類型轉(zhuǎn)化為抗炎癥類型的能力受 Fc區(qū)中N-連接糖的唾液酸化程度影響。
實施例5.主動免疫應(yīng)答中存在IgG唾液酸化介導(dǎo)的抗炎活性的增強 患有肺出血-腎炎綜合征(Goodpasture癥)的小鼠模型
在此模型中，用綿羊IgG合用佐劑初次致敏小鼠，四天以后注射綿羊抗-小鼠腎小球基底膜制備物(腎毒性血清，NTS)。簡單地說，用200w g混于CFA中的綿羊IgG (Serotec 公司)腹腔預(yù)免疫小鼠，緊接著4天以后，每克體重靜脈注射2.5ulNTS血清。注射抗-腎小球基底膜(GBM)抗-血清4天后，收集未-處理對照小鼠的血液，用蛋白G(GE醫(yī)療 集團，普林斯頓，NJ)和通過在NHS-活化的s印harose柱(GE醫(yī)療集團，普林斯頓，NJ) 上共價偶聯(lián)綿羊IgG生成的s印harose結(jié)合的綿羊IgG柱進行親和層析以純化血清IgG。
預(yù)致敏隨后用NTS處理，可以誘導(dǎo)小鼠IgG2b抗-綿羊IgG抗體(神經(jīng)營養(yǎng)因子NTN 免疫的)。KanekoY.等人.， M，203:789 (2006)。小鼠IgG2b抗體與NTS抗體一 起沉積于腎小球中，并導(dǎo)致由IgG2b介導(dǎo)的浸潤巨噬細(xì)胞上Fc yRIV的活化所造成的急 性和重癥炎癥反應(yīng)。在不預(yù)致敏的情況下，沒有觀察到炎癥，表明小鼠IgG2b抗-綿羊IgG 抗體是該炎癥反應(yīng)的介質(zhì)。
為了檢測導(dǎo)致促炎癥IgG的主動免疫與唾液酸化的變化是否密切相關(guān)，通過SNA凝 集素結(jié)合鑒定取自預(yù)免疫小鼠以及NTS免疫小鼠的血清IgG和IgM的唾液酸含量、圖 IOA,B，C)。與未免疫對照相比，接受免疫的小鼠中總IgG唾液酸化平均降低40y。。該效應(yīng) 是IgG特異的，IgM的唾液酸化在免疫前與免疫后相同。這種唾液酸化的不同在分析小鼠 血清中綿羊特異的IgG組分時更加明顯，顯示與免疫前的IgG相比，唾液酸化降低50-60%。 (圖10B)
這些結(jié)果經(jīng)MALDI-TOF-MS分析而證實。單糖組成分析由加州大學(xué)圣地亞哥分校 (UCSD)糖技術(shù)核心資源中心(SanDiego， CA)完成。糖蛋白樣品經(jīng)SDS和2-巰基乙醇變 性，并經(jīng)糖苷酶PNGase F.消化。釋放出來的混合的N-聚糖經(jīng)反相HPLC和固相萃取純化， 繼而暴露的N-聚糖的羥基被甲基化。得到的糖衍生物再次經(jīng)反相HPLC純化，并用MALDI-TOF-MS分析
免疫前和免疫后IgG的分析證實N-糖結(jié)構(gòu)的改變對于末端的唾液酸配基是特異的 (圖IOC)。先甜顯示負(fù)責(zé)征集(engagement)帶有Fc y RIV的浸潤性巨噬細(xì)胞的，沉積于腎 小球的小鼠IgG2b抗-綿羊抗體呈現(xiàn)與預(yù)免疫對照相比降低的唾液酸含量(圖10D)。
本文中所引用的所有專利的和非專利的出版物都并入本文，其引用程度如同每個專 利的和非專利的出版物以參考其全文的方式并入本文。另外，盡管本發(fā)明參考特定的實 施例和實施方式而描述，應(yīng)理解為這些實施例和實施方式僅僅是本發(fā)明的原理和應(yīng)用的 例證。因此應(yīng)理解可以對于示例性的實施方式進行大量的修飾，并且可以設(shè)計其他的安 排而不偏離如下面的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的主旨和范圍。
權(quán)利要求
1. 含有至少一個IgG Fc區(qū)的多肽，該多肽與未純化抗體相比具有較高的抗炎癥活性和較低的細(xì)胞毒性活性。
2. 如權(quán)利要求l所述的多肽，其包含人類IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4的Fc區(qū)，該多肽與未純化抗體相比具有較高含量的唾液酸。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的多肽，其在體外具有增強的抗炎癥活性。
4. 如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的多肽，其在體內(nèi)具有增強的抗炎癥活性。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的多肽，其由天然的抗體來源衍生而來。
6. 如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的多肽，其由重組的抗體來源衍生而來。
7. 如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的多肽，其與未修飾的抗體相比具有較 高百分比的唾液酸含量，其中所述未修飾的抗體含有IVIG。
8. 如權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述的抗體，其來源于具有增強的蛋白質(zhì)唾 液酸活性的細(xì)胞株。
9. 如權(quán)利要求1-8中任一權(quán)利要求所述的抗體，其通過用唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理而 修飾。
10. 如權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的抗體，其是經(jīng)過純化的。
11. 一種藥物制劑，含有權(quán)利要求i-io中任一權(quán)利要求所述的抗體和合適的載 體或稀釋劑。
12. 含有至少一個Fc區(qū)的多肽的制備方法，所述多肽與未純化抗體相比具有較 高的抗炎癥活性和較低的細(xì)胞毒性，該方法包括提供含有至少一個Fc區(qū)的非純化來源的多肽，所述含有至少一個Fc區(qū)的非純 化來源的多肽包含多個含有至少一個帶唾液酸的Fc區(qū)的多肽，以及多個含有至少一 個缺乏唾液酸的Fc區(qū)的多肽；并且提高多個含有至少一個帶唾液酸的Fc區(qū)的多肽相對于多個含有至少一個缺乏 唾液酸的Fc區(qū)的多肽的比率。
13. 如權(quán)利要求12所述方法，其中所述非純化來源的多肽含有至少一個包含人 類非純化IgG抗體的Fc區(qū)。
14. 如權(quán)利要求12或13所述的方法，其中含有至少一個Fc區(qū)的非純化來源的 多肽由在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)含有核酸序列的載體而提供，其中所述核酸序列翻譯成 IgG抗體。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中表達(dá)系統(tǒng)含有能夠進行N-連接的糖基化 的修飾的宿主表達(dá)系統(tǒng)，其選自真菌、植物、脊椎動物和無脊椎動物表達(dá)系統(tǒng)，以 及其任一組合。
16. 如權(quán)利要求12-15中任一權(quán)利要求所述的方法，其中提高多個含有至少一 個帶唾液酸的Fc區(qū)的多肽相對于多個含有至少一個缺乏唾液酸的Fc區(qū)的多肽的比 率的步驟通過去除含有至少一個缺乏唾液酸的Fc區(qū)的多肽而實現(xiàn)。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述去除通過物理或化學(xué)方法實現(xiàn)。
18. 如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述去除通過選自HPLC、凝集素親 和層析、高PH陰離子交換層析，以及其任一組合的方'，實現(xiàn)。
19. 如權(quán)利要求12-18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中提高多個含有至少一 個帶唾液酸的Fc區(qū)的多肽相對于多個含有至少一個缺乏唾液酸的Fc區(qū)的多肽的比 率的歩驟通過富集所述含有至少一個Fc區(qū)的非純化來源的多肽而實現(xiàn)。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中富集通過選自HPLC、凝集素親和層析、 高pH陰離子交換層析，以及其任一組合的方法而實現(xiàn)。
21. 如權(quán)利要求19或20所述的方法，其中所述唾液酸化通過酶的化學(xué)反應(yīng)， 將唾液酸附加在含有至少一個Fc區(qū)的多肽中的附加的糖上而實現(xiàn)。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中酶是a-(2, 6)唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
全文摘要
本發(fā)明提供含有至少一個IgG Fc區(qū)的區(qū)域的多肽以及該多肽的制備方法，該多肽與未純化的抗體相比，含有較高的抗炎癥活性和較低的細(xì)胞毒性活性。
文檔編號C12P21/08GK101432301SQ200780015563
公開日2009年5月13日 申請日期2007年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月5日
發(fā)明者善藤金子, 尼莫雅恩·福克, 杰夫瑞·V·華弗治 申請人:洛克菲勒大學(xué)