專利名稱：：選擇高水平表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體的，本發(fā)明涉及用于對(duì)選擇高水平表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞進(jìn)行改進(jìn)的手段(means)和方法?？梢栽诙喾N宿主細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)用于廣泛的生物學(xué)和生物技術(shù)應(yīng)用，例如作為生物藥物。對(duì)于該目的，例如在這些蛋白質(zhì)具有某些翻譯后修飾例如糖基化時(shí)，優(yōu)選真核宿主細(xì)胞特別是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞用于表達(dá)許多蛋白質(zhì)。已經(jīng)充分建立了這類生產(chǎn)的方法，通常包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸(也被稱作"轉(zhuǎn)基因")。通常將轉(zhuǎn)基因連同可選擇標(biāo)記基因引入到前體細(xì)胞中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行可選擇標(biāo)記基因表達(dá)的選擇，對(duì)一個(gè)或者多個(gè)高水平表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)的克隆進(jìn)行鑒定并用于表達(dá)所感興趣的蛋白質(zhì)。選擇表達(dá)相對(duì)高水平期望蛋白質(zhì)的重組宿主細(xì)胞的方法是已知的(參見例如在WO2006/048459和US2006/0141577中的介紹)。國(guó)際申請(qǐng)PCT/EP2005/055794(公開為WO2006/048459)中公開了一種選擇表達(dá)高水平感興趣的多肽的宿主細(xì)胞的新理念，其中該國(guó)際申請(qǐng)是在本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)日之前提交，但在本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)日之后公開的。美國(guó)專利申請(qǐng)No.11/359,953(公開為US2006/0141577)和國(guó)際申請(qǐng)PCT/EP2007/051696公開了替換的方法，其中這兩份申請(qǐng)也是在本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)日之前提交，但在本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)日之后公開的。簡(jiǎn)言之，這些申請(qǐng)教導(dǎo)使用具有非ATG起始密碼子如GTG或TTG的編碼可選擇標(biāo)記多肽的序列。這達(dá)到了可以以高嚴(yán)格性選擇克隆，并用于獲得表達(dá)水平非常高的宿主細(xì)胞的克隆。本發(fā)明旨在提供進(jìn)一步改進(jìn)的途徑和方法用于選擇表達(dá)高水平感興趣蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。發(fā)明概述在本文中通過參照將申請(qǐng)PCT/EP2005/055794(WO2006/048459)，US11/359,953(US2006/0141577)和PCT/EP2007/051696的公開內(nèi)容整體并入。簡(jiǎn)言之，這些申請(qǐng)教導(dǎo)使用具有非ATG起始密碼子如GTG或TTG的編碼可選擇標(biāo)記多肽的序列。這達(dá)到了可以以高嚴(yán)格性選擇克隆，并用于獲得表達(dá)水平非常高的宿主細(xì)胞的克隆。本發(fā)明公開了具有GTG或TTG起始密碼子的改進(jìn)的可選擇標(biāo)記基因。例如，這些改進(jìn)的可選擇標(biāo)記基因可以用于在WO2006/048459和US2006/0141577中所公開的轉(zhuǎn)錄單位及其所使用的方法中。這獲得了進(jìn)一步改進(jìn)的高表達(dá)水平宿主細(xì)胞(的選擇)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種DNA分子，其包含編碼可選擇標(biāo)記多肽的開放閱讀框序列，其中所述編碼鏈中的所述DNA分子包含選自由a)GTG起始密碼子，和b)TTG起始密碼子所組成組的可選擇標(biāo)記多肽的翻譯起始序列；其中與編碼可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的原始開放閱讀框序列相比，編碼所述可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的開放閱讀框序列已經(jīng)被突變以替換其至少一半的CpG二核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)提供了針對(duì)選擇劑例如抗生素致死和/或生長(zhǎng)抑制效果的抗性。在某些實(shí)施方式中，可選擇標(biāo)記多肽提供了針對(duì)Zeocin或針對(duì)新霉素的抗性。本發(fā)明還提供了一種根據(jù)本發(fā)明的DNA分子，其中編碼所述可選擇標(biāo)記多肽的開放閱讀框是多順反子轉(zhuǎn)錄單位的一部分，其中所述多順反子轉(zhuǎn)錄單位還包含編碼感興趣的多肽的開放閱讀框序列。本發(fā)明還提供了一種包含這類DNA分子的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含在所述多順反子轉(zhuǎn)錄單位上游的啟動(dòng)子，以及優(yōu)選在所述多順反子轉(zhuǎn)錄單位的下游具有轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明還提供了包含根據(jù)本發(fā)明的DNA分子或表達(dá)盒的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)感興趣的多肽的方法，其包括培養(yǎng)包含本發(fā)明表達(dá)盒的宿主細(xì)胞，以及從所述表達(dá)盒表達(dá)所感興趣的多肽。圖1.在CHO-K1細(xì)胞中利用CpG含量減少的Zeocin抗性標(biāo)記物的結(jié)果。點(diǎn)表示單獨(dú)的數(shù)據(jù)點(diǎn)，線表示平均表達(dá)水平；垂直軸表示d2EGFP信號(hào)。詳細(xì)內(nèi)容參見實(shí)施例1。圖2.除在CHO-DG44細(xì)胞中外，與圖1相同。詳細(xì)內(nèi)容參見實(shí)施例1。圖3.使用具有不同突變的"貧CpG"的新霉素抗性標(biāo)記的結(jié)果。點(diǎn)表示單獨(dú)的數(shù)據(jù)點(diǎn)，線表示平均表達(dá)水平；垂直軸表示d2EGFP信號(hào)。詳細(xì)內(nèi)容參見實(shí)施例2。發(fā)明詳述術(shù)語(yǔ)"單順反子基因"被定義為能夠提供編碼一種多肽的RNA的基因。"多順反子轉(zhuǎn)錄單位"也被稱作多順反子基因，被定義為能提供編碼至少兩種多肽的RNA分子的基因。術(shù)語(yǔ)"雙順反子基因"被定義為能夠提供編碼兩種多肽的RNA分子的基因。因此，雙順反子基因包含在多順反子基因的定義內(nèi)。本文中所使用的"多肽"包含通過肽鍵連接的至少五個(gè)氨基酸，例如可以是蛋白質(zhì)或其一部分例如亞基。多肽可以包含翻譯后修飾例如糖基化。通常，術(shù)語(yǔ)多肽和蛋白質(zhì)在本文中是可以互換使用的。在本發(fā)明中所使用的"基因"或"轉(zhuǎn)錄單位"可以包括染色體DNA、cDNA、人工DNA及其組合等。"可操作地連接"是指允許所描述組分以期望的方式發(fā)揮功能的位置關(guān)系。因此，例如"可操作地連接"到順反子的啟動(dòng)子是以一種在與啟動(dòng)子兼容的條件下達(dá)到表達(dá)順反子的模式進(jìn)行連接。類似的，可操作地連接于順反子的IRES核苷酸序列，是以在與IRES兼容的條件下達(dá)到翻譯順反子的模式進(jìn)行連接。本發(fā)明的DNA分子可以以雙鏈DNA的形式存在，關(guān)于可選擇標(biāo)記多肽和感興趣的多肽，其具有編碼鏈和非編碼鏈，其中除了存在T替換U以外，所述編碼鏈具有與被翻譯的RNA相同的序列。因此，AUG起始密碼子是由編碼鏈中的ATG序列所編碼的，包含對(duì)應(yīng)RNA中AUG起始密碼子的該ATG序列的鏈被稱作DNA的編碼鏈。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，實(shí)際上起始密碼子或翻譯起始序列存在于RNA分子中，但是這些可以被等價(jià)地認(rèn)為包含在編碼這類RNA分子的DNA分子中；因此，除非以其他方式明確說明，無(wú)論在本發(fā)明中何處提到起始密碼子或翻譯起始序列，是為了包括除了在所述DNA分子的編碼鏈中存在T替換U外具有與RNA序列相同序列的相應(yīng)DNA分子，反之亦然。換句話說例如起始密碼子是RNA中的AUG序列，但在本發(fā)明中DNA編碼鏈中相應(yīng)的ATG序列也被稱作起始密碼子。同樣的還用于引用"符合閱讀框的"編碼序列，其意思是被翻譯成氨基酸的RNA分子中的三聯(lián)體(三個(gè)堿基)，但也被解釋成DNA分子的編碼鏈中相應(yīng)的三核苷酸序列。在本領(lǐng)域中翻譯起始序列通常被稱作"Kozak序列"，最佳的Kozak序列是RCCATGG，下劃線的是起始密碼子，R是嘌呤即A或G(參見KozakM，1986，1987,1989，1990，1997，2002)。因此，除了起始密碼子本身外，其背景特別是-31和+4位核苷酸是有關(guān)的，最佳的翻譯起始序列包括在最佳背景(即ATG之前即是RCC，之后即跟著G)中的最佳啟動(dòng)密碼子(即ATG)()。在存在Kozak序列時(shí)，核糖體翻譯最有效(參見KozakM，1986，1987，1989,19卯，1997，2002)。然而，在小比例事件中，核糖體識(shí)別并使用非最佳翻譯起始序列來(lái)起始翻譯。本發(fā)明利用該原理，能夠減少翻譯進(jìn)而表達(dá)可選擇標(biāo)記多肽的量，因此這被用于提高選擇系統(tǒng)的嚴(yán)格性。術(shù)語(yǔ)"選擇標(biāo)記"或"可選擇標(biāo)記"通常用于指可以直接或間接檢測(cè)其在細(xì)胞中存在的基因和/或蛋白質(zhì)，例如使選擇劑失活并保護(hù)宿主細(xì)胞免于藥物致死或生長(zhǎng)抑制作用的多肽(例如抗生素抗性基因和/或蛋白質(zhì))?？蛇x擇標(biāo)記多肽是本領(lǐng)域中公知的，并且在要獲得真核宿主細(xì)胞時(shí)被常規(guī)使用，WO2006/048459中提供了許多適當(dāng)?shù)目蛇x擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的某些例子。編碼這類可選擇標(biāo)記多肽的DNA序列是己知的，WO2006/048459提供了編碼可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的DNA野生型序列的某些例子(例如其中的圖15~21，通過參照并入本文中)。明顯的是也可以適當(dāng)使用可選擇標(biāo)記的突變體或衍生物，因此只要所述可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)仍然發(fā)揮功能，就包括在術(shù)語(yǔ)"可選擇標(biāo)記多肽"的范圍內(nèi)。例如還包括由于遺傳密碼冗余性而不改變所編碼蛋白質(zhì)的任何沉默突變。還包括其他導(dǎo)致保守氨基酸突變或其他突變的突變，只要所編碼的蛋白質(zhì)仍具有活性，該活性可以比指定序列所編碼野生型蛋白質(zhì)的活性低，或者可以不低于所指定序列所編碼野生型蛋白質(zhì)的活性。特別的，優(yōu)選所編碼的蛋白質(zhì)與由分別指定序列所編碼蛋白質(zhì)具有至少70%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少卯％，更加優(yōu)選至少95%的同一性?？梢酝ㄟ^常規(guī)的方法完成對(duì)可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)活性的測(cè)試。根據(jù)本發(fā)明的可選擇標(biāo)記多肽是由核酸編碼的蛋白質(zhì)，其中所述多肽功能上被用于選擇，例如由于其提供了對(duì)選擇劑例如抗生素的抗性。因此，如果使用抗生素作為選擇劑，則DNA編碼提供對(duì)所述選擇劑抗性的多肽，該多肽是可選擇標(biāo)記多肽。可選擇標(biāo)記多肽是由本發(fā)明的DNA所編碼的。根據(jù)本發(fā)明的可選擇標(biāo)記多肽必須在真核宿主細(xì)胞中有功能，因此能夠被選擇用于真核宿主細(xì)胞中。對(duì)于本發(fā)明適當(dāng)?shù)目蛇x擇標(biāo)記基因的例子是Zoecin和新霉素。其他適當(dāng)?shù)暮蜻x物包括例如殺稻瘟菌素、嘌呤霉素、博來(lái)霉素、潮霉素、DHFR、GS等(同樣參見WO2006/048459)。其他可以使用的可選擇標(biāo)記基因以及它們的選擇劑被列舉在例如美國(guó)專利5，561，053的表1中；還可以參見Kaufinan,MethodsinEnzymology，185:537-566(1990)，或者這些的綜述。術(shù)語(yǔ)"選擇"通常被定義為使用選擇標(biāo)記/可選擇標(biāo)記以及選擇劑以鑒定具有具體遺傳特征的宿主細(xì)胞(例如宿主細(xì)胞包含整合到其基因組上的轉(zhuǎn)基因)的過程。為了方便并且通常本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠接受，在許多出版物以及本文中，經(jīng)常講編碼對(duì)選擇劑抗性的基因和蛋白質(zhì)分別稱作"可選擇劑(抗性)基因"或"選擇劑(抗性)蛋白質(zhì)"，盡管正式名稱可能不同，例如編碼提供對(duì)新霉素(以及對(duì)G418和卡那霉素)抗性的蛋白質(zhì)的基因經(jīng)常被稱作新霉素(抗性)(或nec/)基因，而其正式名稱為氨基葡糖苷3，-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。WO2006/048459和US2006/0141577在優(yōu)選的實(shí)施方式中編碼可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的序列具有GTG起始密碼子，或者更優(yōu)選TTG起始密碼子。這達(dá)到了非常嚴(yán)格的選擇以及在所獲得的克隆中蛋白質(zhì)非常高水平的表達(dá)。在本發(fā)明中，通過降低其中CpG的含量對(duì)可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的編碼序列進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)，這達(dá)到了更高的嚴(yán)格性以及進(jìn)一步提高的表達(dá)水平。優(yōu)選，可選擇標(biāo)記多肽編碼鏈中的翻譯起始序列包含TTG起始密碼子。優(yōu)選GTG或TTG起始密碼子的側(cè)面是提供對(duì)非ATG序列相對(duì)好地識(shí)別為起始密碼子的序列，以便至少某些核糖體從這些起始密碼子開始翻譯，即翻譯起始序列優(yōu)選包含序列ACC[GTG或TTG起始密碼子]G或者GCC[GTG或TTG起始密碼子]G。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種DNA分子，其包含編碼可選擇標(biāo)記多肽的開放閱讀框序列，其中編碼鏈中的DNA分子包含選自由a)GTG起始密碼子和b)TTG起始密碼子所組成組的可選擇標(biāo)記多肽的翻譯起始序列；其中與編碼可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的原始開放閱讀框序列相比，編碼所述可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的開放閱讀框序列已經(jīng)被突變以替換至少10%的CpG二核苷酸(該序列中的所有"CG")。根據(jù)本發(fā)明，通過選擇可選擇標(biāo)記多肽的表達(dá)，這類DNA分子可以用于獲得表達(dá)高水平感興趣的多肽的真核宿主細(xì)胞。接著，或者同時(shí)，可以鑒定一種或者多種表達(dá)感興趣的多肽的宿主細(xì)胞，并進(jìn)一步用于表達(dá)高水平的感興趣的多肽。本文中顯示本發(fā)明可選擇標(biāo)記基因(即具有TTG或GTG起始密碼子)中CpG含量的降低能夠引起感興趣的多肽提高的表達(dá)，其中所述感興趣的多肽是從同樣翻譯出可選擇標(biāo)記多肽的多順反子轉(zhuǎn)錄單位中翻譯的。不希望受到理論的限制，相信，CpG含量的降低可以降低轉(zhuǎn)錄沉默的可能性，因?yàn)樵谡婧思?xì)胞中CpG二核苷酸能夠被甲基化并沉默。具有相對(duì)高CpG含量的基因所編碼的可選擇標(biāo)記多肽通常來(lái)自細(xì)菌序列，例如Zeocin和新霉素可以最大受益于CpG含量的降低，盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有相對(duì)低CpG含量的選擇基因的某些益處。在某些實(shí)施方式中，從編碼可選擇標(biāo)記多肽的序列中除去CpG二核苷酸而不改變所編碼的氨基酸序列。可以通過利用遺傳密碼子的冗余性完成這一點(diǎn)，并且對(duì)于分子生物學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是公知并且常規(guī)的。期望在可選擇標(biāo)記基因的編碼序列中至少10%的CpG二核苷酸已經(jīng)被替換時(shí)，除去CpG二核苷酸的積極效果是明顯的。期望除去更多的CpG二核苷酸會(huì)提高效果，因此在某些實(shí)施方式中，與編碼可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的原始幵放閱讀框序列相比，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的CpG二核苷酸被突變。在某些有利的實(shí)施方式中，與編碼可選擇標(biāo)記多肽的原始開放閱讀框序列相比，編碼可選擇標(biāo)記多肽的開放閱讀框序列中至少一半CpG二核苷酸被替換。SEQ.ID.NO.l(包含內(nèi)部ATG)給出了編碼提供對(duì)Zeocin抗性的可選擇標(biāo)記多肽的原始開放閱讀框序列()，在該序列中第280位的A突變成T提供了缺少內(nèi)部ATG的序列，其中在第94位內(nèi)部編碼的甲硫氨酸被替換成為亮氨酸。對(duì)于本發(fā)明的DNA序列，起始密碼子(DNA序列的開始三個(gè)核苷酸)被突變成GTG起始密碼子或突變成TTG起始密碼子。在某些有利的實(shí)施方式中，可選擇標(biāo)記多肽提供了針對(duì)Zeodn的抗性。在其某些實(shí)施方式中，DNA分子包含SEQ，ID.NO.1，其中至少一半CpG二核苷酸已經(jīng)被替換而沒有突變所編碼的氨基酸序列，前提是起始密碼子(DNA序列的開始三個(gè)核苷酸)被替換為選自GTG或TTG的起始密碼子。在替換的實(shí)施方式中，DNA分子包含SEQ.ID.NO.1，其中第280位的核苷酸A被替換為T，以便第94位氨基酸(甲硫氨酸)被替換為亮氨酸，其中至少一半CpG二核苷酸已經(jīng)被替換而沒有突變所編碼的氨基酸序列，前提是起始密碼子(DNA序列的開始三個(gè)核苷酸)被替換為選自GTG或TTG的起始密碼子。該實(shí)施方式在Zeodn抗性基因的編碼序列中缺少ATG序列，因此其適合本發(fā)明的多順反子轉(zhuǎn)錄單位，其中可選擇標(biāo)記多肽的編碼序列在感興趣的多肽編碼序列的上游。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，DNA分子包含SEQ.ID.NO.3。SEQ.ID.NO.5(包含內(nèi)部ATG)和SEQ.ID.NO.7(缺少內(nèi)部ATG)中給出了編碼提供對(duì)新霉素抗性的可選擇標(biāo)記多肽的原始開放閱讀框。在有利的實(shí)施方式中，這些序列可以包含一個(gè)或者更多個(gè)其他的突變，以便所編碼的多肽在第201位纈氨酸突變成甘氨酸(201V〉G)，第185位的谷氨酸突變成天冬氨酸(185E〉D)，或者都突變(185E〉D，201V>G)。在其他有利的實(shí)施方式中，可選擇標(biāo)記多肽提供了針對(duì)新霉素的抗性。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，DNA分子包含選自由a)SEQ.ID.N0.5，前提是至少一半CpG二核苷酸已經(jīng)被替換而沒有突變所編碼的氨基酸序列，進(jìn)一步的前提是起始密碼子(開始的ATG序列)被替換為GTG或TTG;b)SEQ.ID.NO.7，前提是至少一半CpG二核苷酸已經(jīng)被替換而沒有突變所編碼的氨基酸序列，進(jìn)一步的前提是起始密碼子(開始的ATG序列)被替換為GTG或TTG;和c)SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.7中任意一種所組成的組，與所指定序列編碼的序列相比，其包含突變以編碼新霉素抗性蛋白質(zhì)變體，所述變體在所編碼蛋白質(zhì)的第201位具有甘氨酸(201G變體)，或者在第185位具有天冬氨酸(185D變體)或者同時(shí)在第201位具有甘氨酸在第185位具有天冬氨酸(185D，201G變體)，前提是給定DNA序列中至少一半CpG二核苷酸已經(jīng)被替換而沒有進(jìn)一步突變所編碼的氨基酸序列，進(jìn)一步的前提是起始密碼子(開始的ATG序列)被替換為GTG或TTG。例如185D變體是通過將所提供核酸序列中第553555位的密碼子替換為GAC而獲得的，例如201G變體是通過將給定核酸序列中第601~603位的密碼子替換為GGT而獲得的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，DNA分子包含SEQ.ID.NO.9，前提是第555位的核苷酸A被替換為C(以編碼185E>D變體)，第602位的核苷酸T替換為G并且第603位的核苷酸G被替換為T(以編碼201V>G變體)，進(jìn)一步的前體是啟動(dòng)密碼子(第1~3位的ATG)被替換為GTG或TTG。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備其他的變體而不離開本發(fā)明的教導(dǎo)，因此只要啟動(dòng)密碼子不是ATG并且所編碼的蛋白質(zhì)提供針對(duì)新霉素(或G418)的抗性則這些其他的變體也包含在本發(fā)明中。185D和201G變體進(jìn)一步提高了本發(fā)明的選擇嚴(yán)格性。在某些實(shí)施方式中，可選擇標(biāo)記多肽還包含與野生型對(duì)應(yīng)物相比降低可選擇標(biāo)記多肽活性的突變。這可以用于進(jìn)一步提高選擇的嚴(yán)格性。作為非限制性實(shí)施例，可以對(duì)Zeocin抗性多肽中第9位的脯氨酸進(jìn)行突變，例如突變成Thr或Phe，對(duì)于新霉素抗性多肽，則第182位或第261位的氨基酸或者兩個(gè)氨基酸都可以被進(jìn)一步突變(參見例如WO01/32901)。原則上，本發(fā)明編碼可選擇標(biāo)記多肽的DNA分子可以用于任何表達(dá)載體中，例如作為單順反子基因。他們提供了嚴(yán)格的選擇標(biāo)準(zhǔn)。然而在優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼可選擇標(biāo)記多肽的ORF是還包含編碼感興趣的多肽的ORF的多順反子轉(zhuǎn)錄單位的一部分。本發(fā)明的多順反子轉(zhuǎn)錄單位可以是例如包含編碼5'到3'為可選擇標(biāo)記多肽和感興趣的多肽的序列的多順反子轉(zhuǎn)錄單位，或者例如包含編碼5'到3，為感興趣多肽和可選擇標(biāo)記多肽的序列的多順反子轉(zhuǎn)錄單位。在前一種情況中，優(yōu)選可選擇標(biāo)記多肽的編碼序列在編碼鏈中不含ATG序列(參見WO2006/048459)。在后一種情況中，從可選擇標(biāo)記多肽編碼序列的上游編碼感興趣的多肽，并且內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)可操作地連接于編碼可選擇標(biāo)記多肽的序列，因此可選擇標(biāo)記多肽依賴IRES進(jìn)行其翻譯(參見US2006/0141577)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多順反子轉(zhuǎn)錄單位按照下列順序包含a)啟動(dòng)子；b)編碼可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的序列；以及C)編碼感興趣蛋白質(zhì)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多順反子轉(zhuǎn)錄單位按照下列順序包含a)啟動(dòng)子；b)編碼感興趣蛋白質(zhì)的序列；以及C)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，其可操作地連接于d)編碼可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的序列。在某些實(shí)施方式中，多順反子轉(zhuǎn)錄單位在第二順反子的下游包含第三順反子，所述第三順反子優(yōu)選可操作地連接于IRES,例如第三順反子是編碼第二可選擇標(biāo)記多肽。在某些實(shí)施方式中這種第二可選擇標(biāo)記多肽是DHFR，優(yōu)選具有GTG或TTG起始密碼子以能夠在dhfr缺陷型細(xì)胞中進(jìn)行連續(xù)選擇(參見例如PCT/EP2007/0516%，在本文中通過參照并入)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明DNA分子的表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒在本發(fā)明多順反子轉(zhuǎn)錄單位的上游包含啟動(dòng)子，以及在本發(fā)明多順反子轉(zhuǎn)錄單位的下游包含轉(zhuǎn)錄終止序列。在真核宿主細(xì)胞中，所述表達(dá)盒是有功能的，用于驅(qū)動(dòng)多順反子轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)錄。在本文中所使用的"表達(dá)盒"是至少包含功能上連接于期望表達(dá)序列的啟動(dòng)子的核酸序列。優(yōu)選，表達(dá)盒還包含轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止/聚腺苷酸化序列的例子是公知的，并易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員獲得，例如在WO2006/048459，第28~29頁(yè)中所討論的，在本文中通過參照并入。還可以包含其他調(diào)控序列例如增強(qiáng)子。啟動(dòng)子必須能夠在真核宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用，即其必須能夠驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)錄。因此，啟動(dòng)子可操作地連接于轉(zhuǎn)錄單位。表達(dá)盒可以可選擇地還包含本領(lǐng)域中己知的其他元件例如剪切位點(diǎn)以包含內(nèi)含子等。在可選擇標(biāo)記多肽是在感興趣的多肽的下游被編碼的實(shí)施方式中，IRES被可操作地連接于包含編碼可選擇標(biāo)記多肽序列的順反子。在可選擇標(biāo)記多肽是在感興趣的多肽的上游被編碼的實(shí)施方式中，編碼可選擇標(biāo)記多肽的序列在編碼鏈中不包含ATG序列。本文中所使用的"內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)"或"IRES"是指促進(jìn)內(nèi)部核糖體直接進(jìn)入起始密碼子的元件，例如通常為順反子(編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域)的ATG，但在本發(fā)明中優(yōu)選為GTG或TTG，使得基因不依賴于帽進(jìn)行翻譯。IRES序列和其應(yīng)用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，如在US2006/0141577和PCT/EP2007/051696中所教導(dǎo)的，在本文中通過參照并入U(xiǎn)S2006/0141577和PCT/EP2007/051696。還參見例如JacksonRJ，HowellMT，KaminskiA(1990)TrendsBiochemSci15(12):477-83)，JacksonRJandKaminski,A.(1995)RNA1(10):985-1000，Martinez-Salas，1999，Venkatesan&Dasgupta，2001，Rees等人，1996和Mizuguchi等人，2000。在US2006/0141577(其中的SEQIDNO.127)的實(shí)施例19中提供了適當(dāng)?shù)腎RES序列的例子，在本文中通過參照并入?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠利用的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法產(chǎn)生本發(fā)明的DNA分子。例如，可以通過常規(guī)的方法對(duì)原始序列例如來(lái)自商業(yè)上可以獲得的質(zhì)粒進(jìn)行突變。此外，目前還可以任意合成(如果需要，使用亞克隆步驟)具有可選擇標(biāo)記多肽ORF的充分長(zhǎng)度的DNA序列，目前這類合成的DNA序列可以從各種公司商業(yè)訂購(gòu)。因此，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)本發(fā)明編碼可選擇標(biāo)記多肽的適當(dāng)序列(具有GTG或TTG起始密碼子，CpG含量降低，在某些實(shí)施方式中不包含內(nèi)部ATG)，合成該序列，并且通過將該DNA分子引入到真核宿主細(xì)胞中對(duì)DNA分子測(cè)試所編碼可選擇標(biāo)記的功能，以及測(cè)試發(fā)揮功能的可選擇標(biāo)記多肽的表達(dá)。這些序列的商業(yè)可獲得性使得便于提供缺少內(nèi)部的ATG編碼選擇標(biāo)記的序列而沒有過分的壓力，其中選擇標(biāo)記多肽的野生型序列包含某些這類的內(nèi)部ATG(參見WO2006/048459)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的DNA分子是載體如質(zhì)粒的一部分。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，容易對(duì)這些載體進(jìn)行處理，例如可以被設(shè)計(jì)成能夠在原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞中復(fù)制。另外，許多載體可以直接或者以從其分離的期望片段的形式用于轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞，并能夠全部或部分整合到這些細(xì)胞的基因組中，得到在它們的基因組中包含期望核酸的穩(wěn)定宿主細(xì)胞。所使用的載體可以是任何適合克隆DNA的載體，并能夠用于感興趣核酸的轉(zhuǎn)錄。在使用宿主細(xì)胞吋，優(yōu)選所述載體是整合型載體?？商鎿Q的，所述載體可以是游離復(fù)制型載體。廣泛接受的是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和其它外遺傳調(diào)控機(jī)制可以影響轉(zhuǎn)基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)(例如Whitelaw等人，2001)。本發(fā)明的多順反子表達(dá)單位形成了選擇體系的一部分，其具有相當(dāng)嚴(yán)格的選擇方案。通常，這需要在所選擇宿主細(xì)胞中的高轉(zhuǎn)錄水平。為了提高發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)格選擇方案中存活的宿主細(xì)胞克隆的機(jī)會(huì)，并可能提高在所獲得克隆中表達(dá)的穩(wěn)定性，通常優(yōu)選提高轉(zhuǎn)錄的可預(yù)測(cè)性。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的表達(dá)盒還包含至少一個(gè)染色質(zhì)調(diào)控元件。本文中所使用的"染色質(zhì)調(diào)控元件"是能夠以某種方式影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而在真核細(xì)胞中影響鄰近轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平和/或穩(wěn)定性(它們順式發(fā)揮作用，因此優(yōu)選置于距離轉(zhuǎn)基因5kb以內(nèi)，更優(yōu)選在2kb以內(nèi)，更加優(yōu)選在lkb以內(nèi))的DNA序列的總稱。優(yōu)選這類染色質(zhì)調(diào)控元件選自由絕緣子序列、遍在染色質(zhì)開放元件(UCOE)、基質(zhì)或支架附著區(qū)(MAR/SAR)和抗阻抑物(STAR)序列所組成的組。在WO2006/048459第32~37頁(yè)提供了染色質(zhì)調(diào)控元件的例子以及獲得和使用它們以及功能上進(jìn)行測(cè)試的方法，通過參照并入本文中。在某些實(shí)施方式中，所述至少一個(gè)染色質(zhì)調(diào)控元件是抗阻抑物元件，其選自由WO2006/048459中SEQ.ID.NO.1~SEQ.ID.NO.66的任何一種及其片段所組成的組。在其某些實(shí)施方式中，所述表達(dá)盒包含WO2006/048459的SEQ.ID.NO.66或其片段，其位于驅(qū)動(dòng)多順反子轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的上游。在其它一些實(shí)施方式中，多順反子轉(zhuǎn)錄單位的兩側(cè)連接至少一個(gè)抗阻抑物序列，所述抗阻抑物序列選自由WO2006/048459中SEQ.ID.NO.1~SEQ.ID.NO.65的任何一種或其片段所組成的組。優(yōu)選，所述染色質(zhì)調(diào)控元件選自由STAR67、STAR7、STAR9、STAR17、STAR27、STAR29、STAR43、STAR44、STAR45、STAR47、STAR61或所述STAR序列的功能片段或衍生物所組成的組(參見例如WO2006/048459獲得這些STAR元件的序列和優(yōu)選應(yīng)用，通過參照并入本文中)。本發(fā)明的感興趣的多肽可以是任何蛋白質(zhì)，并且可以是單體蛋白質(zhì)或者多聚體蛋白質(zhì)(的一部分)。多聚體蛋白質(zhì)包含至少兩條多肽鏈。本發(fā)明感興趣蛋白質(zhì)的非限制性例子是酶、激素、免疫球蛋白鏈、諸如抗癌蛋白質(zhì)的治療性蛋白質(zhì)、諸如VIII因子的血液凝集蛋白質(zhì)、諸如紅細(xì)胞生成素的多功能蛋白質(zhì)、診斷性蛋白質(zhì)，或者可以用于免疫目的的蛋白質(zhì)或其片段，所有都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。感興趣的多肽可以來(lái)自任何來(lái)源，在某些實(shí)施方式中是哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)、人工蛋白質(zhì)(例如融合蛋白或突變的蛋白質(zhì))，并優(yōu)選是人蛋白質(zhì)。包含本發(fā)明的多順反子轉(zhuǎn)錄單位和/或表達(dá)盒的DNA分子可以用于提高核酸的表達(dá)，優(yōu)選在宿主細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"/"宿主細(xì)胞"和"細(xì)胞系"/"宿主細(xì)胞系"通常分別被定義為通過本領(lǐng)域中已知的方法可以維持在細(xì)胞培養(yǎng)中并且具有表達(dá)異源或同源蛋白質(zhì)能力的細(xì)胞和其均一的群體。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明DNA分子或表達(dá)盒的宿主細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以用于繁殖和/或使用本發(fā)明的DNA分子進(jìn)行遺傳工程。本發(fā)明的DNA分子，特別是出現(xiàn)在質(zhì)粒上時(shí)能夠在原核宿主細(xì)胞例如細(xì)菌中復(fù)制。根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞優(yōu)選是真核細(xì)胞，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如嚙齒類動(dòng)物(例如小鼠、倉(cāng)鼠)細(xì)胞或人細(xì)胞或者不同細(xì)胞的融合。在某些非限制性實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是U-20S骨肉瘤、HEK293、HuNS-l骨髓瘤、WERI-Rb陽(yáng)l眼癌、BHK、COS、Vero、非分泌性小鼠骨髓瘤Sp2/0-Ag14、非分泌性小鼠骨髓瘤NSO、NCI-H295R腎上腺癌或PEILC6②細(xì)胞。對(duì)于本發(fā)明的目的，PER.C6細(xì)胞的意思是在ECACCno.96022940保藏的細(xì)胞(參見例如美國(guó)專利5,994,128)傳代的上游或下游，或者其上游或下游的派生物即具有這些細(xì)胞特征。之前已經(jīng)顯示這些細(xì)胞能夠以高水平表達(dá)蛋白質(zhì)(例如WO00/63403和Jones等人，2003)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞，例如CHO-K1、CHO-S、CHO-DG44、CHO-DUKXB11等。在某些實(shí)施方式中，所述CHO細(xì)胞具有dhfr—表型。這些真核宿主細(xì)胞能夠表達(dá)期望的多肽，并且通常用于該目的。能夠通過將本發(fā)明的DNA分子優(yōu)選以表達(dá)盒的形式引入到細(xì)胞中，獲得這些真核宿主細(xì)胞。優(yōu)選，表達(dá)盒被整合到宿主細(xì)胞的基因組中，在各種宿主細(xì)胞中可以整合在基因組的不同位置中，選擇將提供轉(zhuǎn)基因被整合到適當(dāng)位置的克隆，這得到了在表達(dá)水平、穩(wěn)定性、生長(zhǎng)特征等方面具有期望性能的宿主細(xì)胞克隆?？商鎿Q的，可以靶向或隨即選擇轉(zhuǎn)錄單位用于整合到轉(zhuǎn)錄活躍的染色體區(qū)域例如在基因組中所存在啟動(dòng)子的后面。優(yōu)選，宿主細(xì)胞來(lái)自根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的標(biāo)準(zhǔn)程序可以選擇并增殖的穩(wěn)定克隆。如果細(xì)胞包含編碼感興趣的多肽的轉(zhuǎn)錄單位，則這類克隆的培養(yǎng)物能夠產(chǎn)生感興趣的多肽。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生能夠表達(dá)感興趣多肽的宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括步驟a)將本發(fā)明的DNA分子或表達(dá)盒引入到多個(gè)前體細(xì)胞中，b)在適合表達(dá)可選擇標(biāo)記多肽的條件下培養(yǎng)這些前體細(xì)胞，以及c)選擇至少一個(gè)表達(dá)所述可選擇標(biāo)記多肽的宿主細(xì)胞。完成對(duì)可選擇標(biāo)記多肽表達(dá)的選擇，例如通過施加選擇壓力(例如在存在選擇劑時(shí)培養(yǎng))，并將保證在本發(fā)明的多順反子轉(zhuǎn)錄單位和表達(dá)盒中感興趣的多肽的表達(dá)。在所獲得克隆與期望多肽高表達(dá)的克隆的比例方面，該新型方法提供了非常好的結(jié)果使用相同濃度的選擇劑獲得了比使用已知的選擇系統(tǒng)少得多的集落，以及相對(duì)高比例的所獲得克隆以高水平產(chǎn)生感興趣的多肽。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)感興趣的多肽的方法，其包括培養(yǎng)包含本發(fā)明表達(dá)盒的宿主細(xì)胞，以在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，從所述細(xì)胞或這從培養(yǎng)基中或者同時(shí)從兩者中收獲感興趣的蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞?？梢酝ㄟ^多種方法之一完成在細(xì)胞中引入待表達(dá)的核酸，同樣這也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，也依賴于所要引入核酸的模式。所述方法包括但不限于轉(zhuǎn)染、感染、注射、轉(zhuǎn)化等。在某些實(shí)施方式中至少在培養(yǎng)過程中的部分時(shí)間內(nèi)，在培養(yǎng)基中存在選擇劑，其濃度足以選擇表達(dá)可選擇標(biāo)記多肽的細(xì)胞，或者以較低的濃度。在其他實(shí)施方式中，如果表達(dá)多肽，則在生產(chǎn)階段，在培養(yǎng)基中不再出現(xiàn)選擇劑。進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞，以使其能夠代謝和/或生長(zhǎng)和/或分裂和/或生產(chǎn)感興趣的重組蛋白。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法完成，其包括但不限于為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物。這些方法包括附著到表面的生長(zhǎng)，在懸浮液中的生長(zhǎng)，或其組合。例如可以在盤、滾瓶或者在生物反應(yīng)器中使用分批系統(tǒng)、補(bǔ)料分批系統(tǒng)、連續(xù)系統(tǒng)例如灌注系統(tǒng)等進(jìn)行培養(yǎng)。為了達(dá)到通過細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模(連續(xù))生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，本領(lǐng)域中優(yōu)選使用能夠在懸浮液中生長(zhǎng)的細(xì)胞，并且優(yōu)選使用在無(wú)血清甚至無(wú)蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)的細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的條件(參見例如TissueCulture,AcademicPress,Kruse和Paterson，編輯(1973))以及表達(dá)重組蛋白的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。通常，可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生物技術(shù)實(shí)用方法(MammalianCellBiotechnology:aPracticalApproach)(M.Butler，ed.，IRLPress,1991)中發(fā)現(xiàn)用于使哺乳動(dòng)物培養(yǎng)物產(chǎn)量最大化的原理、方案和實(shí)用技術(shù)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，從細(xì)胞或者從培養(yǎng)基或者從二者收集(分離)表達(dá)的蛋白質(zhì)。接著可以使用己知的方法進(jìn)行進(jìn)一步純化，例如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行過濾、柱層析等。顯然，在最終目的不是生產(chǎn)感興趣的多肽，而是RNA本身時(shí)，也可以使用該結(jié)構(gòu)的表達(dá)盒，例如用于從表達(dá)盒來(lái)生產(chǎn)量提高的RNA，其可以用于調(diào)節(jié)其他基因的目的(例如RNAi，反義RNA)、基因治療、體外蛋白質(zhì)生產(chǎn)等。除非以其他方式明確說明，本發(fā)明的實(shí)踐將采用在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA的傳統(tǒng)技術(shù)。參見，例如Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第2版(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndedition),1989;分子生物學(xué)當(dāng)前方案(CmrentProtocolsinMolecularBiology),AusubelFM，etal，eds，1987;酶學(xué)系列手冊(cè)(theseriesMethodsinEnzymology)(AcademicPress,Inc.);PCR2:實(shí)用方法(PCR2:APracticalApproach),MacPhersonMJ，HamsBD，TaylorGR,編輯，1995;抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Antibodies:ALaboratoryManual),Harlow和Lane，編輯，1988。在下面的實(shí)施例中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步解釋。這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明。它們僅僅是為了闡明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:從編碼可選擇標(biāo)記的序列除去CpG二核苷酸提高了使用本發(fā)明選擇方法的表達(dá)使用可選擇標(biāo)記的不同翻譯起始密碼子如GTG或TTG的選擇方法可以達(dá)到非常嚴(yán)格的選擇，并且感興趣的多肽非常高水平地產(chǎn)生感興趣的多肽(參見WO2006/048459和US2006/0141577，例如后者中的實(shí)施例119)。在該實(shí)施例中，通過除去CpG二核苷酸對(duì)可選擇標(biāo)記多肽基因本身的編碼區(qū)進(jìn)行修飾?；驹硎荂pG核苷酸中的C核苷酸可以傾向于甲基化，這可能導(dǎo)致可選擇標(biāo)記的基因沉默，因此除去CpG二核苷酸可能改進(jìn)結(jié)果。采用具有TTG起始密碼子的Zeocin抗性基因作為標(biāo)記，盡可能除去CpG二核苷酸，而不改變Zeocin抗性蛋白質(zhì)的氨基酸序列，進(jìn)一步不在編碼鏈中引入ATG序列以防止在Zeocin抗性蛋白質(zhì)的編碼區(qū)中不期望的翻譯起始(例如在WO2006/048459中所解釋的)。因此，某些CG未被除去。原始序列的CpG含量(此處:包含TTG起始密碼子，突變以除去內(nèi)部ATG序列)為13.3%，而在CpG突變之后，CpG含量降低到1.8%[稱作"TTGZeo(貧CpG)"]。在d2EGFP編碼區(qū)的上游克隆CpG含量降低的Zeocin抗性基因以得到多順反子表達(dá)構(gòu)建體。檢測(cè)d2EGFP的表達(dá)水平。制備構(gòu)建體，其在CMV啟動(dòng)子的上游包含STAR7和67，接著是TTGZeo(貧CpG)選擇標(biāo)記(GeneArtGmbH，Regensburg，Germany合成，參見SEQ.ID.NO3;參見SEQ.ID.NO.l，具有天然CpG含量的Zeocin抗性編碼序列)，d2EGFP基因和STAR7(圖1)。將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到CHO-K1細(xì)胞。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染DNA，在補(bǔ)加10%FBS(Invitrogen)的HAM-F12培養(yǎng)基(Invitrogen)中存在150pg/mlZeocin時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞。在以對(duì)照"富CpG"TTGZeo構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)了8個(gè)集落(圖1中的A)，而在轉(zhuǎn)染包含"貧CpG"TTGZeo的構(gòu)建體后則沒有出現(xiàn)集落(圖1中的C)。相反，如果構(gòu)建體中包含STAR7/67-7，則使用"富CpG"TTGZeo(圖1中的B)選擇標(biāo)記和使用"貧CpG"TTGZeo(圖1中的D)選擇標(biāo)記都會(huì)出現(xiàn)超過24個(gè)集落。使用"富CpG"TTGZeo選擇標(biāo)記(圖1中的A)，禾U用STAR-少的對(duì)照構(gòu)建體，d2EGFP的平均表達(dá)為140，而利用包含STAR的構(gòu)建體，d2EGFP的平均表達(dá)為1332(圖1中的B)。這是由于存在STAR元件的提高。使用包含STAR的構(gòu)建體以及"貧CpG"TTGZeo，d2EGFP的平均表達(dá)為2453(圖1中的D)，與使用"富CpG"TTGZeo(圖1中的B)相比，幾乎提高了兩倍。此外，使用"富CpG"TTGZeo(B)達(dá)到的最高d2EGFP值是2481，使用"貧CpG"TTGZeo(D)達(dá)到的最高值是4308。我們得出結(jié)論降低Zeocin標(biāo)記基因的CpG含量提高了選擇系統(tǒng)的嚴(yán)格性。這達(dá)到了如果構(gòu)建體中包含STAR元件則d2EGFP表達(dá)值較高，而使用對(duì)照構(gòu)建體則沒有集落。還將相同的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染CHO-DG44細(xì)胞。這是使用Lipofectamine2000(Invitrogen)進(jìn)行的，并使用在培養(yǎng)基中的150pg/mlZeocin進(jìn)行選擇。該培養(yǎng)基由HAMF12:DMEM-1:1，加上10°/。胎牛血清構(gòu)成。利用"富CpG"TTGZeocin選擇標(biāo)記，通過STAR-少的對(duì)照構(gòu)建體，d2EGFP的平均表達(dá)為43(圖2中的A)，通過包含STAR的構(gòu)建體，d2EGFP的平均表達(dá)為586(圖2中的B)。這是由于存在STAR元件的提高。利用STAR構(gòu)建體和"貧CpG"Zeo，平均d2EGFP表達(dá)為1152(圖2中的D)，與"富CpG"TTGZeo(圖2中的D)相比，提高了幾乎兩倍。此外，使用"富CpG"TTGZeo構(gòu)建體達(dá)到的最高d2EGFP值是1296(圖2中的B)，使用"貧CpG"TTGZeo構(gòu)建體則到達(dá)的最高值時(shí)2416(圖2中的D)。與使用"貧CpG"TTGZeo構(gòu)建體沒有出現(xiàn)對(duì)照集落(圖1中的C)的CHO-K1相反，使用CHO-DG44出現(xiàn)了對(duì)照集落，但平均d2EGFP值是52，集落中最高值是15(圖2中的C)。我們得出結(jié)論，同樣在CHO-DG44中，向構(gòu)建體加入"貧CpG"TTGZeo選擇標(biāo)記達(dá)到了在采用STAR元件時(shí)的高蛋白質(zhì)表達(dá)。實(shí)施例2:在本發(fā)明的選擇系統(tǒng)中新霉素抗性編碼序列的修飾在該實(shí)施例中，除了起始密碼子外，還修飾了新霉素抗性基因的編碼區(qū)，其通過盡可能多地除去新霉素抗性基因的CpG二核苷酸(ATG-少，因此已經(jīng)排除了編碼鏈中的ATG序列)，而沒有改變新霉素抗性蛋白質(zhì)的氨基酸序列(與野生型序列相比，除了Me^Leu突變夕卜，在該突變處內(nèi)部ATG序列符合閱讀框并且被替換為CTG:顯然這是由于從編碼鏈中除去ATG序列并且獨(dú)立于降低CpG含量的努力，參見WO2006/04845的實(shí)施例17)，在編碼鏈中沒有引入新的ATG序列，這與在實(shí)施例1種對(duì)Zeocin抗性基因所進(jìn)行的一樣。野生型新霉素選擇標(biāo)記基因的CpG含量為10.4%(SEQ.ID.NO.5)，而改變后，CpG含量降低到2.3。/。(SEQ.ID.N0.9)。在該實(shí)施例中包含新霉素抗性基因的構(gòu)建體是從GeneArtGmbH，Regensburg，德國(guó)訂購(gòu)的。作為起始密碼子，在該實(shí)施例中使用TTG。因此，所使用的序列由SEQ.ID.NO.9構(gòu)成，前提是起始密碼子(開始三個(gè)核苷酸，ATG)被替換為TTG起始密碼子，進(jìn)一步在某些情況中包含下面所提到突變之一。在"貧CpG"新霉素抗性基因中，進(jìn)行某些突變以改變新霉素抗性蛋白質(zhì)中的氨基酸，以測(cè)試在本發(fā)明的多順反子轉(zhuǎn)錄單位中使用時(shí)，是否這些突變對(duì)所感興趣多肽的表達(dá)水平有影響。這些突變(Sautter等人，2005;注意與(Sautter等人，2005)所使用的序列相比，在本發(fā)明中所使用的neo序列編碼在緊接著起始密碼子后的三個(gè)額外氨基酸，因此本申請(qǐng)中的氨基酸編號(hào)比在(Sautter等人，2005)中的編號(hào)高三個(gè)數(shù))由下列構(gòu)成第201位氨基酸纈氨酸(Sautter等人，2005中的第198位)改變成第201位甘氨酸(TTGNeo201V>G)，第185位谷氨酸(Sautter等人，2005中的第182位)改變成第185位天冬氨酸(TTGNeo185E>D)，以及第201位纈氨酸和第185位谷氨酸分別改變成第201位甘氨酸和第185位天冬氨酸的雙突變(TTGNeo185E>D/201V〉G)(圖3)。將這些修飾與對(duì)照新霉素(貧CpG的TTGNeo185E/201V)進(jìn)行比較。在所有情況中，制備具有或沒有STAR元件的構(gòu)建體(圖3)。將修飾的TTGNeo選擇標(biāo)記并入到構(gòu)建體中，所述構(gòu)建體在CMV啟動(dòng)子的上游包含STAR7和67，接著是所述TTGNeo選擇標(biāo)記、d2EGFP基因和STAR7(圖3)。將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到CHO-Kl細(xì)胞。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染DNA，在補(bǔ)加10%FBS(Invitrogen)的HAM-F12培養(yǎng)基(Invitrogen)中存在500ng/mlG418遺傳霉素時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞。使用對(duì)照Neo構(gòu)建體(185E/201V)，僅觀察到STAR元件非常有限的影響。這可能至少部分是由于在500pg/mlG418遺傳霉素下所產(chǎn)生的許多集落，這說明TTG新霉素修飾的嚴(yán)格性低。然而，具有本發(fā)明修飾的新霉素是可以運(yùn)行的在TTGNeol85E201V構(gòu)建體中，從新霉素抗性基因的編碼鏈中除去所有ATG，盡管d2EGFP值低，但明顯ATG的除去仍能夠在遺傳霉素選擇壓力下進(jìn)行正常的選擇。在進(jìn)一步修飾新霉素抗性基因時(shí)，觀察到了加入STAR元件的顯著影響。21個(gè)TTGNeo201V>G對(duì)照集落的平均值是65(圖3中的A2)，而24個(gè)具有STAR元件的TTGNeo201V>G集落的平均d2EGFP信號(hào)是150(圖3中的B2)。使用TTGNeo185E>D突變，進(jìn)一步提高了選擇嚴(yán)格性，因?yàn)闆]有STAR元件的話，沒有對(duì)照集落存活(圖3中的A3)，而17個(gè)存活的TTGNeo185E>DSTAR集落的平均d2EGFP信號(hào)是204(圖3中的B3)。這意味著GFP熒光比TTGNeo201V>G集落的熒光高(圖3中的B2)。與TTGNeo201V>G集落中最高值433相比，TTGNeo185E〉D201V〉G集落中d2EGFP的最高值是715，(比較圖3中的B3禾HB2)。沒有對(duì)照集落存活(圖3中的A4)而7個(gè)存活的STARTTGNeo185E>D201V>G集落的平均d2EGFP值是513，最高d2EGFP值是923(圖3中的B4)。結(jié)論是引入特定的突變提高了根據(jù)本發(fā)明在使用新霉素抗性基因時(shí)的選擇嚴(yán)格性。這些修飾中的某些將該選擇嚴(yán)格性轉(zhuǎn)移到了新霉素抗性基因，其僅在并入STAR元件之后才能由于高表達(dá)值而存活。這伴隨著達(dá)到了更高的d2EGFP表達(dá)值。顯然，本文所描述的新霉素抗性基因的有利實(shí)施方式進(jìn)一步提高了該基因用于根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的適當(dāng)性。明顯的是在將新霉素抗性蛋白質(zhì)置于IRES調(diào)控下時(shí)(參見，例如US2006/0141577的實(shí)施例19)，CpG含量降低并具有GTG或TTG起始密碼子并具有指定突變(185E〉D和/或201V〉G)的新霉素抗性基因的構(gòu)造也能夠被置于所感興趣的多肽(這里使用d2EGFP作為模型)編碼序列的下游。對(duì)于Zeocin抗性基因也一樣(實(shí)施例1)。在這種情況中，不需要關(guān)注CpG而據(jù)核苷酸的突變會(huì)引入ATG序列。在這些實(shí)施方式中，也期望能夠得到良好的結(jié)果，即CpG含量的降低以及在可選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)編碼序列中指定位點(diǎn)的突變會(huì)提高表達(dá)水平。參考文獻(xiàn)JonesD，KroosN，AnemaR，VanMontfortB,VooysA，VanDerKraatsS，VanDerHelmE，SmitsS，SchoutenJ，BrouwerK,LagerwerfF，VanBerkelP，OpsteltenD-J，LogtenbergT，BoutA(2003)High-levelexpressionofrecombinantIgGinthehumancelllinePER.C6.萬(wàn)/o/ec/zwo/.19:163-168.KozakM.(1986)PointmutationsdefineasequenceflankingtheAUGinitiatorcodonthatmodulatestranslationbyeukaryoticribosomes.Ce〃44:283-292.KozakM.(1987)Ananalysisof5'-noncodingsequencesfrom699vertebratemessengerRNAs.TVwc/e/d^Was.15:8125-8148.KozakM.(1989)Contexteffectsandinefficientinitiationatnon-AUGcodonsineucaryoticcell-freetranslationsystems.M/Ce//傷o/.9:5073-5080.KozakM.(1990)Downstreamsecondarystructurefacilitatesrecognitionofinitiatorcodonsbyeukaryoticribosomes,尸racTV""/87:8301-8305.KozakM.(1997)RecognitionofAUGandalternativeinitiatorcodonsisaugmentedbyGinposition+4butisnotgenerallyaffectedbythenucleotidesinpositions+5and+6.￡細(xì)0J.16:2482-2492.KozakM.(2002)加大掃描機(jī)制的限制用于起始翻譯(Pushingthelimitsofthescanningmechanismforinitiationoftranslation),Gewe299:1-34.Martinez-Salas，E.(1999)InternalribosomeentrysitebiologyanditsuseinexpressionvectorsCm/tO//"萬(wàn)/0/ec/7w0//0，458-64.Mizuguchi，H，Xu，Z，Ishii-Watabe，A，Uchida，E，andHayakawa，T.(2000)IRES-dependentsecondgeneexpressionissignificantlylowerthancap-dependentfirstgeneexpressioninabicistronicvectorMo/7Tzer/，376-82.Rees，S，Coote，J，Stables,J，Goodson，S，Harris,S，andLee，MG.(1996)Bicistronicvectorforthecreationofstablemammaliancelllinesthatpredisposesallantibiotic-resistantcellstoexpressrecombinantprotein所她c—i/es20，102-104，106，108-110.Sautter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