專利名稱：人巨核細胞生成期間的微小rna指紋的制作方法
相關申請的交叉參考
本申請要求2006年3月20日提交的美國臨時申請?zhí)?0/743,585的利益，其公開內(nèi)容引入這里作為參考。
關于聯(lián)邦政府贊助研究的聲明
本發(fā)明，全部或部分，得到National Institutes of HealthProgram Project Grants P01CA76259，P01CA16058，P01CA81534和P01CA16672支持。政府具有本發(fā)明的某些權利。
背景技術：
微小RNA(miRNA)是19-25個核苷酸RNA的小非編碼家族，其根據(jù)miRNA與它們的靶之間的互補程度，通過以序列特異性方式靶向信使RNA(mRNA)，誘導翻譯抑制或mRNA降解來調(diào)節(jié)基因表達(Bartel，D.P.(2004)Cell 116，281-297；Ambros，V.(2004)Nature 431，350-355)。許多miRNA在遠緣相關的生物體之間是序列保守的，這表明這些分子參與基本的過程。實際上，在發(fā)育期間基因表達的調(diào)節(jié)(Xu，P.，等人(2003)Curr.Biol.13，790-795)，細胞增殖(Xu，P.，等人(2003)Curr.Biol 13，790-795)，細胞程序死亡(Cheng，A.M.，et al(2005)Nucl.Acids Res.33，1290-1297)，葡萄糖代謝(Poy，M.N.，等人(2004)Nature 432，226-230)，脅迫抗性(Dresios，J.，等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，1865-1870)和癌癥(Calin，G.A，等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，1554-15529；Calin，G.A.，等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101，11755-11760；He，L.，等人(2005)Nature 435，828-833；and Lu，J.，等人(2005)Nature 435834-838)中涉及miRNA。
這也是mi RNA在哺乳動物造血中發(fā)揮作用的強有力證據(jù)。在小鼠中，miR-181，miR-223與miR-142在造血組織中差異表達，并在造血與譜系定型期間調(diào)節(jié)它們的表達(Chen，C.Z.，等人(2004)Science303，83-86)。miR-181在鼠造血祖細胞中的異位表達導致了B細胞區(qū)室中的增殖(Chen，C.Z.，等人(2004)Science 303，83-86)。在鼠造血系統(tǒng)細胞中系統(tǒng)性miRNA基因的概況分析揭示了相較于神經(jīng)元組織，造血系統(tǒng)中不同的miRNA表達模式，并確定了細胞分化期間發(fā)生的各個miRNA表達變化(Monticelli，S.，等人(2005)GenomeBiology 6，R71)。最近的研究已經(jīng)確定了miR-221與miR-222在人CD34+臍帶血祖細胞的紅細胞生成培養(yǎng)物中的下調(diào)(Felli，N.，等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.102，18081-18086)。發(fā)現(xiàn)這些miRNA靶向致癌基因c-Kit。另外的功能研究表明了這兩種miRNA在紅細胞生成培養(yǎng)物中的降低開啟了翻譯水平的Kit蛋白生產(chǎn)，其導致早期紅細胞樣細胞的擴展(Felli，N.，et al(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.102，18081-18086)。與miRNA調(diào)節(jié)細胞分化的假說一致，發(fā)現(xiàn)miR-223是包括C/EBPa和NFI-A的調(diào)節(jié)循環(huán)的主要成員，其控制粒細胞在全反式視黃酸治療的急性前髓細胞白血病細胞系中的分化(Fazi，F(xiàn).，等人(2005)Cell 123，819-831)。
還發(fā)現(xiàn)miRNA在造血惡性腫瘤中下調(diào)。實際上，聯(lián)系miRNA與癌癥的第一個報告涉及miR-15a與miR-16-1簇的缺失與下調(diào)，該簇位于染色體13q14.3，一種在慢性淋巴細胞性白血病中通常缺失的區(qū)域(Calin，G.A，et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99，1554-15529)。在B細胞淋巴瘤中也報道了miR-155與宿主基因BIC的高表達(Metzler M.，等人(2004)Genes Chromosomes and Cancer39；167-169)。新近，表明miR-17-92簇，其位于淋巴瘤中擴增的基因組區(qū)域，在人B細胞淋巴瘤中過表達，而且該簇的強迫性表達與c-MYC表達一致，以在小鼠B細胞淋巴瘤模型中加速腫瘤發(fā)育(He，L.，等人(2005)Nature 435，828-833)。這些觀察表明，miRNA是造血的重要調(diào)節(jié)劑，而且可能涉及惡性轉(zhuǎn)化。
血小板在止血與血栓形成中發(fā)揮基本作用。它們由它們的親本細胞，即骨髓巨核細胞大量產(chǎn)生，并起因于細胞質(zhì)的碎裂。什么可能原來是影響血小板生產(chǎn)的相關疾病的大家族的分子基礎，最近才開始被確定。如果循環(huán)血小板的水平降到低于一定數(shù)量(血小板減少)，則患者冒著災難性出血的風險。已經(jīng)接受了化療或骨髓移植的患有癌癥的患者通?；加醒“鍦p少，而且這些患者中血小板計數(shù)的緩慢恢復一直是所關切的事。對用于轉(zhuǎn)輸?shù)难“鍐挝坏男枨笠恢痹诓粩嘣黾?，主要是因為需要在這類患有癌癥的患者或經(jīng)歷重大的心臟手術的患者中保持某種血小板水平。
在癌細胞(例如，白血病細胞)中差異表達的微小RNA的鑒定可以幫助精確定位癌癥及其他疾病(例如，血小板疾病)中所涉及的特異性miRNA。而且，這些miRNA的假定靶的鑒定可以有助于闡明它們的致病作用。特別是，發(fā)現(xiàn)造血分化期間miRNA表達的模式與順序可以提供對于這些微小的非編碼基因在正常與惡性造血中功能性作用的了解。
需要新的方法與組合物，用于癌癥，骨髓增生性疾病與血小板疾病(例如，遺傳的血小板疾病)的診斷，預后和治療。
發(fā)明概述 本發(fā)明部分基于特異性miRNA的鑒定，該miRNA涉及巨核細胞分化和/或在癌細胞(例如，在急性巨核細胞白血病(AMKL細胞系))中具有改變的表達水平。在本研究中，研究了miRNA基因在來自骨髓CD34+祖細胞系和急性巨核細胞白血病細胞系中的表達。該分析的結(jié)果表明，幾種miRNA在正常的巨核細胞分化期間下調(diào)。這些結(jié)果此外證明，這些miRNA靶基因涉及巨核細胞生成，而其他的miRNA靶基因在癌細胞中過表達。
因此，本發(fā)明包括在個體(例如，人)中診斷或預測癌癥和/或骨髓增生性疾病的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，將來自個體的測試樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平與對照樣品中相應miR基因產(chǎn)物的水平進行比較。相對于對照樣品中相應miR基因產(chǎn)物的水平，測試樣品中miR基因產(chǎn)物的水平的改變指示個體患有癌癥和/或骨髓增生性疾病，或者處于發(fā)生癌癥和/或骨髓增生性疾病的風險中。在一個實施方案中，來自個體的測試樣品中miR基因產(chǎn)物的水平大于對照的。在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-99a，miR-99-prec，miR-106，miR-339，miR-99b，miR-149，miR-33，miR-135和miR-20。仍然在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-106，miR-20和miR-135。仍然在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-106，miR-20和miR-135。在特定的實施方案中，診斷或預測的癌癥是白血病(例如，急性粒細胞白血病(例如，急性巨核細胞白血病))或多發(fā)性骨髓瘤。在其他的實施方案中，骨髓增生性疾病選自原發(fā)性血小板增多癥(ET)，真性紅細胞增多(PV)，脊髓發(fā)育不良，骨髓纖維化(例如，原因不明的骨髓硬化癥(AMM)(也稱為自發(fā)的骨髓纖維化))和慢性粒細胞白血病(CML)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明是一種治療個體(例如，人)中的癌癥和/或骨髓增生性疾病的方法。在該方法中，施用有效量的化合物給個體，該化合物用于抑制選自miR-101，miR-126，miR-99a，miR-99-prec，miR-106，miR-339，miR-99b，miR-149，miR-33，miR-135和miR-20的至少一種miR基因產(chǎn)物的表達。在一個實施方案中，用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物表達的化合物抑制選自miR-101，miR-126，miR-106，miR-20和miR-135的miR基因產(chǎn)物的表達。在另一個實施方案中，用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物表達的化合物抑制選自miR-106，miR-20和miR-135的miR基因產(chǎn)物的表達。在特定的實施方案中，治療的癌癥是白血病(例如，急性粒細胞白血病(例如，急性巨核細胞白血病))或多發(fā)性骨髓瘤。在其他的實施方案中，骨髓增生性疾病選自原發(fā)性血小板增多癥(ET)，真性紅細胞增多(PV)，脊髓發(fā)育不良，骨髓纖維化(例如，原因不明的骨髓硬化癥(AMM)(也稱為自發(fā)的骨髓纖維化))和慢性粒細胞白血病(CML)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明是一種治療個體(例如，人)中與MAFB基因產(chǎn)物過表達相關的癌癥和/或骨髓增生性疾病的方法。在該方法中，施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物或其變體或生物學活性片段給個體，其與MAFB基因產(chǎn)物結(jié)合并降低MAFB基因產(chǎn)物的表達。在一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物，其變體或生物學活性片段包括一種與MAFB基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-130a或其變體或生物學活性片段。適于使用這種方法治療的癌癥和骨髓增生性疾病包括，例如，這里描述的那些疾病。
在另一個實施方案中，本發(fā)明是一種治療個體(例如，人)中與HOXA1基因產(chǎn)物過表達相關的癌癥和/或骨髓增生性疾病的方法。在該方法中，施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物或其變體或生物學活性片段給個體，其與HOXA1基因產(chǎn)物結(jié)合并降低HOXA1基因產(chǎn)物的表達。在一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物，其變體或生物學活性片段包括一種與HOXA1基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-10a或其變體或生物學活性片段。適于使用這種方法治療的癌癥和骨髓增生性疾病包括，例如，這里描述的那些疾病。
在一個實施方案中，本發(fā)明是一種確定和/或預測巨核細胞分化的方法。在這種方法中，測定樣品(例如，來自個體(例如，人))，包括巨核細胞后代和/或巨核細胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。將該水平與對照中相應的miR基因產(chǎn)物的水平進行比較。相對于對照的水平，樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平的改變是巨核細胞分化的指示。在一個實施方案中，該改變是樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物水平的降低。在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-10a，miR-126，miR-106，miR-010b，miR-130a，miR-130a-prec，miR-124a，miR-032-prec，miR-101，miR-30c，miR-213，miR-132-prec，miR-150，miR-020，miR-339，let-7a，let-7d，miR-181c，miR-181b和miR-017。仍然在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-10a，miR-10b，miR-30c，miR-106，miR-126，miR-130a，miR-132和miR-143。
本發(fā)明更進一步提供了用于治療癌癥和/或骨髓增生性疾病的藥物組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括至少一種miR表達抑制化合物和一種藥學可接受的載體。在一個特定的實施方案中，至少一種miR表達抑制化合物是miR基因產(chǎn)物特異性的，癌細胞(例如，急性巨核細胞白血病(AMKL)細胞)中該miR基因產(chǎn)物的表達大于對照細胞(即，它是上調(diào)的)。在一個實施方案中，miR表達抑制化合物是選自miR-101，miR-126，miR-99a，miR-99-prec，miR-106，miR-339，miR-99b，miR-149，miR-33，miR-135和miR-20的一種或多種miR基因產(chǎn)物特異性的。在另一個實施方案中，miR表達抑制化合物是選自miR-101，miR-126，miR-106，miR-20和miR-135的一種或多種miR基因產(chǎn)物特異性的。仍然在另一個實施方案中，miR表達抑制化合物是選自miR-106，miR-20和miR-135的一種或多種miR基因產(chǎn)物特異性的。仍然在另一個實施方案中，藥物組合物此外包括至少一種抗癌劑。
在一個實施方案中，本發(fā)明是一種藥物組合物，其用于治療與MAFB基因產(chǎn)物的過表達相關的癌癥，和/或與MAFB基因產(chǎn)物的過表達相關的骨髓增生性疾病。這種藥物組合物包括有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物和藥學上可接受的載體，其中至少一種miR基因產(chǎn)物與MAFB基因產(chǎn)物結(jié)合，并降低MAFB基因產(chǎn)物的表達。在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物，包括一種與MAFB基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。仍然在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-130a或其變體或生物學活性片段。仍然在另一個實施方案中，藥物組合物此外包括至少一種抗癌劑。
在一個實施方案中，本發(fā)明是一種藥物組合物，其用于治療與HOXA1基因產(chǎn)物的過表達相關的癌癥，和/或與HOXA1基因產(chǎn)物的過表達相關的骨髓增生性疾病。這種藥物組合物包括有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物和藥學上可接受的載體，其中至少一種miR基因產(chǎn)物與HOXA1基因產(chǎn)物結(jié)合，并降低HOXA1基因產(chǎn)物的表達。在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物，包括一種與HOXA1基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。仍然在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-10a或其變體或生物學活性片段。仍然在另一個實施方案中，藥物組合物此外包括至少一種抗癌劑。
當考慮到附圖閱讀時，根據(jù)下列優(yōu)選實施方案的詳細描述，本發(fā)明的各種目的和優(yōu)點對本領域技術人員來說將是顯然的。
附圖簡述 本專利或申請文件包含至少一幅以顏色制作的附圖。帶有顏色附圖的本專利或?qū)＠暾埑霭嫖锏目截惤?jīng)要求并支付必要的費用將由專利局提供。


圖1A-1D描述了Northern印跡和實時miRNA-PCR結(jié)果，其證實了CD34祖細胞分化實驗中的微小RNA芯片數(shù)據(jù)。
圖1A描述了miR-130a，miR-10a和miR-223的Northern印跡。用U6進行加樣RNA對照。
圖1B的圖表描述了miR-10a，miR-106，miR-126和miR-130a的RT-miRNA-PCR。miRNA表達以相對于培養(yǎng)之前的CD34+細胞的倍數(shù)差異表示。
圖1C的圖表通過微陣列描述了miR-223的瞬時表達。
圖1D的圖表通過RT-miRNA PCR描述了miR-15-1和miR-16-1的瞬時表達。
圖2A-2C證明了MAFB是miR-130a的靶。
圖2A描述了被誘導巨核細胞分化的CD34+祖細胞中的MAFB mRNA和蛋白表達數(shù)據(jù)。β-肌動蛋白用于RT-PCR和Western印跡加樣對照。
圖2B的圖表描述了用miR-10a和PGL33′UTR MAFB，帶有PGL33′UTR的miR-10a，種子匹配突變的miR-10a和帶有突變的，和野生型3’UTR MAFB的混雜物共轉(zhuǎn)染的MEG01細胞中熒光素酶活性的相對抑制。
圖2C描述了用miR-130a和混雜物轉(zhuǎn)染的K562細胞中MAFB總蛋白切割物的Western印跡。
圖3A-3G證明了miR-10a通過調(diào)節(jié)RNA切割下調(diào)HOXA1。
圖3A的圖表描述了在分化的巨核細胞中HOXA1基因表達的RT-PCR結(jié)果(在基線相對于CD34+祖細胞的轉(zhuǎn)錄物相對量)。
圖3B的Western印跡顯示了hoxal蛋白在分化的巨核細胞中的表達。
圖3C的圖表描述了當用miR-10a和對照混雜物共轉(zhuǎn)染時，HOXA13′UTR克隆的PGL3報告質(zhì)粒的熒光素酶活性的相對抑制。
圖3D的簡圖顯示了如通過PICTAR預測的，miR-10a與HOXA1 3′UTR之間的互補性。
圖3E描述了在混雜物與miR-10a前體轉(zhuǎn)染的K562細胞中，miR-10a基因表達的RT-PCR結(jié)果。
圖3F描述了在混雜物與miR-10a前體轉(zhuǎn)染的K562細胞中，HOXA1基因表達的RT-PCR結(jié)果。
圖3G的Western印跡顯示了在用對照混雜物與前體miR-10a轉(zhuǎn)染的K562細胞中的HOXA1表達。
圖4A和4B顯示了體外分化的CD34+祖細胞的表型表征結(jié)果。
圖4A描述了在培養(yǎng)的不同天數(shù)(第6天，第10天，第12天和第14天)，對培養(yǎng)中的CD34+祖細胞的細胞離心涂片(cytospin)制品進行的May-Giemsa染色。在第4天，大部分細胞是未成熟的，如通過高細胞核細胞質(zhì)比例證明的。在第10天觀察到較大的和多核細胞。在第14天，觀察到具有長胞質(zhì)突的顯著較大的，多倍體細胞和具有內(nèi)陷和液泡的許多膜泡(原始放大倍數(shù)400X)。
圖4B描述了體外分化的巨核細胞中CD34的FACS分析。顯示了培養(yǎng)物中生長的CD34+祖細胞的膜表型。在第10(D+10)，14(D+14)和16(D+16)天收獲細胞，并使用抗CD41抗體，抗CD61a抗體，抗CD42a抗體和它們的各自同種型單克隆抗體(D+10同種型；D+14同種型；D+16同種型)，通過單熒光標記進行分析。用抗CD41a和CD61b單克隆Ab，僅僅在第14天進行雙標記。
圖5的圖表描述了在分化的巨核細胞中miR-20和miR-17的RT-PCR表達結(jié)果。結(jié)果以用18S和ΔCt計算標準化以后，在基線相對于CD34+細胞的倍數(shù)差異表示。
圖6A的圖表描述了巨核細胞分化期間miR-16-1的瞬時表達。通過每薄片的中值標準化，確定miR-16-1的絕對表達值。
圖6B的圖表描述了巨核細胞分化期間miR-142的瞬時表達。通過每薄片的中值標準化，確定miR-142的絕對表達值。
圖6C的圖表描述了巨核細胞分化期間miR-181b的瞬時表達。通過每薄片的中值標準化，確定miR-181b的絕對表達值。
圖7是從用miR-130a前體和用miR-130a的探針雜交的混雜物序列轉(zhuǎn)染的K562細胞獲得的總RNA的Northern印跡。使用U6雜交進行RNA加樣對照。
圖8是描繪位于HOXA，HOXB，HOXC和HOXD基因簇的微小RNA的示意圖。
圖9A的圖表描述了分化的巨核細胞中HOXB4基因的表達。HOXB4的RT-PCR結(jié)果以基線(培養(yǎng)前)相對于CD34+祖細胞的表達水平的倍數(shù)差異表示。
圖9B的圖表描述了分化的巨核細胞中HOXB5基因的表達。HOXB5的RT-PCR結(jié)果以基線(培養(yǎng)前)相對于CD34+祖細胞的表達水平的倍數(shù)差異表示。
圖10的圖表描述了通過RT-PCR，在急性巨核細胞細胞系中微小RNA的表達。結(jié)果以用18S和ΔCt計算標準化以后相對于CD34分化的巨核細胞的倍數(shù)差異表示。
優(yōu)選實施方案的詳述 本發(fā)明部分基于特異性微小RNA(miRNA)的鑒定，該miRNA參與巨核細胞的分化和/或在癌細胞(例如，在急性巨核細胞白血病(AMKL細胞系))中具有改變的表達水平。本發(fā)明還部分基于這些miRNA與特定的診斷，預后和治療特征的相關。如這里描述和例示的 i)特定的miRNA在巨核細胞分化期間下調(diào)； ii)轉(zhuǎn)錄因子MAFB是miR-130a的靶； iii)miR-10a表達與HOXB基因表達平行； iv)miR-10a下調(diào)HOXA1表達；和 v)特定的miRNA在癌細胞(例如，急性巨核細胞白血病(AMKL)細胞)中下調(diào)。
如這里可互換使用的，“miR基因產(chǎn)物”，“微小RNA”，“miR”，“miR”或“miRNA”意指來自miR基因的未加工的或加工的RNA轉(zhuǎn)錄物。由于miR基因產(chǎn)物沒有翻譯成蛋白，術語“miR基因產(chǎn)物”不包括蛋白。未加工的miR基因轉(zhuǎn)錄物也稱為“miR前體”，而且一般包括長度大約為70-100個核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物?？赏ㄟ^用RNA酶(例如，切酶，Argonaut，RNA酶III(例如，大腸桿菌RNA酶III))消化，將miR前體加工成活性的19-25個核苷酸的RNA分子。這種活性的19-25個核苷酸的RNA分子也稱為“加工的”miR基因轉(zhuǎn)錄物或“成熟”miRNA。
可通過天然的加工途徑(例如，使用完整細胞或細胞切割物)，或通過合成加工途徑(例如，使用分離的加工酶，如分離的切酶，Argonaut，或RNA酶III)，從miR前體獲得活性的19-25個核苷酸的RNA分子。應當理解，活性的19-25個核苷酸的RNA分子也可以通過生物學或化學合成直接產(chǎn)生，而不必從miR前體加工。當微小RNA這里通過名稱提及時，該名稱相應于前體和成熟形式，除非另有說明。
表1a和1b描述了特定的前體和成熟人微小RNA的核苷酸序列。
表1a人微小RNA前體序列。
*前體序列內(nèi)的下劃線序列相應于成熟的加工的miR轉(zhuǎn)錄物(參見表1b)。一些前體序列具有兩個下劃線序列，表示來源于相同前體的兩個不同的成熟miR。所有的序列都是人的。
表1b人成熟微小RNA序列。
本發(fā)明包括診斷或預測個體是否患有癌癥和/或骨髓增生性疾病，或處于發(fā)展癌癥和/或骨髓增生性疾病的風險中的方法。該方法包括確定來自個體的樣品至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，并比較樣品與對照中該miR基因產(chǎn)物的水平。如這里使用的，“個體”可以是任何哺乳動物，其患有或懷疑患有癌癥和/或骨髓增生性疾病。在一個優(yōu)選的實施方案中，個體是人，其患有或懷疑患有癌癥，骨髓增生性疾病和/或血小板疾病。
可以在獲自個體的生物樣品的細胞中，測定至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，可以通過常規(guī)的活組織切片檢查技術，從懷疑患有癌癥和/或骨髓增生性疾病的個體取出組織樣品。在另一個實施方案中，可以從個體取出血液樣品，而且可通過標準技術分離白血球用于DNA提取。在一個實施方案中，在放射治療，化療或其他的治療開始之前，從個體獲得血液或組織樣品。對應的對照組織或血液樣品，或?qū)φ諈⒄諛悠?例如，獲自對照樣品的群體)，可以從個體的未受影響的組織，從正常的人個體或正常個體的群體，或從相當于個體樣品中大部分細胞的培養(yǎng)細胞獲得。對照組織或血液樣品然后可以與來自個體的樣品一起加工，以便來自個體的樣品的細胞中給定miR基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的水平可以與來自對照樣品的細胞的相應miR基因產(chǎn)物水平相比較。作為選擇，可以從測試樣品分別地(例如，在不同的時間)獲得參照樣品并加工，而且來自測試樣品的細胞中給定miR基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的水平可以與來自參照樣品的對應miR基因產(chǎn)物水平相比較。
在一個實施方案中，測試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平高于對照樣品中相應miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達是“上調(diào)的”)。如這里使用的，當來自個體的細胞或組織樣品中miR基因產(chǎn)物的量大于對照(例如，參照標準，對照細胞樣品，對照組織樣品)中相同的基因產(chǎn)物的量時，miR基因產(chǎn)物的表達是“上調(diào)的”。在另一個實施方案中，測試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平低于對照樣品中相應miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達是“下調(diào)的”)。如這里使用的，當來自個體的細胞或組織樣品中該基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的量低于對照細胞或組織樣品中相同的基因產(chǎn)生的量時，miR基因的表達是“下調(diào)的”。可以根據(jù)一種或多種RNA表達標準，確定對照與正常樣品中相對的miR基因表達。該標準可以包括，例如，零miR基因表達水平，標準細胞系中miR基因表達水平，個體的未受影響的組織中miR基因表達水平，或miR基因表達的平均水平，其預先獲得用于正常的人對照群體(例如，對照參照標準)。
相對于對照樣品中相應miR基因產(chǎn)物的水平，從個體獲得的樣品中miR基因產(chǎn)物水平的改變指示個體中癌癥和/或骨髓增生性疾病的存在。在一個實施方案中，測試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平高于對照樣品中相應miR基因產(chǎn)物的水平。這里描述和例示了在癌細胞系(例如，AMKL細胞系)比在對照細胞(例如，體外CD34+分化的巨核細胞)中的表達水平高的miR基因產(chǎn)物(參見，例如，實施例5)。在一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-99a，miR-99-prec，miR-106，miR-339，miR-99b，miR-149，miR-33，miR-135，miR-20及其組合。在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-106，miR-20和miR-135及其組合。仍然在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-106，miR-20和miR-135及其組合。如這里描述和例示的，這種miR基因產(chǎn)物增加的表達將癌細胞與對應的非癌細胞區(qū)分開。
如這里描述的，本發(fā)明的診斷和預測方法可用于診斷或預測癌癥和/或骨髓增生性疾病。在特定的實施方案中，該診斷和預測方法可用于診斷或預測個體，組織樣品，細胞樣品或液體樣品中的癌癥。該診斷和預測方法可用于診斷或預測任何類型的癌癥。在特定的實施方案中，該診斷和預測方法可用于診斷或預測白血病。在一個實施方案中，診斷或預測的白血病是急性粒細胞白血病(例如，急性巨核細胞白血病)。在其他的實施方案中，該診斷和預測方法可用于診斷或預測多發(fā)性骨髓瘤。
本發(fā)明的診斷和預測方法還可以用于診斷或預測血液學惡性腫瘤(例如，骨髓增生性疾病)。在一個實施方案中，診斷或預測的骨髓增生性疾病選自原發(fā)性血小板增多病(ET)，真性紅細胞增多(PV)，脊髓發(fā)育不良，骨髓纖維化(例如，原因不明的骨髓硬化癥(AMM)(也稱為自發(fā)的骨髓纖維化))和慢性粒細胞白血病(CML)。
在特定的實施方案中，本發(fā)明的診斷，預測和治療方法也可用于診斷，預測和/或治療血小板疾病(例如，遺傳血小板疾病)。例如，該診斷，預測和治療方法可用于診斷，預測和/或治療血小板-血管壁相互作用中的缺陷(即，附著病)。這種附著病包括，例如，血管性血友病(血漿vWF的缺乏或缺陷)和巨血小板綜合征(GPIb的缺乏或缺陷)。在其他的實施方案中，本發(fā)明的診斷，預測和治療方法可用于診斷，預測和/或治療血小板-血小板相互作用中的缺陷(即，聚集病)。這種聚集病包括，先天性纖維蛋白原缺乏癥(血漿纖維蛋白原缺乏)和格蘭茨曼血小板衰弱癥(GPIIb-IIIa缺乏或缺陷)。在其他的實施方案中，該診斷，預測和治療方法可用于診斷，預測和/或治療血小板分泌病和顆粒異常。這種血小板分泌病和顆粒異常包括，例如，儲存庫缺乏和Quebec血小板疾病。仍然在其他的實施方案中，該診斷，預測和治療方法可用于診斷，預測和/或治療血小板分泌和信號轉(zhuǎn)導病(原發(fā)的分泌缺陷)。這種原發(fā)的分泌缺陷包括，例如，血小板-拮抗劑相互作用缺陷(受體缺陷)(例如，凝血噁烷A2，膠原蛋白，ADP，腎上腺素)，G蛋白激活缺陷(例如，Gαq缺乏，Gαs異常，Gαi缺乏)，磷脂酰肌醇代謝缺陷(例如，磷脂酶C-2缺乏)，鈣調(diào)動中的缺陷，蛋白質(zhì)磷酸化中的缺陷(血小板-白細胞C激酶底物)PKC-y缺乏，和花生四烯酸途徑和凝血噁烷合成異常(例如，環(huán)加氧酶缺乏，凝血噁烷合成酶缺乏)。在其他的實施方案中，該診斷，預測和治療方法可用于診斷，預測和/或治療細胞骨架調(diào)節(jié)中的缺陷(例如，維-奧二氏綜合癥)。仍然在其他的實施方案中，該診斷，預測和治療方法可用于診斷，預測和/或治療血小板促凝劑-蛋白質(zhì)相互作用病(膜磷脂缺陷)(例如，斯克特綜合征)。其他的血小板病(例如，遺傳性血小板病)也可以使用本發(fā)明的方法診斷，預測和/或治療。
本發(fā)明還提供了確定患有癌癥和/或骨髓增生性疾病的個體預后的方法。在該方法中，在來自個體的測試樣品中測定至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其與癌癥和/或骨髓增生性疾病中特定的預后相關(例如，好的或陽性預后，差的或不利的預后)。相對于對照樣品中相應miR基因產(chǎn)物的水平，測試樣品中miR基因產(chǎn)物水平的改變是患有癌癥和/或骨髓增生性疾病的個體具有特定預后的指示。在一個實施方案中，miR基因產(chǎn)物與不利的(即，差的)預后相關。不利預后的例子包括，但不限于，低的存活率和快速疾病進展。在一個實施方案中，測試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平高于對照樣品中相應miR基因產(chǎn)物的水平(即，它是上調(diào)的)。在一個特定的實施方案中，上調(diào)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-99a，miR-99-prec，miR-106，miR-339，miR-99b，miR-149，miR-33，miR-135，miR-20及其組合。在另一個實施方案中，上調(diào)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-106，miR-20和miR-135及其組合。仍然在另一個實施方案中，上調(diào)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-106，miR-20和miR-135及其組合。這種miR基因產(chǎn)物增加的表達，可能與個體的癌癥和/或骨髓增生性疾病的不利預后和嚴重程度相關。
在這里描述的診斷和預測方法的某些實施方案中，通過從獲自個體的測試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核糖核苷酸，使該靶寡脫氧核糖核苷酸與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供測試樣品的雜交型，并將測試樣品的雜交型與對照樣品產(chǎn)生的雜交型進行比較，來測定至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。
特定miR基因產(chǎn)物(例如，相對于對照樣品那些miR基因產(chǎn)物顯示上調(diào)或下調(diào)表達)靶的鑒定有助于闡明微小RNA的作用機理。如這里描述和例示的，鑒定了選擇的微小RNA的特定靶和假定的靶(參見，例如，表2，3和5和例證)。例如，轉(zhuǎn)錄因子MAFB被鑒定為mi-130a的靶(實施例2)。類似地，HOXA1被鑒定為miR-10a的靶(實施例5)。對于兩種miR，證實了miR與它的各自靶的3′UTR的直接相互作用(實施例2和5)。而且，證明了miR表達與它的各自靶的反相關。因此，前miR-130a的表達導致降低的MAFB表達(參見，例如，圖2C)，而前miR-10a的表達導致降低的HOXA1表達(參見，例如，圖3C，3F和3G)。因此，在一個實施方案中，特定微小RNA的靶基因的表達(例如，表2，3和5中所列的那些)可用于診斷癌癥和/或骨髓增生性疾病。這些靶基因顯示與靶向它的各自miR相反的表達。本領域的技術人員可以使用已知的方法，和/或這里描述用于測定微小RNA的表達水平的方法(例如，定量或半定量RT-PCR，Northern印跡分析，溶液雜交檢測，微陣列分析)來測定這些靶基因的表達水平，而不需要過度的實驗。在特定的實施方案中，測定的靶基因是MAFB或HOXA1。
可以使用本領域技術人員公知的各種技術(例如，定量或半定量RT-PCR，Northern印跡分析，溶液雜交檢測)測定至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個特定的實施方案中，通過從獲自個體的測試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一或多組靶寡脫氧核糖核苷酸，使該靶寡脫氧核糖核苷酸與一種或多種miRNA特異性探針寡核苷酸(例如，包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列)雜交，以提供測試樣品的雜交型，并將測試樣品的雜交型與對照樣品產(chǎn)生的雜交型進行比較，來測定至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。相對于對照樣品，測試樣品中至少一種miRNA信號的改變是個體患有癌癥和/或骨髓增生性疾病或處于發(fā)展癌癥和/或骨髓增生性疾病的風險中的指示。在一個實施方案中，相對于對照樣品產(chǎn)生的信號，至少一種miRNA的信號是上調(diào)的。在另一個實施方案中，相對于對照樣品產(chǎn)生的信號，至少一種miRNA的信號是下調(diào)的。在一個特定的實施方案中，微陣列包含miRNA特異性探針寡核苷酸，其用于全部已知人miRNA的相當部分(例如，表1a和1b中所列的miRNA，加上其他已知的或發(fā)現(xiàn)的miRNA)。在一個另外的實施方案中，微陣列包含用于一種或多種miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸，該miRNA選自miR-101，miR-126，miR-99a，miR-99-prec，miR-106，miR-339，miR-99b，miR-149，miR-33，miR-135，miR-20及其組合。在一個實施方案中，微陣列包含用于一種或多種miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸，該miRNA選自miR-101，miR-126，miR-106，miR-20和miR-135及其組合。
可以從由已知的miRNA序列產(chǎn)生的基因特異性寡核苷酸探針制備微陣列。該陣列可以包含用于每種miRNA的兩個不同的寡核苷酸探針，一個包含活性的，成熟序列，另一個是miRNA的前體特異性的。陣列也可包含對照，如只有幾個堿基不同于人直向同源物的一種或多種小鼠序列，其可用作對照用于雜交嚴格條件。來自兩個物種的tRNA和其他RNA(例如，rRNA，mRNA)，也可以印跡到微芯片上，提供一個內(nèi)部的，相對穩(wěn)定的，陽性對照用于特異性雜交。微芯片中還可以包括用于非特異性雜交的一個或多個合適的對照。為此目的，根據(jù)具有任何已知miRNA的任何同源物的缺乏來選擇序列。
也可以使用本領域已知的技術來制備微陣列。例如，合適長度如40個核苷酸的探針寡核苷酸，在C6位置進行5′-胺修飾，并使用商業(yè)可獲得的微陣列系統(tǒng)，例如，GeneMachine OmniGridTM 100微陣列儀和Amersham CodeLinkTM活化的載玻片印跡。通過用標記的引物逆轉(zhuǎn)錄靶RNA，來制備相應于靶RNA的標記的cDNA寡聚物。第一鏈合成以后，使RNA/DNA雜交體變性以降解RNA模板。然后使這樣制備的標記的靶cDNA與微陣列芯片在雜交條件下雜交，例如，6X SSPE/30％甲酰胺于25℃18小時，然后于37℃在0.75X TNT中洗滌40分鐘。在陣列中固定的探針DNA識別樣品中互補的靶cDNA的位置，發(fā)生雜交。標記的靶cDNA標明陣列中結(jié)合發(fā)生的精確位置，允許自動檢測和定量。輸出包括一系列雜交事件，其表明特異性cDNA序列的相對豐度，從而表明患者樣品中對應的互補miR的相對豐度。根據(jù)一個實施方案，標記的cDNA寡聚物是一種從生物素標記的引物制備的生物素標記的cDNA。然后使用例如鏈霉親和素-Alexa647配合物，通過包含生物素的轉(zhuǎn)錄物的直接檢測對微陣列進行處理，并利用常規(guī)的掃描方法掃描。陣列上每個點的圖像強度，與患者樣品中對應miR的豐度成正比。
使用陣列對miRNA表達檢測具有幾個優(yōu)點。第一，可以在相同的樣品中，在一個時間點，確定幾百個基因的整體表達。第二，通過仔細設計寡核苷酸探針，可以確定成熟和前體分子的表達。第三，與Northern印跡分析相比，芯片需要少量的RNA，而且使用2.5μg總RNA，提供可重復的結(jié)果。相對有限數(shù)量的miRNA(每個種幾百個)，允許構(gòu)建用于幾個種的公共微陣列，每個種具有獨特的寡核苷酸探針。這種工具允許分析每種已知的miR在不同條件下的跨種表達。
除了用于特定miR的定量表達水平分析之外，包含相應于相當部分的miRNA組，優(yōu)選總的miRNA組的miRNA特異性探針寡核苷酸的芯片，可用于進行miR基因表達型作圖，用于分析miR表達模式。獨特的miR特征可能與確定的疾病標記相關，或直接與疾病狀況相關。
根據(jù)這里描述的表達型作圖方法，來自懷疑患有癌癥和/或骨髓增生性疾病的個體的樣品的總RNA，進行定量逆轉(zhuǎn)錄，以提供一組標記的靶寡脫氧核糖核苷酸，其與樣品中RNA互補。靶寡脫氧核糖核苷酸然后與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供樣品的雜交型。結(jié)果是樣品的雜交型，其表示樣品中miRNA的表達模式。雜交型包括來自樣品的靶寡脫氧核糖核苷酸與微陣列中的miRNA特異性探針寡核苷酸結(jié)合的信號。分布圖可以記錄為存在或缺乏結(jié)合(信號對零信號)。更優(yōu)選地，記錄的分布圖包括來自每個雜交的信號強度。將該分布圖與正常(例如，非癌癥，非骨髓增生性疾病)對照樣品或參照樣品產(chǎn)生的雜交型進行比較。信號改變是個體中癌癥存在或傾向發(fā)生癌癥的指示。
用于測定miR基因表達的其他技術也在本領域技術內(nèi)，包括用于測定RNA轉(zhuǎn)錄和降解速率的各種技術。
本發(fā)明也提供了利用不利的預后，診斷個體是否患有癌癥和/或骨髓增生性疾病或處于發(fā)生癌癥和/或骨髓增生性疾病的風險中的方法。在該方法中，通過從獲得個體的測試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核糖核苷酸來測定至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其與癌癥和/或骨髓增生性疾病中不利的預后相關。靶寡脫氧核糖核苷酸然后與一種或多種miRNA特異性探針寡核苷酸(例如，包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列)雜交，以提供測試樣品的雜交型，并將測試樣品雜交型與對照樣品產(chǎn)生的雜交型進行比較。相對于對照樣品，測試樣品中至少一種miRNA信號的改變是個體患有癌癥和/或骨髓增生性疾病或處于發(fā)生癌癥和/或骨髓增生性疾病的風險中的指示，其具有不利的預后。適合用于這種方法的miR包括，例如，在癌細胞(例如，AMKL細胞)中上調(diào)的那些。
在本發(fā)明的診斷，預測和治療方法，以及本發(fā)明的藥物組合物的特定實施方案中，miR基因產(chǎn)物不是下列中的一種或多種let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
如這里所述的，可使用適于檢測生物樣品中RNA表達水平的任何技術，來測定樣品中miR基因產(chǎn)物的水平。用于確定生物樣品(例如，細胞，組織)中RNA表達水平的合適技術(例如，Northern印跡分析，RT-PCR，原位雜交)，是本領域技術人員公知的。在一個特定的實施方案中，使用Northern印跡分析檢測至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，在存在核酸提取緩沖液時，可通過均質(zhì)化，接著離心，從細胞純化總的細胞RNA。沉淀核酸，并通過用DNA酶處理和沉淀來除去DNA。然后根據(jù)標準技術，通過在瓊脂糖凝膠上凝膠電泳來分離RNA分子，并轉(zhuǎn)入硝酸纖維素濾膜。然后通過加熱將RNA固定在濾膜上。使用適當標記的DNA或RNA探針，其與所討論的RNA互補，來進行特定RNA的檢測和定量。參見，例如，Molecular CloningA LaboratoryManual，J.Sambrook等人，eds.，2nd edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，第7章，以其公開的全部內(nèi)容引入作為參考。
可以從表1a和表1b中提供的核酸序列，產(chǎn)生用于給定miR基因產(chǎn)物Northern印跡雜交的適合探針(例如，DNA探針，RNA探針)，而且其包括，但不限于，與目標miR基因產(chǎn)物至少大約70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％互補的探針，以及與目標miR基因產(chǎn)物完全互補的探針。Molecular CloningA Laboratory Manual，J.Sambrook等人，eds.，2nd edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989，第10和11章，中描述了用于制備標記的DNA和RNA探針的方法，和用于其與靶核苷酸序列雜交的條件，以其公開內(nèi)容引入這里作為參考。
例如，核酸探針可以用例如放射性核素，如3H，32P，33P，14C或35S；重金屬；能用作特定的結(jié)合對成員用于標記配體的配體(例如，生物素，抗生物素蛋白或抗體)；熒光分子；化學發(fā)光分子；酶等等進行標記。
探針可通過Rigby等(1977)，J.Mol.Biol.113237-251的缺口翻譯方法，或通過Fienberg等的隨機引物方法(1983)，Anal.Biochem.1326-13標記成高比活性，以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。后者是選擇用于從單鏈DNA或RNA模板合成32P標記的高比活性探針的方法。例如，根據(jù)缺口翻譯方法，用高放射性的核苷酸置換先存在的核苷酸，制備具有超過108cpm/微克的比活性的32P標記的核酸探針是可能的。然后可通過將雜交的濾膜暴露于感光膠片來進行雜交的放射自顯影檢測。通過雜交濾膜暴露的感光膠片的光密度掃描，提供了miR基因轉(zhuǎn)錄水平的精確測定。使用另一種方法，可通過計算機化成像系統(tǒng)，如獲自Amersham Biosciences，Piscataway，NJ的Molecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager，定量miR基因轉(zhuǎn)錄水平。
當DNA或RNA探針的放射性核素標記沒有實用性時，隨機引物方法可用于將類似物，例如，dTTP類似物5-(N-(N-生物素基-ε-氨基己?；?-3-氨基烯丙基)脫氧尿苷三磷酸鹽整合到探針分子中。可通過與熒光染料或產(chǎn)生顯色反應的酶偶聯(lián)的生物素結(jié)合蛋白如抗生物素蛋白，鏈霉親和素和抗體(例如，抗生物素抗體)反應，來檢測生物素化的探針寡核苷酸。
除了Northern和其他RNA雜交技術，可使用原位雜交技術來確定RNA轉(zhuǎn)錄的水平。該技術需要的細胞少于Northern印跡技術，而且涉及將全部細胞置于顯微鏡蓋玻片上，并用包含放射性或相反標記核酸(例如，cDNA或RNA))探針的溶液，探測細胞的核酸含量。這種技術尤其很適于分析來自個體的組織活檢樣品。美國專利5,427,916中詳細描述了原位雜交技術的實施，以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。如上所述，可以從表1a和表1b中提供的核酸序列產(chǎn)生用于給定miR基因產(chǎn)物原位雜交的適合探針，而且其包括，但不限于，與目標miR基因產(chǎn)物至少大約70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％互補的探針，以及與目標miR基因產(chǎn)物完全互補的探針。
也可以通過miR基因轉(zhuǎn)錄物的逆轉(zhuǎn)錄，接著通過聚合酶鏈反應擴增逆轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄物(RT-PCR)，確定miR基因轉(zhuǎn)錄物的相對數(shù)，例如，如這里例示的?？梢耘c內(nèi)標準，例如，來自相同樣品中存在的“看家”基因的mRNA水平相比較來定量miR基因轉(zhuǎn)錄物的水平。適合用作內(nèi)標準的“看家”基因包括，例如，U6核內(nèi)小RNA，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)。用于進行定量和半定量RT-PCR的方法及其變體是本領域技術人員公知的。
在有些情況下，同時確定樣品中許多不同miR基因產(chǎn)物的表達水平是合乎需要的。在其他的情況中，需要確定與癌癥和/或骨髓增生性疾病相關的所有已知miR基因的轉(zhuǎn)錄物的表達水平。評估數(shù)百種miR基因或基因產(chǎn)物的癌癥特異性表達水平是耗費時間的，而且需要大量的總RNA(例如，每個Northern印跡至少20μg)以及需要放射性同位素的放射自顯影技術。
為了克服這些限制，可以構(gòu)建微芯片形式的寡核苷酸文庫(即，微陣列)，其包含一組miR基因特異性的一組寡核苷酸(例如，寡脫氧核糖核苷酸)探針。使用這種微陣列，可通過逆轉(zhuǎn)錄RNA以產(chǎn)生一組靶寡脫氧核糖核苷酸，并使它們與微陣列上的探針寡核苷酸雜交，而產(chǎn)生雜交或表達型來確定生物樣品中許多微小RNA的表達水平。然后將測試樣品的雜交型與對照樣品的雜交型進行比較來確定癌細胞和/或顯示骨髓增生性疾病的細胞中具有改變的表達水平的微小RNA。如這里使用的，“探針寡核苷酸”或“探針寡脫氧核糖核苷酸”意指能與靶寡核苷酸雜交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脫氧核糖核苷酸”意指待檢測的分子(例如，通過雜交)?！癿iR特異性探針寡核苷酸”或“特異于miR的探針寡核苷酸”意指具有選擇與特異性的miR基因產(chǎn)物，或特異性miR基因產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄物雜交的序列的探針寡核苷酸。
特定樣品的“表達型”或“雜交型”基本上是樣品狀況的指紋；雖然兩種狀況可以具有類似表達的任何特定基因，但是許多基因的評價同時允許產(chǎn)生只有細胞狀況才有的基因表達型。即，正常組織，細胞或液體樣品可能不同于顯示對應的癌和/或骨髓增生性疾病的組織，細胞或液體樣品。顯示癌和/或骨髓增生性疾病的組織，細胞或液體樣品內(nèi)，不同的預后狀況(例如，好的或差的長期存活前景)可以被確定。通過比較顯示癌和/或骨髓增生性疾病的組織，細胞或液體樣品在不同狀況的表達型，獲得了關于在每種這些狀況中哪個基因是重要的的信息(包括基因的上調(diào)和下調(diào))。在顯示癌和/或骨髓增生性疾病的組織，細胞或液體樣品中差異表達的序列的鑒定，以及導致不同預后結(jié)果的差異表達，允許以許多方式利用該信息。例如，可以評價特定的治療方式(例如，以確定一種化學治療藥物是否能在特定的個體中改善長期預后)。類似地，可以進行診斷或通過比較來自具有已知表達型的個體的樣品來確認診斷。而且，這些基因表達型(或單個基因)允許篩選藥物候選者，其抑制癌和/或骨髓增生性疾病表達型或?qū)⒉畹念A后分布圖轉(zhuǎn)變成較好的預后分布圖。
不希望受任何一種理論束縛，相信細胞中一種或多種miR基因產(chǎn)物水平的改變，能導致這些miR的一個或多個指定靶的下調(diào)，其可能導致異常的巨核細胞分化和/或癌，骨髓增生性疾病和/或血小板疾病的形成。因此，改變miR基因產(chǎn)物的水平(例如，通過降低在顯示癌和/或骨髓增生性疾病的細胞中上調(diào)的miR的水平，通過增加在顯示癌和/或骨髓增生性疾病的細胞中下調(diào)的miR的水平)可成功地治療癌，骨髓增生性疾病和/或血小板疾病。
因此，本發(fā)明包含治療個體中的癌和/或骨髓增生性疾病的方法，其中至少一種miR基因產(chǎn)物在個體的細胞(例如，顯示癌細胞和/或骨髓增生性疾病的細胞)中失控(例如，下調(diào)，上調(diào))。在一個實施方案中，測試樣品(例如，包含顯示癌和/或骨髓增生性疾病的組織，細胞或液體的樣品)中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平高于對照或參照樣品中相應miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個實施方案中，測試樣品(例如，包含顯示癌和/或骨髓增生性疾病的組織，細胞或液體的樣品)中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平低于對照樣品中相應miR基因產(chǎn)物的水平。當至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在測試樣品(例如，包含顯示癌和/或骨髓增生性疾病的組織，細胞或液體的樣品)中下調(diào)時，該方法包括施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物學活性片段，以便抑制個體中顯示癌和/或骨髓增生性疾病的細胞的增殖。例如，當一種miR基因產(chǎn)物在個體的癌細胞中下調(diào)時，施用有效量的分離的miR基因產(chǎn)物給個體能抑制癌細胞的增殖。施用給個體的分離的miR基因產(chǎn)物可以與在癌細胞中下調(diào)的內(nèi)源野生型miR基因產(chǎn)物(例如，表1a或表1b中顯示的miR基因產(chǎn)物)相同，或者它可以是其變體或生物學活性片段。如這里定義的，miR基因產(chǎn)物的“變體”意指與相應的野生型miR基因產(chǎn)物具有小于100％的同一性，并具有相應野生型miR基因產(chǎn)物的一種或多種生物學活性的miRNA。這種生物學活性的例子包括，但不限于，抑制靶RNA分子的表達(例如，抑制靶RNA分子的翻譯，調(diào)節(jié)靶RNA分子的穩(wěn)定性，抑制靶RNA分子的加工)和抑制與癌和/或骨髓增生性疾病相關的細胞過程(例如，細胞分化，細胞生長，細胞死亡)。這些變體包括種變體和miR基因中一種或多種突變(例如，置換，缺失，插入)的結(jié)果的變體。在某些實施方案中，變體與相應的野生型miR基因產(chǎn)物的同一性為至少大約70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，或99％。
如這里定義的，miR基因產(chǎn)物的“生物學活性片段”意指具有相應的野生型miR基因產(chǎn)物的一種或多種生物學活性的miR基因產(chǎn)物的RNA片段。如上所述，這種生物學活性的例子包括，但不限于，抑制靶RNA分子的表達和抑制與癌和/或骨髓增生性疾病相關的細胞過程。在某些實施方案中，生物學活性片段的長度為至少大約5，7，10，12，15或17個核苷酸。在一個特定的實施方案中，將分離的miR基因產(chǎn)物施用給個體，同時結(jié)合一種或多種另外的抗癌治療。適合的抗癌治療包括，但不限于，化療，放射治療及其組合(例如，化放療)。
當至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細胞中上調(diào)時，該方法包括施用有效量的化合物給個體，該化合物能抑制至少一種miR基因產(chǎn)物的表達，從而抑制顯示癌和/或骨髓增生性疾病的細胞的增殖。這種化合物這里指miR基因表達抑制化合物。適合的miR基因表達抑制化合物的例子包括，但不限于，這里描述的那些(例如，雙鏈RNA，反義核酸和酶促RNA分子)。在一個特定的實施方案中，將抑制miR基因表達的化合物施用給個體，同時結(jié)合一種或多種另外的抗癌治療。適合的抗癌治療包括，但不限于，化療，放射治療及其組合(例如，化放療)。
如描述的，當至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細胞(例如，AMKL細胞)中上調(diào)時，該方法包括施用有效量的至少一種化合物給個體用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物的表達，因此抑制癌細胞的增殖。在一個實施方案中，用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物表達的化合物抑制選自以下的miR基因產(chǎn)物miR-101，miR-126，miR-99a，miR-99-prec，miR-106，miR-339，miR-99b，miR-149，miR-33，miR-135，miR-20及其組合。在另一個實施方案中，用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物表達的化合物抑制選自miR-101，miR-126，miR-106，miR-20，miR-135及其組合的miR基因產(chǎn)物。在又一個實施方案中，用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物表達的化合物抑制選自miR-106，miR-20，miR-135及其組合的miR基因產(chǎn)物。
如這里描述和例示的，轉(zhuǎn)錄因子MAFB，其在巨核細胞分化中上調(diào)，是miR-130a的靶。而且，證明了miR-130a表達與它的各自靶的反相關。因此，前miR-130a的表達導致MAFB降低的表達(參見，例如，圖2C)。MAFB已知在癌(例如，多發(fā)性骨髓瘤和急性粒細胞白血病)中失控。例如，已經(jīng)在攜帶(14；20)(q32；q11)染色體易位的人骨髓瘤細胞中觀察到MAFB的異位表達(Hanamura，I.，等人(2001)Jpn.J.Cancer Res.92(6)638-644(2001))。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明是一種治療個體中的癌和/或骨髓增生性疾病的方法，包括施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物學活性片段給個體，其中 癌和/或骨髓增生性疾病與MAFB基因產(chǎn)物的過表達相關；和 至少一種miR基因產(chǎn)物結(jié)合MAFB基因產(chǎn)物，并降低MAFB基因產(chǎn)物的表達。
在一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物學活性片段包括一種與MAFB基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補的核苷酸序列(例如，與MAFB的3’UTR互補)。在一個特定的實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-130a或其分離的變體或生物學活性片段。
同樣如這里描述和例示的，HOXA1的mRNA，HOX蛋白家族的成員之一，在巨核細胞分化中上調(diào)7倍(參見，例如，實施例4)。而且，HOXA1是miR-10a的靶，而且它的表達與miR-10a的表達反相關。因此，前miR-10a的表達導致HOXA1降低的表達(參見，例如，圖3C，3F和3G)。HOXA1。HOXA1的表達已經(jīng)證明足以導致具有攻擊性體內(nèi)腫瘤形成的永生化人乳房上皮細胞的致癌性轉(zhuǎn)化(Zhang，X.，等人，(2002)J.Biol.Chem.278(9)7580-7590)。而且，HOXA1在乳房癌細胞中以Bc1-2依賴的方式的強迫性表達，導致無貼壁依賴性增殖和軟瓊脂中集落形成的顯著增強。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明是一種治療個體中的癌和/或骨髓增生性疾病的方法，包括施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物學活性片段給個體，其中 癌和/或骨髓增生性疾病與HOXA1基因產(chǎn)物的過表達相關；和 至少一種miR基因產(chǎn)物結(jié)合HOXA1基因產(chǎn)物，并降低HOXA1基因產(chǎn)物的表達。
在一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物學活性片段包括一種與HOXA1基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補的核苷酸序列(例如，與HOXA1的3’UTR互補)。在一個特定的實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-10a或其分離的變體或生物學活性片段。
在一個相關的實施方案中，治療個體中的癌和/或骨髓增生性疾病的方法包括首先確定來自個體的樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的量的步驟，并比較miR基因產(chǎn)物的水平與對照中相應miR基因產(chǎn)物的水平。如果在來自個體的樣品中miR基因產(chǎn)物失控(例如，下調(diào)，上調(diào))，該方法此外包括改變在來自個體的樣品中表達的至少一種miR基因產(chǎn)物的量。在一個實施方案中，在來自個體的樣品中表達的miR基因產(chǎn)物的量低于在對照中表達的miR基因產(chǎn)物的量，并將有效量的miR基因產(chǎn)物，或其分離的變體或生物學活性片段施用給個體。在另一個實施方案中，在來自個體的樣品中表達的miR基因產(chǎn)物的量高于在對照中表達的miR基因產(chǎn)物的量，并將有效量的至少一種化合物施用給個體，該化合物用于抑制至少一種miR基因的表達。適合的miR和能抑制miR基因表達的化合物包括，例如，這里描述的那些。
如這里使用的，術語“treat(治療)”，“treating(治療)”和“treatment(治療)”意指改善與疾病或不適例如癌和/或骨髓增生性疾病相關的癥狀，包括預防或延遲病征的發(fā)作，和/或減輕疾病或不適的癥狀的嚴重程度或頻率。術語“受試者”，“患者”和“個體”，這里限定為包括動物如哺乳動物，包括但不限于，靈長類動物，牛，綿羊，山羊，馬，狗，貓，兔，豚鼠，大鼠，小鼠或其他的牛類，羊，馬類，犬科的，貓科的，嚙齒動物或鼠科種類。在一個優(yōu)選的實施方案中，動物是人。
如這里使用的，分離的miR基因產(chǎn)物的“有效量”是足以抑制遭受癌和/或骨髓增生性疾病的個體中細胞(例如，癌細胞，顯示骨髓增生性疾病的細胞)增殖的量。本領域的技術人員能容易地確定施用給給定個體的miR基因產(chǎn)物的有效量，通過考慮如個體的大小和體重；疾病侵入的程度；個體的年齡，健康和性別；給藥途徑；和給藥是局部的還是全身的等因素。
例如，分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可以基于待治療的腫瘤塊的近似重量?？赏ㄟ^計算腫瘤塊的近似體積來確定腫瘤塊的近似重量，其中1立方厘米的體積大致等于1克?；谀[瘤塊重量的分離的miR基因產(chǎn)物的有效量，可以在大約10-500微克/克腫瘤塊的范圍內(nèi)。在某些實施方案中，腫瘤塊可以為至少大約10微克/克腫瘤塊，至少大約60微克/克腫瘤塊或至少大約100微克/克腫瘤塊。
分離的miR基因產(chǎn)物的有效量也可以基于待治療的個體的近似或估計體重。優(yōu)選地，這種有效量胃腸外或腸道施用，如這里所述。例如，施用給個體的分離的miR基因產(chǎn)物的有效量范圍為大約5-3000微克/千克體重，大約700-1000微克/千克體重，或大于大約1000微克/千克體重。
本領域技術人員也可以容易地確定合適的給藥方案，其用于施用分離的miR基因產(chǎn)物給給定的個體。例如，miR基因產(chǎn)物可以一次施用給個體(例如，作為單次注射液或沉積物)。作為選擇，miR基因產(chǎn)物可以每天一次或兩次施用給個體，施用大約3到大約28天，更特別地大約7到大約10天的時間。在一個特定的給藥方案中，miR基因產(chǎn)物一天施用一次，而且施用7天。當給藥方案包括多次給藥時，應當理解施用給個體的miR基因產(chǎn)物的有效量可以包括在整個給藥方案中施用的基因產(chǎn)物的總量。
如這里使用的，“分離的”miR基因產(chǎn)物是通過人的干預從天然狀態(tài)合成或改變或取出的miR基因產(chǎn)物。例如，合成的miR基因產(chǎn)物，或者部分或完全從miR基因產(chǎn)物的天然狀態(tài)的共存材料分離的miR基因產(chǎn)物，認為是“分離的”。分離的miR基因產(chǎn)物可以基本上純化的形式存在，或者可以存在于miR基因產(chǎn)物遞送到的細胞中。因此，有意遞送給細胞，或在細胞中表達的miR基因產(chǎn)物，認為是“分離的”miR基因產(chǎn)物。在細胞內(nèi)從miR前體分子產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物，也認為是“分離的”分子。根據(jù)本發(fā)明，這里描述的分離的miR基因產(chǎn)物可用于制造治療個體(例如，人)中的癌和/或骨髓增生性疾病的藥物。
分離的miR基因產(chǎn)物可使用許多標準技術獲得。例如，可使用本領域已知的方法，化學合成或重組生產(chǎn)miR基因產(chǎn)物。在一個實施方案中，使用適當保護的核糖核苷亞磷酰胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀化學合成miR基因產(chǎn)物。合成的RNA分子或合成試劑的商業(yè)供應商包括，例如，Proligo(Hamburg，Germany)，Dharmacon Research(Lafayette，CO，U.S.A.)，Pierce Chemical(part of Perbio Science，Rockford，IL，U.S.A.)，Glen Research(Sterling，VA，U.S.A.)，ChemGenes(Ashland，MA，U.S.A.)和Cruachem(Glasgow，UK)。
作為選擇，可以使用任何適合的啟動子，從重組的環(huán)狀或線性DNA質(zhì)粒表達miR基因產(chǎn)物。用于從質(zhì)粒表達RNA的適合啟動子包括，例如，U6或H1 RNA pol III啟動子序列，或巨細胞病毒啟動子。其他適合的啟動子的選擇在本領域技術人員范圍內(nèi)。本發(fā)明的重組質(zhì)粒還可以包括用于在細胞(例如，癌細胞，顯示骨髓增生性疾病的細胞)中表達miR基因產(chǎn)物的可誘導或可調(diào)節(jié)啟動子。
可以通過標準技術，從培養(yǎng)的細胞表達系統(tǒng)分離從重組質(zhì)粒表達的miR基因產(chǎn)物。從重組質(zhì)粒表達的miR基因產(chǎn)物還可以遞送給細胞(例如，癌細胞，顯示骨髓增生性疾病的細胞)，并在細胞中直接表達。利用重組質(zhì)粒遞送miR基因產(chǎn)物給細胞(例如，癌細胞，顯示骨髓增生性疾病的細胞)，下面更詳細地論述。
miR基因產(chǎn)物可以從獨立的重組質(zhì)粒表達，或者可以從相同的重組質(zhì)粒表達。在一個實施方案中，miR基因產(chǎn)物從單一質(zhì)粒表達為RNA前體分子，前體分子通過適合的加工系統(tǒng)加工成功能性的miR基因產(chǎn)物，該加工系統(tǒng)包括，但不限于，癌細胞內(nèi)現(xiàn)存的加工系統(tǒng)。其他適合的加工系統(tǒng)包括，例如，體外果蠅細胞切割物系統(tǒng)(例如，如Tuschl等的美國公開的專利申請2002/0086356中描述的，以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考)和大腸桿菌RNA酶III系統(tǒng)(例如，如Yang等的美國公開的專利申請2004/0014113中所述的，以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考)。
適于表達miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒，用于插入核酸序列到質(zhì)粒中以表達基因產(chǎn)物的方法，和遞送重組質(zhì)粒到目標細胞中的方法的選擇均在本領域的技術范圍之內(nèi)。參見，例如，Zeng等人(2002)，MolecularCell 91327-1333；Tuschl(2002)，Nat.Biotechnol，20446-448；Brummelkamp等人(2002)，Science 296550-553；Miyagishi et al.(2002)，Nat.Biotechnol.20497-500；Paddison等人(2002)，Genes Dev.16948-958；Lee等人(2002)，Nat.Biotechnol.20500-505；和Paul等人(2002)，Nat.Biotechno l.20505-508，以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。
在一個實施方案中，表達miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒，包括編碼在CMV中間早期啟動子調(diào)控下的miR RNA前體的序列。如這里使用的，在啟動子的“調(diào)控下”意指編碼miR基因產(chǎn)物的核酸序列位于啟動子的3’，以便該啟動子可以起始miR基因產(chǎn)物編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
miR基因產(chǎn)物還可以從重組病毒載體表達?？梢詮膬蓚€獨立的重組病毒載體，或者從相同的病毒載體表達miR基因產(chǎn)物，是期待的。從重組病毒載體表達的RNA可以通過標準技術從培養(yǎng)的細胞表達系統(tǒng)分離，或者可以直接在細胞(例如，癌細胞，顯示骨髓增生性疾病的細胞)中表達。利用重組病毒載體遞送miR基因產(chǎn)物給細胞(例如，癌細胞，顯示骨髓增生性疾病的細胞)，下面更詳細地論述。
本發(fā)明的重組病毒載體包括編碼miR基因產(chǎn)物的序列和任何用于表達RNA序列的適合啟動子。適合的啟動子包括，但不限于，U6或H1RNA pol III啟動子序列，或巨細胞病毒啟動子。其他適合的啟動子的選擇在本領域的技術范圍之內(nèi)。本發(fā)明的重組病毒載體還可以包括用于在癌細胞中表達miR基因產(chǎn)物的可誘導或者可調(diào)節(jié)啟動子。
能接受miR基因產(chǎn)物的編碼序列的任何病毒載體都可使用；例如，來源于腺病毒(AV)；腺病毒相關病毒(AAV)；逆病毒(例如，慢病毒屬(LV)，彈狀病毒，鼠白血病病毒)；皰疹病毒的載體，等等。通過用來自其他病毒的包膜蛋白或其他的表面抗原假型包裝該載體，或者通過替代不同的病毒衣殼蛋白(視情況而定)可以改變病毒載體的向性。
例如，本發(fā)明的慢病毒載體可以用來自水泡性口膜炎病毒(VSV)，rabies，Ebola，Mokola，等等的表面蛋白假型包裝。通過工程操作載體，可以使本發(fā)明的AAV載體靶向不同的細胞，以表達不同的衣殼蛋白血清型。例如，表達血清型2基因組上的血清型2衣殼的AAV載體稱為AAV 2/2。AAV 2/2載體中的這種血清型2衣殼基因可以被血清型5衣殼基因替代，以產(chǎn)生AAV 2/5載體。構(gòu)建表達不同的衣殼蛋白血清型的AAV載體的技術，在本領域的技術范圍之內(nèi)；參見，例如，Rabinowitz，J.E.，等人(2002)，J.Virol.76791-801，以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。
適合用于本發(fā)明的重組病毒載體的選擇，用于插入表達RNA的核酸序列到載體中的方法，遞送病毒載體到目標細胞的方法，和表達的RNA產(chǎn)物的回收的選擇均在本領域的技術范圍之內(nèi)。參見，例如，Dornburg(1995)，Gene Therapy 2301-310；Eglitis(1988)，Biotechniques 6608-614；Miller(1990)，Hum.Gene Therapy15-14；和Anderson(1998)，Nature 39225-30，以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。
特定的適合的病毒載體是來源于AV和AAV的那些載體。Xia等(2002)，Nat.Biotech.201006-1010中描述了用于表達miR基因產(chǎn)物的適合的AV載體，構(gòu)建重組AV載體的方法，和遞送載體到靶細胞中的方法，以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。Samulski等(1987)，J.Virol.613096-3101；Fisher等(1996)，J.Virol.，70520-532；Samulski等(1989)，J.Virol.633822-3826；美國專利5,252,479；美國專利5,139,941；國際專利申請WO 94/13788；和國際專利申請WO93/24641中描述了用于表達miR基因產(chǎn)物的適合的AAV載體，構(gòu)建重組AAV載體的方法，和遞送載體到靶細胞中的方法，以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。在一個實施方案中，從包含CMV中間早期啟動子的單一重組AAV載體表達miR基因產(chǎn)物。
在某個實施方案中，本發(fā)明的重組AAV病毒載體包括編碼在人U6RNA啟動子調(diào)控下的miRRNA前體的核酸序列，其與polyT終止序列可操作地連接。如這里使用的，“與polyT終止序列可操作連接”意指編碼有義或反義鏈的核酸序列，在5’方向與polyT終止信號緊鄰。從載體轉(zhuǎn)錄miR序列期間，polyT終止信號發(fā)揮作用以終止轉(zhuǎn)錄。
在本發(fā)明的治療方法的其他實施方案中，施用有效量的抑制miR表達的至少一種化合物給個體。如這里使用的，“抑制miR表達”意指治療后miR基因產(chǎn)物的前體和/或活性，成熟形式，低于治療之前產(chǎn)生的量。使用例如這里論述的確定miR轉(zhuǎn)錄物水平的技術，本領域技術人員可以容易地確定細胞(例如，癌細胞，顯示骨髓增生性疾病的細胞)中miR表達是否已經(jīng)被抑制。抑制可以發(fā)生在基因表達水平(即，通過抑制編碼miR基因產(chǎn)物的miR基因的轉(zhuǎn)錄)或加工水平(例如，通過抑制miR前體加工成成熟的，活性miR)。
如這里使用的，抑制miR表達的化合物的“有效量”是足以抑制遭受癌和/或骨髓增生性疾病的個體中細胞(例如，癌細胞，顯示骨髓增生性疾病的細胞)增殖的量。本領域的技術人員能容易地確定施用給給定個體的抑制miR表達的化合物的有效量，通過考慮如個體的大小和體重；疾病侵入的程度；個體的年齡，健康和性別；給藥途徑；和給藥是局部的還是全身的等因素。
例如，抑制表達的化合物的有效量可以基于待治療的腫瘤塊的近似重量，如這里所述。例如，抑制miR表達的化合物的有效量可以基于待治療的個體的近似或估計體重，如這里所述。
本領域技術人員也可以容易地確定合適的給藥方案，其用于施用抑制miR表達的化合物給給定的個體，如這里所述。用于抑制miR基因表達的適合的化合物包括雙鏈RNA(如短的或小的干擾RNA或“siRNA”)，反義核酸，和酶促RNA分子，如核酶。這些化合物的每一種都可以靶向給定的miR基因產(chǎn)物并干擾靶miR基因產(chǎn)物的表達(例如，通過抑制翻譯，通過誘導切割和/或降解)。
例如，可通過用與miR基因產(chǎn)物的至少一部分具有至少90％，例如，至少95％，至少98％，至少99％，或100％序列同源性的分離的雙鏈RNA(“dsRNA”)誘導miR基因的RNA干擾來抑制給定miR基因的表達。在一個特定的實施方案中，dsRNA分子是“短的或小的干擾RNA”或“siRNA”。
用于本方法的siRNA包括長度為大約17個核苷酸到大約29個核苷酸，優(yōu)選長度為大約19到大約25個核苷酸的短的雙鏈RNA。siRNA包括有義RNA鏈和互補的反義RNA鏈，其通過標準的Watson-Crick堿基配對相互作用(在下文中“堿基對”)一起退火。有義鏈包括與靶miR基因產(chǎn)物內(nèi)包含的核酸序列基本上相同的核酸序列。
如這里使用的，siRNA中的核酸序列，其與靶mRNA內(nèi)包含的靶序列“基本上相同”，是與靶序列相同的核酸序列，或與靶序列有1個或2個核苷酸不同的核酸序列。siRNA的有義鏈和反義鏈可以包括兩個互補的，單鏈RNA分子，或者可以包括單個分子，其中兩個互補的部分是堿基對，并通過單鏈的“發(fā)夾”區(qū)域共價連接。
siRNA也可以是改變的RNA，其可以通過添加，缺失，置換和/或改變一個或多個核苷酸而不同于天然存在的RNA。這種改變可以包括添加非核苷酸物質(zhì)，如到siRNA的末端或到siRNA的一個或多個內(nèi)部核苷酸中，或者使siRNA抗核酸酶消化的修飾，或者用脫氧核糖核苷酸置換siRNA中的一個或多個核苷酸。
siRNA的一條或兩條鏈也可以包括一個3’突出。如這里使用的，“3’突出”指至少一個不成對的核苷酸，其從雙螺旋RNA鏈的3’末端伸出。因此，在某些實施方案中，siRNA包括長度為1到大約6個核苷酸(其包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)，長度為1到大約5個核苷酸，長度為1到大約4個核苷酸，或長度為大約2到大約4個核苷酸的至少一個3’突出。在一個特定的實施方案中，3’突出存在于siRNA的兩條鏈中，而且長度為2個核苷酸。例如，siRNA的每條鏈都包括二胸腺嘧啶脫氧核苷酸(“TT”)或二尿嘧啶脫氧核苷酸(“uu”)的3’突出。
siRNA可以化學或生物學產(chǎn)生，或者可以從重組質(zhì)?；虿《据d體表達，如上分離的miR基因產(chǎn)物所述的。Gewirtz的美國公開的專利申請2002/0173478，和Reich等的美國公開的專利申請2004/0018176中描述了用于生產(chǎn)和檢驗dsRNA或siRNA分子的示例性方法，二者都以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。
還可以通過反義核酸抑制給定miR基因的表達。如這里使用的，“反義核酸”意指通過RNA-RNA，RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用的方式，與靶RNA結(jié)合的核酸分子，其改變靶RNA的活性。適合用于本方法的反義核酸是單鏈核酸(例如，RNA，DNA，RNA-DNA嵌合體，肽核酸(PNA))，其一般包括與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列互補的核酸序列。反義核酸可以包括與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列50-100％互補，75-100％互補，或95-100％互補的核酸序列。表1a和表1b中提供了特定的人miR基因產(chǎn)物的核酸序列。不希望受任何理論的束縛，認為反義核酸激活RNA酶H或另一種細胞核酸酶，其消化miR基因產(chǎn)物/反義核酸雙螺旋。
反義核酸還可以包含對核酸主鏈或糖和堿基部分(或它們的同等物)的修飾以增強靶特異性，核酸酶抗性，遞送或與分子的功效相關的其他特性。這樣的修飾包括膽固醇部分，雙螺旋嵌入劑，如吖啶，或一種或多種核酸酶抗性基團。
反義核酸可以化學或生物學產(chǎn)生，或者可以從重組質(zhì)?；虿《据d體表達，如上分離的miR基因產(chǎn)物所述的。生產(chǎn)和檢驗的示例性方法在本領域的技術范圍之內(nèi)；參見例如，Stein和Cheng(1993)，Science2611004和Woolf等的美國專利5,849,902，其以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。
還可以通過酶促核酸抑制給定miR基因的表達。如這里使用的，“酶促核酸”指包括底物結(jié)合區(qū)域的核酸，其與miR基因產(chǎn)物的連續(xù)核酸序列互補，而且能特異性切割miR基因產(chǎn)物。酶促核酸底物結(jié)合區(qū)域可以例如與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列50-100％互補，75-100％互補，或95-100％互補。酶促核酸還可以包括堿基，糖和/或磷酸基團的修飾。用于本方法的示例性酶促核酸是核酶。
酶促核酸可以化學或生物學產(chǎn)生，或者可以從重組質(zhì)?；虿《据d體表達，如上分離的miR基因產(chǎn)物所述的。用于生產(chǎn)和測試dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Werner and Uhlenbeck(1995)，Nucleic Acids Res.232092-96；Hammann et ah(1999)，Antisenseand Nucleic Acid Drug Dev.925-31；和Cech等的美國專利4,987,071，以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。
施用至少一種miR基因產(chǎn)物，或至少一種抑制miR表達的化合物，將抑制患有癌和/或骨髓增生性疾病的個體中細胞(例如，癌細胞，顯示骨髓增生性疾病的細胞)的增殖。如這里使用的，“抑制癌細胞或顯示骨髓增生性疾病的細胞增殖”意指殺死細胞，或永久地或暫時地抑制或減緩細胞的生長。如果在施用miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物以后，個體中這類細胞的數(shù)量保持恒定或降低，則可以推斷細胞增殖的抑制。如果這類細胞的絕對數(shù)量增加，但是腫瘤生長的速率降低，也可以推斷癌細胞或顯示骨髓增生性疾病的細胞增殖的抑制。
可通過直接測定，或通過從原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤塊的大小估計來確定個體體內(nèi)癌細胞的數(shù)量。例如，可通過免疫組織學方法，流式細胞術，或用來檢測癌細胞的特征性表面標記的其他技術來測定個體中癌細胞的數(shù)量。
通過直接目測，或通過診斷顯象方法，如X射線，磁共振成象，超聲和閃爍照相術，可以確定腫瘤塊的大小。如現(xiàn)有技術已知的，可應用用于確定腫瘤塊大小的診斷顯象方法，用或不用造影劑。也可以通過物理方法，如組織塊的觸診，或用測量儀器如卡鉗測定組織塊來確定腫瘤塊的大小。
miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物可通過適于遞送這些化合物到個體的細胞(例如，癌細胞，顯示骨髓增生性疾病的細胞)中的任何方式施用給個體。例如，miR基因產(chǎn)物或抑制miR表達的化合物可通過適于用這些化合物，或用包含編碼這些化合物的序列的核酸轉(zhuǎn)染個體的細胞的方法施用。在一個實施方案中，用包含編碼至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物的序列的質(zhì)?；虿《据d體轉(zhuǎn)染細胞。
用于真核細胞的轉(zhuǎn)染方法是本領域公知的，而且包括，例如，直接注射核酸到細胞的細胞核或原核中；電穿孔；脂質(zhì)體遞送或親脂性材料介導的遞送；受體介導的核酸遞送，生物彈道或粒子加速；磷酸鈣沉淀，和病毒載體介導的轉(zhuǎn)染。
例如，細胞可以用脂質(zhì)體遞送化合物，例如，DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基硫酸銨，Boehringer-Mannheim)或同等物如LIPOFECTIN轉(zhuǎn)染。使用的核酸的量對本發(fā)明的實施不是關鍵的；可用0.1-100微克核酸/105細胞獲得可接受的結(jié)果。例如，可使用每105細胞3微克DOTAP中大約0.5微克質(zhì)粒載體的比例。
miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物也可以通過任何適合的腸或腸胃外給藥徑施用給個體。用于本方法的適合的腸給藥途徑包括，例如，口服，直腸或鼻內(nèi)遞送。適合的腸胃外給藥途徑包括，例如，血管內(nèi)給藥(例如，靜脈內(nèi)快速濃注，靜脈內(nèi)灌輸，動脈內(nèi)快速濃注，動脈內(nèi)灌輸和導管滴注到脈管系統(tǒng)中)；組織周圍和組織內(nèi)注射(例如，腫瘤周圍和腫瘤內(nèi)注射，視網(wǎng)膜內(nèi)注射，或視網(wǎng)膜下肌注)；皮下注射或沉積，包括皮下灌輸(如通過滲透泵)；直接應用到目標組織，例如通過導管或其他的安置裝置(例如，視網(wǎng)膜小球或栓劑或包含多孔，無孔或凝膠物質(zhì)的植入物)；和吸入。特別適合的給藥途徑是注射，灌輸和直接注射到腫瘤中。
在本方法中，miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因產(chǎn)物表達的化合物可以作為裸RNA，與遞送試劑一起，或以包含表達miR基因產(chǎn)物或者抑制miR基因表達的化合物的序列的核酸(例如，重組質(zhì)粒或病毒載體)，施用給個體。適合的遞送試劑包括，例如，Mirus Transit TKO親脂性試劑；LIPOFECTIN；lipofectamine；cellfectin；聚陽離子(例如，聚賴氨酸)和脂質(zhì)體。
包含表達miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物的重組質(zhì)粒和病毒載體，和用于遞送這種質(zhì)粒和載體到癌細胞的技術，是這里論述的和/或本領域公知的。
在一個特定的實施方案中，脂質(zhì)體用于遞送miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達的化合物(或包含編碼它們的序列的核酸)給個體。脂質(zhì)體也可以增加基因產(chǎn)物或核酸的半衰期。適合用于本發(fā)明的脂質(zhì)體可以由形成標準囊的脂質(zhì)組成，其一般包括中性或帶負電荷的磷脂和甾醇如膽固醇。脂質(zhì)的選擇一般根據(jù)如期望的脂質(zhì)體大小和血流中脂質(zhì)體的半衰期等因素來考慮。例如，Szoka等(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467；和美國專利4,235,871，4,501,728，4,837,028和5,019,369中描述了已知用于制備脂質(zhì)體的各種方法，以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。
用于本方法的脂質(zhì)體可以包括靶向脂質(zhì)體到癌細胞的配體分子。與癌細胞中普遍的受體，如結(jié)合腫瘤細胞抗原的單克隆抗體的配體結(jié)合，是優(yōu)選的。
也可以對用于本發(fā)明的脂質(zhì)體進行修飾，以便避免被單核細胞噬細胞系統(tǒng)(“MMS”)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(“RES”)清除。這種修飾的脂質(zhì)體具有位于表面的調(diào)理作用抑制部分或已經(jīng)摻入到脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以包括調(diào)理作用抑制部分和配體。
用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分，一般是與脂質(zhì)體膜結(jié)合的大親水聚合物。如這里使用的，當它化學或物理附著于膜時，例如，通過插入脂質(zhì)可溶性錨到膜本身，或通過直接與膜脂的活性基團結(jié)合時，調(diào)理作用抑制部分與脂質(zhì)體膜“結(jié)合”。這些調(diào)理作用抑制親水聚合物形成了保護性表面層，其顯著降低MMS和RES對脂質(zhì)體的吸收；例如，如美國專利4,920,016中所述的，以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。
適于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分優(yōu)選是數(shù)量平均分子量為大約500到大約40,000道爾頓，更優(yōu)選大約2,000到大約20,000道爾頓的水溶性聚合物。這種聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)或其衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸鹽；合成的聚合物，如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；線性，支化，或樹狀聚體聚酰氨基胺；聚丙烯酸類；多元醇，例如，羧基或氨基與其化學連接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經(jīng)節(jié)糖苷，如神經(jīng)節(jié)糖苷GM1。PEG，甲氧基PEG，或甲氧基PPG，或其衍生物的共聚物，也是適合的。而且，調(diào)理作用抑制聚合物可以是PEG與聚氨基酸，多糖，聚酰氨基胺，聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。調(diào)理作用抑制聚合物也可以是包含氨基酸或羧酸類的天然多糖，例如，半乳糖醛酸，葡萄糖醛酸，甘露糖醛酸，透明質(zhì)酸，果膠酸，神經(jīng)氨酸，海藻酸，角叉菜膠；胺化多糖或寡糖(線性或支化的)；或羧酸多糖或寡糖，例如，與帶有結(jié)果的羧基連接的碳酸的衍生物反應。優(yōu)選地，調(diào)理作用抑制部分是PEG，PPG，或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的脂質(zhì)體有時稱為“PEG化的脂質(zhì)體”。
調(diào)理作用抑制部分可以通過任何一種公知的技術與脂質(zhì)體膜結(jié)合。例如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯與磷脂酰基-乙醇胺脂質(zhì)-可溶性錨結(jié)合，然后與膜結(jié)合。類似地，可使用Na(CN)BH3和溶劑混合物，如60℃比例為30:12的四氫呋喃與水，通過還原的氨基化作用，右旋糖酐聚合物可以用十八胺脂質(zhì)可溶性錨衍生。
用調(diào)理作用抑制部分修飾的脂質(zhì)體，在循環(huán)中比未修飾的脂質(zhì)體保留更長的時間。因此，這種脂質(zhì)體有時稱為“隱形”脂質(zhì)體。隱形脂質(zhì)體已知在供給多孔或“有漏隙的”微脈管系統(tǒng)的組織中積累。因此，其特征在于這些微脈管系統(tǒng)缺陷的組織，例如，實體瘤，將有效地積累這些脂質(zhì)體；參見，Gabizon，等人(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，186949-53。此外，RES降低的吸收通過防止脂質(zhì)體在肝臟和脾中的顯著積累降低了隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用抑制部分修飾的脂質(zhì)體特別適于遞送miR基因產(chǎn)物或miR基因表達抑制化合物(或包含編碼它們的序列的核酸)給腫瘤細胞。
根據(jù)本領域已知的技術，在將它們施用給個體之前，可以將miR基因產(chǎn)物或miR基因表達抑制化合物配制成藥物組合物，有時稱為“藥物”。因此，本發(fā)明包含了用于治療癌癥和/或骨髓增生性疾病的藥物組合物。
在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括至少一種miR表達抑制化合物和一種藥學可接受的載體。在一個特定的實施方案中，至少一種miR表達抑制化合物是miR基因產(chǎn)物特異性的，該miR基因產(chǎn)物的表達在癌細胞中大于對照細胞(即，它是上調(diào)的)。在另一個實施方案中，miR表達抑制化合物是一種或多種miR基因產(chǎn)物特異性的，該miR選自miR-101，miR-126，miR-99a，miR-99-prec，miR-106，miR-339，miR-99b，miR-149，miR-33，miR-135和miR-20。在另一個實施方案中，miR表達抑制化合物是選自miR-101，miR-126，miR-106，miR-20和miR-135的一種或多種miR基因產(chǎn)物特異性的。仍然在另一個實施方案中，miR表達抑制化合物是選自miR-106，miR-20和miR-135的一種或多種miR基因產(chǎn)物特異性的。
在其他的實施方案中，藥物組合物包括有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物，或其分離的變體或生物學活性片段，和藥學上可接受的載體。在一個實施方案中，本發(fā)明是一種用于治療癌和/或骨髓增生性疾病的藥物組合物，其中該癌和/或骨髓增生性疾病與MAFB基因產(chǎn)物的過表達相關。在這個實施方案中，藥物組合物包括至少一種miR基因產(chǎn)物，其與MAFB基因產(chǎn)物結(jié)合，并降低MAFB基因產(chǎn)物的表達。在一個特定的實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物包括與MAFB基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-130a，或其分離的變體或生物學活性片段。
在一個實施方案中，本發(fā)明是一種用于治療癌和/或骨髓增生性疾病的藥物組合物，其中該癌和/或骨髓增生性疾病與HOXA1基因產(chǎn)物的過表達相關。在這個實施方案中，藥物組合物包括至少一種miR基因產(chǎn)物，其與HOXA1基因產(chǎn)物結(jié)合，并降低HOXA1基因產(chǎn)物的表達。在一個特定的實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物包括與HOXA1基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在另一個實施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-10a，或其分離的變體或生物學活性片段。
本發(fā)明的藥物組合物特征為至少是無菌的和無熱原的。如這里使用的，“藥物組合物”包括用于人和獸醫(yī)用途的制劑。制備本發(fā)明的藥物組合物的方法在本領域技術人員的范圍內(nèi)，例如，如Remington′s Pharmaceutical Science，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA.(1985)中所述，以其全部公開內(nèi)容引入這里作為參考。
本藥物組合物包括至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達抑制化合物(或包含編碼miR基因產(chǎn)物或miR基因表達抑制化合物的序列的至少一種核酸)(例如，0.1到90％重量百分比)，或其生理學可接受的鹽，其與藥學上可接受的載體混合。在某些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物另外包括一種或多種抗癌劑(例如，化療劑)。本發(fā)明的藥物組合物還包括至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達抑制化合物(或包含編碼miR基因產(chǎn)物或miR基因表達抑制化合物的序列的至少一種核酸)，其被脂質(zhì)體包封和藥學上可接受的載體。在一個實施方案中，藥物組合物包括一種miR基因或基因產(chǎn)物，其不是miR-15，miR-16，miR-143和/或miR-145。
特別適合的藥學上可接受的載體是水，緩沖的水，生理鹽水，0.4％鹽水，0.3％甘氨酸，透明質(zhì)酸等等。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達抑制化合物(或包含編碼miR基因產(chǎn)物或miR基因表達抑制化合物的序列的至少一種核酸)，其抗核酸酶的降解。本領域技術人員可以容易地合成核酸酶抗性的核酸，例如通過將在2’-位置修飾的一種或多種核糖核苷酸摻入到miR基因產(chǎn)物中。適合的2′-修飾的核糖核苷酸包括那些在2’-位置用氟，氨基，烷基，烷氧基和O-烯丙基修飾的核糖核苷酸。
本發(fā)明的藥物組合物還可以包括常規(guī)的藥物賦形劑和/或添加劑。適合的藥物賦形劑包括穩(wěn)定劑，抗氧化劑，滲透壓度調(diào)節(jié)劑，緩沖液和pH調(diào)節(jié)劑。適合的添加劑包括，例如，生理學生物相容的緩沖液(例如，鹽酸氨基丁三醇)，螯合劑(如，例如，DTPA或DTPA-雙酰胺)或鈣螯合的復合物(如，例如，鈣DTPA，CaNaDTPA-雙酰胺)的添加，或者，任選地，鈣或鈉鹽(例如，氯化鈣，抗壞血酸鈣，葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)的添加。本發(fā)明的藥物組合物可以包裝用于以液態(tài)形式使用，或者可以冷凍干燥。
對于本發(fā)明的固體藥物組合物，常規(guī)的無毒固體藥學上可接受的載體能被使用；例如，藥物級的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石，纖維素，葡萄糖，蔗糖，碳酸鎂，等等。
例如，用于口服的固體藥物組合物可以包括上列的任何載體和賦形劑，和10-95％，優(yōu)選25％-75％的至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達抑制化合物(或包含編碼它們的序列的至少一種核酸)。用于氣霧劑(吸入)給藥的藥物組合物，可以包括0.01-20％重量百分比，優(yōu)選1％-10％重量百分比的至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達抑制化合物(或包含編碼miR基因產(chǎn)物或miR基因表達抑制化合物的序列的至少一種核酸)，其如上所述被包封在脂質(zhì)體中，和拋射劑。如需要還可以包括載體，例如，用于鼻內(nèi)遞送的卵磷脂。
本發(fā)明的藥物組合物另外可包括一種或多種抗癌劑。在一個特定的實施方案中，該組合物包括至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達抑制化合物(或包含編碼miR基因產(chǎn)物或miR基因表達抑制化合物的序列的至少一種核酸)和至少一種化療劑。適于本發(fā)明的方法的化療劑包括，但不限于，DNA-烷基化劑，抗腫瘤抗生素劑，抗代謝劑，微管蛋白穩(wěn)定劑，微管蛋白去穩(wěn)定劑，激素拮抗劑，拓撲異構(gòu)酶抑制劑，蛋白激酶抑制劑，HMG-CoA抑制劑，CDK抑制劑，細胞周期蛋白抑制劑，胱天蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，反義核酸，三螺旋DNA，核酸適配子，和分子修飾的病毒，細菌和外毒素試劑。用于本發(fā)明組合物的適合的試劑的例子包括，但不限于，胞嘧啶核苷阿拉伯糖苷，氨甲喋呤，長春新堿，鬼臼亞乙苷(VP-16)，亞德利亞霉素(阿霉素)，順氯氨鉑(CDDP)，地塞米松，arglabin，環(huán)磷酰胺，苯基丙氨酸氮芥，甲基亞硝基脲，氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶(5FU)，長春花堿，喜樹堿，放線菌素-D，絲裂霉素C，過氧化氫，奧沙利鉑，依立替康，托泊替坎，甲酰四氫葉酸，亞硝脲氮芥，鏈脲霉素，CPT-11，紫杉酚，三苯氧胺，氮烯唑胺，利妥昔單抗，道諾紅菌素，1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶，伊馬替尼，氟達拉濱，多西他賽和FOLFOX4。
本發(fā)明還包括確定抗癌劑的方法，包括提供測試藥劑給細胞，并測定細胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個實施方案中，該方法包括提供測試藥劑給細胞，并測定癌細胞(例如，AMKL細胞)中與增加的表達水平相關的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。相對于適合的對照(例如，對照細胞中miR基因產(chǎn)物的水平)，癌中與增加的表達水平相關的miR基因產(chǎn)物的水平的降低指示該測試藥劑是抗癌劑。在一個特定的實施方案中，與癌細胞中增加的表達水平相關的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-99a，miR-99-prec，miR-106，miR-339，miR-99b，miR-149，miR-33，miR-135和miR-20。在另一個實施方案中，與癌細胞中增加的表達水平相關的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-106，miR-20和miR-135。仍然在另一個實施方案中，與癌細胞中增加的表達水平相關的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-106，miR-20和miR-135。在一個實施方案中，miR基因產(chǎn)物不是下列中的一種或多種let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
在一個實施方案中，該方法包括提供測試藥劑給細胞，并測定癌細胞中與降低的表達水平相關的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。相對于適合的對照(例如，對照細胞中miR基因產(chǎn)物的水平)，細胞中miR基因產(chǎn)物水平的增加指示該測試藥劑是抗癌劑。
適合的藥劑包括，但不限于，藥物(例如，小分子，肽)和生物學大分子(例如，蛋白質(zhì)，核酸)。該藥劑可以重組，合成生產(chǎn)，或者它可以從天然來源分離(即，純化)。提供這種藥劑給細胞的各種方法(例如，轉(zhuǎn)染)是本領域公知的，而且上文中描述了這些方法中的幾種。檢測至少一種miR基因產(chǎn)物的表達的方法(例如，Northern印跡，原位雜交，RT-PCR，表達型)也是本領域公知的。這里也描述了這些方法中的幾種。
現(xiàn)在通過下列非限制性實施例來舉例說明本發(fā)明。
實施例 除非另有說明，下列材料和方法用于本實施例。
材料和方法 細胞系和人CD34+細胞。
人慢性粒細胞性白血病(CML)原始細胞危象細胞系K-562和MEG-01獲自美國典型組織培養(yǎng)物中心(ATCC，Manassas，VA)并于37℃，5％ CO2下保持在具有青霉素-慶大霉素的包含10％ FBS的RPMI 1640(GIBCO，Carlsbad，CA)中。人巨核細胞白血病細胞UT-7，和CMK，以及慢性粒細胞性白血病(CML)原始細胞危象LAMA獲自DSMZ(Br aunsweig，Germany)。所有細胞都保持在具有20％FBS和抗生素的RPMI培養(yǎng)基1640中，除UT-7之外，UT-7是因子依賴性的并且培養(yǎng)在具有20％FBS和5ng/ml GM-CSF的MEM-α中。新鮮的和冷凍的人骨髓CD34+細胞獲自StemcellTechnologies(Vancouver，B.C.，Canada)。CD34抗原的FACS分析顯示純度>98％。
人祖細胞CD34+細胞培養(yǎng)。
人骨髓CD34+細胞生長在STEM-培養(yǎng)基(Stemcell Technologies)中，其包括Isocove改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基，并且該培養(yǎng)基補充有人轉(zhuǎn)鐵蛋白，胰島素，牛絲氨酸白蛋白，人低密度脂蛋白和谷氨酰胺，在100ng/ml人重組促血小板生成素(TPO)存在下培養(yǎng)頭4天，接著是100ng/ml TPO，IL3和SCF(細胞因子混合物CC-200，StemcellTechnologies)的組合。起始細胞密度是100,000細胞/ml；一周3次，將細胞密度調(diào)節(jié)到100,000到200,000細胞/ml。為了增加用于微陣列分析的細胞的純度，在培養(yǎng)的第10天時進行細胞分選。細胞用抗人CD34+，抗人CD41+，抗人CD61+，和它們各自的同種型，在冰上孵育45分鐘。用PBS 3％ FBS洗滌兩次以后，細胞使用FACS Aria分選機在兩個獨立的群體中大批分選，CD34-CD61+和CD34+CD61+細胞用于培養(yǎng)和RNA提取。分選群體的純度大于95％。
巨核細胞表征。
進行培養(yǎng)物中的CD34+祖細胞的Cytospin制備并在巨核細胞分化誘導期間用May-Grunwald Giemsa在不同的時間點進行染色。對于FACS分析，使用的初級抗體如下CD41A，CD61A，CD42B，和CD34，以及它們各自的同種型(BD Pharmingen，San Diego，CA)。使用FACScalibur(BD Biosciences)和CELLQUEST軟件(BD Biosciences)，如前面描述(Tajima，S.，等人(1996)J.Exp.Med.184，1357-1364)的進行流式細胞研究。
RNA提取，Northern印跡和miRNA微陣列實驗。
如其它地方詳細描述(Liu，C.G.，等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101，9740-9744)的進行這些方法。原始數(shù)據(jù)在GENESPRING7.2軟件中標準化和分析(zcomSilicon Genetics，Redwood City，CA)。使用GENESPRING標準化選擇和BIOCONDUCTOR程序包(www.bioconductor.org)的整體中值標準化，用類似的結(jié)果，對表達數(shù)據(jù)進行中值-中心化。使用GENESPRING ANOVA工具，微陣列的預測分析(PAM)和微陣列(SAM)的顯異性分析軟件(www-stat.stanford.edu/～tibs/SAM/index.html)進行統(tǒng)計學比較。
逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)和實時PCR。
使用Superscript II(Invitrogen)，DNA酶處理(Ambion，Austin，TX)以后，通過逆轉(zhuǎn)錄，直接將用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)分離的總RNA加工成cDNA。比較實時PCR一式三份進行。以下基因的引物和探針獲自Applied Biosystems(Foster City，CA)HOXA1，HOXA3，HOXB4，HOXB5和HOXD10。使用ABI Prism 7900序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)定量基因表達水平。使用18S RNA引物試劑盒進行標準化。使用計算層析成象(CT)方法計算相對表達。還使用下列寡核苷酸引物進行RT-PCR MAFB FW；5′-AACTTTGTCTTGGGGGACAC-3′(SEQ I D NO499)； MAFB RW；5′-GAGGGGAGGATCTGTTTTCC-3′(SEQ ID NO500)； HOXA1 FW；5′-CCAGGAGCTCAGGAAGAAGA GAT-3′(SEQ ID NO501)；和 HOXA1 RW；5′-CCCTCTGAGGCATCTGATTGGGTTT-3′(SEQ ID NO502). 通過干-環(huán)RT-PCR進行miRNA的實時定量。
如所述(Chen，C，等人(2005)Nucl.Acids Res.33，e179.)的進行pri-miRNA 10a，miR15a，miR16-1，miR-130a，miR-20，miR-106，miR-17-5，miR-181b，miR-99a和miR-126的實時PCR。18S用于標準化。所有試劑和引物都獲自Applied Biosystems。
生物信息學。
使用TARGETSCAN(www.genes.mit.edu/targetscan)，MIRANDA(www.mskc.miranda.org)和PICTAR(www.pictar.bio.nyu.edu)軟件進行差異表達的miRNA的miRNA靶預測。
用miRNA前體轉(zhuǎn)染細胞 miRNA前體miR-10a和miR-130a購自Ambion使用Amaxa(Gaithesburg，MD)，5百萬K562細胞用5μg的前體寡核苷酸在10ml的總體積中核穿孔。如所述的，通過Northern印跡和RT-PCR評價寡核苷酸的表達。
熒光素酶報告實驗。
使用熒光素酶終止密碼子緊接下游的XbaI位點，通過PCR從基因組DNA擴增包含分別來自HOXA1和MAFB基因的miR-10a和miR-130a的靶位點的3′UTR并插入到pGL3對照載體(Promega，Madison，WI)中。下列寡核苷酸引物組用于產(chǎn)生特異性片段 MAFB FW 5′-GCATCTAGAGCACCCCAGAGGAGTGT-3′(SEQ I D NO503)； MAFB RW 5′-GCATCTAGACAAGCACCATGCGGTTC-3′(SEQ ID NO504)； HOXA1F W 5′-TACTCTAGACCAGGAGCTCAGGAAGA-3′(SEQ ID NO505)；和 HOXA1 RW 5′-MCATTCTAGATGAGGCATCTGATTGGG-3′(SEQI DNO506). 我們還使用QuikChange XL-定點突變試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)分別從完全互補的位點產(chǎn)生兩個插入物，其帶有5bp和9bp的缺失。通過測序證實了野生型(WT)和突變體插入。
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，根據(jù)制造商的方案，用0.4μg的熒光蟲熒光素酶報告載體和0.08μg的包含Renilla熒光素酶的對照載體，pRL-TK(Promega)，在6孔板中共轉(zhuǎn)染巨核細胞原始細胞危象細胞系(MEG-01)中的人慢性粒細胞性白血病(CML)。對于每個孔，使用10nM的premiR-130a和premiR-10a前體(Ambion)。轉(zhuǎn)染以后24小時，使用雙重熒光素酶分析(Promega)連續(xù)測定螢火蟲和Renilla熒光素酶活性。
Western印跡。
來自用miR-10a和miR-130a轉(zhuǎn)染的K562細胞，以及巨核細胞分化不同階段的CD34+細胞的總蛋白和核蛋白提取物使用RIPA緩沖液或核提取試劑盒(Pierce，Rockford，IL)提取。通過Western印跡法，利用下列初級抗體分析蛋白表達MAFB(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)，HOXA1(R & D Systems，Minneapolis，MN)，β-肌動蛋白和核仁素(Santa Cruz Biotechnology)。使用合適的第二抗體(Santa Cruz Biotechnology)。
實施例1CD34+祖細胞的體外巨核細胞分化期間的miRNA表達。
使用特異性巨核細胞生長因子(促血小板生成素)和非特異性細胞因子(SCF和IL-3)的組合，我們能從適于微陣列研究的CD34+骨髓祖細胞體外產(chǎn)生純的，豐富的巨核細胞后代(圖4)。在用細胞因子培養(yǎng)的基線和第10，12，14和16天，獲得來自3個不同的CD34祖細胞的總RNA，用于miRNA芯片分析。我們在分化過程期間的所有點，開始比較了CD34+祖細胞與合并的CD34+分化的巨核細胞之間miRNA的表達。確定了巨核細胞分化期間顯著下調(diào)的17種miRNA(表1)。巨核細胞分化期間沒有統(tǒng)計上顯著的上調(diào)miRNA。使用微陣列的預測分析(PAM)，我們確定了8種微小RNA，其預測巨核細胞分化而沒有錯誤分類誤差miR-10a，miR-10b，miR-30c，miR-106，miR-126，miR-130a，miR-132和miR-143。所有這些miRNA，除了miR-143，都包括在通過微陣列的顯異性分析(SAM)確定的17種miRNA內(nèi)。幾種miRNA的Northern印跡和實時PCR證實了通過miRNA芯片分析獲得的結(jié)果(圖1)。
因為我們主要發(fā)現(xiàn)巨核細胞形成期間miRNA的下調(diào)，我們猜測這些miRNA可以開啟涉及分化的靶基因。和該假說一致，在我們的系統(tǒng)中顯著下調(diào)的miRNA，預測為靶向在巨核細胞分化中具有重要作用的基因。在巨核細胞形成中具有公知功能的轉(zhuǎn)錄因子中，RUNX-1(Elagib，K.E.，等人(2003)Blood，1014333-4341)，F(xiàn)li-1(Athanasoiu，M.，等人(1996)Cell Growth Differ.7，1525-1534)，F(xiàn)LT1(Casella，I，等人(2003)Blood 101，1316-1323)，ETV6(Hock，H.，et al(2004)GenesDev.182336-2341)，TAL1(Begley，C.G.，and Green，A.R.(1999)Blood，932760-2770)，ETS1(Jackers，P.，等人(2004)J.Biol.Chem.27952183-52190)和CRK(Lannutti，B.J.，et al(2003)Exp.Hematol.121268-1274)是分化的巨核細胞中下調(diào)的幾種miRNA的假定靶。而且，這些轉(zhuǎn)錄因子中的每一個都具有不止一種miRNA，其預測為它的調(diào)節(jié)劑。例如，RUNX1(AML1)預測為miR-106，miR-181b，miR-101，let7d和miR-17-92簇的靶。預測為靶向AML1的許多miRNA表明組合的調(diào)節(jié)模型。
然后我們從CD34+祖細胞觀察巨核細胞分化過程期間，miRNA的瞬時表達。我們集中于已經(jīng)在造血組織中描述的miRNA，如miR-223，miR-181，miR-155，miR-142，miR-15a，miR-16，miR-106和miR-17-92的簇(圖5)。我們發(fā)現(xiàn)了miR-223表達的連續(xù)改變。開始，巨核細胞分化期間miR-223是下調(diào)的，但是培養(yǎng)14天以后，它的表達回到與CD34祖細胞相當?shù)乃?圖1C)。miR-15a和miR-16-1簇也遵循與miR-223相同的表達模式(圖1D)，而miR-181b，miR-155，miR-106a，miR-17和miR-20在分化期間是下調(diào)的(圖6)。miR-223和miR-15a/mir-16-1表達的時間變化表明階段特異性功能。
表2.體外CD34+巨核細胞分化期間下調(diào)的miRNA。
所有差異表達的miRNA都具有<0.01的q值(假陽性率)。



t檢驗p<0.05。
*這些miRNA通過PAM鑒定為巨核細胞歸入最低錯誤分類誤差的預測因子。除了miR-143以外，在巨核細胞分化期間所有的miR都是下調(diào)的。
NA±m(xù)iRNA前體序列不包含成熟miRNA，因此沒有顯示假定的靶。
實施例2MAFB轉(zhuǎn)錄因子是miR-130a的靶。
使用3個靶預測算法(TARGETSCAN(www.genes.mit.edu/targetscan)，MIRANDA(www.microrna.org/miranda_new.html)，和PICTAR(www.pictar.bio.nyu.edu))，我們確定miR-130a預測為靶向MAFB，MAFB是巨核細胞分化期間上調(diào)并誘導GPIIb基因的轉(zhuǎn)錄因子，其與GATA1，SP1和ETS-1協(xié)同作用(Sevinsky，J.R.，等人(2004)Mol.Cell.Biol.24，4534-4545)。為了研究這種假定的相互作用，首選，我們檢驗了在基線和細胞因子刺激以后，CD34+中MAFB蛋白和mRNA水平(圖2A)。我們發(fā)現(xiàn)，體外巨核細胞分化期間MAFB蛋白是上調(diào)的。雖然通過PCR，MAFB的mRNA水平隨著分化增加，但是這種增加不與它的蛋白表達強度較好的相關。MAFB和miR-130a表達的相反模式表明了另外研究的體內(nèi)相互作用。
為了證明MAFB的3’UTR與miR-130a之間的直接相互作用，我們將預測與該miRNA相互作用的3’UTR區(qū)插入到熒光素酶載體中。這個實驗顯示，與對照載體相比，大約～60％的熒光素酶活性抑制(圖2B)。作為一個另外的對照實驗，我們使用了MAFB的突變的靶mRNA序列，其缺乏5個互補堿基。正如所料，該突變完全消除了miR-130a與它的靶3’UTRs之間的相互作用(圖2B)。
我們也確定了MAFB表達上過表達miR-130a的體內(nèi)后果。pre-miR-130a與陰性對照通過電穿孔轉(zhuǎn)染到K562細胞中，K562細胞天然表達MAFB并缺乏miR-130a。轉(zhuǎn)染pre-miR-130a，而不是對照，導致48小時時蛋白水平的降低(圖2C)。Northern印跡證實了miR-130a在K562細胞中成功的異位表達(圖7)。
實施例3MiR-10a與HOXB基因表達相關。
已經(jīng)報道了在小鼠胚中，miR-10a，miR-10b和miR-196以HOX樣模式表達(Mansfield，J.H.，等人(2004)Nature 36，1079-1083)而且在進化過程中緊密跟隨它們的“宿主”HOX簇(Tanzer，A.，et al(2005)J.Exp.Zool.B Mol.Dev.Evol.304B，75-85)。這些數(shù)據(jù)表明共同的調(diào)節(jié)元件跨越旁系同源簇。MiR-10a位于HOXB基因簇內(nèi)的17q21染色體上(圖8)，miR-10b位于HOXD基因簇內(nèi)的2q31染色體上。為了確定miR-10a表達模式與HOXB基因的表達相關，我們對HOXB4和HOXB5進行了RT-PCR，其是HOXB簇中分別將5’和3’定位于miR-10a的基因。如圖8所示，HOXB4和HOXB5表達與miR-10a的平行，這表明共同的調(diào)節(jié)機制。
實施例4MiR-10a下調(diào)HOXA1。
通過miRNA陣列和Northern印跡，我們確定了巨核細胞分化期間，miR-10a是顯著下調(diào)的。有趣地，我們發(fā)現(xiàn)了幾個HOX基因為miR-10a的假定靶(表2)。我們因此研究了，miR-10a是否能靶向HOX基因。我們對miR-10的預測HOX靶HOXA1，HOXA3和HOXD10進行了實時PCR。與18S RNA標準化以后，我們發(fā)現(xiàn)與CD34祖細胞相比，巨核細胞分化期間，HOXA1mRNA上調(diào)7倍(圖3A；也參見圖9)。巨核細胞分化期間，HOXA1蛋白水平也是上調(diào)的(圖3B)。這些結(jié)果與巨核細胞分化中miR-10a的下調(diào)成鮮明對比，這表明miR-10a可能是HOXA1表達的抑制劑。為了證明miR-10a與HOXA1基因的3’UTR序列的直接相互作用，我們?nèi)绮牧虾头椒ㄖ兴龅倪M行了熒光素酶報告分析。當miRNA前體miR-10a，與包含HOXA1的3′UTR序列的報告質(zhì)粒一起引入到MEG01細胞中時，觀察到熒光素酶活性50％降低(圖3C)。圖3D中顯示了miR-10a與HOXA1 3′UTR之間的互補性程度，如通過PICTAR預測的(www.pictar.bio.nyu.edu)。
為了體內(nèi)證實這些發(fā)現(xiàn)，使用核穿孔，我們用前-miR-10a前體轉(zhuǎn)染K562細胞，并通過RT-PCR測定HOXA1mRNA表達，和通過Western印跡法測定HOXA1蛋白水平。通過Northe rn印跡證實了miR-10a成功的異位表達(圖3E)。在用miR-10a前體，而不是用陰性對照轉(zhuǎn)染的K562細胞中，發(fā)現(xiàn)了HOXA1的mRNA與蛋白水平的顯著降低(圖3F和3G)。這些數(shù)據(jù)表明miR-10a體外和體內(nèi)靶向HOXA1。
已經(jīng)報道了miR-196誘導HOXB8 mRNA的切割，其針對HOX基因表達的轉(zhuǎn)錄后限制機制(Yekta，S.，等人(2004)Science，304594-596)。與miR-196-HOXB8相互作用相反，當幾乎完全的互補存在時，miR-10a與人HOXA13′UTR之間的配對程度是亞最佳的(圖4)。雖然我們的結(jié)果表明靶mRNA降解，但是還需要進一步的研究，以確定切割或翻譯抑制是否是該系統(tǒng)中HOXA1基因下調(diào)的初級機制。使用微陣列分析，以前的研究表明大量的靶mRNA基因在轉(zhuǎn)錄水平被miRNA下調(diào)(Lim，L.P.，等人(2005)Nature433，769-771)。這些數(shù)據(jù)提出了這樣的問題，靶降解是翻譯抑制與miR-靶復合物隨后再定位于胞質(zhì)加工體的結(jié)果還是初級事件(Pillai，R.(2005)RNA11，1753-1761)。
實施例5急性巨核細胞白血病(AMKL)細胞系中的miRNA分布圖。
鑒定了巨核細胞分化期間CD34+細胞的微小RNA表達型以后，我們?nèi)缓笱芯苛薃MKL細胞系中miRNA表達，同時帶著鑒定差異表達的miRNA的目標，其在巨核細胞白血病中具有致病作用。我們開始對4個AMKL細胞系中的miRNA表達，與體外CD34+分化的巨核細胞的miRNA表達進行了比較。使用微陣列的顯異性分析(SAM)，我們鑒定了與體外分化的巨核細胞中的CD34相比，在AMKL細胞系中上調(diào)的10種miRNA(表3；也參見表4)。這些miRNA為如下的miRNA(以相對于分化的巨核細胞成倍增加的順序)miR-101，miR-126，miR-99a，miR-99-prec，miR-106，miR-339，miR-99b，miR-149，miR-33和miR-135。結(jié)果通過如圖10所示的RT-PCR證實。使用PAM，我們比較了在帶有體外分化的巨核細胞的CD34+細胞與AMKL細胞系中的miRNA表達(圖10)。有趣地，我們發(fā)現(xiàn)涉及巨核細胞分化特征的5種miRNA(miR-101，miR-126，miR-106，miR-20和miR-135)，它們在白血病的細胞系中是上調(diào)的(表3，5和6)。該分布圖是否僅僅表示細胞的分化狀況，或者具有真正的致病作用，還有待解釋。支持第二種假說，miR-106，miR-135和miR-20預測為靶向RUNX1，其是與白血病通常最相關的基因之一(Nakao，M.，等人(2004)Oncogene125，709-719)。而且，已經(jīng)在家族性的血小板減少癥中描述了RUNX1的突變，家族性的血小板減少癥具有發(fā)展急性粒細胞白血病的傾向(Song，W.J.，等人(1999)Nat.Genet.23，166-175)。
表3.與體外分化的巨核細胞相比，在急性巨核細胞細胞系中上調(diào)的微小RNA 所有的miRNA的q值<0.01(假的發(fā)現(xiàn)率)。
除了miR-339和miR-149外，使用PAM發(fā)現(xiàn)相同的miRNA預測巨核細胞白血病歸入到?jīng)]有錯誤分類誤差。
這里所述的結(jié)果表明存在miRNA的下調(diào)。

這里所述的結(jié)果證明在巨核細胞形成期間存在miRNA的下調(diào)。假設地，miRNA的下調(diào)開啟了分化中所涉及的靶基因。和該假說一致，在我們的系統(tǒng)中顯著下調(diào)的miRNA，預測為靶向在巨核細胞分化中具有重要作用的基因。因此，我們已經(jīng)表明miR-130a靶向MAFB，miR-10a調(diào)節(jié)HOXA1。我們發(fā)現(xiàn)在分化和白血病期間幾種差異表達的miRNA的事實，該miRNA預測為靶向HOXA1，這表明HOXA1在巨核細胞形成中的功能。最終將需要損耗和增益研究，以明確說明HOXA1在該分化過程中的作用。我們的發(fā)現(xiàn)描述了在巨核細胞分化中miRNA的表達，并表明通過靶向巨核細胞轉(zhuǎn)錄因子，該世系的miRNA調(diào)節(jié)作用。而且，在巨核細胞白血病細胞系中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)涉及正常的巨核細胞分化的miRNA相反的表達。這些數(shù)據(jù)提供了在巨核細胞和白血病中，miRNA未來研究的起點。
表4.巨核細胞分化的特征。

PAM選擇具有很低的錯誤分類誤差的微小RNA。
表5 巨核細胞白血病細胞系的特征
PAM選擇的微小RNA。在t檢驗分數(shù)(SAM)和假定的靶旁邊，顯示了miRNA表達的倍數(shù)變化。
表6顯示3種細胞類型中不同調(diào)節(jié)的微小RNA的3級分析CD34+祖細胞，急性巨核細胞白血病細胞系(AMKL)和體外分化的巨核細胞。

在3種不同的細胞類型種存在3種miRNA表達模式。第一種模式由在CD34+細胞種高度表達，而且在AMKL和分化的巨核細胞中下調(diào)的miRNA限定。miR-10a和miR-130a遵循這種表達模式；但是，相對于分化的巨核細胞，miR-10a在AMKL中是上調(diào)的。第二種模式是在AMKL中上調(diào)，在CD34+細胞和分化的巨核細胞中下調(diào)的miRNA，而且包括下列miRNAmiR-126，miR-99，miR-101，let 7A和miR-100。最后兩種miRNA在CD34+和分化的巨核細胞中相等地表達，而不是顯示逐漸降低的表達，如通過miR-126，miR-99和miR-101證明的。最后的模式包括miRNA-106和miRNA-135-2，其在CD34+細胞和AMKL中是上調(diào)的，但是在分化的巨核細胞中較低。
微小RNA是高度保守類的非編碼RNA，其在增殖，細胞程序死亡，發(fā)育和分化中具有重要的調(diào)節(jié)功能。如這里所述的，為了發(fā)現(xiàn)巨核細胞分化期間新的調(diào)節(jié)途徑，我們對來源于CD34+造血祖細胞的體外分化的巨核細胞進行了微小RNA表達概況分析。一個重要的發(fā)現(xiàn)是miR-10a，miR-126，miR-106，miR-10b，miR-17和miR-20的下調(diào)。不希望受任何理論的束縛，認為微小RNA的下調(diào)開啟了分化中所涉及的靶基因。在體外和體內(nèi)證實了，miR-130a靶向轉(zhuǎn)錄因子MAFB，MAFB涉及GPIIB啟動子的激活，是血小板生理機能的關鍵蛋白。而且，分化的巨核細胞中miR-10a表達顯示與HOXA1的相反，而HOXA1是miR10a的直接靶。最后，將巨核細胞白血病細胞系的微小RNA表達與體外分化的巨核細胞和CD34+祖細胞進行了比較。該分析顯示，miR-101，miR-126，miR-99a，miR-135和miR-20在癌細胞系中上調(diào)。這里所述的數(shù)據(jù)和結(jié)果描述了巨核細胞形成期間微小RNA的表達，并證實了通過靶向巨核細胞轉(zhuǎn)錄因子微小RNA在該過程中的調(diào)節(jié)作用。
這里引用的所有出版物的相關教導，其沒有明確地引入作為參考，都以其全部內(nèi)容引入這里作為參考。雖然本發(fā)明已經(jīng)參考其優(yōu)選實施方案進行了具體顯示和描述，但是本領域的技術人員應當理解，可以對本發(fā)明進行形式和細節(jié)的各種改變，而不背離附加的權利要求所涵蓋的本發(fā)明的范圍。
雖然參考不同的和優(yōu)選的實施方案已經(jīng)描述了本發(fā)明，但是本領域的技術人員應當理解，可以進行各種改變，而且同等物可以替代其要素，而不背離本發(fā)明的基本范圍。而且，可以進行許多改進，以使特定的狀況或材料適應本發(fā)明的教導，而不背離其基本范圍。因此，本發(fā)明的目的不是為了限定到這里公開的期望用于實施本發(fā)明的特定實施方案，而是本發(fā)明將包括屬于權利要求范圍內(nèi)的所有實施方案。
權利要求
1.一種診斷或預測個體中的癌和/或骨髓增生性疾病的方法，包括
i)確定來自個體的樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平；和
ii)比較樣品與對照中該至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中相對于對照，來自個體的樣品中該至少一種miR基因產(chǎn)物的水平的增加，是診斷或預后癌和/或骨髓增生性疾病的指示，而且
其中該至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-99a，miR-99-prec，miR-106，miR-339，miR-99b，miR-149，miR-33，miR-135和miR-20。
2.權利要求1的方法，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-106，miR-20和miR-135。
3.權利要求1的方法，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-106，miR-20和miR-135。
4.權利要求1的方法，其中癌和/或骨髓增生性疾病是癌癥。
5.權利要求4的方法，其中癌癥是白血病。
6.權利要求5的方法，其中白血病是急性粒細胞白血病。
7.權利要求6的方法，其中急性粒細胞白血病是急性巨核細胞白血病。
8.權利要求4的方法，其中癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。
9.權利要求1的方法，其中癌和/或骨髓增生性疾病是骨髓增生性疾病。
10.權利要求9的方法，其中骨髓增生性疾病選自原發(fā)性血小板增多癥(ET)，真性紅細胞增多(PV)，脊髓發(fā)育不良，骨髓纖維化和慢性粒細胞白血病(CML)。
11.權利要求1的方法，其中對照選自
i)參照標準；
ii)來自未患癌和/或骨髓增生性疾病的個體的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平；和
iii)來自非癌和/或不顯示骨髓增生性疾病的個體的樣品的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。
12.權利要求1的方法，其中個體是人。
13.一種治療個體中的癌和/或骨髓增生性疾病的方法，包括施用有效量的抑制至少一種miR基因產(chǎn)物表達的化合物給個體，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-99a，miR-99-prec，miR-106，miR-339，miR-99b，miR-149，miR-33，miR-135和miR-20。
14.權利要求13的方法，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-106，miR-20和miR-135。
15.權利要求13的方法，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-106，miR-20和miR-135。
16.權利要求13的方法，其中癌和/或骨髓增生性疾病是癌癥。
17.權利要求16的方法，其中癌癥是白血病。
18.權利要求17的方法，其中白血病是急性粒細胞白血病。
19.權利要求18的方法，其中急性粒細胞白血病是急性巨核細胞白血病。
20.權利要求16的方法，其中癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。
21.權利要求13的方法，其中癌和/或骨髓增生性疾病是骨髓增生性疾病。
22.權利要求21的方法，其中骨髓增生性疾病選自原發(fā)性血小板增多癥(ET)，真性紅細胞增多(PV)，脊髓發(fā)育不良，骨髓纖維化和慢性粒細胞白血病(CML)。
23.權利要求13的方法，其中個體是人。
24.一種治療個體中的癌和/或骨髓增生性疾病的方法，包括施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物學活性片段給個體，其中
癌和/或骨髓增生性疾病與MAFB基因產(chǎn)物的過表達相關；和該至少一種miR基因產(chǎn)物與MAFB基因產(chǎn)物結(jié)合，并降低MAFB基因產(chǎn)物的表達。
25.權利要求24的方法，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物學活性片段包括與MAFB基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
26.權利要求25的方法，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-130a或其分離的變體或生物學活性片段。
27.權利要求24的方法，其中癌和/或骨髓增生性疾病是癌癥。
28.權利要求27的方法，其中癌癥是白血病。
29.權利要求28的方法，其中白血病是急性粒細胞白血病。
30.權利要求29的方法，其中急性粒細胞白血病是急性巨核細胞白血病。
31.權利要求27的方法，其中癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。
32.權利要求24的方法，其中癌和/或骨髓增生性疾病是骨髓增生性疾病。
33.權利要求32的方法，其中骨髓增生性疾病選自原發(fā)性血小板增多癥(ET)，真性紅細胞增多(PV)，脊髓發(fā)育不良，骨髓纖維化和慢性粒細胞白血病(CML)。
34.權利要求24的方法，其中個體是人。
35.一種治療個體中的癌和/或骨髓增生性疾病的方法，包括施用有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物學活性片段給個體，其中
癌和/或骨髓增生性疾病與HOXA1基因產(chǎn)物的過表達相關；和該至少一種miR基因產(chǎn)物與HOXA1基因產(chǎn)物結(jié)合，并降低HOXA1基因產(chǎn)物的表達。
36.權利要求35的方法，其中該至少一種m iR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物學活性片段包括與HOXA1基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
37.權利要求36的方法，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-10a或其分離的變體或生物學活性片段。
38.權利要求35的方法，其中癌和/或骨髓增生性疾病是癌癥。
39.權利要求38的方法，其中癌癥是白血病。
40.權利要求39的方法，其中白血病是急性粒細胞白血病。
41.權利要求40的方法，其中急性粒細胞白血病是急性巨核細胞白血病。
42.權利要求38的方法，其中癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。
43.權利要求35的方法，其中癌和/或骨髓增生性疾病是骨髓增生性疾病。
44.權利要求43的方法，其中骨髓增生性疾病選自原發(fā)性血小板增多癥(ET)，真性紅細胞增多(PV)，脊髓發(fā)育不良，骨髓纖維化和慢性粒細胞白血病(CML)。
45.權利要求35的方法，其中個體是人。
46.一種確定和/或預測巨核細胞分化的方法，包括
i)確定包含巨核細胞后代和/或巨核細胞的樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平；和
ii)比較樣品與對照中該至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中相對于對照，樣品中該至少一種miR基因產(chǎn)物的水平的改變是巨核細胞分化的指示。
47.權利要求46的方法，其中改變是樣品中該至少一種miR基因產(chǎn)物的水平降低。
48.權利要求46的方法，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-10a，miR-126，miR-106，miR-010b，miR-130a，miR-130a-prec，miR-124a，miR-032-prec，miR-101，miR-30c，miR-213，miR-132-prec，miR-150，miR-020，miR-339，1et-7a，1et-7d，miR-181c，miR-181b和miR-017。
49.權利要求46的方法，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-10a，miR-10b，miR-30c，miR-106，miR-126，miR-130a，miR-132和miR-143。
50.權利要求46的方法，其中所述樣品來自于個體。
51.權利要求50的方法，其中個體是人。
52.權利要求1的方法，其中對照選自
i)參照標準；和
ii)包含非分化巨核細胞后代和/或巨核細胞的參照樣品的該至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。
53.一種用于治療癌和/或骨髓增生性疾病的藥物組合物，包括有效量的抑制至少一種miR基因產(chǎn)物表達的化合物，和藥學上可接受的載體，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-99a，miR-99-prec，miR-106，miR-339，miR-99b，miR-149，miR-33，miR-135和miR-20。
54.權利要求53的藥物組合物，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-101，miR-126，miR-106，miR-20和miR-135。
55.權利要求53的藥物組合物，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-106，miR-20和miR-135。
56.權利要求53的藥物組合物，其中該藥物組合物另外包括至少一種抗癌劑。
57.一種用于治療與MAFB基因產(chǎn)物的過表達相關的癌和/或與MAFB基因產(chǎn)物的過表達相關的骨髓增生性疾病的藥物組合物，包括有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物和藥學上可接受的載體，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物與MAFB基因產(chǎn)物結(jié)合，并降低MAFB基因產(chǎn)物的表達。
58.權利要求57的藥物組合物，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物包括與MAFB基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
59.權利要求58的藥物組合物，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-130a或其分離的變體或生物學活性片段。
60.權利要求57的藥物組合物，其中該藥物組合物另外包括至少一種抗癌劑。
61.一種用于治療與HOXA1基因產(chǎn)物的過表達相關的癌和/或與HOXA1基因產(chǎn)物的過表達相關的骨髓增生性疾病的藥物組合物，包括有效量的至少一種miR基因產(chǎn)物和藥學上可接受的載體，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物與HOXA1基因產(chǎn)物結(jié)合，并降低HOXA1基因產(chǎn)物的表達。
62.權利要求61的藥物組合物，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物包括與HOXA1基因產(chǎn)物中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
63.權利要求62的藥物組合物，其中該至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-10a或其分離的變體或生物學活性片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于診斷，預后和治療癌癥與脊髓增生病的新方法與組合物。本發(fā)明還提供了鑒定抗癌劑的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101448958SQ200780018496
公開日2009年6月3日 申請日期2007年3月19日 優(yōu)先權日2006年3月20日
發(fā)明者C·M·克羅斯, R·加爾松, G·A·卡林 申請人:俄亥俄州立大學研究基金會