專利名稱：：分離和測定胰酶制劑樣品中病毒載量的方法分離和測定胰酶制劑樣品中病毒栽量的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種從胰酶制劑樣品中基本上定量分離病毒栽量的方法和一種定量測定該胰酶制劑樣品的病毒栽量的方法?；钚越M分的混合物。胰酶制劑的主要組分是消化酶，特別是胰脂肪酶，但也可以是淀粉酶和蛋白酶。由于其有價值的治療性質(zhì)和在使用中高水平的安全性，很長時間以來胰酶制劑已經(jīng)成功地在酶補充療法中用作藥物制劑。胰脂肪酶是最為顯著的，但淀粉酶和蛋白酶也為胰酶制劑的治療益處做出了重要的貢獻。用于治療目的的胰酶制劑通常是從牛("牛胰酶制劑")或豬("豬胰酶制劑")獲得的，豬胰酶制劑在數(shù)量方面具有最大的重要性。制備用于治療目的的胰酶制劑的方法本身是已知的，例如見出版物EP0115023A。由于來源于動物的胰酶制劑的性質(zhì)，原料典型地伴隨著不希望的生物組分，例如細菌或病毒污染物。但是，在包含胰酶制劑的藥品商業(yè)化的100多年期間，還沒有報道患者受到了病毒污染的胰酶制劑的影響的病例。盡管如此，生產(chǎn)來源于生物組織和/或體液的藥品的^^司^可能的最低水平來提高其產(chǎn)品的安全性水平^不依賴于;斤關注的污染物是否被認為是人的病原體。因此，對于胰酶制劑在藥品中的應用，需要有檢測和定量這些生物污染物的可靠的分析方法。迄今為止，還沒有開發(fā)出可靠的方法來定量檢測或分離胰酶制劑樣品中的病毒污染物。這可能是由于下列事實使用本領域普通技術人員已知的技術時，胰酶制劑的酶活性組分與典型地用于多種病毒的細胞系是不相容的，因此使得更難以或者甚至無法確定胰酶制劑樣品中的病毒滴度。因此，本發(fā)明的目的是提供一種從胰酶制劑樣品中基本上定量分離病毒載量的方法和一種定量測定該胰酶制劑樣品的病毒栽量的方法。特別地，本發(fā)明的目的是提供一種從胰酶制劑樣品中基本上定量分離傳染性的病毒栽量的方法和一種定量測定該胰酶制劑樣品的傳染性的病毒載量的方法現(xiàn)在，已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，如果首先以多步離心分離方法從胰酶制劑樣品中分離病毒載量，然后用本身已知的病毒學方法定量測定所分離的病毒載量，那么就可以基本上定量測定胰酶制劑樣品中的病毒載量，特別是傳染性的病毒栽量。出版物JP12856990已經(jīng)披露了一種通過非特異性的低速離心分離和超速離心的組合來濃縮或分離肝炎病毒的方法。在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種從胰酶制劑樣品中分離病毒載量的方法，包括步驟a)制備適合從胰酶制劑樣品中離心分離的液體胰酶制劑試驗樣品，這樣做的話不會改變其病毒載量，b)在一定條件下將步驟a)的胰酶制劑試驗樣品的至少一個限定部分迸行至少一次低速離心分離，在該條件下沉降常數(shù)>120S的病毒不會形成沉淀，c)棄去任選在步驟b)的低速離心分離期間出現(xiàn)的任何固體沉淀，保留胰酶制劑試驗樣品的上清液，d)將在步驟c)中獲得的胰酶制劑試驗樣品的上清液的至少一個限定部分在不連續(xù)梯度的介質(zhì)中超速離心，其中選擇超速離心的持續(xù)時間和超速離心的相對離心力，以便將病毒載量從胰酶制劑試驗樣品的上清液定量轉運到位于上方的靶級分中或上層最低濃度梯度組分和下層次高濃度梯度組分之間的分界層中，和e)從胰酶制劑試驗樣品的上清液中定量分離包含病毒載量的靶級分。在第二個實施方案中，本發(fā)明涉及一種定量測定胰酶制劑樣品的病毒載量，特別是胰酶制劑樣品的傳染性的病毒載量的方法。在該第二個實施方案中，除了根據(jù)第一個實施方案的方法以外，還在步驟e)后的步驟f)中，通過測定包含病毒栽量的靶級分中的病毒感染滴度來進行胰酶制劑樣品的病毒栽量的定量測定。除了本文另有特定說明，在所有情況下下文所述的任何技術和科學術語都具有與該特定的
技術領域：
的技術人員常規(guī)所知相同的含義。下文所引用的例如"0-15匸"形式的溫度范圍是指0匸到15C的溫度范圍，在所有情況下都包括該范圍的界值。下文所引用的例如"30-120分鐘"形式的時間范圍是指30分鐘到120分鐘的時間范圍，在所有情況下都包括該范圍的界值。下文所引用的例如"2-8小時"形式的時間范圍是指2小時到8小時的時間范圍，在所有情況下都包括該范圍的界值。下文所引用的例如"10-15ml"形式的體積范圍是指10毫升到15毫升的體積范圍，在所有情況下都包括該范圍的界值。下文所引用的例如"1，500-5，000xg"形式的相對離心力范圍是指1,500xg到1，500xg范圍的相對離心力，在所有情況下都包括該范圍的界值。下文所引用的例如"80-100mm"形式的長度范圍的測量值是指80毫米到100毫米范圍的長度范圍的測量值，在所有情況下都包括該范圍的界值。根據(jù)本發(fā)明的方法適合動物來源的所有類型的胰酶制劑，特別是可以在常規(guī)的商品化的豬胰酶制劑和牛胰酶制劑上進行。該方法優(yōu)選是在豬胰酶制劑樣品上進行的。根據(jù)本發(fā)明的方法一般適合從胰酶制劑樣品中分離病毒栽量并隨后定量測定胰酶制劑樣品的病毒栽量。特別地，該方法適合分離和定量測定胰酶制劑樣品的病毒載量，其中病毒載量包含牛輪狀病毒A、腦炎心肌炎病毒(=EMCV)、豬環(huán)病毒(=PCV)、豬細小病毒(-PPV)、豬輪狀病毒A、豬輪狀病毒和/或豬水泡病病毒(-SVDV)。由于其非常相似的性質(zhì)，可以將人柯薩奇病毒B5/1用作證明根據(jù)本發(fā)明的方法分離和/或定量測定SVDV的適合性的模型。由于其非常類似的性質(zhì)，牛輪狀病毒A(例如菌林B223)可以用作證明根據(jù)本發(fā)明的方法分離和/或定量測定豬輪狀病毒A的適合性的模型。在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟a)中，適合離心分離的液體胰酶制劑試驗樣品是由胰酶制劑樣品制備的，這樣做不會改變或更改病毒栽量，特別是傳染性的病毒載量。這可以例如通過由胰酶制劑樣品制備胰酶制劑試驗樣品的混懸液來實現(xiàn)。胰酶制劑試驗樣品的混懸液是通過將胰酶制劑樣品與適合用于培養(yǎng)待研究的病毒種的細胞系的細胞培養(yǎng)基和適合該目的的一種或多種抗生素組合制備的。一般地，所有的抗生素都適合用于制備任選在步驟a)中使用的抗生素溶液。通常，使用廣鐠抗生素或這些廣鐠抗生素的混合物。適當?shù)目股乜梢允沁x自15-內(nèi)酰胺類抗生物例如青霉素類、頭孢菌素類(包括氧頭孢烯和碳頭孢烯)、碳青霉烯和單酰胺菌素；鏈霉素(包括硫酸鏈霉素)；新霉素(包括新霉素A、新霉素B和巴龍霉素)；卡那霉素(包括卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星和妥布霉素)；大觀霉素；四環(huán)素(包括四環(huán)素、土霉素、多西環(huán)素和米諾環(huán)素)；大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(包紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、交沙霉素和螺旋霉素)；或旋轉酶抑制劑(包括萘啶酸、西諾沙星、吡哌酸、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和氟羅沙星)；葉酸拮抗劑(包括磺胺類抗生素、二氨基芐基嘧啶和它們的組合)；氯霉素；林可酰胺類抗生素；糖肽類抗生素(包括萬古霉素和替考拉寧)；磚霉素；多肽抗生素(包括多粘菌素B、粘菌素、桿菌肽和短桿菌素)和莫匹羅星。優(yōu)選的抗生素是硫酸鏈霉素和青霉素以及硫酸鏈霉素和青霉素的混合物，例如抗生素"混合物(cocktail)"。一種或多種抗生素可以例如在所有情況下都適合用于一種或多種抗生素的溶劑的溶液中使用，即作為抗生素溶液。將溫度冷卻至0-15。C，例如冷卻至4-iox:的溫度來方便地制備胰酶制劑試驗樣品的混懸液。在水冷卻下常規(guī)地攪拌用于制備胰酶制劑試驗樣品的混懸液的組分，持續(xù)時間為至少30分鐘，例如30-120分鐘，優(yōu)選45-90分鐘，特別地是50分鐘或60分鐘。在所有情況下，冷卻胰酶制劑試驗樣品的混懸液和在所有的其他步驟中冷卻的目的是避免或者至少大幅降低由于胰酶制劑樣品的酶活性組分而導致的病毒栽量失活。在一個實施方案中，本發(fā)明也提供了一種可以根據(jù)步驟a)制備的胰酶制劑試驗樣品的混懸液。確定所有情況下在步驟a)中制備胰酶制劑試驗樣品的混懸液使用什么樣的細胞培養(yǎng)基，通過該細胞培養(yǎng)基，使用本發(fā)明的方法病毒種得以分離和/或定量測定。如果可能所研究的病毒種在其中開始出現(xiàn)細胞病變效應(-CPE)的允許細胞培養(yǎng)基被用于培養(yǎng)和檢測具體的病毒種。CPE是通過光學顯微鏡可以識別的病毒感染細胞的改變。如果在培養(yǎng)的細胞中病毒種增殖而沒有出現(xiàn)CPE，那么這種增殖一般可以通過本身已知的間接檢測方法來鑒定。如果，例如，要分離和/或定量測定牛輪狀病毒A，那么，例如，胎猴腎細胞(-MA-104細胞)可以用于其培養(yǎng)。在這種情況下，本身已知的Dulbecco氏改良的Eagle培養(yǎng)基(=Dulbecco培養(yǎng)基)例如適合作為細胞培養(yǎng)基。如果分離和/或定量測定EMCV，豬腎細胞(-PK-15細胞)或胚胎豬腎細胞(=SPEV)細胞可以用于其培養(yǎng)。在PK-15細胞的情況中，本身已知的最低必需培養(yǎng)基(=MEM)例如適合作為細胞培養(yǎng)基。在SPEV細胞的情況中，Dulbecco培養(yǎng)基例如適合作為細胞培養(yǎng)基。如果，例如分離和/或定量測定PCV，PK-15細胞可以例如用于其培養(yǎng)。如果，例如分離和/或定量測定PPV，豬腎細胞(SK-6細胞)可以例如用于其培養(yǎng)。在這種情況下，Dulbecco培養(yǎng)基例如適合作為細胞培養(yǎng)基。如果，例如分離和/或定量測定豬輪狀病毒A，MA-1(M細胞可以例如用于其培養(yǎng)。如果，例如分離和/或定量測定豬輪狀病毒，PK-15細胞可以例如用于其培養(yǎng)。如果，例如分離和/或定量測定SVDV，SPEV細胞可以例如用于其培養(yǎng)。本領域技術人員知道用于培養(yǎng)特定病毒種的適當細胞系和相應的適當細胞培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明可以使用的病毒幹和相應的細胞系可以從適當?shù)膩碓传@得，例如來自美國Manassas的美國"典型培養(yǎng)物保藏中心"(-ATCC)，"DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH"，Braunschweig,Germany(=DSMZ),"Friedrich-Uiffler-Institut"，F(xiàn)ederalResearchInstituteforAnimalHealth,InselRiems，Germany(=FLI)或"VeterinaryServiceDivision"ofthe"DepartmentofAgricultureandRuralDevelopment",Belfast,UnitedKingdom(=DARD)。在步驟b)中，在步驟a)中獲得的胰酶制劑試驗樣品可以以其整體使用，或以該胰酶制劑試驗樣品的某一限定部分使用，特別是可以使用限定體積的該胰酶制劑試驗樣品。在步驟a)獲得的胰酶制劑試驗樣品優(yōu)選是以其整體使用的。在步驟b)中，在低速離心分離的情況下，可以確定條件，在該條件下，沉降常數(shù)>120S，特別是>120S到5,000S的病毒不會形成沉淀。在所有情況下，以相對離心力低于10，OOQxg，在所有情況下以1，500-5，000xg，，特別優(yōu)選在所有情況下以2，000-3，500xg，例如在所有情況下以2,700xg的相對離心力進行低速離心分離時，沉降常數(shù)>120S的病毒，特別是沉降常數(shù)>120S到5，000S的病毒通常不會形成沉淀。低速離心分離步驟的持續(xù)時間常規(guī)地是至少5分鐘，通常是5-60分鐘，特別地是10-45分鐘，優(yōu)選10-30分鐘，例如15分鐘。在步驟b)的一個優(yōu)選實施方案中，將溫度冷卻至0-15。C，例如至4-10。C的溫度，優(yōu)選在冷凍離心機中來進行低速離心分離步驟。在步驟中b),低速離心分離步驟的目的主要是從胰酶制劑的混懸液中除去那些胰酶制劑組分例如在胰酶制劑樣品的病毒載量的分離和/或定量測定中破裂的不溶性顆粒等等，以獲得適合進一步處理的胰酶制劑試驗樣品的上清液。因此在低速離心分離步驟中任選獲得的固體沉淀一般是在步驟中c)中除去，而將上清液用于下一步驟d)?？梢苑奖愕刂貜偷退匐x心分離步驟并隨后除去任選獲得的固體沉淀，直至不再觀察到固體沉淀形成。一般地，在重復l-3次，特別是只重復l次后就不必要再重復低速離心分離步驟和隨后除去低速離心分離了。在本發(fā)明的一個實施方案中，在步驟b)中獲得的固體沉淀可以是沉淀。在本發(fā)明的一個實施方案中，用適當?shù)南礈煲簩⒃诘退匐x心分離步驟中獲得的沉淀洗滌一次或多次，例如l-3次，然后棄去洗滌液。適當?shù)南礈煲菏?，例如，在低速離心分離后獲得的胰酶制劑試驗樣品的上清液本身，然后其可以在步驟d)中使用。如果使用胰酶制劑試驗10樣品的上清液本身以外的洗滌液，合并所述洗滌液，用胰酶制劑試驗樣品的上清液將沉淀徹底洗滌一次，然后在步驟d)中使用。如果胰酶制劑樣品的病毒載量包含EMCV，在步驟d)中使用前以上述方式洗滌沉淀是特別有利的。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明也包含胰酶制劑試驗樣品的上清液，其可以根據(jù)如上所述的步驟a)-c)來制備。不連續(xù)的雙相蔗糖梯度可以方便地用作步驟d)中的不連續(xù)梯度的介質(zhì)。該不連續(xù)梯度的介質(zhì)優(yōu)選包含由5(^(wt./vol.)緩沖蔗糖溶液和20%(wt./vol.)緩沖蔗糖溶液制備的梯度。中性緩沖液(即pH值大約為7的緩沖液)可以例如用作蔗糖溶液的緩沖液。優(yōu)選使用PBS緩沖液(="磷酸鹽緩沖鹽水"緩沖液，pH7.2)。通?？梢允褂脽o菌梯度介質(zhì)。上述種類的雙相不連續(xù)的蔗糖梯度特別適合沉淀和可以發(fā)現(xiàn)病毒的分離條件。而且，不連續(xù)的蔗糖梯度，特別是上述由任選的50%(wt./vol.)緩沖蔗糖溶液和20%(wt./vol.)緩沖蔗糖溶液制備的梯度顯示了適當?shù)臐B透情況，以便不會使任何任選存在的病毒載量失活。例如，根據(jù)步驟d)的超速離心確保了，由胰酶制劑樣品產(chǎn)生的病毒載量是從胰酶制劑試驗樣品的上清液基本上定量地轉移到不連續(xù)梯度的介質(zhì)中。這里的基本上定量是指之前加入到試驗樣品中的病毒載量是如此完全地恢復，以至于在所加入的病毒栽量和在已經(jīng)進行了超速離心后恢復的病毒載量的滴度差異小于或等于病毒滴度的10的對數(shù)的一半(=0.5的病毒對數(shù)值)。此外，根據(jù)步驟d)的超速離心確保了將病毒載量轉運到乾級分中，該靶級分距離胰酶制劑試驗樣品足夠地遠，以允許從胰酶制劑試驗樣品中機械分離，同時這些相的再混合物不會分裂而發(fā)生分離?？梢苑奖愕剡M行步驟d)，包括將一定體積的最高的濃度梯度介質(zhì)引入到超速離心管中，其上層是一定體積的次低的濃度梯度介質(zhì)。需要時，重復該方法很多次，以獲得多相梯度介質(zhì)，其終(頂)層是一定體積的適合從其中分離病毒載量的液體胰酶制劑試驗樣品。在雙相梯度介質(zhì)的情況中，然后立即將該體積的次低的濃度梯度介質(zhì)覆蓋在適合離心分離的一定體積的液體胰酶制劑試驗樣品或胰酶制劑試驗樣品的混懸液(胰酶制劑試驗樣品體積)上。在雙相梯度介質(zhì)的情況中，這在超速離心管中從第一層的頂部以下獲得了一系列的相，其中第一層包含胰酶制劑試驗樣品(頂層)的體積，然后是最低的濃度梯度介質(zhì)(中層；例如20Uwt./vol.)緩沖蔗糖溶液)的體積，最后是最高的濃度梯度介質(zhì)(底部，覆蓋超速離心管的底部；例如50Uwt./vol.)緩沖蔗糖溶液)的體積。當覆蓋初始體積時，必須小心照看以確保在各自的界面上不會出現(xiàn)湍流或混合。步驟d)中的靶級分典型地包含(i)足夠遠和遠離胰酶制劑試驗樣品體積的一部分最低的濃度梯度介質(zhì)和(ii)完整體積的次高的濃度梯度介質(zhì)。在雙相梯度介質(zhì)的情況中，靶級分包含，例如，足夠遠和遠離胰酶制劑試驗樣品體積的一部分最低的濃度梯度介質(zhì)和向下延伸到超速離心管的底部的完整體積的最高的濃度梯度介質(zhì)。當計算足夠遠離胰酶制劑試驗樣品體積的靶級分的位置因而可以進行隨后的分離時，應當牢記的是，顆粒位置(即，從完整體積的次高的濃度梯度介質(zhì)中分離的病毒顆粒的位置)的計算值通常表示的是高斯分布的至高點。這樣，該顆粒將被分布在它們的所計算位置之上和之下。因此，當確定靶級分距胰酶制劑試驗樣品體積的所需距離時，包括另外的界限以說明顆粒位置的高斯分布是必要的。如果由于超速離心沉降常數(shù)>120S,特別是>120S到5,000S的顆粒從胰酶制劑試驗樣品體積中移出至少10mm，例如至少15mm，至少20mm,至少25mm或至少30腿而進入最低的濃度梯度介質(zhì)中，那么可以常規(guī)地將病毒載量轉運到靶級分中，其中該靶級分與胰酶制劑試驗樣品體積足夠地遠，以用于隨后的分離。在前述雙相梯度介質(zhì)的情況中，最低的濃度梯度介質(zhì)是20Mwt./vol.)緩沖蔗糖溶液，在超速離心步驟的一個變型中，基本上所有的沉降常數(shù)>120S，特別是>120S到5，000S的顆粒都完全通過了最低濃度梯度介質(zhì)，并在分界層上濃縮成次高的濃度梯度介質(zhì)(即，在"蔗糖墊層"("sucrosecushion")上)。本領域技術人員知道計算和實現(xiàn)超速離心的相應條件的適當方法。基于要從胰酶制劑樣品中分離的病毒的性質(zhì)(例如，密度和沉降常數(shù))可以確定適當?shù)某匐x心條件，其中可以使用假設本身已知的簡單化處理(參見，例如Lebowitz等人，"Modernanalyticalultracentrifugationinproteinscience:Atutorialreview";ProteinScience旦(2002)2067-2079)。假如使用常規(guī)的體積比并在不連續(xù)梯度的介質(zhì)中，優(yōu)選在雙相不連續(xù)的蔗糖梯度中進行超速離心，如果進行超速離心的持續(xù)時間是至少1小時，通常至少2小時，例如持續(xù)時間是2-8小時，特別地持續(xù)時間是3-6小時，可以常規(guī)地將病毒載量轉運到適合隨后分離的靶級分中。根據(jù)本發(fā)明的超速離心的相對離心力是至少100，000xg，例如200,000-350,000xg。在超速離心步驟的一個實施方案中，進行所述步驟的持續(xù)時間是3-6小時，相對離心力是200，000-350，000xg,體積比是進行超速離心的常規(guī)比例，是在由50。/。(wt./vol.)緩沖蔗糖溶液和20。/。(wt./vol.)緩沖蔗糖溶液的梯度中制備的。在超速離心步驟的另一個實施方案中，進行所述步驟的持續(xù)時間是3.5-4.5小時，相對離心力是250，000-300，000xg，體積比是進行超速離心的常規(guī)比例，是在由50%(wt./vol.)緩沖蔗糖溶液和20%(wt./vol.)緩沖蔗糖溶液的梯度中制備的。如果使用常規(guī)的超速離心管，例如就獲得了進行超速離心的常規(guī)體積比。這里的常規(guī)超速離心管是例如體積為10-15ml,特別地12-13ml;內(nèi)半徑為6-8mm,特別是7mm;高度是80-100mm，特別是85-95mm。假如在步驟d)中使用常規(guī)的超速離心管，最高的濃度梯度介質(zhì)(例如5(T/。(wt./vol.)緩沖蔗糖溶液)的體積可以是例如合計0.5ml，次低的濃度梯度介質(zhì)(例如20y。(wt./vo1.)緩沖蔗糖溶液)的體積可以是例如合計4.5ml,胰酶制劑試驗樣品的體積可以是例如合計5ml。在步驟d)的實施方案的一個優(yōu)選的變型中，不管所選擇的條件，將溫度冷卻至o-15x:，優(yōu)選冷卻至4-iox:的溫度來進行超速離心?？梢栽谠摬襟E中使用的常規(guī)冷凍離心機是本領域技術人員已知的。在步驟d)中常規(guī)使用的是常規(guī)的商業(yè)超速離心機，例如具有浮桶13式轉頭的可冷卻超速離心機，例如來自Sorval^的具有模型"TH-641"浮桶式轉頭的超速離心機。本領域技術人員可以將本發(fā)明的低速離心分離步驟和超速離心步驟的上述描述增加或減小至任何所需的程度，特別地是借助于本發(fā)明的說明書所述的其他技術信息。在步驟e)中，從胰酶制劑試驗樣品的上清液中定量分離包含病毒載量的靶級分。通常進行分離，包括在預先確定的靶級分的界面的高度上，在超速離心管上標上標記。然后例如通過抽吸從剩余體積中分離該界面上的整個體積。例如，用常規(guī)的振動泵，管和事先已經(jīng)滅菌的毛細管來進行抽吸。適當?shù)谋贸鏊俾适抢纾?ml/分鐘的速率。在抽吸期間，應當小心照看，以確保振動泵的毛細管總是位于液體的上邊緣上。然后可以以本身已知的方式，用優(yōu)選具有無菌尖端的常規(guī)單道吸量管從超速離心管中除去保留在超速離心管中的靶級分。同時可以除去仍然可能保留在超速離心管中的沉淀，例如通過用單道吸量管反復抽吸和重懸浮。在一個實施方案中，本發(fā)明也提供了分離的靶級分，其可以根據(jù)步驟a)-e)制備。如果要實施一種定量測定胰酶制劑樣品的病毒載量的方法，那么在步驟e)后進行步驟f)。在步驟f)中，通過測定包含病毒栽量的把級分中的病毒感染滴度來定量測定胰酶制劑樣品的病毒載量。可以按照病毒學中本身已知的操作方法來進行靶級分中的病毒感染滴度的定量測定，例如，根據(jù)本身已知的病毒感染滴度測定的原理(-VITD)。例如，可以用適當?shù)募毎囵B(yǎng)基，以適當?shù)谋壤♂尠屑壏?，以獲得病毒測定的試驗樣品。適當?shù)呐囵B(yǎng)基是上述可以使用的那些，在所有情況中都作為所研究的病毒種的函數(shù)。在本發(fā)明的排除病毒感染的假陽性命中數(shù)的一個實施方案中，在步驟f)中進行病毒載量的定量測定前，可以將稀釋或未稀釋的靶級分過濾通過微過濾器。適當?shù)南♂尶梢裕缤ㄟ^用細胞培養(yǎng)基稀釋把級分至在步驟d)中使用的胰酶制劑試驗樣品的上清液的初始體積來實現(xiàn)。然后，在第一個步驟中，首先可以以本身已知的方式制備病毒測定的試驗樣品的稀釋液系列，例如，以l:2,1:5或1:10的稀釋步驟或?qū)⑦@些稀釋步驟組合，以急性定量的VITD。然后，在第二個步驟中，用稀釋液系列的不同濃度的病毒測定的試驗樣品，以本身已知的方式來灌輸適當?shù)募毎鞈乙?，因此，可以在不同濃度的病毒測定的試驗樣品上形成細胞層。為了排除由于微生物例如惰性細菌或支原體的存在而導致的病毒感染的假陽性命中數(shù)，然后通常有利的是在將它們接種到檢測器的細胞上之前過濾該病毒測定的試驗樣品。為此目的，可以將病毒測定的試驗樣品或稀釋的病毒測定的試驗樣品過濾通過適當孔徑的過濾器，例如微過濾器，例如孔徑0.1到10nm(包括范圍的邊界值；-微孔過濾)的微過濾器，通常是孔徑lpm的微過濾器。然后可以將濾液用作進一步研究的試驗樣品。然后，在第三個步驟中，根據(jù)其中指示它們感染的方式對所接種的試驗樣品的感染程度進行讀數(shù)。例如，當CPE可以用作細胞層感染的指示劑時，在約4-7天后以本身已知的方式對CPE進行讀數(shù)。此處病毒測定的試驗樣品的滴定(末點稀釋)允許進行原來存在的感染劑量的定量測定。通過10倍稀釋，即基于10的對數(shù)來常規(guī)地進行滴定。實際上，通常計算50%感染劑量(-105。)。在平行多批次的情況中，然后鑒定的ID5。值對應于病毒測定的試驗樣品的最高(倒數(shù)的)稀釋液，在該值下在正好一半的批次中檢測到了CPE。此外任選可以以本身已知的方式通過計算校正或以內(nèi)插值替換該結果。病毒滴度計算的最常用的方法是根據(jù)Spearman和Karber(參見C.Spearman,Br.J.Psychol.^(1908)227-242和G.Karber，Arch.Exp.Path.Pharmak.j^(1931)480-483;alsoBundesanzeiger[Federalgazette]no.84，May41994)或根據(jù)Reed和Muench(參見Reed，L.J.，Muench,H.Am.J.Hyg.^(1938)493-497)的那些方法。也可以使用細胞層的感染的其他指示劑，例如病毒抗原誘導或斑點誘導。本領域技術人員熟悉這些方法和它們在當前情況中的應用，例如從病毒學的教科書，例如H,W.Doerr的"MedizinischeVirologie"和W.H.Gerlich,GeorgThiemeVerlagStuttgart,NewYork,1stedition2002，或在所有的情況中，采用最新版。實施例在無菌條件下，在無菌工作臺上完成下列實施例所述的任務。必須遵守病毒實驗室中的一般規(guī)程，例如安全規(guī)程。特別是使用下列物質(zhì):.1.抗生素溶液，將1.0g的硫酸鏈霉素和1.2g的青霉素溶解于20ml的蒸餾過兩次的水中，并通過O.2jtm過濾器過濾。然后將濾液分成lml的等分不分，并任選在-20t;下貯存至使用；2.Dulbecco培養(yǎng)基，SK6細胞、SPEV細胞和MA104細胞的細胞培養(yǎng)基；3.單道吸量管，具有無菌尖端；4.FCS,來自BioWhittaker的胎牛血清(-血清)。5.組織培養(yǎng)瓶，無菌，在所有情況中瓶底的面積是25，75或175cm2;6.MEM,PK-15細胞的細胞培養(yǎng)基，具有1.5g/1碳酸氫鈉和1mM丙酮酸鹽；7.微量滴定板，無菌，具有96孔和蓋；8.PAN混懸液，10%胰酶制劑的混懸液；在無菌條件下稱出l.Og的豬胰酶制劑(除非另有說明)到燒杯中，與lml的抗生素溶液和1ml的(除非另有說明)8.Oml的特定對應的細胞培養(yǎng)基混合，(除非另有說明)攪拌下在冰浴中懸浮60分鐘；9.Pardee緩沖液，Pardee氏二氧化碳緩沖液；10.PBS，無菌的"磷酸鹽緩沖鹽水"溶液(pH7.2);11.吸量管，無菌；12.吸量管端，在滅菌盤中滅菌；13.整形外科用藥袋，密封，CO廣不可滲透("Anaerocult"，來自Merck);14.多克隆抗-PPV抗體，異硫氛酸熒光素(-FITC)綴合物，來自NatuTecGmbH;15.管，無菌，15和50ml;16.蔗糖溶液，20°/。，PBS-緩沖的，無菌；在常規(guī)的折光計的輔助下以本身已知的方式調(diào)節(jié)濃度；17.蔗糖溶液，50%,PBS-緩沖的，無菌；在常規(guī)的折光計的輔助下以本身已知的方式調(diào)節(jié)濃度；18.頂部為螺絲釘?shù)墓?，無菌；19.胰蛋白酶溶液，"TrypLExpress",來自INVITROGEN;20.振動泵，來自"ismaTec"，泵出速率高達5.8ml/分鐘；21.冷凍超速離心機，具有"TH-641"旋轉器的"SorvalPPro80";22.超速離心管，無菌，容量llml,大小9x90mm23.稀釋塊，96孑L,每孔1.0ml;24.MA-104細胞由提供FLI;25.PK-15細胞由提供DARD;26.SK-6細胞由提供FLI;27.SPEV細胞由提供FLI;28.在含有10%FCS的細胞培養(yǎng)基中，以200,000細胞/ml測定的SK6、SPEV和PK-15細胞的細胞混懸液；29.無菌Falcon微型管，容量15ml實施例l:胰酶制劑對于各種細胞系的有害效應的研究為了達到用細胞培養(yǎng)物檢測物質(zhì)的試驗樣品中的病毒的目的，應當確定所要研究的胰酶制劑樣品對于細胞的有害效應，以便能夠在評價CPE時排除假陰性結果。如下所述，由此對各種細胞系進行確定胰酶制劑試驗樣品的混懸液的有害效應的研究。采用如上制備的PAN混懸液的0.5ml來測定有害效應并將其指定為"胰酶制劑的混懸液試驗樣品"。低速離心分離在常規(guī)的冷凍離心機(具有浮桶式轉頭冷凍離心機的Megafuge1.ORHeraeusSEPATECH4)中，在4X3下，將剩余的PAN混懸液以4，000rpm(2，700xg)離心分離15分鐘。然后在下將低速離心分離后的上清液以4，000rpm再離心分離15分鐘，并將其指定為"低速離心分離后的上清液，，，用于病毒滴定和超速離心。合并低速離心分離后在所有情況下得到的兩種沉淀(總共1ml)，并重懸浮于9ml的各自適當?shù)募毎囵B(yǎng)基中，并將其指定為"沉淀"。超速離心從試驗樣品"低速離心分離后的上清液"中取5.Oml并在超速離心機中進行超速離心。為此目的，通過吸量管將0.5ml的50%蔗糖溶液引導到進行測定必需的一定數(shù)量的超速離心管中。以斜角持著超速離心管，用4.5ml的20%蔗糖溶液小心覆蓋該層，在兩種溶液之間可以辨認出一個分離層。然后再次小心地將如上所述取的5.Oml的"低速離心分離后的上清液"的層置于20%蔗糖溶液上，避免湍流和混合。然后在超速離心轉子中將超速離心管懸浮。為此目的，在所有情況下用PBS使該轉子對側的兩個超速離心管平衡，插入到相應的支架上，用所配的蓋密封。當支架插入到轉子中時，在ioic下，以40，000rpm(273，799xg)離心分離該試驗樣品。在超速離心后，在無菌工作臺上將超速離心管從支架中取出，該超速離心管在從超速離心管的底部開始測量的1.5cm的高度有標記。使用振動泵、事先已經(jīng)滅菌的管和毛細管時，以2ml/分鐘的泵出速率從超速離心管中吸出標記以上的液體，毛細管始終位于液體的上邊緣。以該方式獲得的第一部分指定為"超速離心后的上層級分"。在所有情況中，在單道吸量管的輔助下從超速離心管中移出超速離心管中剩余的"超速離心后的下層級分，，(1.5ml)。通過用單道吸量管反復吸取并移出將超速離心管底部可能剩余的任何沉淀重懸浮。對應于初始使用的包含病毒的試驗樣品體積，將"超速離心后的下層級分，，加至5.Oml，在具有各自適合的細胞培養(yǎng)基的無菌刻度管中。在進一步處理前，將這兩種所得到的部分在4C下貯存，或者在長期貯存的情況中，在-20C下貯存。18然后測定試驗樣品"胰酶制劑的混懸液試驗樣品"、"低速離心分離后的上清液"、"沉淀"(低速離心分離后)、"超速離心后的上層級分"和"超速離心后的下層級分"(在接近5.0ml后)對于各種細胞系的有害效應。為此目的，在所有情況下制備要測定的稀釋液系列。以2為因數(shù)，用各自適合的細胞培養(yǎng)基由1:5的稀釋液將要測定的所有試驗樣品進一步進行2倍稀釋。在微量滴定板中，在8行中向每個孔中加入100^1的包含PK-15、SPEV或SK6細胞的細胞混懸液，在所有情況中100pl的試驗樣品稀釋液制備成100pi新制備的細胞混懸液。當測定MA104細胞時，使用具有24小時細胞層的微量滴定板。為此目的，在所有情況中從孔中除去細胞培養(yǎng)基，并用不含血清的100的新鮮細胞培養(yǎng)基替代，以產(chǎn)生1:10，1:20，1:40，1:80，1:160等等的最終試驗樣品稀釋液。作為對照，將100pl的細胞培養(yǎng)基而非100pl的稀釋液系列引入到每個微量滴定板的8個孔中。將成對的板和含有包含4ml的Pardee緩沖液和濾紙的管置于不透氣的袋中，并用密封夾密封。然后將該板在36±ix:下培養(yǎng)高達7天。在培養(yǎng)期間，通過顯微鏡每天檢查該板的CPE的程度，即作為胰酶制劑的有害效應結果的細胞溶解和/或細胞變性和不形成細胞層。在7天后進行最終的評價。如果在最后讀數(shù)時，對照組中已經(jīng)發(fā)生了細胞變性，則重復該滴定。下表1顯示的是測定不同試驗樣品對于各種細胞系的有害效應的結果。如果低至例如l:640的最終稀釋度的試驗樣品是有害的，但是在l:1280的稀釋度下不再有害，那么在該表中該樣品顯示的結果是在">1:640，但<1:1280下的試驗樣品有害"。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>胰酶制劑樣品和可能對活細胞有害的組分中定量分離病毒載量。為此目的，以已知方式制備，每種病毒的高滴度的"刺狀病毒制品"。此處的"高滴度"特別地(作為所使用的病毒種的函數(shù))在所有情況下都是指每ml的所研究的試驗樣品的半數(shù)最大"組織培養(yǎng)感染劑量"的10的對數(shù)的(-TCIDs。/ml)至少4步的刺狀病毒制品的滴度。例如，根據(jù)I.Tischer等人，Arch.Virol.￡^(1987)39-57的方法，通過用D-(+)-葡糖胺溶液預處理用于培養(yǎng)的PK-15細胞來獲得PCV的高滴度刺狀病毒制品。a.用EMCV(菌林LC75)進行的高刺突測試將0.75mlEMCV(菌林LC75)的高滴度(7.70±0.10logTCIDs。/ml)刺狀病毒制品和0.75ml的抗生素溶液加入到PAN混懸液(向0.75g的胰酶制劑中加入4.5ml的Dulbecco培養(yǎng)基并在冰冷卻下攪拌50分鐘制備)中，將所得到的混懸液再攪拌10分鐘。取0.5ml的該混懸液用于病毒滴定，并在41下貯存直至滴定前(="EMCV上層級分1")。將剩余的混懸液在4。C下，以4,000rpm(-2,700xg)離心分離15分鐘。將離心分離后的上清液在新的離心管中在4X:下，以4，000rpm再離心15分鐘。將第二次離心分離后的上清液定量轉移到無菌管中(-"EMCV上層級分2")。用總體積6.5ml的Dulbecco培養(yǎng)基將低速離心分離的兩種沉淀重懸浮，合并并在4t:下，以4,000rpm再離心15分鐘。將所得到的上清液轉移到無菌管中。每次用6.5ml的新鮮Dulbecco培養(yǎng)基洗滌沉淀，并再重復2次。將三次洗滌的溶液合并，并用于病毒滴定(-"EMCV上層級分3")。在3次洗滌后，將沉淀重懸浮于6.5ml的Dulbecco培養(yǎng)基中，然后滴定(-"EMCV上層級分4")。將5.0ml的EMCV上層級分2在如實施例1所述的不連續(xù)的蔗糖梯度中超速離心。在超速離心后，分別獲得上層(-"EMCV上層級分5")和下層(-"EMCV上層級分6")部分并滴定。制備3倍的病毒稀釋液系列，并分別用12個稀釋步驟以12平行線的方式轉移到具有SPEV細胞混懸液的微量滴定板上。刺狀病毒-由稀釋液10—3滴定；EMCV上層級分1-由稀釋液10—2滴定；EMCV上層級分2-由稀釋液1(T滴定；EMCV上層級分4-由稀釋液10_1滴定；EMCV上層級分3-由稀釋液1(T滴定；EMCV上層級分5-由未稀釋的試驗樣品滴定；EMCV上層級分4-由稀釋液1(T一式三份地滴定。在約5。/。C02的大氣中，在36士1X:下培養(yǎng)該微量滴定板，在6-7天的過程沖，通過顯微鏡評價孔中CPE的發(fā)展。根據(jù)Spearman-Karber法評價試驗樣品的滴度。用EMCV進行的高刺突測試結果如下表2所示。表2:在胰酶制劑的混懸液中用EMCV進行的高刺突測試的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>"值是各個滴定的標準差；2)值是95%置信區(qū)間；3)值是3次測定的標準差從表2清楚地看出，當實施根據(jù)本發(fā)明的方法時，考慮到變異的一般可接受的病毒對數(shù)值范圍是0.5，在超速離心后的下層級分(EMCV上層級分6)中至少大約定量地恢復未處理的刺狀試驗樣品(BMCV上層級分1和2)的病毒載量。此外，從該試驗結果可以推斷，胰酶制劑樣品本身對于EMCV沒有抑制或滅活活性。b.用豬細小病毒進行高刺突測試可以將豬細小病毒(PPV)在生長的SK6細胞中培養(yǎng)。如果獲得的病毒太少，則在培養(yǎng)后濃縮病毒。將1.0ml的PPV的高滴度(4.75±0.06logTCID5。/ml)刺狀病毒制品加入到加入到PAN混懸液(加入7.0ml的Dulbecco培養(yǎng)基并在冰冷卻下攪拌50分鐘來制備)中，將所得到的混懸液再攪拌10分鐘。取0.5ml的該混懸液用于病毒滴定，并在4X:下貯存直至滴定前卜"PPV上層級分l")。將剩余的混懸液在4"下，以4，000rpm(=2，700xg)離心分離15分鐘。將離心分離后的上清液在新的離心管中在4TC下，以4,000rpm再離心15分鐘。將第二次離心分離后的上清液定量轉移到無菌管中(-"PPV上層級分2")。用總體積9ml的Dulbecco培養(yǎng)基將低速離心分離的兩種沉淀重懸浮，合并并在4X:下，以4,000rpm再離心15分鐘。將所得到的上清液轉移到無菌管中。每次用9ml的新鮮Dulbecco培養(yǎng)基洗滌沉淀，并再重復2次。將三次洗滌的溶液合并，并用于病毒滴定(="PPV上層級分3")。在3次洗滌后，將沉淀重懸浮于9ml的Dulbecco培養(yǎng)基中，然后滴定(="PPV上層級分4")。將5.0ml的PPV上層級分2在如實施例1所述的不連續(xù)的蔗糖梯度中超速離心。在超速離心后，分別獲得上層(-"PPV上層級分5")和下層(-"PPV上層級分6")部分并滴定。制備3倍的病毒稀釋液系列，并分別用12個稀釋步驟以12平行線的方式轉移到具有SK6細胞混懸液的微量滴定板上。在約5%C02的大氣中，在36土1X:下培養(yǎng)該微量滴定板，在6-7天的過程沖，通過顯微鏡評價孔中CPE的發(fā)展。在培養(yǎng)期后，通過加入冰冷的丙酮/曱醇混合物來固定該板，此外用FITC-標記的抗-PPV抗體來培養(yǎng)具有不確定的CPE的孔，以用于最終的滴定測定，然后在UV光顯微鏡下評價。根據(jù)Spearman-Karber法評價試驗樣品的滴度。表3:在胰酶制劑的混懸液中用PPV進行的高刺突測試的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>"值是各個滴定的標準差；2)值是95%置信區(qū)間；3)值是3次測定的標準差從表3清楚地看出，在如上所述的EMCV高刺突實驗中，如果成功地實施本發(fā)明的方法，考慮到變異的一般可接受的病毒對數(shù)值范圍是0.5,在超速離心后的下層級分(PPV上層級分6)中至少大約定量地恢復未處理的刺狀試驗樣品(PPV上層級分1和2)的病毒載量。在PPV上層級分l中，即在不溶性顆粒存在下，確定的一個病毒對數(shù)值的滴定度低于PPV上層級分2。因此，不溶性組分的存在顯然破壞了滴定。此外，從該試驗結果可以推斷，胰酶制劑樣品本身對于PPV沒有抑制或滅活活性。實施例3:加入低病毒滴度來進行胰酶制劑樣品的研究用加入逐漸降低的病毒滴度進行胰酶制劑樣品的研究(="低刺突(Low-spike)測試")的目的特別是確定在所有情況中本發(fā)明的方法對于所使用的病毒的檢測限。如果考慮到到變異的一般可接受的病毒對數(shù)值范圍是0.5，在超速離心后的下層級分中至少大約定量恢復初始加入的刺狀病毒制品的病毒滴度，那么就認為用逐漸降低的病毒滴度定量測定個體試驗樣品中的病毒載量就是成功的。a.用EMCV進行低刺突測試制備PAN混懸液(用2.5g的豬胰酶制劑，2.5ml的抗生素溶液，20ml的Dulbecco培養(yǎng)基)。然后以互相獨立的測定中，以一式兩份進行低刺突測試在第一個測定中，由PAN混懸液和EMCV刺狀病毒溶液制備下列的批次1)4.5ml的胰酶制劑的混懸液+0.5ml的10_3刺狀病毒的稀釋液；得到稀釋液10一4;2)4.5ml的胰酶制劑的混懸液+0.5ml的l(T刺狀病毒的稀釋液；得到稀釋液10—5;3)4.5ml的胰酶制劑的混懸液+0.5ml的10—5刺狀病毒的稀釋液；等等。4)4.5ml的胰酶制劑的混懸液+0.5ml的10—6刺狀病毒的稀釋液；5)4.5ml的胰酶制劑的混懸液+0.5ml的l(T刺狀病毒的稀釋液；6)4.5ml的胰酶制劑的混懸液+0.5ml的10—8刺狀病毒的稀釋液.在室溫下將所有的批次培養(yǎng)1小時，然后在4t)下以4，000rpm(2，700xg)低速離心分離15分鐘。在所有情況下，將低速離心分離后的上清液轉移到新的離心管中，然后在相同條件下進行另一次低速離心分離。如果必要，用細胞培養(yǎng)基將低速離心分離后的上清液加至體積為5.0ml,在所有情況下，將低速離心分離后的5.0ml的上清液在如上文實施例1所述的不連續(xù)的蔗糖梯度中進行超速離心。在超速離心后，在所有情況下用振動泵泵出上層級分(-"EMCV下層級分2";下至超速離心管的1.5cm)，用吸量管從超速離心管中吸出各個下層級分(-"EMCV下層級分3")。在所有情況下，用MEM將超速離心后的下層級分加至5.Oml，然后用于滴定或在組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。然后由上述的批次l)到3)分別制備3倍的病毒稀釋液系列，用SPEV細胞混懸液(每孔100的SPEV細胞的新制備的細胞混懸液，濃度為200，000細胞/ml)以12個稀釋步驟，以12平行線的方式轉移。此外，將所有批次的EMCV下層級分3的試驗樣品轉移到底面積為EMCV的細胞培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)瓶中包含10ml的濃度為200，000細胞/ml的SPEV細胞的新制備的細胞混懸液。為此目的，用0.2ml的試驗樣品EMCV下層級分3感染每個樣品的組織培養(yǎng)瓶。平行地，將不加入物質(zhì)的一個組織培養(yǎng)瓶作為對照。在36±1C下培養(yǎng)所有的滴定板和組織培養(yǎng)瓶，在6-7天的過程中，通過顯微鏡評價孔或組織培養(yǎng)瓶中的CPE發(fā)展。根據(jù)Spearman-Karber法計算滴定的試驗樣品的滴度。如果在7天后在一個批次的任意6個組織培養(yǎng)瓶中沒有觀察到CPE,那么將這些培養(yǎng)瓶在-70t:下冷凍3次，并再次融化。合并所有組織培養(yǎng)瓶的內(nèi)容物，并過濾通過0.1nm(孔徑)的過濾器。使用所得到的濾液在SPEV細胞混懸液上制備第二代用第一代得到的2ml混懸液來感染分別包含10ml新鮮SPEV細胞混懸液的2個組織培養(yǎng)瓶，然后在36±1C下培養(yǎng)最多7天，并觀察CPE的發(fā)展。如果在第二代中也未觀察到CPE，再實施第三代。如果在第三代中也發(fā)現(xiàn)了陰性結果，可以認為原試驗樣品不含試驗樣品EMCV。用EMCV的有刻度的稀釋液，在上述低刺突測定中確定所使用的每0.1g的胰酶制劑樣品的EMCV的一個感染單元的根據(jù)本發(fā)明的方法的檢測限。b.用PPV進行低刺突測試制備PAN混懸液(用2.5g的豬胰酶制劑，2.5ml的抗生素溶液，20ml的Dulbecco培養(yǎng)基)。然后以互相獨立的測定中，以一式兩份進行低刺突測試為此目的，由PAN混懸液和PPV刺狀病毒溶液制備下列的批次1)4.5ml的胰酶制劑的混懸液+0.5ml的10_1刺狀病毒的稀釋液；2)4.5ml的胰酶制劑的混懸液+0.5ml的10_2刺狀病毒的稀釋液；3)4.5ml的胰酶制劑的混懸液+0.5ml的1(T刺狀病毒的稀釋液；4)4.5ml的胰酶制劑的混懸液+0.5ml的IO"刺狀病毒的稀釋液；在室溫下將所有的批次培養(yǎng)1小時，然后在4X:下以4,000rpm(2,700xg)低速離心分離15分鐘。在所有情況下，將低速離心分離后的上清液轉移到新的離心管中，然后在相同條件下進行另一次低速離心分離。如果必要，用細胞培養(yǎng)基將低速離心分離后的上清液加至體積為5.0ml,在所有情況下，將低速離心分離后的5.0ml的上清液在如上文實施例1所述的不連續(xù)的蔗糖梯度中進行超速離心分離。在超速離心后，在所有情況下用振動泵泵出上層級分(-"PPV下層級分2";下至超速離心管的1.5cm)，用吸量管從超速離心管中吸出各個下層級分H'PPV下層級分3，，)。在所有情況下，用Dulbecco培養(yǎng)基將超速離心后的下層級分加至5.0ml，然后用于滴定或在組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。然后由上述的批次l)到3)分別制備3倍的病毒稀釋液系列，用SK-6細胞混懸液(每孔100—的SK-6細胞的新制備的細胞混懸液，濃度為200，000細胞/ml)以12個稀釋步驟，以12平行線的方式轉移。用0.2ml的PPV下層級分3感染每個批次的6個組織培養(yǎng)瓶。平行地，將不加入物質(zhì)的一個組織培養(yǎng)瓶作為對照。在36±IC下培養(yǎng)所有的滴定板和組織培養(yǎng)瓶，在6-7天的過程中，通過顯微鏡評價孔或組織培養(yǎng)瓶中的CPE發(fā)展。根據(jù)Spearman-Karber法計算滴定的試驗樣品的滴度。如果在7天后在一個批次的任意6個組織培養(yǎng)瓶中沒有觀察到CPE，那么將這些培養(yǎng)瓶在-70'C下冷凍3次，并再次融化。合并所有組織培養(yǎng)瓶的內(nèi)容物，并過濾通過O.lpm(孔徑)的過濾器。使用所得到的濾液在SK-6細胞混懸液上制備第二代用第一代得到的2ml混懸液來感染分別包含10ml新鮮SK-6細胞混懸液的2個組織培養(yǎng)瓶，然后在36±1C下培養(yǎng)最多7天，并觀察CPE的發(fā)展。如果在第二代中也未觀察到CPE，再實施第三代。如果在第三代中也沒有發(fā)現(xiàn)CPE，在7天后從第三代的瓶中移出細胞培養(yǎng)基，用水冷的丙酮/曱醇(80:20vol./vol.)固定細胞層。然后通過FITC-標記的抗-PPV抗體(每瓶具有l(wèi)ml的抗體溶液；在37t:下培養(yǎng)60分鐘，用洗滌緩沖液洗滌，隨后在UV光下通過顯微鏡評價)檢測組織培養(yǎng)瓶中受感染的細胞。如果第三代的瓶中不含受感染的細胞，可以認為原試驗樣品不含PPV。用PPV的有刻度的稀釋液，在上述低刺突測定中確定所使用的每0.1g的胰酶制劑樣品的PPV的一個感染單元的根據(jù)本發(fā)明的方法的檢測限。權利要求1.一種從胰酶制劑樣品中分離病毒載量的方法，包括下列步驟a)制備適合從胰酶制劑樣品中離心分離的液體胰酶制劑試驗樣品，這樣做的話不會改變其病毒載量，b)在一定條件下將步驟a)的胰酶制劑試驗樣品的至少一個限定部分進行至少一次低速離心分離，在該條件下沉降常數(shù)≥120S的病毒不會形成沉淀，c)棄去任選在步驟b)的低速離心分離期間出現(xiàn)的任何固體沉淀，保留胰酶制劑試驗樣品的上清液，d)將在步驟c)中獲得的胰酶制劑試驗樣品的上清液的至少一個限定部分在不連續(xù)梯度的介質(zhì)中超速離心，其中選擇超速離心的持續(xù)時間和超速離心的相對離心力，以便將病毒載量從胰酶制劑試驗樣品的上清液定量轉運到位于上方的靶級分中或上層最低濃度梯度組分和下層次高濃度梯度組分之間的分界層中，和e)從胰酶制劑試驗樣品的上清液中定量分離包含所述病毒載量的靶級分。2.如權利要求1所要求保護的方法，其中還在步驟e)后的步驟f)中，通過測定包含病毒載量的靶級分中的病毒感染滴度來進行胰酶制劑樣品的病毒載量的定量測定。3.如權利要求2所要求保護的方法，其中在進行病毒載量的定量測定前將稀釋或未稀釋的靶級分通過微過濾器過濾。4.如權利要求1所要求保護的方法，其中在步驟a)中通過將胰酶制劑樣品與適合用于培養(yǎng)待研究的病毒類型的細胞系的細胞培養(yǎng)基和一種或多種抗生素組合將該胰酶制劑試驗樣品制備成胰酶制劑試驗樣品的混懸液。5.如權利要求4所要求保護的方法，其中將溫度冷卻至0-15X:以進行胰酶制劑試驗樣品的混懸液的制備。6.如權利要求1所要求保護的方法，其中在所有情況中，以小于的相對離心力來進行步驟b)的低速離心分離。7.如權利要求1所要求保護的方法，其中在所有情況中，以1，500-5,000xg的相對離心力來進行步驟b)的低速離心分離。8.如權利要求1所要求保護的方法，其中進行步驟b)的低速離心分離的持續(xù)時間是至少5分鐘。9.如權利要求1所要求保護的方法，其中進行步驟d)的超速離心，其持續(xù)時間是至少l小時，相對離心力是至少100,000xg。10.如權利要求9所要求保護的方法，其中進行步驟d)的超速離心，其持續(xù)時間是2-8小時，相對離心力是200，000-350，000xg,11.如權利要求1所要求保護的方法，其中在所有情況中，將溫度冷卻至0-15。C以進行步驟b)的低速離心分離和步驟d)的超速離心。12.如權利要求1所要求保護的方法，其中在步驟d)中引入的不連續(xù)梯度的介質(zhì)是不連續(xù)的雙相蔗糖梯度。13.如權利要求12所要求保護的方法，其中不連續(xù)梯度的介質(zhì)是由50%(wt./vol.)緩沖蔗糖溶液和20%(wt./vol.)緩沖蔗糖溶液制備的梯度。14.如權利要求1所要求保護的方法，其中胰酶制劑樣品是豬的胰酶制劑樣品。15.如權利要求1所要求保護的方法，其中胰酶制劑試驗樣品的病毒載量包含牛輪狀病毒A、腦炎心肌炎病毒、豬環(huán)病毒、豬細小病毒、豬輪狀病毒A、豬輪狀病毒和/或豬水泡病病毒。16.—種胰酶制劑試驗樣品的混懸液，通過權利要求4的方法的步驟a)可得到的，其中通過將胰酶制劑樣品與適合用于培養(yǎng)待研究的病毒類型的細胞系的細胞培養(yǎng)基和一種或多種抗生素組合將該胰酶制劑試驗樣品制備成胰酶制劑試驗樣品的混懸液。17.—種胰酶制劑試驗樣品的上清液，通過權利要求l的方法的步驟a)-c)可得到的，其中在步驟a)中通過將胰酶制劑樣品與適合用于培養(yǎng)待研究的病毒類型的細胞系的細胞培養(yǎng)基和一種或多種抗生素組合將該胰酶制劑試驗樣品制備成胰酶制劑試驗樣品的混懸液。18.分離的靶級分，通過權利要求1的方法可以獲得。19.如權利要求18所要求保護的分離的靶級分，其中在權利要求1的步驟a)中通過將胰酶制劑樣品與適合用于培養(yǎng)待研究的病毒類型的細胞系的細胞培養(yǎng)基和一種或多種抗生素組合將該胰酶制劑試驗樣品制備成胰酶制劑試驗樣品的混懸液。全文摘要本發(fā)明描述了從胰酶制劑樣品中分離病毒載量和定量測定胰酶制劑樣品中病毒載量的方法。文檔編號C12N9/94GK101448935SQ200780018677公開日2009年6月3日申請日期2007年5月21日優(yōu)先權日2006年5月22日發(fā)明者D·貝歇爾,F·布塞,L·德納,M·弗林克申請人:索爾瓦藥物有限公司