專利名稱：利用金屬結(jié)合蛋白制備金屬納米顆粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用重金屬結(jié)合蛋白制備來(lái)制備重金屬納米顆粒的方法， 特別涉及一種制備重金屬結(jié)構(gòu)的方法，該方法包括在含重金屬離子的培養(yǎng)基中 對(duì)轉(zhuǎn)化有重金屬結(jié)合蛋白編碼基因的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，從而在微生物中產(chǎn)生重 金屬結(jié)構(gòu)，并收集所產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu)以及通過(guò)所述方法所產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu) 的納米顆粒。
背景技術(shù)：
量子點(diǎn)是納米級(jí)的半導(dǎo)體顆粒，當(dāng)它們被諸如光線等能量所激發(fā)時(shí)會(huì)發(fā)光， 并且所發(fā)出光的顏色取決于顆粒的尺寸。也就是說(shuō)，如果顆粒尺寸減小從而減 小了顆粒維數(shù)時(shí)，電子云密度及其能量發(fā)生改變，由此該顆粒的特征會(huì)基于其 維數(shù)而發(fā)生改變。例如，在二維系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)量子霍爾效應(yīng)，但該效應(yīng)并不出現(xiàn) 在三維系統(tǒng)中。在本文中，術(shù)語(yǔ)"減小的維數(shù)"嚴(yán)格意義上意指電子被束縛在 比德布羅意波長(zhǎng)還小的區(qū)域中。零尺寸的量子點(diǎn)不是沒(méi)有面積的點(diǎn)，而是指具 有小于德布羅意波長(zhǎng)的三維尺寸。在量子力學(xué)中，所有具備動(dòng)量的物質(zhì)顆粒的 波即德布羅意波長(zhǎng)會(huì)基于物質(zhì)的不同而有所不同，并且對(duì)半導(dǎo)體材料而言大約
為IO腿。
如圖1所示，量子點(diǎn)總體上是由核和殼所構(gòu)成的球形，除圖1所示的Zn、 S及Cd之外還包括其它各種重金屬。
量子點(diǎn)的制備方法大體上能夠分為兩種利用諸如激光等光源的平版法； 以及化學(xué)合成法。通過(guò)化學(xué)方法合成量子點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)在它能夠利用比平版相對(duì)簡(jiǎn) 單的系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)量子點(diǎn)，但是該方法仍有許多技術(shù)問(wèn)題有待解決以便以高成本 效益方式生產(chǎn)大量的量子點(diǎn)。同樣地，與利用現(xiàn)有的批量方法所制備的量子點(diǎn) 相比，利用分子化學(xué)技術(shù)所制備的量子點(diǎn)具有優(yōu)良的光學(xué)穩(wěn)定性，并且它們的光學(xué)特性能夠被控制從而基于納米材料的尺寸大小、形狀及成分發(fā)出各種不同 波長(zhǎng)的光線。有鑒于此，把基于量子點(diǎn)的納米材料應(yīng)用于生物領(lǐng)域成為可能。 這表明基于量子點(diǎn)的納米材料不僅能夠廣泛地用于生物傳感器還能夠用于體
外光學(xué)成像的造影劑，這些可能性近來(lái)已經(jīng)為多項(xiàng)研究所證實(shí)(Jovin, Nat.Biotechnol" 21:32, 2003; Wu " a/" Nat.Biotechnol" 21:41, 2003; Alivisatos, Nat.Biotechno22: 47， 2004; Gao " a/" Nat.Biotechno.,22:969,2004; Lidke W a/.Nat.Biotechno1, 22:198,2004)。
作為該可能性的典型例子，開(kāi)發(fā)了一種能夠體外示蹤活細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的技 術(shù)，該技術(shù)的一個(gè)例子是HER2/neu途徑的方法。這克服了已有有機(jī)熒光團(tuán)的 缺陷，因?yàn)闊晒鈭F(tuán)容易失去其光學(xué)活性從而無(wú)法對(duì)連續(xù)的細(xì)胞變化進(jìn)行示蹤 (Wu et al" Nat. Biotechnol"21:41,2003; Lidke et al.， Nat. Biotechnol"22:198,2004)。 同樣地，為了對(duì)活細(xì)胞體內(nèi)由erbB/HER受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行示蹤，給上 皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)結(jié)合上量子點(diǎn)并通過(guò)把它結(jié)合到上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受 體上(EGFR)從而使其激活。然后對(duì)量子點(diǎn)耦合的EGFR耦合物結(jié)合入細(xì)胞 的過(guò)程得到了示蹤(Lidke e"/" Nat. Biotechnol.， 22:198, 2004)。該方法使得對(duì) 活細(xì)胞內(nèi)的生物過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)成為可能。
進(jìn)一步地，為了克服體內(nèi)穿透性不足這一缺陷，開(kāi)發(fā)了能夠利用近紅外范 圍內(nèi)波長(zhǎng)的半導(dǎo)體納米晶體，從而使體內(nèi)圖像收集成為可能(Gao W "/.， Nat. Biotechnol., 22:969,2004)。在該方法中，為了有效地使量子點(diǎn)溶解并且同時(shí)有 效地把量子點(diǎn)傳遞到體內(nèi)，給量子點(diǎn)(ZnS-包覆CdSe)包被了多嵌段共聚物， 并把單克隆抗體結(jié)合到包被共聚物的反應(yīng)基團(tuán)上。
此外，為了克服光學(xué)成像體內(nèi)穿透性低這一缺陷，具有近紅外波長(zhǎng)的量子 點(diǎn)被用于對(duì)大鼠腋窩下的前哨淋巴結(jié)進(jìn)行光學(xué)成像(Kim et al., Nat. Biotechnol.， 22:93,2004)。該納米材料表現(xiàn)出不同于通過(guò)已有方法獲得量子點(diǎn)所 表現(xiàn)出的物理性質(zhì)，并且由此具備應(yīng)用于核磁共振成像的前景。
同時(shí)，處理環(huán)境中重金屬的方法大體上包括化學(xué)，物理和生物處理方法。 生物處理方法利用了微生物自身的生物機(jī)制以及由微生物所引起的機(jī)制，包括 生物吸附和生物聚集、氧化和還原、金屬有機(jī)復(fù)合物和不溶性復(fù)合物的形成，
6為恢復(fù)被重金屬污染的環(huán)境奠定了重要技術(shù)基礎(chǔ)(Vails and de Lorenzo, FEMS Microbiol. Rev., 26:327, 2002)。此外，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近期在開(kāi)發(fā)具 備改善的結(jié)合重金屬的性質(zhì)方面的嘗試表明對(duì)現(xiàn)有生物處理方法進(jìn)行改善是 可能的。微生物合成重金屬結(jié)合蛋白以通過(guò)生物聚集來(lái)去除體內(nèi)外的重金屬， 并且這些蛋白質(zhì)涉及到胞外金屬離子的儲(chǔ)存或濃度的調(diào)節(jié)。
近來(lái)，發(fā)現(xiàn)名為植物螯合肽的肽可以通過(guò)把真菌和植物暴露在重金屬中的 方法來(lái)產(chǎn)生，所述肽天然就能結(jié)合諸如鉛、汞及鎘等有害元素從而除去這些元 素。植物螯合肽具有(y-Glu-Cys) n-Gly(n^2-7)結(jié)構(gòu)并通過(guò)形成肽-金屬的結(jié)合 來(lái)聚集金屬離子(Cobbett, Curr.Opin. Plant Biol.3:211,2000)。此外，作為其它 種類的重金屬結(jié)合蛋白，名為金屬硫蛋白的低分子量蛋白質(zhì)已經(jīng)得到了很多研 究，并且這些蛋白質(zhì)具有豐富的半胱氨酸并能結(jié)合鎘、鋅、鎳、銅等等(Hamer, Annu. Rev. Biochem.， 55:913， 1986; Wu and Lin， Biosens. Bioelectron., 20:864,2004)。
同時(shí)，涉及量子點(diǎn)制備的專利文獻(xiàn)包括韓國(guó)專利號(hào)10-0540801,名為"(利 用金屬粉末帝廿備量子點(diǎn)的方法)Method of preparing quantum dots using metal powder";韓國(guó)專利號(hào)10-0526828,名為"(通過(guò)激光照射磁性膜或半導(dǎo)體膜制 備均勻分布量子點(diǎn)的方法)Method of preparing quantum dots having uniform distribution by irradiating magnetic membrane or semiconductor membrane with laser";韓國(guó)專利10-0541516，名為"(半導(dǎo)體材料量子點(diǎn)的形成方法)method for forming quantum dots of semiconductor material";以及卓爭(zhēng)國(guó)專禾U 10-0279739, 名為"(納米尺寸硅量子點(diǎn)的形成方法)Method for forming nanometer-size silicon dots"。然而，這些方法都是通過(guò)金屬材料的物理結(jié)合來(lái)制備量子點(diǎn)的方 法。
本發(fā)明人己經(jīng)注意到量子點(diǎn)成分通過(guò)鎘(Cd)、硒(Se)、鋅(Zn)以及碲 (Te)的常規(guī)組合來(lái)合成，在此利用生物工程方法對(duì)重金屬結(jié)合蛋白進(jìn)行了表 達(dá)。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)經(jīng)濟(jì)地合成量子點(diǎn)是可能的，并且也利用了上 述生物系統(tǒng)來(lái)制備光學(xué)性能穩(wěn)定的量子點(diǎn)，由此完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的目的在于提供一種具有生產(chǎn)重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 以及制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，該方法包括在含培養(yǎng)基的重金屬環(huán)境中 培養(yǎng)重組微生物。
本發(fā)明的另一目的在于提供改善納米顆粒的方法，該方法包括把該納米顆 粒結(jié)合至選自下列物質(zhì)中的至少一種化學(xué)物質(zhì)、配基、金屬、DNAs以及蛋白質(zhì)。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，該方
法包括步驟在含重金屬離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，該微生物轉(zhuǎn)化有一個(gè)編 碼一個(gè)或多個(gè)重金屬結(jié)合蛋白的基因，從而在微生物中產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)；以及
收集所產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明也提供了重金屬結(jié)構(gòu)的納米顆粒，其通過(guò)所述的方法制得，直徑
5-120nm，且呈球形。
本發(fā)明也提供了具有生產(chǎn)重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，該微生物中轉(zhuǎn)化 有含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一部分的表達(dá)載體。
本發(fā)明也提供了一種改善納米顆粒的方法，該方法包括把納米顆粒結(jié)合到 選自下列物質(zhì)中的至少一種化學(xué)材料、配基、金屬、DNAs以及蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也提供了改善納米顆粒的方法，該方法包括把蛋白質(zhì)結(jié)合到納米顆 粒上，并用可識(shí)別標(biāo)記在該結(jié)合蛋白上的材料的蛋白質(zhì)、結(jié)合目標(biāo)蛋白的經(jīng)標(biāo) 記配基或者特異性結(jié)合至目標(biāo)蛋白的抗體來(lái)處理該結(jié)合蛋白。
本發(fā)明也提供了改善納米顆粒的方法，該方法包括步驟(a)用生物素包 被納米顆粒的表面；(b)把鏈霉親和素包被在包被了生物素的表面上；(c)用
至少一種選擇下列組中的化學(xué)殘基氨基、醛基和羧基對(duì)上述鏈霉親和素包被 的表面進(jìn)行修飾；并且(d)用金或銀包被該經(jīng)修飾的表面。
本發(fā)明的其它特點(diǎn)和實(shí)施方式將在下面的"具體實(shí)施方式
"以及所附"權(quán)利
要求"中作更清楚地闡述。


圖1顯示了量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。
8圖2為本發(fā)明所述pTJl-AtPCS表達(dá)載體的基因譜圖。
圖3為本發(fā)明所述pTJl-PpMT表達(dá)載體的基因譜圖。
圖4表示在含重金屬諸如鎘、鋅及硒離子的培養(yǎng)基中表達(dá)植物螯合肽合成 酶的五.co"的熒光掃描圖。
圖5表示聚集在表達(dá)植物螯合肽合成酶的細(xì)胞內(nèi)重金屬結(jié)構(gòu)的激光 共聚焦掃描顯微圖。在圖5中，"a": ￡. //細(xì)胞顯示出與42011111發(fā)射光譜相對(duì) 應(yīng)的藍(lán)色熒光；"b，，: Eco/Z細(xì)胞顯示出700nm發(fā)色光譜的黃色熒光;"c，，:實(shí) 時(shí)圖像；以及"d": "a"和"b"的結(jié)合圖。同樣地，圖中所有的刻度條都表示5^m。
圖6表示在本發(fā)明所述表達(dá)植物螯合肽合成酶的E.coli中聚集的重金屬結(jié) 構(gòu)的電子顯微(TEM)圖。在圖6中，"a":不表達(dá)植物螯合肽合成酶的控制
組；b-d:在本發(fā)明所述表達(dá)植物螯合肽合成酶的￡.^//中聚集的不同放大倍數(shù)
的重金屬結(jié)構(gòu)TEM圖。
圖7表示根據(jù)本發(fā)明所述，當(dāng)表達(dá)植物螯合肽合成酶的五xo/Z在含鎘(Cd)、 鋅(Zn)及銫(Cs)離子的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，聚集在細(xì)胞中的重金屬結(jié)構(gòu) 的能譜X射線圖(EDS)和TEM分析結(jié)果。
圖8表示根據(jù)本發(fā)明所述的，當(dāng)表達(dá)植物螯合肽合成酶的￡.co//在含鎘 (Cd)、鋅(Zn)及硒(Se)離子的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，聚集在細(xì)胞中的重 金屬結(jié)構(gòu)的能譜EDS和TEM分析結(jié)果。
圖9表示根據(jù)本發(fā)明所述地，當(dāng)表達(dá)植物螯合肽合成酶的E.coli在含鎘 (Cd)、鋅(Zn)及碲(Te)離子的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，聚集在細(xì)胞中的重 金屬結(jié)構(gòu)的能譜EDS和TEM分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，為了把重金屬結(jié)合蛋白基因引入五."http://并在其中表達(dá)，然后 依賴于由￡.^//細(xì)胞中的金屬結(jié)合蛋白的表達(dá)所產(chǎn)生的重金屬吸附和聚集來(lái)合 成量子點(diǎn)，構(gòu)建了可單獨(dú)表達(dá)或組合表達(dá)植物螯合肽合成酶及金屬硫蛋白的編 碼基因的質(zhì)粒，所述編碼基因編碼重金屬結(jié)合蛋白。然后，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化五.co// 并進(jìn)行培養(yǎng)以在細(xì)胞中產(chǎn)生重金屬結(jié)合蛋白，該細(xì)胞隨后在含各種重金屬離子 的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并通過(guò)質(zhì)量分析和熒光分析檢測(cè)在細(xì)胞中所合成的重金屬結(jié)構(gòu)是否是量子點(diǎn)。
一方面，本發(fā)明涉及制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，該方法包括步驟在 含重金屬離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，該微生物轉(zhuǎn)化有重金屬結(jié)合蛋白編碼基 因，從而在微生物中產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)；以及收集所產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu)，通過(guò)所
述方法所獲得的重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的直徑為5-120nm并呈球形。
在本發(fā)明中，該重金屬結(jié)構(gòu)優(yōu)選納米顆粒，并且該納米顆粒優(yōu)選是量子點(diǎn)。 在本發(fā)明中，該重金屬結(jié)合蛋白能夠選自下列組中智人(//omo^; /e朋入
擬南芥64raZ)/(iop57.s ^"http://"""入觀賞煙草(^97-wa附ewto/ 小家鼠^Mws
mMsra/M y> 、酉良？酉酵母 f Sacc/zflrcw_yces cerev/w'fle J 、 粟酒裂歹直酵母 6S"c/n.zo加cc/^ra附7CM/ o附6e入 惡臭假單胞菌r7^ewfifo附ow似/^,/t/fl J及大腸
桿菌(&c/^r/c/2/aco/Z義但本發(fā)明并不僅限于此。
在本發(fā)明中，植物螯合肽合成酶以及金屬硫蛋白被解釋為重金屬結(jié)合蛋白，
但本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到其它具備等同或類似于所述蛋白性質(zhì)的蛋白或肽
也可以用于本發(fā)明中。
在另一方面，本發(fā)明涉及具備生產(chǎn)重金屬結(jié)構(gòu)能力的微生物，該微生物轉(zhuǎn) 化有含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一部分的表達(dá)載體。
在本發(fā)明中，重金屬結(jié)合蛋白優(yōu)選植物螯合肽合成酶或金屬硫蛋白，并且 所述植物螯合肽合成酶編碼基因的一部分優(yōu)選具有序列號(hào)5的堿基序列。
本發(fā)明所述方法包括對(duì)轉(zhuǎn)化有重組載體的五.co//進(jìn)行培養(yǎng)的步驟以便在 五.co//細(xì)胞中表達(dá)重金屬結(jié)合蛋白，該Eco//可單獨(dú)或組合表達(dá)擬南芥來(lái)源的 植物螯合肽合成酶以及惡臭假單胞菌來(lái)源的金屬硫蛋白。在本發(fā)明中，重金屬 結(jié)合蛋白優(yōu)選融合于所述蛋白的C末端或者N末端。
用于本發(fā)明的重金屬的特定實(shí)施例包括鎘(Cd)、鋅(Zn)、硒(Se)、碲 (Te)、銫(Cs)、銅(Cu)、氯(Cl)、鉛(Pb)、鎳(Ni)、錳(Mn)、滎(Hg)、 鈷(Co)及鉻(Cr)。
重組質(zhì)粒pTJl-AtPCS，其被用于本發(fā)明來(lái)轉(zhuǎn)化￡.co//從而表達(dá)植物螯合肽 合成酶，包括植物螯合肽合成酶編碼基因、青霉素抗性基因以及用于誘導(dǎo)表達(dá) 的trc啟動(dòng)子。為了在Exoli中表達(dá)植物螯合肽合成酶，植物螯合肽合成酶蛋
10白編碼基因通過(guò)合成兩個(gè)來(lái)自與擬南芥染色體DNA互補(bǔ)的堿基序列(cDNA) 的引物并利用該引物進(jìn)行PCR而得以構(gòu)建。同樣地，利用GenBank中所儲(chǔ)存 的堿基序列通過(guò)PCR法從惡臭假單胞菌的染色體DNA中獲取金屬硫蛋白的重 金屬結(jié)合基因，并把該基因進(jìn)行部分重疊PCR，從而獲得植物螯合肽合成酶與 金屬硫蛋白的融合基因。氨芐青霉素抗性基因則能夠用于菌株的篩選。
從菌株中獲得的植物螯合肽合成酶和金屬硫蛋白可以單獨(dú)或組合表達(dá)，含 有表達(dá)于其中的蛋白的細(xì)胞置于含重金屬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并對(duì)各個(gè)生長(zhǎng)階段 以及各種重金屬濃度下進(jìn)行觀察。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)重金屬被吸收并聚集在細(xì)胞中形 成了具有規(guī)則排列的量子點(diǎn)。體內(nèi)量子點(diǎn)經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的細(xì)胞破碎工序并通過(guò)具有 幾百納米孔尺寸的膜濾除破碎的細(xì)胞，由此容易地收集到量子點(diǎn)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到不僅上述重金屬結(jié)合蛋白而且包括蛋白、DNAs、 媒介物以及代謝物在內(nèi)的所有重金屬所能結(jié)合的胞內(nèi)成分都能夠被應(yīng)用于本 發(fā)明，而并不僅限于本發(fā)明的實(shí)施例。從較高等的生物體到微生物中都發(fā)現(xiàn)有 重金屬結(jié)合蛋白，該重金屬結(jié)合蛋白首次發(fā)現(xiàn)于馬的腎臟細(xì)胞中(Margoshe and Vallee,J.Am.Chem.Soc.,79:4813,1957)。目前己知在現(xiàn)有知識(shí)中典型的種包括智 人(//o膨e似入擬南芥 64ra6油戸S Afl//""aJ、 觀賞煙草 fO"纖ewto/ fo6occo人 小家鼠 ^Mws mwscM/us人酉良酒酵母 (TSacc/zaromyces cerev/sz'ae人 粟酒裂殖酵母"cA/^wa"A"廠頻戸s / 譜6e入 惡臭假單胞菌仍e油腳""s /n/f/JaJ及大腸桿菌(&c/2er/c/z/a co/Z人因此，本領(lǐng)技術(shù)人員容易想到各種金 屬結(jié)合區(qū)域都能夠用于本發(fā)明中。
在本發(fā)明中，微生物優(yōu)選從格蘭氏陽(yáng)性菌、格蘭氏陰性菌、放線菌、酵母 菌及真菌中選擇。在本發(fā)明中，重組微生物優(yōu)選Eco//。
在本發(fā)明中，微生物優(yōu)選經(jīng)過(guò)如此修飾其不產(chǎn)生使所表達(dá)蛋白發(fā)生降解 的胞內(nèi)和胞外蛋白酶，從而有利于重金屬結(jié)合蛋白的胞外表達(dá)。
在本發(fā)明中，含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一部分的表達(dá)載體在該重金 屬結(jié)合蛋白的部分氨基酸序列中有缺失或位點(diǎn)特異性突變，從而該重金屬結(jié)合 蛋白有利于重金屬結(jié)合。
在本發(fā)明中，該含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其片段表達(dá)載體優(yōu)選具有圖
112所示酶切圖譜的pTJl-AtPCS。同樣地，該含有重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其 一部分的表達(dá)載體優(yōu)選具有圖3所示酶切圖譜的pTJl-PpMT。
根據(jù)本發(fā)明的重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒容易結(jié)合到各種化學(xué)材料或生物材料 上，并由此能夠用于各種目的的改造。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及改善納 米顆粒的方法，其包括把該納米顆粒結(jié)合到選自化學(xué)材料、配基、金屬、DNAs 及蛋白中的至少一種。
在一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒能夠通過(guò)如下方法得以改善把 蛋白質(zhì)結(jié)合到該納米顆粒上并用具有識(shí)別標(biāo)記在該結(jié)合蛋白上的物質(zhì)的蛋白 質(zhì)、結(jié)合在該目標(biāo)蛋白上的標(biāo)記配體或者特異性結(jié)合該目標(biāo)蛋白的抗體來(lái)處理 該結(jié)合蛋白。
在另一實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒能夠通過(guò)包括如下步驟的方法進(jìn)
行改善(a)用生物素包被納米顆粒的表面；(b)把鏈霉親和素包被在包被了 生物素的表面上；(C)用至少一種選擇下列組中的化學(xué)殘基氨基、醛基和羧 基對(duì)上述鏈霉親和素包被的表面進(jìn)行修飾；并且(d)用金或銀包被該經(jīng)修飾
的表面。
實(shí)施例
下文參考實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想 到提供這些實(shí)施例是為了對(duì)本發(fā)明作更充分的描述，本發(fā)明的范圍并不僅限于 此。
實(shí)施例l:重金屬結(jié)合蛋白表達(dá)載體的制備
(1)植物螯合肽合成酶表達(dá)載體的制備
為了獲得合成植物螯合肽合成酶的AtPCS基因(NCBI登錄號(hào)AF461180)， 利用由堿基序列號(hào)5的序列(擬南芥植物螯合肽合成酶)所代表的擬南芥互 補(bǔ)DNA (cDNA)作為模板并利用序列號(hào)1與序列號(hào)2的引物進(jìn)行PCR。 該P(yáng)CR反應(yīng)以下列條件進(jìn)行在94'C下預(yù)變性7min;在94 。C下變性lmin， 循環(huán)30次；在55'C下退火lmin;在72°C下延伸1 min;然后最終在72。C下延 伸7min。
序列號(hào)h 5' -GGAATTCATGGCTATGGCGAGTTTAT-3'序列號(hào)2: 5' -CCCAAGCTTATTAATAGGCAGGAGCAGCGAG-3'
利用瓊脂糖凝膠電泳法分離由PCR反應(yīng)所獲得的1.5-kb DNA片段，并用 2種限制性酶￡"7 /和///"必//酶切。同時(shí)，用兩種限制性酶五coi /和歷m//// 對(duì)具有強(qiáng)誘導(dǎo)tac啟動(dòng)子的pTac99A質(zhì)粒進(jìn)行酶切(Park and Lee， J.Bacteriol.,185:5391，2003)。然后，該質(zhì)粒通過(guò)T4 DNA連接酶組裝并連接到 DNA片段上，并且該連接的質(zhì)粒通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化入E.coliDH5a。該轉(zhuǎn)化菌株 在含抗生素氨芐青霉素(100ug/L)的LB平板培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，由此獲得 pTJl-AtPCS重組質(zhì)粒(圖2)。在所制備的重組質(zhì)粒pTJl-AtPCS中，被用作重 金屬結(jié)合蛋白的AtPCS基因可通過(guò)強(qiáng)誘導(dǎo)tac啟動(dòng)子而得以表達(dá)。 (2)金屬硫蛋白表達(dá)載體的制備 為了獲得合成金屬硫蛋白的PpMT基因(NCBI登錄號(hào)NC一002947 REGION:3696753..3696977 )，利用由堿基序列序列號(hào)6 (惡臭假單胞菌 KT2440金屬硫蛋白)的序列所代表的惡臭假單胞菌KT2440基因組DNA作 為模板并以序列號(hào)3與序列號(hào)4的引物進(jìn)行PCR。該P(yáng)CR反應(yīng)以下列條件 進(jìn)行在94"C下預(yù)變性7min;在94 °C下變性lmin，循環(huán)30次；在55卩下退 火lmin;在72'C下延伸1 min;然后最終在72。C下延伸7min。 序列號(hào)3: 5'-GGAATTCATGAACGATCAACGCTGCGC-3' 序列號(hào)4: 5'-AACTGCAGTTAGGGCGAGATCGGATCACT-3' 利用瓊脂糖凝膠電泳法分離由PCR反應(yīng)所獲得的230bp DNA片段，并用 2種限制性酶&oi /和尸M酶切。同時(shí)，用兩種限制性酶&oi I和尸Wl對(duì)具有 強(qiáng)誘導(dǎo)tac啟動(dòng)子的pTac99A質(zhì)粒進(jìn)行酶切。然后，該質(zhì)粒通過(guò)T4DNA連接 酶組裝并連接到DNA片段上，并且該連接的質(zhì)粒通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化入 DH5a。該轉(zhuǎn)化菌株在含抗生素氨芐青霉素(100ug/L)的LB平板培養(yǎng)基中進(jìn) 行篩選，由此獲得pTJl-PpMT重組質(zhì)粒(圖3)。在所制備的重組質(zhì)粒pTJl-PpMT中，被用作重金屬結(jié)合蛋白的PpMT基因可通過(guò)強(qiáng)誘導(dǎo)tac啟動(dòng)子而得 以表達(dá)。
作為用于表達(dá)重組蛋白宿主細(xì)胞，諸如E.coli和Bacillus subtillis等能夠在 短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行高濃度培養(yǎng)、容易進(jìn)行基因改造并具備良好生理特性的原核細(xì)胞
13已經(jīng)被廣泛地使用。然而，為了解決包括轉(zhuǎn)錄后修飾、分泌、三維活性結(jié)構(gòu)以 及蛋白質(zhì)激活等各種問(wèn)題，包括單細(xì)胞真核細(xì)胞、酵母菌(尸/W/" /^Wor&、 Sflcc/wrawyces cerev,w'ae、 //awe朋/fl/ 0/，0/7 /2a等等)、絲狀真菌、昆蟲(chóng)纟田胞、 植物細(xì)胞、以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞在內(nèi)的從微生物到高等生物體各種生物體近來(lái)都 被用作生產(chǎn)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。因此，不僅可以利用實(shí)施例中所述的￡.^//細(xì) 胞而且也可以利用其它宿主細(xì)胞，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。 實(shí)施例2:表達(dá)重組質(zhì)粒pTJl-AtPCS的E.coli的熒光分析 通過(guò)培養(yǎng)具有強(qiáng)誘導(dǎo)tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pTJl-AtPCSd的E.coli DH5a制備了植物螯合肽合成酶?；谠撃康?，該轉(zhuǎn)化的E.coli被接種于含 100mLLB液體培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，其中所述液體培養(yǎng)基中含有重金屬離 子(5mMCdCl2.2.5H20、 ZnCl2、 Se02、 TeCI^CsCl2)并且在37。C下培養(yǎng)。 該pTJl-AtPCS重組質(zhì)粒具有tac啟動(dòng)子，并且加入IPTG來(lái)誘導(dǎo)基因表達(dá)。為 此，用分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)下對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)其光密度達(dá)到0.6時(shí)， 加入ImM IPTG以誘導(dǎo)基因表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)后，該培養(yǎng)基在4。C下以 6000rpm離心5min。然后，棄上清，用10mLPBS緩沖液(pH7.4)洗滌沉淀 一次，在4。C下以6000rpm再次離心5min，然后懸浮于10mL PBS緩沖液中。 把100uL懸浮液樣品加到96孔板的各孔中并利用熒光光度計(jì)(Molecular Devices, USA)在360-700nm的發(fā)射光譜下進(jìn)行分析(圖4)。如圖4所示， 可以看到在320nm UV激發(fā)光下出現(xiàn)強(qiáng)烈的發(fā)射光譜峰值約為420nm的熒光信 號(hào)。這顯示了具有特征性熒光信號(hào)的由量子點(diǎn)產(chǎn)生的材料進(jìn)入到了 Exoli菌株 中。
同樣地，用蒸餾水洗滌該表達(dá)植物螯合肽合成酶的E.coli菌株，并固定于 聚L-賴氨酸包被的玻片上并用蓋玻片覆蓋。隨后，利用激光共聚焦掃描顯微鏡 (LSM510， CarlZeiss， Germany)對(duì)聚集在細(xì)胞內(nèi)的重金屬熒光圖像進(jìn)行分 析(圖5)。結(jié)果，如圖5所示，可以在五.co/Z細(xì)胞中觀察到圖4中對(duì)應(yīng)于約 420nm發(fā)射波長(zhǎng)的藍(lán)色熒光(a)以及發(fā)射波長(zhǎng)約為700nm的黃色熒光(b)。 因此，諸如量子點(diǎn)等納米顆粒的特征性熒光也可在本發(fā)明的胞外重金屬結(jié)構(gòu)中 觀察到。圖5中，(c)為實(shí)時(shí)圖，(d)表示圖(a)和(b)的合并圖。同樣地，
14圖中所有刻度條都代表5iim。
實(shí)施例3:在表達(dá)重組質(zhì)粒pTJl-AtPCS的E.coli所合成的體內(nèi)重金屬的 特征
為了確證通過(guò)IPTG所表達(dá)的植物螯合肽合成酶是否能在轉(zhuǎn)化有帶誘導(dǎo)tac 啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pTJl-AtPCS的E.coli DH5a中產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)，用蒸餾水洗 滌實(shí)施例2中的E.coli并在冷凍干燥器中于真空狀態(tài)下干燥一天，并用TEM (TehnaiG2， FEI， the Netherlands)對(duì)聚集在細(xì)胞中的重金屬進(jìn)行分析。結(jié)果， 發(fā)現(xiàn)重金屬結(jié)構(gòu)的大小和形狀是一致的(圖6)。此外可以觀察到，不出現(xiàn)在未 表達(dá)植物螯合肽合成酶的控制組(a)中的重金屬結(jié)構(gòu)在表達(dá)植物螯合肽合成 酶的Eco/Z中(b)出現(xiàn)了 (圖6b、 6c及6d)。
用圖中的刻度條可以確定細(xì)胞中所合成的重金屬顆粒的大小約為 5-120nm，當(dāng)然本發(fā)明的范圍并不僅限于該大小而是有可能制備各種大小重金 屬顆粒。同樣地，可以發(fā)現(xiàn)在￡.^//細(xì)胞中形成了作為重金屬顆粒特異性結(jié)構(gòu) 的格子狀結(jié)構(gòu)(圖6c及6d)。
進(jìn)一步地，利用TEM對(duì)由表達(dá)植物螯合肽合成酶的Eco/Z所吸收的重金屬 結(jié)構(gòu)進(jìn)行EDS分析(Technai G2, FEI, the Netherlands)。在此，對(duì)顯微圖中作 標(biāo)記部分的重金屬結(jié)構(gòu)作了分析，結(jié)果，在培養(yǎng)基中所添加成分中清除了鎘 (Cd)、鋅(Zn)及銫(Cs)(圖7)。
圖7顯示了，根據(jù)本發(fā)明當(dāng)具有表達(dá)于其中的植物螯合肽合成酶的Eco// 在含鎘(Cd)、鋅(Zn)及銫(Cs)各5mM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，聚集在細(xì)胞 中的重金屬結(jié)構(gòu)的EDS和TEM分析結(jié)果。如圖7所示，可以發(fā)現(xiàn)除了可能出 現(xiàn)于生物體Eco//中的碳(C)和氧(O)、以及通常存在于五.co/Z細(xì)胞中的鈉 (Na)和氯(Cl)之外，鋅(Zn)、鎘(Cd)及銫(Cs)為細(xì)胞中重金屬納米 顆粒的成分。
圖8顯示了，根據(jù)本發(fā)明當(dāng)具有表達(dá)于其中的植物螯合肽合成酶的Eco" 在含鎘(Cd)、鋅(Zn)及硒(Se)各5mM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，聚集在細(xì)胞 中的重金屬結(jié)構(gòu)的EDS和TEM分析結(jié)果。特別地，對(duì)電子顯微圖中所標(biāo)記的 重金屬結(jié)構(gòu)的一部分作了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)含有鋅(Zn)和硒(Se)并且
15硒(Se)的濃度高。
圖9顯示了，根據(jù)本發(fā)明當(dāng)具有表達(dá)于其中的植物螯合肽合成酶的￡.co// 在含鎘(Cd)、鋅(Zn)及碲(Te)各5mM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，聚集在細(xì)胞 中的重金屬結(jié)構(gòu)的EDS和TEM分析結(jié)果。對(duì)電子顯微圖中所標(biāo)記的重金屬結(jié) 構(gòu)的一部分作了分析，結(jié)果，重金屬結(jié)構(gòu)含有少量鋅(Zn)、硒(Se)及鎘(Cd) 并還具有高濃度的碲(Te)。
圖7-圖9中EDS所用胞外重金屬的尺寸約為30-50nm。此外，通過(guò)TEM 可觀察到具有從約5nm-約120nm各種尺寸的重金屬顆粒都出現(xiàn)在細(xì)胞中。
工業(yè)實(shí)用性
如上所述和所證實(shí)的，本發(fā)明提供一種利用重金屬結(jié)合蛋白制備的重金屬 結(jié)構(gòu)的方法、根據(jù)所述方法制備的納米顆粒作為量子點(diǎn)、以及具有生產(chǎn)重金屬 結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，該重組微生物轉(zhuǎn)化有含金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一 部分的表達(dá)載體。和通過(guò)物理結(jié)合金屬材料來(lái)制備量子點(diǎn)的現(xiàn)有方法不同，本 發(fā)明所提供的作為納米顆粒的體內(nèi)量子點(diǎn)通過(guò)體內(nèi)所表達(dá)酶的活性來(lái)合成。根 據(jù)本發(fā)明，能夠通過(guò)簡(jiǎn)單的方法以高效且經(jīng)濟(jì)的方式來(lái)大量生產(chǎn)量子點(diǎn)。此外， 由于該量子點(diǎn)能夠解決有機(jī)熒光團(tuán)的缺陷即光學(xué)穩(wěn)定性問(wèn)題，因而該量子點(diǎn)是 有用的。
雖然已經(jīng)參考細(xì)節(jié)特征對(duì)本發(fā)明作了具體描述，但是該描述僅為優(yōu)選實(shí)施 方式而并非限制本發(fā)明的范圍，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。因此，通 過(guò)所附權(quán)利要求及其等同物來(lái)限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍。
權(quán)利要求
1. 一種用于制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，該方法包括步驟在含重金屬離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有重金屬結(jié)合蛋白編碼基因的微生物，以在該微生物中生產(chǎn)重金屬結(jié)構(gòu)；以及收集所產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu)。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在 于，該重金屬結(jié)合蛋白為植物螯合肽合成酶或金屬硫蛋白。
3. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在 于，該重金屬結(jié)合蛋白源自下組中的任一種智人、擬南芥、觀賞煙草、 小家鼠、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、惡臭假單胞菌及大腸桿菌。
4. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在 于，所述微生物從革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、放線菌、酵母菌及真 菌種選擇。
5. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在 于，所述微生物經(jīng)過(guò)修飾使其不會(huì)產(chǎn)生使所表達(dá)蛋白發(fā)生降解的胞內(nèi)和 胞外蛋白酶，從而有利于重金屬結(jié)合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)。
6. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在 于，所述微生物為E.C0li。
7. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在于，該重金屬為從如下物質(zhì)中的一種或多種鎘、鋅、硒、碲、銫、銅、 氯、鉛、鎳、錳、汞、鈷及鉻。
8. 如權(quán)利要求1所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在 于，所述重金屬結(jié)構(gòu)是納米顆粒。
9. 如權(quán)利要求8所述的制備重金屬結(jié)構(gòu)納米顆粒的方法，其特征在于，所述納米顆粒是量子點(diǎn)。
10. 重金屬納米顆粒，其特征在于，其通過(guò)權(quán)利要求8所述方法制得，直徑為5-120nm且呈球形。
11. 一種具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，其特征在于，所述 微生物轉(zhuǎn)化有含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一部分的表達(dá)載體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，其特征在于，所述重金屬是如下物質(zhì)中的一種或多種鎘、鋅、硒、碲、銫、銅、氯、鉛、鎳、錳、汞、鈷及鉻。
13. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 其特征在于，所述重金屬結(jié)合蛋白是植物螯合肽合成酶或金屬硫蛋白。
14. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，其特征在于，編碼所述植物螯合肽合成酶的基因部分具有序列號(hào)5的堿基序列。
15. —種根據(jù)權(quán)利要求11所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，其特征在于，所述重金屬結(jié)合蛋白源自下列組中的任一種智人、擬南芥、觀賞煙草、小家鼠、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、惡臭假單胞菌及大腸桿菌。
16. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物，其特征在于，所述微生物從革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、放線菌、酵 母菌及真菌種選擇。
17. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 其特征在于，所述微生物是E. co/Z。
18. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 其特征在于，所述微生物經(jīng)過(guò)修飾使其不會(huì)產(chǎn)生使所表達(dá)蛋白發(fā)生降解 的胞內(nèi)和胞外蛋白酶，從而有利于重金屬結(jié)合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)。
19. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 其特征在于，所述含有重金屬結(jié)合蛋白表達(dá)基因或其一部分的表達(dá)載體 在該重金屬結(jié)合蛋白的氨基酸序列的一部分有缺失或位點(diǎn)特異性突變，從而該重金屬結(jié)合蛋白有利于重金屬結(jié)合。
20. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 其特征在于，該含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一部分的表達(dá)載體為具有圖2所示酶切圖譜的pTJl-AtPCS 。
21. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的具有產(chǎn)生重金屬結(jié)構(gòu)能力的重組微生物， 其特征在于，該含重金屬結(jié)合蛋白編碼基因或其一部分的表達(dá)載體為具 有圖3所示酶切圖譜的pTJl-PpMT。
22. —種改善納米顆粒的方法，其特征在于，所述方法包括把根據(jù)權(quán) 利要求IO所述納米顆粒結(jié)合到化學(xué)材料、配基、金屬、DNAs及蛋白中 的至少一種上。
23. —種改善納米顆粒的方法，其特征在于，所述方法包括把蛋白結(jié) 合到根據(jù)權(quán)利要求IO所述納米顆粒上，并用具有識(shí)別標(biāo)記在該結(jié)合蛋白 上的物質(zhì)的蛋白質(zhì)以及結(jié)合在該目標(biāo)蛋白上的標(biāo)記配體、或者特異性結(jié) 合該目標(biāo)蛋白的抗體來(lái)處理該結(jié)合蛋白。
24. —種用于改善納米顆粒的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a) 把生物包被在根據(jù)權(quán)利要求IO所述納米顆粒的表面上；(b) 把鏈霉親和素包被在上述由生物素包被的表面上；(c) 用氨基、醛及及羰基中的至少一種化學(xué)基團(tuán)對(duì)上述鏈霉親和素包 被的表面進(jìn)行修飾;以及(d) 用金或銀對(duì)上述經(jīng)修飾的表面進(jìn)行包被。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用重金屬結(jié)合蛋白制備重金屬納米顆粒的方法。特別涉及一種用于制備重金屬結(jié)構(gòu)的方法，其包括步驟在含重金屬離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有重金屬結(jié)合蛋白編碼基因的微生物，從而在該微生物中生產(chǎn)重金屬結(jié)構(gòu)；以及收集所產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu)以及根據(jù)所述方法產(chǎn)生的重金屬結(jié)構(gòu)的納米顆粒。與通過(guò)物理結(jié)合金屬材料的方式制備重金屬結(jié)構(gòu)現(xiàn)有方法不同，本文所公開(kāi)的量子點(diǎn)能夠通過(guò)在細(xì)胞表達(dá)重金屬結(jié)合蛋白來(lái)生產(chǎn)。此外，由于該量子點(diǎn)能夠解決有機(jī)熒光團(tuán)的缺陷即光學(xué)穩(wěn)定性問(wèn)題，因而該量子點(diǎn)是有用的。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101454454SQ200780019089
公開(kāi)日2009年6月10日 申請(qǐng)日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日
發(fā)明者樸泰正, 李相燁 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院