專利名稱：植物基于病毒的誘導型表達系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用病毒表達系統(tǒng)在植物或植物細胞中產(chǎn)生或表達一種或 多于一種的目的蛋白質的方法。本發(fā)明還涉及用于該方法的植物或植物細 胞，特別是轉基因植物或植物細胞。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生本發(fā)明的植物或 植物細胞的方法。
背景技術：
大體上可以使用病毒載體實現(xiàn)在植物中異源蛋白質的高產(chǎn)量表達。但 是，盡管存在不同的植物病毒表達系統(tǒng)，植物病毒表達系統(tǒng)主要用于在用
重組病毒載體感染(Donson等人，1991， A^/」c^Z f/ S J，
^:7204-7208; Chapman, Kavanagh & Baulcombe， 1992， / ， 2:549-557)或轉染(Marillonnet等人，2005， 7V"t所ofec/^o/" 0:718-723; Santi等人，2006， /Voc A^/爿cfld5W (7S A巡:861-866; WO2005/049839)
植物宿主后在植物中目的蛋白質的瞬時表達。盡管有一些科學出版物和公 開的專利申請，仍然沒有可用的已經(jīng)建立的商用基于病毒的產(chǎn)生系統(tǒng)(可 容易地放大并且提供高產(chǎn)量)，這主要是由于兩個主要原因
首先，瞬時的植物基于病毒的表達系統(tǒng)通常被限定在特定的宿主中， 所述宿主由于其對于環(huán)境因素的易感性而不適于大規(guī)^莫培養(yǎng)。此外，它們 通常被限定于植物宿主的某些部分，因此排除了大多數(shù)來自生產(chǎn)過程的植 物生物質，并且因此將每單位植物生物質的重組產(chǎn)品的相對產(chǎn)量減少到這 樣的水平，所述水平是與在轉基因植物中使用常規(guī)轉錄啟動子可以達到的 水平相當?shù)摹?br> 其次，通過生成具有穩(wěn)定整合到每個細胞中的病毒復制子的轉基因植 物宿主來放大基于病毒的產(chǎn)生系統(tǒng)的嘗試也未能提供解決方案，這尤其是
5因為所述復制子在此類位置中表現(xiàn)不佳，也是因為病毒復制子的穩(wěn)定形成 會危害植物生長和發(fā)育。通常，在瞬時表達系統(tǒng)中的系統(tǒng)病毒載體可以耐 受相對較短(最高達lkb)的異源核酸插入片段，因此限制為表勤目對小
的蛋白質。用于轉染的病毒栽體(農(nóng)桿菌介導的遞送，WO2005/049839) 可以表達更大的插入片段，但是需要整林植物的農(nóng)桿菌浸潤 (agro-infiltration )。顯然，此類系統(tǒng)便于產(chǎn)生許多重組蛋白質，包括抗 原，因為它們需要較短的時間來使用和放大，但是，在許多其它應用中基 于病毒載體的表達系統(tǒng)的轉基因形式是有用的。特別地，需要以大量和相 對低的花費生產(chǎn)重組蛋白質(例如不同的纖維素酶和其它工業(yè)酶)是個問 題，其中基于農(nóng)桿菌浸潤的瞬時表達系統(tǒng)(WO2005/049839 )不是商業(yè)可 行的。在轉基因植物宿主中表達病毒載體通常對于植物生長和發(fā)育是有害 的。同樣，此類表達最終將導致轉基因沉默。為了尋找這一問題的解決方 案，嘗試借助于轉錄后基因沉默(PTGS)阻抑制子從植物染色體釋放沉 默的病毒復制子(US6395962; Mallory等人，2002， 7V ,.必/otec/^10/.， ^:622-625 )?；谥参锶?lián)RNA病毒(Mori等人，2001，尸/朋,/.， |2， 79一86)——雀麥草花葉病毒(BMV)的糖皮質激素誘導型表達系統(tǒng)產(chǎn)生 了非常低產(chǎn)量的目的蛋白質(3-4網(wǎng)/g新鮮重量)(可能是由于PTGS)， 所述產(chǎn)量與標準(非-病毒)轉錄啟動子所提供的產(chǎn)量相當。
目前，還沒有這樣的大M^莫植物病毒表達系統(tǒng)，所述系統(tǒng)的產(chǎn)量和效 率足夠高從而能在市場上與其它大規(guī)沖莫表達系統(tǒng)如細菌、真菌或昆蟲細胞 表達系統(tǒng)相竟爭。此類植物表達需要盡可能好地實現(xiàn)下列標準
(i) 高產(chǎn)量，包括目的蛋白質在盡可能多的植物組織和盡可能多 的所述組織的細胞中表達；
(ii) 為了預防蛋白質表達對于存活的植物細胞的有害影響，目的 蛋白質或產(chǎn)物的表達應當在同一時間在被處理的植物或植物組織的所有植 物細胞中開始。
通常目的蛋白質或產(chǎn)物在產(chǎn)生所述產(chǎn)物或蛋白質的每個細胞中聚集到 某一點。但是，在聚集過程中，可降解的過程通常使得傾向于減少目的蛋白質或產(chǎn)物的產(chǎn)量或品質。因此，存在應當收獲目的產(chǎn)物或蛋白質的最優(yōu) 時間點。這一最優(yōu)時間點應當是在植物的所有組織或細胞中以及在所有選 定批次的植物中在相同時間可達到的，從而使得整個過程有效率并且有利 可圖。
發(fā)明的一般描述
因此，本發(fā)明的目標是提供在植物系統(tǒng)中表達一種或多種蛋白質的方 法，其能容易地被升級為大規(guī)模應用，產(chǎn)生大量的待表達的蛋白質，并且 同時，由于目的重組蛋白質未受控表達的可能性很低而是生物安全的。本 發(fā)明的另一目標是提供產(chǎn)生轉基因植物的有效方法，所述轉基因植物編碼 病毒復制子，其適合于從所述病毒復制子表達目的蛋白質。
因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生一種或多于一種目的蛋白質的方法，包括
(a) 提供植物或植物細胞，其包含
第一異源核苷酸序列，其包含編碼RNA復制子的核苷酸序列，以及 與所述編碼所述RNA復制子的核苷酸序列有效相連的第一誘導型啟動子；
所述RNA復制子不編碼這樣的蛋白質，所述蛋白質在所述植物中提 供了所述RNA復制子的細胞間的移動；
所述RNA復制子編碼聚合酶和所述一種或多于一種的目的蛋白質， 所述聚合酶能被改造用于復制所述RNA復制子；以及
(b) 在步驟(a)的所述植物或植物細胞中誘導所述誘導型啟動子， 從而在所述植物或植物細胞中產(chǎn)生所述一種或多于一種的目的蛋白質。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生一種或多于一種的目的蛋白質的方法，其包括 (a)提供植物，其包含
(i)第一異源核苷酸序列，其包含編碼RNA復制子的核苦酸序列， 以及與所述編碼所述RNA復制子的核苷酸序列有效相連的第一誘導型啟
動子；
所述RNA復制子不編碼這樣的蛋白質，所述蛋白質在所述植物中提 供了所述RN A復制子的細胞間的移動；
7所述RNA復制子編碼聚合酶和所述一種或多于一種的目的蛋白質， 所述聚合酶能被改造用于復制所述RNA復制子；以及
(ii)包含編碼蛋白質的序列的第二異源核苷酸序列，所述蛋白質使得 所述RNA復制子能夠細胞間移動，其中所述第二異源核苷酸序列包含第 二誘導型啟動子，所述啟動子與編碼使得所述RNA復制子能夠細胞間移 動的所述蛋白質的所述序列有效連接；以及
(b)在步驟(a)的所述植物中誘導所述第一和所述第二誘導型啟動 子，從而在所述植物中產(chǎn)生所述一種或多于一種的目的蛋白質。
本發(fā)明還提供了上述方法的步驟(a)中提供的植物或植物細胞。本發(fā) 明還提供了產(chǎn)生本發(fā)明的植物或植物細胞的方法，包括向植物核染色體中 引入所述第一異源核苷酸序列以及任選地所述第二異源核苷酸序列，然后 再生包含所述第 一 以及任選地所述第二異源核苷酸序列的經(jīng)轉化的植物。 本發(fā)明的發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了在植物或植物細胞中產(chǎn)生一種或多于一 種的目的蛋白質的方法，其達到在現(xiàn)有技術中不能達到的表達水平。同時， 本發(fā)明的方法是生物學安全的，并且可升級為工業(yè)水平。本發(fā)明的異常的 表達水平是通過病毒表達系統(tǒng)達到的，所述病毒表達系統(tǒng)以迄今未知的程 度避開了植物或植物細胞的抗病毒應答，例如轉基因沉默。在本發(fā)明中， 從編碼RNA復制子的核苷酸序列釋放RNA復制子并且表達所述使得所述 RNA復制子能夠細胞間移動的蛋白質是受到誘導型啟動子控制的。由于 RNA復制子的滲漏轉錄而從編碼RNA復制子的核苷酸序列中的任何不想 要的RNA復制子的釋放被限定在發(fā)生了此類滲漏轉錄的那些細胞中，因 為所述RNA復制子不能在缺乏提供細胞間移動的所述蛋白質時在所述植 物或所述植物細胞中進行細胞間移動。重要的是，在未被誘導的狀態(tài)中沒 有以能夠觸發(fā)轉基因沉默的水平表達病毒序列。因此，轉基因沉默不太可 能發(fā)生。此外，通過遺漏在所述植物中提供所述RNA復制子的細胞間移 動的蛋白質而對RNA復制子的表達產(chǎn)量造成的有害影響通過提供相對于 所述RNA復制子反式的編碼下述蛋白質的序列來補償，所述蛋白質使所 述RNA復制子能夠細胞間移動。提供所述RNA復制子的細胞間移動的所
8述蛋白質的表達受到誘導型啟動子的控制。這保留了將所述病毒復制子的 滲漏表達限制于其中已經(jīng)發(fā)生此類滲漏表達的細胞中，并且避免了基因沉 默，但是允許所述目的蛋白質在誘導的狀態(tài)中的高表達水平。因此，在本 發(fā)明中，基因沉默對于目的蛋白質產(chǎn)量的有害影響基本不存在。
此外，發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，當植物細胞用本發(fā)明的所述第一
異源核苷酸序列轉化時的轉化效率高于RNA復制子編碼提供細胞間移動 的蛋白質的情形。在一些情形中，如果RNA復制子編碼提供細胞間移動 的蛋白質，則根本不可能獲得具有所述第一異源核苷酸序列的初級轉化體。 本發(fā)明改善轉化效率的這一作用可以是由于本發(fā)明RNA復制子不能細胞 間移動。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述植物或植物細胞包含第二異源核苷 酸序列，所述第二異源核苷酸序列包含編碼使得所述RNA復制子能夠細 胞間移動的蛋白質的核苷#列，其中所述第二異源核苷*列包含與編 碼使得所述RNA復制子能夠細胞間移動的所述蛋白質的所述核苷酸序列 有效連接的第二誘導型啟動子。本發(fā)明的這一實施方案允許進一步增加所 述一種或多于一種目的蛋白質的產(chǎn)生的產(chǎn)量。
在產(chǎn)生一種或多于一種目的蛋白質的方法的步驟(a)中，向植物或植 物細胞提供了所述第一異源核苷酸序列。向所述植物或植物細胞提供了所 述第一異源核苷酸序列，從而獲得轉基因植物或轉基因植物細胞。在一個 實施方案中，所述轉基因植物或所述轉基因植物細胞在核染色體中包含所 述第一異源核苷酸序列。
還向所述植物或植物小提供了所述第二異源核苷酸序列，從而獲得轉 基因植物或轉基因植物細胞。在一個實施方案中，所述轉基因植物或所述 轉基因植物細胞在核染色體中包含所述第二異源核普酸序列。
本領域已知產(chǎn)生包含異源核苷酸序列的轉基因植物，所述異源核苷酸 序列被穩(wěn)定整合到核染色體中或是游離的。通常，所述異源核香酸序列將 包含選擇性標記基因，用于選擇具有整合的所述異源核苷酸序列的植物細 胞或植物組織。然后可以使用植物生物技術領域中的標準技術從經(jīng)轉化的細胞或組織中再生出在所述轉基因植物的細胞中包含所述異源核苷^列
的整抹轉基因植物。本發(fā)明的所述異源核苷酸序列通常是DNA。
如果要提供包含所述第一和所述第二異源核苷酸序列的植物，所述第 一和所述第二異源核苷酸序列可以是用于轉化植物細胞或植物的一個大異 源核苷酸序列的一部分。在該實施方案中，所述大異源核苷酸序列包含所 述第一和所述第二異源核苷酸序列?？蛇x地，包含所述第一異源核苷, 列的第一植物和包含所述第二異源核苷酸序列的第二植物可以獨立生成。 然后所述第一和所述第二植物可以雜交(例如通過有性雜交或通過細胞融 合)，以獲得包含所述第一和所述笫二異源核苷酸序列的植物。在另一個備 選中，包含所述第一異源核苷酸序列的轉基因植物或植物細胞可以用所述 第二異源核苷酸序列再轉化，用于產(chǎn)生包含所述第一和所述第二異源核苷
酸序列的植物或植物細胞；或者包含所述第二異源核苷酸序列的轉基因植 物或植物細胞可以用所述第一異源核苷酸序列再轉化，用于產(chǎn)生包含所述 第二和所述第一異源核普酸序列的植物或植物細胞。在本文中，"異源"表
示相對于所述植物是異源的。
所述第一異源核香酸序列包含編碼所述RNA復制子的核苷酸序列區(qū) 段。所述第一異源核普酸序列還包含與編碼所述RNA復制子的所述核苷 酸序列區(qū)段有效連接的第一誘導型啟動子。所述誘導型啟動子允許在本發(fā) 明的方法的步驟(b)中誘導編碼所述RNA復制子的所述核苷酸序列區(qū)段 的轉錄。轉錄從編碼所述RNA復制子的所述核苷酸序列區(qū)段中釋放所述 RNA復制子。所述RNA復制子是RNA水平上的復制子。在植物細胞核 中產(chǎn)生的所述RNA復制子然后可以遷移到細胞溶膠中，在所述細胞溶膠 中編碼所述RNA復制子的蛋白質可以被產(chǎn)生并且可以復制RNA復制子。
所述RNA復制子編碼這樣的蛋白質，所述蛋白質在通過誘導所述誘 導型啟動子釋放所述RNA復制子后被表達。在本發(fā)明中，由所述第一異 源核苷酸序列編碼的所述第一 RNA復制子是編碼用于復制所述RNA序列 的聚合酶的RNA序列，借此所述RNA序列被改變以被其上編碼的聚合酶 所復制。所述聚合酶因此是RNA-依賴性RNA聚合酶，其在本文中也被成為"復制酶"。所述RNA復制子優(yōu)選具有用于翻譯所述聚合酶的序列和用 于結合所述聚合酶的序列，以允許所述RNA復制子在所述植物的細胞或 所述植物細胞中復制。所述RNA復制子還編碼待表達的所述一種或多于 一種的目的蛋白質，以M達所述一種或多種的目的蛋白質所需的序列， 例如亞基因組啟動子、轉錄增強子或翻譯增強子。
在優(yōu)選的實施方案中，所述RNA復制子來源于RNA病毒，例如單聯(lián) (monopartite ) RNA病毒。"單聯(lián)，，意思是單聯(lián)病毒具有由一個核酸分子 組成的基因組。因此，本發(fā)明的所述RNA復制子優(yōu)選是單聯(lián)RNA復制子， 即其由單一類型的RNA分子構成。在優(yōu)選的實施方案中，所述RNA復制 子來源自正義單鏈RNA病毒，因為此類病毒包含復制和表達所需的遺傳 元件并且通過進化^皮優(yōu)化用于本發(fā)明的目的。在所述優(yōu)選的實施方案中， 所述RNA復制子是正義單鏈RNA復制子。
"來源自"意思是使用本發(fā)明所需的RNA病毒的那些遺傳元件，其中 其它可以被缺失或使其功能障礙。在本發(fā)明中，可以將編碼提供所述病毒 的細胞間移動的所述蛋白質的序列缺失或使其功能障礙，例如通過部分缺 失或突變對于細胞間移動關鍵的序列部分?？蛇x地，編碼目的蛋白質的序
自"表明取自植物病毒的所述RNA復制子的序列不需要與所述RNA病毒 的相應RNA序列完全相同，但是可以例如具有適當?shù)赝蛔兓蛘呖梢员憩F(xiàn) 出功能保守性差異，例如如WO 2005/049839所述的內(nèi)含子插入到編碼所 述復制酶的序列部分中。由于所述差異是功能保守的，所述序列優(yōu)選編碼 能夠實現(xiàn)復制子功能的蛋白質，這與其在所述復制子所源自的所述RNA 病毒中所做的相似。本發(fā)明的所述RNA復制子或其聚合酶可以源自的適 當?shù)恼x單鏈RNA病毒是煙草花葉病毒(TMV)或馬鈴薯X病毒。其它 所述RNA復制子可以源自的植物病毒在下文中給出。
但是，還可以人工合成所述RNA復制子或編碼其的cDNA,其中可以 或可以不使用天然病毒的遺傳元件。
本發(fā)明的所述RNA復制子不需要由所述第一異源核苷酸序列的一個
ii連續(xù)核苷酸序列區(qū)段所編碼。相反，所述第一異源核苷酸序列可以具有兩
個或多個序列區(qū)段，它們一起編碼所述RNA復制子。兩個或多個此類序 列區(qū)段可以是連續(xù)的或者可以由另 一序列部分所打斷。所述植物的細胞中 所述RNA復制子的形成然后可以涉及序列特異性DNA或RNA重組。在 DNA重組的情形中，所述RNA復制子可以通過切除阻斷所述RNA復制 子祐束達的序列部分來形成?？蛇x地，不連續(xù)編碼所述RNA復制子的兩 個或多個序列區(qū)段之一可以通過重組,皮翻轉，從而形成編碼所述RNA復 制子的單一的連續(xù)序列區(qū)段。還可能的是，所述RNA復制子可以通過在 兩個復制子前體之間的重組來形成，所述兩個復制子前體都不是RNA復 制子。此類重組可以是如WO02/097080中所描述的核酶介導的反式剪接。
的細胞間移動的蛋白質。本發(fā)明的這一特征允許將所述RNA復制子的任 何滲漏釋放限制在所述滲漏釋放的植物細胞中。在所述植物中提供所述 RNA復制子的細胞間移動的蛋白質通常被稱作為"移動蛋白"。植物病毒通 常編碼并表達一種或多種允許病毒或所述病毒的基因組RNA細胞間擴散 的蛋白質。本發(fā)明的RNA復制子必需不能表達移動蛋白，所述移動蛋白 將允許在所述植物中所述RNA復制子的顯著的細胞間擴散。除非是在誘 導型啟動子的控制之下，否則所述植物或所述植物細胞應當不表達在所述 植物中提供所述RNA復制子的細胞間移動的蛋白質。在一個實施方案中， 所述RNA復制子可以包含天然RNA病毒的移動蛋白的一部分，前提是所 述移動蛋白的一部分不允許所述RNA復制子在所述植物中進行細胞間的 顯著擴散。
在本發(fā)明的方法和植物的一個實施方案中，所述植物包含第二異源核 苷酸序列，所述核苷酸序列包含編碼使得所述RNA復制子能夠細胞間移 動的蛋白質的核苷酸序列，其中所述第二異源核苷酸序列包含與下述核苷 酸序列有效連接的第二誘導型啟動子，所述核苷酸序列編碼使得所述RNA 復制子能夠細胞間移動的所述蛋白質。所述蛋白質可以來源自與所述RNA 復制子的聚合酶所來源的相同植物RNA病毒，或者來自另一 RNA病毒。
12編碼RNA復制子的所述核普酸序列和編碼使得能夠細胞間移動的蛋 白質的所述核苷酸序列受到分開的誘導型啟動子的控制，從而避免了來自 一個誘導型啟動子的滲漏表達將導致移動蛋白的表達和所述RNA復制子 的形成。因此，編碼RNA復制子的所述核苷酸序列和編碼使得能夠細胞 間移動的蛋白質的所述核苷酸序列在所述植物或植物細胞中存在于不同的 表達盒中。但是，這些分開的誘導型啟動子不需要是誘導型啟動子的不同
列, 、，, '，一 口 5、 'P 、 5
所述第一、所述第二的所述誘導型啟動子或任何其它誘導型啟動子可 以由相同的或不同的誘導信號或誘導劑所誘導?？梢杂糜诒景l(fā)明的誘導型 啟動子在下文中給出。在一個實施方案中，所述第一和/或所述第二異源核 苷酸序列的誘導型啟動子是化學誘導的。在另一個實施方案中，所述第一 和/或所述第二異源核苷酸序列(以及任選地其它異源核苷酸序列)的誘導 型啟動子是由相同的誘導劑例如IPTG、乙醇、四環(huán)素或糖皮質激素所i秀 導的。
在本發(fā)明方法的步驟(b)中，步驟(a)的所述植物或所述植物細胞 中的所述誘導型啟動子被誘導，從而起始所述一種或多于一種的目的蛋白 質的表達，從而在所述植物或植物細胞中產(chǎn)生所述一種或多于一種的目的 蛋白質。誘導模式取決于誘導型啟動子的類型。如果誘導型啟動子是化學 誘導型的，則向所述植物或所述植物細胞提供能夠誘導啟動子的化學劑。 如果不同的誘導型啟動子用于所述第一和所述第二異源核苷酸序列，則同 時向所述植物或所述植物細胞應用不同的化學劑，例如作為不同誘導劑的 混合物。如果所述方法在液體培養(yǎng)基中的植物細胞中進行，可以將誘導劑 加入到培養(yǎng)基中。如果所述方法在植物中進行，可以通過用所述誘導劑的 溶液或懸液噴霧所述植物來將所述誘導劑應用到所述植物中。
本發(fā)明的方法可以用于產(chǎn)生一種目的蛋白質或多于一種的目的蛋白 質。如果要產(chǎn)生一種目的蛋白質，編碼所述目的蛋白質的核苷酸序列可以 包括在編碼所述RNA復制子的所述核苷酸序列中。在一個實施方案中，編碼所述目的蛋白質的核苷酸序列可以替換所述RNA復制子所來源的植 物RNA病毒的移動蛋白基因?？蛇x地，可以用編碼目的蛋白質的核苷酸 序列替換所述RNA復制子所來源的RNA病毒的外殼蛋白基因。如果要表 達兩個目的蛋白質，可以用編碼目的蛋白質的核苷M列替換(完全或部 分)移動蛋白基因和外殼蛋白基因。
如果要產(chǎn)生兩個或多個目的蛋白質，所述植物或植物細胞可以包含第 三異源核苷酸序列，所述核苷酸序列包含編碼另一 RNA復制子的核苷酸 序列以及與所述編碼所述另一 RNA復制子的所述序列有效連接的第三誘 導型啟動子。所述另一 RNA復制子優(yōu)選不編碼在所述植物中提供所述 RNA復制子或所述另一 RNA復制子的細胞間移動的蛋白質。所述另一 RNA復制子然后可以編碼一種或多種另一目的蛋白質。如果所述植物編碼 兩個或多個RNA復制子，則使得所述RNA復制子能夠細胞間移動的蛋白 質也可以使得所述另一 RNA復制子能夠細胞間移動?？蛇x地，所述另一 RNA復制子的細胞間移動可以由使得所述另一 RNA復制子能夠細胞間移 動的另一蛋白質來提供，其表達可以受到另一誘導型啟動子的控制。
所述另一 RNA復制子可以通過所述聚合酶來復制，所述聚合酶是由 所述第一異源核苷酸序列所編碼的所述RNA復制子所編碼的。但是，在 一個實施方案中，所述另一 RNA復制子編碼用于復制所述另一 RNA復制 子的另一聚合酶，其中所述另一聚合酶可以不同于所述RNA復制子的聚 合酶。
在一個實施方案中，所述RNA復制子和所述另一 RNA復制子可以是 非竟爭性RNA復制子。來自非竟爭性RNA復制子或非竟爭性病毒載體的 蛋白質的產(chǎn)生描述在WO 2006/79546 (PCT/EP2006/000721)中。
可以在所述植物或植物細胞中產(chǎn)生后將所述一種或多于一種的目的蛋 白質從不想要的細胞成分中純化出來。從植物或植物細胞中純化蛋白質的 方法是本領域已知的。在一種方法中，如WO 03/020938中所述的目的蛋 白質涉及植物質外體。
通常，本發(fā)明可以被應用于任何植物，其中感染性RNA病毒存在并
14且建立了病毒載體系統(tǒng)。在一個實施方案中，雙子葉植物用于實踐本發(fā)明。
在另一個實施方案中，使用茄科(Solanaceae)植物。優(yōu)選的植物是煙草 屬(7V,'co"flWfl )沖勿種，，j長口本生煙(A^ortVm" 6^1^"/mVmfl)和煙草(A^o Z/flw" to6flcw附)；優(yōu)選的除煙草屬物種外的植物物種是碧冬茄(/^M附'fl/^;6nV/a)、 蕓莒(6ms5i.cfl cfl附/ e欲/51)、 芥菜(JS. 7固c'm)、 水芽、芝麻菜、白芥、草蕃、 菠菜、0lefio/7oWw附cfl/;/加"柳、苜覆、萵苣、向EI蔡和黃瓜。
本發(fā)明的產(chǎn)生方法還可以在本文提到的植物細胞中進行。所述細胞可 能是植物組織例如葉的一部分，或者所述細胞可以存在于細胞培養(yǎng)物例如 懸浮培養(yǎng)物中。
適當?shù)腞NA復制子可以來自下文給出的RNA病毒的列表。本發(fā)明可 以應用于單聯(lián)植物RNA病毒。本發(fā)明可以基于的最優(yōu)選的植物RNA病毒 是煙草花葉病毒組，特別是煙草花葉病毒；以及馬鈴薯X病毒組，例如馬 鈴薯X病毒。在煙草花葉病毒的情形中，通常是移動蛋白ORF被待表達 的所述目的蛋白質的ORF所替換。外殼蛋白ORF也可以被移除或者被目 的蛋白質的ORF所替換。
本發(fā)明的主要應用是在植物、植物葉或植物組織或細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生 目的蛋白質。如果本發(fā)明的方法在植物中進行，則優(yōu)選不進入人或動物食 物鏈的植物，例如煙草屬物種。不i^7v人或動物食物鏈的植物可以在開放 的田地中栽培，并且在誘導所述RNA復制子釋放后(當一種或多于一種 的目的蛋白質在植物組織中的表達水平達到其峰值時)在某一時期內(nèi)收獲。 優(yōu)選地，整林植物或植物部分應當被限制在封閉的環(huán)境中，例如溫室或特 別設計的用于提供所述水平表達所需的孵育時期的室。
本發(fā)明的產(chǎn)生方法的效率是這樣的，使得達到植物表達系統(tǒng)中的新規(guī) 模。用本發(fā)明可達到的表達水平是這樣的，從而使得用于下游加工(包括 目的蛋白質的分離和純化)的支出足夠低，使得本發(fā)明的方法與其它大規(guī) 模表達系統(tǒng)不相上下。在現(xiàn)有技術的使用穩(wěn)定轉化了病毒載體的植物的表 達系統(tǒng)中，表達水平低，因為這些系統(tǒng)的滲漏4吏得復制子甚至在未誘導的 狀態(tài)中產(chǎn)生，從而觸發(fā)破壞產(chǎn)量的PTGS機制。此外，能夠細胞間移動的RNA復制子破壞了攜帶所述穩(wěn)定摻入到植物染色體DNA中的復制子的穩(wěn) 定轉化的植物細胞的產(chǎn)生。令人驚訝地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與獲得攜帶能夠細 胞間移動的RNA復制子的轉基因植物相比，更容易獲得包含下述載體的 轉基因植物，所述載體編碼不能細胞間移動的RNA復制子。很可能是這 一現(xiàn)象還有助于在包含不能細胞間移動的病毒載體的轉基因植物中的高表 達水平。本發(fā)明提供了可以大規(guī)厲使用的第 一 高產(chǎn)量誘導型植物表達系統(tǒng)。
附圖簡述


圖1.發(fā)明的一般原理A——能夠細胞間移動的RNA復制子的擴散； B——缺乏細胞間移動的本發(fā)明的RNA復制子被限制于發(fā)生了所述RNA 復制子的不想要的形成的細胞中。
圖2A描述了質粒pICH17155、 pICH17401、 pICH16141、 pICH17171、 pICH18867、 pICH17424和pICH17388的T-DNA區(qū)域。圖2B描述了質 粒pICH18693、 pICH18969、 pICH18951、 pICH19940和pICH20592的 T-DNA區(qū)域。圖2C描述了質粒pICH26022和pICH26356的T-DNA區(qū)域。 在更大的表示TVCV聚合酶的灰框中的白框表示在核中穩(wěn)定轉錄物并且因 此使得在細胞核中形成的RNA復制子向細胞溶膠中的轉移更加有效的內(nèi) 含子。3，Nos——胭脂堿合酶基因的轉錄終止區(qū)域；pNos——胭脂堿合酶 基因的啟動子；p35S——CaMV的35S啟動子；pAct2——擬南芥(A.
thaliana)肌動蛋白2基因的啟動子；NLS-核定位信號；lacO——大腸
桿菌lac操縱子的操g因序列；lacl——大腸桿菌lac操縱子的阻抑基因； BAR——賦予對除草劑膦絲菌素抗性的基因；int——內(nèi)含子序列的5，部 分；AttP——整合酶phC31識別的重組位點。NPTII——新霉素磷酸轉移 酶II; sGFP——合成的綠色熒光蛋白；NTR——煙草花葉病毒組非翻譯的 區(qū)域；PalcA——編碼醇脫氫酶的誘導型構巢曲霉菌(A. nidulans ) alcA 基因的誘導型啟動子；alcR——構巢曲霉菌(/^/7Cg/〃附附V/w/"附)的a/c 調(diào)節(jié)子的轉錄激活子。TVCV MP——蕪菁脈露病病毒移動蛋白；PVX CP——馬鈴薯X病毒外殼蛋白；PVX Pol——馬鈴薯X病毒RNA依賴性RNA聚合酶；25K、 12K、 8K——三基因區(qū)段；sgp——亞基因組啟動子。 圖3顯示了用誘導型lac系統(tǒng)的瞬時表達測試。用不同組合的構建體 浸潤葉，處理6天后，在UV光下對其進行監(jiān)控。黑背景前的光斑表明GFP 熒光。葉的左側lac阻抑物缺乏；葉的右側lac阻抑物存在。pICH17424 是具lacO的5'-前載體(provector)， pICH17388是無lacO的相應的對照構 建體。pICH17401是lac阻抑物構建體。所有的樣品還包含GFP3，-前載體 和整合酶。
圖4A顯示用lac阻抑物穩(wěn)定轉化的植物的葉子。將植物用在其啟動子 中包含lacO序列的栽體pICH17171以及用缺乏lacO序列的相應的對照構 建體pICH16141進行農(nóng)桿菌浸潤。
圖4B顯示通過用IPTG處理消除阻抑。將用lac阻抑物穩(wěn)定轉化的本 生煙植物用在其啟動子中包含lacO序列的載體pICH17171以及用相應的 對照構建體pICH16141進行農(nóng)桿菌浸潤。將5mM IPTG包括在浸潤緩沖 液中用于誘導(右圖)。左圖是缺乏誘導物IPTG。
圖5顯示了用提供RNA復制子的構建體再次轉化包含lacl阻抑物的 植物(pICH17155或pICH17401 )。用5mM IPTG浸潤植物。品系N6 (左 圖)顯示高的誘導性，但是也是高的背景，而品系N8 (右圖)顯示低背景 和低誘導性。
圖6顯示了用基于TMV載體的乙醇-誘導型系統(tǒng)的瞬時表達測試。對 照浸潤后2天(2 days post-infiltration )用水處理的植物；乙醇-處理的 浸潤后2天用4%乙醇處理的植物。
圖7顯示了使用基于PVX載體的乙醇-誘導型系統(tǒng)的瞬時表達測試。 對照浸潤后2天用水處理的植物；乙醇-處理的浸潤后2天用4%乙醇 處理的植物。
圖8顯示了在UV光下的攜帶有pICH18951的T-DNA的穩(wěn)定轉化體 的葉。綠(光)點對應于用攜帶有pICH18693的農(nóng)桿菌浸潤并且用醇噴霧 的區(qū)域。
圖9顯示了在用含水醇溶液處理(澆灌——1%醇，并且噴#——4%醇)后表達GFP的轉基因本生煙植物(Fl后代)。
圖IO顯示了在用4。/o醇溶液噴霧后表達GFP的轉基因煙草植物(Fl 后代)。
圖11描述了質粒pICH25408的T-DNA區(qū)域。在更大的表示TVCV 聚合酶的灰框中的白框表示在核中穩(wěn)定轉錄物以及因此使得在細胞核中形 成的RNA復制子轉移到細胞溶膠中的內(nèi)含子。在更大的表示TVCV聚合 酶的灰框中的白框表示在核中穩(wěn)定轉錄物以及因此使得在細胞核中形成的 RNA復制子轉移到細胞溶膠中的內(nèi)含子。3，Nos——胭脂堿合酶基因的轉 錄終止區(qū)域；pNos——胭脂堿合酶基因的啟動子；3'()cs——章魚堿合酶 基因的轉錄終止區(qū)域；NPTII——新霉素磷酸轉移酶II; NTR——煙草花 葉病毒組非翻譯的區(qū)域；PalcA——編碼醇脫氫酶的誘導型構巢曲霉菌(A.
nidulans) alcA基因的誘導型啟動子；alcR-構巢曲霉菌(/1s/^/^7/"s
mV/"/flws)的fl/c調(diào)節(jié)子的轉錄激活子。TVCV MP——蕪菁脈露病病毒移 動蛋白；sgp——亞基因組啟動子。
圖12顯示了總的可溶性蛋白質的電泳分析結果的考馬斯-染色的聚丙 烯酰胺凝膠，所述總的可溶蛋白質提取自不同的轉基因植物(N18， N19 和N20),所述轉基因植物攜帶有具有擬酶肽基因的質粒pICH25408的 T-DNA區(qū)域。
道l——對照，從未處理的植物分離的總的可溶性蛋白質；道2——用 攜帶有編碼alcR激活子(pICH18693 )的質粒的農(nóng)桿菌浸潤并且用4%乙 醇處理的植物；道3——用攜帶有編碼alcR激活子(pICH18693)的質粒、 編碼攜帶有擬酶肽基因的病毒載體的質粒(pICH25408)的農(nóng)桿菌混合物 浸潤并且用4%的乙醇處理的才直物。
圖13顯示了總的可溶性蛋白質的電泳分析結果的考馬斯-染色的聚丙 烯酰胺凝膠，所述總的可溶蛋白質提取自Fl植物，所述F1植物是從攜帶 有編碼具有擬酶肽基因的病毒載體的質粒pICH25408的T-DNA區(qū)域的轉 基因植物和攜帶有編碼alcR激活子(pICH18693)的T-DNA區(qū)域的轉基 因植物之間的雜交獲得的。植物用4%的乙醇處理。
18發(fā)明詳述
本發(fā)明描述了使用可以來源自單聯(lián)RNA病毒的RNA復制子來高產(chǎn) 量、大規(guī)模產(chǎn)生目的蛋白質的誘導型表達系統(tǒng)。所述RNA復制子能夠在 植物中表達一種或多于一種的目的蛋白質。本發(fā)明的方法具有生物安全性
子感染其它植物(由于其不能進行短距離(細胞間)移動)以及任選地， 還預防了長距離移動。
我們已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)移除所述RNA病毒載體的細胞間移動功能
化的植物的選擇和再生。本發(fā)明的基本原理示于圖1中。在能夠細胞間移 動的病毒栽體的情形中，誘導型系統(tǒng)的滲漏引起了病毒載體釋放到細胞溶 膠中并且進一步擴散到鄰近細胞(圖1A)。最終，這導致在植物宿主中病 毒載體的非受控擴散，破壞了所述植物的生長和發(fā)育。在克服所述問題并 且通過轉錄后基因沉默(PTGS)機制控制病毒載體復制的植物宿主的情 形中，PTGS對于植物宿主中目的蛋白質的表達水具有負面作用。在本發(fā) 明中，誘導型系統(tǒng)的滲漏不具有此類顯著的作用，因為本發(fā)明的RNA復 制子不能細胞間移動，因此PTGS實際上是可以忽略的。所述RNA復制 子基本上^皮限制在由于啟動子滲漏而導致其^皮釋放的細胞中(圖1B),因 此改善了對不想要的目的蛋白質表達的控制并且降低了 PTGS對于系統(tǒng)生 產(chǎn)力的潛在的負面作用。
在本發(fā)明中，誘導型和組織特異性啟動子可以用于在植物或植物細胞 中觸發(fā)目的蛋白質的產(chǎn)生。根據(jù)其誘導條件，誘導型啟動子可以被分為兩 類由非生物因素(溫度、光、化學物質)誘導的啟動子和由生物因素(例 如病原體或害蟲攻擊)誘導的啟動子。第一類的實例包括但不限于熱誘導 型(US 05187287)和冷誘導型(US05847102)啟動子、銅-誘導型系統(tǒng)(Mett等 人，1993， Proc. Natl. Acad. Sci" 90, 4567-4571)、類固醇誘導型系統(tǒng) (Aoyama & Chua， 1997， Plant丄，11, 605-612; McNellis等人，1998， Plant J" 14， 247-257; US06063985)、乙醇-誘導型系統(tǒng)(Caddick等人，1997， NatureBiotech., 16， 177-180; WO09321334; WO0109357; W()02064802)、異丙基 [5-D-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)-誘導型系統(tǒng)(Wilde等人，1992, EMBO J.， 11:1251-1259)和四環(huán)素-誘導型系統(tǒng)(Weinmann等人，1994, Plant J" 5， 559-569).用于植物的化學誘導型系統(tǒng)領域中最近的發(fā)展之一是可以由糖 皮質激素地塞米松啟動并且由四環(huán)素關閉的嵌合啟動子(Bohner等人， 1999， Plant J.， 19， 87-95).化學誘導型系統(tǒng)是最適合于實施本發(fā)明的。對 于化學誘導型系統(tǒng)的綜述參見Zuo & Chua， ( 2000, Current Opin. Biotechnol., 11， 146-151)和Moore等人，(2006， Plant J" 45: 651-683).對于
本領域^L術人員顯而易見的是選定的誘導型系統(tǒng)的功能性所需的任何蛋白 質例如阻抑物或激活子必須要在所述植物或所述植物細胞中表達，用于使 得誘導型系統(tǒng)有功能(參見實施例)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，我們使用IPTG-誘導型系統(tǒng)用于控制 RNA復制子釋放和目的蛋白質產(chǎn)生。示例性構建體的設計描述在實施例1 中。將編碼lacl阻抑物的細菌基因克隆為受到強組成型35S啟動子的控制。 將雙份lac操縱基因序列插入到驅動本發(fā)明的RNA復制子轉錄的擬南芥肌 動蛋白2啟動子中。使用實施例2中描述的瞬時表達測定測試該系統(tǒng)。當 編碼RNA復制子的異源核苷酸序列與攜帶lacl阻抑物的構建體一起#_浸 潤到植物中時，這一系統(tǒng)不顯示出任何所述RNA復制子釋放的抑制，這 可能是由于在阻抑物合成前的RNA復制子的形成(圖3，右下)。事實上， 當使用前載體系統(tǒng)時，需要位點-特異性重組酶用于裝配進RNA復制子的 DNA前體中(Marillonnet等人，2004， /Voc. TV""爿ow/. 5W. C/&4， 101:6852-6857 )從而延遲復制子形成、復制子釋放的阻抑是明顯的(圖3, 右上角)。在不存在提供了 lacl阻抑物的載體時(圖3,左上)，在前載 體系統(tǒng)的情形觀察到RNA復制子形成阻抑完全不存在。
在本發(fā)明的另一個實施方案中(實施例3),我們測試了用提供了 lacl 阻抑物的構建體穩(wěn)定轉化的轉基因植物阻抑RNA復制子從瞬時遞送的第 一異源核苷酸序列釋放的能力，所述核苷酸序列受到具有l(wèi)ac操氛基因序 列的啟動子的控制。從圖4A中顯而易見，與用缺乏lac操M因序列的構
20建體pICH16141的對照實驗相比，包含此類序列的構建體pICH17171的 農(nóng)桿菌浸潤未給出有效的RNA復制子釋放。用相同構建體和lmM IPTG 對所述轉基因植物的共浸潤導致誘導了 RNA復制子釋》文(在pICH17171 的情形中)(圖.4B，右圖)，而在無IPTG的對照實驗中，沒有觀察到RNA 復制子的釋放(圖4B，左圖)。用使得RNA復制子能夠細胞間移動的構 建體穩(wěn)定再轉化包含lacl阻抑物的植物產(chǎn)生了在未誘導的狀態(tài)中具有嚴重 背景表達的雙重轉化體(圖5 )。綜合對于LacMacO系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)，很 明顯，關于RNA復制子釋放的具有可以忽略的背景表達的最佳對照是在 缺乏細胞間移動的RNA復制子的情形中獲得的(pICH17171，圖4A;圖 4B,左圖)。包含功能性MP的構建體在未誘導的狀態(tài)中顯示出嚴重的背 景表達(pICH17424，圖3，右上；圖5， 對照)。同樣，具有所述構建 體的初級轉化體最終成為轉基因表達沉默的，從而無法用于目的蛋白質的 高產(chǎn)量表達。
在本發(fā)明的另 一個實施方案中，使用乙醇誘導型系統(tǒng)來控制轉基因植 物中RNA復制子的釋放。構建體的設計描述在實施例5中，并且構建體 的圖示顯示于圖2B中。所述構建體的瞬時表達實驗的結果顯示于圖6中。 很明顯乙醇誘導型系統(tǒng)提供了對于RNA復制子釋放的嚴密控制，例如僅 在構建體與alcR激活子被共浸潤的實驗中觀察到GFP表達。實際上，不 存在alcR構建體和/或化學誘導物乙醇時沒有觀察到背景表達(存在alcR 構建體時觀察到可以忽略的表達)。提供RNA復制子的構建體 (pICH18951 )的轉基因本生煙植物與alcR構建體在存在4。/。乙醇時的農(nóng) 桿菌浸潤顯示了由強GFP表達報告的RNA復制子的形成(圖8 )。令人 驚訝地，在乙醇誘導型系統(tǒng)中，沒有獲得具有包含功能性MP的病毒構建 體的初級轉化體(甚至沒有對RNA復制子釋放的控制滲漏)(實施例5 )。 這可以解釋為由于RNA復制子的細胞間移動導致的植物愈傷組織/細胞培 養(yǎng)物中系統(tǒng)的滲漏(Roberts等人，2005，尸/""f尸/i"/0/.， 138:1259-1267)。 這一解釋由下述令人驚訝的發(fā)現(xiàn)支持如果在所使用的植物宿主中RNA 復制子不編碼用于細胞間移動的蛋白質，那么提供受到乙醇誘導型啟動子控制的RNA復制子的初級轉化體可以無任何難度的獲得。我們還證明了 具有提供RNA復制子的載體的轉基因植物與包含alcR的轉基因產(chǎn)物 (transgenics )的雜交-后代在用乙醇處理后顯示出強的GFP遍在表達(圖 9和10)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，我們證明了我們的系統(tǒng)用除才艮 道基因(例如GFP)之外的蛋白質也有效工作。用于擬酶肽表達的構建體 顯示在圖11中。在用醇處理后在本生煙植物的Fl后代中重組擬酶肽產(chǎn)生 的分析表明在考馬斯-染色的凝膠上可檢測的高表達水平(主蛋白帶之一 )。
在實施例中，我們使用基于TMV的RNA復制子。但是，屬于不同分 類群的許多不同病毒可以用于構建根據(jù)本發(fā)明的基于RNA病毒的載體。 如果被ICTV所批準，目、科和屬名為斜體。引用(非斜體)中的分類名 表明該類不具有ICTV國際批準的名稱。物種(本國)名以標準體給出。 指出了未被正規(guī)分配為屬或科的病毒。
RNA病毒
ssRNA病毒科雀麥花葉病毒科(5ra附ov/nV/"e)，屬苜?；ㄈ~ 病毒屬(/4/>/mm>"s) ， #^種苜蓿花葉病毒，屬等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒 屬(〃fl/"Wms), ^"式'神煙草條紋病毒，屬雀麥花葉病毒組(必ra附owWw)， 雀麥花葉病毒，屬黃瓜花葉病毒組(Cucumovirus)、才莫式種 黃瓜花葉病毒；
科紡錘病毒科(a^ferav/nV/fle),屬線形病毒組(ao對erawV附)， 模^:種,甜菜根黃病毒，屬線性病毒屬(0/"/v/n ) ， 萵苣傳 染性黃病毒，科虹豆花葉病毒科(O 附0v/nV/fle),屬虹豆花葉病毒組 (Co附ovfWw) , &豆花葉病毒，屬豆病毒屬(F"6flWrws)，
^#4神蠶豆萎蔫病毒l，屬蠕傳多角體病毒組(7V印oWr附)，^"式辨; 煙草環(huán)斑病毒；
科馬鈴薯Y病毒科(A^v/z7V/ae)，屬馬鈴薯Y病毒組(尸o印v/r"力， 馬鈴薯Y病毒，屬黑麥草花葉病毒屬(/^/mmWw)， ^^^C神黑 麥草花葉病毒，屬大麥黃化花葉病毒屬(^woWr"s)， 大麥黃花 葉病毒；科Sequi病毒科(5^—v/nV/"e)，屬Sequi病毒屬(5"e—v,Vm),模< 神歐洲防風黃點病毒，屬矮化病毒屬(『"汰flWr"s)， 水稻東格 獸球狀病毒；科蕃茄叢矮病毒科(ro附6船v/nV/fle)，屬麝香石竹斑駁病 毒屬(Cflwiov/ms) , #4 石竹斑點病毒，屬香石竹病毒組 (Z)/"rt幼ov/rws) ， ^^<種香石竹環(huán)斑病毒，屬玉米褪綠斑駁病毒屬 (Mfldi/omov/n^), ^"4神玉米褪綠斑駁病毒，屬壞死病毒組(A^rov/ms)， ^#式'神；煙草壞死病毒，屬番茄叢矮病毒組(ro附6Msv/ras)， ^^式神.'番 茄叢矮病毒，ssRNA病毒未分配的屬，屬毛狀病毒組(0^///0^>附)，模 蘋果凹莖病毒；
屬石竹隱潛病毒組(CV^/av,V^s)， ^"4'神石竹潛伏病毒；屬碗豆 耳突花葉病毒組(E""附0v/r附)，豌豆耳突花葉病毒，
屬真菌傳纟奉狀病毒組(FMwWrMs) , 土傳小麥花葉病毒， 屬大麥病毒屬(flWflfe/Wms)， ^"4并.'大麥條斑花葉病毒，屬懸鉤子 病毒屬(^/a^ v/ra"，^"4i神z懸鉤子叢矮病毒；
屬黃矮病毒組(丄wfeov//^) ， ^^^;神大麥黃矮病毒；屬玉米雷 亞多非納病毒屬(Mflm/ v/r船)，^"式神.'玉米雷亞多非納病毒；屬馬鈴 薯X病毒組(尸otexWrMs) ， 馬鈴薯X病毒；屬南方菜豆花葉
病毒組(SWe附0v,V^力，模^神.'南方菜豆花葉病毒，屬細病毒組 (7>"肌>,>附)，^"4;神,禾舀條纟丈病毒，
屬煙草花葉病毒組(7^^附ov,'r附)，^^4神.'煙草花葉病毒，
屬煙草脆裂病毒組(r^mWr附)，^#4神煙草脆裂病毒，
屬蘋果退綠葉斑病毒屬(7Wc/^v/r附)，^"4神；蘋果褪綠葉斑病毒； 屬蕪菁黃化病毒組(7);mov/ws),模式神；蕪菁黃花葉病毒；屬傘形植 物病毒屬(t/附6rav/r^) ， 胡蘿卜斑點病毒；負ssRNA病毒目
單負病毒目(Mo朋/iegwV"/es)，科彈狀病毒科(/ /rfl6^w>,W"e)，屬 質型彈狀病毒屬(Q加r/^6flf6mW^) ， ^^4神萵苣壞死黃化病毒，屬 核型彈狀病毒屬(M/c'/ew/mM<m>"s) , ^^4神馬鈴薯黃矮病毒；
負ssRNA病毒科布尼亞病毒科CBwwjflv/nV/"e),屬蕃癡斑萎病
23毒屬(r仍/7ov/ms) ， ^"4'神蕃茄斑萎病毒；
dsRNA病毒科分體病毒科(i^r故/WnW^)，屬a潛隱病毒屬 (J//7A"co;/7tov/m:y)，模式'神白三葉草潛隱病毒1，屬|3潛隱病毒屬 (^""c/jptowVws),白三葉草潛隱病毒2，科呼腸病毒科 (/^。v,'nV/"e)，屬變濟病毒屬(/^7Wr"s)， ^"式'神.'變濟病病毒，屬 植物呼腸病毒屬(尸/^toreov/n^) ， ^"4神傷瘤病毒，屬矮縮病毒屬 (6^z"v/ms)，^^4神水稻草叢矮化病毒；
未分配的病毒基因組5^Z)A^:物種香蕉束狀頂病毒(banana bunchy top virus)，物種椰子葉衰敗病毒(coconut foliar decay virus),物種地 下三葉草矮病毒(subteiranean clover stunt vims ),
基因纟且AZ)A^，物種黃瓜^"黃4匕病毒(cucumber vein yellowing vims);基因組ffeJ 7V/4，物種煙草矮化病毒(tobacco stunt virus),
基因組m/ A^,物種Garlic病毒A、 B、 C、 D，物種葡萄斑點 病毒(grapevine fleck virus ),物種玉米白線花葉病毒(maize white line mosaic virus )，物種Wt潛伏性病毒2型(olive latent virus 2 )，物種 Ourmia甜瓜病毒(ourmia melon virus )，物種天竺葵帶狀斑點病毒 (Pelargonium zonate spot virus );
衛(wèi)星和類病毒衛(wèi)星ssRNA衛(wèi)星病毒亞逸2衛(wèi)星病毒，模式神 煙草壞死衛(wèi)星病毒(tobacco necrosis satellite )，
衛(wèi)星RNA,亞遂；2B婁附/ A^ JZ^，亞組3C型線性RNA衛(wèi)星， 4D型環(huán)形RNA衛(wèi)星，
類病毒，模4神.'馬鈴薯紡錘塊莖病類病毒(po似to 似6w v,V"cV/)。
不同RNA病毒具有 一種或多種病毒蛋白質用于細胞間或短距離移動。 例如,在TMV的情形中，需要一種蛋白質(MP);三聯(lián)雀麥花葉病4( BMV) 需要兩個蛋白質——3a和CP。單聯(lián)RNA病毒馬鈴薯X病毒(PVX )具 有負責細胞間移動的四種蛋白質由三基因區(qū)段(TGB)編碼的蛋白質和 外殼蛋白(CP)。但是缺乏細胞間移動所需的兩種或多種蛋白質中的一種
24足以阻斷病毒載體的有效短距離移動。就植物病毒移動蛋白的更多細節(jié)，
參見WJ Lucas近期的綜述(2006， K/n /o^y， 344:169-184)。
在本發(fā)明中，所述第一異源核苷酸序列具編碼所述RNA復制子的序 列區(qū)段。可選地，所述第一異源核苷酸序列具有一起編碼所述RNA復制 子的多于一個的序列區(qū)段，即，所述RNA復制子不是由一個連續(xù)DNA所 編碼的。相反，所述RNA復制子是由兩個或多個序列區(qū)段所不連續(xù)編碼 的，其中所述區(qū)段可以彼此鄰近存在。所述RNA復制子的形成隨后需要 所述區(qū)段的重排，例如通過重組。用于所述重組的重組酶可以由經(jīng)改造的 植物宿主提供，從而將所述病毒復制子的誘導型表達限制在能夠表達所述 重組酶的植物宿主中。例如，序列區(qū)段可以編碼所述RNA復制子的所述 聚合酶的一部分，并且編碼所述聚合酶的另 一部分的另 一序列區(qū)段可以以 相對于與第一序列區(qū)段而言被翻轉的方向存在于所述第一異源核苷酸序列 中。；陂翻轉部分側翼可以是重組位點(見WO2004/108934)。在該狀況中， 第一異源核苷酸序列或其序列區(qū)段的轉錄物將不是RNA復制子，因為從 轉錄物中沒有翻譯出功能性聚合酶。倘若識別重組位點的位點-特異性重組 酶允許翻轉所述區(qū)段之一，從而連續(xù)編碼復制子。在該實施方案中，提供 重組酶可以作用為開關來開啟RNA復制子形成以及在誘導的狀態(tài)中的目 的序列的表達，并且有助于高生物安全性。優(yōu)選地，所述重組酶受到誘導 型啟動子的控制。如果重組酶被用于開啟本發(fā)明的過程，可以向所述植物 或植物葉瞬時提供所述重組酶，其中所述提供可以作用為開關，用于表達 所述一種或多于一種的目的蛋白質。優(yōu)選地，這樣的重組酶可以在植物細 胞中被穩(wěn)定地編碼，并且重組酶的表達受到組成型或誘導型啟動子的控制。 通過誘導所述啟動子誘導重組酶表達隨后可以引起所述目的序列的表達。 在一個實施方案中，重組酶將由所述第一異源核苷酸序列所編碼，并且重 組酶的表達將受到所述第一異源核苷酸序列的誘導型啟動子的控制。
可選地，兩種區(qū)段可以都存在于穩(wěn)定摻入到不同的植物染色體中的不 同T-DNA上。RNA復制子的形成隨后需要兩個區(qū)段的轉錄以及兩個轉錄 物的反式-剪接，以用于裝配所述RNA復制子。這一實施方案可以用于在后代植物或細胞中快速分離一起編碼所述RNA復制子的區(qū)段，如 WO02/097080所述，從而有助于系統(tǒng)的生物安全性。
在實施例中，我們描述了編碼一種類型的來源于植物病毒的RNA復 制子的轉基因植物。但是，在本發(fā)明方法中，兩種或多種不同的RNA復 制子(特別是兩種或多種不同的單聯(lián)RNA復制子)可以用于轉基因植物 或植物細胞，其中此類不同的RNA復制子優(yōu)選來源于不同的植物病毒。 所述不同RNA復制子所來源的此類不同的植物病毒優(yōu)選是協(xié)同的或非竟 爭性病毒。"協(xié)同的，，和"非竟爭性，，在本文中同義使用。系統(tǒng)病毒可以共存 在并且在相同植物細胞中有效擴增。類似地，來自協(xié)同RNA病毒的RNA 復制子可以共存在并且在相同植物細胞中有效擴增。此類協(xié)同的RNA復 制子對的實例是一對RNA復制子，其中一個RNA復制子來源于TMV, 另一個RNA復制子來源于PVX。此類協(xié)同的RNA復制子可以從不同的 表達盒中被釋放，使用相同或不同的誘導型啟動子。在相同的植物細胞中， 協(xié)同的RNA復制子可以用于表達兩個或多個目的蛋白質或蛋白質亞基， 例如單克隆抗體的重鏈和輕鏈。使用不同(非竟爭性)病毒載體在相同植 物或在相同植物細胞中表達兩個或多個目的蛋白質的方法描述在WO 2006/79546 (PCT/EP2006/000721)中，其在本文以其全文引用作為參考。
在實施例中，我們在植物細胞中主要使用了農(nóng)桿菌介導的T-DNA遞 送，其中所述T-DNA包含所述第一和/或所述第二異源核苷酸序列?？梢?使用多種方法將載體遞送到植物細胞中，例如將異源核苷酸序列通過下述 方法直接引入到細胞中微粒轟擊、電穿孔或PEG-介導的原生質體轉化。 農(nóng)桿菌介導的植物轉化是優(yōu)選的。因此，可以通過多種技術將異源核苷酸 序列轉化到植物細胞中，例如通過農(nóng)桿菌(/^rW"cfen'M附)攜帶的Ti-質 粒載體(US5，591，616; US 4,940,838; US 5,464,763)、粒子或微粒轟擊(US 05100792; EP 00444882B1; EP 00434616B1)。原則上，其它植物轉4匕方 法也可以使用，例如顯微注射(WO 09209696; WO 09400583A1; EP 175966Bl)、電穿孔(EP00564595B1; EP00290395B1; WO 08706614A1) 等。轉化方法的選擇取決于待轉化的植物物種及其它。例如對于單子葉植物轉化，微粒轟擊可以是優(yōu)選的，而對于雙子葉植物，農(nóng)桿菌-介導的轉化 一般給出更優(yōu)結果。
本發(fā)明優(yōu)選用高等多細胞植物進行。用于本發(fā)明中的優(yōu)選的植物包括 優(yōu)先提供農(nóng)業(yè)經(jīng)濟和園藝重要物種的任何植物物種。用于本發(fā)明的常規(guī)作 物植物包括苜蓿、大麥、菜豆、卡諾拉油菜、豇豆、棉、谷類、三葉草、 蓮、兵豆、羽扇豆、黍、燕麥、豌豆、花生、稻、黑麥、草木樨、向日葵、 香豌豆、大豆、高粱、黑小麥、西印度豆薯、黎豆、野豌豆、小麥、紫藤
和堅果植物。優(yōu)選用于實踐本發(fā)明的植物物種包括但不限于禾本科 (Graminae)、菊科(Compositae )、癡科(Solanacea )和薔薇科(Rosaceae ) 的代表。此外用于本發(fā)明的優(yōu)選的物種，以及上文特定指出的那些植物來 自屬鼠耳芥屬(Arabidopsis )、剪股穎屬(Agrostis )、蔥屬(Allium)、 金魚草屬(Antirrhinum)、芽屬(Apium)、落花生屬(Arachis)、天門冬屬 (Asparagus)、顛癡屬(Atropa)、 燕麥屬(Avena)、 山白竹屬(Bambusa)、 蕓 苔屬(Brassica)、雀麥屬(Bromus)、 Browaalia、 山茶屬(Camellia)、 ；^J^屬 (Cannabis)、辣椒屬(Capsicum)、鷹嘴豆屬(Cicer)、 藜屬(Chenopodium)、 菊苣屬(Chichorium)、柑橘屬(Citrus)、咖啡屬(Coffea)、薏苡屬(Coix)、香 瓜屬(Cucumis)、 南瓜屬(Curcubita)、狗牙4艮屬(Cynodon)、鴨茅屬 (Dactylis)、曼陀羅屬(Datura)、胡蘿卜屬(Daucus)、毛地黃屬(Digitalis)、 薯蕷屬(Dioscorea)、油棕屬(Elaeis)、糝屬(Eleusine)、羊茅屬(Festuca)、草 莓屬(Fragaria)、老鸛草屬(Geranium)、大豆屬(Glycine)、向日葵屬 (Helianthus)、 Heterocallis、橡膠樹屬(Hevea)、大麥屬(Hordeum)、天仙子 屬(Hyoscyamus)、 番薯屬(Ipomoea)、 萵苣屬(Lactuca)、兵豆屬(Lens)、百 合屬(Lilium)、亞麻屬(Linum)、黑麥草屬(Lolium)、百樂M艮屬(Lotus)、番 癡屬(Lycopersicon)、 Majorana、蘋果屬(Malus)、 芒果屬(Mangifera)、木 薯屬(Manihot)、 苜蓿屬(Medicago)、 龍面花屬(Nemesia)、煙草屬 (Nicotiana)、驢食豆屬(Onobrychis)、稻屬(Oryza)、稷屬(Panicum)、天竺 葵屬(Pelargonium)、狼尾草屬(Pennisetum)、碧冬茄屬(Petunia)、豌豆屬 (Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、梯牧草屬(Phleum)、早熟禾屬(Poa)、李屬(Prunus)、 毛策屬(Ranunculus), 蘿卜屬(Raphanus)、 Ribes、 茶薦子屬 (Ricinus)、懸鉤子屬(Rubus)、甘蔗屬(Saccharum)、智利喇p八花屬 (Salpiglossis)、黑麥屬(Secale)、千里光屬(Senecio)、狗尾草屬(Setaria)、白 芥屬(Sinapis)、 癡屬(Solanum)、 蜀黍屬(Sorghum)、 鈍葉草屬 (Stenotaphrum)、可可樹屬(Theobroma)、車軸草屬(Trifolium)、胡盧巴屬 (Trigonella)、小麥屬(Triticum)、野豌豆屬(Vicia)、豇豆屬(Vigna)、葡萄 屬(Vitis)、玉蜀黍屬(Zea)、以及莪利竹族(Olyreae)、 Pharoideae和許多其 它。
在本發(fā)明的一個實施方案中，來自TMV的RNA復制子與煙草屬植物 使用。在另一個實施方案中，來自PVX的RNA復制子與煙草屬植物使用。
使用本發(fā)明可以以正義或反義方向表達的目的蛋白質或其片段包括淀 粉修飾酶(淀粉合酶、淀粉磷酸化酶、脫支酶、淀粉分支酶、淀粉分支酶 II、顆粒體結合的淀粉合酶)、蔗糖磷酸合酶、蔗糖磷酸化酶、多聚半乳 糖醛酸酶、多聚果聚糖蔗糖酶、腺苷二磷酸-葡糖焦磷酸化酶、環(huán)化糊精糖 基轉移酶、果糖基轉移酶、糖原合酶、果膠酯酶、抑酶肽、抗生物素蛋白、 細菌果聚糖蔗糖酶、大腸桿菌(E.co/Z)glgA蛋白、MAPK4和直向同源物、 氮同化/代謝酶、谷氨酰胺合酶、植物滲透蛋白、2S清蛋白、奇異果甜蛋白、 位點特異性重組酶/整合酶(FLP、 Cre、 R重組酶、Int、 SSVI整合酶R、 整合酶phiC31、或其活性片段或變體)、異戊烯基轉移酶、ScaM5(大豆 4丐調(diào)蛋白)、鞘翅類之昆蟲型毒素(cokopteran type toxin)或殺蟲活性的 片段、泛素綴合酶(E2)融合蛋白、代謝脂類、氨基酸、糖類、核酸和多糖 的酶、超氧化物岐化酶、蛋白酶的非活性酶原形式、植物蛋白毒素、在纖 維生產(chǎn)植物中改變纖維的性狀、來自蘇云金芽孢桿菌(5""7/附 ^"n'"g&"s/s)的鞘翅類之昆蟲活性毒素(Bt2毒素、殺蟲晶體蛋白(ICP)、 CryIC毒素、S內(nèi)毒素、多肽毒素、毒素原等)、昆蟲特異性毒素AaIT、 纖維素降解酶、來自解纖維熱酸菌(爿"V/w/^7mw"〃M/d'c'MS)的El纖維 素酶、木質素修飾酶、肉桂酰醇脫氫酶、海藻糖-6-磷酸合酶、細胞分裂素 代謝途徑的酶、HMG-CoA還原酶、大腸桿菌無機焦磷酸酶、種子貯存蛋白、草生歐文氏菌(￡>W"/ /^^/"/")番茄紅素合酶、ACC氧化酶、 pTOM36編碼的蛋白質、肌醇六磷酸酶、酮水解酶(ketohydrolase)、乙 酰乙酰輔酶A還原酶、PHB (聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutanoate))合 酶、酰基載體蛋白、油菜籽蛋白、EA9、非高等植物八氫番茄紅素合酶、 pTOM5編碼的蛋白質、ETR (乙烯受體)、質體丙酮酸磷酸雙激酶(plastidic pyruvate phosphate dikinase)、線蟲-誘導型跨膜孔蛋白、增強植物細胞 的光合或質體功能的性狀、芪合酶(stilbene synthase )，能夠羥基化酚類 的酶、兒茶酚雙加氧酶、兒茶酚2，3-雙加氧酶、氯l^康酸環(huán)化異構酶、鄰 M苯曱酸合酶、蕓苔屬AGL15蛋白、果糖1，6-二磷酸酶(FBPase)、 AMV RNA3、 PVY復制酶、PLRV復制酶、馬鈴薯Y病毒組外殼蛋白、CMV 外殼蛋白、TMV外殼蛋白、黃矮病毒組復制酶、MDMV信使RNA、 突 變雙粒病毒組復制酶、加州月桂(C/附Z^〃w/fl"'fl cfl/,ybr"/M ) C12:0優(yōu)選的 ?；?ACP硫酯酶、植物C10或C12:0優(yōu)選的?；?ACP硫酯酶、C14:0優(yōu) 選的?；?ACP硫酯酶(luxD)、植物合酶因子A、植物合酶因子B、 6-去飽 和酶、在植物細胞中脂肪酸的過氧化物酶體(peroxysomal)-氧化中具有 酶促活性的蛋白質、酰基輔酶A氧化酶、3-酮脂酰輔酶A硫解酶、脂肪酶、 玉米乙酰輔酶A羧化酶、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶 (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) (EPSP)、膦絲菌素乙?；D 移酶(BAR、 PAT)、 CP4蛋白、ACC脫氨酶、核酶、具有翻譯后切割位 點的蛋白質、由Gal4轉錄激活子的DNA結合結構域和轉錄激活結構域組 成的蛋白質融合、能夠將融合蛋白靶向到脂相的油質蛋白與目的蛋白質的 翻譯融合、賦予氨磺?？剐缘腄HPS基因、細菌腈水解酶、2，4-D單加氧 酶、乙酰乳酸合酶或乙酰羥酸合酶(ALS、 AHAS)、多聚半乳糖醛酸酶、細 菌腈水解酶、位于質體的內(nèi)包膜的成熟磷酸易位蛋白的氨基末端疏水區(qū)域 與待靶向到所述膜中的目的蛋白質的融合等。
可以使用本發(fā)明的系統(tǒng)表達任何人或動物蛋白質。此類目的蛋白質的 實例包括下述蛋白質(藥物蛋白質)等免疫應答蛋白(單克隆抗體、單 鏈抗體、T細胞受體等)、抗原、集落刺激因子、松弛素、多肽激素、細胞因子及其受體、干擾素、生長因子和凝固因子、酶促活性的溶酶體酶、
纖維蛋白溶酶多肽、凝血因子、胰蛋白酶原、l-抗胰蛋白酶(AAT)，以 及功能性保守的蛋白質例如上述蛋白質融合體(fusion)、突變形式和合 成衍生物。
本專利申請要求優(yōu)先權的在2006年5月29日提交的歐洲專利申請No. 06 011 002和2006年6月2日提交的美國臨時專利申請60/810,398的公開 內(nèi)容在本文以其全文引入作為參考。
實施例 實施例1
/尸rG-謬尋型/w-系鍵溝^^謬設 V"
4吏用引物laclprl (SEQ ID NO: 1) (5，-gat cca tgg aac cag taa cgt tat ac-3，)和laclpr2 (SEQ ID NO: 2) (5，- tc tgg ate etc act gec cgc ttt cca gtc g —3，)通過PCR擴增lac阻抑物(lacl， Acc. J01636 ),并將其作為NcoI-BamHI 片段克隆進標準二元載體pICBVl中，產(chǎn)生構建體pICH17155 (圖2A)。 通過使用引物laclpr5 (SEQ ID NO: 3) (5,- cgc cat ggg ccc taa gaa gaa gag gaa ggt tga acc agt aac gtt ata cga tgt c -3')替代laclprl將核定位信號 (NLS)引入N-末端，給出構建體pICH17401 (圖2A)。將這一構建體穩(wěn) 定轉化到煙草和本生煙才直物中，使用標準的轉化才支術(Horsh等人，1985, Sc/e證，巫1229-1231)。
將合成的lac操縱基因序列(SEQ ID NO: 4) (aat tgt gag cgc tea caa tt) 引入一些病毒載體的TATA-框和肌動蛋白2-啟動子的轉錄起始之間(An 等人，1996， P/aw,/.， 107-121)。這是通過將兩個重疊的PCR-產(chǎn)物組合 進行的，所述PCR-產(chǎn)物是用引物A: brb4nosph (SEQ ID NO: 5) (5，- gga acc ctg tgg ttg gca cat -3，)和lacOact2pr2 (SEQ ID NO: 6) (5，- cga att gtg age get cac aat tta tat agg egg gtt tat etc -3，)和引物B: lacOactprl (SEQ ID NO: 7) (5，- taa att gtg age get cac aat teg ctt tga agt ttt agt ttt att g —3')和 rdrppr4 (SEQ ID NO: 8) (5，- ttt ctgcag gaa atg aaa ggc cgc gaa aca ag -3，)來制備的。將得到的產(chǎn)物作為Kpnl-Sphl片段克隆到病毒載體pICH16141 中，得到載體pICH17171。其它病毒載體是通過使用方便的限制性酶亞克 隆啟動子而源自pICH17171的。這些載體被優(yōu)化用于表達(MarilIonnet等 人，2005， AW肌ofec/mo/.， 2:718-723)，并且包含完全的MP (pICH18867) 或MP的缺失(pICH17171)。此外，構建了 5'-前載體(pICH17424) (Marillonnet等人，2004，尸 c 7V""巡:6852-6857)，其被證 明對于瞬時測試是有用的(見實施例2)。 實施例2
瞬時系統(tǒng)中阻抑效率的測試
在測試中使用具有不同構建體的農(nóng)桿菌菌林混合物進行瞬時表達實 驗。我們在瞬時測定中使用完整裝配的病毒載體時不能觀察到任何阻抑。 最有可能地，構建體在阻抑物翻譯前已經(jīng)被轉錄為病毒RNA復制子。因 此，我們使用病毒前載體pICH17424 (圖2A)和pICH6892 (Marillonnet等 人，2004，尸rw 7Vfl"/k"d5W f/S!￡1:6852-6857)，它們在植物中通過位點 特異性重組酶的活性被裝配成為病毒RNA復制子的DNA前體 (Marillonnet等人，2004， A^/爿ow/S"' fASv4，巡:6852-6857)。這一額 外步驟將延遲病毒載體的裝配并且為阻抑物被翻譯并且結合到病毒構建體 中的操縱基因序列提供了足夠的時間。事實上，使用這一方法，我們可以 看到病毒擴增的強阻抑(圖3)。
實施例3
在穩(wěn)定轉化的植物中的lacl阻抑物活性以及通過IPTG的誘導 使用標準轉化技術，在煙草和本生煙植物中穩(wěn)定轉化阻抑物構建體 pICH17401 (圖2A) (Horsh等人，1985， S"Wice， ^ 1229-1231)。通過用包 含lacO的病毒構建體進行經(jīng)轉化植物的農(nóng)桿菌浸潤來證明阻抑物活性(圖 4A)。通過用相同構建體并且在浸潤緩沖液中包括IPTG的農(nóng)桿菌浸潤類 似地測試i秀導性(圖4B)。 實施例4
用病毒構建體再次轉化包含阻抑物的植物
31攜帶在其基因組中穩(wěn)定整合的lacl-阻抑物重組DNA(pICH17401，圖 2A )的煙草植物用包含lac操縱基因的完整的病毒載體構建體(pICH18867， 圖2A)第二次進行轉化?？梢栽偕恍┲参铮撬鼈?nèi)慷硷@示出或多 或少的病毒載體的嚴重背景表達。
將IPTG(5mM)浸潤到雙轉化體的葉中可以實際上在一些轉基因植物 中誘導RNA復制子的擴增(圖5)。但是，我們發(fā)現(xiàn)，具有RNA復制子 的滲漏表達的所有初級轉化體都最終將被轉基因沉默并且產(chǎn)生在誘導條件 下不顯示任何RNA復制子釋放的后代。
實施例5
用于乙醇誘導型系統(tǒng)的構建體的設計
乙醇誘導型系統(tǒng)的原理由Caddick和其同事所描述(1998， 7VW 肌Wec/mo/., 1^:177-180 )。如Caddick和其同事所描述的(1998， 7Vflf 5/Wed^0/., 1^:177-180)，設計受到CaMV 35S啟動子控制的轉錄激活子 alcR (構建體pICH18693,圖2B )。這一構建體被穩(wěn)定轉化到煙草和本生 煙植物中(Horsh等人，1985，Sd^ice， ^ 1229-1231 )。通過PCR4吏用 引物alcAprl (SEQ ID NO: 9) (5,畫cat gaa ttc tag gat tgg atg cat gcg g —3，) 和alcApr2 (SEQ ID NO: 10) (5，- cag etc gag gtc gtc etc tec aaa tga aat g -3，)擴增alcA啟動子，并且將其作為EcoRI-Xhol片段與基于TMV的病 毒載體相融合(所述病毒載體具有功能性MP(pICH18969,圖2B)或不具有 功能性MP (pICH18951，圖2B))，以及獨立地與功能性病毒MP (pICH19940，圖2B)相融合。此外，將構建體plCH18951和pICH19940 組合到一個栽體(pICH20592,圖2B)中。除了 pICH18969外的所有這 些構建體被轉化到煙草和本生煙中，使用標準轉化技術。不能獲得這樣的 初級轉化體，其具有編碼有功能性MP的RNA復制子的構建體。
還4吏用引物alcApr4 (SEQ ID NO: 11) (5，- cgc gca tgc tac tag gat tgg ata cat gcg gaa c —3')和alcApr5 (SEQ ID NO: 12) (5，- ttt ggt etc ate aac tec aaatgaaatgaacttcc-3，)擴增alcA啟動子，并將其作為Sphl-Bsal片段克 隆到基于PVX的病毒載體pICH25233中，替換35S啟動子并且給出構建體pICH26022(圖2C)。 alcA啟動子與參與細胞間移動的PVX外殼蛋白的 融合(pICH26356，圖2C )是通過將來自pICH19940的EcoRl-SacI片段 克隆到pICH22066中所進行的。 實施例6
由乙醇誘導的TMV-構建體的瞬時表達
在本生煙植物中通過農(nóng)桿菌浸潤測試上述構建體(圖6 )。在浸潤后2 天用4%乙醇溶液或用水(作為對照)處理植物。病毒載體的擴增和GFP 的表達僅在乙醇處理的植物中并且僅在激活子alcR存在時被誘導。在alcR 存在時在對照植物中觀察到非常弱的背景表達。
實施例7
由乙醇誘導的PVX-構建體的瞬時表達
將alcA-CP構建體(plCH26356 )與alcR ( pICH18693 )和CP-缺乏 的病毒載體(pICH21692)共浸潤。僅在用乙醇處理的植物上可以檢測到 細胞間移動，對于35S啟動子-CP構建體不能觀察到差異(圖7)。
實施例8
用病毒構建體/7/C77/"5/和穩(wěn)定轉化的植物的分析 根據(jù)標準方案轉化本生煙和煙草植物(Horsh等人，1985， 5Wew"， 227, 1229-1231 )。通過用alcR構建體(pICH18693 )的農(nóng)桿菌浸潤和乙 醇處理，就轉基因的存在分析再生的植物。事實上，大多數(shù)植物在葉的浸 潤部分中顯示出GFP-表達，并且在其它部分中沒有背景。 實施例9
整林轉基因植物的誘導
將包含pICH18951或pICH20592的轉基因植物(在實施例8中描述 的)與包含轉錄激活子alcR (pICH18693 )的那些雜交。通過用4%乙醇 噴霧或者通過根浸泡(用1%乙醇)和噴霧(4%乙醇)的組合來用乙醇處 理那些植物的Fl后代。在這些才直物的幾乎全部部分中檢測到病毒擴增以 及因此的GFP-表達(圖9)。最特別地，還在用根浸泡處理的那些植物的 莖和葉柄中檢測到強表達。植物的這些部分通常不顯示或僅顯示微弱的表
33達，這使用標準的放大方法，即整林植物的真空-浸潤(Marillonnet等人， 2005， AW. ^Wec/i"o/.， ^:718-723)。用4%乙醇噴霧植物而不用根浸泡導 致GFP僅在軟的葉組織中表達，而不再莖和葉柄中表達(圖10)。 實施例10
誘導型病毒載體系統(tǒng)用于在植物中表達重組擬酶肽的用途 以與質粒pICH20592 (見實施例5 )類似的方式設計質粒pICH25408 (圖11)。根據(jù)標準方案用pICH25408轉化本生煙植物(Horsh等人，1985， ^/e"", 1229-1231 )。通過用alcR構建體(pICH18693 )的農(nóng)桿菌
浸潤和乙醇處理隨后通過用聚丙烯酰胺凝膠(PAAG)電泳進行重組蛋白 質的表達分析，就轉基因的存在分析再生的植物。用alcR構建體 (pICH18693)農(nóng)桿菌浸潤以及用乙醇處理的葉組織的部分被用于總可溶 性蛋白質提取，這通過2xLaemmli緩沖液(125 mM tris-HCl， pH 7.8， 10%-巰基乙醇，20%甘油，0.001%溴酚藍，10% SDS)，然后通過在PAAG 中電泳分離。就不同初級轉化體的此類分析的結果顯示在圖12中。
在下一步中，將用pICH25408轉化的植物與攜帶alcR基因 (pICH18693)的植物雜交。將從用乙醇處理后的Fl后代的葉組織中分離的 總可溶性蛋白質在PAAG上進行分析。分析結果顯示在圖13中。很明顯 擬酶肽高水平表達(大約lmg/g的新鮮葉生物質)。
權利要求
1. 產(chǎn)生一種或多于一種的目的蛋白質的方法，其包括(a)提供植物或植物細胞，其包含(i)第一異源核苷酸序列，其包含編碼RNA復制子的核苷酸序列，以及與所述編碼所述RNA復制子的核苷酸序列有效相連的第一誘導型啟動子；所述RNA復制子不編碼這樣的蛋白質，所述蛋白質在所述植物中提供了所述RNA復制子的細胞間的移動；所述RNA復制子編碼用于復制所述RNA復制子的聚合酶和所述一種或多于一種的目的蛋白質；以及(ii)包含編碼蛋白質的序列的第二異源核苷酸序列，所述蛋白質使得所述RNA復制子能夠細胞間移動，其中所述第二異源核苷酸序列包含第二誘導型啟動子，所述啟動子與編碼使得所述RNA復制子能夠細胞間移動的所述蛋白質的所述序列有效連接；以及(b)在步驟(a)的所述植物或植物細胞中分別誘導所述第一和所述第二誘導型啟動子，從而在所述植物中或在所述植物細胞中產(chǎn)生所述一種或多于一種的目的蛋白質。
2. 根據(jù)權利要求l的方法，其中所述第一和所述第二誘導型啟動子是 由相同的誘導信號誘導的。
3. 根據(jù)權利要求1或2的方法，其中所述第一或所述第二誘導型啟動 子是化學誘導型啟動子。
4. 根據(jù)權利要求3的方法，其中所述化學誘導型啟動子選自乙醇-誘導 型啟動子、IPTG-誘導型啟動子和四環(huán)素-誘導型啟動子。
5. 根據(jù)權利要求1至4的任一項的方法，其中所述誘導型啟動子是熱 激誘導型啟動子。
6. 根據(jù)權利要求1至5中任一項的方法，其中所述RNA復制子來源自正義單鏈RNA病毒。
7. 根據(jù)權利要求6的方法，其中所述正義單鏈RNA病毒是煙草花葉 病毒或馬鈴薯X病毒。
8. 根據(jù)權利要求1至7中任一項的方法，其中所述植物包含第三異源 核苷酸序列，所述第三異源核苷酸序列包含編碼另一 RNA復制子的核苷 酸序列以及與編碼所述另一 RNA復制子的所述序列有效連接的第三誘導 型啟動子，所述另一 RNA復制子不編碼在所述植物中提供所述RNA復制 子或所述另一 RNA復制子的細胞間移動的蛋白質，所述另一 RNA復制子 編碼目的蛋白質。
9. 根據(jù)權利要求8的方法，其中所述植物包含異源核苷酸序列，所述 異源核苷酸序列包含編碼使得所述另一 RNA復制子能夠細胞間移動的蛋 白質的核苷酸序列，其與編碼佳:得所述RNA復制子能夠細胞間移動的所 述蛋白質的核苷酸序列有效連接。
10. 根據(jù)權利要求9的方法，其中使得所述RNA復制子能夠細胞間移 動的所述蛋白質和使得所述另一 RNA復制子能夠細胞間移動的所述蛋白 質是相同的蛋白質或不同的蛋白質。
11. 根據(jù)權利要求8的方法，所述另一復制子編碼用于復制所述另一 RNA復制子的聚合酶。
12. 根據(jù)權利要求8至11中任一項的方法，其中所述第三誘導型啟動 子是由與所述第 一誘導型啟動子相同的誘導劑所誘導的。
13. 根據(jù)權利要求8至12中任一項的方法，其中所述RNA復制子和 所述另一 RNA復制子是非竟爭性復制子。
14. 根據(jù)權利要求13的方法，其中所述非竟爭性復制子是來源自不同 病毒屬的植物病毒的植物病毒復制子。
15. 根據(jù)權利要求1至14中任一項的方法，其中步驟(a)包括從種 子生長植物，所述種子包含所述第一異源核苷酸序列以及任選地所述第二 和/或第三異源核苷酸序列。
16. 植物或植物細胞，其包含在核染色體中第一異源核苷酸序列，所述異源核苷酸序列包含編碼RNA復制子的核苷酸序列和與編碼所述RNA復制子的所述核苷酸序列有 效連接的第一誘導型啟動子；所述RNA復制子不編碼在所述植物中提供所述RNA復制子的細胞間 移動的蛋白質；所述RNA復制子編碼用于復制所述RNA復制子的聚合酶。
17. 植物或才直物細力包，其包含(i) 在核染色體中第一異源核苦酸序列，所述異源核苷酸序列包含編 碼RNA復制子的核苷酸序列和與編碼所述RIN A復制子的所述核苷酸序列 有效連接的第一i秀導型啟動子；所述RNA復制子不編碼在所述植物中提供所述RNA復制子的細胞間 移動的蛋白質；所述RNA復制子編碼用于復制所述RNA復制子的聚合酶；以及(ii) 包含編碼蛋白質的核苷酸序列的第二異源核苷酸序列，所述蛋白 質使得所述RNA復制子能夠細胞間移動，其中所述第二異源核苷酸序列 包含第二誘導型啟動子，所述啟動子與編碼使得所述RNA復制子能夠細 胞間移動的所述蛋白質的所述核苷酸序列有效連接。
18. 根據(jù)權利要求16或17的植物或植物細胞，其屬于煙草屬 (Nicotiana )。
19. 產(chǎn)生在權利要求17中定義的植物或植物細胞的方法，其包括向植 物核染色體中引入權利要求17中定義的第一異源核苷^列以及如權利 要求17中定義的第二異源核苷*列，并且再生包含所述第一和所述第二 異源核苷酸序列的經(jīng)轉化的植物。
20. 產(chǎn)生如權利要求8中所定義的植物或植物細胞的方法，其包括將 包含所述第 一異源核苷酸序列以及任選地所述第二異源核苷酸序列的第一 植物與包含所述第三異源核苷酸序列的第二植物雜交。
全文摘要
產(chǎn)生一種或多于一種目的蛋白質的方法，其包括(a)提供植物或植物細胞，其包含包含編碼RNA復制子的核苷酸序列，以及與所述編碼所述RNA復制子的核苷酸序列有效相連的第一誘導型啟動子的第一異源核苷酸序列；所述RNA復制子不編碼這樣的蛋白質，所述蛋白質在所述植物中提供了所述RNA復制子的細胞間的移動；所述RNA復制子編碼聚合酶和所述一種或多于一種的目的蛋白質，所述聚合酶能被改造用于復制所述RNA復制子；以及(b)在步驟(a)的所述植物或植物細胞中誘導所述誘導型啟動子，從而在所述植物或植物細胞中產(chǎn)生所述一種或多于一種的目的蛋白質。
文檔編號C12N15/82GK101454456SQ200780019567
公開日2009年6月10日 申請日期2007年5月25日 優(yōu)先權日2006年5月29日
發(fā)明者S·維爾納, S·馬里約內(nèi), V·克利姆克, Y·格萊巴 申請人:愛康遺傳有限公司