專利名稱：提高木聚糖酶嗜熱性、熱穩(wěn)定性和嗜堿性的修飾的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含位于位置99和118的半胱氨酸殘基以形成分子內(nèi)二硫鍵的修飾的木聚糖酶，該木聚糖酶是通過(guò)用半胱氨酸置換位于位置99和/或118的氨基酸產(chǎn)生的。通過(guò)將所述修飾的木聚糖酶與SEQ ID NO16中定義的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)確定氨基酸置換的位置。所述修飾的木聚糖酶呈現(xiàn)嗜熱性、嗜堿性、熱穩(wěn)定性或具有以上性質(zhì)的組合。
所述修飾的木聚糖酶可以來(lái)自于家族11木聚糖酶，包括但不限于里氏木霉木聚糖酶。所述修飾的木聚糖酶優(yōu)選地不是天然的曲霉(Aspergillus)木聚糖酶。
本發(fā)明還提供了如上述的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置40的置換氨基酸殘基。所述位于位置40的置換氨基酸選自于His、Cys、Phe、Lys、Tyr和Arg。在一個(gè)具體的實(shí)例中，所述位于位置40的置換氨基酸為包括但不限于His的堿性氨基酸。
本發(fā)明還涉及這樣的修飾的木聚糖酶，其包含位于位置99和158的半胱氨酸殘基并且還包含位于位置58的置換氨基酸，包括但不限于堿性氨基酸(例如Arg)。另外，上述的修飾的木聚糖酶還可以包含位于位置10的堿性置換氨基酸、位于位置27的疏水性置換氨基酸及位于位置29的疏水性置換氨基酸。所述位于位置10的堿性置換氨基酸可以是His、所述位于位置27的疏水性置換氨基酸是Met并且所述位于位置29的疏水性置換氨基酸是Leu(HML)。除了這些突變之外，所述修飾的木聚糖酶還可以包含位于位置75的非極性置換氨基酸、位于位置105的堿性置換氨基酸、位于位置125的非極性置換氨基酸及位于位置129的酸性氨基酸。所述位于位置75的非極性氨基酸可以是Ala、所述位于位置105的堿性氨基酸是His、所述位于位置125的非極性氨基酸可以是Ala并且所述位于位置129的酸性氨基酸可以是Glu。所述修飾的木聚糖酶還可以包含位于位置11的酸性氨基酸例如Asp。除了位于位置11的突變之外，所述修飾的木聚糖酶還可以包含位于位置131的變成Asn的突變。
本發(fā)明還包括這樣的修飾的木聚糖酶，其包含位于位置99和118的半胱氨酸殘基并且還包含位于位置40和58的堿性氨基酸。所述修飾的木聚糖酶還可以包含位于位置10的堿性置換氨基酸、位于位置27的疏水性置換氨基酸及位于位置29的疏水性置換氨基酸。所述位于位置10的堿性置換氨基酸可以是His、所述位于位置27的疏水性置換氨基酸可以是Met并且所述位于位置29的疏水性置換氨基酸可以是Leu(HML)。除了這些突變之外，上述修飾的木聚糖酶還可以包含位于位置75的非極性置換氨基酸包括但不限于Ala；位于位置105的堿性置換氨基酸包括但不限于His；位于位置125的非極性置換氨基酸包括但不限于Ala；以及位于位置129的酸性氨基酸包括但不限于Glu。所述修飾的木聚糖酶還可以包含位于位置11的酸性置換氨基酸包括但不限于Asp；以及任選的位于位置131的Asn。上述修飾的木聚糖酶還可以包含位于位置52的置換氨基酸包括但不限于Cys。另外，所述修飾的木聚糖酶還可以包含位于位置144和161的堿性置換氨基酸包括但不限于Arg殘基。
本發(fā)明還涉及這樣的修飾的木聚糖酶，其包含在位于位置99和118的置換氨基酸殘基并且具有介于約65℃和約85℃之間的最高有效溫度(MET)或者介于具有約pH6.5和約pH8.0之間的最大有效pH(MEP)。
本發(fā)明還涉及選自于以下的修飾的木聚糖酶
包含位于位置99和118的半胱氨酸的本發(fā)明的木聚糖酶與野生型木聚糖酶相比顯示出了改良的嗜熱性、嗜堿性或熱穩(wěn)定性。這樣的木聚糖酶可用于需要在高于天然酶的溫度和/或pH值的溫度和/或pH值下的酶活性的多種工業(yè)應(yīng)用中。例如，如本文所述的修飾的木聚糖酶可用于下列目的漂白紙漿、改良家禽和豬飼料的可消化性或者處理精密儀器。
本發(fā)明還涉及包含位于位置40的置換氨基酸的修飾的木聚糖酶，該位置是通過(guò)將修飾的木聚糖酶與SEQ ID NO16中定義的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)確定的。以上定義的修飾的木聚糖酶還可以包含具有一個(gè)10-24個(gè)氨基酸的環(huán)的分子內(nèi)二硫鍵?？梢酝ㄟ^(guò)用半胱氨酸置換位于位置99和/或118的氨基酸產(chǎn)生該分子內(nèi)二硫鍵。所述位于位置40的氨基酸置換優(yōu)選地是堿性氨基酸包括但不限于His。
本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容無(wú)須描述本發(fā)明的所有必要特征，而且本發(fā)明還可以是屬于所述特征的亞組合。



本發(fā)明的這些特征和其他特征通過(guò)下文的描述將更加顯而易見(jiàn)，在下文中參考了附圖，其中 圖1示出了家族11木聚糖酶的氨基酸序列比對(duì)。在序列上方標(biāo)出的氨基酸編號(hào)對(duì)應(yīng)于里氏木霉木聚糖酶II(Tr2，本文也稱為T(mén)rX II)。在位于位置99和118(相對(duì)于Tr2)的殘基為斜體字并用星號(hào)標(biāo)示。至少75％的所列出的家族11木聚糖酶共有的氨基酸以黑體字標(biāo)示。所有家族11木聚糖酶都共有的殘基以下劃線標(biāo)示。對(duì)于有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的木聚糖酶，僅顯示催化核心序列。
圖2示出了TrX木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ ID NO40)，以及用于構(gòu)建質(zhì)粒pTrX中的編碼里氏木霉木聚糖酶II(TrX)的序列的合成寡核苷酸TrX(1-91)和TrX(92-190)(SEQ ID NO61-64)。
圖3示出了與TrX相比，在pH5.0下孵育30分鐘期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-99C、TrX-58R、TrX-40H、TrX-118C、TrX-99C-118C、TrX-58-99C-118C、TrX-40H-99C-118C和TrX-40H-58R-99C-118C的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)于在40℃下觀測(cè)的活性進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。
圖4示出了與TrX相比，在pH5.0下孵育30分鐘期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-99C-118C、TrX-58R-99C-118C、TrX-40H-99C-118C和TrX-40H-58R-99C-118C的酶活性的作用。數(shù)據(jù)基于圖3的數(shù)據(jù)，但相對(duì)于最適溫度下觀測(cè)的活性進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。
圖5示出了與已知木聚糖酶TrX、TrX-10H-27M-29L和TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E相比，在pH5.0下孵育30分鐘期間(除非另外指出)，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-118C、TrX-99C-118C、TrX-40H-58R-99C-118C和TrX-10H-27M-29L-40R-58R-99C-118C的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)于最適溫度下觀測(cè)的活性進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。
圖6示出了與已知木聚糖酶TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E相比，在pH5.5下孵育30分鐘期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-10H-27M-29L-40R-58R-99C-118C、TrX-10H-27M-29L-40R-58R-75A-99C-118C、TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E、TrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E、TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E、TrX-10H-11D-27M-29L-40H-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E和TrX-10H-11D-27M-29L-40H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)于最適溫度下觀測(cè)的活性進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。
圖7示出了在pH5.5下孵育30分鐘期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E和TrX-10H-11D-27M-29L-40X-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(其中X為T(mén)、C、F、Y、R和H)的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)于最適溫度下觀測(cè)的活性進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。
圖8示出了與已知木聚糖酶TrX、TrX-10H-27M-29L和TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E(pH5.5)相比，在pH5.5下孵育30分鐘期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E、TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E、TrX-10H-11D-27M-29L-40H-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E和TrX-10H-11D-27M-29L-40H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)于在40℃下觀測(cè)的活性進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。
圖9示出了與已知木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-75A-105H-118C-125A-129E-144R-161R(pH6)相比，在孵育30分鐘期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R-161R(pH6.5)的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)于最適溫度下觀測(cè)的活性進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。
圖10示出了與天然TrX和已知木聚糖酶TrX-118C相比，在pH4.5-7.5和55℃下孵育30分鐘期間，pH對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-99C和TrX-99C-118C的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)于在最適pH下觀測(cè)的每種酶的活性進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。
圖11示出了與已知木聚糖酶TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E相比，在pH5.0-8.0和65℃下孵育30分鐘期間，pH對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E、TrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E、TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E和TrX-10H-11D-27M-29L-40H-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)于在最佳pH下觀測(cè)的每種酶的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖12示出了與已知木聚糖酶TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E、TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E-144R-161R和TrX-10H-11D-27M-29L-75A-105H-116G-118C-125A-129E-144R-161R相比，在pH5.0-8.0和65℃下孵育30分鐘期間，pH對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R-161R的酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)于在最適pH下觀測(cè)的每種酶的活性進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。
圖13示出了與天然木聚糖酶TrX相比，在48℃、52℃、56℃和60℃及無(wú)任何可溶的木聚糖底物的情況下孵育30分鐘期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-99C-118C的殘余酶活性的作用。數(shù)據(jù)相對(duì)于在48℃下預(yù)孵育之后在室溫下觀測(cè)的活性進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。
圖14示出了在pH7下持續(xù)60分鐘期間，溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N和TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E作用于1％小麥阿拉伯木聚糖底物的最大木糖釋放的百分?jǐn)?shù)的影響。
圖15示出了在70℃下持續(xù)60分鐘期間，pH對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N和TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E作用于硬木紙漿(稠度為10％)的最大木糖釋放的百分?jǐn)?shù)的影響。
圖16示出了在70℃下持續(xù)60分鐘期間，pH對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N和TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E作用于軟木紙漿(稠度為10％)的最大木糖釋放的百分?jǐn)?shù)的影響。
圖17示出了在50℃、60℃、70℃和80℃下孵育30分鐘之后，預(yù)孵育溫度對(duì)修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E、TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125E-131N和TrX-10H-27M-29L的相對(duì)殘余活性(％)的影響。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明涉及修飾的木聚糖酶。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及在高溫和pH的條件下具有改良的性能并且在高溫下具有改良的穩(wěn)定性的修飾的木聚糖酶。
以下描述的是(僅通過(guò)實(shí)例的方式)優(yōu)選的實(shí)施方案，而不是對(duì)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明效果的必要特征組合的限定。
木聚糖酶促進(jìn)紙漿漂白的機(jī)制還未完全明了。不希望拘囿于理論，已有觀點(diǎn)認(rèn)為有色的木質(zhì)素通過(guò)木聚糖與晶體狀纖維素相連接，木聚糖酶通過(guò)水解木聚糖而促進(jìn)紙漿的漂白，釋放紙漿中的有色木質(zhì)素。本文給出的修飾的木聚糖酶可用于漂白紙漿或者用于需要在超過(guò)野生型酶的溫度和pH值的溫度和pH值下具有活性的其他應(yīng)用。對(duì)于紙漿的生物漂白，優(yōu)選的木聚糖酶衍生自分類至家族11的木聚糖酶(見(jiàn)表1)。
家族11木聚糖酶是一組分子量相對(duì)低的小型酶(大約20kDa且約200個(gè)氨基酸殘基)。家族11木聚糖酶的小尺寸使其可以迅速穿透紙漿塊。家族11木聚糖酶的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們沒(méi)有纖維素酶活性。迄今為止鑒定的大多數(shù)家族11木聚糖酶都是嗜中溫的并且具有較小的分子量(20kDa)。然而，該家族也包括至少3種較大分子量的熱穩(wěn)定的木聚糖酶296個(gè)氨基酸且分子量大約32kDa的褐色高溫單孢菌(Thermomonospora fusca)木聚糖酶A(TfX-A)(Irwin et al.，1994；WO 95/12668，兩者都通過(guò)引用的方式納入本文)、194個(gè)氨基酸且分子量大約22kDa的嗜熱真菌(Thermomyceslanuginosus)木聚糖酶(Tln)(Gruber et al.，1998，它通過(guò)引用的方式納入本文)及511個(gè)氨基酸且分子量大約56kDa的糞堆梭菌(Clostridiumstercorarium)木聚糖酶A。糞堆梭菌木聚糖酶A在70℃的溫度下呈現(xiàn)最大活性(Sakka et al.，1993，它通過(guò)引用的方式納入本文)。
某些大型熱穩(wěn)定的家族11木聚糖酶與小型嗜中溫酶的不同之處是在酶的延伸C末端具有疏水性的纖維素結(jié)合域(CBD)。TfX-A酶由所有家族11木聚糖酶共有的189個(gè)殘基的催化核心序列及107個(gè)殘基的纖維素結(jié)合域組成。更大的糞堆梭菌木聚糖酶A具有2個(gè)拷貝的纖維素結(jié)合域。
若(a)蛋白具有水解木聚糖聚合物主鏈中相鄰木糖殘基之間的內(nèi)部β-1，4糖苷鍵的能力，并且(b)它具有與家族11木聚糖酶相關(guān)的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，則該蛋白被分類為家族11木聚糖酶。源自細(xì)菌和真菌的所有家族11木聚糖酶共享主要包含β折疊、轉(zhuǎn)角和單個(gè)α螺旋的相同的通用分子結(jié)構(gòu)。對(duì)82種家族11木聚糖酶的氨基酸序列的比對(duì)鑒定出了在α螺旋及β帶(beta strand)B5、B6和B8中高度保守的特征序列(Sapag et al.，2002)，所述木聚糖酶的氨基酸序列的長(zhǎng)度在173-220個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)并且具有寬范圍的等電點(diǎn)(pi 3.5-10.25)、最適pH值(2.0-8.0)及最適溫度(45℃-75℃)。再者，家族11木聚糖酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)是高度保守的。使用來(lái)自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)對(duì)10種具有31-97％同一性的家族11木聚糖酶C-α原子的兩兩比較表明它們的均方根偏差(rmsd)為0.6-1.4□(Hakulinen et al.2003；它通過(guò)引用的方式納入本文)。該偏差水平在大多數(shù)X-射線晶體結(jié)構(gòu)的典型分辨率內(nèi)。再者，所有家族11木聚糖酶均包含位于位置86和177的兩個(gè)保守谷氨酸殘基(參見(jiàn)圖1；基于里氏木霉木聚糖酶II(TrX II或Tr2)氨基酸編號(hào))，它們位于β折疊B4和B5(Torronen& Rouvinen，1995；Sapag et al.，2002，它們都通過(guò)引用的方式納入本文)。
因此，家族11木聚糖酶可以被定義為在每個(gè)β折疊B5、B6、B8及α螺旋內(nèi)包含80-100％或中間的任意量、90-100％或中間的任意量、95-100％或中間的任意量，或者約80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100％的序列同一性。家族11木聚糖酶還可以被定義為包含的位于位置86和177的谷氨酸，所述位置編號(hào)基于TrX II氨基酸編號(hào)(參見(jiàn)圖1)。
給定家族11木聚糖酶中的高度保守結(jié)構(gòu)，本領(lǐng)域技術(shù)人員就可以運(yùn)用已知的方法(包括本文給出的方法)提高任何家族11木聚糖酶的嗜熱性、熱穩(wěn)定性和/或嗜堿性，家族11木聚糖酶的非限制性實(shí)例在下文表1中有所描述。家族11木聚糖酶的其他非限制性實(shí)例在Sapag et al.，(2002)和Hakulinen et al.，(2003)中給出，以及通過(guò)URLcazy.org/fam/GH11.html公開(kāi)，它們都通過(guò)引用的方式納入本文。
而且，除了在位置99和118引入半胱氨酸殘基外，所述修飾的家族11木聚糖酶還可以包含另外的突變。這些另外的突變應(yīng)當(dāng)被引入至氨基酸序列中相容的位置，例如至非保守位置(參見(jiàn)圖1)。再者，通過(guò)在引入突變后確定本文所述的嗜熱性、嗜堿性和/或熱穩(wěn)定性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定給定突變是否能與二硫化突變相容。能夠與所述99/118突變相容的突變的非限制性實(shí)例在表2中給出。使用已知的重組技術(shù)或定向進(jìn)化(directed evolution)可以引入一種或多種這樣的額外突變，并且這樣的突變可以進(jìn)一步促進(jìn)所述酶的嗜熱性、熱穩(wěn)定性、嗜堿性或其組合的提高。
表1家族11木聚糖酶
家族11木聚糖酶的實(shí)例(并不意在進(jìn)行限制)包括里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶I、綠色木霉木聚糖酶、淺青紫鏈霉菌木聚糖酶B及淺青紫鏈霉菌木聚糖酶C。例如，本發(fā)明的木聚糖酶突變體可以包含里氏木霉木聚糖酶II突變體。
“修飾的木聚糖酶”是指包含突變或改變的天然木聚糖酶序列的木聚糖酶。該突變或改變?cè)谙鄳?yīng)的天然木聚糖酶中不存在。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)可以修飾的木聚糖酶分子。這些技術(shù)包括但不限于定向誘變、盒式誘變、隨機(jī)誘變、合成的寡核苷酸構(gòu)建、克隆及其他遺傳工程技術(shù)。定向誘變是這樣的合適技術(shù)的實(shí)例，所述技術(shù)可在木聚糖酶中產(chǎn)生使該酶與天然酶相比更加嗜熱和/或更加嗜堿的突變。然而，本發(fā)明的范圍還考慮使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的引入突變的其他技術(shù)。
術(shù)語(yǔ)“最佳活性”是指具體的酶在觀察到最大活性的pH(即最適pH)和觀察到最大活性的溫度(即最適溫度)下在指定時(shí)長(zhǎng)過(guò)程中的活性。
若木聚糖酶具有出約60℃-約90℃的最高有效溫度，則它是本文所指的“嗜熱的”?！白罡哂行囟取被颉癕ET”是指木聚糖酶呈現(xiàn)至少80％的其最佳活性的最高溫度。對(duì)于本說(shuō)明書(shū)來(lái)說(shuō)，通過(guò)使用實(shí)施例2.3詳述的且實(shí)施例3中改良的用于測(cè)量木聚糖酶活性的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法測(cè)量木聚糖酶的溫度譜可確定木聚糖酶的MET。在木聚糖酶的最適pH下測(cè)量其活性。確定修飾的木聚糖酶呈現(xiàn)至少約80％的其最佳(最大)活性的溫度，最高溫度為MET。
修飾的木聚糖酶的MET可為約60℃、62℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、86℃、88℃或90℃或者處于其間的任何溫度。在一個(gè)非限制的實(shí)例中，修飾的木聚糖酶的MET可以是約62℃-約85℃或中間任意范圍；約65℃-約85℃或中間任意范圍；約68℃-約85℃或中間任意范圍；或者約70℃-約85℃或中間任意范圍。
若木聚糖酶具有約55℃-約85℃的T50，則它是本文所指的“熱穩(wěn)定的”。“T50”是所述修飾的酶或天然酶在30分鐘的孵育時(shí)間后保持50％的殘余活性的孵育溫度。通過(guò)實(shí)施例5中詳述的測(cè)定方法可以確定木聚糖酶的T50。如實(shí)施例5中指出的，將48℃下的殘余活性標(biāo)準(zhǔn)化為100％。
修飾的木聚糖酶的T50可為約55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、64℃、68℃、72℃、76℃、80℃或85℃或者處于其間的任何溫度。在一個(gè)非限制的實(shí)例中，修飾的木聚糖酶的T50可以是約54℃-約80℃或中間任意范圍；約56℃-約80℃或中間任意范圍；或者約58℃-約80℃或中間任意范圍。
因?yàn)樵谶^(guò)去的文獻(xiàn)中術(shù)語(yǔ)嗜熱性和熱穩(wěn)定性可互換使用，所以它們的使用一直是混淆的。但是，本文定義的這些術(shù)語(yǔ)的使用與本領(lǐng)域的所述術(shù)語(yǔ)的用法一致(Mathrani and Ahring，1992)。
若木聚糖酶具有約pH6.0至約pH8.5的最大有效pH(MEP)，則它是本文所指的嗜堿的?！白畲笥行H”或“MEP”是指木聚糖酶呈現(xiàn)出至少80％的最佳活性時(shí)的最大pH。如實(shí)施例4中指出的，通過(guò)測(cè)量木聚糖酶的pH譜可以確定MEP。確定至少80％的最佳(最大)活性的pH，最大pH為MEP。
修飾的木聚糖酶的MEP可為pH 6.2、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、8.0或8.5或者處于其間的任何pH。在一個(gè)非限制的實(shí)例中，該MEP可以是約pH 6.5-約8.5或中間任意范圍；約pH 6.8-約8.0或中間任意范圍；或者約pH 7.0-約8.0或中間任意范圍。
“TrX編號(hào)”是指對(duì)應(yīng)于TrX(XynII-表1；Tr2-圖1；SEQ ID NO16)氨基酸序列的氨基酸位置的編號(hào)。如下文公開(kāi)的并且如圖1標(biāo)示的，家族11木聚糖酶呈現(xiàn)出了很大程度的序列相似性。因此，通過(guò)比對(duì)氨基酸使木聚糖酶之間的序列相似性最優(yōu)并且通過(guò)使用TrX氨基酸的編號(hào)作為編號(hào)的基礎(chǔ)，可以確定其他木聚糖酶內(nèi)的氨基酸相對(duì)于TrX的位置。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可用于對(duì)這些序列進(jìn)行比對(duì)。
如本文中更詳細(xì)描述的，已經(jīng)制備了數(shù)種呈現(xiàn)出提高的嗜熱性、嗜堿性和/或熱穩(wěn)定性的木聚糖酶突變體。表2中列出了數(shù)種突變體，但不能被認(rèn)為是以任何方式對(duì)此進(jìn)行限制。
表2修飾的木聚糖酶
對(duì)WO 03/046169、美國(guó)專利No.5,759,840、WO 01/92487和WO 2005/093072(它們的內(nèi)容通過(guò)引用的方式納入本文)中記載的木聚糖酶突變體進(jìn)行進(jìn)一步修飾以在位置99和118引入半胱氨酸。可以根據(jù)本發(fā)明修飾的木聚糖酶突變體的非限制性實(shí)例在表3中列出。
表3WO 03/046169、美國(guó)專利No.5,759,840和WO 01/92487中記載的修飾的木聚糖酶
aWO 03/046169(Sung) b美國(guó)專利No.5,759,840(Sung et al.) cWO 01/92487(Sung) 提高木聚糖酶的嗜熱性 在圖3中示出了溫度對(duì)具有單突變S40H(TrX-40H)、K58R(TrX-58R)、S99C(TrX-99C)或Y118C(TrX-118C)的里氏木霉木聚糖酶TrX水解木聚糖的作用。
在WO 03/046169(Sung)中已經(jīng)描述了利用單突變提高了家族11木聚糖酶的嗜熱性，例如修飾的木聚糖酶TrX-118C中的Y118C。然而，還沒(méi)有報(bào)道過(guò)基于位于位置118的半胱氨酸和另一半胱氨酸產(chǎn)生二硫鍵以提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性、嗜熱性或嗜堿性的可能性。本發(fā)明涉及為上述目的而構(gòu)建99C/118C二硫鍵合，基于天然出現(xiàn)的或生成的Cys-118與在殘基99處天然出現(xiàn)的或通過(guò)S99C突變形成的第二半胱氨酸。
為了驗(yàn)證在較高溫度下任何活性的提高都是形成二硫鍵的結(jié)果，測(cè)試了S99C單突變(TrX-99C；圖3)。該木聚糖酶突變體(TrX-99C)與天然TrX相比在較高溫度下沒(méi)有顯示出酶活性的提高。因此，僅S99C單突變對(duì)TrX的溫度/活性譜沒(méi)有作用。
然而，當(dāng)突變S99C和Y118C結(jié)合形成木聚糖酶雙突變體(TrX-99C-118C)時(shí)，甚至與單突變體TrX-118C相比嗜熱性都有顯著提高(圖3和4)。雙突變體TrX-99C-118C的最適溫度比天然木聚糖酶(TrX)和TrX-118C分別提高約7℃和5℃(圖3和4)。TrX-99C-118C除了具有更高的最適溫度外，它與TrX在各自的最適溫度下相比還呈現(xiàn)出更高的最佳活性(圖3)。
在木聚糖酶TrX-40H中單突變S40H與野生型TrX相比，在較高溫度顯示了提高的酶活性(圖3)。當(dāng)與TrX-99C-118C相比時(shí)，該突變對(duì)嗜熱性產(chǎn)生的正效應(yīng)在另一種木聚糖酶突變體TrX-40H-99C-118C(圖3和4)中也得到了確證。
在修飾的木聚糖酶TrX-58R的情況下，如Turunen et al.(2002)之前所報(bào)道的，突變K58R單獨(dú)無(wú)法提高天然TrX的活性(圖3)。然而，在包含突變S99C和Y118C的木聚糖酶突變體中，突變K58R提高了在較高溫度下的酶活性。通過(guò)將木聚糖酶突變體TrX-58R-99C-118C和TrX-40H-58R-99C-118C(圖3和4)的嗜熱性與木聚糖酶TrX-99C-118C和TrX-40H-99C-118C的嗜熱性分別比較確證了這一點(diǎn)。雖然突變K58R單獨(dú)不能提高木聚糖酶在較高溫度下的活性，但是它有可能與其他突變S40H和S99C/Y118C結(jié)合對(duì)嗜熱性有產(chǎn)生正效應(yīng)。
上述突變與本領(lǐng)域中已述的其他有利的木聚糖酶突變是相容的。如下文所述，在構(gòu)建具有較高最適溫度和最佳活性的木聚糖酶的組合突變體時(shí)證明了這些突變與已經(jīng)公開(kāi)突變組合的疊加效應(yīng)。
已經(jīng)以突變體TrX-10H-27M-29L的形式證明了突變N10H、Y27M和N29L提高了TrX的嗜熱性(TrX-HML；見(jiàn)美國(guó)專利No.5,759,840)。突變S40H、K58R和S99C/Y118C整合到TrX-10H-27M-29L中形成木聚糖酶突變體TrX-10H-27M-29L-40R-58R-99C-118C，在較高溫度下具有進(jìn)一步提高的酶活性(圖5)。
突變N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A和I129E也已經(jīng)被證明提高了TrX的嗜熱性(突變體TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E；參見(jiàn)WO01/92487)。突變S40H、K58R和S99C/Y118C整合到TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E中形成木聚糖酶突變體TrX-10H-27M-29L-40R-58R-75A-99C-118C、TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E和TrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E，在較高溫度下具有增強(qiáng)的酶活性(圖6和8)。
添加N11D突變形成了修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(圖6、7和8)。構(gòu)建了一系列基于該木聚糖酶的在位置40攜帶另一突變的突變體以確定增強(qiáng)該酶嗜熱性的那些氨基酸殘基。在位置40引入不同的突變(S40C、F、R、Y、A或T)以形成7種新木聚糖酶突變體TrX-10H-11D-27M-29L-40X-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(其中X是A、C、F、H、R、Y或T)。與具有較少突變的木聚糖酶TrX-40H和TrX-40H-99C-118C類似，與原酶相比突變S40H或S40R的引入適度地提高了所得木聚糖酶突變體在較高溫度下的相對(duì)活性(圖6、7和8)。S40C、S40F和S40Y之類的其他突變也呈現(xiàn)出了相同的增強(qiáng)效應(yīng)(圖7)，而S40T和S40A對(duì)溫度/活性譜的沒(méi)有這種增強(qiáng)效應(yīng)(圖7)。
現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有報(bào)道通過(guò)將Ser 40突變成Cys、Phe、Tyr、His或Arg對(duì)家族11木聚糖酶的嗜熱性產(chǎn)生的正效應(yīng)。已知的家族11木聚糖酶在位置40都不具有殘基Cys、Phe、Tyr或His。Arg殘基雖然存在于嗜熱的嗜熱真菌Xyn中(圖1)，但是也存在于嗜中溫的淺青紫鏈霉菌Xln B中。
將另一個(gè)突變Q52C引入TrX-10H-11D-27M-29L-40H-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E中。產(chǎn)生的木聚糖酶突變體TrX-10H-11D-27M-29L-40H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E與原酶相比，在80和85℃下能保持顯著高的相對(duì)活性(圖6、7和8)。已知家族11木聚糖酶在位置52都不具有殘基Cys。
之前已經(jīng)證明突變H144R和Q161R可提高木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-75A-105H-118C-125A-129E-144R-161R(TrX-HDML-AH-118C-AE-RR；WO03/046169)的最適pH。添加突變S40R、K58R和S99C產(chǎn)生木聚糖酶突變體TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R-161R(圖9)，它可在80和85℃的較高溫度下保持較高活性。
以上結(jié)果證明了突變S40X(其中X是C、F、H、R或Y)、Q52C、K58R和S99C/Y118C對(duì)突變木聚糖酶嗜熱性的提高效應(yīng)不僅相互之間是互補(bǔ)的或疊加的，而且與美國(guó)專利No.5,759,840、WO 01/92487和WO 03/046169中記載的突變也是互補(bǔ)的或疊加的。
將突變113N引入修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E中。生成的突變木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N與TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E相比顯示出稍高的最適溫度(圖14)。這些結(jié)果證明了突變131N與99C/118C二硫化突變以及提高嗜熱性的其他突變是相容的。
提高木聚糖酶的嗜堿性 二硫化突變S99C/Y118C對(duì)木聚糖酶pH/活性譜的影響示于圖10中。木聚糖酶突變體TrX-99C-118C與天然木聚糖酶TrX相比在6.5-7.5的較高pH值時(shí)保持了較高的活性。木聚糖酶TrX-99C-118C保持80％最佳活性的pH范圍是4.8-7.0，寬于相應(yīng)的天然或未修飾的木聚糖酶TrX的4.8-6.0的范圍。這些結(jié)果證明所述99C/118C突變對(duì)木聚糖酶TrX嗜堿性的正貢獻(xiàn)。
為了鑒定在較高pH下有較高活性的直接原因，將僅具有S99C/Y118C中一個(gè)突變的木聚糖酶與TrX-99C-118C和天然木聚糖酶TrX兩者對(duì)比。這兩種具有單突變TrX-99C或TrX-118C的木聚糖酶顯示了與TrX類似的pH/活性譜(圖10)。這確證了在較高pH下活性的提高是突變S99C和Y118C組合而形成的二硫鍵的結(jié)果，而不是單Cys突變的結(jié)果。
還在按照上文所述構(gòu)建的兩組突變體中研究了突變S40X(其中X是H或R)、K58R和S99C/Y118C對(duì)木聚糖酶的pH/活性譜的作用。
第一組衍生自突變體TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E(參見(jiàn)WO01/92487)。二硫化木聚糖酶突變體TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E在7.0、7.5和8.0的pH值下分別顯示了75、60和50％的活性提高(圖11)，而原木聚糖酶TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E在這些pH下分別僅顯示60、40和22％的活性提高。這確證了99C/118C突變對(duì)木聚糖酶嗜堿性的貢獻(xiàn)，并且該突變與本領(lǐng)域已經(jīng)公開(kāi)的嗜堿性和嗜熱性突變是相容的。
構(gòu)建了在位置40和58具有額外突變的該組其他成員，這些成員還含有所述99C/118C二硫化突變。它們包括TrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E、TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E和TrX-10H-11D-27M-29L-40H-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E。然而，這些突變體與原木聚糖酶TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E相比在較高pH下沒(méi)有顯示出任何的活性提高(圖11)。雖然這些位于位置40和58的嗜熱性突變無(wú)法提高木聚糖酶的嗜堿性，但是它們沒(méi)有不利效應(yīng)，這因此證明了它們?cè)跇?gòu)建嗜熱性和嗜堿性的木聚糖酶時(shí)與其他有利突變是相容的。
突變S99C/Y118C的提高效應(yīng)還在基于TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E-144R-161R的第二組中得到了進(jìn)一步的證明，該木聚糖酶包含兩個(gè)突變H144R和Q161R且在WO 01/92487中成功地提高了木聚糖酶的最適pH。具有突變99C/118C的木聚糖酶突變體TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R-161R與它的原TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E-144R-161R相比在較高pH下呈現(xiàn)出更大的活性(圖12)。它還優(yōu)于另一種木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-75A-105H-116G-118C-125A-129E-144R-161R(圖12)，后者是WO 03/046169的突變木聚糖酶中具有最大改良的pH/活性譜的木聚糖酶突變體。這是證明突變99C/118C與其他嗜堿性突變相容的另一個(gè)非限制性實(shí)例。
還研究了突變131N對(duì)木聚糖酶突變體TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E的pH/活性譜的作用。如圖15和16所示，修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N與TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E相比對(duì)硬木(圖15)和軟木(圖16)兩者都有稍寬的最適pH。這是證明突變99C/118C與提高嗜堿性的其他突變相容的另一個(gè)非限制性實(shí)例。
提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性 通過(guò)在無(wú)底物的情況下于不同溫度下孵育比較突變體木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。在30分鐘后，用可溶性木聚糖作為底物通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法確定木聚糖酶的殘余活性。
通過(guò)突變體TrX-99C-118C和天然TrX的比較研究確定了突變99C/118C對(duì)木聚糖酶的熱穩(wěn)定性的作用。在較高溫度孵育30分鐘后，前者保持了比后者更高的殘余活性(圖13)。
確定了T50。與51℃的天然木聚糖酶TrX的T50相比，二硫化木聚糖酶TrX-99C-118C的T50是58℃。這表明了通過(guò)引入突變99C/118C，以“T50”度量的熱穩(wěn)定性提高了約7℃。
還測(cè)試了包含突變99C/118C與另外突變的修飾的木聚糖酶的熱穩(wěn)定性并與TrX-10H-27M-29L進(jìn)行了比較。如圖17所示，TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N和TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E與TrX-10H-27M-29L相比都顯示了更優(yōu)的熱穩(wěn)定性。
總之，本發(fā)明的嗜熱性、嗜堿性和/或熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的木聚糖酶突變體包含位于位置99和118的半胱氨酸殘基。所述修飾的木聚糖酶還可以包含一種或多種的以下的氨基酸置換 (i)在位置58的置換氨基酸例如堿性氨基酸，包括但不限于Arg； (ii)在位置40的置換氨基酸，包括但不限于選自Arg、Cys、Phe、His和Tyr的氨基酸； (iii)在位置10、27和29的氨基酸置換——例如在位置10的置換氨基酸，包括但不限于His的堿性；在位置27的疏水性置換氨基酸，包括但不限于Met；及在位置29的疏水性置換氨基酸，包括但不限于Leu；以及 (iv)在(i)-(iii)中所列突變的任意組合。
另外，上述的修飾的木聚糖酶還可以包含一種或多種以下氨基酸置換 (v)在位置75和125的非極性的置換置換氨基酸，例如包括但不限于Ala或Gla；在位置105的氨基酸置換例如取代的堿性氨基酸，包括但不限于His、Arg和Lys；及/或在位置129的氨基酸置換例如取代的酸性氨基酸，包括但不限于Asp或Glu； (vi)在位置52的氨基酸置換包括但不限于Cys； (vii)在位置11的氨基酸置換例如酸性氨基酸，包括但不限于Asp； (viii)在位置144和/或161的氨基酸置換包括但不限于堿性氨基酸，例如Arg； (ix)在位置131的變成Asn的氨基酸置換；以及 (x)在(v)-(viii)中所述突變的任意組合。
在表2中給出了包含99C/118C二硫鍵與上文列出氨基酸置換的木聚糖酶突變體的非限制性實(shí)例。
將(v)-(x)中一種或多種氨基酸置換引入包含突變99C/118C且不包含(i)-(iv)中所列突變的修飾的木聚糖酶也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。再者，所述修飾的木聚糖酶可以包含上文未列出的氨基酸置換與突變99C/118C的組合。另外，突變99C/118C還可以被引入美國(guó)專利No.5,759,840、WO03/046169、WO 01/92487或WO 2005/093072(它們通過(guò)引用的方式納入本文)中記載的任何木聚糖酶突變體中。
還需要理解的是，若99或118這兩個(gè)位置之一已經(jīng)有Cys殘基，則也可以通過(guò)僅將位于位置99或118的一個(gè)位置的氨基酸置換成Cys來(lái)形成99C/118C二硫鍵。因此，本發(fā)明涉及在位置99和118包含半胱氨酸殘基以形成99C/118C二硫鍵的修飾的木聚糖酶，該木聚糖酶是通過(guò)將位于位置99和/或118的氨基酸置換成半胱氨酸產(chǎn)生。
存在在相當(dāng)于里氏木霉木聚糖酶II位置99和118的位置具有半胱氨酸殘基的曲霉木聚糖酶的天然實(shí)例——例如黑曲霉awamori變種；白曲霉XynC；塔賓曲霉(圖1)。然而，與天然TrX類似，曲霉木聚糖酶僅在低溫(Fushinobuet al.，1998)及酸性pH(Krengel and Dijkstra，1996)下有功能，且穩(wěn)定的上限僅為40℃(Ito et al.，1992，Biosci.Biotechnol.Biochem.56906-912)。因此，在這些嗜中溫曲霉木聚糖酶的位置99和118存在半胱氨酸殘基不能表明在木聚糖酶中形成二硫鍵會(huì)提高其在高溫下的活性。再者，這些曲霉木聚糖酶僅能在酸性pH值下發(fā)揮功能，具有大約2-3的酸性的最適pH(Krengel and Dijkstra，1996；Fushinobu et al.，1998，Esteveset al.，2004；Hakul inen et al.，2003)。因此，這并不表明在另一種嗜酸性木聚糖酶(包括但不限于TrX)中形成類似的二硫鍵會(huì)提高其在較高pH下的活性。而且，很少觀察到二硫化突變提高酶嗜堿性的情況。
因此，本發(fā)明的修飾的木聚糖酶可以衍生自家族11木聚糖酶，包括但不限于里氏木霉木聚糖酶。所述修飾的木聚糖酶優(yōu)選地不是天然的曲霉木聚糖酶。然而，在位置99和118(TrXII編號(hào))包含天然出現(xiàn)的半胱氨酸殘基的曲霉木聚糖酶可用于衍生修飾的木聚糖酶，所述修飾的木聚糖酶包含本文描述的其他突變以提高該曲霉木聚糖酶嗜熱性和嗜堿性。
再者，一種被稱為MODIP的計(jì)算方法(Sowdhamini et al.，1989；Daniet al.，2003)——它是為協(xié)助設(shè)計(jì)用于穩(wěn)定蛋白的二硫橋而建立的——已經(jīng)預(yù)測(cè)，任何穩(wěn)定作用的二硫鍵圍住一個(gè)含有25個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的環(huán)——即兩個(gè)半胱氨酸殘基之間的殘基數(shù)目。另一項(xiàng)相關(guān)研究也得出結(jié)論，長(zhǎng)度少于25個(gè)殘基的環(huán)的穩(wěn)定作用很小。本發(fā)明的99C/118C二硫鍵——具有19個(gè)殘基的環(huán)——顯然少于所預(yù)測(cè)的用于穩(wěn)定作用的二硫鍵的最少25個(gè)殘基。已經(jīng)報(bào)道的在家族11木聚糖酶中任何穩(wěn)定作用的二硫鍵的最小環(huán)是在TrX的N末端形成的2/28二硫鍵，其環(huán)長(zhǎng)度為26個(gè)殘基(Fenel et al.，2004)。該2/28二硫鍵不會(huì)在較大pH范圍內(nèi)提高木聚糖酶活性。
上面的描述并非意在以任何方式限制要求保護(hù)的本發(fā)明。再者，所討論的特征的組合對(duì)本發(fā)明的方案來(lái)說(shuō)不是一定必需的。
在以下的實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡明。然而，應(yīng)理解這些實(shí)施例只是為了闡明本發(fā)明，而不應(yīng)用于任何方式限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例 實(shí)施例中的木聚糖酶變體的構(gòu)建需要用到僅包含部分木聚糖酶基因的質(zhì)粒前體(表4)。該質(zhì)粒前體不能夠表達(dá)木聚糖酶。質(zhì)粒前體的合成已經(jīng)在前文中描述。
表4用于構(gòu)建新的突變木聚糖酶的包含部分木聚糖酶基因的質(zhì)粒。
aWO 01/92487(Sung) 還將以下實(shí)施例中構(gòu)建的新木聚糖酶變體與多種選定的已知木聚糖酶變體比較。表達(dá)前述的這些木聚糖酶突變體的質(zhì)粒在表5中列出。
表5本領(lǐng)域中已經(jīng)報(bào)道的表達(dá)木聚糖酶的質(zhì)粒 aWO 03/046169(Sung) b美國(guó)專利No.5,759,840(Sungetal.) cWO 01/92487(Sung) 實(shí)施例1構(gòu)建里氏木霉木聚糖酶突變體 根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的已確立的方案(例如Sung et al.，1986)或者依照酶或試劑盒廠商推薦的方法進(jìn)行諸如質(zhì)粒制備、限制性內(nèi)切酶消化、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、寡核苷酸磷酸化、連接、轉(zhuǎn)化和DNA雜交的基本的重組DNA方法。用于多種酶的緩沖液為試劑盒的一部分，或者根據(jù)廠商的說(shuō)明書(shū)而制備。限制性內(nèi)切酶、T4多核苷酸激酶和T4DNA連接酶購(gòu)自New EnglandBioLabs Ltd，Mississauga，Ontario。GeneAmp PCR試劑試劑盒購(gòu)自Perkin-Elmer。前體質(zhì)粒pXYbc——它是具有插入的環(huán)狀芽胞桿菌木聚糖酶基因的pUC型質(zhì)?！耙呀?jīng)被制備并且被公開(kāi)過(guò)(Sung et al.，1993；Campbell et al.，美國(guó)專利No.5,405,769)。將常用的大腸桿菌菌株HB101(Clonetech Lab，Palo Alto，CA)用作所有基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化和表達(dá)宿主。樺木木聚糖和Remazol Brilliant Blue R-D-木聚糖購(gòu)自Sigma(St.Louis，Mo)。羥基苯甲酸酰肼(HBAH)購(gòu)自Aldrich。用APPLIED BIOSYSTEM DNA合成儀(380B型)制備寡核苷酸。所有木聚糖酶的測(cè)定均在有蓋的循環(huán)水浴(Haake，F(xiàn) 4391型)中進(jìn)行，并保持在±0.1℃溫度范圍內(nèi)。
1.1 構(gòu)建攜帶合成的TrX(SEQ ID NO40)的質(zhì)粒前體pTrX 以下公開(kāi)的用于突變的質(zhì)粒前體pTrX已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中有記載(Sung etal.，1995)。該質(zhì)粒衍生自質(zhì)粒pUC119并具有編碼里氏木霉木聚糖酶(TrX；圖2)的合成的核苷酸序列。該木聚糖酶及接下來(lái)所述的其他木聚糖酶突變體的表達(dá)均在pUC質(zhì)粒的lacZ啟動(dòng)子的控制之下。木霉木聚糖酶基因的完全裝配需要兩個(gè)階段，初始涉及92-190區(qū)域的連接，隨后是1-92區(qū)域(TrX編號(hào))。該基因的構(gòu)建方案是常規(guī)的，并且與用于多種其他基因的標(biāo)準(zhǔn)公開(kāi)方法相同。該方案需要將編碼木聚糖酶的重疊的合成寡核苷酸進(jìn)行酶促磷酸化。然后將其連接至適當(dāng)切割的質(zhì)粒中。
為了構(gòu)建TrX(92-190)，設(shè)計(jì)了以下10種重疊的寡核苷酸(參見(jiàn)圖2) XyTv-101，SEQ ID NO30； XyTv-102，SEQ ID NO31； TrX-103，SEQ ID NO32； XyTv-104，SEQ ID NO33； XyTv-105，SEQ ID NO34； XyTv-106，SEQ ID NO39； XyTv-107，SEQ ID NO38； TrX-108，SEQ ID NO37； XyTv-109，SEQ ID NO36；和 XyTv-110，SEQ ID NO35。
用模擬大腸桿菌的密碼子使用頻率設(shè)計(jì)這些突變體。兩末端寡核苷酸的SalI和BglII粘性末端使得可以將所述10個(gè)片段酶連接至線性質(zhì)粒pXYbc中。在包含10×標(biāo)準(zhǔn)激酶緩沖液(0.4μL)、1mMATP(4μL)、T4DNA激酶(5單位)和水(3μL)的混合液中，將編碼木霉木聚糖酶TrX(92-190)區(qū)域的這10個(gè)寡核苷酸(50pmol，每個(gè)1μL)磷酸化。在37℃下進(jìn)行1小時(shí)的磷酸化反應(yīng)。然后將溶液合并并且加熱至70℃維持10分鐘。在緩慢冷卻至室溫之后，將合并的溶液加至4mM ATP(3.5μL)、SalI/BglII線性化質(zhì)粒pXYbc(0.1pmol)和T4DNA連接酶(3.5μL)的混合液中，并且在12℃下孵育20小時(shí)。將等份的連接混合液用于轉(zhuǎn)化含氨芐青霉素(100mg/L)的YT平板(1L水中溶8g酵母提取物、5g細(xì)菌用胰蛋白胨、5g NaCl和15g瓊脂)上的大腸桿菌HB101。
為了制備雜交探針，在37℃下將所述寡核苷酸之一例如XyTv-110(10pmol，1μL)用T4DNA激酶(1μL)、10×激酶緩沖液(1μL)和水(4μL)以32P-ATP(10pmol，3μL)磷酸化1小時(shí)。
隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)化體用于雜交分析。將菌落在具有氨芐青霉素的YT平板上培養(yǎng)過(guò)夜并轉(zhuǎn)移至尼龍濾膜上。然后將它們用0.5N NaNOH-1.5M NaCl變性(10分鐘)并用0.5N Tris-HCl(pH 7.0)-1.5M NaCl中和(10分鐘)。將該濾膜用254nm的紫外線照射8分鐘后，用6×SSC-0.05％ Triton X-100洗滌30分鐘。將細(xì)胞碎片完全刮掉。在新鮮溶液中再孵育30分鐘后，將雙份濾膜分別轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的6×SSC-1％硫酸葡聚糖-0.05％ Triton X-100-1×Denhardt雜交液的混合液中。將32P-標(biāo)記的探針加到濾膜上。在45℃下維持16小時(shí)后，用6×SSC-0.05％ Triton X-100洗滌濾膜兩次在室溫下洗滌5分鐘，然后在65℃下洗滌30分鐘。通過(guò)放射自顯影分析鑒定具有中間質(zhì)粒pBcX-TrX的陽(yáng)性雜交克隆。
上述涉及合成的重疊寡核苷酸的酶促磷酸化及連接至線性化質(zhì)粒的方案被應(yīng)用于TrX(1-92)區(qū)域的裝配以及用于隨后產(chǎn)生本發(fā)明中所述其他木聚糖酶突變體的盒式誘變中。
為了裝配TrX(1-92；TrX編號(hào))區(qū)域以獲得全長(zhǎng)里氏木霉木聚糖酶II基因(TrX)，將中間質(zhì)粒pBcX-TrX用內(nèi)切核酸酶NheI和KpnI線性化以釋放用于BcX的DNA插入片段(1-83)。通過(guò)上述的方案，使用NheI和KpnI粘性末端將編碼TrX(1-91)序列的8個(gè)重疊寡核苷酸 TrX-1，SEQ ID NO22； XyTv-2，SEQ ID NO23； TrX-3，SEQ ID NO24； XyTv-4，SEQ ID NO25； XyTv-5，SEQ ID NO29； TrX-6，SEQ ID NO28； XyTv-7，SEQ ID NO27；和 TrX-8，SEQ ID NO26 連接至線性化質(zhì)粒pBcX-TrX(圖2)中。新質(zhì)粒pTrX因此攜帶合成的TrX基因(SEQ ID NO40)。
下文所述的所有木聚糖酶突變體都通過(guò)盒式誘變的方法構(gòu)建。盒式誘變的方案與上述基因裝配的方案相同。盒式誘變通常包括(i)將重疊的合成寡核苷酸進(jìn)行酶促磷酸化，(ii)將合成寡核苷酸與線性化的質(zhì)粒連接，(iii)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞中，(iv)通過(guò)標(biāo)記的寡核苷酸雜交鑒定突變轉(zhuǎn)化體，以及(v)通過(guò)雙脫氧核苷酸測(cè)序法確證突變。
1.2 構(gòu)建攜帶外膜蛋白A分泌前導(dǎo)序列(SEQ ID NO41和42)的質(zhì)粒pOmp-TrX 接著1.1的實(shí)驗(yàn)方案，寡核苷酸Omp-TX-1、-2、-3和-4——編碼大腸桿菌外膜蛋白A分泌前導(dǎo)序列以及重建的TrX(1-7)區(qū)域——連接至NheI/PinAI-切割的質(zhì)粒pTrX上。形成的質(zhì)粒pOmp-TrX通過(guò)表達(dá)和分泌可以產(chǎn)生有功能的木聚糖酶。
Omp-TX-1 [OmpA2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14K K T A I A I A V A LA G 5′-CT AGC AAG AAG ACA GCA ATA GCA ATC GCT GTG GCA TTA G|CC GGCG TTC TTC TGT CGT TAT CGT TAG|CGA CAC CGT AAT C GG CCG NheIOmp-TX-4 Omp-TX-3 Omp-TX-2 TrX序列15 16 17 18 19 20 21][ 1 2 3 4 5 6 7 F A T V A Q A Q T I Q P G T TTT GCG ACC GTT GCT CAG GCC CAG ACC ATA CAA CCA GGA A(SEQ ID NO41 AAA CGC TGG CAA CGA GTC CGG GTC TGG TAT GTT GGT CCT TGG CC(SEQ ID NO42) PinAI 1.3 構(gòu)建質(zhì)粒前體pOmp-TrX(1-113) 質(zhì)粒pOmp-TrX-(1-113)包含TrX的1-113位氨基酸序列且不能表達(dá)有活性的木聚糖酶。這種轉(zhuǎn)化體通過(guò)在藍(lán)色木聚糖平板上轉(zhuǎn)化體菌落周?chē)鷽](méi)有透明區(qū)或暈輪而確證。
該質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)(i)通過(guò)用限制性內(nèi)切酶BamHI和BglII切割去除質(zhì)粒pOmp-TrX的TrX(114-190)編碼序列，(ii)連接線性化質(zhì)粒的相同粘性末端，(iii)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布含有氨芐青霉素(100mg/L)的YT平板(1L水中溶5g酵母提取物、3g細(xì)菌用胰蛋白胨、5g NaCl、15g瓊脂；1g Remazol Brilliant Blue R-D-木聚糖)，(iv)通過(guò)木聚糖酶活性喪失鑒定突變轉(zhuǎn)化體(40℃下過(guò)夜后在藍(lán)色木聚糖平板上的菌落周?chē)鷽](méi)有透明區(qū)或暈輪)，以及(v)通過(guò)雙脫氧核苷酸測(cè)序法確證突變。所述每個(gè)步驟的方案類似于上述基因裝配的方案。
1.4 構(gòu)建質(zhì)粒前體pTrX-HML 這個(gè)質(zhì)粒前體pTrX-HML的構(gòu)建在美國(guó)專利No.5,759,840中已經(jīng)有詳細(xì)的描述(參見(jiàn)實(shí)施例1N，通過(guò)引用的方式納入本文；被稱為pNI-TX13的質(zhì)粒)。TrX-HML包含天然TrX木聚糖酶，連同N10H(位于位置10的Asn被His替換)、Y27M和N29L三個(gè)突變。包含N10H、Y27M和N29L的序列的前30個(gè)氨基酸如以下所示。
TrX 1 2 3 4 5 6 7 8 氨基酸 Q T I Q P G T G 5′-CT AGC TAA GGA GG CTG CAG ATG CAA ACA ATA CAA CCA GGA ACC GGT3′-G ATT CCT CC GAC GTC TAC GTT TGT TAT GTT GGT CCT TGG CCA NheI PinAI 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Y H N G Y F Y S Y W N D G H G G TAC CAC AAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG AAC GAT GGC CAT GGA GGC ATG GTG TTG CCA ATG AAA ATG TCG ATA ACC TTG CTA CCG GTA CCT CCG25 26 27 28 29 30 V T M T L G GTC ACA ATG ACT CTG GGG(SEQ ID NO43) CAG TGT TAC TGA GAC CCC(SEQ ID NO44) 1.5 構(gòu)建質(zhì)粒前體pOmp-TrX-HML(1-113)和pOmp-TrX-HDML(1-113) 質(zhì)粒pOmp-TrX-HML(1-113)和pOmp-TrX-HDML(1-113)包含TrX的1-113位氨基酸序列且不能表達(dá)有活性的木聚糖酶。這些轉(zhuǎn)化體通過(guò)在藍(lán)色木聚糖平板上轉(zhuǎn)化體菌落周?chē)鷽](méi)有透明區(qū)或暈輪而確證。
在構(gòu)建質(zhì)粒pOmp-TrX-HML(1-113)的過(guò)程中，以TX-10H-1(SEQ NO45)和TX-C1為PCR引物并以pTrX-HML(表5)為模板通過(guò)PCR產(chǎn)生編碼(8-C末端)區(qū)域的DNA片段。用限制性內(nèi)切酶PinAI和BamHI切割該P(yáng)CR產(chǎn)物產(chǎn)生(8-113)序列。
在構(gòu)建質(zhì)粒pOmp-TrX-HDML(1-113)的過(guò)程中，以引物TX-10H11D-1(SEQNO46，它已經(jīng)被記載于WO 03/046169中)替代TX-10H-1通過(guò)PCR產(chǎn)生(8-C末端)序列。用限制性內(nèi)切酶PinAI和BamHI切割該P(yáng)CR產(chǎn)物產(chǎn)生(8-113)序列。
TX-10H-1(SEQ ID NO45) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 G T G Y H N G Y F Y S Y W 5′-GGA ACC GGT TAC CAC AAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG PinAI TX-10H11D-1(SEQ ID NO46) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 G T G Y H D G Y F Y S Y W 5′-GGA ACC GGT TAC CAC GAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG PinAI 反向PCR引物TX-C1包含 TX-C1(SEQ ID NO47) 183 184 185 186 187 188 189 190 ter GSASITVS CCA AGG CGA TCA TAA TGT CAC TCG ATT TCT AGA ACT TCG AAC CC-5′ BglI HindIII 合適的PCR模板pTRX-HML(表5)、引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表6)。
表6
將所述PCR切割產(chǎn)物(a)和(b)(表6)連接至PinAI/BglII線性化的質(zhì)粒pOmp-TrX(在1.2中描述)中以分別產(chǎn)生質(zhì)粒pOmp-TrX-HML(1-113)和pOmp-TrX-HDML(1-113)。
接下來(lái)的步驟包括(i)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布含有氨芐青霉素(100mg/L)的YT平板(1L水中溶5g酵母提取物、3g細(xì)菌用胰蛋白胨、5g NaCl、15g瓊脂；1g Remazol Brilliant Blue R-D-木聚糖)，(ii)通過(guò)木聚糖酶活性喪失鑒定突變轉(zhuǎn)化體(40℃下過(guò)夜后在藍(lán)色木聚糖平板上的菌落周?chē)鷽](méi)有透明區(qū)或暈輪)，以及(iii)通過(guò)雙脫氧核苷酸測(cè)序法確證突變。所述每個(gè)步驟的方案類似于1.3中描述的構(gòu)建質(zhì)粒pOmp-TrX-(1-113)的方案。
1.6 構(gòu)建質(zhì)粒pTrX-58R 制備了質(zhì)粒pTrX-58R，該質(zhì)粒與其前體質(zhì)粒pTrX相比具有額外的突變K58R。
用PCR產(chǎn)生編碼(54-190)區(qū)且具有突變K58R的DNA片段。具有突變K58R(黑體字)的PCR引物顯示如下。
TX-58R-1(SEQ ID NO48)53 54 55 56 57 58 59 60 61 P G T K N R V I N 5′-CAA CCC GGG ACC AAA AAT AGG GTG ATC AAC Xma I 使用合適的PCR模板pTrX(表5)，引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表7)。
表7
將所述PCR切割產(chǎn)物(c)(表7)連接至XmaI/HindIII線性化的質(zhì)粒pTrX(1-113)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pTrX-58R。
1.7 構(gòu)建質(zhì)粒pTrX-40H和pTrX-40R 制備了質(zhì)粒pTrX-40H和pTrX-40R，它們與其前體質(zhì)粒pTrX相比具有額外的突變S40H和S40R。
用PCR產(chǎn)生編碼(39-190)區(qū)且具有突變S40H和S40R的DNA片段。具有突變S40H和S40R(黑體字)的PCR引物顯示如下。 TX-40H-1(SEQ ID NO49)39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 W H N S G N F V G G 5′-GTC AAT TGG CAT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGA Mun I TX-40R-1(SEQ ID NO50)39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 W R N S G N F V G G 5′-GTC AAT TGG CGT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGA Mun I 使用合適的PCR模板pTrX，引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表8)。
表8
將所述PCR切割產(chǎn)物(d)和(e)(表8)連接至MunI/HindIII線性化的質(zhì)粒pTrX(1-113)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pTrX-40H和pTrX-40R。
1.8 構(gòu)建質(zhì)粒pTrX-99C 制備了質(zhì)粒pTrX-99C，該質(zhì)粒具有其前體質(zhì)粒pTrX中沒(méi)有的突變S99C。
用PCR產(chǎn)生編碼(95-190)區(qū)且具有突變S99C的DNA片段。
具有突變(黑體字)的PCR引物顯示如下。
TX-99C-1(SEQ ID NO51)95 96 97 98 99 100 101 T Y N P C T G 5′-TTC GGT ACC TAC AAT CCG TGT ACC GGC Kpn I 使用合適的PCR模板pTrX，引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表9)。
表9
將所述PCR切割產(chǎn)物(f)(表9)連接至KpnI/HindIII線性化的質(zhì)粒pTrX(1-113)(表4)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pTrX-99C。
1.9 構(gòu)建質(zhì)粒pOmpTrX-99C-118C 制備了質(zhì)粒pOmpTrX-99C-118C，該質(zhì)粒具有其前體質(zhì)粒pTrX中沒(méi)有的突變S99C和Y118C及分泌前導(dǎo)信號(hào)序列。
用PCR產(chǎn)生編碼(95-190)區(qū)且具有突變S99C和Y118C的DNA片段。
使用合適的PCR模板pTrX-118C(參見(jiàn)表5，WO 03/046169)，引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表10)。
表10
將所述PCR切割產(chǎn)物(g)(表10)連接至KpnI/HindIII線性化的質(zhì)粒pOmpTrX(1-113)(見(jiàn)1.3所述)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pOmpTrX-99C-118C。
1.10 構(gòu)建質(zhì)粒pOmpTrX-58R-99C-118C 制備了質(zhì)粒pOmpTrX-58R-99C-118C，該質(zhì)粒與其前體質(zhì)粒pTrX相比具有額外突變K58R、S99C和Y118C及分泌前導(dǎo)信號(hào)序列。
用PCR產(chǎn)生編碼(54-190)區(qū)且具有突變K58R、S99C和Y118C的DNA片段。
使用合適的PCR模板pOmpTrX-99C-118C(見(jiàn)1.9所述)，引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表11)。
表11
將所述PCR切割產(chǎn)物(h)(表11)連接至XmaI/HindIII線性化的質(zhì)粒pOmpTrX(1-113)(見(jiàn)1.3所述)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pOmpTrX-58R-99C-118C。
1.11 構(gòu)建質(zhì)粒pOmpTrX-40H-99C-118C和pOmpTrX-40H-58R-99C-118C 制備了質(zhì)粒pOmpTrX-40H-99C-118C，該質(zhì)粒與其前體質(zhì)粒pTrX相比具有額外突變S40H、S99C和Y118C及分泌前導(dǎo)信號(hào)序列。pOmpTrX-40H-58R-99C-118C具有額外的突變K58R。
用PCR產(chǎn)生編碼(39-190)區(qū)且具有突變S40H、S99C和Y118C的DNA片段，該片段具有或不具有突變K58R(由合適的質(zhì)粒模板決定)。
使用合適的PCR模板pOmpTrX-99C-118C(見(jiàn)1.9所述)用于產(chǎn)生pOmpTrX-40H-99C-118C，引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表12)。
表12
使用合適的PCR模板pOmpTrX-58R-99C-118C(見(jiàn)1.10所述)用于產(chǎn)生pOmpTrX-40H-58R-99C-118C，引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表13)。
表13
將所述PCR切割產(chǎn)物(i)(表12)和(j)(表13)連接至MunI/HindIII線性化的質(zhì)粒pOmpTrX(1-113)(見(jiàn)1.3所述)中以分別產(chǎn)生質(zhì)粒pOmpTrX-40H-99C-118C和pOmpTrX-40H-58R-99C-118C。
1.12 構(gòu)建質(zhì)粒pOmpTrX-HML-40R-58R-99C-118C 制備了質(zhì)粒pOmpTrX-HML-40R-58R-99C-118C，該質(zhì)粒與其前體質(zhì)粒pTrX-HML相比具有額外突變S40H、K58R、S99C和Y118C及分泌前導(dǎo)信號(hào)序列。
使用合適的PCR模板pOmpTrX-58R-99C-118C(見(jiàn)1.10所述)，引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表14)。
表14
將所述PCR切割產(chǎn)物(k)(表14)連接至MunI/HindIII線性化的質(zhì)粒pOmpTrX-HML(1-113)(見(jiàn)1.5所述)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-40R-58R-99C-118C。
1.13 構(gòu)建質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-40R-58R-75A-99C-118C 制備了質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-40R-58R-75A-99C-118C，該質(zhì)粒與質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-40R-58R-99C-118C相比具有額外突變S75A。具有突變S75A(黑體字)的PCR引物顯示如下。
TX-75A-1(SEQ ID NO52) 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 N G N S Y L A V Y G W S R 5′-T GGG AAT TCA TAC TTA GCC GTC TAT GGC TGG TCT AG EcoRI 使用同時(shí)合適于PCR產(chǎn)物(1)和(m)的PCR模板pOmpTrX-10H-27M-29L-40R-58R-99C-118C(見(jiàn)1.12所述)，引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表15)。
表15
將所述PCR切割產(chǎn)物(1和m)(表15)連接至PinAI/HindIII線性化的質(zhì)粒pOmpTrX(1-113)(見(jiàn)1.3所述)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-40R-58R-75A-99C-118C。
1.14 構(gòu)建質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E 通過(guò)兩個(gè)PCR反應(yīng)制備了質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E，涉及以下引物 TX-118C-1(SEQ ID NO53)111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 DGSVYDI CRTQR5′-GAC GGA TCC GTA TAT GAT ATC TGC CGT ACC CAA CGC BamHI TX-99C105H-1r(SEQ ID NO54) 114 113 112 111 110 109 108 107 106 105 104 103 102 101 100 VSGDST VEGHKT AGT 5′-TAC GGA TCC ATC ACT AGT GAC TTC GCC GTG TTT TGT GGC GCC GGT BamHI KasI99 98 97 96 C P N Y ACA CGG ATT GTA KasI 使用pTrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E作為PCR模板(表5)，合成了一個(gè)編碼(8-112)序列的PCR產(chǎn)物(n)及另一個(gè)編碼(113-190)區(qū)域的PCR產(chǎn)物(o)。
使用合適的PCR模板pTrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E(表5)，引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表16)。
表16
將所述PCR切割產(chǎn)物(n和o)(表16)連接至PinAI/HindIII線性化的質(zhì)粒pOmpTrX-HML(1-113)(見(jiàn)1.5所述)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E。
1.15 構(gòu)建質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E 產(chǎn)生了質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E，該質(zhì)粒與其前體質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E(見(jiàn)1.14)相比具有額外的突變K58R。
使用合適的PCR模板pOmpTrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E(見(jiàn)1.14)，引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表17)。
表17
將所述PCR切割產(chǎn)物(p)(表17)連接至XmaI/HindIII線性化的質(zhì)粒pOmpTrX-HML(1-113)(見(jiàn)1.5所述)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E。
1.16 構(gòu)建質(zhì)粒pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E 使用與1.15中用于制備質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E的策略相同的策略制備了具有額外突變N11D的質(zhì)粒pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E。
將用于構(gòu)建pOmpTrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(見(jiàn)1.15)的PCR切割產(chǎn)物(p)(表17)連接至XmaI/HindIII線性化的質(zhì)粒pOmpTrX-HDML(1-113)(見(jiàn)1.5中所述)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E。
1.17 構(gòu)建質(zhì)粒pOmp-TrX-10H-11D-27M-29L-40X-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E，其中X是C、F、H、R、Y、A或T 以同樣的策略制備了質(zhì)粒pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40X-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E，其中X是C、F、H、R、Y、A或T，使用的是攜帶合適突變的PCR引物 TX-40C-1(SEQ ID NO55)39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 W C N S G N F V G G 5′-GTC AAT TGG TGT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGA Mun I TX-40Y-1(SEQ ID NO56)39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 W Y N S G N F V G G 5′-GTC AAT TGG TAT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGAMun ITX-40F-1(SEQ ID NO57) 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 W F N S G N F V G G 5′-GTC AAT TGG TTT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGAMun ITX-40T-1(SEQ ID NO58)39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 W T N S G N F V G G 5′-GTC AAT TGG ACT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGAMun ITX-40A-1(SEQ ID NO59)39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 W A N S G N F V G G 5′-GTC AAT TGG GCT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGAMun I TX-40H-1和TX-40R-1已經(jīng)在1.8中描述。
使用合適的PCR模板質(zhì)粒pOmpTrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(見(jiàn)1.15中所述)，引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表18)。
表18
將所述PCR切割產(chǎn)物(q、r、s、t、u、v和w)(表18)連接至MunI/HindIII線性化的質(zhì)粒pOmpTrX-HDML(1-113)(見(jiàn)1.5中所述)中以分別產(chǎn)生質(zhì)粒pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40H-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E、pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E、pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E、pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40Y-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E、pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40F-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E、pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40T-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E和pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40A-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E。
1.18 構(gòu)建質(zhì)粒pOmp-TrX-10H-11D-27M-29L-40H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E 通過(guò)將兩個(gè)PCR序列，即PinAI/XmaI線性化的(8-53)片段和XmaI/HindIII線性化的(54-190)片段連接起來(lái)制備了pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E。前者的序列由使用以下攜帶突變Q52C的引物的PCR來(lái)合成TX-52C-1r(SEQ ID NO60) 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 44G P C W G K G G V F N 5′-GT CCC GGG ACA CCA ACC TTT TCC ACC TAC GAA GT Xma I 使用合適的PCR模板質(zhì)粒pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40H-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(見(jiàn)1.17中所述)，引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表19)。
表19
該(54-190)片段被制備為1.15中表17的XmaI/HindIII-切割PCR產(chǎn)物(p)。
將PinAI/XmaI切割的(8-53)片段(x)(表19)和XmaI/HindIII切割的(54-190)片段(p)(表17)連接至PinAI/HindIII線性化的質(zhì)粒前體pOmp-TrX-(1-113)(見(jiàn)1.3中所述)中，產(chǎn)生新的質(zhì)粒pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E。
1.19 構(gòu)建質(zhì)粒pOmp-TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R-161R 制備了質(zhì)粒pOmp-TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R-161R，該質(zhì)粒與1.18的pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E相差兩個(gè)突變H144R和Q161R。
它通過(guò)將兩種合適的PCR切割產(chǎn)物連接而合成。所述編碼區(qū)域(39-112)的第一插入片段通過(guò)用MunI/BamHI切割1.17的表18中已述的PCR產(chǎn)物(r)產(chǎn)生。
所述編碼(113-190)區(qū)域的第二插入片段是使用合適的PCR模板質(zhì)粒pTrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E-144R-161R(WO 03/046169)通過(guò)PCR制備。引物及用于切割PCR產(chǎn)物末端的限制性內(nèi)切酶列出于下(表20)。
表20
將兩種合適的PCR切割產(chǎn)物(y)(表20)和MunI/BamHI切割物(r)連接至MunI/HindIII線性化的質(zhì)粒pOmpTrX-HDML(1-113)(見(jiàn)1.5中所述)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pOmp-TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R-161R。
實(shí)施例2木聚糖酶突變體的特征 2.1 生產(chǎn)木聚糖酶 培養(yǎng)條件包括5mL接種至包含氨芐青霉素(100mg/L)的2YT培養(yǎng)基(1L水中溶16g酵母提取物、10g細(xì)菌用胰蛋白胨、5g NaCl)中的隔夜的培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物涂布于均勻覆蓋有0.5L含氨芐青霉素(100mg/L)的固體YT瓊脂(1L水中溶8g酵母提取物、5g細(xì)菌用胰蛋白胨、5g NaCl和15g瓊脂)的平板(32×25cm)上。在37℃下培養(yǎng)所述培養(yǎng)物。40小時(shí)后，將細(xì)胞收獲用于提取木聚糖酶。
2.2 純化木聚糖酶突變體 將收獲的細(xì)胞放入試管中進(jìn)行木聚糖酶的凍融提取。該步驟包括在干冰/乙醇浴中5分鐘的凍結(jié)期，之后是水/冰浴中10分鐘。重復(fù)該步驟3次。用緩沖液(5mL，100mM檸檬酸鈉，pH5.5)提取細(xì)胞。以8000×g離心30分鐘得到含木聚糖酶的上清液。將該木聚糖酶溶液調(diào)節(jié)至pH5.2。通過(guò)在相同條件下離心除去出現(xiàn)的沉淀。根據(jù)木聚糖酶重組體的熱穩(wěn)定性，將上清液加熱至50-60℃的范圍并維持30分鐘以將更多不合乎需要的細(xì)菌蛋白轉(zhuǎn)換成沉淀，然后通過(guò)離心除去這些沉淀。
在進(jìn)行柱色譜之前，用醋酸將上清液調(diào)節(jié)至pH4.6并通過(guò)離心除去任何的沉淀。對(duì)于所有木聚糖酶突變體來(lái)說(shuō)，隨后的柱色譜步驟都是相同的。
經(jīng)酸化和離心之后，將木聚糖酶樣品灌注至用10mM醋酸鈉(pH 5.1)平衡的50mL柱床體積、CM-sepharose快速流陽(yáng)離子交換柱上(PharmaciaBiotech，Uppsala)。用250mL線性梯度(溶于10mM醋酸鈉中的0-0.6MNaCl，pH 5.1)以1mL/分鐘的流速洗脫木聚糖酶。木聚糖酶在150-200mL的梯度時(shí)被洗脫下來(lái)。將所收集的組分的樣品用SDS-PAGE檢測(cè)，并將那些含大部分的木聚糖酶的組分合并。對(duì)于大多數(shù)TrX木聚糖酶突變體，使用54,600-53,400M-1的消光系數(shù)在280nm下通過(guò)分光光度法定量所述純化的木聚糖酶。從10g細(xì)胞通?？杉兓玫?5mg木聚糖酶。
2.3 測(cè)量酶活性的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法 定量測(cè)定法確定了由可溶木聚糖產(chǎn)生的還原糖末端的數(shù)目。該測(cè)試的底物是來(lái)自5％的樺木木聚糖(Sigma Chemical Co.)懸浮液中的溶解于水中的樺木木聚糖組分。在去除不溶的組分之后，將上清液凍干并儲(chǔ)存于干燥器中。按如下進(jìn)行活性測(cè)量。將含有100μL30mg/mL的以測(cè)試緩沖液(50mM檸檬酸鈉，pH5.5或測(cè)試木聚糖酶的最適pH)預(yù)先稀釋的木聚糖、150μL測(cè)試緩沖液及50μL的以測(cè)試緩沖液稀釋的酶(15μg/mL)的反應(yīng)混合液在40℃下孵育。在多個(gè)時(shí)間間隔，取出50μL的樣品并通過(guò)稀釋于1mL 5mM的NaOH中終止反應(yīng)。用羥基苯甲酸酰肼試劑(HBAH)確定還原糖的量(Lever，1972，它通過(guò)引用的方式納入本文)。
實(shí)施例3木聚糖酶突變體的嗜熱性 檢測(cè)嗜熱性以測(cè)試不同溫度對(duì)于由不同木聚糖酶突變體對(duì)可溶木聚糖的酶促水解的作用。
該測(cè)定的步驟類似于標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，不同之處是孵育溫度和時(shí)間。將木聚糖酶(15μg/mL)和可溶樺木木聚糖——在50mM pH5.5的檸檬酸鈉緩沖液中或者另外聲明——混合，并孵育于不同溫度的循環(huán)水浴中。在孵育30分鐘后，用HBAH分析確定從木聚糖釋放的還原糖的量，并將其計(jì)算為相對(duì)活性，以40℃或最適溫度下的值作為100％。
圖3示出溫度對(duì)于由具有S40H、K58R、S99C或Y118C之類單突變的里氏木霉木聚糖酶TrX對(duì)水解木聚糖的水解的作用。
木聚糖酶TrX-40H中的突變S40H與TrX相比在較高溫度下顯示了適度改良的酶活性(圖3)。對(duì)于木聚糖酶TrX-58R的情況，如Turunen et al.(2002)已報(bào)道的，單突變K58R與TrX相比沒(méi)有出現(xiàn)改良(圖3)。
雖然單突變Y118C在如木聚糖酶TrX-118C中提高嗜熱性(圖3)已經(jīng)在本領(lǐng)域中有記載(WO 03/046169)，但是從來(lái)沒(méi)有研究通過(guò)引入半胱氨酸-118形成二硫鍵的可能性。該突變有可能與殘基99處的半胱氨酸置換形成二硫鍵合。
首先以木聚糖酶突變體TrX-99C形式測(cè)試了單突變S99C(圖3)，它在較高溫度沒(méi)有明顯的酶活性提高，因此這證明了該突變對(duì)TrX的溫度/活性譜沒(méi)有作用。然而，當(dāng)以木聚糖酶雙突變體TrX-99C-118C的形式整合突變S99C和Y118C時(shí)，嗜熱性有顯著提高(圖3)，甚至是當(dāng)與單突變體TrX-118C相比時(shí)。雙突變體TrX-99C-118C的最適溫度比天然木聚糖酶TrX提高約7℃(圖4)。TrX-99C-118C除了有較高的最適溫度(圖4)外，它與TrX相比在各自的最適溫度下還呈現(xiàn)出更高的最佳活性(圖3)。
突變S40H和K58R對(duì)突變99C/118C有疊加效應(yīng)以提高在較高溫度下的酶活性，以木聚糖酶突變體TrX-58R-99C-118C、TrX-40H-99C-118C和TrX-40H-58R-99C-118C的形式確證了這一事實(shí)(圖3和4)。雖然突變K58R單獨(dú)不能提高木聚糖酶在較高溫度下的活性(圖3)，但是已經(jīng)證明了它與其他突變S40H和S99C/Y118C結(jié)合有正效應(yīng)。
這些新突變與本領(lǐng)域中已經(jīng)記載的其他有利突變是相容的。這在下文中具有較高最適溫度和最佳活性的木聚糖酶變體的制備中得到了證明。
已經(jīng)記載了——以突變體TrX-10H-27M-29L(或TrX-HML)的形式——突變N10H、Y27M和N29L提高了TrX的嗜熱性(美國(guó)專利No.5,759,840)。制備了木聚糖酶變體TrX-10H-27M-29L-40R-58R-99C-118C(圖5)和TrX-10H-27M-29L-40R-58R-75A-99C-118C，它們具有進(jìn)一步提高的嗜熱性(圖5)。
WO 01/92487中記載了——以突變體TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E(TrX-HML-AHAE)的形式——突變N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A和I129E提高了TrX的嗜熱性。制備了木聚糖酶變體TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E(圖6和8)和TrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(圖6)，二者都具有進(jìn)一步提高的嗜熱性。
WO 03/046169中記載了突變N11D。添加該突變制備了變體TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(圖6、7和8)。在該變體中引入突變40(S40C、A、F、H、R、Y或T)的變異產(chǎn)生了新的突變體TrX-10H-11D-27M-29L-40X-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(其中X＝C、A、F、H、R、Y和T)。如上文的研究所表明的，引入突變S40H或S40R與宿主酶相比適度改良了較高溫度下的相對(duì)活性(圖6、7和8)。再者，其他突變S40C、S40F和S40Y呈現(xiàn)出相同的提高效應(yīng)(圖7)，而S40T和S40A對(duì)溫度/活性譜沒(méi)有這種提高效應(yīng)(圖7)。
將另一突變Q52C引入TrX-10H-11D-27M-29L-40H-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E中。木聚糖酶突變體TrX-10H-11D-27M-29L-40H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E也能夠在80和85℃的較高溫度下保持顯著高的相對(duì)活性(圖6、7和8)。
已經(jīng)證明突變H144R和Q161R(見(jiàn)WO 03/046169所述)可提高木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-75A-105H-118C-125A-129E-144R-161R(或TrX-10H-11D-27M-29L-AH-118C-AE-RR)的最適pH。添加突變S40R、K58R和S99C使得木聚糖酶突變體TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R-161R在80和85℃的較高溫度下保持較高的活性(圖9)。
上文的結(jié)果證明了突變S40X(X＝C、F、H、R或Y)、Q52C、K58R及二硫化突變S99C/Y118C對(duì)木聚糖酶突變體嗜熱性的提高效應(yīng)不僅在彼此之間是互補(bǔ)的或疊加的，而且與本領(lǐng)域已公開(kāi)的其他突變(美國(guó)專利No.5,759,840、WO 01/92487和WO 03/046169)也是互補(bǔ)的或疊加的。
實(shí)施例4木聚糖酶突變體的嗜堿性 檢測(cè)遺傳修飾的木聚糖酶的嗜堿性以測(cè)試不同pH條件對(duì)木聚糖酶突變體酶促水解可溶樺木木聚糖的作用。該測(cè)定的步驟類似于標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，不同之處是孵育溫度和時(shí)間。將遺傳修飾的木聚糖酶(15μg/mL)樣品和可溶木聚糖在pH處于4-8之間的50mM檸檬酸鈉緩沖液中在55℃或65℃下共同孵育，如所述。在孵育30分鐘后，用HBAH分析確定從木聚糖底物釋放的還原糖的量，并且以最大活性作為100％為多種木聚糖酶突變體計(jì)算酶活性，所述酶活性是pH的函數(shù)。
研究了突變S99C/Y118C對(duì)木聚糖酶pH/活性譜的作用。這種新的二硫化突變體TrX-99-C118C與天然木聚糖酶TrX相比在6.5-7.5的較高pH值下保持了較大的活性(圖10)。該木聚糖酶的二硫化突變體TrX-99-C118C保持80％最大活性的pH范圍是4.8-7.0，而天然木聚糖酶TrX僅為4.8-6.0，這表明前者具有更寬的有效pH范圍。
具有單突變TrX-99C和TrX-118C的木聚糖酶也與TrX-99C-118C和天然木聚糖酶TrX進(jìn)行了對(duì)比。TrX-99C和TrX-118C都與TrX具有相同的pH/活性譜(圖10)。這確證了在較高pH下活性的改良是突變S99C和Y118C結(jié)合形成二硫鍵的結(jié)果，而非單Cys突變的結(jié)果。
還在上文構(gòu)建的兩組突變體中研究了突變S40X(X為H或R)、K58R和二硫化S99C/Y118C對(duì)木聚糖酶pH/活性譜的作用。
第一組衍生自突變體TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E(或TrX-HML-AH-AE)并在WO 01/92487中有記載。如TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E、TrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E、TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E和TrX-10H-11D-27M-29L-40H-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E的衍生物與親本TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E相比在較高pH下顯示了更大的活性(圖11)。然而，TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E活性的極大改良——與親本木聚糖酶TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E相比——是通過(guò)添加99C/118C二硫化實(shí)現(xiàn)的。該系列中具有突變S40H或K58R的其他木聚糖酶突變體對(duì)木聚糖酶活性的沒(méi)有其他作用。
突變S99C/Y118C的提高作用還在基于TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E-144R-161R的第二組中被進(jìn)一步證實(shí)，這個(gè)木聚糖酶包含兩個(gè)已經(jīng)被證明可成功增加木聚糖酶最適pH的突變H144R和Q161R(參見(jiàn)WO 01/92487)。這個(gè)構(gòu)建體TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R-161R在較高pH下呈現(xiàn)出比其親本TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E-144R-161R更大的活性(圖12)。它還優(yōu)于另一個(gè)木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-75A-105H-116G-118C-125A-129E-144R-161R(圖12)，一種在WO 03/046169的木聚糖酶突變體中顯示出最大改良的pH/活性譜的木聚糖酶突變體。
實(shí)施例5木聚糖酶突變體的熱穩(wěn)定性 在無(wú)底物的情況下研究了木聚糖酶對(duì)不同溫度孵育的耐受性。將溶于測(cè)定緩沖液(50mM檸檬酸鈉，pH 5.0)中的木聚糖酶(150μg/mL)在48、52、56和60℃下孵育30分鐘。將樣品冷卻至室溫(大約20℃)并通過(guò)在55℃下利用HBAH測(cè)定法測(cè)定30分鐘確定這些樣品的殘余酶活性。將48℃下的殘余酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為100％。
在較高溫度下孵育之后，二硫化突變TrX-99C-118C保持了比天然木聚糖酶TrX更高的殘余活性(圖13)。該二硫化木聚糖酶的T50為58℃，與天然木聚糖酶TrX的51℃的T50(圖13)相比，前者的熱穩(wěn)定性提高了約7℃。
雖然本發(fā)明已經(jīng)描述了呈現(xiàn)出了改良的嗜熱性、嗜堿性和熱穩(wěn)定性的木聚糖酶突變體以及與這些酶在紙漿生產(chǎn)中具有的優(yōu)點(diǎn)，但是也可以將這些木聚糖酶突變體用于其他的工業(yè)過(guò)程中，例如但不限于清洗精密儀器和半導(dǎo)體。再者，得益于木聚糖酶突變體的提高的嗜熱性和熱穩(wěn)定性，它們可以被用于使用少量變性劑或去污劑或者溶劑的化學(xué)處理中，所述溶劑例如但不限于少量非極性溶劑——例如但不限于己烷、二噁烷、四氯化碳、苯、醚、氯仿、醋酸和二氯甲烷；以及極性溶劑——例如但不限于丙酮、乙醇、二甲基酰胺、乙腈、環(huán)丁砜、二甲基亞砜和水。
實(shí)施例6分離里氏木霉基因組DNA并構(gòu)建里氏木霉基因組文庫(kù) 里氏木霉菌株M2C38是Iogen Corporation的專利菌株，所述菌株衍生自里氏木霉RutC30(ATCC #56765；Montenecourt and Eveleigh，1979)，后者又衍生自里氏木霉Qm6A(ATCC # 13631；Mandels and Reese，1957)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本文描述的方法、來(lái)自這些菌株的遺傳構(gòu)建體及遺傳構(gòu)建體在這些菌株中的表達(dá)均適用于所有衍生自Qm6A的木霉菌株。
為了分離基因組DNA，用無(wú)菌接種環(huán)將從馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板收集的里氏木霉孢子接種于50mL的馬鈴薯葡萄糖肉湯(Difco)中。在28℃下以200rpm將培養(yǎng)物振蕩2-3天。將菌絲體在GFA玻璃微纖維過(guò)濾器(Whatman)上過(guò)濾并用冷的去離子水清洗。將真菌塊在液氮中凍結(jié)并且用預(yù)冷的研缽和研杵將其研磨成粉末；將0.5g粉末化的生物菌體懸浮于5mL pH 7.5的100mMTris、50mM EDTA加1％的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液中。將裂解產(chǎn)物離心(4℃，5000g 20分鐘)以使細(xì)胞碎片成片狀沉淀。將上清液用1倍體積的緩沖液(10mM Tris、1mM EDTA，pH 8.0)飽和的苯酚萃取，然后用1倍體積的緩沖液飽和的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)萃取以去除可溶蛋白。通過(guò)添加0.1體積pH5.2的3M醋酸鈉及2.5體積冷的95％乙醇從溶液中沉淀DNA。在-20℃下放置至少1小時(shí)后，通過(guò)離心(4℃，5000g 20分鐘)使DNA沉淀成片，用10mL 70％乙醇沖洗，在空氣中晾干并再懸浮于1mL pH 8.0的10mMTris、1mM EDTA溶液中。通過(guò)加入核糖核酸酶A(Boehringer Mannheim)至終濃度0.1mg/mL并在37℃下孵育1小時(shí)消化RNA。依次用1倍體積的緩沖液飽和的苯酚和1倍體積的緩沖液飽和的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)萃取以用于從該DNA溶液中去除核糖核酸酶。再次用0.1體積pH5.2的3M醋酸鈉及2.5體積冷的95％乙醇沉淀DNA，通過(guò)離心使之成片，用70％的乙醇沖洗，在空氣中晾干并再懸浮于50μL pH 8.0的10mM Tris、1mM EDTA溶液中。通過(guò)測(cè)量溶液在260nm下的吸光度確定DNA的濃度(p.Cl in Sambrook et al.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd.ed.Cold SpringHarbor，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)。
使用從里氏木霉菌株M2C38分離的基因組DNA構(gòu)建兩個(gè)質(zhì)粒文庫(kù)和一個(gè)噬菌體文庫(kù)。在質(zhì)粒pUC119中構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)(Viera and Mess ing，1987)，步驟如下將體積100μL的10μg基因組DNA在37℃下用2單位/μg的BamH1或EcoR1限制性內(nèi)切酶消化20小時(shí)。將該消化的DNA在0.75％瓊脂糖凝膠上于0.04M Tris-醋酸鹽、1mM EDTA中電泳進(jìn)行分離并用溴化乙錠染色。將對(duì)應(yīng)于目的基因大小(基于發(fā)表的信息和DNA印跡)的凝膠片切下并經(jīng)過(guò)電洗脫以回收DNA片段(Sambrook et al.，第6.28-6.29頁(yè))。在含有20-50μg/mL的載體插入DNA摩爾比為2:1的DNA、1mM ATP及5單位T4 DNA連接酶且總體積為10-15μL的連接反應(yīng)液中于4℃下反應(yīng)16小時(shí)，將這些富集的DNA片段連接至pUC119中以形成基因文庫(kù)。使用Cell Porator System(Gibco/BRL)依照廠商的方案以該連接反應(yīng)物電穿孔大腸桿菌菌株HB101，并在含70μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂上篩選轉(zhuǎn)化體。
在λ載體λDASH(Stratagene，Inc.)中構(gòu)建噬菌體文庫(kù)，步驟如下用2、1、0.5和0.5單位/μg的BamHI在37℃下消化基因組DNA(3μg)1小時(shí)以產(chǎn)生9-23kB大小的片段。將每次消化產(chǎn)生的DNA通過(guò)以下步驟純化用1倍體積的Tris-飽和的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)萃取，然后用10μL pH5.2的3M醋酸鈉及250μl 95％乙醇(-20℃)沉淀。通過(guò)微量離心使該消化的DNA成片沉淀，用0.5mL冷的70％乙醇沖洗，在空氣中晾干并再懸浮于10μL無(wú)菌的去離子水中。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(在0.04M Tris-醋酸鹽、1mM EDTA中的0.8％瓊脂糖)確認(rèn)9-23kB大小的DNA片段的富集。在含有2單位T4DNA連接酶和1mM ATP的總體積為5μl的反應(yīng)液中于4℃下反應(yīng)過(guò)夜，將消化的DNA(0.4μg)連接至1μg以BamH1(Stratagene)預(yù)消化的λDASH臂中。使用

II Gold包裝蛋白(packaging extracts)(Stratagene)依照廠商的方案將連接混合物包裝至噬菌體顆粒中。用大腸桿菌宿主菌株XL1-Blue MRA(P2)滴定該文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)其含有3×105個(gè)獨(dú)立克隆。
實(shí)施例7從里氏木霉M2C38文庫(kù)中分離基因組克隆 7.1 從pUC119文庫(kù)克隆纖維二糖水解酶I(cbh1)和纖維二糖水解酶II(cbh2)基因 通過(guò)菌落轉(zhuǎn)移雜交(colony lift hybridization)鑒定了攜帶來(lái)自于重組體pUC119-BamHI或-EcoRI文庫(kù)的克隆cbh1或cbh2的大腸桿菌HB101轉(zhuǎn)化體將1-3×104個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至HyBond尼龍膜(Amersham)上；將膜的菌落面向上置于用0.5M NaOH、1M NaCl飽和的印跡紙(VWR238)上5分鐘以裂解細(xì)菌細(xì)胞并變性DNA；然后通過(guò)將膜的菌落面向上置于用pH7.5的1.5MTris、1M NaCl飽和的印跡紙(VWR 238)上5分鐘進(jìn)行中和；將膜在空氣中干燥30分鐘，然后通過(guò)在80℃下烘烤2小時(shí)將DNA固定于膜上。
在含有10-50ng靶DNA、0.2mM每種d(GCT)TP、0.5μM dATP、20-40μCiα-32P-dATP、10pmole寡核苷酸引物和0.5單位Taq聚合酶且總體積為20μL的標(biāo)記反應(yīng)液中，通過(guò)從BamH1或EcoR1片段的富集池中分別PCR擴(kuò)增cbh1和cbh2編碼區(qū)的短片段(0.7-1.5kB)制備了32P-標(biāo)記的探針。該反應(yīng)經(jīng)過(guò)6-7個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95℃，2分鐘；56℃，1.5分鐘；70℃，5分鐘)。通過(guò)加入0.5mL 10％(w/v)三氯醋酸和0.5mg酵母tRNA沉淀所述擴(kuò)增的32P-標(biāo)記的DNA。通過(guò)微量離心使DNA成片沉淀，用1mL 70％的乙醇洗滌2次，在空氣中晾干并再懸浮于pH7.5的1M Tris、1mM EDTA溶液中。
將已經(jīng)固定有重組pUC119質(zhì)粒的尼龍膜在熱封口的袋中于60-65℃下用含100μg/mL變性的剪切鮭精DNA的pH7.5的1M NaCl、1％ SDS、50mM Tris、1mM EDTA溶液預(yù)雜交1小時(shí)。在熱封口的袋中于60-65℃用僅含50μg/mL變性的剪切鮭精DNA及5×106-5×107cpm變性的cbh1或cbh2探針的相同緩沖液中雜交16-20小時(shí)。將膜用1M NaCl、0.5％ SDS于60℃下洗滌1次，持續(xù)15分鐘；用0.3M NaCl、0.5％ SDS于60℃下洗滌2次，每次持續(xù)15分鐘；用0.03M NaCl、0.5％ SDS于55℃下洗滌1次，持續(xù)15分鐘。將膜再次放入熱封口的袋中并在-70℃下暴露于Kodak RP X射線膠片下16-48小時(shí)。依照廠商的方案將X-射線膠片顯影。挑選顯示強(qiáng)信號(hào)或弱信號(hào)的克隆并在含70μg/mL氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用堿裂解法(Sambrook，et al.，第1.25-1.28頁(yè))從這些培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切消化、DNA雜交(Sambrook，et al.，第9.38-9.44頁(yè))和PCR分析(Sambrook，et al.，第14.18-14，19頁(yè))進(jìn)行分析。
通過(guò)用0.7kb的cbh1探針進(jìn)行的pUC119-BamH1文庫(kù)的菌落轉(zhuǎn)移雜交鑒定了攜帶cbh1基因的克隆，所述探針是使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增公開(kāi)的cbh1序列(Shoemaker et al.，1983.)的bp 597-1361的寡核苷酸引物制備的。分離了cbh1克隆pCOR132，它包含5.7kb的對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子(4.7kb)和1kb的cbh1結(jié)構(gòu)基因(2.3kb)的BamH1片段。通過(guò)這，將2.5kb的含有cbh1啟動(dòng)子(2.1kb)和5′末端cbh1編碼區(qū)(0.4kb)的EcoR1片段亞克隆至pUC119中以產(chǎn)生pCB152。通過(guò)用1.5kb的cbh2探針進(jìn)行的對(duì)pUC119-EcoR1文庫(kù)的菌落轉(zhuǎn)移雜交鑒定了攜帶cbh2的克隆，所述探針是使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增公開(kāi)cbh2序列(Chen et al.1987)的bp 580-2114的寡核苷酸引物制備的。分離了cbh2克隆pZUK600，它包含4.8kb的對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子(600bp)、結(jié)構(gòu)基因(2.3kb)和終止子(1.9kb)的EcoR1片段。
7.2 從λDASH文庫(kù)克隆cbh1終止子和木聚糖酶II(x1n2)基因 使用DIG標(biāo)記和探測(cè)試劑盒(Boehringer Mannheim)并依照廠商方案，通過(guò)隨機(jī)引物標(biāo)記從cbh1和x1n2基因的PCR擴(kuò)增編碼區(qū)制備了異羥基洋地黃毒苷配基-11-dUTP(Digoxigen-11-dUTP)標(biāo)記的探針。通過(guò)λDASH文庫(kù)的噬斑轉(zhuǎn)印雜交鑒定了含有cbh1和x1n2基因的基因組克隆。對(duì)于每個(gè)目的基因，將1×104個(gè)克隆轉(zhuǎn)移至

(Schleicher and Schull)尼龍膜。通過(guò)將膜的噬斑面向上置于用0.5M NaOH、1M NaCl飽和的印跡紙(VWR 238)上5分鐘裂解噬菌體顆粒并變性噬菌體DNA；然后通過(guò)將膜的噬斑面向上置于用pH 7.5的1.5M Tris、1M NaCl飽和的印跡紙(VWR 238)上5分鐘進(jìn)行中和；將膜在空氣中干燥30分鐘，然后通過(guò)在80℃下烘烤2小時(shí)將DNA固定于膜上。將膜在熱封口的袋中于65℃下用含6×SSPE、5×Denhardt溶液、1％SDS加100μg/mL變性的剪切鮭精DNA的溶液預(yù)雜交2小時(shí)。然后將膜在熱封口的袋中于65℃下用含50μg/mL變性的剪切鮭精DNA及0.5μg異羥基洋地黃毒苷配基-dUTP標(biāo)記探針的相同緩沖液雜交過(guò)夜。將膜用2×SSPE、0.1％ SDS于室溫下洗滌15分鐘2次，用0.2×SSPE、0.1％ SDS于65℃下洗滌15分鐘2次，用2×SSPE洗滌5分鐘1次。依照廠商的方案，通過(guò)與抗-異羥基洋地黃毒苷配基/堿性磷酸酶抗體綴合合物、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和4-硝基藍(lán)四氮唑(Boehringer Mannheim)的反應(yīng)鑒定了陽(yáng)性雜交克隆。通過(guò)用異羥基洋地黃毒苷配基-dUTP標(biāo)記探針的第二輪篩選進(jìn)一步純化了陽(yáng)性雜交克隆。
單個(gè)克隆的分離及噬菌體DNA的純化如Sambrook et al.(1989)第2.118-2.121頁(yè)中的描述，不同之處是CsCl梯度步驟由使用1倍體積的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)及1倍體積的氯仿:異戊醇(24:1)的萃取所替代。用0.1體積pH 5.2的3M醋酸鈉及2.5體積冷的95％乙醇沉淀DNA。用0.5mL冷的70％乙醇沖洗沉淀的噬菌體DNA，在空氣中晾干并再懸浮于50μL pH 8.0的10mM Tris、1mM EDTA溶液中。通過(guò)將純化噬菌體DNA限制性消化及使用與用于篩選λDASH文庫(kù)的相同的異羥基洋地黃毒苷配基-dUTP標(biāo)記探針進(jìn)行DNA印跡雜交(Sambrook，et al.，第9.38-9.44頁(yè))，鑒定包含目的基因的限制片段。通過(guò)與用于噬斑轉(zhuǎn)印的相同的方法雜交所述膜并顯影陽(yáng)性雜交的片段。一旦鑒定了來(lái)自每個(gè)λDASH克隆的所需限制片段，重復(fù)進(jìn)行限制性消化，將片段于TAE中在0.8％瓊脂糖凝膠上分離并切下所需的帶。使用SephaglasBandPrep試劑盒(Pharmacia)依照廠商的方案從凝膠片上洗脫DNA。
通過(guò)使用含有公開(kāi)cbh1序列(Shoemaker et al.)的bp45-2220的cbh1探針進(jìn)行的對(duì)λDASH文庫(kù)(實(shí)施例7)的菌落轉(zhuǎn)移雜交，鑒定了攜帶cbh1基因的克隆。通過(guò)將從λDASH cbh1克隆純化的噬菌體DNA進(jìn)行限制性消化分離了1.8kb的含cbh1編碼區(qū)(0.5kb)的3’端和cbh1終止子(1.3kb)的BamHI片段。將該片段亞克隆入大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC119的BamH1位點(diǎn)以產(chǎn)生質(zhì)粒pCB1Ta。通過(guò)使用含有公開(kāi)x1n2序列(Saarelainen et al.，1993，Mol.Gen.Genet.241497-503)的bp100-783的x1n2探針進(jìn)行的對(duì)λDASH文庫(kù)(實(shí)施例7)的菌落轉(zhuǎn)移雜交，鑒定了攜帶x1n2基因的克隆。通過(guò)將從λDASHx1n2克隆純化的噬菌體DNA進(jìn)行限制性消化分離了5.7kb的含x1n2的啟動(dòng)子(2.3kb)、編碼區(qū)(0.8kb)和終止子(2.6kb)的Kpn1片段。將該片段亞克隆入pUC119的Kpn1位點(diǎn)以產(chǎn)生質(zhì)粒pXYN2K-2。
實(shí)施例8構(gòu)建在里氏木霉中指導(dǎo)修飾的家族11木聚糖酶表達(dá)的載體 使用x1n2-專用引物(包含位于bp190-195的PinA1或密碼子31和32)和pUC反向引物(可與位于x1n2基因5′末端的Kpn1位點(diǎn)的下游退火)(Cat.No.18432-013，Gibco/BRL)以Pwo聚合酶從基因組x1n2亞克隆pXYN2K-2(實(shí)施例7)擴(kuò)增2.4kb的含有x1n2基因啟動(dòng)子和分泌信號(hào)(bp-2150至+195，其中+1表示ATG起始密碼子且+193-195代表密碼子32)的片段。將該x1n2PCR產(chǎn)物作為平末端片段以某一方向插入至pUC119聚合接頭的SmaI位點(diǎn)中，所述方向即聚合接頭的BamHI位點(diǎn)位于PinAI位點(diǎn)的3′端；這產(chǎn)生了質(zhì)粒pUC/XynPSS(Pin)。通過(guò)用EcoR1(其被從pXYN2K-2擴(kuò)增出來(lái)作為pUC119聚合接頭的一部分)和BamHI進(jìn)行消化從pUC/XynPSS(Pin)中再分離相同的x1n2PCR產(chǎn)物，并將其插入至質(zhì)粒pBR322L(pBR322的衍生物，在位于bp565和650的原Sph1和Sal1位點(diǎn)之間含有Sph1-Not1-Sal1接頭)中，也用EcoRI和BamHI消化以產(chǎn)生質(zhì)粒pBR322LXP。為了促進(jìn)修飾的木聚糖酶的高水平表達(dá)，將pBR322LXP中1.23kb的含有x1n2啟動(dòng)子的bp-1400至-121的HindIII片段替換為通過(guò)HindIII消化pCOR132分離的1.2kb的含有cbh1啟動(dòng)子的bp-1399至-204的HindIII片段；這產(chǎn)生了質(zhì)粒pBR322LXC。最后，然后將pBR322LXC的EcoRI位點(diǎn)用Klenow進(jìn)行鈍化，并且加入Spe1接頭(Cat.No.1086，NewEngland Biolabs)以產(chǎn)生pBR322SpXC。
將含有通過(guò)用NheI和BamHI消化從質(zhì)粒pUC/HML(下文實(shí)施例9.1中所述)分離的包含突變N27H、Y27M和N29L的木聚糖酶基因第1-190位密碼子的片段插入至NheI和BamHI消化的pCB219N-N中以產(chǎn)生pHML/C2ter。為了制備pCB219N-N，使用與cbh2基因(Chen et al.，1987)的公開(kāi)3′非翻譯區(qū)的bp2226-2242同源并含有在5′末端包含XbaI-NheI-BamHI-SmaI-Kpn1位點(diǎn)的短聚合接頭的引物以及可與pZUK600(上文實(shí)施例7中所述)中位于cbh23′末端的EcoR1上游退火的pUC正向引物(Cat.No.1224，New EnglandBiolabs)，從pZUK600模板擴(kuò)增cbh2終止子片段。在改造的XbaI和EcoRI位點(diǎn)消化該片段并且將其插入至pUC119的相應(yīng)位點(diǎn)以產(chǎn)生pCB219。將EcoRI-NotI接頭(Cat.No.35310-010，Gibco/BRL)插入至pCB219的單EcoRI位點(diǎn)以產(chǎn)生pCB219N。通過(guò)用PinAI和NotI消化從pHTX4/C2ter中分離2.7kb的含有HTX4基因第9-190密碼子及cbh2終止子的片段，并將其插入至PinAI和NotI消化的pBR322SpXC中以產(chǎn)生表達(dá)盒pc/xHML-EC。
實(shí)施例9誘變里氏木霉木聚糖酶II以產(chǎn)生變體TRX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N 9.1 引入突變N10H、27M和Y29L 將pTrX-HML(實(shí)施例1.4)中包含第32-190密碼子的合成DNA替換成包含位于密碼子58處的108bp的內(nèi)含子的里氏木霉x1n2的相應(yīng)基因組片段，該片段是使用基因組里氏木霉DNA作為模板擴(kuò)增的并在密碼子31和32處引入單PinAI位點(diǎn)及在TAG終止密碼子的直接下游區(qū)引入單BamHI。這產(chǎn)生了pUC/HML。
9.2 引入突變75A、105H、125A和129E 將3.2kb的包含啟動(dòng)子區(qū)、x1n2基因和一部分的cbh2終止子的SstI片段從pc/xHML-EC(實(shí)施例8)中分離并克隆進(jìn)入誘變載體

-1(Promega)的聚合接頭的SstI位點(diǎn)中。進(jìn)行了4個(gè)連續(xù)的誘變循環(huán)以改變特定的氨基酸，使用的是為引入所需突變而專門(mén)設(shè)計(jì)的引物 S75AAGCTACCTCG CCGTGTACGG(SEQ ID NO83) L105HCCACCAAGCA CGGCGAGGT(SEQ ID NO84) S125AACGCAGCGCG TCAACGCCCC GTCCATCATC GGC(SEQ ID NO85) I129EAACGCCCCGT CCATCGAGGG CACCGCCACC TTT(SEQ ID NO86) (參見(jiàn)WO 01/92487和WO 03/046169；相關(guān)的方法通過(guò)引入的方式納入本文)；這產(chǎn)生了質(zhì)粒pALT-TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E。所有引入的突變通過(guò)DNA序列分析進(jìn)行了驗(yàn)證。
9.3 引入突變K58R、S99C和Y118C 使用Promega Altered

II體外誘變系統(tǒng)及引物序列 K58RGGC ACC AAG AAC CGC TAA GAC TAC CTA(SEQ ID NO87) S99CACC TAC AAC CCG TGC ACG GGC GCC ACC(SEQ ID NO88) Y118CC TAC GAC ATT TGC CGC ACG C(SEQ ID NO89) 對(duì)質(zhì)粒pALT-TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的誘變以引入突變K58R、S99C和Y118C并產(chǎn)生pALT-TrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E。所有引入的突變通過(guò)DNA序列分析進(jìn)行了驗(yàn)證。
9.4 引入突變N11D和S40R 使用Promega Altered Sites

II體外誘變系統(tǒng)及引物序列 N11DGGT TAC CAC GAC GGT TAC T(SEQ ID NO90) S40RTCC GTC AAC TGG CGC AAC TCG GGC AAC(SEQ ID NO91) 對(duì)質(zhì)粒pALT-TrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的誘變以引入突變N11D和S40R并產(chǎn)生pALT-TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E。所有引入的突變通過(guò)DNA序列分析進(jìn)行了驗(yàn)證。
9.5 引入突變T131N 使用Promega Altered

II體外誘變系統(tǒng)及引物序列 T131NCCG TCC ATC GAG GGC AAC GCC ACC TTT TAC(SEQ ID NO92) 對(duì)質(zhì)粒pALT-TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的誘變以引入突變T131N并產(chǎn)生pALT-TRX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N。引入的突變通過(guò)DNA序列分析進(jìn)行了驗(yàn)證。
實(shí)施例10構(gòu)建在里氏木霉中指導(dǎo)TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N表達(dá)的載體 將3640bp的來(lái)自pALT-TRX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N且包含啟動(dòng)子區(qū)、修飾x1n2基因及一部分的cbh2終止子的SacI片段克隆至含有pSP72中保留的cbh2終止子序列的質(zhì)粒SacI位點(diǎn)中。該步驟產(chǎn)生包含質(zhì)粒pc/xTRX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N-PSP的表達(dá)盒。含有質(zhì)粒pNCBg1NSNB(r)的選擇盒衍生自包含鏈孢霉(N.crassa)pyr4的質(zhì)粒pFB6(Radford et al，1985)。將3.2kb的來(lái)自質(zhì)粒pFB6并包含鏈孢霉pyr4基因(GenBank登記號(hào)M13448)及其啟動(dòng)子、終止子和某些5′序列的BglII片段克隆至在聚合接頭(EcoRI和SacI之間)中pUC119的BamHI位點(diǎn)中以產(chǎn)生pNCBg1-NSNB(r)，所述pUC119的BamHI經(jīng)過(guò)了修飾以包含NotI、SmaI、NheI和BglII位點(diǎn)。將2238bp的包含整個(gè)鏈孢霉pyr4編碼區(qū)、啟動(dòng)子和終止子的KpnI片段從pNCBg1-NSNB(r)分離并克隆至包含所述表達(dá)盒的單KpnI位點(diǎn)的質(zhì)粒中以產(chǎn)生pc/xTRX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N-TV。
實(shí)施例11轉(zhuǎn)化里氏木霉M2C38 將5×106個(gè)M2C38aux5的孢子置于添加5mM尿苷的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上的無(wú)菌玻璃紙上并在30℃下孵育20小時(shí)以促進(jìn)孢子萌發(fā)和菌絲體生長(zhǎng)。將含菌絲體的玻璃紙片轉(zhuǎn)移至10mL原生質(zhì)體溶液中，所述原生質(zhì)體溶液是在含0.6M硫酸銨的pH 6.5的50mM磷酸鉀緩沖液(緩沖液P)中含7.5g/L崩潰堿(Driselase)及125單位的不含蛋白酶的β葡聚糖酶(InterSpex ProductsInc.，貨號(hào)分別為0465-1和0410-3)。以60rpm振蕩5小時(shí)消化菌絲體叢。通過(guò)以無(wú)菌的No.30 MIRACLOTH的過(guò)濾從未消化的菌絲體分離原生質(zhì)體，將其收集至無(wú)菌的50mL圓底離心管中并在常溫下通過(guò)以1000-1500×g離心10分鐘進(jìn)行回收。用5mL緩沖液P洗滌原生質(zhì)體并在室溫下以1000-1500×g再次離心10分鐘。將原生質(zhì)體重新懸浮于1mL的STC緩沖液中(1.2M山梨糖醇、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl，pH 7.5)。為了進(jìn)行轉(zhuǎn)化，0.1mL再懸浮的原生質(zhì)體與10μg載體DNA和25μL的PEG溶液(25％ PEG 4000、50mM CaCl2、10mM Tris-HCl，pH 7.5)組合。在冰水浴中孵育30分鐘后，加入1mL的PEG溶液并將混合物在室溫下孵育5分鐘。用2mL1.2M的山梨糖醇的PEG溶液稀釋轉(zhuǎn)化混合液，并將整個(gè)混合液加入冷卻至約47℃的25mL熔化MMSS瓊脂培養(yǎng)基(見(jiàn)下文)中，然后將原生質(zhì)體懸浮液傾倒于MMSS瓊脂上。將平板在30℃下孵育直至長(zhǎng)成可見(jiàn)的菌落。將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移至含MM瓊脂的單平板上并使得孢子形成。收集孢子并以高度稀釋鋪平板于MM瓊脂上以分離同核體轉(zhuǎn)化體，然后將所述轉(zhuǎn)化體鋪平板于PDA上以使其生長(zhǎng)并形成足夠的孢子用于接種如下文實(shí)施例12中所述的篩選培養(yǎng)物。
基本培養(yǎng)基(MM)瓊脂包含表21中所列的成分。
表21
MMSS瓊脂含有與MM瓊脂相同的成分并添加1.2M山梨糖醇、1g/L YNB(無(wú)氨基酸酵母氮源，購(gòu)自于DIFCO Cat.No.291940)及0.12g/L氨基酸(-UraDO Supplement，購(gòu)自于BD Biosciences Cat.No.630416)。
實(shí)施例12在里氏木霉培養(yǎng)物過(guò)濾液中檢測(cè)嗜熱性木聚糖酶活性 通過(guò)在65℃下測(cè)量從可溶性小麥阿拉伯木聚糖底物釋放的還原糖確定里氏木霉轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物過(guò)濾液中存在嗜熱性木聚糖酶活性。具體地，將30μL適當(dāng)稀釋的培養(yǎng)物過(guò)濾液在65℃下預(yù)孵育5分鐘。接著，將300μL的1.5％小麥阿拉伯木聚糖(Megazyme International)溶液(將小麥阿拉伯木聚糖重新溶解于含0.04％土溫的pH7.0磷酸鹽緩沖液中)也在65℃下預(yù)孵育5分鐘，并且加入至微量離心管的酶樣品中。將管短暫渦旋以促進(jìn)混合，然后將反應(yīng)物在65℃下孵育20分鐘。通過(guò)加入150μL含43.64mM 2-羥基-3，5-二硝基苯甲酸、0.93M酒石酸鈉鉀、0.4M氫氧化鈉和0.4M氫氧化鉀的終止溶液終止酶促水解反應(yīng)。然后將生成的溶液煮沸10分鐘以促進(jìn)2-羥基-3，5-二硝基苯甲酸與通過(guò)酶從阿拉伯木聚糖底物釋放的還原糖的反應(yīng)。將該管在冰上冷卻5分鐘，然后加入1.5mL去離子水。在530nm測(cè)定該溶液的吸光度。在孵育過(guò)程中通過(guò)嗜熱性木聚糖酶釋放的還原糖的量通過(guò)以下的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，即與相同終止溶液反應(yīng)的多個(gè)稀釋度純木糖溶液的A530測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例13在液體培養(yǎng)物中生產(chǎn)修飾的木聚糖酶 將木霉的單菌落轉(zhuǎn)移至PDA平板用于繁殖每種培養(yǎng)物。為了將用于測(cè)試培養(yǎng)物產(chǎn)生嗜熱性木聚酶和纖維素酶能力的微培養(yǎng)物進(jìn)行統(tǒng)一接種，孢子形成是必需的。培養(yǎng)基組成如下 表22
*微量元素溶液含5g/L FeSO4·7H2O；1.6g/L MnSO4·H2O；1.4g/L ZnSO4·7H2O。
**葡萄糖、纖維素粉(Solka floc)、纖維二糖、槐糖、玉米糖漿或微晶纖維素。碳源可以pH2-7的水溶液形式單獨(dú)進(jìn)行滅菌并在起始時(shí)或者在發(fā)酵過(guò)程中加入至其他培養(yǎng)基中。
在24-孔微型板上，將單轉(zhuǎn)化體以1mL培養(yǎng)物的規(guī)模培養(yǎng)于上述培養(yǎng)基中。起始pH為5.5，在接種前將培養(yǎng)基用蒸汽高壓滅菌器在121℃滅菌30分鐘。對(duì)于天然細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從PDA平板分離孢子，懸浮于水中并以104-106孢子/mL用于接種每種培養(yǎng)物。在30℃的溫度下以500rpm振蕩培養(yǎng)物6天的時(shí)間。通過(guò)以12,000rpm離心從含分泌蛋白的過(guò)濾液分離生物菌體。使用Bio-Rad蛋白測(cè)定方法(Cat.No.500-0001)確定蛋白濃度。如實(shí)施例12中所述確定木聚糖酶活性。選擇表達(dá)最高的木聚糖酶活性及呈現(xiàn)出高總蛋白產(chǎn)量的菌株用于在30升試發(fā)酵中培養(yǎng)。
實(shí)施例14在30L補(bǔ)料分批發(fā)酵中生產(chǎn)木聚糖酶 將里氏木霉菌株在28-30℃下培養(yǎng)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，直至孢子的菌苔匯聚。收集孢子并用于接種2L培養(yǎng)瓶中750mL的Berkeley培養(yǎng)基(10g/L葡萄糖、1.4g/L(NH4)2SO4、2.0g/L KH2PO4、0.31g/L MgSO4·7H2O、0.53g/LCaCl2；5.1g/L干玉米漿、5mg/L FeSO4·7H2O；0.8mg/L MnSO4·H2O、0.7mg/LZnSO4·7H2O)。在28℃及150rpm下培養(yǎng)3天后，將該培養(yǎng)物用于接種23L具有以下初始組分的發(fā)酵培養(yǎng)基中31g/L葡萄糖、4.4g/L(NH4)2SO4、2.77g/L KH2PO4、1.4g/L MgSO4·7H2O、0.37g/L CaCl2、12g/L干玉米漿、3.5mg/LFeSO4·7H2O、1.12mg/L MnSO4·H2O、0.98g/L ZnSO4·7H2O。將使用實(shí)施例13中所列的一種或多種誘導(dǎo)性碳水化合物源的補(bǔ)料分批需氧發(fā)酵在30L NewBrunswick Microferm發(fā)酵罐中于pH4.5和28℃下進(jìn)行6天。在6天后，將培養(yǎng)物經(jīng)Harborlite過(guò)濾并將培養(yǎng)物過(guò)濾液調(diào)節(jié)至pH4.5，然后加0.5％的苯甲酸鹽儲(chǔ)存以防止微生物生長(zhǎng)。
每天用Bio-Rad蛋白測(cè)定方法(Cat.No.500-0001)確定發(fā)酵罐樣品中的蛋白濃度。如實(shí)施例12所述確定木聚糖酶活性。
來(lái)自轉(zhuǎn)化的里氏木霉菌株的TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N和TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E在30L發(fā)酵中的表達(dá)(生物量和木聚糖酶活性)顯示于以下的表23。
表23
實(shí)施例15修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N和TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E的嗜堿性和嗜熱性 利用木霉菌株P(guān)345A和P275H制備的修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N和TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E的pH和溫度譜顯示于圖14、15和16中。數(shù)據(jù)是通過(guò)測(cè)量在多種條件下從小麥阿拉伯木聚糖、硬木紙漿或軟木紙漿釋放的還原糖形成的。
圖14顯示TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N的最適溫度稍微高于TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E的最適溫度。每種酶的溫度譜是通過(guò)于pH7持續(xù)作用于1％小麥阿拉伯木聚糖(Megazyme International)底物上60分鐘產(chǎn)生。
圖15和16顯示，來(lái)自P345A的嗜熱的/嗜堿的酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N作用于硬木木漿和軟木木漿上時(shí)的最適pH范圍都比來(lái)自菌株P(guān)275H的TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E稍微寬。pH譜是通過(guò)在70℃下持續(xù)作用于10％稠度的木漿上60分鐘產(chǎn)生。以400mL/t紙漿的劑量添加酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N，以800mL/t紙漿的劑量添加酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E。實(shí)施例16修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N、TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E和TrX-10H-27M-29L的熱穩(wěn)定性測(cè)試 在無(wú)底物的條件下研究了修飾的木聚糖酶TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N、TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E和TrX-10H-27M-29L對(duì)不同溫度孵育的耐受性。將修飾的木聚糖酶在pH8.0的200mM Bis-Tris-丙烷緩沖液中稀釋10倍-50倍并在50℃、60℃、70℃和80℃下孵育30分鐘。在孵育期結(jié)束時(shí)，如實(shí)施例12所述確定殘余酶活性，但有以下不同將所述處理過(guò)的酶溶液的樣品以100倍稀釋度加入至預(yù)孵育至70℃的pH7.0的溶于200mM bis-tris-丙烷緩沖液的1％樺木木聚糖溶液中(對(duì)于TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N和TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E)或者預(yù)孵育至55℃的pH 6.5的溶于200mM Bis-Tris-丙烷緩沖液的1％樺木木聚糖溶液中。將殘余活性標(biāo)準(zhǔn)化為每種酶在50℃預(yù)孵育0分鐘后測(cè)量的活性。
包含二硫化99C-118C的TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N和TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E都顯示優(yōu)于無(wú)二硫化99C-118C的TrX-HML的熱穩(wěn)定性。二硫化木聚糖酶的T50被確定為71-72℃，作為對(duì)比的是TrX-10H-27M-29L的65℃的T50(圖17)。
以上通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，只要不背離本文描述的本發(fā)明的范圍，可進(jìn)行多種修改和修飾。
所有的參考文獻(xiàn)和引用通過(guò)引用的方式納入本文。
參考文獻(xiàn)
Arase，A.，Yomo，T.，Urabe，I.，Hata，Y.，Katsube，Y.and Okada，H.(1993)FEBS Lett.316123-127.
Campbell，R.L.，Rose，D.R.，Sung，W.L.，Yaguchi，M.and Wakarchuk，W.，U.S.Patent No.5,405,769.
Dani，V.S.，Ramakrishnan，C.and Varadarajan，R.(2003)Protein Engineering 16187-193.
Esteves，F(xiàn).D.L.，Ruelle，V.，Lamotte-Brasseur，J.，Quinting，B.and Frere，J.-M.(2004)Protein Science 131209-1218.
Fenel，F(xiàn).，Leisola，M.，Janis，J.and Turunen(2004)J.Biotechnology 108137-143.
Fushinobu，S.，Ito，K.，Konno，M.，Wakagi，T.and Matsuzawa，H.(1998)ProteinEngineering 111121-1128.
Gruber，K.，Klintschar，G.，Hayn，M，Schlacher，A.，Steiner，W.and Kratky，C.(1998)Biochemistry 3713475-13485.
Hakulinen，N.，Turunen，O.，Janis，J.，Leisola，M.and Rouvinen，J.(2003)Eur.J.Biochem.2701399-1412.
Irwin，D.，Jung，E.D.and Wilson，D.B.(1994)Appl.Environ.Microbiol.60763-770.
Krengel，U.and Dijkstra，B.W.(1996)J.Mol.Biol.26370-78.
Lee，S.L.，F(xiàn)orsberg，C.W.，and Rattray，J.B.(1987)Appl.Environ.Microbiol.53644-650.
Lever(1972)Analytical Biochem 47273-279.
Lüthi，E.，Jasmat，N.B.，and Bergquist，P.L.(1990)Appl.Environ.Microbiol.562677-2683.
Mathrani，I.M.and Ahring，B.K.(1992)Appl.Microbiol.Biotechnol.3823-27.
Misset，O.(1993)in Stability and Stabilization of Enzymes，edited by W.J.J.van denTweel，A.Harder and R.M.Buitelaar；published by Elsevier Science Publishers B.V.PP11l-131.
Nissen A.M.，Anker，L.，Munk，N.，and Lange，N.K.in Xylans and Xylanases，editedby J.Visser，G.Beldman，M.A.Kusters-van Someren and A.G.J.Voragen，published byElsevier，Amsterdam，1992.p325-337.
Sakka，K.，Kojima Y.，Kondo，T.，Karita，S.，Ohmiya，K.and Shimada，K.(1993)Biosci.Biotech.Biochem.57273-277.
Sapag，A.，Wouters，J.，Lambert，C.，de Ioannes，P.，Eyzaguirre，J.and Depiereux，E.(2002)J.Biotechnology 95109-131.
Simpson，H.D.，Haufler，U.R.，and Daniel，R.M.(1991)Biochem.J.(1991)277413-417.
Sowdhamini，R.，Srinivasan，N.，Shoichet，B.，Santi，D.V.，Ramakrishnan，C.andBalaram，P.(1989)Protein Engineering 395-103.
Sung，W.L.，Yao.F.-L.，Zahab，D.M.and Narang，S.A.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83561-565.
Sung，W.L.，Luk，C.K.，Zahab，D.M.and Wakarchuk，W.(1993)Protein ExpressionPurif.4200-206.
Sung，W.L.，Luk，C.K.，Chan，B.，Wakarchuk，W.，Yaguchi，M.，Campbell，R.，Willick，G.，Ishikawa，K.and Zabab，D.M.(1995)Biochem.Cell.Biol.73253-259.
Torronen，A.，and Rouvinen，J.(1995)Biochemistry 34847-856
Turunen，O.，Etuaho，K.，F(xiàn)enel.F，Vehmaanpera，J.，Wu，X.，Rouvinen，J.and Leisola，M.(2001)J.Biotechnology 8837-46.
Turunen，O.，Vuorio，M.，F(xiàn)enel.F.and Leisola，M.(2002)Protein Engineering(2002)15141-145.
Wakarchuck W.W.，Sung，W.L.，Campbell，R.L.，Cunningham，A.，Watson，D.C.andYaguchi，M.(1994)Protein Engineering 71379-1386.
Winterhalter C.and Liebl，W.(1995)Appl.Environ.Bicrobiol.611810-1815.
序列表
<110>加拿大國(guó)家研究委員會(huì)
<120>提高木聚糖酶嗜熱性、熱穩(wěn)定性和嗜堿性的修飾
<130>V8905584WO1
<140>
<141>
<150>PCT/CA2006/001192
<151>2006-07-19
<150>60/791,541
<151>2006-04-12
<160>92
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>184
<212>PRT
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)
<400>1
<210>2
<211>184
<212>PRT
<213>塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)
<400>2
<210>3
<211>185
<212>PRT
<213>環(huán)狀芽胞桿菌(Bacillus circulans)
<400>3
<210>4
<211>201
<212>PRT
<213>短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)
<400>4
<210>5
<211>185
<212>PRT
<213>枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)
<400>5
<210>6
<211>211
<212>PRT
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>6
<210>7
<211>206
<212>PRT
<213>糞堆梭菌(Clostridium stercorarium)
<400>7
<210>8
<211>211
<212>PRT
<213>生黃瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)
<400>8
<210>9
<211>197
<212>PRT
<213>裂褶菌(Schizophyllum commune)
<400>9
<210>10
<211>191
<212>PRT
<213>淺青紫鏈霉菌Xyn B(Streptomyces lividans Xyn B)
<400>10
<210>11
<211>191
<212>PRT
<213>淺青紫鏈霉菌Xyn c
<400>11
<210>12
<211>189
<212>PRT
<213>鏈霉菌36a(Streptomyces sp.No.36a)
<400>12
<210>13
<211>189
<212>PRT
<213>褐色高溫單孢菌(Thermomonospora fusca)
<400>13
<210>14
<211>190
<212>PRT
<213>哈茨木霉(Trichoderma harzianum)
<400>14
<210>15
<211>178
<212>PRT
<213>里氏木霉Xyn I(Trichoderma reesei Xyn I)
<400>15
<210>16
<211>190
<212>PRT
<213>里氏木霉Xyn II
<400>16
<210>17
<211>190
<212>PRT
<213>綠色木霉(Trichoderma viride)
<400>17
<210>18
<211>202
<212>PRT
<213>產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes)
<400>18
<210>19
<211>189
<212>PRT
<213>泡盛曲霉變種kawachi(Aspergillus awamori var.kawachi)
<400>19
<210>20
<211>194
<212>PRT
<213>嗜熱真菌(Thermomyces lanuginosus)
<400>20
<210>21
<211>184
<212>PRT
<213>白曲霉Xyn C(Aspergillus kawachii Xyn C)
<400>21
<210>22
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述TrX-1
<400>22
<210>23
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述XyTv-2
<400>23
<210>24
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述TrX-3
<400>24
<210>25
<211>74
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述XyTv-4
<400>25
<210>26
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述TrX-8
<400>26
<210>27
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述XyTv-7
<400>27
<210>28
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述TrX-6
<400>28
<210>29
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述XyTv-5
<400>29
<210>30
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述XyTv-101
<400>30
<210>31
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述XyTv-102
<400>31
<210>32
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述TrX-103
<400>32
<210>33
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述XyTv-104
<400>33
<210>34
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述XyTv-105
<400>34
<210>35
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述XyTv-110
<400>35
<210>36
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述XyTv-109
<400>36
<210>37
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述XyTv-108
<400>37
<210>38
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述XyTv-107
<400>38
<210>39
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述XyTv-106
<400>39
<210>40
<211>596
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述TrX
<400>40
<210>41
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述蛋白A的分泌前導(dǎo)序列
<400>41
<210>42
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述蛋白A的互補(bǔ)分泌前導(dǎo)序列
<400>42
<210>43
<211>112
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述TrX-HML
<400>43
<210>44
<211>108
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述TrX-HML互補(bǔ)序列
<400>44
<210>45
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述TX-10H-1
<400>45
<210>46
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>互補(bǔ)人工序列描述TX-10H11D-1
<400>46
<210>47
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-C1
<400>47
<210>48
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-58R-1
<400>48
<210>49
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-40H-1
<400>49
<210>50
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-40R-1
<400>50
<210>51
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-99C-1
<400>51
<210>52
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-75A-1
<400>52
<210>53
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-118C-1
<400>53
<210>54
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-99C105H-1r
<400>54
<210>55
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-40C-1
<400>55
<210>56
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-40Y-1
<400>56
<210>57
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-40F-1
<400>57
<210>58
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-40T-1
<400>58
<210>59
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-40A-1
<400>59
<210>60
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Tx-52C-1r
<400>60
<210>61
<211>306
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述TrX(1-91)
<400>61
<210>62
<211>298
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述與TrX(1-91)互補(bǔ)
<400>62
<210>63
<211>290
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述TrX(92-190)
<400>63
<210>64
<211>306
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述與TrX(92-190)互補(bǔ)
<400>64
<210>65
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-40H
<400>65
<210>66
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-99C-118C
<400>66
<210>67
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-40H-99C-118C
<400>67
<210>68
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-58R-99C-118C
<400>68
<210>69
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-40H-58R-99C-118C
<400>69
<210>70
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-HML-40R-58R-99C-118C
<400>70
<210>71
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-HML-40R-58R-75A-99C-118C
<400>71
<210>72
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-HML-75A-99C-105H-118C-125A-129E
<400>72
<210>73
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-HML-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E
<400>73
<210>74
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E
<400>74
<210>75
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-10H-11D-27M-29L-40C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E
<400>75
<210>76
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-10H-11D-27M-29L-40F-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E
<400>76
<210>77
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-10H-11D-27M-29L-40H-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E
<400>77
<210>78
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-H-11D-ML-40Y-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E
<400>78
<210>79
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E
<400>79
<210>80
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-10H-11D-27M-29L-40H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E
<400>80
<210>81
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R-161R
<400>81
<210>82
<211>190
<212>PRT
<213>TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N
<400>82
<210>83
<211>20
<212>PRT
<213>S75A引物
<400>83
<210>84
<211>19
<212>PRT
<213>L105H引物
<400>84
<210>85
<211>33
<212>PRT
<213>S125A引物
<400>85
<210>86
<211>33
<212>PRT
<213>I129E引物
<400>86
<210>87
<211>27
<212>PRT
<213>K58R引物
<400>87
<210>88
<211>27
<212>PRT
<213>S99C引物
<400>88
<210>89
<211>20
<212>PRT
<213>Y118C引物
<400>89
<210>90
<211>19
<212>PRT
<213>N11D引物
<400>90
<210>91
<211>27
<212>PRT
<213>S40R引物
<400>91
<210>92
<211>30
<212>PRT
<213>T131N引物
<400>92
權(quán)利要求書(shū)(按照條約第19條的修改)
1.一種修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶包含位于位置99和118的半胱氨酸殘基以形成分子內(nèi)二硫鍵，所述木聚糖酶是通過(guò)用半胱氨酸置換位于位置99和/或118的氨基酸產(chǎn)生的，所述位置是通過(guò)將所述修飾的木聚糖酶與如SEQ ID NO16中定義的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)確定的，其中所述修飾的木聚糖酶是嗜熱的、嗜堿的、熱穩(wěn)定的或具有以上性質(zhì)的組合，并且其中所述木聚糖酶是家族11木聚糖酶。
2.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置40的選自Arg、Cys、Phe、Tyr和His的置換氨基酸。
3.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置40的堿性置換氨基酸。
4.權(quán)利要求3的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置40的堿性氨基酸為His。
5.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置58的堿性置換氨基酸。
6.權(quán)利要求5的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置58的堿性氨基酸為Arg。
7.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶。
8.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶不是衍生自在位置99和118具有天然存在的半胱氨酸殘基的木聚糖酶。
9.權(quán)利要求5的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置10的堿性置換氨基酸、位于位置27的疏水性置換氨基酸及位于位置29的疏水性置換氨基酸。
10.權(quán)利要求9的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置10的堿性置換氨基酸是His、所述位于位置27的疏水性置換氨基酸是Met且所述位于位置29的疏水性置換氨基酸是Leu(HML)。
11.權(quán)利要求10的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置75的非極性置換氨基酸、位于位置105的堿性置換氨基酸、位于位置125的非極性置換氨基酸及位于位置129的酸性氨基酸。
12.權(quán)利要求11的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置75的非極性置換氨基酸是Ala、所述位于位置105的堿性置換氨基酸是His、所述位于位置125的非極性置換氨基酸是Ala，且所述位于位置129的酸性氨基酸是Glu。
13.權(quán)利要求12的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置11的酸性氨基酸。
14.權(quán)利要求13的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置11的酸性氨基酸是Asp。
15.權(quán)利要求14的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置131的Asn。
16.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置40和58的堿性置換氨基酸。
17.權(quán)利要求16的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置40的堿性氨基酸是His且所述位于位置58的堿性氨基酸是Arg。
18.權(quán)利要求16的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置10的堿性置換氨基酸、位于位置27的疏水置換氨基酸及位于位置29的疏水置換氨基酸。
19.權(quán)利要求18的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置10的堿性置換氨基酸是His、所述位于位置27的疏水置換氨基酸是Met且所述位于位置29的疏水置換氨基酸是Leu(HML)。
20.權(quán)利要求19的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置75的非極性置換氨基酸、位于位置105的堿性置換氨基酸、位于位置125的非極性置換氨基酸及位于位置129的酸性氨基酸。
21.權(quán)利要求20的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置75的非極性置換氨基酸是Ala、所述位于位置105的堿性置換氨基酸是His、所述位于位置125的非極性置換氨基酸是Ala且所述位于位置129的酸性氨基酸是Glu。
22.權(quán)利要求21的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置11的酸性氨基酸。
23.權(quán)利要求22的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置11的酸性氨基酸是Asp。
24.權(quán)利要求23的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置131的Asn。
25.權(quán)利要求23的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置52的Cys。
26.權(quán)利要求25的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置144和161的堿性置換氨基酸。
27.權(quán)利要求26的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置144和161的堿性置換氨基酸均為Arg。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶具有介于約65℃和約85℃之間的最高有效溫度(MET)。
29.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶具有介于約pH6.5和約pH8.0之間的最大有效pH(MEP)。
30.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶來(lái)源自曲霉屬(Aspergillus)、桿菌屬(Bacillus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、欽氏菌屬(Chainia)、梭菌屬(Clostridium)、絲狀桿菌屬(Fibrobacter)、Neocallimastix、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、高溫雙岐菌屬(Thermobijida)、嗜熱真菌屬(Thermomyces)、Piromyces、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、Orpinomyces、平革菌屬(Phanerochaete)、赤霉屬(Gibberella)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、毛殼菌屬(Chaetomiun)、網(wǎng)絡(luò)球桿菌屬(Dictyoglomus)、Magnaporthe、青霉菌屬(Penicillium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、木霉屬(Trichoderma)或肉座菌屬(Hypocrea)。
31.一種修飾的家族11木聚糖酶，所述木聚糖酶選自于
TrX-99C-118C(SEQ ID NO66)；
TrX-40H-99C-118C(SEQ ID NO67)；
TrX-58R-99C-118C(SEQ ID NO68)；
TrX-40H-58R-99C-118C(SEQ ID NO69)；
TrX-10H-27M-29L-40R-58R-99C-118C(SEQ ID NO70)；
TrX-10H-27M-29L-40R-58R-75A-99C-118C(SEQ ID NO71)；
TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E(SEQ IDN O72)；
TrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(SEQ ID NO73)；
TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(SEQ ID NO74)；
TrX-10H-11D-27M-29L-40X-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E，其中X為C，F(xiàn)，H，Y或R(SEQ ID NO分別為75，76，77，78或79)；
TrX-10H-11D-27M-29L-40H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(SEQ IDNO80)；
TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R161R(SEQID NO81)；和
TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N(SEQ ID NO82)。
32.一種修飾的家族11木聚糖酶，所述木聚糖酶包含位于位置99和118的半胱氨酸殘基以形成分子內(nèi)二硫鍵，所述木聚糖酶是通過(guò)用半胱氨酸置換位于位置99和/或118的氨基酸產(chǎn)生的，所述位置是通過(guò)將所述修飾的木聚糖酶與如SEQ ID N016中定義的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)確定的。
33.一種修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶包含位于位置40的堿性置換氨基酸，所述位置是通過(guò)將所述修飾的木聚糖酶與如SEQ IDNO16中定義的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)確定的。
34.一種修飾的家族11木聚糖酶，所述木聚糖酶包含位于位置40的堿性置換氨基酸及圍成一個(gè)10至24個(gè)氨基酸的環(huán)的分子內(nèi)二硫鍵，所述位置是通過(guò)將所述修飾的木聚糖酶與如SEQ ID N016中定義的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)確定的。
35.權(quán)利要求34的修飾的家族11木聚糖酶，其中所述分子內(nèi)二硫鍵是通過(guò)用半胱氨酸置換位于位置99和/或118的氨基酸來(lái)產(chǎn)生的。
36.權(quán)利要求34的修飾的家族11木聚糖酶，其中所述位于位置40的堿性置換氨基酸是His。
權(quán)利要求
1.一種修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶包含位于位置99和118的半胱氨酸殘基以形成分子內(nèi)二硫鍵，所述木聚糖酶是通過(guò)用半胱氨酸置換位于位置99和/或118的氨基酸產(chǎn)生的，所述位置是通過(guò)將所述修飾的木聚糖酶與如SEQ ID NO16中定義的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)確定的，其中所述修飾的木聚糖酶是嗜熱的、嗜堿的、熱穩(wěn)定的或具有以上性質(zhì)的組合，并且其中所述木聚糖酶是家族11木聚糖酶。
2.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置40的選自Arg、Cys、Phe、Tyr和His的置換氨基酸。
3.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置40的堿性置換氨基酸。
4.權(quán)利要求3的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置40的堿性氨基酸為His。
5.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置58的堿性置換氨基酸。
6.權(quán)利要求5的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置58的堿性氨基酸為Arg。
7.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶。
8.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶不是衍生自在位置99和118具有天然存在的半胱氨酸殘基的木聚糖酶。
9.權(quán)利要求5的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置10的堿性置換氨基酸、位于位置27的疏水性置換氨基酸及位于位置29的疏水性置換氨基酸。
10.權(quán)利要求10的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置10的堿性置換氨基酸是His、所述位于位置27的疏水性置換氨基酸是Met且所述位于位置29的疏水性置換氨基酸是Leu(HML)。
11.權(quán)利要求10的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置75的非極性置換氨基酸、位于位置105的堿性置換氨基酸、位于位置125的非極性置換氨基酸及位于位置129的酸性氨基酸。
12.權(quán)利要求11的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置75的非極性置換氨基酸是Ala、所述位于位置105的堿性置換氨基酸是His、所述位于位置125的非極性置換氨基酸是Ala，且所述位于位置129的酸性氨基酸是Glu。
13.權(quán)利要求12的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置11的酸性氨基酸。
14.權(quán)利要求13的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置11的酸性氨基酸是Asp。
15.權(quán)利要求14的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置131的Asn。
16.權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置40和58的堿性置換氨基酸。
17.權(quán)利要求16的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置40的堿性氨基酸是His且所述位于位置58的堿性氨基酸是Arg。
18.權(quán)利要求16的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置10的堿性置換氨基酸、位于位置27的疏水置換氨基酸及位于位置29的疏水置換氨基酸。
19.權(quán)利要求18的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置10的堿性置換氨基酸是His、所述位于位置27的疏水置換氨基酸是Met且所述位于位置29的疏水置換氨基酸是Leu(HML)。
20.權(quán)利要求19的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置75的非極性置換氨基酸、位于位置105的堿性置換氨基酸、位于位置125的非極性置換氨基酸及位于位置129的酸性氨基酸。
21.權(quán)利要求20的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置75的非極性置換氨基酸是Ala、所述位于位置105的堿性置換氨基酸是His、所述位于位置125的非極性置換氨基酸是Ala且所述位于位置129的酸性氨基酸是Glu。
22.權(quán)利要求21的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置11的酸性氨基酸。
23.權(quán)利要求22的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置11的酸性氨基酸是Asp。
24.權(quán)利要求23的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置131的Asn。
25.權(quán)利要求23的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置52的置換氨基酸。
26.權(quán)利要求25的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置52的置換氨基酸是Cys。
27.權(quán)利要求26的修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶還包含位于位置144和161的堿性置換氨基酸。
28.權(quán)利要求27的修飾的木聚糖酶，其中所述位于位置144和161的堿性置換氨基酸均為Arg。
29.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶具有介于約65℃和約85℃之間的最高有效溫度(MET)。
30.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶具有介于約pH6.5和約pH8.0之間的最大有效pH(MEP)。
31.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的木聚糖酶，其中所述修飾的木聚糖酶來(lái)源自曲霉屬(Aspergillus)、桿菌屬(Bacillus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、欽氏菌屬(Chainia)、梭菌屬(Clostridium)、絲狀桿菌屬(Fibrobacter)、Neocallimastix、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、高溫雙岐菌屬(Thermobijida)、嗜熱真菌屬(Thermomyces)、Piromyces、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、Orpinomyces、平革菌屬(Phanerochaete)、赤霉屬(Gibberella)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、毛殼菌屬(Chaetomiun)、網(wǎng)絡(luò)球桿菌屬(Dictyoglomus)、Magnaporthe(Magnaporthe)、青霉菌屬(Penicillium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、木霉屬(Trichoderma)或肉座菌屬(Hypocrea)。
33.一種修飾的家族11木聚糖酶，所述木聚糖酶選自于
TrX-99C-118C(SEQ ID NO66)；
TrX-40H-99C-118C(SEQ ID NO67)；
TrX-58R-99C-118C(SEQ ID NO68)；
TrX-40H-58R-99C-118C(SEQ ID NO69)；
TrX-10H-27M-29L-40R-58R-99C-118C(SEQ ID NO70)；
TrX-10H-27M-29L-40R-58R-75A-99C-118C(SEQ ID NO71)；
TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E(SEQ ID NO72)；
TrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(SEQ ID NO73)；
TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(SEQ ID NO74)；
TrX-10H-11D-27M-29L-40X-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E，其中X為C、F、H、Y或R(SEQ ID NO分別為75、76、77、78或79)；
TrX-10H-11D-27M-29L-40H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E(SEQ IDNO80)；
TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R161R(SEQID NO81)；和
TrX-10H-11D-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N(SEQ ID NO82)。
34.一種修飾的家族11木聚糖酶，所述木聚糖酶包含位于位置99和118的半胱氨酸殘基以形成分子內(nèi)二硫鍵，所述木聚糖酶是通過(guò)用半胱氨酸置換位于位置99和/或118的氨基酸產(chǎn)生的，所述位置是通過(guò)將所述修飾的木聚糖酶與如SEQ ID NO16中定義的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)確定的。
35.一種修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶包含位于位置40的置換氨基酸，所述位置是通過(guò)將所述修飾的木聚糖酶與如SEQ ID NO16中定義的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)確定的。
36.一種修飾的家族11木聚糖酶，所述木聚糖酶包含位于位置40的置換氨基酸及圍成一個(gè)10至24個(gè)氨基酸的環(huán)的分子內(nèi)二硫鍵，所述位置是通過(guò)將所述修飾的木聚糖酶與如SEQ ID NO16中定義的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)確定的。
37.權(quán)利要求36的修飾的家族11木聚糖酶，其中所述分子內(nèi)二硫鍵是通過(guò)用半胱氨酸置換位于位置99和/或118的氨基酸來(lái)產(chǎn)生的。
38.權(quán)利要求37的修飾的家族11木聚糖酶，其中所述位于位置40的置換氨基酸是堿性氨基酸。
39.權(quán)利要求38的修飾的家族11木聚糖酶，其中所述位于位置40的堿性氨基酸是His。
全文摘要
提供了一種修飾的家族11木聚糖酶，所述木聚糖酶包含位于位置99和118的半胱氨酸殘基以形成分子內(nèi)二硫鍵。通過(guò)用半胱氨酸置換位于位置99和/或118的氨基酸以形成分子內(nèi)二硫鍵來(lái)產(chǎn)生所述木聚糖酶。本發(fā)明的木聚糖酶與野生型木聚糖酶相比顯示了改良的嗜熱性、嗜堿性或熱穩(wěn)定性。這樣的木聚糖酶可用于需要在高于天然酶的溫度和/或pH值的溫度和/或pH值下的酶活性的多種工業(yè)應(yīng)用中。
文檔編號(hào)C12N9/24GK101460615SQ200780020890
公開(kāi)日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2007年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月12日
發(fā)明者W·L·宋 申請(qǐng)人:加拿大國(guó)家研究委員會(huì)