專利名稱：具有iNOS的表達(dá)控制作用的正義寡核苷酸以及含有其的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于控制iNOS (誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，inducible nitric oxide synthase)的表達(dá)且具有與下述單鏈RNA (反義轉(zhuǎn)錄物)互補(bǔ)的序列的正義 寡核苷酸(sense oligonucleotide),所述單鏈RNA具有與iNOS基因的mRNA
互補(bǔ)的堿基序列。
背景技術(shù)：
生物體內(nèi)的一氧化氮(NO)從巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)區(qū)域等 各處產(chǎn)生，作為其作用，有殺菌作用、血管松馳作用，或者也作為神經(jīng)信 號(hào)傳達(dá)物質(zhì)而發(fā)揮作用。
已知介由一氧化氮產(chǎn)生的是一氧化氮合成酶(NOS， nitric oxide synthase),根據(jù)在體內(nèi)的作用場(chǎng)所的不同，NOS分為誘導(dǎo)型NOS (iNOS, inducible NOS)、神經(jīng)型NOS (nNOS， neuronal NOS)和血管內(nèi)皮型NOS (eNOS, endothelial NOS) 3類，特別是，介由iNOS的NO產(chǎn)生與其它的 NO合成系統(tǒng)即神經(jīng)型NOS和血管內(nèi)皮型NOS相比較，能長(zhǎng)時(shí)間地持續(xù)其 活性，并能產(chǎn)生更多量的NO (lnM以上)。
iNOS主要是在巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、消化道上 皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等受到細(xì)胞毒素、感染或 炎癥性病灶中產(chǎn)生的IL-lp (白細(xì)胞介素-lj3， Interleukin-lf3)、 TNF-a (腫瘤 壞死因子-a， Tumor Necrosis Factor-a)、 IFN-丫 (干擾素-y， Interferon- )等 炎癥性細(xì)胞因子的攻擊時(shí)表達(dá)，從而產(chǎn)生NO。過剩生成的NO作為生物體 的感染防御反應(yīng)中的主要炎癥性介質(zhì)而發(fā)揮作用。
iNOS的表達(dá)也伴隨炎癥反應(yīng)或細(xì)菌、真菌、病毒、原生動(dòng)物等多種病 原體的感染而產(chǎn)生。例如己知通過作為革蘭氏陰性菌的普遍構(gòu)成成分的脂 多糖(LPS)和作為革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁成分的脂磷壁酸(LTA)的刺激、 或介由炎癥性細(xì)胞因子的間接的產(chǎn)生誘導(dǎo)，會(huì)引起iNOS的誘導(dǎo)。另夕卜，最近發(fā)現(xiàn)，各種病毒的生物體內(nèi)增殖也會(huì)引起NO合成的亢進(jìn)，這種情況下
的iNOS的誘導(dǎo)主要是介由IL-lf3、 IFN-y等炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
來源于iNOS的NO顯示出殺菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤作用，在 生物體系的生命維持中不可缺少地存在。然而，另一方面， 一旦由于炎癥 反應(yīng)等引起iNOS活化而產(chǎn)生過剩的NO，則與活性氧反應(yīng)而生成的強(qiáng)過氧 亞硝酸鹽(過氧亞硝酸根、過氧化亞硝酸)會(huì)損傷DNA，從而產(chǎn)生引起突 變和致癌等負(fù)面作用。
目前已知，通過多種因素引起iNOS過剩地表達(dá)，產(chǎn)生過剩的NO，由 此會(huì)引起毒性休克或利用某種細(xì)胞因子的治療等引起的全身性血壓降低、 血壓響應(yīng)降低、自身免疫疾病、炎癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、 炎癥性腸病、血管功能不全、病原性血管擴(kuò)張、組織損傷、心血管缺血、 痛覺過敏癥、腦缺血、惡液質(zhì)、癌癥等各種疾病。
因此，控制iNOS的表達(dá)在生物體防御或NO過剩產(chǎn)生相關(guān)的疾病、例 如致癌和炎癥性疾病、細(xì)菌感染等引起的內(nèi)毒素休克等的治療和預(yù)防方面 是非常重要的。
以往已知被稱為RNAi (RNA干擾RNA interference)的方法，即用 雙鏈RNA切斷目標(biāo)mRNA來抑制轉(zhuǎn)錄的方法，但通常的RNAi都是20個(gè) 堿基對(duì)左右的堿基長(zhǎng)(專利文獻(xiàn)l:特開2005-13224號(hào)公報(bào))，并公開了其 雙鏈寡核苷酸和其反義RNA的篩選方法。另外，還公開了下述化合物，該 化合物可用于通過使用小核酸分子、例如短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA (siRNA)、雙鏈RNA( dsRNA )、微小RNA( miRNA )和短發(fā)夾RNA( shRNA) 分子的RNA干擾(RNAi)來調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素基因、白細(xì)胞介素超家族基 因或與基因表達(dá)和/或活性的白細(xì)胞介素路徑相關(guān)的基因的表達(dá)和活性(專 利文獻(xiàn)2:特開2005-524393號(hào)公報(bào))。
當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在反義RNA時(shí)，其和與之互補(bǔ)的mRNA雜交，從mRNA 向蛋白質(zhì)的翻譯受到阻礙，因此可以阻礙基因的表達(dá)。如果人為地將反義 RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，就可以阻礙靶基因的表達(dá)，因而目前作為闡明基因功能 的技術(shù)來使用，也在研究其向醫(yī)藥品的應(yīng)用。至今為止，對(duì)于iNOS基因， 反義RNA的存在并未得到確認(rèn)。另外，至今為止，雖然暗示了存在著從 mRNA轉(zhuǎn)錄時(shí)有助于mRNA的穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)(非專利文獻(xiàn)1: Eur. J.
4Pharmacol. 500: 255-266(2004))，但其詳細(xì)情況并不明了，關(guān)于iNOS的表 達(dá)控制還有很多不明確的問題。
專利文獻(xiàn)l:特開2005-13224號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)2:特開2005-524393號(hào)公報(bào)
非專利文獻(xiàn)1: Eur. J. Pharmacol. 500: 255-266(2004)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用于iNOS的表達(dá)控制且具有與下述單鏈RNA (反義轉(zhuǎn)錄 物)互補(bǔ)的序列的正義寡核苷酸，所述單鏈RNA具有與iNOS基因的mRNA
互補(bǔ)的堿基序列。
本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)存在具有與mRNA互補(bǔ)的序列的單鏈RNA (反義轉(zhuǎn)錄物)、其與以往的反義RNA不同、且會(huì)有助于mRNA的穩(wěn)定化 的情況，并在同一天申請(qǐng)了專利。
進(jìn)而，本發(fā)明人等對(duì)iNOS的表達(dá)控制進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了下 述方法，從而完成了本發(fā)明，該方法使用具有與上述單鏈RNA (反義轉(zhuǎn)錄 物)互補(bǔ)的序列的正義寡核苷酸來與反義轉(zhuǎn)錄物雜交以抑制其功能，從而 干擾mRNA的穩(wěn)定性，結(jié)果抑制iNOS的表達(dá)，從而抑制NO的過剩產(chǎn)生。
艮卩，本發(fā)明涉及具有與以下的iNOSmRNA反義RNA (iNOSmRNA反 義轉(zhuǎn)錄物)互補(bǔ)的序列的正義寡核苷酸、具有NO產(chǎn)生抑制活性的組合物、 以及iNOS產(chǎn)生量的抑制方法。
1. 一種正義寡核苷酸，其具有與下述iNOSmRNA反義RNA (iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物)互補(bǔ)的序列，所述iNOSmRNA反義RNA具有
與iNOS (誘導(dǎo)型一氧化氮合酶)mRNA互補(bǔ)的序列。
2. 根據(jù)上述1記載的正義寡核苷酸，其具有與含有序列號(hào)1所示的核 酸序列的上述iNOSmRNA反義RNA (iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物)互補(bǔ)的序 列。
3. 根據(jù)上述1或2記載的正義寡核苷酸，其在與上述iNOSmRNA反 義RNA (iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物)中熱力學(xué)不穩(wěn)定的環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的區(qū)域具 有互補(bǔ)的序列。
4. 根據(jù)上述1 3的任意一項(xiàng)記載的正義寡核苷酸，其具有16個(gè)堿基 335個(gè)堿基的堿基長(zhǎng)。
5. 根據(jù)上述1 4的任意一項(xiàng)記載的正義寡核苷酸及其衍生物，其經(jīng)過
對(duì)核酸分解酶引起的分解的穩(wěn)定化。
6. 根據(jù)上述5中記載的正義寡核苷酸，其中，穩(wěn)定化是利用LNA、PNA、 ENA、嗎啉和其它修飾方法進(jìn)行的。
7. —種組合物，其含有上述1 6的任意一項(xiàng)記載的正義寡核苷酸，且 具有促進(jìn)iNOSmRNA的分解的NO產(chǎn)生抑制活性。
8. —種iNOS產(chǎn)生量的抑制方法，其特征在于，在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入下述正 義寡核苷酸，該正義寡核苷酸具有與iNOSmRNA反義RNA (iNOSmRNA 反義轉(zhuǎn)錄物)互補(bǔ)的序列。
本發(fā)明的具有和具有與iNOSmRNA互補(bǔ)的序列的反義轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的 序列的正義寡核苷酸、以及其硫代磷酸酯型、即S代正義寡核苷酸可以作 為對(duì)與NO的過剩產(chǎn)生相關(guān)的疾病即炎癥性疾病、細(xì)菌感染造成的內(nèi)毒素 休克、致癌等有效的醫(yī)藥品組合物、即作為醫(yī)藥品來使用，或作為對(duì)這些 疾病有效的保健食品組合物、即作為保健食品來使用。


圖1為表示利用RT-PCR法的大鼠肝細(xì)胞中的mRNA量的測(cè)定結(jié)果的 電泳圖。
圖2為表示利用實(shí)時(shí)PCR法的大鼠肝細(xì)胞中的mRNA量的測(cè)定結(jié)果 的圖。
圖3為表示iNOSmRNA通過小鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物而被分解的電泳圖。
圖4為表示顯示投予肝臟保護(hù)劑(IGF-I)的大鼠的iNOSmRNA增加 被抑制的利用鏈特異性RT-PCR的iNOSmRNA的檢測(cè)結(jié)果的電泳圖。
圖5為顯示投予肝臟保護(hù)劑(IGF-I)的大鼠的iNOS反義轉(zhuǎn)錄物增加 被抑制的利用鏈特異性RT-PCR的iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)結(jié)果(電泳圖)。
圖6為表示將投予肝臟保護(hù)劑(IGF-I)的大鼠的iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的 增加用實(shí)時(shí)PCR來定量的結(jié)果的圖。圖中，"f'表示相對(duì)于GalN/LPS大鼠 (n二3 6只大鼠/組)，p<0.05。
圖7為表示顯示投予肝臟保護(hù)劑(FR183998)的大鼠的iNOSmRNA增加被抑制的利用鏈特異性RT-PCR的iNOSmRNA的檢測(cè)結(jié)果的電泳圖。 圖8為表示顯示投予肝臟保護(hù)劑(FR183998)的大鼠的iNOS反義轉(zhuǎn) 錄物增加被抑制的利用鏈特異性RT-PCR的iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)結(jié)果的 電泳圖。
圖9為表示將投予肝臟保護(hù)劑(FR183998)的大鼠的iNOS反義轉(zhuǎn)錄 物的增加用實(shí)時(shí)PCR來定量的結(jié)果的圖。圖中，"*"表示相對(duì)于GalN/LPS 大鼠(n二3 6只大鼠/組)，p<0.05。
圖10為表示實(shí)施例10中iNOS蛋白質(zhì)和培養(yǎng)基中的一氧化氮(NO) 量的測(cè)定結(jié)果的電泳圖和圖。
圖11為表示實(shí)施例11中4種RNA的利用Northern法得到的分析結(jié) 果的X射線放射自顯影圖。從左開始表示"無刺激大鼠肝細(xì)胞的全RNA"、 "IL-1(3刺激大鼠肝細(xì)胞的全RNA"、 "IL-1(3刺激大鼠肝細(xì)胞的Poly (A) 十RNA"和"IL-l(3刺激大鼠肝細(xì)胞的的Poly (A)—脂A"的結(jié)果。
圖12為表示顯示實(shí)施例11中RACE的結(jié)果和核糖核酸酶保護(hù)分析的 結(jié)果的圖。
圖13為實(shí)施例12中構(gòu)建的載體的示意圖。
圖14為表示在實(shí)施例12中iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體加入時(shí)(AS( + )) 和未加入時(shí)(AS ( — ))的Luc/pGal值的隨時(shí)間變化的圖。
圖15為表示在實(shí)施例12中使用連結(jié)有SVpA的報(bào)告基因(reporter) 作為對(duì)照時(shí)的Luc/(3Gal值的隨時(shí)間變化的圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是在細(xì)胞內(nèi)使用具有與下述單鏈RNA (反義轉(zhuǎn)錄物)互補(bǔ)的序 列的正義寡核苷酸來與反義轉(zhuǎn)錄物雜交以抑制其功能，從而干涉mRNA的 穩(wěn)定性，結(jié)果抑制iNOS的表達(dá)，從而抑制NO的過量產(chǎn)生，所述單鏈RNA (反義轉(zhuǎn)錄物)具有與有助于誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS mRNA的穩(wěn)定化 的iNOSmRNA互補(bǔ)的序列。
具有與iNOSmRNA互補(bǔ)的序列的單鏈RNA是含有和序列號(hào)1表示的 堿基序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的堿基序列的核苷酸。實(shí)質(zhì)上相同的核苷酸是 指含有序列號(hào)1或與之具有75%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上的同源性的堿基序列、且使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的合成量增加的物 質(zhì)，可以用化學(xué)合成、公知的表達(dá)方法以及精制法或者實(shí)施例中記載的方 法來制備。
本發(fā)明的具有與iNOSmRNA的上述反義轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的序列的正義寡 核苷酸(以下將之稱為"本發(fā)明的正義寡核苷酸")是可以和反義轉(zhuǎn)錄物發(fā)生 雜交的寡核苷酸或其衍生物，按照不會(huì)被核內(nèi)的核酸分解酶分解的方式進(jìn) 行修飾的物質(zhì)即可。
正義寡核苷酸設(shè)計(jì)可以使用Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415(2003)和J. Mol. Biol. 288, 911-940(1999)中公開的程序"mfold"(參照http:〃www.bioinfo. rpi-edu廠zukerm/rna/)預(yù)測(cè)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)來進(jìn)行。正義寡核苷酸的候補(bǔ) 序列設(shè)計(jì)為與熱力學(xué)不穩(wěn)定的部分(例如莖環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)中莖部分 之外的區(qū)域)、優(yōu)選與含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)的部分相對(duì)的正義寡 核苷酸。
關(guān)于上述的正義寡核苷酸的候補(bǔ)序列，可以選擇不含有會(huì)在細(xì)胞中引 起序列非特異性反應(yīng)的5，-CG-3，、 5，-GGGG-3，以及5'-GGGGG-3，等序列的 序列，在大鼠基因組中進(jìn)行同源性檢索，確認(rèn)不存在類似的序列后，選擇 優(yōu)選的序列(參照J(rèn). Neurochem. 86， 374382(2003))。
作為正義寡核苷酸，可以列舉出序列號(hào)2 4所示的寡核苷酸等(下述 序列都省略了修飾來表示)。
5,-GCCTCATACTTCCTCAGAGC-3，(序列號(hào)36)
5，-TAGCTGCATTGTGTACAGAT-3，(序列號(hào)37)
5，-GTGTATAATTCCTTGATGAA-3，(序列號(hào)38)
它們可以用化學(xué)合成、公知的表達(dá)方法以及精制法或者實(shí)施例中記載 的方法來制備。
本發(fā)明的正義寡核苷酸修飾成不會(huì)被核內(nèi)的核酸分解酶分解即可，該 修飾沒有特別的限制。由于正義寡核苷酸在細(xì)胞內(nèi)會(huì)被從5'或3'末端依次 除去核苷酸的酶即核酸外切酶(exonudease)從兩端消化，因此優(yōu)選修飾為 例如從兩端開始將1個(gè)以上的磷酸鍵P = 0置換為P = S、且對(duì)分解酶穩(wěn)定 的硫代磷酸酯型(以下將之稱為"S代正義寡核苷酸")(參照J(rèn). Neurochem. 86: 374-382(2003))。但是， 一旦全部的磷酸鍵都發(fā)生硫代，則會(huì)產(chǎn)生光學(xué)異構(gòu)性，從雜交方面來說變得不利。
作為S代正義寡核苷酸的具體例子，可以列舉出下述等(序列中，*表 示S代的部分)。
5，-G*C*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C-3，，
5'-PAWCTGCATTGTGTACAWA叮-3，
5，-G*T*G*TATAATTCCTTGAT*G*A*A-3'
作為其它的修飾方法，可以列舉出PNA(肽核酸，peptide nucleic acids)、 LNA (鎖核酸，Locked Nucleic Acids) 、 ENA (2，-O， 4，-C-亞乙基-橋核酸，2 ，-O, 4，-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids; Sigma-Aldrich公司)、嗎啉(Morpholino) 寡核苷酸(GeneTools公司，OR, USA)等。
本發(fā)明的正義寡核苷酸通過導(dǎo)入到已確認(rèn)存在iNOSmRNA的反義轉(zhuǎn) 錄物的細(xì)胞內(nèi)，從而與反義轉(zhuǎn)錄物反應(yīng)(雜交)，降低細(xì)胞內(nèi)的反義轉(zhuǎn)錄物 的有效量，因而，通過正義寡核苷酸的投予，可以使原來的基因產(chǎn)物(iNOS) 的表達(dá)量減少，從而抑制NO的過剩產(chǎn)生。
實(shí)施例
以下示出實(shí)施例來具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受它們的限定。 (1)與iNOSmRNA互補(bǔ)的序列、即反義轉(zhuǎn)錄物的序列和區(qū)域(堿基 長(zhǎng))的確定方法
實(shí)施例1:大鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物
用以下的方法對(duì)大鼠iNOS的mRNA研究是否存在從基因的反義鏈轉(zhuǎn) 錄而成的"反義轉(zhuǎn)錄物"，并研究該"反義轉(zhuǎn)錄物"與正義基因產(chǎn)物的產(chǎn)生的控 制是怎樣相關(guān)的。另外，大鼠iNOS的mRNA的堿基序列通過 DDBJ/EMBL/GenBank國(guó)際堿基序列數(shù)據(jù)庫(http:Vwww.ddbj.nig.ac.jp/、 http:〃www.ebi,ac.uk/embl八http:〃www.ncbi.nlm.nih,gov/Genbank)可矢口。
在細(xì)胞因子和急性期蛋白等引起誘導(dǎo)表達(dá)的基因的mRNA的3'非翻譯 區(qū)域(3'UTR)中存在被稱為AU-rich dement (AU富含元素，ARE)的序 歹U，即5，-AUUUA-3，或5'-AUUUUA-3，的序列(參照Proc Natl Acad SciUSA 83: 1670-1674 (1986))。由于ARE也存在于人、大鼠和小鼠的iNOSmRNA 的3'UTR中，因而通過鏈特異性RT-PCR法研究了與含有該ARE的3'UTR相對(duì)應(yīng)(序列互補(bǔ)的)反義轉(zhuǎn)錄物是否存在。該方法是下述的方法使用
寡聚dT引物之類的僅與mRNA雜交(鏈特異性)的引物來進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄， 合成互補(bǔ)的DNA (cDNA)后，進(jìn)行PCR法以擴(kuò)增cDNA，從而測(cè)定mRNA
艮P，使用以下所示的iNOS基因的正義鏈的引物5，-TGCCCCTCCCC CACATTCTCT-3，(序列號(hào)2)，對(duì)向培養(yǎng)基中添加IL-1(3而誘導(dǎo)了 iNOSmR NA的大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的全RNA進(jìn)行RT-PCT，從而合成cDNA。
將從大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞制備的RNA (l昭)和2pmol的引物混合后， 在70'C加熱10分鐘，然后迅速冷卻至Ot:。向其中加入ReverTraAce反應(yīng) 緩沖液(東洋紡)、dNTP (N=A、 C、 G、 T)(最終濃度為lmM)、 20 units RNase抑制劑(東洋紡)和200 units ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄酶(東洋紡)，使 總量為25pl。在47。C下保溫60分鐘以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后在70。C加熱15分 鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。之后，加入5units的TthRNaseH (東洋紡)，在37°C 加熱20分鐘以分解模板RNA。合成的cDNA進(jìn)行乙醇沉淀來回收，并用 2(Hil的TE緩沖液溶解。
向如此獲得的cDNA2pl中加入PCR反應(yīng)緩沖液(Nippon Gene公司)、 dNTP (N二A、 C、 G、 T; Nippon Gene公司)(最終濃度為125pM)、下述 2種引物、正向(Forward)引物40pmo1、反向(Reverse)引物40pmo1、 1 unit Gene Taq DNA聚合酶(Nippon Gene公司)以及anti-Taq high (=抗Taq 聚合酶抗體，東洋紡)#，使總量為4(Hi1，進(jìn)一步進(jìn)行PCR。
正向
5，-ACCAGGAGGCGCCATCCCGCTGC-3,(序列號(hào)3)
反向
5 ， -CTTGATCAAACACTCATTTTATTAAA-3 ，(序列號(hào)4) PCR的溫度方案可以依照公知的方法、即步減(step-down)法(參照 Nishizawa M, Nakajima T, Yasuda K, Kanzaki H, Sasaguri Y, Watanabe K, and Ito S. Close kinship of human 2Oa勿droxysteroid dehydrogenase gene with three aldo-keto reductase genes. Genes Cells(2000)5, 111-125)來進(jìn)《亍。進(jìn)《亍 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見186個(gè)堿基對(duì)(bp)的條帶的擴(kuò)增。 將該條帶從凝膠中切下并精制，確定堿基序列，結(jié)果確認(rèn)了其為夾在上述的引物序列間、與大鼠iNOSmRNA的3，UTR的序列互補(bǔ)的序列。艮卩， 通過使用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了反義轉(zhuǎn)錄物 的存在。
為了進(jìn)一步研究iNOS基因的反義轉(zhuǎn)錄物的全部結(jié)構(gòu)，嘗試了用RACE 法(參照Frohman MA. Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full-length complementary DNAs: thermal RACE. Methods Enzymol. (1993) 218: 340-356)來解析。RACE法是由已知的cDNA序列制
作鏈特異性引物來進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、從而確定5'側(cè)和3'側(cè)的cDNA的序列的方法。
向大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中添加IL-lf3以誘導(dǎo)iNOS mRNA，并用Trizol 試劑(Invitrogen)制備RNA。以該RNA為模板，使用序列號(hào)2的引物(iNOS 的正義(正向)引物；5 ，-TGCCCCTCCCCCACATTCTCT-3 ，)合成雙鏈cDNA 。 在該cDNA上連接CA cassette adapter (接頭)(cDNA PCR文庫試劑盒
(TakaraBio株式會(huì)社)附帶)之后，使用序列號(hào)3的引物(針對(duì)iNOS mRNA 的3'UTR的正義(正向)引物)和CA引物(cDNAPCR文庫試劑盒(Takara Bio株式會(huì)社)附帶)進(jìn)行PCR。將反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 約250bp大小的條帶發(fā)生了擴(kuò)增。切下該條帶，克隆至pGEM-TEasy載體
(Promega)，從而確定堿基序列。 [3'側(cè)的cDNA的序列的確定]
與上述同樣地由用IL-1J3誘導(dǎo)的大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞制備RNA。使用 PolyATract mRNA Isolation System (PolyATract mRNA分離體系)(Prome ga)來精制PolyA—級(jí)分的RNA，以該RNA為模板，使用帶有錨定(ancho r)序列(下劃線部分)的隨機(jī)引物(錨定隨機(jī)引物5,-TTCCCTCCCGTT TTCTCTGCCACTAGAATTCTCGAGCGGCCGCNNNNNNN-3，(序列號(hào)5)) 來合成雙鏈cDNA。在該雙鏈cDNA上連接CA cassette adapter之后，使用 序列號(hào)4的引物(針對(duì)iNOS mRNA的3'UTR的反義(反向)引物)和C A引物進(jìn)行PCR。精制該反應(yīng)液并將之作為模板，使用針對(duì)iNOS mRNA 的3，UTR的反義(反向)引物(5，-ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCT C-3，(序列號(hào)6))和錨定引物(針對(duì)上述"錨定隨機(jī)引物"的錨定序列的引物；
ii5，-ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC-3，(序列號(hào)7))進(jìn)行2次PCR。將反 應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)200 500bp大小的條帶發(fā)生了擴(kuò)增。 切下該條帶，克隆至pGEM-T Easy載體，從而確定堿基序列。
根據(jù)其結(jié)果推測(cè)反義轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)大致為600個(gè)堿基以上。以下表示 了其序列(序列號(hào)l，顯示的是cDNA序列)。即，反義轉(zhuǎn)錄物對(duì)應(yīng)于iNOS mRNA的3'UTR，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(5'側(cè))位于iNOS mRNA的polyA附加部 位的互補(bǔ)鏈。
實(shí)施例2:人iNOS反義轉(zhuǎn)錄物
用以下的方法對(duì)人iNOS的mRNA研究是否存在由基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄 而成的"反義轉(zhuǎn)錄物"。另外，人iNOS的mRNA的堿基序列通過 DDBJ/EMBL/GenBank國(guó)際堿基序列數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ddbj .nig.ac.jp/ 、 http:〃www.ebi.ac.uk/embl八http:〃www.ncbi.nlm.nih,gov/Genbank)可矢卩。
依照通常的方法，使用Trizol試劑(Invitrogen公司)，從人的組織(胎 盤、肝臟、胃粘膜)或細(xì)胞(未刺激的淋巴細(xì)胞)中提取全RNA。將獲得 的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems 公司)進(jìn)行處理，除去混入的基因組DNA。以該全RNA為模板，使用如 下所示的人iNOS基因的正義鏈的引物5'-CTGAGTGCACCACTTCAAGT GAC-3'(序列號(hào)8)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA。具體來說，除了不使 用實(shí)施例1中的由大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞制備的RNA l嗎和用序列號(hào)2表示 的引物2pmo1，而是使用從人的組織或細(xì)胞制備的全RNA (lpg)和上述序 列號(hào)8表示的引物(2pmo1)以外，用和實(shí)施例1相同的方法合成cDNA。
向如此獲得的cDNA2fi1中加入PCR反應(yīng)緩沖液(Nippon Gene公司)、 dNTP (N=A、 C、 G、 T; Nippon Gene公司)(最終濃度為125pM)、下述 2種引物、正向引物40pmo1、反向引物40pmo1、 1 unit Gene Taq DNA聚合 酶(Nippon Gene公司)以及anti-Taqhigh (二抗Taq聚合酶抗體，東洋紡) #，使總量為40(^1，進(jìn)一步進(jìn)行PCR。
正向
5，-CAGGAGGTGCTATCGCACCACT-3，(序列號(hào)9)
反向5，-GCAATTCATGTAAATATCTCCATC-3，(序列號(hào)10) 用和實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在使用人胎盤來源的cDNA時(shí)可見151個(gè)堿基對(duì)(bp)的條帶的 擴(kuò)增。而在其它的cDNA(肝臟、胃粘膜或未刺激的淋巴細(xì)胞)中未見擴(kuò)增。 將擴(kuò)增的條帶從凝膠中切下并精制，確定堿基序列，結(jié)果確認(rèn)了其為 夾在上述的引物序列間、與人iNOSmRNA的3'UTR的序列互補(bǔ)的序列。 即，通過使用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了人iNOS 反義轉(zhuǎn)錄物的存在。iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的序列如序列號(hào)11所示。是以cDNA 序列的形式表示的。
實(shí)施例3:小鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物
用以下的方法對(duì)小鼠iNOS的mRNA研究是否存在由基因的反義鏈轉(zhuǎn) 錄而成的"反義轉(zhuǎn)錄物"。另外，小鼠iNOS的mRNA堿基序列通過 DDBJ/EMBL/GenBank國(guó)際堿基序列數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/ 、 http:〃www.ebi.ac.uk/embl/、 http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)可矢口 。
依照通常的方法，使用Trizol試劑(Invitrogen公司)，從RAW264細(xì) 胞中提取全RNA。將獲得的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free 試劑盒(Applied Biosystems公司)進(jìn)行處理，除去混入的基因組DNA。 以該全RNA為模板，使用如下所示的小鼠iNOS基因的正義鏈的引物5'-CCTTCTTCTCCACTCCCCAGCT-3，(序歹iJ號(hào)12)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而合成c DNA。具體來說，除了不使用實(shí)施例1中的由大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞制備的 RNA l嗎和用序列號(hào)2表示的引物2pmo1，而是使用從RAW264細(xì)胞制備 的全RNA (l嗎)和序列號(hào)12表示的引物(2pmo1)以外，用和實(shí)施例1 相同的方法合成cDNA。
向如此獲得的cDNA2jil中加入PCR反應(yīng)緩沖液(Nippon Gene公司)、 dNTP (N=A、 C、 G、 T; Nippon Gene公司)(最終濃度為125pM)、下述 2種引物、正向引物40pmo1、反向引物40pmo1、 1 unit Gene Taq DNA聚合 酶(Nippon Gene公司)以及anti-Taqhigh (二抗Taq聚合酶抗體，東洋紡) #，使總量為40(il，進(jìn)一步進(jìn)行PCR。
正向5，-GACCACCAGGAGGCACCATGCCG-3，(序列號(hào)13)
反向
5，-ATACAGGAAAGGCCCAAGCCATC畫3，(序列號(hào)14) 用和實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳， 結(jié)果可見127個(gè)堿基對(duì)(bp)的條帶的擴(kuò)增。
將擴(kuò)增的條帶從凝膠中切下并精制，確定堿基序列，結(jié)果確認(rèn)了其為 夾在上述的引物序列間、與小鼠iNOS mRNA的3，UTR互補(bǔ)的序列。艮P， 通過使用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了小鼠iNOS 反義轉(zhuǎn)錄物的存在。小鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的序列如序列號(hào)15所示。是以 cDNA序列的形式表示的。
(2)利用與iNOSmRNA互補(bǔ)的反義轉(zhuǎn)錄物(以下僅簡(jiǎn)稱為"反義")
使iNOSmRNA穩(wěn)定化
實(shí)施例4:利用與大鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物使iNOSmRNA穩(wěn)定化 為了明確大鼠反義是否能使iNOSmRNA穩(wěn)定化，將具有與大鼠反義互
補(bǔ)的序列、并具有與大鼠反義雜交的性質(zhì)的iNOS的正義寡核苷酸導(dǎo)入大鼠
原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中并研究iNOSmRNA的量。
正義寡核苷酸通過將寡核苷酸中的一個(gè)磷酸二酯鍵的磷酸的氧原子置
換為硫原子(S代)，從而防止了細(xì)胞內(nèi)核酸分解酶導(dǎo)致的寡核苷酸的分解。
通過IB A公司(Gottingen， Germany)的禾ll用Magnet assisted transfection
法的基因?qū)朐噭┖?MATm-A試劑)，將S代正義寡核苷酸導(dǎo)入至大鼠原
代培養(yǎng)肝細(xì)胞中。
大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞用公知的方法(J. Hepatol， 40, 616-623, 2004)制備， 并接種在6孔板中(每孔3xl()S個(gè)細(xì)胞)。2小時(shí)后，更換為每孔L5ml的新 培養(yǎng)基(在Williams'E培養(yǎng)基(WE)中含有10%胎牛血清、10nM地塞米 松和lOnM胰島素的培養(yǎng)基。簡(jiǎn)稱為WES-DI)。然后4小時(shí)后，將寡核苷 酸(2嗎)和WE (200^1)混合，接著混合2^1的MATra-A試劑(IBA公司)， 在室溫下靜置20分鐘后，將之全部滴加至加入有肝細(xì)胞的孔中。將6孔板 置于磁盤(IBA公司)上，在室溫下靜置15分鐘，從而將寡核苷酸導(dǎo)入細(xì) 胞內(nèi)。更換為含有10%胎牛血清的WE (每孔1.5ml)，之后在37。C下放置
14一夜。第二天早晨，更換為含有l(wèi)nM的IL-l(3的WE培養(yǎng)基，在37t:下放 置4小時(shí)后，制備了全RNA。
用IL-lj3刺激肝細(xì)胞時(shí)，iNOSmRNA的量顯著增加，導(dǎo)入上述的S代 正義寡核苷酸后用IL-1卩刺激，用RT-PCR法和實(shí)時(shí)PCR法進(jìn)行mRNA量 的測(cè)定。結(jié)果如圖l和2所示。
此處使用的iNOS基因的正義鏈序列、即具有與iNOSmRNA相同的序 列的S代寡核苷酸為如下所示的序列。在實(shí)驗(yàn)中相當(dāng)于S2、 S4和S5。
S2: 5，-G*C*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C-3'
S4: 5，-T*A*G*CTGCATTGTGTACA*G*A*T-3'
S5: 5,-G*T*G*TATAATTCCTTGAT*G*A*A-3' "代的部分用*表示。)
另一方面，作為陰性對(duì)照，堿基組成相同但序列不同，因而導(dǎo)入具有 確認(rèn)不會(huì)與iNOSmRNA或其轉(zhuǎn)錄物、或其它的RNA發(fā)生雜交的序列的"隨 機(jī)寡核苷酸(scramble oligo)"。隨機(jī)寡核苷酸的序列如下所示。
Scr2: 5，-G*G*T*ATTGCCCACCCAAC*T*C*T-3，
Scr4: 5，-G*G*C*TCCATATGATTAGA*T*G*T-3，
Scr5: 5,-G*A*T*TGTTACTTAGAGAC*T*A*T-3，
為了防止細(xì)胞內(nèi)的分解，這些隨機(jī)寡核苷酸也和正義寡核苷酸同樣， 在硫代后使用。對(duì)于"隨機(jī)寡核苷酸"，通過進(jìn)行與大鼠基因組的同源性檢 索，確認(rèn)了不存在類似的序列。
進(jìn)而，作為另一個(gè)陰性對(duì)照，導(dǎo)入相對(duì)于iNOSmRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖 部分的硫代正義寡核苷酸S1。 Sl的序列如下所示。
SI: 5'-C*A*T*TCTCTTTCCTTTGC*C*T*C-3' (*表示和上述相同的意義。)
使用與正義鏈(具有與mRNA相同序列的鏈)相同序列的引物進(jìn)行鏈 特異性RT-PCR法時(shí)，由于僅有相對(duì)于"反義轉(zhuǎn)錄物"cDNA被逆轉(zhuǎn)錄，因而 可以測(cè)定"反義轉(zhuǎn)錄物"的量。另外，設(shè)置在不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的情況下進(jìn)行PCR 的對(duì)照，確認(rèn)了肝細(xì)胞的全RNA中混入的基因組沒有通過PCR而擴(kuò)增。 在圖中用RT ( — )表示。
結(jié)果是，導(dǎo)入了 S2、 S4和S5的硫代正義寡核苷酸時(shí)，iNOSmRNA的量減少。這表示，硫代正義寡核苷酸和iNOS的反義轉(zhuǎn)錄物發(fā)生雜交，反 義轉(zhuǎn)錄物被分解，因而iNOSmRNA也被分解。另一方面，在導(dǎo)入隨機(jī)寡核 苷酸時(shí)，iNOSmRNA的量沒有大的變動(dòng)。另外，在導(dǎo)入相對(duì)于莖部分的Sl 時(shí)，iNOSmRNA的量也沒有大的變動(dòng)。
另外，在向肝細(xì)胞中導(dǎo)入正義寡核苷酸S5或隨機(jī)寡核苷酸Scr5時(shí)， 以經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)PCR法來測(cè)定添加IL-ip后的 iNOSmRNA的量。其結(jié)果是，導(dǎo)入隨機(jī)寡核苷酸Scr5時(shí)，iNOSmRNA的 量變?yōu)?倍所需要的時(shí)間為119分鐘。與之相對(duì)，導(dǎo)入正義寡核苷酸S5 時(shí)為461分鐘(圖2)。
與iNOS同樣，iNOS之外的早期應(yīng)答基因Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant (細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子)1、 CINC-1也在肝 細(xì)胞中在IL-ip刺激下引起顯著的mRNA的誘導(dǎo)。而且，在CINC-l的mRNA 的3，非翻譯區(qū)域(3'UTR)中也與iNOSmRNA同樣地存在ARE序列。在 將iNOS的正義寡核苷酸導(dǎo)入肝細(xì)胞時(shí)測(cè)定CINC-1的mRNA量，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)與未導(dǎo)入正義寡核苷酸時(shí)的mRNA量沒有差別。即，顯示了iNOS的正 義寡核苷酸的作用僅限于iNOS (圖1)。
綜合以上結(jié)果可見，iNOS的正義寡核苷酸與iNOS反義轉(zhuǎn)錄物特異性 地雜交，從而促進(jìn)iNOSmRNA的分解，結(jié)果使iNOSmRNA的量特異性地 減少。
實(shí)施例5:利用小鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物使iNOSmRNA穩(wěn)定化
向來源于小鼠巨噬細(xì)胞的RAW264細(xì)胞中導(dǎo)入具有與小鼠反義雜交的 性質(zhì)的iNOS正義寡核苷酸的硫代正義寡核苷酸，研究小鼠反義轉(zhuǎn)錄物對(duì) iNOSmRNA的表達(dá)抑制。
以下未記載的操作采用和實(shí)施例4相同的方法進(jìn)行。將小鼠RAW264 細(xì)胞按每孔5x105細(xì)胞接種，更換為DMEM培養(yǎng)基，用C02恒溫器培養(yǎng)。
通過IBA公司(Gottingen， Germany)的Magnet assisted transfection 法，在RAW264細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入硫代正義寡核苷酸。更換為含有10%胎牛血清 的DMEM培養(yǎng)基(每孔1.5ml)，之后在37C放置一夜。第二天早晨，更 換為含有大腸桿菌LPS (lpg/ml)的DMEM培養(yǎng)基，在37'C放置4小時(shí)，
16之后提取全RNA以供于RT-PCR。另夕卜，全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems公司)進(jìn)行處理，除去混入的基因 組DNA。
正義寡核苷酸相對(duì)于對(duì)應(yīng)于小鼠反義轉(zhuǎn)錄物的小鼠iNOSmRNA來制作。
此處使用的小鼠iNOS基因的正義鏈的序列、即具有與iNOSmRNA相 同的序列的硫代寡核苷酸以序列表示。在實(shí)驗(yàn)中相當(dāng)于S1、 S2和S3。 S1: 5，-G*A*A*GCACTTTGGGTGAC*C*A*C-3' S2: 5，-T*A*G*CTGCACTATGTACA*G*A*T-3' S3: 5，-C*A*G*ATATTTATACTTCA*T*A*T-3,
(硫代的部分用*表示。) 依照在實(shí)施例4中進(jìn)行的鏈特異性RT-PCR法，測(cè)定小鼠iNOSmRNA
結(jié)果是小鼠iNOSmRNA的量減少。這表明，硫代正義寡核苷酸和iNOS 的反義轉(zhuǎn)錄物發(fā)生雜交，反義轉(zhuǎn)錄物被分解或被競(jìng)合，因而，iNOSmRNA 也被分解(圖3)。
由實(shí)施例4和5的結(jié)果顯示，不僅是大鼠，對(duì)于小鼠，iNOS的正義寡 核苷酸也通過和iNOS反義轉(zhuǎn)錄物特異性地雜交而促進(jìn)iNOSmRNA的分 解，結(jié)果使iNOSmRNA的量特異性地減少。
這樣，在大鼠肝細(xì)胞和小鼠細(xì)胞中都可以使用正義寡核苷酸來抑制 iNOSmRNA的表達(dá)。因此，使用正義寡核苷酸的iNOSmRNA的表達(dá)抑制 會(huì)減輕肝臟等的炎癥時(shí)的iNOS誘導(dǎo)和NO產(chǎn)生，可以說是肝功能障礙的有 效治療方法。
(3)和iNOS基因之外的早期應(yīng)答基因的mRNA互補(bǔ)的序列即反義轉(zhuǎn) 錄物的序列和區(qū)域(堿基長(zhǎng))的確定方法
在炎癥時(shí)被誘導(dǎo)而表達(dá)的基因(所謂的"早期應(yīng)答基因")中，不僅有 iNOS，還包含細(xì)胞因子和趨化因子等生理活性物質(zhì)的基因。這些早期應(yīng)答 基因具有使炎癥惡化、或使其改善等多種作用。調(diào)節(jié)早期應(yīng)答基因的表達(dá)
17最終與調(diào)節(jié)炎癥有關(guān)。因此，除了 iNOS基因的反義轉(zhuǎn)錄物之外，也研究 了其它早期應(yīng)答基因是否也表達(dá)反義轉(zhuǎn)錄物。接著，推定對(duì)于在物種間高
保守的、且含有多個(gè)ARE序列的3'UTR序列，反義轉(zhuǎn)錄物也被表達(dá)。而 且，對(duì)該部分設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)錄用的正義引物和PCR用的一對(duì)引物，與用大鼠的 iNOS基因來檢測(cè)反義轉(zhuǎn)錄物的實(shí)施例4同樣地進(jìn)行鏈特異性RT-PCR法， 研究在大鼠肝細(xì)胞中是否有反義轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。
在iNOS之外的早期應(yīng)答基因中，以3'UTR中含有多個(gè)ARE序列、且 物種間(人、小鼠、大鼠)3'UTR序列高度類似的3個(gè)典型的基因?yàn)槔M(jìn) 行研究。即，使用以下的3個(gè)基因。
(a) 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子l(CINC-l):也被稱為趨化 因子(C-X-C motif)配體l (CXCL1)，是被IL-1(3刺激的大鼠肝細(xì)胞中誘導(dǎo) 的趨化因子。
(b) NF-KBp50:轉(zhuǎn)錄因子NF-kb的亞型之一，是與炎癥密切相關(guān)的 蛋白質(zhì)。
(c) IkB-cx:抑制NF-KB的活性的蛋白質(zhì)。
另外，人、小鼠以及大鼠的這些mRNA的堿基序列通過 DDBJ/EMBL/GenBank國(guó)際堿基序列數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/、 http:〃www.ebi.ac.uk/embl/、 http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)可知。
實(shí)施例6:大鼠CINC-1反義轉(zhuǎn)錄物
用以下方法對(duì)大鼠CINC-1的mRNA研究是否存在由基因的反義鏈轉(zhuǎn) 錄而成的"反義轉(zhuǎn)錄物"。以下沒有特別記載的操作用和實(shí)施例1相同的方 法進(jìn)行。
用IL-1卩剌激原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞，然后依照通常的方法，使用Trizol 試劑(Invitrogen公司)提取全RNA。將獲得的全RNA用含有DNase的 TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems公司)進(jìn)行處理，除去混入 的基因組DNA。以該全RNA為模板，使用如下所示的大鼠CINC-1基因的 正義鏈的引物5，-TGTCTGGTGAACGCTGGCTTCTGA-3，(序列號(hào)16)進(jìn) 行逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA。
使用獲得的cDNA和以下所示的大鼠CINC-1基因的正義鏈的2種引物正向5，-TGTGGATGCGTTTCATCGATGGT-3，(序列號(hào)17);反向5' -CTAGCACAGTGGTTGACACTTA-3'(序列號(hào)18)，用和實(shí)施例1相同的 步減法進(jìn)行PCR。
進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見122個(gè)堿基對(duì)(bp)的條
帶的擴(kuò)增。將該擴(kuò)增的條帶從凝膠中切下并精制，確定堿基序列，結(jié)果確 認(rèn)了其為夾在上述的引物序列間的大鼠CINC-1 mRNA的3'UTR的序列。 即，通過使用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了大鼠 CINC-1基因的反義轉(zhuǎn)錄物的存在。大鼠CINC-1基因的反義轉(zhuǎn)錄物的序列 如序列號(hào)19所示。是以cDNA序列的形式表示的。
實(shí)施例7:大鼠NF-KBp50反義轉(zhuǎn)錄物
用以下方法對(duì)大鼠NF-kB p50的mRNA研究是否存在由基因的反義鏈 轉(zhuǎn)錄而成的"反義轉(zhuǎn)錄物"。以下沒有特別記載的操作用和實(shí)施例6相同的 方法進(jìn)行。
用IL-1(3刺激原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞，然后依照通常的方法，使用Trizol 試劑(Invitrogen公司)提取全RNA。將獲得的全RNA用含有DNase的 TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems公司)進(jìn)行處理，除去混入 的基因組DNA。以該全RNA為模板，使用如下所示的大鼠NF-kB p50基 因的正義鏈的引物5，-CTGTCATTAAGGTATCGCAGTCC-3，(序列號(hào)20) 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA。
使用獲得的cDNA和以下所示的大鼠NF-kB p50基因的正義鏈的2種 引物正向5，-CATCTACAGTACAGTCATGCACTC-3，(序列號(hào)21);反 向5，-GGGAAAATACTATTTTCAGCACTGAT-3，(序列號(hào)22)，用和實(shí)施 例1相同的步減法進(jìn)行PCR。
進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見192個(gè)堿基對(duì)(bp)的條 帶的擴(kuò)增。將該條帶從凝膠中切下并精制，確定堿基序列，結(jié)果確認(rèn)了其 為夾在上述的引物序列間的大鼠NF-KBp50mRNA的3'UTR的序列。艮口， 通過使用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了大鼠NF-kB p50基因的反義轉(zhuǎn)錄物的存在。大鼠NF-kb p50基因的反義轉(zhuǎn)錄物的序列如 序列號(hào)23所示。是以cDNA序列的形式表示的。實(shí)施例8:大鼠IKB-(x反義轉(zhuǎn)錄物
用以下方法對(duì)大鼠IkB-(x的mRNA研究是否存在由基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄 而成的"反義轉(zhuǎn)錄物"。以下沒有特別記載的操作用和實(shí)施例6相同的方法 進(jìn)行。
用IL-1(3刺激原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞，然后依照通常的方法，使用Trizol 試劑(Invitrogen公司)提取全RNA。將獲得的全RNA用含有DNase的 TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems公司)進(jìn)行處理，除去混入 的基因組DNA。以該全RNA為模板，使用如下所示的大鼠IkB-(x基因的正 義鏈的引物5，-TCCAGAATCTGATAAAAGGACCAC-3，(序列號(hào)24)進(jìn)行 逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA。
使用獲得的cDNA和以下所示的大鼠IkB-(x基因的正義鏈的2種引物 正向5，-TGAACCGCCATAGACTGTAGCTG-3，(序列號(hào)25);反向 5，-GCACATACCACTGAACACCTGGT-3，(序列號(hào)26)，用和實(shí)施例1相同 的步減法進(jìn)行PCR。
進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見102個(gè)堿基對(duì)(bp)的條 帶的擴(kuò)增。將該條帶從凝膠中切下并精制，確定堿基序列，結(jié)果確認(rèn)了其 為夾在上述的引物序列間的大鼠lKB-amRNA的3'UTR的序列。艮P，通過 使用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了大鼠lKB-a基因 的反義轉(zhuǎn)錄物的存在。大鼠IkB-oc基因的反義轉(zhuǎn)錄物的序列如序列號(hào)27所 示。是以cDNA序列的形式表示的。
作為炎癥時(shí)表達(dá)的早期應(yīng)答基因，選擇了 iNOS之外的代表性的3個(gè) 基因(CINC-1、 NF-KBp50、 IkB-oi)，每一個(gè)都在3，UTR中含有多個(gè)ARE 序列，且物種(人、小鼠、大鼠)之間3'UTR的序列高度相似。和iNOS 相同，這3種基因也確認(rèn)了有反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)。
由此推測(cè)，反義轉(zhuǎn)錄物是在含有ARE序列、且在物種間3'UTR序列 高度相似的早期應(yīng)答基因中均可見的分子。進(jìn)而，強(qiáng)烈地暗示了反義轉(zhuǎn)錄 物調(diào)節(jié)這些mRNA的穩(wěn)定性的可能性。因此，期待可以通過抑制肝臟等的 炎癥中的早期應(yīng)答基因的反義轉(zhuǎn)錄物的作用來抑制炎癥。(4)使用大鼠急性肝功能衰竭模型的生物體內(nèi)(in vivo)的iNOS和 反義轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)誘導(dǎo)和肝臟保護(hù)劑(IGF-I和FR183998)對(duì)iNOS和反 義轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)誘導(dǎo)的抑制效果
由實(shí)施例1和實(shí)施例4的結(jié)果顯示，在大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞(in vitro) 體系中，iNOS誘導(dǎo)時(shí)，與iNOSmRNA的3'-非翻譯區(qū)域(3'UTR)對(duì)應(yīng)的 反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)，從而促進(jìn)iNOSmRNA的穩(wěn)定化。如下示出在肝功能障礙 大鼠(in vivo)中，iNOS反義轉(zhuǎn)錄物也隨著iNOS誘導(dǎo)而表達(dá)。另外，胰 島素樣生長(zhǎng)因子I (Insulin-like growth factor-I， IGF-I)和Na+7H+交換抑制 劑(FR183998)等肝臟保護(hù)劑的投予所引起的存活率的變化和炎癥性細(xì)胞 因子、iNOSmRNA以及反義轉(zhuǎn)錄物的誘導(dǎo)之間的關(guān)系如下所示。
實(shí)施例9
(I) 急性肝功能衰竭模型的制作和肝臟保護(hù)劑的投予
對(duì)雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)靜脈注射D-半乳糖胺 (400g/kg)和細(xì)菌內(nèi)毒素LPS (16嗎/kg)的混合液(D-GalN/LPS)，制造 急性肝功能衰竭的模型。在D-GalN/LPS處理的30分鐘前投予胰島素樣生 長(zhǎng)因子I (IGF-I， 3.2mg/kg)或NaVH+交換抑制劑(FR183998， lmg/kg)。 測(cè)定血中和肝臟的炎癥性細(xì)胞因子(TNF-a、IL-l卩、IL-6、干擾素Y、CINC-l)、 MIP-2和一氧化氮(NO)。由肝臟制備全RNA，通過RT-PCR來研究 iNOSmRNA和iNOS反義轉(zhuǎn)錄物。
(II) RNA的分析
靜脈注射D-半乳糖胺和LPS的混合液3或6小時(shí)后，取出大鼠的肝臟， 依照通常的方法，使用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取全RNA。以該全 RNA為模板，使用寡聚dT引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，之后通過和實(shí)施例1等相同 的方法進(jìn)行PCR (RT-PCR法)。對(duì)于iNOSmRNA和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)延伸因子(e longation factor) -la (EF1) mRNA的定量，逆轉(zhuǎn)錄時(shí)使用寡聚dT引物， PCR時(shí)使用iNOSmRNA: CCAACCTGCAGGTCTTCGATG (序歹ij號(hào)28) 和GTCGATGCACAACTGGGTGAAC (序列號(hào)29); EFmRNA: TCTGGT TGGAATGGTGACAACATGC (序列號(hào)30)禾卩CCAGGAAGAGCTTCACT CAAAGCTT (序列號(hào)31)。另外，在PCR反應(yīng)液中加入了 anti-Taqhigh (=抗Taq聚合酶抗體，東洋紡)。
另外，iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的定量依照實(shí)施例1的方法進(jìn)行。設(shè)置在不進(jìn) 行逆轉(zhuǎn)錄的情況下進(jìn)行PCR的對(duì)照，確認(rèn)了肝細(xì)胞的全RNA中混入的基 因組沒有通過PCR而擴(kuò)增。iNOSmRNA檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，iNOS反義 轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。圖中，RT ( — )表示逆轉(zhuǎn)錄(一)的陰性 對(duì)照。
(III) 利用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行mRNA和反義轉(zhuǎn)錄物的定量 逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA使用日本Bio-Rad公司的iCycler System,也通過
實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行了定量。在PCR反應(yīng)液中添加SYBR Green I (Roche-Diagnostics公司)和anti-Taq high(=抗Taq聚合酶抗體，東洋紡)， 用公知的方法即觸減(TouchDown)法進(jìn)行PCR。實(shí)際的PCR方案如下所 述。
1個(gè)循環(huán)(94°C， 1分鐘)
50個(gè)循環(huán)(94°C， 30秒鐘;(72-0.3xn) °C， 1分鐘;72°C， 30秒鐘)， n為循環(huán)數(shù)。結(jié)果如圖6所示。圖中，"*"表示"相對(duì)于GalN/LPS大鼠(n =3 6只大鼠/組)，p<0.05"。
(IV) 肝臟保護(hù)劑帶來的iNOSmRNA和iNOS反義轉(zhuǎn)錄物量的變化 未投予肝臟保護(hù)劑時(shí)，在D-GalN/LPS的靜脈注射后，約24小時(shí)內(nèi)幾
乎全部的動(dòng)物(90%以上)死亡。隨著時(shí)間的推移(1 12小時(shí))，血中和 肝臟中的炎癥性介質(zhì)(TNF-a、 IL-1卩、IL-6、干擾素丫、 CINC-1、 MIP-2、 NO)增加。顯示出反義轉(zhuǎn)錄物隨著肝臟的iNOSmRNA誘導(dǎo)而增加 (iNOSmRNA和iNOS反義轉(zhuǎn)錄物都在6小時(shí)后達(dá)到最大)，其結(jié)果可見過 剩的NO產(chǎn)生。
IGF-I的投予使死亡率減少至20 30。/。以下。而且，除了上述的炎癥性 細(xì)胞因子、NO產(chǎn)生被抑制以外，iNOSmRNA和反義轉(zhuǎn)錄物誘導(dǎo)的增加也 同樣被抑制(圖4 6)。
FR183998的投予也使死亡率減少至20 30%以下，除了上述的炎癥性 細(xì)胞因子、NO產(chǎn)生被抑制以外，iNOSmRNA和反義轉(zhuǎn)錄物誘導(dǎo)的增加也 同樣被抑制(圖7 9)。
(IV-1)大鼠急性肝功能衰竭模型中肝臟保護(hù)劑IGF-I對(duì)iNOSmRNA和反義轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)誘導(dǎo)的效果
由圖4的結(jié)果可知，投予了 D-半乳糖胺和LPS的大鼠(GalN/LPS大 鼠)在3 6小時(shí)內(nèi)iNOSmRNA水平增加，但投予了 IGF-I的大鼠中其增 加被抑制。
由圖5和6的結(jié)果所示，在RT( — )中幾乎未見擴(kuò)增的cDNA，因而 可以認(rèn)為全RNA中混入的基因組DNA是極微量的。GalN/LPS大鼠在3 6小時(shí)內(nèi)反義轉(zhuǎn)錄物水平增加，但投予了 IGF-I的大鼠中其增加被抑制。
(IV-2)大鼠急性肝功能衰竭模型中肝臟保護(hù)劑FR183998對(duì) iNOSmRNA和反義轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)誘導(dǎo)的效果
由圖7的結(jié)果可知，GalN/LPS大鼠在3 6小時(shí)內(nèi)iNOSmRNA水平增 加，但投予了 FR183998的大鼠中其增加被抑制。
由圖8和9的結(jié)果所示，在RT ( — )中幾乎未見擴(kuò)增的cDNA，因而 可以認(rèn)為全RNA中混入的基因組DNA是極微量的。GalN/LPS大鼠在3 6小時(shí)內(nèi)反義轉(zhuǎn)錄物水平增加，但投予了FR183998的大鼠中其增加被抑制。
(5) 大鼠肝細(xì)胞中的正義寡核苷酸的效果(iNOS蛋白質(zhì)和一氧化氮 (NO)量的變化)
實(shí)施例10
通過和實(shí)施例4相同的方法，將在實(shí)施例4中獲得的正義寡核苷酸S5 或隨機(jī)寡核苷酸Scr5導(dǎo)入肝細(xì)胞中，用一氧化氮比色法分析試劑盒(Nitric Oxide Colorimetric Assay Kits (Roche-Diagnostics公司))測(cè)定培養(yǎng)基中的一 氧化氮(NO)的量。第二天早晨，更換為含有InM的IL-ip的WE培養(yǎng)基， 在37'C下放置8 10小時(shí)，之后進(jìn)行測(cè)定。另夕卜，從細(xì)胞中提取全蛋白質(zhì)， 通過使用ECL試劑盒(GE Healthcare公司)的Western法來檢測(cè)iNOS蛋 白質(zhì)。結(jié)果如圖10所示。
其結(jié)果顯示，通過在大鼠肝細(xì)胞中導(dǎo)入正義寡核苷酸S5， iNOS蛋白 質(zhì)和培養(yǎng)基中的一氧化氮(NO)量減少。
(6) 利用Northern法來檢測(cè)iNOS反義轉(zhuǎn)錄物 實(shí)施例ll
23通過Northern blot analysis (以下簡(jiǎn)稱為Northern法)確認(rèn)了在用IL-1J3 刺激的大鼠肝細(xì)胞中存在iNOS基因的反義轉(zhuǎn)錄物。
(I) RNA的制備
用IL-ip刺激大鼠肝細(xì)胞一定時(shí)間，然后使用Trizol試劑(Invitrogen 公司)提取全RNA。將獲得的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free試 劑盒(Applied Biosystems公司)進(jìn)行處理，除去混入的基因組DNA。用 PolyATract mRNA分離體系(Promega公司)對(duì)Poly (A) +和Poly (A) 一RNA進(jìn)行分級(jí)。為了防止非特異性的雜交，使核糖體RNA (rRNA)在 最終濃度為5%的聚乙二醇6000和最終濃度為0.75M的NaCl存在下沉淀除 去，將上清通過乙醇沉淀來回收，用于電泳。
(II) Northern法電泳
將上述4種RNA、即無刺激大鼠肝細(xì)胞的全RNA、 IL-1(3刺激大鼠肝 細(xì)胞的全RNA、 IL-l卩剌激大鼠肝細(xì)胞的Poly (A) +RNA和IL-lp刺激大 鼠肝細(xì)胞的Poly (A) —RNA，用含有2.2M福爾馬林的瓊脂糖進(jìn)行電泳和 分離。
(III) Northern法雜交
依照常法，將凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移至NytranN過濾器(Whatman公司)。 之后，在DIG EasyHyb緩沖液(Roche-Diagnostics公司)中，與地高辛(DIG) 標(biāo)記的iNOS的3'UTR的正義探針在73。C下進(jìn)行一夜的雜交。第二天早晨， 依照Roche-Diagnostics公司的操作手冊(cè)，將過濾器進(jìn)行洗滌。另外，iNOS 的3'UTR的正義探針是通過使用DIG-ll-UTP (Roche-Diagnostics公司)和 T3RNA聚合酶(Stratagene公司)在試管內(nèi)合成RNA而制得的。
(IV) Northern法檢測(cè)
依照Roche-Diagnostics公司的操作手冊(cè)進(jìn)行封閉，將其和與堿性磷酸 酶結(jié)合了的抗DIG抗體(Roche-Diagnostics公司) 一起孵育。洗滌后，使 其與底物CDP-Star (Applied Biosystems公司)反應(yīng)，然后通過X射線膠片 來檢測(cè)與iNOS正義探針雜交的RNA的條帶。
(V) 結(jié)果和考察
上述4種RNA的利用Northern法得到的分析結(jié)果(X射線膠片的放射 自顯影圖)如圖11所示。在"IL-1卩刺激大鼠肝細(xì)胞的全RNA"和"IL-1卩刺激大鼠肝細(xì)胞的Poly (A) —RNA"中觀察到了 600 1000個(gè)核苷酸(nt)的涂片(smear)狀的 深色條帶。由于使用了iN0S的3'UTR的正義探針，因而可以認(rèn)為這些涂 片狀條帶是iNOS的反義轉(zhuǎn)錄物的條帶。因此可知，iNOS的反義轉(zhuǎn)錄物的 長(zhǎng)度并非恒定，而是各種長(zhǎng)度(600 1000個(gè)核苷酸)的轉(zhuǎn)錄物的集合。
綜合RACE的結(jié)果和核糖核酸酶保護(hù)分析(Ribonuclease Protection Assay)的結(jié)果，可以認(rèn)為，如圖12所示，iNOS的反義轉(zhuǎn)錄物被合成。圖 中，虛線表示形成了 600個(gè)核苷酸以上的各種長(zhǎng)度的反義轉(zhuǎn)錄物。圖中的 數(shù)字為iNOS基因的外顯子的編號(hào)，黑色部分為蛋白質(zhì)的翻譯區(qū)域，反白 框是位于外顯子27中的3'UTR。 iNOS的mRNA示于基因的圖中上側(cè)。
(7) iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的過剩表達(dá)所帶來的mRNA的穩(wěn)定化 實(shí)施例12
當(dāng)在大鼠肝細(xì)胞中使iNOS基因的反義轉(zhuǎn)錄物過剩表達(dá)時(shí)，確認(rèn)了 mRNA通過iNOS的3'UTR而穩(wěn)定化。
在一般的報(bào)告基因的情況下，將螢光素酶基因與iNOS基因的啟動(dòng)子 結(jié)合。由于iNOS基因的啟動(dòng)子是"誘導(dǎo)型啟動(dòng)子"，因此在大鼠肝細(xì)胞中， 由于IL-1卩刺激，啟動(dòng)子活性發(fā)生較大的變化，經(jīng)常不能觀察到報(bào)告基因 后結(jié)合的3'UTR的作用。因此，使用了無論是否受到剌激都能促成恒定量 的表達(dá)的"組成型啟動(dòng)子"即延伸因子-lcc (EF)基因的啟動(dòng)子。因此，由 EF啟動(dòng)子控制的螢光素酶基因和卩半乳糖苷酶基因無論是否受到剌激都能 以恒定量表達(dá)。由此，可以單純地觀察到含有poly (A)信號(hào)序列的 iNOSmRNA的3'UTR對(duì)螢光素酶mRNA的穩(wěn)定性所帶來的影響。
以pGL3-Basic質(zhì)粒(Promega公.司)為基礎(chǔ)構(gòu)建以下3種載體。構(gòu)建 的載體的示意圖如圖13所示。
(i)報(bào)告基因(螢光素酶載體)
EF啟動(dòng)子+螢光素酶基因(Luc)十iNOS3'UTR
EF啟動(dòng)子+螢光素酶基因(Luc)十SVpA (螢光素酶mRNA組成型地表達(dá)，但可以通過光素酶基因的后部控制 mRNA的穩(wěn)定性)(ii) iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體
CMV啟動(dòng)子+反向插入iNOS 3'UTR十SVpA (iNOS反義轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞內(nèi)過剩地表達(dá))
(iii) 內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(p半乳糖苷酶載體) EF啟動(dòng)子+卩半乳糖苷酶(lacZ)基因+ SVpA
(P半乳糖苷酶mRNA組成型地表達(dá)) 另外，SVpA是來源于SV40病毒的poly (A)信號(hào)的序列，已知是穩(wěn) 定的3，UTR，加成了 SVpA的mRNA難以被破壞。作為iNOS 3'UTR的對(duì) 照的CMV啟動(dòng)子是來源于巨細(xì)胞病毒的比EF啟動(dòng)子更強(qiáng)的組成型啟動(dòng) 子。
將(i)和(iii)的質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入大鼠肝細(xì)胞時(shí)，由于EF啟動(dòng)子是組 成型的，因此螢光素酶mRNA (Luc)和卩半乳糖苷酶mRNA (卩Gal)的 合成量大致是恒定的。進(jìn)而，如果iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體(ii)添加時(shí) 和未添加時(shí)存在差別，則Luc mRNA/卩Gal mRNA (Luc/(3Gal值)應(yīng)該也存 在差別。如果Luc/(3Gal值根據(jù)iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體的有無而變化， 則iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的過剩表達(dá)通過iNOS 3'UTR而影響螢光素酶mRNA 的穩(wěn)定性。
對(duì)于iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體添加和未添加的情況，隨時(shí)間變化顯 示了 Luc/(3Gal值。結(jié)果如圖14所示。
(i)報(bào)告基因(EF啟動(dòng)子+Luc+iNOS3，UTR)、 ± (ii) iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體、 (iii)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
此時(shí)，比較添加了 iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體時(shí)AS ( + )和未添加時(shí)AS (—)，可見Luc/(3Gal值顯著地增加。圖中，"**"表示"相對(duì)于AS(—)，
po.or，o
即，iNOS反義轉(zhuǎn)錄物通過iNOS 3'UTR使螢光素酶mRNA穩(wěn)定化。 作為對(duì)照，使用連結(jié)有SVpA的報(bào)告基因的結(jié)果如圖15所示。
(i)報(bào)告基因(EF啟動(dòng)子+Luc+SVpA)、 ± (ii) iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體、
(iii)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
此時(shí)，比較添加了 iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體時(shí)[AS (+)]和未添加時(shí) [AS ( — )]，未見Luc/(3Gal值增加。艮卩，SVpA并不影響mRNA的穩(wěn)定性。 [意義]
根據(jù)以上結(jié)果(iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的過剩表達(dá)實(shí)驗(yàn))，可以認(rèn)為，iNOS 反義轉(zhuǎn)錄物具有作用于iNOS 3'UTR而使mRNA穩(wěn)定化的作用。與利用硫 代反義寡核苷酸的iNOSmRNA的knockdown實(shí)驗(yàn)的結(jié)果綜合來看，可以 說iNOS反義轉(zhuǎn)錄物通過iNOS 3'UTR而使iNOSmRNA穩(wěn)定化。
因此，強(qiáng)烈暗示了利用iNOS反義轉(zhuǎn)錄物來控制iNOSmRNA的穩(wěn)定性 的機(jī)理會(huì)在肝臟等的炎癥中發(fā)揮重要的作用。另外，該機(jī)理可以成為NO 所相關(guān)的多種疾病的治療靶的。
通過投予肝臟保護(hù)劑，抑制了 iNOSmRNA和反義轉(zhuǎn)錄物的誘導(dǎo)。以上 的結(jié)果強(qiáng)烈暗示了反義轉(zhuǎn)錄物在體內(nèi)(in vivo)也作為iNOSmRNA表達(dá)誘 導(dǎo)的控制因子而相關(guān)。因此認(rèn)為，使用肝臟保護(hù)劑的反義轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)抑 制會(huì)減少肝臟等的炎癥時(shí)的iNOS誘導(dǎo)和NO產(chǎn)生，是肝功能障礙的有效治 療方法。
權(quán)利要求
1. 一種正義寡核苷酸，其具有與下述iNOSmRNA反義RNA、即iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的序列，所述iNOSmRNA反義RNA具有與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS mRNA互補(bǔ)的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1記載的正義寡核苷酸，其具有與含有序列號(hào)1所示 的核酸序列的所述iNOSmRNA反義RNA、即iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ) 的序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2記載的正義寡核苷酸，其在與所述iNOSmRNA 反義RNA、即iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物中熱力學(xué)不穩(wěn)定的環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的區(qū) 域具有互補(bǔ)的序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 3的任意一項(xiàng)記載的正義寡核苷酸，其具有16個(gè) 堿基 335個(gè)堿基的堿基長(zhǎng)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 4的任意一項(xiàng)記載的正義寡核苷酸及其衍生物，其 經(jīng)過對(duì)核酸分解酶弓I起的分解的穩(wěn)定化。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5中記載的正義寡核苷酸，其中，穩(wěn)定化是通過LNA、 PNA、 ENA、嗎啉和其它修飾方法來進(jìn)行的。
7. —種組合物，其含有權(quán)利要求1 6的任意一項(xiàng)記載的正義寡核苷 酸，且具有促進(jìn)iNOSmRNA的分解的NO產(chǎn)生抑制活性。
8. —種iNOS產(chǎn)生量的抑制方法，其特征在于，在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入下述正 義寡核苷酸，所述正義寡核苷酸具有與iNOSmRNA反義RNA、即 iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供用于iNOS(誘導(dǎo)型一氧化氮合酶)的表達(dá)控制且具有與下述單鏈RNA(反義轉(zhuǎn)錄物)互補(bǔ)的序列的正義寡核苷酸，所述單鏈RNA(反義轉(zhuǎn)錄物)具有與iNOS基因的mRNA互補(bǔ)的堿基序列。使用本發(fā)明的正義寡核苷酸，可以控制iNOS的表達(dá)，對(duì)生物體防御或NO的過剩產(chǎn)生所相關(guān)的疾病、例如致癌和炎癥性疾病、細(xì)菌感染等所引起的內(nèi)毒素休克等的治療和預(yù)防是有用的。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101460624SQ20078002110
公開日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2007年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者三浦健人, 上山泰男, 奧村忠芳, 若命浩二, 西澤干雄 申請(qǐng)人:阿明諾化學(xué)株式會(huì)社;學(xué)校法人關(guān)西醫(yī)科大學(xué)