專利名稱：控制基因產(chǎn)物產(chǎn)量的方法以及產(chǎn)量控制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及控制細(xì)胞內(nèi)的基因產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，特別是增加產(chǎn)量的方 法以及產(chǎn)量控制劑。
背景技術(shù)：
以往，已知被稱為RNAi(RNA干擾RNAinterference)的用雙鏈RNA 將目標(biāo)mRNA切斷以抑制轉(zhuǎn)錄的方法，但通常RNAi的堿基長為20個堿基 對左右(專利文獻(xiàn)l:日本特開2005-13224號公報(bào))，并且其雙鏈寡核苷酸 和其反義RNA的篩選方法己經(jīng)公開了。另外，也公開了對于通過使用小核 酸分子，例如短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA( siRNA)、雙鏈RNA( dsRNA)、 微小RNA (miRNA)以及短發(fā)夾RNA (shRNA)分子的RNA干擾(RNAi) 來調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素基因、白細(xì)胞介素超家族基因、或與基因表達(dá)和/或活性 的白細(xì)胞介素路徑相關(guān)的基因的表達(dá)和活性有用的化合物(專利文獻(xiàn)2:曰 本特開2005-524393號公報(bào))。
當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在反義RNA時(shí)，由于和與其互補(bǔ)的mRNA發(fā)生雜交，阻 礙從mRNA向蛋白質(zhì)的翻譯，因此能夠阻礙基因的表達(dá)。如果人為地將反 義RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，則由于能夠阻礙靶基因的表達(dá)，因此目前作為分析基 因功能的技術(shù)而被使用，且在藥品中的應(yīng)用也正在研究之中。但是，對于 細(xì)胞內(nèi)RNA的存在方式有很多不清楚的地方，關(guān)于以從mRNA向蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)錄的過程為對象的對其表達(dá)的控制也有很多不清楚的地方。
專利文獻(xiàn)1:日本特開2005-13224號公報(bào)
專利文獻(xiàn)2:日本特開2005-524393號公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供控制細(xì)胞內(nèi)的基因產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，特別是增加產(chǎn)量的方 法以及產(chǎn)量控制劑。
本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)存在具有與mRNA互補(bǔ)的序列的單鏈RNA
4(反義轉(zhuǎn)錄物(antisense transcript),通常被認(rèn)為是DNA的反義鏈的轉(zhuǎn)錄物， 而無論其來源如何)，其與現(xiàn)有的反義RNA不同，有助于mRNA的穩(wěn)定化， 從而完成了本發(fā)明。
艮P，本發(fā)明涉及以下的基因產(chǎn)物產(chǎn)量的控制方法，可使用該方法的基 因產(chǎn)物的篩選方法以及產(chǎn)量控制劑。
1. 一種增加細(xì)胞內(nèi)的基因產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括將含有 與和所述基因產(chǎn)物對應(yīng)的mRNA的堿基序列互補(bǔ)的序列的物質(zhì)或其前體或 者在細(xì)胞內(nèi)可與它們具有同等作用的物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的工序。
2. 如上述1所述的增加細(xì)胞內(nèi)的基因產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，其中，含有與 和所述基因產(chǎn)物對應(yīng)的mRNA的堿基序列互補(bǔ)的序列的物質(zhì)或其前體或者 在細(xì)胞內(nèi)可與它們具有同等作用的物質(zhì)是在細(xì)胞內(nèi)有助于mRNA的穩(wěn)定化 的物質(zhì)。
3. 如上述1或2所述的增加細(xì)胞內(nèi)的基因產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，其中，所 述基因產(chǎn)物為細(xì)胞因子或其前體。
4. 如上述1 3任一項(xiàng)所述的增加細(xì)胞內(nèi)的基因產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，其 中，所述基因產(chǎn)物為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)。
5. —種基因產(chǎn)物的篩選方法，其可使用上述1所述的產(chǎn)量增加方法， 并包括判斷細(xì)胞內(nèi)是否存在含有與和基因產(chǎn)物對應(yīng)的mRNA的堿基序列互 補(bǔ)的序列的反義轉(zhuǎn)錄物的工序。
6. 如上述5所述的基因產(chǎn)物的篩選方法，其中，所述反義轉(zhuǎn)錄物存在 的判斷是如下進(jìn)行的通過使用含有和所述基因產(chǎn)物對應(yīng)的mRNA的5'末 端和3'末端或者它們附近的一部分的正義序列的引物，來進(jìn)行從細(xì)胞內(nèi) mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，從而確認(rèn)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的有無。
7. 如上述5或6所述的基因產(chǎn)物的篩選方法，其進(jìn)一步包括將能夠與 反義轉(zhuǎn)錄物中所含的堿基序列雜交的寡核苷酸或其衍生物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，從 而觀察所述基因產(chǎn)物產(chǎn)量的增減的工序。
8. —種增加細(xì)胞因子的合成量的物質(zhì)，其含有與所述細(xì)胞因子mRNA 的全部或部分序列互補(bǔ)的序列。
9. 一種細(xì)胞因子產(chǎn)量控制劑，其含有上述8所述的物質(zhì)。
10. —種增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的合成量的物質(zhì)，其含有 與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA的全部或部分序列互補(bǔ)的序列。11. 一種增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的合成量的物質(zhì)，其含有 序列號1或與序列號1具有75%以上的同源性的堿基序列。
12. —種增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的合成量的RNA，其包括 與從cDNA獲得的序列對應(yīng)的堿基序列，所述cDNA是通過使用含有誘導(dǎo) 型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA的5'末端和3'末端或它們附近的一部分序 列的引物，從細(xì)胞內(nèi)mRNA利用逆轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)而獲得的。
13. —種iNOSmRNA表達(dá)控制劑，其含有上述10 12任一項(xiàng)所述的 物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，若使用含有與基因的mRNA的堿基序列互補(bǔ)的序列的物 質(zhì)或其前體或者在細(xì)胞內(nèi)可與它們具有同等作用的物質(zhì)，則能夠控制相應(yīng) 的基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而可用于廣闊的領(lǐng)域，例如用于包括癌或自身免疫 疾病、炎癥性疾病的疾病的治療和預(yù)防。


圖1為表示利用RT-PCR法測定大鼠肝細(xì)胞的mRNA量的結(jié)果的電泳圖。
圖2為表示利用實(shí)時(shí)PCR法測定大鼠肝細(xì)胞的mRNA量的結(jié)果的圖。 圖3為表示利用小鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物分解iNOSmRNA的電泳圖。 圖4為表示顯示給予肝保護(hù)劑(IGF-I)后的大鼠的iNOSmRNA增加
被抑制的利用鏈特異性RT-PCR法檢測iNOSmRNA的結(jié)果的電泳圖。
圖5為表示顯示給予肝保護(hù)劑(IGF-I)后的大鼠的iNOS反義轉(zhuǎn)錄物
增加被抑制的利用鏈特異性RT-PCR法檢測iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的結(jié)果(電泳圖)。
圖6為表示利用實(shí)時(shí)PCR對給予肝保護(hù)劑(IGF-I)后的大鼠的iNOS 反義轉(zhuǎn)錄物的增加進(jìn)行定量的結(jié)果的圖。其中，圖中"*"表示相對于 GalN/LPS大鼠(n二3 6只大鼠/組)，p<0.05。
圖7為表示顯示給予肝保護(hù)劑(FR183998)后的大鼠的iNOSmRNA 增加被抑制的利用鏈特異性RT-PCR法檢測iNOSmRNA的結(jié)果的電泳圖。
圖8為表示顯示給予肝保護(hù)劑(FR183998)后的大鼠的iNOS反義轉(zhuǎn) 錄物增加被抑制的利用鏈特異性RT-PCR法檢測iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的結(jié)果的 電泳圖。圖9為表示利用實(shí)時(shí)PCR法對給予肝保護(hù)劑(FR183998)后的大鼠的 iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的增加進(jìn)行定量的結(jié)果的圖，其中，圖中"*"表示相對于 GalN/LPS大鼠(n二3 6只大鼠/組)，p<0.05。
圖10為表示實(shí)施例10中的iNOS蛋白質(zhì)和培養(yǎng)基中的一氧化氮(NO) 量的測定結(jié)果的電泳圖和圖。
圖11為表示實(shí)施例11的4種RNA的通過Northern法的分析結(jié)果的X 射線膠片放射自顯影圖。從左起，表示"未刺激大鼠肝細(xì)胞的全RNA"、"IL-1卩 刺激大鼠肝細(xì)胞的全RNA"、 "IL-ip刺激大鼠肝細(xì)胞的Poly (A) +RNA" 和"IL-ip刺激大鼠肝細(xì)胞的Poly (A) -RNA"的結(jié)果。
圖12為表示實(shí)施例11的RACE的結(jié)果和核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 的圖。
圖13為表示實(shí)施例12中構(gòu)建的載體的示意圖。
圖14為表示實(shí)施例12中，加入iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體的情況(AS (+ ))與未加入的情況(AS (-))的Luc/(3Gal值隨時(shí)間變化的圖。
圖15為表示在實(shí)施例12中，作為對照的使用了連接有SVpA的報(bào)告 基因(reporter)時(shí)的Luc/pGal值隨時(shí)間變化的圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中，使用含有與特定基因產(chǎn)物對應(yīng)的mRNA的堿基序列互補(bǔ)的 序列的物質(zhì)或其前體或者在細(xì)胞內(nèi)可與它們具有同等作用的物質(zhì)，來增加 上述基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。
艮P，現(xiàn)有的利用反義RNA的表達(dá)量控制方法中，認(rèn)為例如包括通過反 義RNA與正義RNA (senseRNA)雜交，從而抑制其翻譯的過程，但本發(fā) 明中，與反義轉(zhuǎn)錄物相同或類似的物質(zhì)使利用正義鏈的基因產(chǎn)物的產(chǎn)量增 加。盡管其詳細(xì)的機(jī)理尚不清楚，但認(rèn)為是因?yàn)槔绶戳x轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞內(nèi) 有助于正義mRNA的穩(wěn)定化，其與現(xiàn)有的通過反義RNA的表達(dá)量控制方 法的作用機(jī)理完全不同。另外，含有與mRNA的堿基序列互補(bǔ)的序列的物 質(zhì)或其前體或者在細(xì)胞內(nèi)可與它們具有同等作用的物質(zhì)，通常具有相對于 該mRNA的堿基序列為30X以上、優(yōu)選為50%以上，更優(yōu)選為70%以上 的堿基長即可。典型地為RNA鏈，但也可以部分地經(jīng)修飾或與其他物質(zhì)(例 如，蛋白質(zhì)、糖或低分子等)結(jié)合。前體只要是在導(dǎo)入的細(xì)胞內(nèi)或給予的生物體內(nèi)通過代謝能轉(zhuǎn)變?yōu)樯鲜鑫镔|(zhì)的物質(zhì)即可。
關(guān)于判斷本發(fā)明的方法對于某些基因產(chǎn)物是否有效，首先，判斷細(xì)胞
內(nèi)是否存在含有與和該基因產(chǎn)物對應(yīng)的mRNA的堿基序列互補(bǔ)的序列的反
義轉(zhuǎn)錄物。反義轉(zhuǎn)錄物存在的判斷是如下進(jìn)行的使用含有和基因產(chǎn)物對 應(yīng)的mRNA的5'末端和3'末端或它們附近的一部分的正義序列的引物，來 進(jìn)行從細(xì)胞內(nèi)的全RNA的逆轉(zhuǎn)錄，從而確認(rèn)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)的有無。 cDNA合成后，通過PCR法進(jìn)行其cDNA的擴(kuò)增，例如可以通過RACE法 測定全結(jié)構(gòu)。
在確認(rèn)有反義轉(zhuǎn)錄物存在的情況下，將含有與mRNA的堿基序列互補(bǔ) 的序列的物質(zhì)或其前體或者在細(xì)胞內(nèi)可與它們具有同等作用的物質(zhì)(以下 稱它們?yōu)?本發(fā)明物質(zhì)"。)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⒖膳c反義轉(zhuǎn)錄物中所含的堿基 序列雜交的寡核苷酸(以下稱它們?yōu)檎x寡核苷酸)或者其衍生物導(dǎo)入細(xì) 胞內(nèi)，來觀察上述基因產(chǎn)物的產(chǎn)量的增減。若給予本發(fā)明物質(zhì)后，基因產(chǎn) 物(原始的基因產(chǎn)物)的表達(dá)量增加，則可與現(xiàn)有的反義RNA相反地進(jìn)行 正控制。此外，認(rèn)為通過將正義寡核苷酸與反義轉(zhuǎn)錄物反應(yīng)(雜交)，細(xì)胞 內(nèi)的反義轉(zhuǎn)錄物的有效量減少，因此若給予正義寡核苷酸使得基因產(chǎn)物(原 始的基因產(chǎn)物)的表達(dá)量減少，則認(rèn)為反義轉(zhuǎn)錄物與正表達(dá)量控制相關(guān)。
另外，本申請中稱為"正表達(dá)量控制"的情況，不僅包括利用反義轉(zhuǎn)錄 物增加表達(dá)量的情況，也包括在若不給予反義轉(zhuǎn)錄物則表達(dá)量減少的情況 下維持表達(dá)量的情況。
如上所述，只要(1)對于對象基因產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)存在其反義轉(zhuǎn)錄物， (2)反義轉(zhuǎn)錄物有助于基因產(chǎn)物(原始的基因產(chǎn)物)的表達(dá)量控制(特別 是正控制)，則本發(fā)明的方法有效。因此，可適用的基因產(chǎn)物可以通過上述 (1)和(2)的方法容易地進(jìn)行篩選。近年來，已清楚存在相當(dāng)多的這樣 的反義轉(zhuǎn)錄物的種類(參照Science 309: 1564-1566 (2005))，因此，作為 本發(fā)明物質(zhì)可列舉出各種物質(zhì)。例如，用于基因產(chǎn)物為細(xì)胞因子、與炎癥 密切相關(guān)的環(huán)氧合酶2(cyclo-oxygenase 2; COX-2)、趨化因子(chemokine)、 CINC-1 (細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子1: cytokine-induced neutrophil chemoattractant 1)、 NF-kB p50、 MB-a等，特別是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS)或其前體的情況。此外，無論基因產(chǎn)物來自的種類如何。
本發(fā)明中由與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS; inducible nitric oxidesynthase) mRNA互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的反義轉(zhuǎn)錄物含有和使用 iNOSmRNA的正義鏈引物(包括僅與mRNA雜交的(鏈(Strand)特異性 的)引物)來進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，而從互補(bǔ)的DNA (cDNA)獲得的序列對應(yīng)的 堿基序列。
由與iNOS的mRNA互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的本發(fā)明物質(zhì)為含有與序列 號1表示的堿基序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的堿基序列的核苷酸。實(shí)質(zhì)上相同 的核苷酸包括序列號1或與序列號1具有75%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu) 選95%以上的同源性的堿基序列，其是增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS) 的合成量的物質(zhì)。
含有與mRNA的堿基序列互補(bǔ)的序列的物質(zhì)或其前體或者在細(xì)胞內(nèi)可 與它們具有同等的作用的本發(fā)明物質(zhì)可以通過化學(xué)合成、公知的表達(dá)法以 及精制法或者實(shí)施例中記載的方法來制備。
另外，本發(fā)明還涉及含有這些反義轉(zhuǎn)錄物等的細(xì)胞因子產(chǎn)量控制劑， 特別是iNOS產(chǎn)量控制劑。
上述的具有與iNOSmRNA的反義轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的序列的正義寡核苷酸 是指可與反義轉(zhuǎn)錄物雜交的寡核苷酸或其衍生物，也可以是為了不被核內(nèi) 的核酸分解酶分解而被修飾的物質(zhì)。
正義寡核苷酸設(shè)計(jì)可以使用Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415 (2003) 和J. Mol. Biol. 288, 911-940 ( 1999 )中公開的程序"mfold"(參照 http:〃www.bioinfo.rpi.eduTzukerm/rna/)、預(yù)測RNA的2級結(jié)構(gòu)來進(jìn)行。正
義寡核苷酸的候補(bǔ)序列設(shè)計(jì)與含有熱力學(xué)上不穩(wěn)定的部分(例如莖-環(huán) (stem-loop)結(jié)構(gòu)的莖部分以外的區(qū)域)、優(yōu)選莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)(loop)結(jié)構(gòu) 的部分相對的正義寡核苷酸。
對于上述正義寡核苷酸的候補(bǔ)序列，選擇不含有與細(xì)胞發(fā)生序列非特 異性反應(yīng)的5，-CG-3，、 5'-GGGG-3，和5，-GGGGG-3，等序列的序列，用大鼠 基因組進(jìn)行同源性檢索，確認(rèn)不存在類似的序列，來選擇優(yōu)選的序列(參 照J(rèn). Neurochem. 86, 374382 (2003 ))。
作為正義寡核苷酸，可列舉出以下所示的寡核苷酸等(下述序列的表
示中省略了修飾)
5，一GCCTCATACTTCCTCAGAGC—3，(序列號36) 5，—TAGCTGCATTGTGTACAGAT—3'(序列號37)5， —GTGTATAATTCCTTGATGAA—3，(序列號38) 這些可以通過化學(xué)合成、公知的表達(dá)法以及精制法或者實(shí)施例中記載 的方法來制備。
正義寡核苷酸為了不被核內(nèi)的核酸分解酶分解可以被修飾，對于其修 飾沒有特別的限制。正義寡核苷酸在細(xì)胞內(nèi)被核酸外切酶(exonuclease)從 5'或3'末端依次切下核苷酸而從兩端被消化，例如優(yōu)選從兩端將1個以上 的磷酸鍵P = 0取代成P二S，從而被修飾成對分解酶穩(wěn)定的硫代磷酸酯 (phosphorothioate)型(以下將其稱為"S代正義寡核苷酸")。(參照J(rèn). Neurochem. 86,374-382 (2003))。但是，若將全部的磷酸鍵S代則發(fā)生光 學(xué)異構(gòu)性，從雜交的角度出發(fā)變得不利。
作為S代正義寡核苷酸的具體例子，可列舉出以下序列(序列中*表示 被S代的部分)等。
5, —G*c*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C—3，
5, — t* a* g* ctgc attgtgtac a* g* a* t—3 ，
5 ， 一 G* T* G*TATAATTCCTTGAT* G* A* A—3 ，
作為其它的修飾法，可列舉出PNA (肽核酸)、LNA (鎖核酸)、ENA (2，-0, 4'-C-亞乙基一橋核酸；Sigma-Aldrich公司)、嗎啉(morpholino) 寡核苷酸(Gene Tools公司，OR， USA)等。
由于認(rèn)為通過將正義寡核苷酸導(dǎo)入確認(rèn)存在iNOSmRNA的反義轉(zhuǎn)錄 物的細(xì)胞內(nèi)，該正義寡核苷酸與反義轉(zhuǎn)錄物反應(yīng)(雜交)，而使細(xì)胞內(nèi)的反 義轉(zhuǎn)錄物的有效量降低，因此通過給予正義寡核苷酸使原始的基因產(chǎn)物 (iNOS)的表達(dá)量減少，從而能夠抑制NO的過量產(chǎn)生。
實(shí)施例
以下給出實(shí)施例以具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的 限定。
(1)與iNOSmRNA互補(bǔ)的序列的反義轉(zhuǎn)錄物的序列和區(qū)域(堿基長) 的測定方法
實(shí)施例l:大鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物 通過以下的方法，對大鼠iNOS的mRNA，研究從基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄的"反義轉(zhuǎn)錄物"是否存在，并研究該"反義轉(zhuǎn)錄物"與正義基因產(chǎn)物的產(chǎn)生的
控制具有怎樣的關(guān)系。其中，大鼠iNOS的mRNA的堿基序列可由 DDBJ/EMBL/GenBank國際堿基序列數(shù)據(jù)庫(http:ASvww.ddbj.nig.ac.jp/、 http:〃www.ebi.ac.uk/embl八http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)獲知。
在細(xì)胞因子或急性期蛋白質(zhì)等發(fā)生誘導(dǎo)性表達(dá)的基因的mRNA的3'非 翻譯區(qū)域(3'UTR)存在被稱為富AU單元(AU-rich element, ARE)的序 列，即，5'-AUUUA-3，或5，-AUUUUA-3，的序列(參照Proc Natl Acad Sci USA 83:1670-1674(1986))。由于ARE也存在于人、大鼠以及小鼠的iNOSmRNA 的3'UTR，因此通過鏈特異性RT-PCR法研究和含有該ARE的3'UTR對應(yīng) 的(序列為互補(bǔ)性的)反義轉(zhuǎn)錄物是否存在。本方法使用如寡聚dT引物那 樣僅與mRNA雜交的(鏈(strand)特異性的)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄來合成互補(bǔ) 性DNA (cDNA)，然后進(jìn)行PCR法擴(kuò)增cDNA，從而測定mRNA的量。
艮口，使用下面所示的iNOS基因的正義鏈的引物，對向培養(yǎng)基中添加 IL-ip而誘導(dǎo)iNOS mRAN的大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的全RNA進(jìn)行RT-PCR， 從而合成cDNA。
5，一TGCCCCTCCCCCACATTCTCT—3，(序列號2)
將從大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞制備的RNA (l嗎)與2pmo1的引物混合， 隨后在70。C下加熱IO分鐘，然后急冷到0X:。向其中加入ReverTra Ace反 應(yīng)緩沖液(東洋紡)、dNTP (N=A、 C、 G、 T)(使最終濃度為lmM)、 20 單位RNase抑制劑(RNase inhibitor,東洋紡)以及200單位ReverTra Ace 逆轉(zhuǎn)錄酶(東洋紡)，使總量為25pl。在47'C下保溫60分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后， 在70。C下加熱15分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。接著，加入5單位的TthRNaseH (東洋紡)，在37。C下加熱20分鐘，分解模板RNA。將合成的cDNA進(jìn)行 乙醇沉淀并回收，用20jil的TE緩沖液溶解。
向如此得到的cDNA 2^1中加入PCR反應(yīng)緩沖液(NIPPON GENE公 司)、dNTP (N=A、 C、 G、 T; NIPPON GENE公司)(使最終濃度為125pM)、 下述2種引物正向引物40pmo1、反向引物40pmo1、 1單位Gene TaqDNA 聚合酶(NIPPON GENE公司)、以及anti-Taq high (二抗Taq聚合酶抗體， 東洋紡)#，使總量為40pl，進(jìn)一步進(jìn)行PCR。
正向5'—ACCAGGAGGCGCCATCCCGCTGC—3，(序列號3)
反向5，一CTTGATCAAACACTCATTTTATTAAA—3，(序列號4)PCR的溫度方案按照公知的方法，即步減法(step down method)(參 照Nishizawa M, Nakajima T, Yasuda K， Kanzaki H， Sasaguri Y， Watanabe K， and Ito S. Close Kinship of human 20a-hydroxysteroid dehydrogenase gene with three aldo誦keto reductase genes. Genes Cells (2000) 5, 111-125)進(jìn)行。對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)果可見186個堿基對(bp)的條帶的擴(kuò)增。
將該條帶從凝膠中切出并精制，對堿基序列進(jìn)行測定，結(jié)果確認(rèn)其為 在上述引物序列中夾有的、與大鼠iNOSmRNA的3'UTR的序列互補(bǔ)的序 列。即，通過采用了iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了 反義轉(zhuǎn)錄物的存在。
另外，為了研究iNOS基因的反義轉(zhuǎn)錄物的全部結(jié)構(gòu)，利用RACE法 (參照Frohman MA. Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full-length complementary DNAs: thermal RACE. Methods Enzymol. (1993) 218:340-356)試著進(jìn)行分析。RACE法是從己知的cDNA 序列制作鏈特異性的引物并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而測定5'側(cè)和3'側(cè)的cDNA的 序列的方法。
向大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中添加IL-ip，誘導(dǎo)iNOSmRNA，用Trizol試 劑(Invitrogen公司)制備RNA。以該RNA為模板，使用序列號2的引物
(iNOS的正義(正向)弓l物；5，—TGCCCCTCCCCCACATTCTCT—3，) 合成雙鏈cDNA。將CAcassette adaptor (接頭)(附帶在cDNAPCR文庫試 劑盒(cDNAPCR library kit, TAKARABIO株式會社)內(nèi))與該cDNA連 接后，使用序列號3的引物(針對iNOS mRNA的3'UTR的正義(正向) 引物)和CA引物(附帶在cDNAPCR文庫試劑盒(TAKARABIO株式會 社)內(nèi))進(jìn)行PCR。對反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果擴(kuò)增了約250bp 大小的條帶。將該條帶切出，克隆(cloning)到pGEM-T Easy載體(Promega) 上，從而測定堿基序列。
卩，側(cè)的cDNA的序列測定〗
與上述同樣，從由IL-ip誘導(dǎo)的大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞制備RNA。使用 PolyA Tract mRNA Isolation System (Promega)，精制PolyA級分的RNA， 以該RNA為模板，使用帶有錨定序列(下劃線部分)的隨機(jī)引物(錨定隨 豐幾引物；5' —TTCCCTCCCGTTTTCTCTGCCACTAGAATTCTCGAGC
12GGCCGCNNNNNNN—3，(序列號5))合成雙鏈cDNA。將CA cassette adaptor與該cDNA連接后，使用序列號4的引物(針對iNOS mRNA的3'UTR 的反義(反向)弓l物)和CA引物進(jìn)行PCR。精制該反應(yīng)液并以其為模板， 使用針對iNOS mRNA的3'UTR的反義(反向)引物(5'—ATATTAGAGC AGCGGGATGGCGCCTC — 3，(序列號6))和錨定引物(針對上述"錨定隨 機(jī)引物"的錨定序列的引物；5'—ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC—3，(序 列號7))進(jìn)行2次PCR。對反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果擴(kuò)增了 200 500bp大小的條帶。將該條帶切出，克隆到pGEM-T Easy載體上，從而測 定堿基序列。
其結(jié)果，推定反義轉(zhuǎn)錄物的全長約為600堿基以上。以下示出其序列 (序列號1;其中，作為cDNA序列表示。)。即，反義轉(zhuǎn)錄物和iNOS mRNA 的3'UTR對應(yīng)，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(5'側(cè))在iNOS mRNA的PolyA附加部位的 互補(bǔ)鏈上。
實(shí)施例2:人iNOS反義轉(zhuǎn)錄物
通過以下的方法，針對人iNOS的mRNA，研究是否存在從基因的反 義鏈轉(zhuǎn)錄的"反義轉(zhuǎn)錄物"。其中，人iNOS的mRNA的堿基序列可由 DDBJ/EMBL/GenBank國際堿基序列數(shù)據(jù)庫(http://www.ddbj.nig.ac.jp/、 http:〃www,ebi.ac.uk/embl八http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)獲矢口。
從人的組織(胎盤、肝臟、胃粘膜)或細(xì)胞(未刺激的淋巴細(xì)胞)，按 照常規(guī)方法、使用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取全RNA。對得到的全 RNA用含有DNase的TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems公司) 進(jìn)行處理，除去混入的基因組DNA。以該全RNA為模板，使用如下表示 的人iNOS基因的有義鏈的引物5，-CTGAGTGCACCACTTCAAGTGAC-3， (序列號8)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA:。具體而言，除了用從人的組織或 細(xì)胞中制備的全RNA (l昭)和上述用序列號8表示的引物(2pmo1)代替 實(shí)施例1中的從大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中制備的RNA1嗎和序列號2表示的 引物2pmo1以外，按照同樣的方法合成cDNA。
向如此得到的cDNA 2^1中加入PCR反應(yīng)緩沖液(NIPPON GENE公 司)、dNTP (N=A、 C、 G、 T; NIPPON GENE公司)(使最終濃度為i25pM)、 下述2種引物正向引物40pmo1、反向引物40pmo1、 1單位Gene TaqDNA 聚合酶(NIPPON GENE公司)、以及anti-Taqhigh (二抗Taq聚合酶抗體，東洋紡)#，使總量為4(V1，進(jìn)一步進(jìn)行PCR。
正向5，-CAGGAGGTGCTATCGCACCACT-3，(序列號9)反向5 ，-GCAATTCATGTAAATATCTCCATC-3 ，(序列號10)PCR的方法按照與實(shí)施例1同樣的方法進(jìn)行。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖
凝膠電泳，其結(jié)果可見在使用來自人胎盤的cDNA時(shí)為151個堿基對(bp)
的條帶的擴(kuò)增。在其它的cDNA (肝臟、胃粘膜或未刺激的淋巴細(xì)胞)中未
見擴(kuò)增。
將經(jīng)擴(kuò)增的條帶從凝膠中切出并精制，對堿基序列進(jìn)行測定，結(jié)果確認(rèn)其為在上述引物序列中夾有的、與人iNOSmRNA的3'UTR互補(bǔ)的序列。即，通過采用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了人iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的存在。人iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的序列表示在序列號11。其中，作為cDNA序列表示。
實(shí)施例3:小鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物
通過以下的方法，針對小鼠iNOS的mRNA，研究是否存在從基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄的"反義轉(zhuǎn)錄物"。其中，小鼠iNOS的mRNA的堿基序列可由DDBJ/EMBL/GenBank國際堿基序列數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/、http :〃www, ebi. ac.uk/embl/ 、 http :〃www.ncbi .nlm.nih. gov/Genbank/ )獲矢口 。
從RAW264細(xì)胞，按照常規(guī)方法，使用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取全RNA。對得到的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems公司)進(jìn)行處理，除去混入的基因組DNA。以該全RNA為模板，使用如下所示的小鼠iNOS基因的反義鏈的引物5'-CCTTCTTCTCCACTCCCCAGCT-3，(序列號12)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。具體而言，除了用從RAW264細(xì)胞中制備的全RNA (l嗎)和序列號12表示的引物(2pmo1)代替實(shí)施例1中的從大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中制備的RNA l嗎和序列號2表示的引物2pmo1以夕卜，按照同樣的方法合成cDNA。
向如此得到的cDNA 2^1中加入PCR反應(yīng)緩沖液(NIPPON GENE公司)、dNTP (N=A、 C、 G、 T; NIPPON GENE公司)(使最終濃度為125fiM)、下述2種引物正向引物40pmo1、反向引物40pmo1、 1單位Gene Taq DNA聚合酶(NIPPON GENE公司)、以及anti-Taq high (二抗Taq聚合酶抗體，東洋紡)弁，使總量為40^d，進(jìn)一步進(jìn)行PCR。
正向5，-GACCACCAGGAGGCACCATGCCG-3，(序列號13)反向5，-ATACAGGAAAGGCCCAAGCCATC-3，(序列號14)PCR的方法按照與實(shí)施例1同樣的方法進(jìn)行。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)果可見127個堿基對(bp)的條帶的擴(kuò)增。
將經(jīng)擴(kuò)增的條帶從凝膠中切出并精制，對堿基序列進(jìn)行測定，結(jié)果確認(rèn)其為在上述引物序列中夾有、與小鼠iNOS mRNA的3'UTR互補(bǔ)的序列。即，通過采用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了小鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的存在。小鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的序列表示在序列號15。其中，作為cDNA序列表示。
(2)與iNOSmRNA互補(bǔ)的反義轉(zhuǎn)錄物所帶來的iNOSmRNA的穩(wěn)定化實(shí)施例4:大鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物所帶來的iNOSmRNA的穩(wěn)定化為了弄清楚大鼠反義轉(zhuǎn)錄物是否使iNOSmRNA穩(wěn)定化，將具有與大鼠反義轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的序列，且具有與大鼠反義轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行雜交的性質(zhì)的iNOS的正義寡核苷酸導(dǎo)入大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中，研究iNOSmRNA量。
正義寡核苷酸通過將寡核苷酸中的磷酸二酯鍵的磷酸的一個氧原子取代為硫原子(S代)，從而防止寡核苷酸被細(xì)胞內(nèi)的核酸分解酶分解。利用IBA公司(Gottingen, Germany)的根據(jù)磁輔助轉(zhuǎn)染法(Magnet assistedtransfection method)的基因?qū)朐噭┖?MATra-A試劑)將S代正義寡核
苷酸導(dǎo)入大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中。
按照公知的方法(J. Hepatol. 40, 616-623， 2004)制備大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞，并接種到6孔板上(每孔3xl()S個細(xì)胞)。2小時(shí)后，每孔換為1.5ml的新培養(yǎng)基(為在William's E培養(yǎng)基(WE)中含有10%胎牛血清、10nM地塞米松和10nM胰島素的培養(yǎng)基，略記為WES-DI)。進(jìn)而在4小時(shí)后將寡核苷酸(2嗎)與WE (200^1)混合，接著混入2pl的MATra-A試劑(IBA公司)，在室溫下靜置20分鐘，然后全部滴加到加有肝細(xì)胞的孔中。將6孔板放置在磁盤(IBA公司)上，在室溫下靜置15分鐘，將寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。換為含有10^胎牛血清的WE (每孔1.5ml)，然后在37。C下放置過夜。第二天早上，換為含有l(wèi)nM的IL-幣的WE，在37'C下放置4小時(shí)后，制備全RNA。
當(dāng)用IL-ip刺激肝細(xì)胞時(shí)，iNOSmRNA的量顯著地增加，導(dǎo)入上述S代正義寡核苷酸并用IL-lp進(jìn)行刺激，通過RT-PCR法和實(shí)時(shí)PCR對mRNA量進(jìn)行測定。其結(jié)果表示在圖1和2中。
這里使用的iNOS基因的正義鏈序列，即具有與iNOSmRNA相同的序列的S代寡核苷酸用以下的序列表示。試驗(yàn)中相當(dāng)于S2、 S4和S5。
S2: 5，一G*C*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C—3，
S4: 5，一T*A*G*CTGCATTGTGTACA*G*A*T—3，
S5: 5，一G*T*G*TATAATTCCTTGAT*G*A*A—3，"代部分用*表示。)
另一方面，作為陰性對照，導(dǎo)入具有確認(rèn)由于堿基組成相同而序列不同，而不與iNOSmRNA或其轉(zhuǎn)錄物、或者其它的RNA雜交的序列的"隨機(jī)寡核苷酸(scramble oligos)"。隨機(jī)寡核苷酸的序列表示如下。
Scr2: 5，一GfG寧ATTGCCCACCCAAC承P^C承T一3，
Scr4: 5，一G*G*C*TCCATATGATTAGA*T*G*T—3，
Scr5: 5，_G*A*T*TGTTACTTAGAGAC*T*A*T—3，
與正義寡核苷酸同樣，為了防止在細(xì)胞內(nèi)的分解，也將這些隨機(jī)寡核苷酸S代后使用。對于隨機(jī)寡核苷酸，通過與大鼠基因組的同源性檢索，確認(rèn)不存在類似的序列。
另外，作為另一個陰性對照，導(dǎo)入針對iNOSmRNA的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部分的S代正義寡核苷酸S1。 Sl的序列表示如下。
Sh 5，一C*A*T*TCTCTTTCCTTTGC*C*T*C—3'(*表示與上述同樣的意義。)
當(dāng)使用與正義鏈(具有與mRNA相同序列的鏈)序列相同的引物進(jìn)行鏈特異性RT-PCR法時(shí)，由于僅逆轉(zhuǎn)錄針對"反義轉(zhuǎn)錄物"的cDNA，因此能夠測定"反義轉(zhuǎn)錄物"的量。其中設(shè)置在不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的情況下進(jìn)行了 PCR的對照，確認(rèn)混入肝細(xì)胞全RNA中的基因組沒有被PCR擴(kuò)增。在圖中用RT (-)表示。
其結(jié)果是，在導(dǎo)入了 S2、 S4和S5的S代正義寡核苷酸的情況下，iNOSmRNA的量減少。這是由于S代正義寡核苷酸與iNOS的反義轉(zhuǎn)錄物雜交，使得反義轉(zhuǎn)錄物被分解，表示iNOSmRNA也被分解了。另一方面，在導(dǎo)入了隨機(jī)寡核苷酸的情況下，iNOSmRNA的量沒有很大變化。此外，在導(dǎo)入了針對莖部分的S1的情況下，iNOSmRNA的量也沒有很大變化。
此外，當(dāng)將正義寡核苷酸S5或隨機(jī)寡核苷酸Scr5導(dǎo)入肝細(xì)胞時(shí)，以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板通過實(shí)時(shí)PCR法測定添加IL-ip后的iNOSmRNA量。其結(jié)果為，當(dāng)導(dǎo)入隨機(jī)寡核苷酸Scr5時(shí)，iNOSmRNA量增至2倍需要的時(shí)間為119分鐘。與此相對，導(dǎo)入正義寡核苷酸S5時(shí)為461分鐘(圖2).
與iNOS同樣，iNOS以外的早期應(yīng)答基因細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子1 CINC-1在肝細(xì)胞中在IL-l(3刺激下也顯著地誘導(dǎo)mRNA。因此，在CINC-1的mRNA的3'非翻譯區(qū)域(3'UTR)也與iNOSmRNA同樣地存在ARE序列。將iNOS的正義寡核苷酸導(dǎo)入肝細(xì)胞時(shí)，對CINC-1的mRNA量進(jìn)行測定，結(jié)果與未導(dǎo)入正義寡核苷酸的情況相比mRNA的量沒有差別。即，顯示iNOS的正義寡核苷酸的作用限于iNOS (圖l)。
綜合上述結(jié)果，顯示iNOS的正義寡核苷酸與iNOS反義轉(zhuǎn)錄物特異性地雜交，從而促進(jìn)iNOSmRNA的分解，其結(jié)果特異性地使iNOSmRNA的量減少。
實(shí)施例5:小鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物所帶來的iNOSmRNA的穩(wěn)定化
將具有與小鼠反義轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行雜交的性質(zhì)的iNOS正義寡核苷酸的S代正義寡核苷酸導(dǎo)入來自小鼠巨噬細(xì)胞的RAW264細(xì)胞中，研究小鼠反義轉(zhuǎn)錄物所帶來的iNOSmRNA的表達(dá)抑制。
以下未記載的操作按照與實(shí)施例4同樣的方法進(jìn)行。將小鼠RAW264細(xì)胞以每孔5x105個細(xì)胞接種，更換DMEM培養(yǎng)基,在C02恒溫器中培養(yǎng)。
將IBA公司(Gottingen， Germany)的按照磁輔助轉(zhuǎn)染法的S代寡核苷酸導(dǎo)入RAW264細(xì)胞中。換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(每孔1.5ml)，隨后在37。C下放置過夜。第二天早上，換為含有大腸桿菌LPS(l嗎/ml)的DMEM培養(yǎng)基，在37"C下放置4小時(shí)后，提取全RNA供于RT-PCR。另外，全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free試劑盒(AppliedBiosystems公司)處理，除去混入的基因組DNA。
針對和小鼠反義轉(zhuǎn)錄物對應(yīng)的小鼠iNOSmRNA制備正義寡核苷酸。
這里使用的小鼠iNOS基因的正義鏈序列，即具有與iNOSmRNA相同序列的S代寡核苷酸用序列表示。實(shí)驗(yàn)中相當(dāng)于S1、 S2和S3。
SI: 5， 一G*A*A*GCACTTTGGGTGAC*C*A*C—3，
S2: 5，—T*A*G*CTGCACTATGTACA*G*A*T—3，
S3: 5，—C*A*G*ATATTTATACTTCA*T*A*T—3，(S代部分用^表示。)按照實(shí)施例4中進(jìn)行的鏈特異性RT-PCR法，對小鼠iNOSmRNA的量
進(jìn)行測定。
其結(jié)果是，小鼠iNOSmRNA的量減少。這是由于S代正義寡核苷酸與iNOS的反義轉(zhuǎn)錄物雜交，使得反義轉(zhuǎn)錄物被分解或競合，表示iNOSmRNA也被分解了 (圖3)。
實(shí)施例4和5的結(jié)果表示，不僅大鼠，而且小鼠iNOS的正義寡核苷酸也通過與iNOS反義轉(zhuǎn)錄物特異性地雜交，從而促進(jìn)iNOSmRNA的分解，其結(jié)果是iNOSmRNA的量特異性地減少。
如此，無論大鼠肝細(xì)胞或小鼠的細(xì)胞，使用正義寡核苷酸都能夠抑制iNOSmRNA的表達(dá)。因此，使用了正義寡核苷酸的iNOSmRNA的表達(dá)抑制能夠減輕肝臟等炎癥時(shí)的iNOS誘導(dǎo)和NO產(chǎn)生，因此可以說是肝功能障礙的有效的治療方法。
(3)與iNOS基因以外的早期應(yīng)答基因的mRNA互補(bǔ)的序列的反義轉(zhuǎn)錄物的序列和區(qū)域(堿基長)的測定方法
在炎癥時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)的基因(所謂的"早期應(yīng)答基因")中，不僅包括iNOS，而且包括細(xì)胞因子或趨化因子等生理活性物質(zhì)的基因。這些早期應(yīng)答基因使炎癥或者惡化或者改善等，發(fā)揮著各種各樣的作用。對早期應(yīng)答基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，與最終對炎癥的調(diào)節(jié)相關(guān)。因此，在iNOS基因的反義轉(zhuǎn)錄物以外，研究其它的早期應(yīng)答基因中反義轉(zhuǎn)錄物是否表達(dá)。然后，預(yù)測對于種間高保守的、且包含多個ARE序列的3'UTR的序列，反義轉(zhuǎn)錄物得到了表達(dá)。而且，對于該部分，設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)錄用的正義引物和PCR用的l對引物，與使用大鼠的iNOS基因檢測反義轉(zhuǎn)錄物的實(shí)施例4同樣地，進(jìn)行鏈特異性RT-PCR法，研究大鼠肝細(xì)胞中的反義轉(zhuǎn)錄物是否表達(dá)。
iNOS以外的早期應(yīng)答基因中，以在3，UTR中含有多個ARE序列、且種間(人、小鼠、大鼠)3'UTR的序列非常類似的3個典型的基因?yàn)槔M(jìn)行研究。BP，以下的3個基因
(a)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子1 (CINC-1):也稱之為趨化因子(C-X-C motif)配體l (CXCL1)，其為在用IL-1卩刺激的大鼠肝細(xì)胞中誘導(dǎo)得到的趨化因子。(b) NF-KBp50:轉(zhuǎn)錄因子NF-KB的亞單位之一，其為與炎癥密切相
關(guān)的蛋白質(zhì)。
(c) IkB-ou抑制NF-KB活性的蛋白質(zhì)。
其中，人、小鼠以及大鼠的這些mRNA的堿基序列可由DDBJ/EMBL/GenBank國際堿基序列數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/、http:〃www.ebi.ac.uk/embl八http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)獲知。
實(shí)施例6:大鼠CINC-1反義轉(zhuǎn)錄物
通過以下的方法，針對大鼠CINC-1的mRNA，研究是否存在從基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄的"反義轉(zhuǎn)錄物"。以下未特別記載的操作按照與實(shí)施例1同樣的方法進(jìn)行。
用IL-ip刺激原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞，隨后按照常規(guī)方法，使用Trizol試劑(Invitrogen公司)，提取全RNA。對得到的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems公司)進(jìn)行處理，除去混入的基因組DNA。以該全RNA為模板，使用如下所示的大鼠CINC-1基因的正義鏈的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA: 5，-TGTCTGGTGAACGCTGGCTTCTGA-3，(序列號16)。
使用得到的cDNA和如下所示的大鼠CINC-1基因的正義鏈的2種引物，按照與實(shí)施例1同樣的方法即步減法進(jìn)行PCR:
正向5'—TGTGGATGCGTTTCATCGATGGT—3，(序列號17)反向5'—CTAGCACAGTGGTTGACACTTA—3，(序列號18)。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)果可見122個堿基對(bp)的條帶的擴(kuò)增。將經(jīng)擴(kuò)增的條帶從凝膠中切出并精制，對堿基序列進(jìn)行測定，結(jié)果確認(rèn)其為在上述引物序列中夾有的、大鼠CINC-1 mRNA的3'UTR的序列。即，通過采用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了大鼠CINC-1基因的反義轉(zhuǎn)錄物的存在。大鼠CINC-1基因的反義轉(zhuǎn)錄物的序列表示在序列號19。其中，作為cDNA序列表示。實(shí)施例7:大鼠NF-KBp50反義轉(zhuǎn)錄物
通過以下的方法，針對大鼠NF-KB p50的mRNA，研究是否存在從基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄的"反義轉(zhuǎn)錄物"。以下未特別記載的操作按照與實(shí)施例6同樣的方法進(jìn)行。
用IL-1J3刺激原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞，然后按照常規(guī)方法，使用Trizd
19試劑(Invitrogen公司)，提取全RNA。對得到的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems公司)進(jìn)行處理，除去混入的基因組DNA。以該全RNA為模板，使用如下所示的大鼠NF-kB p50基因的正義鏈的引物5'—CTGTCATTAAGGTATCGCAGTCC—3，(序列號20)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。
使用得到的cDNA和如下所示的大鼠NF-kB p50基因的正義鏈的2種引物，按照與實(shí)施例1同樣的方法即步減法進(jìn)行PCR:
正向5，一CATCTACAGTACAGTCATGCACTC—3，(序列號21)反向5'—GGGAAAATACTATTTTCAGCACTGAT—3，(序列號22)。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)果可見192個堿基對(bp)的條帶的擴(kuò)增。將該條帶從凝膠中切出并精制，對堿基序列進(jìn)行測定，結(jié)果確認(rèn)其為在上述引物序列中夾有的、大鼠NF-kB p50mRNA的3'UTR的序
列。即，通過采用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了大鼠NF-kB p50基因的反義轉(zhuǎn)錄物的存在。大鼠NF-kB p50基因的反義轉(zhuǎn)錄物的序列表示在序列號23。其中，作為cDNA序列表示。實(shí)施例8:大鼠lKB-a反義轉(zhuǎn)錄物
通過以下的方法，針對大鼠MB-oi的mRNA，研究是否存在從基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄的"反義轉(zhuǎn)錄物"。以下未特別記載的操作按照與實(shí)施例6同樣的方法進(jìn)行。
用IL-lj3刺激原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞，隨后按照常規(guī)方法、使用Trizol試劑(Invitrogen公司)，提取全RNA。對得到的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems公司)進(jìn)行處理，除去混入的基因組DNA。以該全RNA為模板，使用如下所示的大鼠IkB-(x基因的正義鏈的引物5，-TCCAGAATCTGATAAAAGGACCAC-3，(序列號24)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。
使用得到的cDNA和如下所示的大鼠lKB-a基因的正義鏈的2種引物，按照與實(shí)施例1同樣的方法即步減法進(jìn)行PCR:
正向5，-TGAACCGCCATAGACTGTAGCTG-3，(序列號25)反向5'-GCACATACCACTGAACACCTGGT-3，(序列號26)。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)果可見102個堿基對(bp)的條帶的擴(kuò)增。將該條帶從凝膠中切出并精制，對堿基序列進(jìn)行測定，結(jié)果確認(rèn)其為在上述引物序列中夾有的、大鼠lKB-a mRNA的3，UTR的序列。 即，通過采用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了大鼠 lKB-a基因的反義轉(zhuǎn)錄物的存在。大鼠lKB-a基因的反義轉(zhuǎn)錄物的序列表示 在序列號27。其中，作為cDNA序列表示。 [實(shí)施例6 8的總結(jié)]
作為炎癥時(shí)表達(dá)的早期應(yīng)答基因，選擇iNOS以外的3個代表性基因 (CINC-1、 NF-kB p50、 IkB-cO，它們?nèi)我粋€在3'UTR中都含有多個ARE 序列，且種間(人、小鼠、大鼠)3'UTR的序列非常相似。與iNOS同樣， 在這3個基因中也確認(rèn)了反義轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。
由此推測，反義轉(zhuǎn)錄物在含有ARE序列、且種間3'UTR的序列非常相 似的早期應(yīng)答基因中是共通地可觀察到的分子。另外，強(qiáng)烈啟示反義轉(zhuǎn)錄 物可能調(diào)節(jié)這些mRNA的穩(wěn)定性。因此，在肝等的炎癥中，期望通過抑制 早期應(yīng)答基因的反義轉(zhuǎn)錄物的作用，從而抑制炎癥。
(4)在使用了大鼠急性肝功能衰竭模型的活體(體內(nèi))中，iNOS、反 義轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)誘導(dǎo)以及肝保護(hù)劑(IGF-I和FR183998)所帶來的iNOS和 反義轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)誘導(dǎo)的抑制效果
實(shí)施例1和實(shí)施例4的結(jié)果顯示，在大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞(體外)的 體系中，iNOS誘導(dǎo)時(shí)和iNOSmRNA的3，-非翻譯區(qū)域(3'UTR)對應(yīng)的反 義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)，從而促進(jìn)了 iNOSmRNA的穩(wěn)定化。在肝功能障礙大鼠(體 內(nèi))，與iNOS誘導(dǎo)相呼應(yīng)，iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)如下所示。另外，給 予胰島素樣生長因子-I (Insulin-like growth factor-I， IGF-I)或NaVH+交換 抑制劑(FR183998)等肝保護(hù)劑所帶來的存活率的變化與炎癥性細(xì)胞因子、 iNOSmRNA以及反義轉(zhuǎn)錄物的誘導(dǎo)之間的關(guān)系如下所示。
實(shí)施例9
(I)急性肝功能衰竭模型的制作和肝保護(hù)劑的給予 給雄性Sprague-Dawley大鼠(250 300g)靜脈注射D-半乳糖胺 (D-galactosamine) (400g/kg)與細(xì)菌內(nèi)毒素LPS (16jag/kg)的混合液 (D-GalN/LPS)，制備急性肝功能衰竭模型。將胰島素樣生長因子-I (IGF-I; 3.2mg/kg)或Na+ZH+交換抑制劑(FR183998; lmg/kg)在D-GalN/LPS處 理的30分鐘前給予。測定血中和肝的炎癥性細(xì)胞因子(TNF-a， IL-ip、IL-6、干擾素y、 CINC-1)、 MIP-2以及一氧化氮(NO)。從肝制備全RNA，用 RT-PCR研究iNOSmRNA和iNOS反義轉(zhuǎn)錄物。
(II) RNA的分析
靜脈注射D-半乳糖胺與LPS混合液后，在3或6小時(shí)后，取出大鼠肝 臟，按照常規(guī)方法，使用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取全RNA。以該 全RNA為模板，使用寡聚dT引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后按照與實(shí)施例l等 同樣的方法進(jìn)行PCR (RT-PCR法)。對于iNOSmRNA或成為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的 延伸因子-la (elongation factor-la， EF1) mRNA的定量，逆轉(zhuǎn)錄時(shí)使用寡 聚dT引物，PCR時(shí)使用下述引物。另外，在PCR反應(yīng)液中添加anti-Taq high (二抗Taq聚合酶抗體，東洋紡)。
iNOSmRNA:
CCAACCTGCAGGTCTTCGATG (序列號28)和 GTCGATGCACAACTGGGTGAAC (序列號29);和 EFmRNA:
TCTGGTTGGAATGGTGACAACATGC (序列號30)和 CCAGGAAGAGCTTCACTCAAAGCTT (序列號31) 此外，iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的定量按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行。另外，設(shè)置 在不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的情況下進(jìn)行PCR的對照，以確認(rèn)混入肝細(xì)胞的全RNA 的基因組沒有因PCR而擴(kuò)增。iNOSmRNA檢測結(jié)果表示在圖4， iNOS反 義轉(zhuǎn)錄物的檢測結(jié)果表示在圖5。圖中RT (-)表示逆轉(zhuǎn)錄(_)的陰性對
照o
(III) 利用實(shí)時(shí)PCR的mRNA和反義轉(zhuǎn)錄物的定量 逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA也使用日本Bio-Rad公司的iCycler System通過實(shí)
時(shí)PCR來定量。在PCR反應(yīng)液中添加SYBR Green I (Roche Diagnostics公 司)和anti-Taq high (二抗Taq聚合酶抗體，東洋紡)，通過公知的方法即 觸減法(touch down method)進(jìn)行PCR。實(shí)際的PCR方案如下所述。 l個循環(huán)(94°C， 1分鐘)
50個循環(huán)(94°C， 30秒鐘;(70-0.3xn) °C， 1分鐘;72°C， 30秒鐘); n為循環(huán)數(shù)。結(jié)果表示在圖6。圖中，"*"表示相對于GalN/LPS大鼠(n=3 6只大鼠/組)，p<0.05。
(IV) 肝保護(hù)劑所帶來的iNOSmRNA和iNOS反義轉(zhuǎn)錄物量的變化在不給予肝保護(hù)劑的情況下，靜脈注射D-GalN/LPS后，約24小時(shí)內(nèi) 幾乎所有的動物(90%以上)死亡。在血中和肝中，炎癥性介質(zhì)(TNF-a， IL-1(3、 IL-6、干擾素Y、 CINC-1、 MIP-2、 NO)隨著時(shí)間(1 12小時(shí))增 加。與肝的iNOSmRNA誘導(dǎo)相呼應(yīng)，顯示反義轉(zhuǎn)錄物增加(iNOSmRNA 和iNOS反義轉(zhuǎn)錄物都在6小時(shí)后最大)，其結(jié)果可見產(chǎn)生了過量的NO。
通過給予IGF-I，死亡率減少到20 30%以下。而且，除上述炎癥性細(xì) 胞因子、NO產(chǎn)生之外，iNOSmRNA和反義轉(zhuǎn)錄物誘導(dǎo)的增加也同樣地受 到抑制(圖4 6)。
通過給予FR183998，死亡率減少到20 30%以下。而且，除上述炎癥 性細(xì)胞因子、NO產(chǎn)生之外，iNOSmRNA和反義轉(zhuǎn)錄物誘導(dǎo)的增加也同樣 地受到抑制(圖7 9)。
(IV-1)大鼠急性肝功能衰竭模型中肝保護(hù)劑IGF-I誘導(dǎo)iNOSmRNA
和反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的效果
根據(jù)圖4的結(jié)果，給予D-半乳糖胺和LPS的大鼠即GalN/LPS大鼠在 3 6小時(shí)內(nèi)iNOSmRNA水平增加，但給予IGF-I的大鼠該增加受到抑制。
根據(jù)圖5和6的結(jié)果，在RT( — )中幾乎未見經(jīng)擴(kuò)增的cDNA，因此 認(rèn)為混入全RNA中的基因組DNA極其微量。GalN/LPS大鼠在3 6小時(shí) 內(nèi)反義轉(zhuǎn)錄物水平增加，但給予IGF-I的大鼠該增加受到抑制。
(IV-2)大鼠急性肝功能衰竭模型中肝保護(hù)劑FR183998誘導(dǎo) iNOSmRNA和反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的效果
根據(jù)圖7的結(jié)果，GalN/LPS大鼠在3 6小時(shí)內(nèi)iNOSmRNA水平增 加，但給予FR183998的大鼠該增加受到抑制。
根據(jù)圖8和9的結(jié)果，在RT(—)中幾乎未見經(jīng)擴(kuò)增的cDNA，因此 認(rèn)為混入全RNA中的基因組DNA極其微量。GalN/LPS大鼠在3 6小時(shí) 內(nèi)反義轉(zhuǎn)錄物水平增加，但給予FR183998的大鼠該增加受到抑制。
(5)大鼠肝細(xì)胞中的正義寡核苷酸的效果(iNOS蛋白質(zhì)和一氧化氮 (NO)量的變化) 實(shí)施例10
按照與實(shí)施例4同樣的方法，將在實(shí)施例4中得到的正義寡核苷酸S5
23或隨機(jī)寡核苷酸Scr5導(dǎo)入肝細(xì)胞，使用一氧化氮比色法分析試劑盒(Nitric Oxide Colorimetric Assay kits, Roche Diagnostics公司)湖lj定培養(yǎng)基中的一 氧化氮(NO)量。第二天早上，換為含有l(wèi)nM的IL-lp的WE培養(yǎng)基，在 37i:下放置8 10小時(shí)后，進(jìn)行測定。另夕卜，從細(xì)胞提取全蛋白質(zhì)，用ECL 試劑盒(GE Healthcare公司)按照Western法檢測iNOS蛋白質(zhì)。結(jié)果表示 在圖10。
其結(jié)果表示，通過將正義寡核苷酸S5導(dǎo)入大鼠肝細(xì)胞，iNOS蛋白質(zhì) 和培養(yǎng)基中的一氧化氮(NO)量減少。
(6)利用Northern法的iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的檢測 實(shí)施例11
在用IL-1(3刺激的大鼠肝細(xì)胞，通過Northern印跡分析(Northern blot analysis,以下略記為Northern法)確認(rèn)iNOS基因的反義轉(zhuǎn)錄物的存在。
(I) RNA的制備
用IL-1卩刺激大鼠肝細(xì)胞一定時(shí)間，隨后使用Trizol試劑(Iiwitrogen 公司)提取全RNA。對得到的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free 試劑盒(AppliedBiosystems公司)進(jìn)行處理，除去混入的基因組DNA。將 Poly ( A) +禾口 Poly (A) -RNA用PolyATract mRNA Isolation System (Promega 公司)進(jìn)行分級。為了防止非特異性的雜交，使核糖體RNA (rRNA)在終 濃度為5%的聚乙烯醇6000和終濃度為0.75MNaCl存在下沉淀并除去，通 過醇沉淀回收上清，用于電泳。
(II) Northern法電泳
上述4個RNA，艮卩未刺激大鼠肝細(xì)胞的全RNA、 IL-1卩刺激大鼠肝 細(xì)胞的全RNA, IL-l卩刺激大鼠肝細(xì)胞的Poly (A) + RNA和IL-1(3刺激大 鼠肝細(xì)胞的Poly(A) -RNA，將它們在含2.2M福爾馬林瓊脂糖中電泳，從 而進(jìn)行分離。
(III) Northern法雜交
按照常規(guī)方法，將凝膠中的RNA移至Nytran N過濾器(Whatman公 司)中。然后，在DIG EasyHyb緩沖液(Roche Diagnostics公司)中，在 73°C下過夜，使之與地高辛(DIG)標(biāo)記的iNOS的3'UTR的正義探針雜 交。第二天早上，按照R0che Diagnostics公司的操作手冊，清洗過濾器。其中，iNOS的3'UTR的正義探針通過使用DIG-ll-UTP (RocheDiagnostics 公司)和T3RNA聚合酶(Stratagene公司)，在試管內(nèi)合成RNA而制作。
(IV) Northern法檢測
按照Roche Diagnostics公司的操作手冊，進(jìn)行封閉，將其和與堿性磷 酸酶結(jié)合的抗DIG抗體(Roche Diagnostics公司) 一起孵育。洗滌后，使 之與作為底物的CDP-Star (Applied Biosystems公司)反應(yīng)，用X射線膠片 檢測與iNOS正義探針進(jìn)行雜交的RNA的條帶。
(V) 結(jié)果與考察
上述4種RNA的利用Northern法的分析結(jié)果(X射線膠片的放射自顯 影圖)表示在圖ll。
觀察到"IL-lp刺激大鼠肝細(xì)胞的全RNA"與"IL-1(3刺激大鼠肝細(xì)胞 的Poly (A) -RNA"中的600 1000核苷酸(nt)的涂片狀的深色條帶。 由于使用了 iNOS的3'UTR的正義探針，因此這些涂片狀條帶被認(rèn)為是 iNOS的反義轉(zhuǎn)錄物的條帶。因此，清楚了 iNOS的反義轉(zhuǎn)錄物的長度并不 恒定，而是各種長度(600 100核苷酸)的轉(zhuǎn)錄物的集合。
綜合RACE的結(jié)果和核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，如圖12所示那樣， 認(rèn)為合成了iNOS的反義轉(zhuǎn)錄物。圖中，虛線表示合成了 600核苷酸以上的 各種大小的反義轉(zhuǎn)錄物。圖中的數(shù)字表示iNOS基因的外顯子的號碼，黑色 部分為蛋白質(zhì)的翻譯區(qū)，反白框?yàn)橥怙@子27處的3'UTR。 iNOS的mRNA 表示在基因的圖上側(cè)。
(7) iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的過量表達(dá)所帶來的mRNA的穩(wěn)定化 實(shí)施例12
在大鼠肝細(xì)胞中，使iNOS基因的反義轉(zhuǎn)錄物過量表達(dá)，可以確認(rèn)借助 于iNOS的3'UTR， mRNA被穩(wěn)定化。
在普通的報(bào)告基因(reporter)的情況下，熒光素酶基因結(jié)合于iNOS 基因的啟動子。由于iNOS基因的啟動子為"誘導(dǎo)型啟動子"，因此在大鼠肝 細(xì)胞中，由于IL-ip刺激，啟動子的活性發(fā)生很大變化，無法很好地觀察結(jié) 合于報(bào)道基因后部的3，UTR的作用。因此，決定使用與刺激無關(guān)地促進(jìn)恒 定量表達(dá)的作為"組成型啟動子(constitutive promotor)"的延伸因子-la (elongation factor-la， EF)基因的啟動子。因此，被EF啟動子控制的熒光素酶基因和P-半乳糖苷酶基因與刺激無關(guān)地基本以恒定量表達(dá)。由此可
觀察到，含有poly (A)信號序列的iNOSmRNA的3'UTR僅對熒光素酶 mRNA的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。
以pGL3-Basic質(zhì)粒(Promega公司)為基礎(chǔ)構(gòu)建以下3種載體。構(gòu)建 的載體的示意圖表示在圖13。
(i) 報(bào)告基因(熒光素酶載體) EF啟動子+熒光素酶基因(Luc)十iNOS3'UTR EF啟動子+熒光素酶基因(Luc) +SVpA
(組成型地表達(dá)熒光素酶mRNA，但mRNA的穩(wěn)定性可被熒光素酶基 因后部的部分控制。)
(ii) iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體
將CMV啟動子+將iNOS 3'UTR插入反向+SVpA (iNOS反義轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞內(nèi)過量地表達(dá))
(iii) 內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(P-半乳糖苷酶載體) EF啟動子+(3半乳糖苷酶(lacZ)基因+SVpA
(P-半乳糖苷酶mRNA組成型地表達(dá)) 其中，"SVpA，，是指來自SV40病毒的poly (A)信號序列，已知其為 穩(wěn)定的3，UTR，且難以破壞加成有SVpA的mRNA。作為iNOS 3'UTR的 對照的CMV啟動子是指來自巨細(xì)胞病毒、比EF啟動子更強(qiáng)的組成型啟動 子。
將(i)和(iii)的質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入大鼠肝細(xì)胞時(shí)，由于EF啟動子為組成 型的，因此熒光素酶mRNA (Luc)與卩半乳糖苷酶mRNA (P-Gal)的合 成量基本恒定。另外，在加入iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體(ii)時(shí)與不加入 時(shí)之間若存在差別，則在Luc mRNA/卩Gal mRNA (Luc/卩Gal值)間也存在 差別。若Luc/(3Gal值根據(jù)iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體的有無而變化，則iNOS 反義轉(zhuǎn)錄物的過量表達(dá)可借助于iNOS 3'UTR而對熒光素酶mRNA的穩(wěn)定 性產(chǎn)生影響。 (I)轉(zhuǎn)染
通過上述方法(MATm)將下述質(zhì)粒導(dǎo)入原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞中。 (i)報(bào)告基因(400ng/孔)± (ii) iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體(50ng/孔)
(iii)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(400ng/孔) 將加入有iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體的表示為AS ( + )，將未加入的表 示為AS (-)。
(II) RNA的制備
進(jìn)行轉(zhuǎn)染，更換經(jīng)過一夜的肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，然后隨時(shí)間變化地提取 全RNA。按照常規(guī)方法，使用Trizol試劑(Invitrogen公司)進(jìn)行。對得到 的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems 公司)進(jìn)行處理，除去混入的基因組DNA。以該全RNA為模板，用寡聚 (dT)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而合成針對mRNA的cDNA。
(III) 利用實(shí)時(shí)PCR的mRNA的定量
使用合成的cDNA，利用實(shí)時(shí)PCR來定量。使用日本Bio-Rad公司的 iCycler系統(tǒng)。在PCR反應(yīng)液中添加SYBR Green I (Roche Diagnostics公司) 和anti-Taq high (二抗Taq聚合酶抗體，東洋紡)，使用公知的方法即觸減 法進(jìn)行PCR。實(shí)際的PCR方案如下所述。
1個循環(huán)(94°C， 1分鐘)
50個循環(huán)(94°C， 30秒鐘;(70-0.3xn) °C， 1分鐘;72°C， 30秒鐘) (n為循環(huán)數(shù))。
在作為報(bào)告基因的熒光素酶(Luc)的mRNA的PCR中使用的引物為 下述2種。 正向
5，-GCGAAGGTTGTGGATCTGGATAC-3，(序列號32)
反向
5 '-GAGCCACCTGATAGCCTTTGTAC畫3，(序列號33) 在作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的卩半乳糖苷酶(PGal)的mRNA的PCR中使用的 引物為下述2種 正向
5，-GTCACACTACGTCTGAACGTCGA-3，(序列號34)
反向
5 ，-TGCAGAGGATGATGCTCGTGACG-3 ，(序列號35 )
進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR后，用iCycler系統(tǒng)的分析軟件，求得熒光素酶mRNA
27(Luc)和J3半乳糖苷酶mRNA (J3Gal)的循環(huán)域(threshold cycle, Ct)值， 相除，求得Luc/卩Gal值。 [結(jié)果]
對于加入了 iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體的情況與未加入的情況，隨時(shí)間 變化地表示Luc/(3Gal值。結(jié)果表示在圖14.
(0報(bào)告基因(EF啟動子+Luc+iNOS3，UTR)， ± (ii) iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體，
(iii)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
此時(shí)，將加入了 iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體時(shí)的AS ( + )，與未加入的 情況AS (-)相比較，Luc/pGal值顯著地增加。圖中，"**"表示相對于AS (-)，p<0.01。
即，iNOS反義轉(zhuǎn)錄物借助于iNOS 3'UTR使熒光素酶mRNA穩(wěn)定化。 作為對照，使用連接SVpA的報(bào)告基因，其結(jié)果表示在圖15中。
(i)報(bào)告基因(EF啟動子+Luc+SVpA)， ± (ii) iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體，
(iii)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
此時(shí)，將加入了 iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達(dá)載體時(shí)的AS ( + )，與未加入的 情況AS (-)相比較，Luc/(3Gal值未增加。艮卩，SVpA對RNA的穩(wěn)定性沒 有影響。
從上述結(jié)果(iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的過量表達(dá)實(shí)驗(yàn))可知，iNOS反義轉(zhuǎn) 錄物具有作用于iNOS 3'UTR而使mRNA穩(wěn)定化的作用。綜合使用S代正 義寡核苷酸的iNOSmRNA的擊倒(konck down)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以說，iNOS 反義轉(zhuǎn)錄物借助于iNOS 3，UTR使iNOSmRNA穩(wěn)定化。
因此，強(qiáng)烈啟示iNOS反義轉(zhuǎn)錄物所帶來的iNOSmRNA穩(wěn)定性的控制 機(jī)理在肝等的炎癥時(shí)發(fā)揮重要的作用。此外，該機(jī)理可成為與NO相關(guān)的 許多疾病的治療對象。
通過給予肝保護(hù)劑，iNOSmRNA與反義轉(zhuǎn)錄物的誘導(dǎo)被抑制。以上結(jié) 果強(qiáng)烈啟示反義轉(zhuǎn)錄物即使在體內(nèi)也可作為iNOSmRNA表達(dá)誘導(dǎo)的控制 因子而相關(guān)。因此使用了肝保護(hù)劑的反義轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)抑制減輕了肝等炎
28癥時(shí)的iNOS誘導(dǎo)以及NO產(chǎn)生，從而被認(rèn)為是肝功能障礙的有效的治療方 法。
權(quán)利要求
1. 一種增加細(xì)胞內(nèi)的基因產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括將含有與和所述基因產(chǎn)物對應(yīng)的mRNA的堿基序列互補(bǔ)的序列的物質(zhì)或其前體或者在細(xì)胞內(nèi)可與它們具有同等作用的物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的工序。
2. 如權(quán)利要求1所述的增加細(xì)胞內(nèi)的基因產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，其中，含有與和所述基因產(chǎn)物對應(yīng)的mRNA的堿基序列互補(bǔ)的序列的物質(zhì)或其前體或者在細(xì)胞內(nèi)可與它們具有同等作用的物質(zhì)是在細(xì)胞內(nèi)有助于mRNA的穩(wěn)定化的物質(zhì)。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的增加細(xì)胞內(nèi)的基因產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，其中，所述基因產(chǎn)物為細(xì)胞因子或其前體。
4. 如權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的增加細(xì)胞內(nèi)的基因產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，其中，所述基因產(chǎn)物為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)。
5. —種基因產(chǎn)物的篩選方法，其使用權(quán)利要求1所述的產(chǎn)量增加方法，并包括判斷細(xì)胞內(nèi)是否存在含有與和基因產(chǎn)物對應(yīng)的mRNA的堿基序列互補(bǔ)的序列的反義轉(zhuǎn)錄物的工序。
6. 如權(quán)利要求5所述的基因產(chǎn)物的篩選方法，其中，所述反義轉(zhuǎn)錄物存在的判斷是如下進(jìn)行的通過使用含有與所述基因產(chǎn)物對應(yīng)的mRNA的5'末端和3'末端或者它們附近的一部分的正義序列的引物，來進(jìn)行從細(xì)胞內(nèi)mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，從而確認(rèn)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的有無。
7. 如權(quán)利要求5或6所述的基因產(chǎn)物的篩選方法，其進(jìn)一步包括將能夠與反義轉(zhuǎn)錄物中所含的堿基序列雜交的寡核苷酸或其衍生物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，從而觀察所述基因產(chǎn)物產(chǎn)量的增減的工序。
8. —種增加細(xì)胞因子的合成量的物質(zhì)，其含有與所述細(xì)胞因子mRNA的全部或部分序列互補(bǔ)的序列。
9. 一種細(xì)胞因子產(chǎn)量控制劑，其含有權(quán)利要求8所述的物質(zhì)。
10. —種增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的合成量的物質(zhì)，其含有與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA的全部或部分序列互補(bǔ)的序列。
11. 一種增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的合成量的物質(zhì)，其含有序列號1或與序列號1具有75%以上的同源性的堿基序列。
12. —種增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的合成量的RNA，其包括與從cDNA獲得的序列對應(yīng)的堿基序列，所述cDNA是通過使用含有與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA的5'末端和3，末端或它們附近的一部分序列的引物，從細(xì)胞內(nèi)mRNA利用逆轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)而獲得的。
13. —種iNOSmRNA表達(dá)控制劑，其含有權(quán)利要求10 12任一項(xiàng)所述的物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供控制基因產(chǎn)物產(chǎn)量的方法以及產(chǎn)量控制劑。本發(fā)明涉及控制細(xì)胞內(nèi)的基因產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，其包括將含有與和上述基因產(chǎn)物對應(yīng)的mRNA的堿基序列互補(bǔ)的序列的物質(zhì)或其前體或者在細(xì)胞內(nèi)可與它們具有同等作用的物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的工序，從而增加上述基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。
文檔編號C12N15/09GK101466835SQ20078002111
公開日2009年6月24日 申請日期2007年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者三浦健人, 上山泰男, 奧村忠芳, 若命浩二, 西澤干雄 申請人:阿明諾化學(xué)株式會社;學(xué)校法人關(guān)西醫(yī)科大學(xué)