專利名稱：：經(jīng)修飾的軟骨素合酶多肽及其晶體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的軟骨素合酶多肽、編碼該多肽的核酸、生產(chǎn)該多肽的方法、該多肽的晶體，等等。
背景技術(shù)：
：本文中所用縮寫及其含義如下K4CP:來自大腸桿菌(E^/2enc/n'aco")K4菌抹(血清型05:K4(L):H4，ATCC23502)的軟骨素合酶GalNAc:N-乙酰-D-半乳糖胺GlcUA:D-葡糖醛酸SDS:十二烷基;克酸鈉SDS-PAGE:十二烷基辟^酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳UDP:尿普5'-二磷酸專利文件1公開了來自大腸桿菌(^c^mc/naco")K4菌抹的疏酸軟骨素合酶和編碼該合酶的DNA。專利文件2公開了在K4CP的某個區(qū)域具有一個或幾個氨基酸替代的經(jīng)修飾的酶。然而，兩個文件都沒有公開和暗示本發(fā)明的多肽、編碼該多肽的核酸、本發(fā)明多肽的晶體，等等。此外，這些文件的任一個都沒有公開和暗示修飾K4CP以增加從它的DNA的表達(dá)水平、增強(qiáng)酶活性和促進(jìn)結(jié)晶的想法。專利文件3公開了來自普通變形菌(尸rafewsvw/gans)的新的硫酸軟骨素裂合酶及其晶體。然而，對K4CP沒有公開或暗示。專利文件l:JP2003-199583A專利文件2:JP2005-65565A專利文件3:JP10-262660A
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供軟骨素合酶多肽，其可以以高水平從核酸表達(dá)，具有高酶促活性，并且可以被結(jié)晶；編碼該多肽的核酸；生產(chǎn)該多肽的方法；該多肽的晶體；等等。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了廣泛研究，且結(jié)果，他們已得到了在K4CP的特定區(qū)域具有缺失的多肽和編碼該多肽的核酸。本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)使用該多肽作為軟骨素合酶可以顯著增從它的核酸表達(dá)的效率并且可以顯著增強(qiáng)酶促活性，并且由于該多肽分子是穩(wěn)定的，其可以被容易地結(jié)晶，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供了下面的(A)或(B)代表的多肽(下文中稱作"本發(fā)明的多肽")(A)由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成的多肽；或(B)由包括一個或幾個氨基酸的缺失、替代或添加的SEQIDNO:2的氨基酸序列組成并且具有軟骨素合酶活性的多肽。此外，本發(fā)明提供了編碼下面的(A)或(B)代表的多肽的核酸(下文中稱作"本發(fā)明的核酸")(A)由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成的多肽；或(B)由包括一個或幾個氨基酸的缺失、替代或添加的SEQIDNO:2的氨基酸序列組成并且具有軟骨素合酶活性的多肽。作為本發(fā)明的核酸，在下面(a)或(b)中描述的核酸可以作為示例(a)由SEQIDNO:1的核苷酸序列組成的DNA;或(b)DNA,其在嚴(yán)才各條件下與由與DNA(a)互補(bǔ)的核苷酸序列組成的DNA雜交并且具有軟骨素合酶活性。此外，本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，其包括至少下面的步驟(l)和(2)(下文中稱作"本發(fā)明的生產(chǎn)方法")(1)從至少一種本發(fā)明的核酸表達(dá)多肽的步驟；和(2)收集步驟(1)中表達(dá)的多肽的步驟。此外，本發(fā)明提供了本發(fā)明的多肽的晶體(下文中稱作"本發(fā)明的晶體")。作為本發(fā)明的晶體，示例可以為片狀晶體(下文中稱作"本發(fā)明的晶體r，)。具體地，示例可以為顯示出下面的晶體數(shù)據(jù)的晶體晶系單斜晶系布喇菲晶格簡單單斜晶格空間群P2i晶格常數(shù)5a=83.5Ab=232.0Ac=86.0A卩=105.5。此外，作為本發(fā)明的晶體，示例也可以為八面體晶體(下文中稱作"本發(fā)明的晶體2")。更具體地，示例可以為顯示出下面的晶體數(shù)據(jù)的晶體晶系四方晶系布喇菲晶格簡單四方晶格空間群P4晶格常數(shù)a=336Ab=336Ac=IOO人此外，本發(fā)明提供了生產(chǎn)軟骨素的方法，其包括在本發(fā)明的多肽存在下，將糖受體底物、D-葡糖醛酸供體和N-乙酰-D-半乳糖胺供體反附圖簡述圖1是顯示用胰蛋白酶處理的K4CP的SDS-PAGE的圖(照片)。圖2是顯示AN57K4CP的凝膠過濾層析級分的SDS-PAGE的圖(照片)。圖3是顯示本發(fā)明的晶體1的光學(xué)顯微鏡圖像的圖(照片)。圖4是顯示本發(fā)明的晶體2的光學(xué)顯微鏡圖像的圖(照片)。圖5是顯示用AN57K4CP合成的軟骨素的洗脫模式的曲線圖。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式下文中，通過參考實(shí)施本發(fā)明的最佳方式詳細(xì)描述本發(fā)明。<1>本發(fā)明的多肽本發(fā)明的多肽是通過下面(A)或(B)代表的多肽(A)由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成的多肽；或(B)由包括一個或幾個氨基酸的缺失、替代或添加的SEQIDNO:2的氨基酸序列組成并且具有軟骨素合酶活性的多肽。下文中，按順序進(jìn)行解釋。多肽(A)多肽(A)是K4CP多肽，其中來自N-末端的57個氨基酸被缺失，并且該多肽的氨基酸序列在SEQIDNO:2中顯示。生產(chǎn)該多肽的方法不被具體限制，只要可以得到具有該序列的多肽。例如，通過肽合成技術(shù)，或者通過用蛋白酶如胰蛋白酶從N-末端除去57個氨基酸殘基，或者使用編碼該多肽的核酸通過基因工程技術(shù)，可以生產(chǎn)所述多肽。更具體的實(shí)例在下面的實(shí)施例1和2中顯示。所述多肽具有高軟骨素合酶活性并且可以如下述容易地結(jié)晶。多肽(B)多肽(B)是由包括一個或幾個氨基酸的缺失、替代或添加的SEQIDNO:2的氨基酸序列組成并且具有軟骨素合酶活性的多肽。在多肽中，可以出現(xiàn)編碼多肽的核酸的多態(tài)性或突變，且由于細(xì)胞中和純化中生產(chǎn)的多肽的修飾，在它的氨基酸序列中也可以出現(xiàn)突變，其引起氨基酸的缺失、替代或添加。盡管如此，已知某種肽顯示出與沒有突變的多肽基本相等的生理/生物學(xué)活性。多肽(B)包括具有與多肽(A)稍微不同的結(jié)構(gòu)但在功能中沒有顯著不同的多肽。添加的實(shí)例包括向SEQIDNO:2的氨基末端添加選自甲石危氨酸、丙氨酸和甘氨酸的一個或兩個或更多個氨基酸殘基和向SEQIDNO:2的氨基末端或羧基末端添加如下迷的用于純化的肽序列或者間隔序列。注意到(B)中"包括一個或幾個氨基酸的添加的SEQIDNO:2的氨基酸序列"不包括在SEQIDNO:2的氨基末端添加來自K4CP的N-末端的57個氨基酸殘基或其部分的序列，其導(dǎo)致喪失本發(fā)明的多肽特有的表達(dá)效率和結(jié)晶性質(zhì)。如本文所用的術(shù)語"幾個氨基酸"指可以被突變的氨基酸殘基的數(shù)目，只要不損害軟骨素合酶活性。具體地，該數(shù)目為例如2到40的整數(shù)，優(yōu)選2到30的整數(shù)，更優(yōu)選2到20的整數(shù)，還更優(yōu)選2到15的整數(shù)，還更優(yōu)選2到10的整數(shù)，還更優(yōu)選2到8的整數(shù)，且還更優(yōu)選2到6的整數(shù)。本發(fā)明的多肽可以具有這樣的氨基酸序列，其與SEQIDNO:2有不小于90%，優(yōu)選不小于95%,更優(yōu)選不小于98%的同源性，只要該肽不包括來自K4CP的N-末端的57個氨基酸殘基，并且該肽具有軟骨素合酶活性?？梢曰贙arlin和Altschul的算法，BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或FASTA(MethodsEnzymol.,183,63(1990))確定氨基酸序列的同源性。本發(fā)明的多肽具有軟骨素合酶活性?？梢愿鶕?jù)下面實(shí)施例3中描述的方法證實(shí)該肽是否具有軟骨素合酶活性。生產(chǎn)該多肽的方法不受到具體限制，并且通過肽合成技術(shù)基于包括一個或幾個氨基酸的缺失、替代或添加的SEQIDNO:2的氨基酸序列(具有軟骨素合酶活性)或者通過基因工程技術(shù)使用通過下述方法在其中導(dǎo)入突變的核酸，可以生產(chǎn)所述肽。本發(fā)明的多肽可以用于軟骨素合成(軟骨素糖鏈的延長反應(yīng))，其通過將所述多肽與糖供體底物(UDP-GalAc和UDP-GluUA)和糖受體底物(軟骨素寡糖)接觸用于所述合成來實(shí)現(xiàn)。此外，本發(fā)明的多肽可以用作生產(chǎn)如下述的本發(fā)明的晶體的材料。細(xì)節(jié)在下面的實(shí)施例中顯示。<2>本發(fā)明的核酸本發(fā)明的核酸是編碼下面的多肽(A)或(B)的核酸(A)由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成的多肽；或(B)由包括一個或幾個氨基酸的缺失、替代或添加的SEQIDNO:2的氨基酸序列組成并且具有軟骨素合酶活性的多肽。多肽(A)和(B)如上面"<1>本發(fā)明的多肽"中所述。如本文所用的術(shù)語"核酸"包括DNA和RNA。因此，本發(fā)明的核酸類型可以是DNA或RNA,只要該核酸編碼上述多肽，且具體地，該核酸優(yōu)選是DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解本發(fā)明的核酸包括由于遺傳密碼簡并性而具有不同的核苷酸序列的核酸。作為本發(fā)明的核酸，在下面(a)或(b)中描述的核酸可以為示例(a)由SEQIDNO:1的核苷酸序列組成的DNA;或(b)DNA,其在嚴(yán)格條件下與具有與DNA(a)互補(bǔ)的核普酸序列的DNA雜交并且具有軟骨素合酶活性。如本文所用的術(shù)語"嚴(yán)格條件"指其中形成所謂的特異雜交體(hybrid)并且不形成非特異性雜交體的條件(見Sambrook,J.等人，MolecularCloningALaboratoryManual,secondEdition,ColdSpringHarbor8LaboratoryPress(1989),等)。"嚴(yán)格條件"的特定實(shí)例包括在42°C下在含有50%曱酰胺，4xSSC,50mMHEPES(pH7.0),10xDenhardt氏溶液,100pg/ml鮭精DNA的溶液中雜交并在室溫下用2xSSC,0.1%SDS溶液洗涂和在50。C下用0.1xSSC,0.1%SDS溶液洗滌的條件?？梢愿鶕?jù)下面實(shí)施例3中描述的方法證實(shí)多肽是否具有軟骨素合酶活性。本發(fā)明的核酸已經(jīng)基于最初分離自大腸桿菌K4菌抹的核酸得到但是包括通過核酸合成、基因工程技術(shù)等等生產(chǎn)的核酸。如上述，盡管生產(chǎn)本發(fā)明的核酸的方法不被具體限制，但是通過下面實(shí)施例中描述的方法可以生產(chǎn)核酸。在本發(fā)明的核酸中，可以如下所述生產(chǎn)編碼多肽(B)的核酸和DNA(b)。向編碼多肽(A)的核酸或DNA(b)中引入核苷酸的缺失、替代或添加以引起氨基酸殘基的缺失、替代或添加，其不相當(dāng)大地?fù)p害此種核酸編碼的多肽的軟骨素合酶活性?？梢匀缦滤鱿蚝怂嶂幸牒似账岬娜笔А⑻娲蛱砑雍铣尚蛄?，該序列在兩端具有限制酶可切割的位點(diǎn)并且含有所突變位置的兩側(cè)部分，并用合成的序列替換非突變核酸中所含的對應(yīng)的核苷酸序列。備選地，也可以按照諸如位點(diǎn)特異性誘變方法(Kramer,W.和Frits,H.J.,Meth.inEnzymol.,154,350(1987);Kunkel,T.A.等人，Meth.inEnzymol.,154,367(1987))的方法向核酸中引入缺失、替代或添加。如果從具有如上述引入的缺失、替代或添加的核酸表達(dá)的多肽具有軟骨素合酶活性，那么可以確定該核酸是目的核酸?？梢愿鶕?jù)下面實(shí)施例3中描述的方法證實(shí)表達(dá)的多肽是否具有軟骨素合酶活性。如果編碼本發(fā)明的多肽的本發(fā)明的核酸;故表達(dá)，那么可以生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。細(xì)節(jié)在下面實(shí)施例中顯示。<3>本發(fā)明的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的生產(chǎn)方法是生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，其包括至少下面的步驟(1)和(2):(1)從至少一種本發(fā)明的核酸表達(dá)多肽的步驟；和(2)收集步驟(1)中表達(dá)的多肽的步驟。下文中，按順序進(jìn)行解釋步驟(1)是從本發(fā)明的核酸表達(dá)多肽的步驟。本發(fā)明的核酸如上面的"<2>本發(fā)明的核酸"中描述。從本發(fā)明的核酸表達(dá)多肽的方法不受到具體限制，只要本發(fā)明的核酸編碼的多肽從該核酸生產(chǎn)。例如，可以如下所述乂人本發(fā)明的核酸表達(dá)多肽將本發(fā)明的核酸插入到合適表達(dá)載體中；將該載體導(dǎo)入合適的宿主中以制備轉(zhuǎn)化體，并生長轉(zhuǎn)化體。表達(dá)載體和宿主不受到具體限制并且可以合適地選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的載體和宿主。其特定實(shí)例在下面的實(shí)施例中顯示。如本文所用的術(shù)語"生長"不僅包括增殖用作轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞或微生物，而且包括已經(jīng)整合入了作為轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞的動物、昆蟲等等的生長。本領(lǐng)域技術(shù)人員可依賴于待用的宿主類型適當(dāng)選擇生長條件。該步驟中表達(dá)的多肽是本發(fā)明的多肽。步驟(2)是收集在步驟(1)中表達(dá)的多肽(本發(fā)明的多肽)的步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員可依賴于步驟(1)中多肽的表達(dá)方法適當(dāng)選擇收集所述多肽的方法。例如，當(dāng)通過將本發(fā)明的核酸插入表達(dá)載體，將載體導(dǎo)入宿主如大腸桿菌并培養(yǎng)宿主，使得本發(fā)明的多肽被表達(dá)并分泌于培養(yǎng)基(培養(yǎng)液體培養(yǎng)基的上清液)中時，可以收獲培養(yǎng)基并不經(jīng)進(jìn)一步處理而用作本發(fā)明的多肽。此外，當(dāng)多肽作為在細(xì)胞質(zhì)中分泌的可溶形式或作為不溶(膜結(jié)合的)形式表達(dá)時，可以通過處理程序提取表達(dá)的多肽，如使用氮空化裝置的方法；通過細(xì)胞裂解提取，如勻漿，玻璃珠磨方法，超聲破裂方法，和滲透壓震擾方法，或者凍融方法；表面活性劑提取；或者其組合。備選地，可以收獲提取物并不經(jīng)進(jìn)一步處理而用作本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的生產(chǎn)方法可以還包括另一步驟，只要該方法包括步驟(1)和步驟(2)。例如，可以在步驟(2)后進(jìn)行純化本發(fā)明的多肽的步驟。純化可以是部分純化或完全純化，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員依賴于本發(fā)明的多肽的目的等等可以適當(dāng)選擇所述方法。純化方法的特定實(shí)例包括處理程序，如用硫酸銨、硫酸鈉等等鹽析、離心、透析、超濾、吸附層析、離子交換層析、疏水層析、反相層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析、親和層析、電泳和其組合。本發(fā)明的多肽可以作為與其他蛋白或肽如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或聚組氨酸的融合蛋白表達(dá)，以使用所述蛋白或肽的親和柱純化該肽。此種融合蛋白也可以被包括在本發(fā)明的多肽中。通過分析所得多肽的氨基酸序列、功能等等可以證實(shí)是否生產(chǎn)了本發(fā)明的多肽。<4〉本發(fā)明的晶體本發(fā)明的晶體是本發(fā)明的多肽的晶體。即，晶體包括上面多肽(A)和(B)兩者的晶體。晶體優(yōu)選為多肽(A)的晶體。本發(fā)明的晶體不受到具體限制，只要該晶體是本發(fā)明的多肽的結(jié)晶于多肽結(jié)晶的技術(shù)。本發(fā)明的k體的^例包括單斜i四方晶體。、'本發(fā)明的晶體的特定實(shí)例包括本發(fā)明的晶體1和2。本發(fā)明的晶體1優(yōu)選為片狀晶體。顯示出下面的晶體數(shù)據(jù)的晶體是更優(yōu)選的晶系單斜晶系布喇菲晶格簡單單斜晶格空間群P2j晶格常數(shù)a=83.5Ab=232.0人c=86.0A(3=105.5°通過向含有本發(fā)明的多肽的溶液中加入終濃度為約15%的聚乙二醇并讓溶液在室溫靜置可以生產(chǎn)本發(fā)明的晶體1。更具體的生產(chǎn)方法在下面實(shí)施例4中顯示。本發(fā)明的晶體2優(yōu)選是八面體晶體。顯示出下面的晶體數(shù)據(jù)的晶體是更優(yōu)選的晶系四方晶系布喇菲晶格簡單四方晶格空間群P4晶格常數(shù)a=336Ab=336Aiic=100人通過向含有本發(fā)明的多肽的溶液中加入終濃度為約4M的曱酸鈉并讓溶液在室溫靜置可以生產(chǎn)本發(fā)明的晶體2。更具體的生產(chǎn)方法在下面實(shí)施例5中顯示。本發(fā)明的晶體可以以極高純度提供本發(fā)明的多肽。例如，可以將本發(fā)明的晶體再溶解在水性溶劑中并用作本發(fā)明的多肽用于軟骨素合成等等。<5>生產(chǎn)本發(fā)明的軟骨素的方法生產(chǎn)本發(fā)明的軟骨素的方法包括將糖受體底物、D-葡糖醛酸供體(GlcUA)及N-乙酰-D-半乳糖胺供體(GalNAc)在本發(fā)明多肽存在下反應(yīng)的步驟。GlcUA供體優(yōu)選為核苷二磷酸-GlcUA,且尤其優(yōu)選UDP-GlcUA。另一方面，GalNAc供體優(yōu)選為核苷二磷酸-GalNAc,尤其優(yōu)選UDP誦GalNAc。糖受體底物優(yōu)選為軟骨素，且尤其優(yōu)選軟骨素寡糖，如軟骨素四糖和軟骨素六糖。例如，通過上述反應(yīng)生產(chǎn)軟骨素并通過柱層析純化所得的軟骨素可以得到純化的軟骨素。生產(chǎn)本發(fā)明的軟骨素的方法不受到所得軟骨素分子量的限制，并且可以如下面實(shí)施例所述生產(chǎn)具有高達(dá)數(shù)十萬或更高分子量的軟骨素。下文中，通過參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。實(shí)施例1通過野生型K4CP的胰蛋白酶處理生產(chǎn)本發(fā)明的多肽(AN57K4CP)將具有SEQIDNO:3(編碼野生型K4CP)的核苦酸序列的DNA插入到作為表達(dá)載體的pGEX4T3(AmershamBiosciences生產(chǎn)；核普酸序列在SEQIDNO:5中顯示)中的BamHI位點(diǎn)(SEQIDNO:5中的核苷酸編號930-935)和EcoRI位點(diǎn)(SEQIDNO:5的核苷酸編號938-943)之間。通過專利文件1中描述的方法制備具有SEQIDNO:3的核普酸序列的DNA(專利文件1的實(shí)施例2中"插入片段"對應(yīng)于具有SEQIDNO:3的核苷酸序列的DNA)。以與專利文件1的實(shí)施例2中所述相同的方法將該DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌Topl0F，(Invitrogen),并且表達(dá)多肽。12pGEX4T3表達(dá)的多肽作為與GST(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)的融合蛋白得到，并且使用谷胱甘肽瓊脂糖(Sepharose)4B(GEHealthcareBiosciences)將表達(dá)的多肽進(jìn)行親和純化。用凝血酶處理純化的多肽以除去GST。通過向13昭多肽加入1單位凝血酶并在4。C過夜溫育混合物進(jìn)行凝血酶處理。凝血酶處理后，進(jìn)行凝膠過濾(Sephacryl-S200;AmershamBiosciences生產(chǎn))，以從而得到不含GST的K4CP(具有SEQIDNO:4的氨基酸序列)。用終濃度10ng/ml的胰蛋白酶在20。C下處理所得的產(chǎn)物15分鐘。將未處理的和處理的溶液進(jìn)行SDS-PAGE(12.5%凝膠)；并用考馬斯亮藍(lán)對凝膠染色。結(jié)果在圖1中顯示。在圖1中，"M"、"-"和"+"分別代表分子量標(biāo)記、胰蛋白酶未處理的溶液、和胰蛋白處理的溶液。如圖l所示，在胰蛋白酶處理的溶液的情況中，檢測到由胰蛋白酶處理生產(chǎn)的具有稍小的分子量的帶(圖1中實(shí)心三角形標(biāo)記)。作為分析具有較小分子量的帶的N-末端氨基酸序列的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該帶對應(yīng)于K4CP分子，其中來自N-末端的57個氨基酸殘基已經(jīng)被缺失。因此，發(fā)現(xiàn)該帶是具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽。下文中，將該多肽稱作"AN57K4CP"。實(shí)施例2通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽(AN57K4CP)將具有SEQIDNO:1(編碼AN57K4CP)的核苷酸序列的DNA插入到上述表達(dá)載體pGEX4T3中的BamHI位點(diǎn)(SEQIDNO:5中的核普酸編號930到935)和EcoRI位點(diǎn)(SEQIDNO:5中的核香酸編號938到943)之間。通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))制備具有SEQIDNO:1的核苦酸序列的DNA。將DNA導(dǎo)入大腸桿菌Topl0F，(Invitrogen)中，并在30。C下在補(bǔ)加了終濃度為100pg/ml的氨千青霉素鈉的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌。當(dāng)培養(yǎng)基中的細(xì)菌細(xì)胞的濃度(OD600;600nm下的吸光度)達(dá)到0.6到1時，向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.1mM的IPTG(異丙基-(3-D(-)-硫代吡喃型半乳糖苦)，接著在30。C過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，用谷胱甘肽瓊脂糖(Sepharose)4B(GEHealthcareBiosciences)將細(xì)胞勻漿的上清液進(jìn)行親和層析。用凝血酶處理純化的多肽以除去GST。以與實(shí)施例l相同的方法用凝血酶處理。凝血酶處理后，以與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行凝月交過濾，以從而得到不含有GST的AN57K4CP(具有SEQIDNO:2的氨基酸序列)。將凝膠過濾得到的洗脫的級分(7個級分)以與實(shí)施例中相同的方法進(jìn)行SDS-PAGE,且用考馬斯亮藍(lán)染色凝膠。結(jié)果在圖2中顯示。在圖2中，"M"代表分子量標(biāo)記。圖2表明通過基因工程技術(shù)可以生產(chǎn)AN57K4CP。發(fā)現(xiàn)在該實(shí)施例中表達(dá)的AN57K4CP的表達(dá)水平為實(shí)施例1中表達(dá)的K4CP的表達(dá)水平的約10倍。實(shí)施例3酶促活性的測量測量在實(shí)施例2中生產(chǎn)的AN57K4CP和通過專利文件1的實(shí)施例2中描述的方法生產(chǎn)的K4CP(通過將含有His-標(biāo)記的肽與具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽的N-末端結(jié)構(gòu)域融合得到)的軟骨素合酶活性。測量方法如下。將反應(yīng)溶液(50)^1)在30。C溫育30分鐘，該反應(yīng)溶液含有要測量其酶促活性的多肽(2.0pg),50mMTris-HCl(pH7.2),20mMMnCl2，0.15MNaCl,軟骨素己糖(0.1nmol;SeikagakuCorporation),UDP-[3H]GalNAc(0.1pCi,3nmol)，和UDP-GlcUA(3nmol)。溫育后，在10(TC加熱反應(yīng)溶液1分鐘以終止酶促反應(yīng)。之后，將溶液應(yīng)用到SuperdexPeptideHR10/30柱(GEHealthcareBiosciences),并使用0.2MNaCl作為洗脫劑進(jìn)行凝膠過濾層析。收集含有軟骨素己糖或者更大分子的級分，并使用閃爍計(jì)數(shù)器測量酶促反應(yīng)摻入的卩H]GalNAc的放射性。發(fā)現(xiàn)AN57K4CP的軟骨素合酶活性為K4CP的2.06倍。實(shí)施例4本發(fā)明的晶體1的生產(chǎn)制備含有濃度為20mg/ml(溶劑組成50mMTris-HCl(pH8.0),500mMNaCl，10mMUDP和5mMMnCl2)的實(shí)施例2中得到的AN57K4CP的溶液，并向該溶液中加入終濃度分別為15%和0.2M的聚乙二醇(PEG3350;HamptonResearch)和NaCl,并讓整個溶液在室溫靜置。結(jié)果，生產(chǎn)了AN57K4CP的晶體。該晶體的光學(xué)顯微鏡圖像在圖3中顯示。如圖3所示，晶體是片狀晶體。為該晶體進(jìn)行X射線晶體學(xué)分析以獲得下述晶體數(shù)據(jù)。晶系單斜晶系布喇菲晶格簡單單斜晶格'空間群P2！晶格常數(shù)a=83.5Ab=232.0Ac=86.0A(3=105.5。實(shí)施例5本發(fā)明的晶體2的生產(chǎn)制備含有濃度為20mg/ml(溶劑組成50mMTris-HCl(pH8.0),50mMNaCl,10mMUDP和5mMMnCl2)的實(shí)施例2中得到的AN57K4CP的溶液，并向該溶液中加入終濃度分別為4M和20mM的甲酸鈉和二硫蘇糖醇，并讓整個溶液在室溫靜置。結(jié)果，生產(chǎn)了AN57K4CP的晶體。該晶體的光學(xué)顯微鏡圖像在圖4中顯示。如圖4所示，晶體是八面體晶體。為該晶體進(jìn)行X射線晶體學(xué)分析以得到下面的晶體數(shù)據(jù)。晶系四方晶系布喇菲晶格簡單四方晶格空間群P4晶格常數(shù)a=336人b=336Ac=100人盡管通過各種方法嘗試了SEQIDNO:4(其中沒有從N-末端除去57個氨基酸殘基)的K4CP的結(jié)晶，但是沒有得到K4CP晶體。15實(shí)施例6將實(shí)施例2中生產(chǎn)的AN57K4CP(20pg)在反應(yīng)溶液(50mMTris-HCl,pH7.2,0.2mMMnCl2，0.15MNaCl,100ilU)中于30°C下溫育72小時，該反應(yīng)溶液含有UDP-卩H]GalNAc(0.1pCi,30nmol),UDP-GlcUA(30nmol),和軟骨素己糖([A]1nmol,[B]0.1nmol,[C]0.01nmol)。加熱反應(yīng)溶液并使用串聯(lián)連接的SephacrylS500HR10/30柱和Superose6HR10/30柱(GEHealthcareBiosciences)以0.5ml/分鐘的流速進(jìn)行凝膠過i:圖5)。、'、、、、、、、'、、一用透明質(zhì)酸參照標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生分子量的校準(zhǔn)曲線，并基于校準(zhǔn)曲線計(jì)算洗脫的合成軟骨素的平均分子量。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)[A]、[B]和[C]的平均分子量分別為約16kDa、約216kDa和約685kDa。實(shí)施例7在如實(shí)施例6中所用的反應(yīng)溶液(IOOiul)中溫育實(shí)施例2中生產(chǎn)的△N57K4CP(200jig)以進(jìn)行酶促反應(yīng)，該反應(yīng)溶液含有沒有放射性的UDP-GalNAc(300nmol),UDP-GlcUA(300nmol)和軟骨素己糖([A]10nmol,[B]1nmol,[C]0.1nmol)。加熱反應(yīng)溶液并應(yīng)用到快速脫鹽柱(GEHealthcareBiosciences),且較高分子量的洗脫的級分穿過C18Sep-Pak(Waters),接著凍干。使用多角度激光散射檢測器(WyattTechnologyCorpomtion)測量所得的合成軟骨素的平均分子量，且結(jié)果，發(fā)現(xiàn)[A]、[B]和[C]的分子量分別為34.7kDa、157kDa和344kDa(表1)。表l:通過光散射檢測器對rCH分子量的測量<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在該表中，"D/A"代表糖-核苷酸供體底物與軟骨素己糖的摩爾濃度比。反應(yīng)在30。C下進(jìn)行72小時。^v實(shí)施例6和7的結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過^f吏用AN57K4CP可以有效生產(chǎn)具有較高分子量的軟骨素。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的多肽可以用作有效和廉價地生產(chǎn)軟骨素的工具等等。它是非常有用的，因?yàn)榕c野生型K4CP相比，所述多肽可以非常有效地從核酸表達(dá)，并且它具有高于野生型K4CP的酶促活性，并且可以被容易地結(jié)晶。此外，通過使用本發(fā)明的多肽可以有效生產(chǎn)具有較高分子量的軟骨素。本發(fā)明的核酸是非常有用的，因?yàn)樵摵怂峥梢杂米饔行Ш土畠r地生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的工具。本發(fā)明的生產(chǎn)方法是非常有用的，因?yàn)樵摲椒梢杂糜谟行a(chǎn)本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的晶體是非常有用的，因?yàn)樵摼w可以以極高純度提供本發(fā)明的多肽。權(quán)利要求1.下面的(A)或(B)代表的多肽(A)由SEQIDNO2的氨基酸序列組成的多肽；或(B)由包括一個或幾個氨基酸的缺失、替代或添加的SEQIDNO2的氨基酸序列組成并且具有軟骨素合酶活性的多肽。2.編碼下面的多肽(A)或(B)的核酸(A)由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成的多肽；或(B)由包括一個或幾個氨基酸的缺失、替代或添加的SEQIDNO:2的氨基酸序列組成并且具有軟骨素合酶活性的多肽。3.下面的(a)或(b)代表的核酸(a)由SEQIDNO:1的核苷酸序列組成的DNA;或(b)DNA，其在嚴(yán)格條件下與由與DNA(a)互補(bǔ)的核苷酸序列組成的DNA雜交并且具有軟骨素合酶活性。4.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的方法，其包括至少下面的步驟(l)和(2):(1)從至少一種根據(jù)權(quán)利要求2和3的核酸表達(dá)多肽的步驟；和(2)收集步驟(1)中表達(dá)的多肽的步驟。5.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的晶體。6.根據(jù)權(quán)利要求5的晶體，其是片狀晶體。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的晶體，其顯示出下面的晶體數(shù)據(jù)晶系單斜晶系布喇菲晶格簡單單斜晶格空間群P2i晶格常數(shù)a=83.5人b=232.0人c=86.0A(3=105.5。。8.根據(jù)權(quán)利要求5的晶體，其是八面體晶體。9.根據(jù)權(quán)利要求5或8的晶體，其顯示出下面的晶體數(shù)據(jù)晶系四方晶系布喇菲晶格簡單四方晶格空間群P4晶格常數(shù)a-336人b=336Ac=100A。10.生產(chǎn)軟骨素的方法，其包括在根據(jù)權(quán)利要求1的多肽存在下將糖受體底物、D-葡糖醛酸供體、和N-乙酰-D-半乳糖胺供體反應(yīng)。全文摘要公開了(A)由SEQIDNO2所示的氨基酸序列組成的多肽；或(B)包含SEQIDNO2中具有一個或幾個氨基酸的缺失、替代或添加的氨基酸序列并且具有軟骨素合酶活性的多肽；編碼所述多肽的核酸；生產(chǎn)所述多肽的方法，其包括至少如下步驟(1)表達(dá)所述核酸以生產(chǎn)多肽；和(2)收集步驟(1)中生產(chǎn)的多肽；以及所述多肽的晶體。所述晶體可以是單斜晶體或四方晶體。文檔編號C12N15/00GK101466833SQ20078002194公開日2009年6月24日申請日期2007年6月12日優(yōu)先權(quán)日2006年6月12日發(fā)明者大澤拓生,木全弘治,杉浦信夫,角田佳充申請人:生化學(xué)工業(yè)株式會社