專利名稱：：具有核酸酶活性的幼蟲多肽的制作方法具有核酸酶活性的幼蟲多肽本發(fā)明涉及幼蟲產(chǎn)品。更具體而言，本發(fā)明涉及從絲光綠蠅(丄w"7^也稱作尸/wem'"a"hcato)幼蟲中分離出的一種或多種多肽，所述多肽能夠降解、消化、切割(cut)或剪切(cleave)核酸。在幾個(gè)世紀(jì)前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)到應(yīng)用昆蟲的幼蟲或蛆可以治愈傷口，但是僅僅近來(lái)，尤其隨著抗生素耐受微生物的增多，人們開始重新著手使用這種稱為"生物外科"的方法，并且蛆治療開始復(fù)興1G。目前在臨床應(yīng)用的幼蟲是絲光綠蠅幼蟲。人們相信幼蟲或蛆具有很強(qiáng)的清除和消毒傷口的能力。近來(lái)還確定其具有促進(jìn)組織再生和傷口愈合的能力。幼蟲可在臨床使用以改善和促進(jìn)許多慢性傷口的愈合率，而通常的治療方法如抗生素、抗菌素、殺菌劑、外科清創(chuàng)術(shù)和傷口引流并不能減少或阻止進(jìn)行性組織破壞u。這種慢性傷口來(lái)源于各種疾病，包括糖尿病足部潰瘍、腿部靜脈潰瘍、外科傷口感染、整形外科傷口、骨髓炎和壓瘡。使用整條幼蟲或蛆會(huì)令一些患者感到不適，為了克服這種不適感，人們傾向于應(yīng)用幼蟲產(chǎn)品而不是幼蟲本身。幼蟲排泄/分泌(ES)產(chǎn)品或幼蟲提取物的組分被認(rèn)為與使用整條幼蟲的療效相當(dāng)。幼蟲產(chǎn)品的組分是蛆能夠促進(jìn)傷口愈合的關(guān)鍵，有幾種機(jī)制來(lái)解釋這種作用。清創(chuàng)被認(rèn)為部分是通過(guò)ES或提取物中的組分膠原酶和絲氨酸蛋白酶的蛋白質(zhì)水解作用實(shí)現(xiàn)的，它們可將壞死組織降解成幼蟲可吸收形式，這樣可將傷口表面的蛻皮清除12，13。在ES中鑒定出的2種抗菌因子對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌具有抗菌活性，其中的一種因子具有顯著的抗MRSA活性14。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重建或關(guān)閉(closure)的刺激也被認(rèn)為是歸功于ES中的一種或多種"糜蛋白酶樣"的絲氨酸蛋白酶的作用，這種蛋白酶能夠?qū)⒗w維結(jié)合素降解為生物活性肽。這些生物活性肽能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的粘附和遷移18并且可能加速傷口的愈合15。ES也可能具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的作用。發(fā)明人確定幼蟲的ES和提取物中均包含一種或多種能夠降解、變性、消化、切割或剪切核酸的多肽。優(yōu)選的情況下，每種多肽包含一種或多種下文所示的序列。假定這些多肽中至少一種是核酸酶(nuclease)或具有核酸酶的功能，其降解、變性、消化、切割或剪切核酸，尤其是DNA。盡管其中至少一些多肽與已知的昆蟲核酸酶不具有同源性，但因?yàn)槠淇尚惺购怂崦傅墓δ?，因此被認(rèn)為是核酸酶，下面將進(jìn)一步的討論。發(fā)明人比較了ES或提取物中具有核酸酶功能的多肽序列與昆蟲序列數(shù)據(jù)庫(kù)中多肽的同源性，鑒定出的最接近的同源家族是昆蟲鐵蛋白的一些部分。鐵蛋白是球狀蛋白復(fù)合物，由24個(gè)蛋白亞基組成，是原核生物和真核生物中主要的細(xì)胞內(nèi)鐵儲(chǔ)存蛋白，使鐵保持為可溶的和非毒性的狀態(tài)。盡管鐵蛋白通常不被描述為核酸酶，但是已發(fā)現(xiàn)21—22在反應(yīng)介質(zhì)中從鐵蛋白中釋放出來(lái)的鐵原子可作用于核酸，尤其是DNA,得到可與DNase相比的結(jié)果。發(fā)明人鑒定出的多肽符合核酸酶的定義，因其能夠切開核酸特別是DNA的核苷酸亞單位間的磷酸二酯鍵，它們能夠催化DNA主鏈中磷酸二酯鍵的水解分裂，因此是一種類型的核酸酶。因此，根據(jù)本申請(qǐng)的目的，基于多肽的活性，用術(shù)語(yǔ)核酸酶或DNase來(lái)描述本發(fā)明的多肽，而不管是否這種多肽通常被描述為核酸酶或DNase。發(fā)明人確定絲光綠蠅幼蟲的ES和提取物包含至少一種核酸酶。核酸酶可被用于治療傷口、燒傷等，或者治療或預(yù)防感染。核酸酶也可用于治療嚢性纖維化(cysticfibrosis),尤其可作為當(dāng)前DNAse療法的替代療法。因此，本發(fā)明提供了一種從昆蟲幼蟲中分離出的核酸酶或其合成類似物或合成物。優(yōu)選地，核酸酶包含一種或多種下列多肽序列IXEYLSMRSFDDTLDMLKSYEYLLLATHFNSYQKSLGNPELPTEWLDLRELDASYQYLAMHKVFVNSGTSLMDVRANFNVVHESS(SEQIDN0:1)(SEQIDNO:2)(SEQIDNO:3)(SEQIDNO:4)(SEQIDNO:5)(SEQIDNO:6)(SEQIDNO:7)有可能，由于獲得上述多肽序列的方法(質(zhì)譜法，其隨機(jī)打斷肽鍵)的問(wèn)題，這些多肽是較長(zhǎng)多肽或蛋白的斷裂產(chǎn)物，尤其是考慮到在2維SDS-PAGE電泳中可見到這些多肽分離形成單個(gè)點(diǎn)。因此，本發(fā)明也包括含有2種或多種上述多肽序列的多肽序列。理想的是，本發(fā)明包括任選地在單一多肽鏈中含有所有上述序列的多肽序列。2種或多種多肽不需要依照給出的數(shù)字順序排序。優(yōu)選地，任何一種這樣的多肽都具有上述核酸酶功能。編碼SEQIDNOs1-7多肽的核苷酸序列及它們?cè)谥苽浜铣苫蛑亟M多肽的用途也包括在本發(fā)明內(nèi)。優(yōu)選地，核酸酶適用于治療或預(yù)防感染，或治療傷口。核酸酶可被用于藥物組合物，或加入到敷料(dressing)中。"傷口，，這個(gè)詞在此定義為任何皮膚、表皮或結(jié)締組織的損傷，不論是因損害或是因疾病引起，包括但并不局限于切割傷，刺傷，外科切口，潰瘍，壓瘡，因熱、凍、化學(xué)物、電和放射引起的灼傷，皮膚擦傷或沖擊傷(assault)、骨髓炎和整形外科傷口。這些傷口可能發(fā)生感染。另外，這些傷口可以是慢性的，也可以是急性的。優(yōu)選地，幼蟲是絲光綠蠅幼蟲。產(chǎn)品可以是核酸酶，可以是DNase、RNase或它們的混合物。理想地，核酸酶降解原核和真核生物的核酸，尤其是，可降解細(xì)菌和哺乳動(dòng)物的核酸。然而，本發(fā)明的核酸酶也^皮用于治療或預(yù)防病毒復(fù)制。核酸酶也被用作常規(guī)抗生素的輔助藥物來(lái)治療感染，不論是全身用藥或局部用藥。核酸酶，例如DNase酶，已凈皮推薦用于傷口清創(chuàng)術(shù)的輔助治療，并已被摻入促進(jìn)慢性傷口的清創(chuàng)的藥物中。當(dāng)用于傷口時(shí)，從牛胰臟提取的DNases能夠降解'lt性傷口壞死組織中的脫氧核糖核蛋白和脫氧核糖核酸16。來(lái)源于蘭氏分群C群鏈球菌，似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)的精制細(xì)胞外產(chǎn)品構(gòu)成了藥物Varidase⑧的組分。Varidase是一種用于化膿傷口清創(chuàng)的局部藥物，包含一種稱為鏈道酶(Streptodomase)的DNase組分。鏈道酶對(duì)胞外DNA的降解祐:認(rèn)為是通過(guò)對(duì)膿液進(jìn)行液化，以使白細(xì)胞可自由活動(dòng)，并聚集于胞外的核蛋白而加強(qiáng)吞噬作用來(lái)促進(jìn)傷口愈合2。然而，已有研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自幼蟲的核酸酶，尤其是那些來(lái)自絲光綠蠅幼蟲的核酸酶，在有或無(wú)特定金屬離子存在的情況下，其穩(wěn)定性和溫度相關(guān)的活性更強(qiáng)。發(fā)明人在ES和幼蟲提取物中發(fā)現(xiàn)了一種金屬離子依賴性的脫氧核糖核酸酶(DNase)活性。這可能有利于通過(guò)對(duì)失活組織中游離DNA的降解而促進(jìn)傷口的清創(chuàng)，以減少滲出液的粘度或焦痂。他們比較了ESDNase與市售DNaseI制劑的DNase活性并且發(fā)現(xiàn)，在無(wú)DNase底物限制時(shí)，ESDNase的反應(yīng)速率(Vmax)比市售DNase為低，但是當(dāng)?shù)孜锸芟迺r(shí)，其對(duì)DNA具有較高的親合力(高Km)。他們也發(fā)現(xiàn)在溫度范圍20-40°C之間，ESDNases的穩(wěn)定性更強(qiáng)(moreresistant),該溫度范圍與傷口狀態(tài)相關(guān)，其中存在溫度梯度，當(dāng)換敷料或血供減少(compromised)時(shí)，冷的壞死組織處于環(huán)境溫度下，其他組織的溫度被降低17。另外，發(fā)明人的研究結(jié)果顯示，與市售DNase相比，ES較少受到乙二胺四乙酸(EDTA)的抑制，并對(duì)高Ca"和Na+離子濃度的回復(fù)性更強(qiáng)(moreresilient)。這些結(jié)果說(shuō)明，與市售制劑相比，ESDNase活性對(duì)金屬離子濃度變化更強(qiáng)(morerobust)。幼蟲提取物中也檢測(cè)到核酸酶活性，下文將會(huì)描述。現(xiàn)在將僅用實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例參考并用附圖來(lái)說(shuō)明。圖1是顯示高濃度(圖la)和低濃度(圖lb)幼蟲ES的情況下，DNA曱基綠測(cè)試結(jié)果的一對(duì)圖表；圖2是顯示ES對(duì)凝膠中DNA甲基綠組分降解的凝膠照片；圖3是在3、18和24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，ES和市售DNase的劑量依賴性曲線；圖4是顯示在EDTA存在，且使用大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)處理的情況下，DNase活性測(cè)定的凝膠照片；圖5顯示在EDTA存在下，ES和DNaseI中DNase活性的DNA甲基綠測(cè)試；圖6顯示在Mg2+濃度為7.5mM(圖6a)和Na+濃度為7.5mM(圖6b)時(shí)，ES的DNA甲基綠測(cè)試結(jié)果；圖7顯示在不同鎂離子濃度下ES的活性；圖8顯示在不同鈉離子濃度下ES的活性；圖9顯示在不同釣離子濃度下ES的活性；圖10是顯示Kco//DNA的瓊脂糖凝膠電泳的凝膠照片；圖11顯示在37。C下，含或不含0.02^ig/mlES的一定pH值的緩沖液中聘育10m后，co/ZDNA(每泳道0.5ng)瓊脂糖凝膠電泳；圖12顯示在37°C下，預(yù)先暴露于給定溫度30分鐘后冷卻的ES或市售DNase對(duì)DNA-曱基綠復(fù)合物作用24h后，其降解情況；圖13顯示在37°C,有或無(wú)5mMEDTA的情況下，暴露于ES或DNase—定時(shí)間后，DNA-曱基綠復(fù)合物的降解情況；圖14顯示在37。C下，與l|ug/mlES和一定濃度的鎂離子孵育19小時(shí)后DNA曱基綠的降解情況；圖15顯示絲光綠蠅提取物中DNase活性的DNA底物(圖版A)和蛋白(圖版B)分析；圖16顯示DNA纖維素純化過(guò)的絲光綠蠅提取物中DNase活性的DNA底物(圖版A)和蛋白(圖版B)分析；圖17是顯示純化的絲光綠蠅DNase對(duì)非治愈性傷口焦痂DNA的消化的凝膠照片；圖18是顯示DNA纖維素純化過(guò)并進(jìn)行二維電泳的絲光綠蠅提取物中DNase活性的DNA底物(圖版A)和蛋白(圖版B)分析的凝膠照片；實(shí)施例1下述試驗(yàn)用來(lái)鑒定和表征核酸酶，尤其是ES的DNase。收集絲光綠蠅幼蟲排泄/分泌產(chǎn)物得自英國(guó)卡迪夫市外科材料檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室LarvE，的大約300只新孵化的絲光綠蠅被多次清洗并收集分泌物(ES),在無(wú)菌條件下執(zhí)行上述操作。將lml的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)加入到幼蟲中并放置30分鐘。在此之后，PBS和分泌物被移走，幼蟲被留置恢復(fù)30分鐘。這個(gè)過(guò)程重復(fù)進(jìn)行4次，然后將收集的ES匯合備用。絲光綠蠅排泄/分泌產(chǎn)物的表征用Bio-Rad蛋白分析試劑盒(Hercules,CA，U.S.A乂對(duì)PBS中的ES蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)FITC酪蛋白分析來(lái)測(cè)定ES蛋白酶的活性。用含5.3%FITC-酪蛋白結(jié)合物的O.lmolL"Tris-HCl緩沖液將ES稀釋20倍。然后在37。C下孵育2小時(shí)。隨后加入5%的三氯乙酸以終止反應(yīng)，并在室溫下放置45分鐘。通過(guò)離心形成蛋白沉淀，用0.5molI/1Tris-HCl(pH8.8)的將上清稀釋10倍。在485nm的激發(fā)波長(zhǎng)和538nm的發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光。從得到的熒光值中減去從ES空白樣品檢測(cè)到的熒光。應(yīng)用DNA和甲基綠對(duì)DNase活性進(jìn)行分析DNA與曱基綠的親和力很強(qiáng)并能與此染料形成一種復(fù)合物。DNase的作用使DNA與曱基綠的親和性消失，并使溶液發(fā)生顏色改變。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)DNaseI酶和ES的活性進(jìn)行了比較。lmg/ml的DNase被稀釋50倍后，向125|il的這種溶液中加入1875pi的0.2mg/ml的DNA甲基綠底物溶液。將162.3jig/ml的ES125|il加入1875pi的DNA曱基綠底物溶液中。因此最后合成的濃度為1.28jig/mlDNase和10.14pg/ml的ES。然后在37°C的水浴中孵育這些溶液。25分鐘內(nèi)每5分鐘取100|il的測(cè)試量，5個(gè)小時(shí)內(nèi)每小時(shí)取一次(每次取一式三份的樣品)。在96空板中，將這些測(cè)試量加入150|iil擰檬酸鈉鹽中。當(dāng)所有樣本加入后，96孔板放置過(guò)夜。然后應(yīng)用AnthosLucyl微孔光度計(jì)4企測(cè)其在630nm的吸光率。在不同ES濃度(5.09ng/ml、2.54pg/ml、1.27pg/ml、0.634jig/ml、0.317pg/ml、0.159|ig/mlES)和1.25pg/mlDNase作用下，每2分鐘重復(fù)一次這種檢測(cè)。由于時(shí)間延長(zhǎng)和ES濃度的增高而導(dǎo)致的底物明顯消耗使這種重復(fù)檢測(cè)得以實(shí)現(xiàn)。在含有DNA甲基綠的凝膠中進(jìn)行電泳分析DNase活性本方法的原理是DNase酶在凝膠中向下遷移形成條帶，在此條帶中DNA甲基綠復(fù)合物被酶降解了。制作2種凝膠，均為SDS聚丙烯酰胺凝膠，其中的DNA甲基綠的濃度均為0.067mg/ml。分別4吏用PBS和水連續(xù)稀釋獲得濃度遞減的ES(10.14pg/ml、5.07|iig/ml、2.54pg/ml、1.268jxg/ml)和DNase(lOng/ml、5pg/ml、2.5pg/ml、1.25(ig/ml)的樣本20^。20pi的非還原性樣品緩沖液被加入這些樣本中，隨后在37°C孵育30分鐘。DNase樣本和ES樣本加入凝膠中預(yù)先染色的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和PBS/H20對(duì)照中。使用0.1%SDS作為跑膠緩沖液并開通電源。跑膠結(jié)束后，將凝膠在2.5%TWEEN⑧中孵育，隨后用蒸餾水清洗30分鐘，并在37。C,置于含7.5mMMgS04的0.5MTRIS緩沖液中過(guò)夜。之后，用溴乙錠(EB)將凝膠染色并在透射儀中顯現(xiàn)結(jié)果。劑量依賴性曲線為了進(jìn)一步表征ES,制作了能夠測(cè)定EC5Q值的劑量依賴性曲線。用PBS將ES的濃度稀釋為13.40pg/ml,之后應(yīng)用PBS進(jìn)行10倍的稀釋。將DNase稀釋為在PBS中濃度為lO^g/ml,然后再用PBS進(jìn)行10倍的稀釋。在96孔板中，每份20的稀釋液中加入180^10.2mg/ml的曱基綠。3、18和24小時(shí)后，在AnthosLucyl型微孔照度儀中檢測(cè)其在630nm處的吸光率。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析程序GraphPadPrismTM,以loglO濃度(mcg/ml)對(duì)平均吸光率(630nm)數(shù)值來(lái)制作劑量依賴性曲線。抑制劑存在下的DNase活性在大豆胰蛋白酶抑制劑和EDTA存在的情況下才羊本的電泳將分別加或不加入EDTA和大豆胰蛋白酶抑制劑的細(xì)菌基因組DNA以及ES或Dnase的樣本加入瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，來(lái)觀察這些抑制劑對(duì)DNase活性的影響。大豆胰蛋白酶抑制劑(Sigma)用PBS清洗4次，且每次清洗后進(jìn)行離心并將PBS上清倒掉。在第5次清洗時(shí)，使用500|iil的PBS懸浮胰蛋白酶抑制劑，以使其在要處理的樣本中均勻分布。用大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)ES162.3pg/ml和PBS(對(duì)照)樣本進(jìn)行預(yù)處理以除去其中的絲氨酸蛋白酶。這些樣本進(jìn)行3次STI處理，盡量除去絲氨酸蛋白酶，每次處理后離心溶液并將ES/PBS作為上清移除。隨后進(jìn)行清洗，這些溶液:故移入新的Eppendorf管中。15.34^1濃度為1.385mg/ml的細(xì)菌基因組DNA被的無(wú)菌PBS或5mMEDTA稀釋至濃度為0.1mg/ml。同樣配制濃度為121.1|xg/ml的DNase(72,6[il的PBS將,濃度為lmg/ml的樣品稀釋)。為了配制樣本，50|iil的這些DNA溶液中加入3.125pi的STI處理/未處理過(guò)的DNase/ES/PBS。將10^1加樣緩沖液(Sigma)加入各樣本中并在37°C孵育20分鐘，然后加入含5^1EB的50ml的1.6。/。(w/v)瓊脂糖凝膠中。因此，在凝膠的泳道中大約含1貼的DNA,有效濃度為7.56嗎/ml的DNase或10.14pg/ml的ES。在紫外透射儀中觀察結(jié)果。EDTA存在的情況下對(duì)ES和DNase活性的DNA甲基綠測(cè)試將125^1濃度為81.15(xg/ml的ES同時(shí)加入到1875WDNA甲基綠溶液(0.2mg/ml)和含5mMEDTA的DNA甲基綠溶液中。因此最終的濃度為5,07貼/mlES和4.7mMEDTA。DNase被稀釋至濃度為121.1|ig/ml,2倍稀釋后加入1875|iil的DNA曱基綠溶液和含EDTA的DNA曱基綠中。按相同的方法，在有或無(wú)EDTA的情況下，對(duì)STI處理過(guò)的ES的活性進(jìn)行分析。然后這些樣本在37。C的水浴中進(jìn)行孵育。每2分鐘吸取100pi的樣品(一式三份)，在96孔板中將其加入到150pi濃度為0.083M的檸檬酸鈉中。這些板子放置過(guò)夜并在AnthosLucyl微孔照度儀中檢測(cè)其在630nm處的吸光率。不同金屬離子存在時(shí)的ES的活性用無(wú)菌PBS和EDTA將ES稀釋10倍獲得濃度為5mM的EDTA和16.23pg/ml的ES。將125pi的這種溶液加入到含7.5mM的一種特殊離子的(銅、鋅、鎂、鈉、鎳、釣)的1875^1濃度為0.2mg/ml的DNA甲基綠溶液中。因此最后的濃度為0.3125mMEDTA和1.014|ig/mlES。每2分鐘吸取100^的樣品(一式三份)，在96孔板中將其加入到150^濃度為0.083M的檸檬酸鈉中，剩余樣本在37°C保存。這些板子在室溫下放置過(guò)夜并在AnthosLucyl微孔照度儀中才全測(cè)其在630nm處的吸光率。為了評(píng)估最適宜ES的Mg2+,Ca2+和Na+濃度，將含10mMMg2+,10mMCa"和2mMNa+的三種0.2mg/mlDNA曱基綠溶液稀釋以制備多種不同濃度的溶液(用不含離子的DNA曱基綠溶液稀釋來(lái)獲得不同的濃度)。lOpl0.2ng/ml的ES被加入到90|il的含離子的DNA曱基綠中(用pH7.5的0.5MTris來(lái)稀釋純的ES)。因此DNA甲基綠中ES的最終濃度為0.02ng/ml。每種濃度制備三份以獲得平均的吸光率。因離子會(huì)改變DNA曱基綠的顏色并改變吸光率，同時(shí)也制備了空白對(duì)照。通過(guò)AnthosLucyl微孔照度儀檢測(cè)樣本和空白在630nm處的吸光率。針對(duì)離子濃度對(duì)空白和樣本之間的吸光率變化進(jìn)行計(jì)算和繪圖。結(jié)果幼蟲排泄/分泌產(chǎn)物〖ES)DNase活性的測(cè)定在DNA甲基綠測(cè)試中，DNA曱基綠復(fù)合物顯著降解證明了ES的DNase活性，如圖1中所示隨著時(shí)間吸光率下降。DNase和ES樣本的吸光率均發(fā)生清晰的下降，說(shuō)明ES確實(shí)具有DNase活性。產(chǎn)生的曲線ii發(fā)生明顯的扁平，尤其是ES曲線，可能是由于ES的濃度太高或取樣的時(shí)間太長(zhǎng)而致底物耗盡。后來(lái)也認(rèn)為可能是因?yàn)橛脕?lái)終止DNA甲基綠復(fù)合物降解的檸檬酸鈉和DNase活性未能完全抑制反應(yīng)。因此當(dāng)放置平板過(guò)夜時(shí)，這種反應(yīng)繼續(xù)發(fā)生。圖la顯示DNA曱基綠測(cè)試的結(jié)果1.28jig/mlDNase和10.14^ig/mlES加入0.2mg/ml的DNA曱基綠底物溶液中。溶液孵育25分鐘，然后在5分鐘內(nèi)取3份樣本。將樣本加入150^1的檸檬酸鈉鹽中(96孔板中)以終止反應(yīng)并在隨后一天測(cè)其吸光率，這些數(shù)值在圖la中列出。隨后，在2分鐘的時(shí)間間隔內(nèi)取樣再次重復(fù)試-瞼，并改變ES的濃度。在ES濃度低于5.09pg/ml時(shí)，產(chǎn)生的曲線顯示了DNase的最小活性，但在濃度為5.09pg/ml時(shí)，線性曲線表明了此濃度下DNase的顯著活性。DNA甲基綠測(cè)試結(jié)果在圖lb中顯示5.09|ig/mlES在0.2mg/mlDNA甲基綠底物溶液中。溶液在37°C中孵育，且每3分鐘取lOO^il的樣本。將樣本加入的檸檬酸鈉鹽(在96孔板中)以終止反應(yīng)，并在隨后一天測(cè)其吸光值。數(shù)值在圖lb中列出。通過(guò)SDS-PAGE以確定DNase的活性，這種凝月交包含0.067mg/mlDNA甲基綠。使用了2種凝膠，一種加入濃度遞減的DNase,另外一種加入濃度遞減的ES。因凝膠中DNA曱基綠的降解，ES顯示出明確的可見的DNase活性。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在ES濃度更低時(shí)，降解程度更大，但是需要重復(fù)試驗(yàn)來(lái)判定這種發(fā)現(xiàn)的可能性。結(jié)果如圖2所示一ES對(duì)凝膠中DNA曱基綠組分的降解。泳道l-預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，泳道2-PBS對(duì)照，泳道3-1.268pg/mlES,泳道5-2.54pg/mlES,泳道7-5.07pg/mlES，泳道9-10.14pg/mlES,泳道4、6、8和10是空白。劑量依賴性曲線對(duì)ES(13.40pg/ml)和DNase(10ng/ml)溶液進(jìn)行系列稀釋，將每種上述20^1稀釋液加入到96孔板中的180^1DNA甲基綠溶液中，并在37。C孵育這些板子以獲得2種劑量依賴性曲線。在3、18和24小時(shí)檢測(cè)其吸光值，并根據(jù)24小時(shí)的吸光值來(lái)構(gòu)建曲線(見圖3)。由劑量依賴性曲線，使用GraphPadPrismTM也可計(jì)算EC5。值。ES和DNase的EC5o值在3小時(shí)分別是0.5885pg/ml和0.1921jig/ml，在18小時(shí)分別是0.0248jig/ml和0.0605jig/ml,在24小時(shí)分別是0.0151pg/ml和0.0571昭/ml，由此說(shuō)明DNase的活性超過(guò)ES的3倍。結(jié)果如圖3所示。ES對(duì)離子的依賴性將加入和不加入離子螯合劑EDTA、用胰蛋白酶抑制劑處理和不處理的細(xì)菌基因組DNA和ES或DNase，在瓊脂糖凝膠中電泳。這么做的目的是想測(cè)定是否DNase酶的活性可被EDTA抑制，是否是離子依賴。對(duì)胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行處理，應(yīng)該去除任何胰蛋白酶和糜蛋白酶，因此可鑒定是否DNase的活性不依賴于這些酶。如預(yù)期，這些包含PBS的對(duì)照樣本沒有顯示發(fā)生DNA降解，這些未降解的DNA顯示出同樣清晰的條帶(泳道2-5)。包含ES的樣本中獲得的結(jié)果表明，DNase的活性不是由于糜蛋白酶的存在(泳道8),因?yàn)闊o(wú)這種酶時(shí)，DNA仍然發(fā)生降解。同樣可見DNase活性被EDTA抑制，因?yàn)樵诘?泳道未發(fā)生DNA降解，因此表明ES的活性是離子依賴性的。分別加入和未加入EDTA的DNase樣本(泳道11和12)均未顯示DNase活性。這種DNase可能對(duì)細(xì)菌基因組DNA無(wú)活性，因?yàn)轭A(yù)期在不存在EDTA的情況下，其能夠降解DNA。結(jié)果如圖4所示，在EDTA存在和用大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)處理后，對(duì)DNase活性的測(cè)定。泳道l-DNA階梯(ladder);泳道2-DNA+未處理的PBS;泳道3-DNA+STI處理的PBS;泳道4-DNA+未處理的PBS+EDTA;泳道5-DNA+STI處理的PBS+EDTA;泳道6-空白；泳道7-DNA+未處理的ES;泳道8-DNA+STI處理的ES;泳道9-DNA+未處理的ES+EDTA;泳道10-DNA+STI處理的ES+EDTA;泳道ll-DNA+未處理的DNase;泳道12-DNA+未處理的DNase+EDTA。在EDTA存在情況下ES和DNaseI的DNase活性顯示DNase和ES的活性均被EDTA所抑制，但是DNase被抑制得更顯著，在EDTA存在情況下，其活性幾乎完全消失。圖5所示為DNA曱基綠試驗(yàn)的結(jié)果，說(shuō)明為何當(dāng)DNA曱基綠復(fù)合物發(fā)生降解時(shí)，下降的吸光值就能表明DNase的活性。在不存在EDTA時(shí)，在這些濃度下(分別為5.07pg/ml和3.78|xg/ml)，ES和DNase具有相似的活性。圖5:在EDTA存在情況下，顯示ES和DNaseI的DNase活性的DNA曱基綠測(cè)試的結(jié)果。不同金屬離子對(duì)ES的DNase活性的影響在7.5mM的銅、鋅、鎂、鈉、鎳和4丐離子存在的情況下，對(duì)ES的活性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示鎂離子對(duì)ES的DNase活性有正面影響，也可能存在鈉的影響，盡管產(chǎn)生的線性曲線結(jié)果不像在鎂離子試驗(yàn)中曲線那么讓人信服(圖6a和6b)。圖6a顯示的是在7.5mMMg^存在情況下的ES的DNA曱基綠試驗(yàn)。鎂似乎可激活ES因?yàn)镈NA曱基綠復(fù)合物的降解和吸光率的下降。圖6b顯示的是在7.5mMNa+存在情況下ES的DNA甲基綠試驗(yàn)。似乎Na+也能激活ES，但是作用不像Mg+那么顯著。隨后，發(fā)現(xiàn)Mg2+、Ca2+和Na+都能刺激ESDNase的活性。增加Ca"和Mg"離子的濃度，可促進(jìn)ES的活性增加至某個(gè)點(diǎn)，在此之后，活性就保持在一個(gè)相對(duì)恒定的水平。最適Mg^濃度是3mM,最適Ca^濃度是0.9mM。在Na+離子存在時(shí)，ES的活性快速增加，在濃度為0.2mM時(shí)活性最適，在此之后，ES活性穩(wěn)定下降。在DNA曱基綠試驗(yàn)中，使用每種離子濃度的空白對(duì)照，來(lái)測(cè)定在不同陽(yáng)離子存在時(shí)ES的活性，這些空白對(duì)照中不包含ES。孵育24小時(shí)后，^v那些含ES的實(shí)際濃度下的吸光值中減去這些空白對(duì)照的吸光值，即可得出結(jié)果。結(jié)果如圖7-9所示。討論絲光綠蠅排泄/分泌產(chǎn)物顯示出明確的，獨(dú)立于先前鑒定的糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的活性，由此在幼蟲分泌物中鑒定出一種新的DNase成分。因此這就指示了蛆促進(jìn)慢性傷口治愈的另一種方法。以前的研究已經(jīng)表明受傷部位的胞外核蛋白會(huì)吸引白細(xì)胞在此聚集，導(dǎo)致傷口引流不良。通過(guò)DNA的降解、膿液液化以及由此增加的白細(xì)胞活動(dòng)和吞噬作用，改善傷口的愈合2。試驗(yàn)過(guò)程中允許比色測(cè)定，通過(guò)DNA-曱基綠底物來(lái)確定DNaseI的活性3。與傷口部位高度相關(guān)的是，同樣發(fā)現(xiàn)ES中的DNase能夠降解細(xì)菌基因組DNA,因此DNase活性以及傷口清創(chuàng)中的輔助作用可能在蛆的抗菌效應(yīng)中起作用，該效應(yīng)以前被認(rèn)為歸因于蛋白酶活性4，以及蛆4聶取和破壞細(xì)菌5。幼蟲DNase顯示出與其他DNases類似的金屬離子依賴性的催化作用。絲光綠蠅排泄/分泌的DNase的活性可被鎂離子、鈉離子和鉀離子刺激。其中鎂離子對(duì)活性的刺激作用最強(qiáng)，其次是Ca2、再次是Na+。當(dāng)與Varidase(以前上市的一種促進(jìn)傷口愈合的產(chǎn)品)中的鏈道酶的耐受性比較時(shí)，在陽(yáng)離子存在情況下，鏈道酶的DNase活性較幼蟲DNase活性弱得多。鎂離子僅在低濃度下刺激DNase的活性(適宜的濃度為0.06mM,而幼蟲DNase的為3mM),在此之后活性快速下降。Ca2+和Na+在任何濃度下均為抑制性的，除非與Mg"同時(shí)使用時(shí)。2對(duì)慢性傷口中的離子濃度尚未調(diào)查，但是可使幼蟲DNase活性回復(fù)的離子濃度范圍較廣，且其持久的活性是其促進(jìn)傷口愈合的一個(gè)明確優(yōu)勢(shì)。當(dāng)研究大范圍的Na+、Mg"和Ca"濃度下的DNase活性時(shí)，所得的結(jié)果有一個(gè)問(wèn)題存在，即用來(lái)計(jì)算吸光值變化的空白對(duì)照應(yīng)該與實(shí)驗(yàn)樣本孵育相同時(shí)間。在計(jì)算吸光值的變化時(shí)，快速讀取空白對(duì)照的吸光值意味著如果DNA曱基綠復(fù)合物因離子存在而表現(xiàn)出任何不穩(wěn)定性，它將不被考慮在內(nèi)，從而可能導(dǎo)致誤差。因此，本試驗(yàn)應(yīng)該重復(fù)進(jìn)行，保證空白對(duì)照和試驗(yàn)樣本孵育相同時(shí)間以確定這些結(jié)果的準(zhǔn)確性。在EDTA存在時(shí)，幼蟲ES的DNase活性較標(biāo)準(zhǔn)DNase的回復(fù)性更強(qiáng)；在離子螯合物存在時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)DNase的活性幾乎完全消失，而幼蟲DNase仍保持顯著的活性。幼蟲DNase的活性可輔助傷口清創(chuàng)，在傷口環(huán)境中增強(qiáng)蛆的抗菌效果，也有假說(shuō)認(rèn)為將細(xì)菌DNA降解為寡核苷酸可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。眾所周之免疫系統(tǒng)的組分的確會(huì)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的成分發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)。也有研究顯示細(xì)菌DNA的序列對(duì)某種免疫細(xì)胞具有免疫激活效應(yīng)，尤其是對(duì)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，以及B細(xì)胞6。細(xì)菌CpGDNA是病原體相關(guān)的分子模式(pattern)(PAMP)。許多病原體都表達(dá)PAMP,但宿主不表達(dá)，因此，PAMP是天然免疫系統(tǒng)的重要刺激物。CpGDNA具有免疫激活作用，可以激活Toll9受體，從而引發(fā)細(xì)胞應(yīng)答7。被幼蟲DNase降解的細(xì)菌DNA會(huì)產(chǎn)生這種具有免疫刺激性的細(xì)菌DNA寡核苷酸。CpG-ODN激活Toll樣受體，產(chǎn)生保護(hù)反應(yīng)，由此表達(dá)氮和氧中間分子、抗菌肽、粘附分子、細(xì)胞因子(TNFa、IL-12、p40和IL-6)和急性期蛋白6'8。樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的Toll樣受體激活后，可以刺激共刺激分子如CD40和CD86的表達(dá)，這些分子和T淋巴細(xì)胞的CD28反應(yīng)，從而發(fā)揮完整的抗原提呈作用并激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)8'9。因此，如果幼蟲DNase能把細(xì)菌基因組DNA降解為具有中央的、未甲基化的胞嘧啶核苷-鳥嘌呤核苷核心的寡核苷酸，則可能促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放并激活免疫系統(tǒng)，這是蛆促進(jìn)傷口愈合的又一個(gè)作用。應(yīng)當(dāng)使用適當(dāng)?shù)膶?duì)照重復(fù)離子實(shí)驗(yàn)，并采用不同組合的金屬離子。Locke和Carpenter2發(fā)現(xiàn)，在存在同等濃度的石危酸4美和氯化鉀時(shí)，Varidase⑧中鏈道酶組分的DNase活性最大，并且假設(shè)鏈道酶有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，這也是研究幼蟲DNase的一個(gè)領(lǐng)域。為了評(píng)估產(chǎn)生的寡核苷酸是否有調(diào)節(jié)作用，研究幼蟲DNase降解的細(xì)菌DNA對(duì)不同類型細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的影響，也是有意義的?？傊?，這些初步研究和經(jīng)證實(shí)的幼蟲排泄/分泌產(chǎn)物的DNase活性提出了更多的可能機(jī)制，它們有助于解釋蛆為何能夠如此成功地對(duì)慢性傷口清瘡、清潔和促進(jìn)愈合。這種DNase活性是陽(yáng)離子依賴性的，在離子螯合劑EDTA存在下，較標(biāo)準(zhǔn)DNase具有更大的回復(fù)性并保持DNase活性，并且在離子濃度增加的情況下，比用于清潔化膿性傷口的Varidase(鏈激酶-鏈道酶藥物)中鏈道酶的DNase活性更強(qiáng)。因此，可以清楚看到，這種被鑒定的DNase活性，是ES促進(jìn)傷口愈合眾多作用中的又一種重要作用。實(shí)施例2絲光綠蠅ES的脫氧核糖核酸酶(DNase)活性如圖2和圖10所示，發(fā)明人已經(jīng)確定了ES的DNase活性。圖2顯示ES的非變性DNA/甲基綠底物聚丙烯酰胺凝膠電泳。凝膠用溴乙錠復(fù)染，第3泳道的暗區(qū)就是DNA經(jīng)蛆分泌物的核酸酶活性消化后的產(chǎn)物l.預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)品(分子量用kDa表示)。2.緩沖液對(duì)照。3.ES(13ng)。圖10是大腸桿菌(E.co/z')DNA的瓊脂糖凝膠電泳.用溴乙錠染色DNA帶。1.100bp標(biāo)準(zhǔn)品(示出堿基對(duì)數(shù)目)。2.只有co//DNA(l|ig)。3.五.co//DNA(lpg)和ES(7.5pg/ml)。4.co//DNA(lpg)+ES(7.5|ig/ml)+5mMEDTA。這是令人感興趣的，因?yàn)镈Nase可以降解失活組織中的游離DNA，從而減少滲出液的粘性，有助于傷口清創(chuàng)。這種DNase活性在中性pH環(huán)境中最佳(圖11)，可被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制(圖4)，表明這種活性是金屬離子依賴性的。圖11是在37。C,含或不含0.02pg/mlES的一定pH值的緩沖液中孵育10m后，co//DNA(每泳道0.5ng)的瓊脂糖16凝膠電泳圖。溴乙錠染色DNA帶。對(duì)照l(shuí).未經(jīng)處理的DNA;2.、3.、4.無(wú)ES,緩沖液pH值分別為4.0、7.0、IO環(huán)境下的DNA帶。標(biāo)準(zhǔn)為100bp標(biāo)準(zhǔn)品(示出堿基對(duì)數(shù)目)。pH值為5.0-8.5時(shí)DNase均有活性，pH值為7.0時(shí)活性最佳。圖4是￡.co//DNA(每泳道lpg)的瓊脂糖凝膠電泳，條件分別是含或不含7.56pg/mlES(ES未經(jīng)處理或預(yù)先暴露于過(guò)量3倍的、固定在4%交聯(lián)珠瓊脂糖上大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)中)，含或不含與ES等體積的5mMEDTA或PBS(未經(jīng)處理或預(yù)先暴露于3倍至過(guò)量的固化STI中)，37。C孵育20m。溴乙錠染色DNA帶。標(biāo)準(zhǔn)為100bp標(biāo)準(zhǔn)品(示出堿基對(duì)數(shù)目)。經(jīng)STI處理的ESDNase活性不受影響，還有可能提高(注意凝膠底部模糊帶量減少，表明去除ES中絲氨酸蛋白酶活性導(dǎo)致小DNA片段降解增加)。ESDNase不是一種絲氨酸蛋白酶，因?yàn)閷S預(yù)先暴露于固化的大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)并不能抑制其活性(圖4)。事實(shí)上，STI處理會(huì)導(dǎo)致酶活性的輕樣"曾加。接下來(lái)我們對(duì)比一下ESDNase活性和市售的DNaseI制劑的活性。圖12顯示經(jīng)預(yù)先暴露于指定溫度30分鐘后冷卻的ES或市售DNase作用，37。C孵育24小時(shí)以上，DNA-甲基綠復(fù)合物的降解情況。對(duì)比預(yù)先經(jīng)4。C孵育的ES或DNase活性，結(jié)果用平均DNase活性±1SD(n二3)表示。如圖12所示，溫度為20-40。C時(shí)，ESDNase抵抗性更強(qiáng)，該溫度范圍與傷口的溫度范圍相當(dāng)。此外，我們有結(jié)果顯示，與市售的DNase相比，ESDNase不易4皮乙二胺四乙酸(EDTA)抑制(圖13)。圖13顯示在37。C,有無(wú)5mMEDTA條件下，經(jīng)ES或DNase作用一段時(shí)間后，DNA-曱基綠復(fù)合物的降解情況。630nm吸光度減少表明復(fù)合物降解。結(jié)果以平均吸光度士1SD0=3)表示。通過(guò)比較有關(guān)出版物也表明，與Varidase相比，ESDNase不易被高濃度Mg"抑制，Varidase是一種市售的鏈激酶-鏈道酶清創(chuàng)藥(圖14)。圖14顯示lpg/mlES和圖中所示的鎂離子濃度下，37。C孵育19小時(shí)，DNA甲基綠的降解情況。在孵育時(shí)間(0小時(shí)-19小時(shí))結(jié)束后，測(cè)量630nm波長(zhǎng)吸光度的改變作為結(jié)果。吸光度的改變?cè)酱?，DNA-曱基綠復(fù)合物的降解越多。如圖14中的插圖(低離子濃度區(qū)域的放大)所示，低Mg"濃度輕微增加ESDNase活性。離子濃度高于O.lmM時(shí)，其影響很小，在離子濃度較高時(shí)，DNase活性僅有輕微減少。圖1中把這些結(jié)果和LockeWa/(2002)2的結(jié)果比較，可以看到當(dāng)Mg2+濃度高于0.06mM時(shí)，Varidase的活性;陂強(qiáng)烈抑制。發(fā)明人也有初步結(jié)果顯示ESDNase對(duì)高濃度的Ca"和Na+也有較高的回復(fù)性。這些結(jié)果表明，與市售制品相比，ESDNase活性對(duì)金屬離子濃度的改變有更強(qiáng)的抵抗力。實(shí)施例3進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)以鑒定并表征核酸酶，尤其是來(lái)自幼蟲提取物的DNass。幼蟲提取物的制備制備絲光綠蠅3齡(3"instar)幼蟲的組織勻漿。組織勻漿用緩沖液(如磷酸鹽緩沖液)稀釋，離心，提取可溶性蛋白。吸取上清，用作蛆的提取物。檢測(cè)DNase活性采用SDS-PAGE底物凝膠方法;險(xiǎn)測(cè)DNase活性，在溶解的SDS-PAGE凝膠中加入小牛胸腺DNA,濃度為4mg/ml。按上述方法制備的3齡蛆提取物預(yù)先在非還原性標(biāo)本緩沖液(0.1MTris-HCl,10%甘油，4。/。SDS,0.04%溴酚藍(lán)，pH6.8)中，37。C孵育30分鐘，然后加載到底物凝膠中。電泳(20mA/膠)后的凝膠用2.5%Triton洗(30分鐘)，再水洗(30分鐘)。為消化DNA，將電泳后的凝膠置于含有7.5mM氯化鎂的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，37。C孵育過(guò)夜。最后，用5pg/ml的溴乙錠染色，在紫外透射儀下觀看(圖15A)。檢測(cè)蛋白用SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)蛋白，0.1%考馬斯亮藍(lán)R250染色，25%曱醇、10%醋酸脫色，直到蛋白條帶顯現(xiàn)(圖15B)。圖15顯示絲光綠蠅提取物DNase活性的DNA底物(圖版A)和蛋白(圖版B)分析結(jié)果。脫氧核糖核酸酶典型的降解產(chǎn)物大約在35-45kDa(圖版A)。然而，在該區(qū)域^[艮少看到相應(yīng)的蛋白(圖版B)。在絲光綠蠅分泌物中也存在類似的情況。DNase活性的純化。LockeetaP嘗試描述DNase的純化。如上述制備方法，提取3.5克3齡蛆的組織勻漿，加入15ml低鹽緩沖液(50mMNaCl,lmMEDTA,lMmDTT,10%甘油，0.1mg/mlBSA,20mMTris,pH8.1)中，離心U3000g,IO分鐘)，22pM濾器過(guò)濾上清。先用低鹽緩沖液平衡DNA纖維素柱(Amersham公司)，然后將蛆提取物過(guò)DNA纖維素柱。低鹽緩沖液流洗DNA纖維素柱，至流出液280nm吸光度值小于零。高鹽緩沖液(2MNaCl，lmMEDTA,lmMDTT,10°/。甘油，0.1mg/mlBSA,20mMTris,pH8.1)洗脫結(jié)合蛋白，每管收集lml，測(cè)各管280nm吸光度值，并將洗脫的峰值蛋白用PBS透析。DNA底物凝膠電泳分析原材料和洗脫蛋白的脫氧核糖核酸酶活性(圖16A),SDS-PAGE電泳分析原材料和洗脫蛋白的蛋白質(zhì)含量(圖16B)。圖16顯示經(jīng)DNA纖維素柱純化后，絲光綠蠅提取物DNase活性的DNA底物(圖版A)和蛋白質(zhì)(圖版B)分析。經(jīng)DNA纖維素柱洗脫后，DNase降解產(chǎn)物約在45kDa(圖版A),并且與考馬斯亮藍(lán)染色的相同分子量的蛋白條帶相符(圖版B)。純化的絲光綠蠅脫氧核糖核酸酶對(duì)傷口DNA的消化用Sigma公司的基因組DNA提取試劑盒提取未愈合焦痂創(chuàng)面的基因組DNA。取絲光綠蠅提取物經(jīng)DNA纖維素柱純化后的DNAl和2pg,與大約0.5pg純化的DNase37。C共同孵育l小時(shí)。消化產(chǎn)物跑1°/。瓊脂糖凝膠電泳(圖17),溴乙錠染色，如前所述。圖17顯示經(jīng)純化的絲光綠蠅DNase作用后，未愈合焦枷創(chuàng)面的DNA消化情況。純化的絲光綠蠅DNase的二維凝膠分析經(jīng)DNA纖維素柱洗脫的脫氧核糖核酸酶約100pg加于第一維等電聚焦帶中，該等電聚焦帶含有固定的pH梯度(3-10)。我們使用Biorad公司的蛋白等電聚焦試劑盒，按照廠家說(shuō)明書進(jìn)行蛋白條帶的等電聚焦。對(duì)DNase活性進(jìn)行等電聚焦后，用DNA底物凝膠電泳(圖18A)和如前所述的非還原性SDS-PAGE電泳(圖18B)分析條帶的蛋白質(zhì)譜。圖18顯示了絲光綠蠅提取物的DNase活性經(jīng)DNA纖維素柱純化和二維電泳后，其DNA底物(圖版A)和蛋白(圖版B)分析結(jié)果。同樣，DNase活性與分子量約為45kDa的蛋白相關(guān)聯(lián)(圖版A),并且與考馬斯亮藍(lán)染色的相同分子量的蛋白斑點(diǎn)相應(yīng)(圖版B)。對(duì)該斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析測(cè)序，結(jié)果如下。序列分析質(zhì)譜分析得到7個(gè)多肽序列LLEYLSMR(SEQIDNO:l)SFDDTLDMLK(SEQIDNO:2)SYEYLLLATHFNSYQK(SEQIDNO:3)SLGNPELPTEWLDLR(SEQIDNO:4)ELDASYQYLAMHK(SEQIDNO:5)VFVNSGTSLMDVR(SEQIDNO:6)ANFNVVHESS(SEQIDNO:7)LLEYLSMR(SEQIDNO:1)和SLGNPELPTEWLDLR(SEQIDNO:4)與舌蠅(刺舌蠅G/c^/"amomY(my)的部分鐵蛋白重鏈有高度同源性。絲光綠錄刺舌蠅絲光綠蠅刺舌蠅絲光綠蠅刺舌蠅絲光綠蠅刺舌蠅絲光綠竭刺舌蠅------------------------SLGNPELPTEWLDLR-----------M腦JVTLCIUWGSQT.VHGEMKCS:tG匿丄PTEW:iD;LRGEC:LKAMRIXU--------------------------------------------LLEYIiSQKE皿SYTYLAM園FSRDT麗PGFAEHE，F(xiàn)KAAKEERQHGAKLJEYLSMR------------------------------------------------MRGQl,TDDVTDL麗PTVSKHEWSSGTEALEDALRLETDVTKSIPJOilOTCERKHNY狐VDWLTGVYLEEQLHG，LAGKISTLKKMM畫GGLGEFLFDKELSYEYLLLATHFNSYQK(SEQIDNO:3)與刺舌蠅和果蠅(Drosophila)的部分鐵蛋白輕鏈有非常高的同源性?！熹涗浹u錄MKFLIFVAIXAS:;—CVLLKAESVCHNNV，濕CS'reTLSC;PSICN肌'GGMKLLVAFJU,IAS";H2A-EEEYCHNSV:"'ACSSSTTSGNSICNARFA;:;萊蠅------------------SYSYLUATHFMS耶----------------!ISHVEPEl,卵rNSHLTK雄m丄ATHn還卿FPGFC!Kli耶I^DRSIgHVt:PF,VQAYI卿I^KSYF'YU,:UVi:HR欲',RPGEWL耶I'SDKS製sF雨I匿KGLT跳GKA闘T則:SPASVST鵬RIXVDEULSI房，F(xiàn)DD'TUKQITKSGGIVDFNTP.HESPASVSTCiRPTIiEVDELHSLALAlXg錄繩製錄隨，TGATHI:HT腿HAT::R--DPSMAHY隨EYI,Ci,、DSVRKLSGY絲光綠蠅s去遽目前，所用的數(shù)據(jù)庫(kù)里沒有與SFDDTLDMLK(SEQIDNO:2)同源性強(qiáng)的序列22,與其最接近的是DNA曱基化酶。ELDASYQYLAMHK(SEQIDNO:5)、VFVNSGTSLMDVR(SEQIDNO:6)和ANFNVVHESS(SEQIDNO:7)似乎和數(shù)據(jù)庫(kù)里任何已知的蛋白都沒有明確的同源性，包括已知的核酸酶序列，因此，這些序列似乎是一些新的核酸酶序列，有待于確定并列入昆蟲蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>70」ShermanRA,HallMJR，ThomasS.Medicinalmaggots:Anancientremedyforsomecontemporaryafflictions.2000,Annualreviewofentomology,45，55-81.11)MumcuogluKY,IngberA,GileadL,StESsmanJFriedmannR,SchulmanH，BichucherH,Ioffe-Uspensky,MillerJ,GalunRetal.Maggottherapyforthetreatmentofintractablewounds.1999,PharmacologyandTherapeutics,623-627BeasleyWD,HirstG,MakingamealofMRSA-theroleofbiosurgeryinhospitalacquiredinfection.2004,Journalofhospitalinfection,56,6-9."JChambersL,WoodrowS,BrownAP,HarrisPD,PhillipsD,HallM，ChurchJCT,PritchardDI.DegradationofextracellularmatrixcomponentsbydefinedproteinasESfromthegreenbottlelarvaLuciliasericatausedfortheclinicaldebridementofnon-healingwounds.BritishJournalofDermatology,2003，148,14-23."」BexfieldA,NigamY，ThomasS,RatcliffeNA,Detectionandpartialcharacterisationoftwoantibacterialfactorsfromtheexcretions/secretionsofthemedicinalmaggotZvM"7/afsm'catoandtheiractivityagainstmethicillin-rESistanti57ap/2>7ococaawrei^.2004,MicrobESandinfection"」HorobinAJ,ShakESheffKM,WoodrowS,RobinsonC,PritchardDI.Maggotsandwoundhealing:aninvEStigationoftheeffectsofsecretionsfromLuciliasericatalarvaeuponinteractionsbetweenhumandermalfibroblastsandextracellularmatrixcomponents.2003,BritishJournalfDermatology,148,923-933.16)PullenR,PoppR,VolkersP,FusgenI.Prospectiverandomizeddouble-blindstudyofthewounddebridingeffectsofcollagenaseandfibrinolysin/deoxyribonucleaseinprESsureulcers.AgeandAgeing,2002,31,126-130.17)ChurchJC(2001)Larvalinterventioninthechronicwound.EWMA1C2):10-13.18)HorobinAJ,ShakESheffKM,PritchardDI(2005)Maggotsandwoundhealing:aninvEStigationoftheeffectsofsecretionsfromi腦7/asm'c齒23larvaeuponthemigrationofhumandermalfibroblastsoverafibronectin-coatedsurface.WoundRepairandRegeneration13(4):422-433.19)Locke,I.C.,Cox,S.F.andCarpenter,B.G.1997,PurificationofaStreptococcaldeoxyribonucleasebyaffinitychromatographybasedonaDNA-cellulosematrix."JournalofChromatographyA788:75-80.20)Whiting,R.F.,Wei,L.andStich,H.F.1981.Chromosome-damagingactivityofferritinanditsrelationtochelationandreductionofiron.CancerRESearch.41(5):1628-36.21)Tovokuni,S.andSagripanti,J丄.1992.Iron-mediatedDNAdamage:sensitivedetectionofDNAstrandbreakagecatalyzedbyiron.JournalofInorganicBiochemistry.47(3-4):241-8.22)AltschulS.F.,MaddenT丄.，SchafferA.A.,ZhangJ.,ZhangZ.,MillerW.andLipmanD丄1997.GappedBLASTandPSI隱BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRESearch.25:3389-3402.權(quán)利要求1.一種從昆蟲幼蟲分離的多肽或其合成的類似物，所述多肽或類似物具有降解、變性、切割或剪切核酸的能力。2.根據(jù)權(quán)利要求l的多肽，其中幼蟲是絲光綠蠅的幼蟲。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽，其中多肽分離自昆蟲幼蟲的排泄/分泌物。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多肽，其中核酸是DNA。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽，其中多肽降解原核和真核核酸。6.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的多肽的核酸。7.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的多肽IXEYLSMRSFDDTLDMLKSYEYLLLATHFNSYQKSLGNPELPTEWLDLRELDASYQYLAMHKVFVNSGTSLMDVRANFNVVHESS8.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的多肽的SEQIDNO:1—7的序列。9.根據(jù)權(quán)利要求8的多肽，其中多肽包含SEQIDNO:1-7的所有序列。10.根據(jù)權(quán)利要求9中的多肽，其中序列按數(shù)字順序排列。11.一種核酸酶，其由前述任一權(quán)利要求的多肽編碼。12.—種鐵蛋白，其由前述任一權(quán)利要求的多肽編碼。13.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的多肽，其用于治療或預(yù)防感染或治療傷口。14.一種藥物組合物，其包含前述任一權(quán)利要求的多肽。,其中多肽降解細(xì)菌和哺乳動(dòng)物,其中多肽至少包含下列序列之(SEQIDNO:l)(SEQIDNO:2)(SEQIDNO:3)(SEQIDNO:4)(SEQIDNO:5)(SEQIDNO:6)(SEQIDNO:7)。,其中多肽包含兩個(gè)或兩個(gè)以上15.—種敷料，其摻入前述任一權(quán)利要求的多肽。16.前述任一權(quán)利要求的多肽在輔助常規(guī)抗生素治療感染中的用途。17.權(quán)利要求16的用途，其中感染是全身性的或局部的。全文摘要本發(fā)明涉及可從昆蟲幼蟲(例如絲光綠蠅)獲得的多肽，其具有核酸酶活性，能夠降解、變性、消化、切割或剪切核酸，例如DNA。文檔編號(hào)C12N15/09GK101473034SQ200780022415公開日2009年7月1日申請(qǐng)日期2007年4月13日優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日發(fā)明者A·J·霍羅賓,A·布朗,D·I·普里特查德申請(qǐng)人:英國(guó)國(guó)防部