專利名稱：阿爾茨海默病進(jìn)展的生物標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及組織樣品的體外分析檢驗(yàn)，更具體地涉及富含 亮氨酸重復(fù)序列激酶2 (LRRK2)基因的遺傳多態(tài)性方面。
背景技術(shù)：


圖1描述了 LRRK2蛋白的結(jié)構(gòu)和兩種常見LRRK2多態(tài)性 (T1602S和T2352M )的位置。
具體實(shí)施例方式輕度認(rèn)知損害(MCI)患者逸艮為阿爾茨海默病的3-4年的研究數(shù) 據(jù)用于調(diào)查兩種常見LRRK2多態(tài)性T1602S和T2352在阿爾茨海默病進(jìn) 展比例上的作用。為了發(fā)逸該研究成果，進(jìn)一步檢測了參與另一個研究的 安慰劑處理的阿爾茨海默患者在6個月時間里這兩種常見LRRK2多態(tài)性 與其認(rèn)知能力之間的關(guān)聯(lián)性。發(fā)現(xiàn)LRRK2-T1602S與輕度認(rèn)知損害轉(zhuǎn)變?yōu)榘柎暮Ｄ★@著相 關(guān)。TT基因型的輕度認(rèn)知損害患者轉(zhuǎn)變?yōu)榘柎暮Ｄ〉娘L(fēng)險較大。 LRRK2- T2352也顯示了轉(zhuǎn)變?yōu)榘柎暮Ｄ〉内厔?。CC基因型的輕度認(rèn) 知損害患者傾向于皿為阿爾茨海默病。類似于APOE-E4等位基因，在 BuChE-K變體存在下，LRRK2騰T1602S與LRRK2畫T2352顯示出與從輕 度認(rèn)知損害轉(zhuǎn)變?yōu)锳D的比例更大的相關(guān)性。人LRKK2基因(SEQ ID NO: 1)位于染色體12ql2的PARK8 基因座上。該基因具有多個結(jié)構(gòu)域。LRKK2蛋白(SEQIDNO: 2)是受 體相互作用蛋白質(zhì)(RIP)激酶。G2019S突變是最常見的LRRK2致病突 變(5-6%的常染色體顯性和~ 1。/。的M遲發(fā)性病例)。G2019S突變位于 LRKK2基因的激酶結(jié)構(gòu)域。圖1示出LRRK2蛋白結(jié)構(gòu)和另外兩種常見多態(tài)性的位置。重點(diǎn)研 究多態(tài)性T1602S和T2352M，因?yàn)?1)它們是常見的多態(tài)性；(2 )它們 是錯義的多態(tài)性。較小等位基因頻率如下T1602S = 30%; T2352M = 34%。該多態(tài) 性引起的氨基酸改變?nèi)缦耇1602S - Thr -> Ser( 1602 A>T); T2352M - Thr -> Met (2352 OT )。才艮據(jù)連鎖不平衡(LD)分析，T1602S和T2352M 存在強(qiáng)連鎖不平衡(D， =0.979)。
14應(yīng)理解，本發(fā)明的某些方面、模式、實(shí)施方式、改變和特征在下 述內(nèi)容中作了不同程度的詳細(xì)描述，以提供對本發(fā)明的本質(zhì)理解。本發(fā)明 的多個方面涉及診斷/治療診斷方法和試劑盒，其使用本發(fā)明的LRRK2突 變來鑒定易患病個體或才艮據(jù)藥物反應(yīng)、副作用或最優(yōu)藥物劑量對個體進(jìn)行 分類。其它方面，本發(fā)明提供了用于驗(yàn)證化合物的方法和用于儲存及分析 與本發(fā)明LRRK2突變相關(guān)的數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。因此，下面給出多種說 明這些方面的具體實(shí)施方式
。
定乂本文所使用的術(shù)語"基因型"指個體同源染色體對基因座上的一 或多個多態(tài)性位點(diǎn)處發(fā)現(xiàn)的不定型5，-3，核苷酸對序列。在此使用的基因型 包括全基因型和/或亞基因型。
24本文所使用的術(shù)語"基因座"指與基因(尤其指LRRK2基因)或 物理或表型特征對應(yīng)的染色體或DNA分子上的位置。本文所使用的術(shù)語"多態(tài)性位點(diǎn)"指在群體內(nèi)的基因座中在該處 發(fā)現(xiàn)至少兩個可改變序列的位置，其中最頻繁出現(xiàn)的有不超過99%的頻 率。本文所^:用的向受試者或患者施用藥劑或藥物包括自體施用和由 他人施用。還應(yīng)理解所述醫(yī)學(xué)狀況治療或預(yù)防的多種才莫式旨在意^^未著"實(shí) 質(zhì)上的"，其包括了全部也包括并非完全的治療或預(yù)防，其中得到了一些 生物或醫(yī)學(xué)相關(guān)的結(jié)果。
ZJ /^0源儲—個實(shí)施方式中，LRRK2調(diào)節(jié)劑可以是LRRK2蛋白(SEQ ID NO: 2)的雜環(huán)化合物抑制劑。其它實(shí)施方式中，雜環(huán)化合物可以是3-[1- (3， 5-二甲基-1H-p比咯 -2-基)畫甲基畫(Z) -亞基畫5-甲氧基-l，3-二氫J引哚隱2畫酮；3-[1- (1H 吲咪■2-基 ) -甲- ( Z) -亞基-5-甲氧基-1，3-二氫-丐|哚-2-酮；5-甲氧基-3-[1- (4，5，6，7-四氫-lH-吲哚-2-基)-甲-(Z)-亞基卜1,3-二氫-丐|哚-2-酮；3-[1- (3，5-二甲 基畫lH-吡咯畫2畫基)國甲-(Z)畫亞基]-5-曱氧基畫2-氧代畫2，3-二氫-丐l哚-4畫甲酸 甲酯；3畫[1畫(3，5-二甲基畫lH-吡咯-2-基)-甲-(Z)國亞基卜5畫曱氧基畫2畫氧代 -2，3-二氫J引咮-4-甲酸乙酯；3-[1- (3,5-二甲基-lH誦吡咯畫2-基)-甲-(Z)畫 亞基]-5-甲氧基-2-氧代-2，3-二氫-丐l咮-4-曱酸甲酯；或3-[l-( 3，5-二甲基-lH-吡咯-2-基) 隱甲-(Z)畫亞基-5畫甲氧基-2畫氧代-2，3-二氫畫丐1咮-4陽曱酸?；蛘?，雜環(huán)化合物可選自可以評估LRRK2調(diào)節(jié)劑的藥理性質(zhì)，如在藥物Pull-Down實(shí)驗(yàn) 中進(jìn)行評估。上述雜環(huán)化合物可以在濃度低于20jiM時在Pull-Down實(shí)驗(yàn) 中顯示出活性?；衔?2顯示的ICso值約為lnM。[421LRRK2基因(SEQ IDNO: 1)可在從輕度認(rèn)知損害逸艮為阿爾 茨海默病和從中度阿爾茨海默病進(jìn)展為更嚴(yán)重的阿爾茨海默病中發(fā)揮作 用。因此，LRRK2調(diào)節(jié)劑可以用來治療MCI患者或阿爾茨海默病患者， 以減緩從輕度認(rèn)知損害向阿爾茨海默病的*或從中度阿爾茨海默病向更 嚴(yán)重阿爾茨海默病的*。
差萄^W^^W蔞;C和或在SNP與特定表型間的相關(guān)性并不必然地表示或需要該SNP是該表 型的致因。相反，這種關(guān)聯(lián)可能僅僅歸因于SNP和那些實(shí)際造成給定表型 的遺傳因子之間的基因組鄰近性，以致SNP和所述遺傳因子緊密連鎖。換 句話說，SNP可能與"真正的"功能性變體連鎖不平衡("LD，，)。在位 于基因組兩個不同位置上的等位基因的關(guān)聯(lián)比預(yù)期的高時，則存在LD(又 名等位基因關(guān)聯(lián))。因此SNP由于其與引起特定表型的突變鄰近可以做為 有價值的標(biāo)記。在描述本發(fā)明多態(tài)性位點(diǎn)時，為了方便以基因的正義鏈作為參照。 然而，正如熟練的技術(shù)人員所理解的，包含基因的核酸分子可能是互補(bǔ)的 雙鏈分子，因而述及正義鏈上特定位點(diǎn)也指與之互補(bǔ)的反義鏈上的相應(yīng)位 點(diǎn)。也就是說，可參照任一鏈上相同的多態(tài)性位點(diǎn)，同時可以將寡核苷酸 設(shè)計(jì)為和含有多態(tài)性位點(diǎn)的靶片段處的任一鏈特異雜交。因此，本發(fā)明還 包括與此處所述基因組變體的正義鏈互補(bǔ)的多核苷酸單鏈。
5TV戶^蔞定和裙迷[47]4艮多不同技術(shù)可以用來鑒定和表征SNP,包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (SSCP)分析，變性高效液相色語(DHPLC)進(jìn)行的異源雙鏈體分析及 直接DNA測序和計(jì)算機(jī)方法。Shi等人，a,Vi. C&附.47:164-172 ( 2001 )。 公共數(shù)據(jù)庫中有很多序列信息。目前最常用的SNP分型方法包括雜交，引物延伸和切割法。每種 方法都必須和適當(dāng)?shù)臋z測系統(tǒng)連接。檢測技術(shù)包括熒光偏振(Chan等人， (7e"o附e及仏9:492-499 (1999 ))、焦磷酸鹽釋放的發(fā)光檢測(焦磷酸測 序)(Ahmadiian等人，^w"/. 5/oc/^附.280:103-10 (2000 ))、基于熒光 共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的切割測試、DHPLC和質(zhì)譜分析(Shi， C7zVi. C7^附. 47:164-172 (2001);美國專利No.6，300,076 Bl)。美國專利No.6,297，018 和No.6，300,063公開了其它檢測和表征SNP的方法。也可用錯配檢測技術(shù)來確定多態(tài)性，其包括但不限于用核糖探針 的RNA酶保護(hù)方法(Winter等人，/Voc. 7Va仗USA 82:7575 (1985); Meyers等人，Sdewce 230:1242 (1985))和識別核酸錯配的 蛋白質(zhì)，如五.mutS蛋白質(zhì)(Modrich P, ^朋J ev 25:229-253 (1991))。或者，變體等位基因可以通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析 (Orita等人，Ge"o附/cs 5:874-879 ( 1989) ; Humphries等人，出自 Mofecw/ar D/flg7i頻's1 6>/ GWi"/c Diseases, R. Elles編著,第321-340頁 (1996 ))或變性梯度凝膠電泳(DGGE ) ( Wartell等人，7V"c/爿"Vfe.
1318:2699-2706( 1990); Sheffield等人，/Voc. TV",/. Sd. USA 86:232-236 (1989))進(jìn)行鑒定。聚合酶介導(dǎo)的引物延伸法也可用于鑒定多態(tài)性。幾 種此類方法已經(jīng)在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中描述，并包括"遺傳比特分析"方法 (WO 92/15712 )和連接酶/聚合酶介導(dǎo)的遺傳比特分析(美國專利 No.5，679，524 )。相關(guān)方法公開在WO 91/02087、WO 90/09455、WO 95/17676 和美國專利No. 5,302,509和5,945,283中。如美國專利No.5,605，798所述， 含有多態(tài)性的延伸引物可通it^譜檢測。另 一種引物延伸方法是等位基因 特異性PCR (Ruafio等人，iVwc/. J"Vfa. 17:8392 (1989 ) ; Ruafio等 人，7V"c/爿"V/s.及m. 19: 6877-6882 (1991) ; WO 93/22456; Turki等人， / C7,Vi. /wv^^. 95:1635-1641 (1995))。另外，可通過用PCT專利申請 WO 89/10414所述的等位基因特異性引物組同時擴(kuò)增多個核酸區(qū)來研究多 個多態(tài)性位點(diǎn)?！獋€實(shí)施方式中，可適用于下述實(shí)施例顯示的結(jié)果，可以在患者 篩查的同時采集患者的血樣并使用如PUREGENETMDNA Isolation Kit (D-50K)提取DNA可以用TaqMan⑧技術(shù)或Third Wave Technologies Invader Assay才支術(shù)進(jìn)4亍基因型分型。
慕裙芬^的卓無型》費(fèi)和差廚型為、型本發(fā)明提供對個體基因進(jìn)行單元型分型和/或基因型分型的方法和 組合物。如本文所使用，術(shù)語"基因型"和"單元型"指分別包含核苷酸 對或核苷酸的基因型和單元型，所述核苷酸對或核苷酸出現(xiàn)在一或多個此 處描述的多態(tài)性位點(diǎn)處，并也可以任選地包括出現(xiàn)在基因上一或多個其它 多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸對或核苷酸。其它多態(tài)性位點(diǎn)可能是現(xiàn)在已知曉的多 態(tài)性位點(diǎn)或隨后發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)。本發(fā)明的基因型分型寡核苷酸可固定于或合成于如微芯片、珠、 玻璃片等的固體表面上。參見例如，WO 98/20020和WO 98/20019。本發(fā)明的基因型分型方法可包括從個體中分離包括目的基因或其 片段的兩個拷貝的核酸混合物，并確定在這兩個拷貝中一或多個多態(tài)性位 點(diǎn)上核普酸對的的特征。熟練的技術(shù)人員很容易理解，個體中基因的兩個 "拷貝"可能是相同的等位基因，或者可能是不同的等位基因。優(yōu)選的具 體實(shí)施方式中，基因型分型方法包括鑒定每個多態(tài)性位點(diǎn)處核苷酸對的特 征。通常，核酸混合物分離自從個體獲得的生物樣品，比如血樣或組織樣 品。合適的組織樣品包括全血、精液、唾液、淚液、尿液、排泄物、汗液、 口腔涂片、皮膚和毛發(fā)。在基因型分型和單元型分型方法中，可通過直接從基因或其片段 的一或兩個拷貝擴(kuò)增包含有多態(tài)性位點(diǎn)的靼區(qū)域，并通過常規(guī)手段對擴(kuò)增 區(qū)域測序來確定核苷酸(或核苷酸對)在多態(tài)性位點(diǎn)處的特征。個體基因 的基因型或單元型也可通過用含有一個或兩個基因拷貝的核酸樣品與核酸 陣列或子陣列雜交來確定，例如公開的PCT專利申請WO 95/11995所述。另外，出現(xiàn)在本發(fā)明任何多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因的特征可通過對 與那些目的位點(diǎn)處于連鎖不平衡的其它多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型分型而間接 地鑒定。如上所述，如果在一個位點(diǎn)處存在的特異變體暗示在第二個位點(diǎn) 處另一變體的存在，那么將這兩個位點(diǎn)稱為是連鎖不平衡的。(Stevens JC， 71^/， Z>/ag. 4: 309-317 (1999))。與本發(fā)明多態(tài)性位點(diǎn)處于連鎖不平衡的多態(tài) 性位點(diǎn)可位于同一基因區(qū)中或其它的基因組區(qū)。其它已知的核酸擴(kuò)增方法可用來擴(kuò)增靼區(qū)域，包括基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò) 增體系(美國專利No.5，130，238; EP 329,822;美國專利No.5，169,766;公 開的PCT專利申請WO 89/06700 )和等溫法(Walker等人，iVoc. 7Va汰/4ow/. 《" USA 89:392-396 (1992))。
爭在差西^^弄^^T核夯^與"^差^^染it靶區(qū)域中的多態(tài)性可在擴(kuò)增前或后用本領(lǐng)域已知的幾種基于雜交的方法之一來檢測。通常利用等位基因特異的寡核苷酸進(jìn)行此類方法。等 位基因特異的寡核苷酸可用作不同的標(biāo)記探針對，其中該探針對的 一 個成 員顯示出完全匹配于耙序列的一個變體，而另外一個成員顯示出完全匹配 于不同變體。 一些實(shí)施方式中，可使用一套等位基因-特異的寡核苷酸或寡 核苷酸對一次檢測一個以上的多態(tài)性位點(diǎn)。優(yōu)選地，當(dāng)與每個待檢測的多
態(tài)性位點(diǎn)雜交時，該套成員的互相之間的溶解溫度在5。C內(nèi)，更優(yōu)選地在 2。C內(nèi)。另 一發(fā)現(xiàn)單元型內(nèi)容與臨床反應(yīng)之間相關(guān)性的方法使用基于g-最小化的最優(yōu)化算法(其中之一是遺傳算法)的預(yù)測模型。參見RJudson， "Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry" 出自 j ev/e將/" Owi/7M她'owfl/ Ore/m'5^v，第十章，KB Lipkowitz & DB Boyd編著(VCH Publishers, New York, 1997 )第1-73頁。模擬退火(Press等人，7Vw eWm/ 及e"]pey /" C: 爿W 5We",折c Q 附/;"ftVig， 第十章 (Cambridge
University Press, Cambridge, 1992)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(E Rich & K Knight, v4fftyZ"'fl//"te///)g^"c，第二版，第十章(McGraw-Hill, New York, 1991)、 標(biāo)準(zhǔn)梯度下降法(Press等人，見上文第十章)，也可以使用其它整體或局 部優(yōu)化方法(見Judson的討論，見上文)。
摔憂試者差^型4'卓倍費(fèi)與治^應(yīng)吝畝^^另一優(yōu)選實(shí)施方式中，目的性狀是患者表現(xiàn)出的對一些治療性治 療的臨床反應(yīng)，如，對藥物靼向的反應(yīng)或?qū)︶t(yī)學(xué)狀況治療性治療的反應(yīng)。為推導(dǎo)出治療的臨床反應(yīng)與基因型或單元型之間的相關(guān)性，從接 受治療的個體群(即下文中的"臨床群")所表現(xiàn)的臨床反應(yīng)中獲得基因 型或單元型的數(shù)據(jù)。這一臨床數(shù)據(jù)可通過分析已經(jīng)在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)的結(jié) 果和/或通過設(shè)計(jì)并進(jìn)行一或多種新臨床試驗(yàn)而獲得。然后分析這些結(jié)果以確定觀察到的多態(tài)性組間臨床反應(yīng)中任何變 異是否是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的?？梢杂玫降慕y(tǒng)計(jì)分析方法描述在L.D. Fisher &
G. vanBelle, 5/os^fl船ft'cs: j M"/itfrfo/0gy 幼e J^a/狄 iSWe"ces
(Wiley-lnterscience， New York, 1993 )。這個分析也包括關(guān)于基因中的哪 些多態(tài)性位點(diǎn)對表型的差異貢獻(xiàn)最為顯著的回歸計(jì)算?！獋€實(shí)施方式中，如首次通過的分析，進(jìn)行Fishers Exact檢驗(yàn)來 評估作為基因型函數(shù)的反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，進(jìn)行此歸屬決定將包括一定程度的不確 定性。因此，將對照組水平的標(biāo)準(zhǔn)偏差用于做出概率確定并且本發(fā)明的方 法可應(yīng)用于很大范圍基于概率的基因型組決定。因此，例如但不限于在一 個實(shí)施方式中，如果測量到的基因表達(dá)產(chǎn)物水平落在任何對照組中值的2.5 標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi)，那么該個體可歸屬于該基因型組。另一個實(shí)施方式中，如 果測量到的基因表達(dá)產(chǎn)物水平落在任何對照組中值的2.0標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi)， 那么該個體可以歸屬于該基因型組。又一個實(shí)施方式中，如果測量到的基 因表達(dá)產(chǎn)物水平落在任何對照組中值的1.5標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi)，那么該個體可 以歸屬于該基因型組。再一個實(shí)施方式中，如果測量到的基因表達(dá)產(chǎn)物水 平落在任何對照組中值的1.0或更低標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi)，那么該個體可以歸屬 于該基因型組。為了推導(dǎo)治療的臨床反應(yīng)以及基因型或單元型之間的相關(guān)性，需 要獲得由接受治療的個體群(下文中稱作"臨M")表現(xiàn)出的臨床反應(yīng) 數(shù)據(jù)?？赏ㄟ^分析已經(jīng)進(jìn)行的臨床試驗(yàn)的結(jié)果獲得該臨床數(shù)據(jù)和/或可通過 設(shè)計(jì)并進(jìn)行一或多種新臨床試驗(yàn)獲得臨床數(shù)據(jù)。在不同對照組中如此測定的基因表達(dá)產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)對照水平將隨之 與給定患者基因表達(dá)產(chǎn)物的測定水平進(jìn)行比較。該基因表達(dá)產(chǎn)物可以是與 特定基因型組相關(guān)的特征mRNA或該基因型組的多肽基因表達(dá)產(chǎn)物。隨后 將根據(jù)測定水平與給定組的對照水平之間的相似程度將患者分類或歸屬于 特定基因型組。
^ f存餘成貞^",,悉^炎拔"鍵本發(fā)明提供用于根據(jù)受試者的遺傳變異類型將其分類的SNP探 針。本發(fā)明的SNP探針是寡核苷酸，其在傳統(tǒng)等位基因識別檢測中辨別 SNP。某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明這一方面的寡核苷酸與SNP核 酸的一個等位基因互補(bǔ)，但與該SNP核酸的任何其它等位基因不互補(bǔ)。本 發(fā)明這一實(shí)施方式的寡核苷酸可以以多種方式在SNP之間進(jìn)行辨別區(qū)分。 例如，在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，合適長度的寡核苷酸將與一個SNP雜交而不與 任何其它的SNP雜交?？墒褂梅派湫詷?biāo)記或熒光分子標(biāo)簽來標(biāo)記寡核苷 酸?；蛘撸线m長度的寡核苷酸能用作PCR引物，其中3，末端的核苷酸 與含有SNP的一個等位基因而非任何其它等位基因互補(bǔ)。在此實(shí)施方式 中，PCR擴(kuò)增的有或無決定了該SNP的單元型。對于基于抗體的試劑盒，該試劑盒可以包括，例如(l)第一抗體， 例如附著在固體支持物上，其結(jié)合對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)記的多肽；和任選地， (2)不同的第二抗體，其與該多肽或第一抗體結(jié)合且綴合有可檢測標(biāo)記。對于基于寡核苷酸的試劑盒，該試劑盒可以包括，例如(l)寡核 苦酸，例如帶有可檢測標(biāo)記的寡核苷酸，其與本發(fā)明標(biāo)記所對應(yīng)的多肽的 編碼核酸序列雜交；或(2)用于擴(kuò)增對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)記的核酸分子的引物 對。試劑盒也可以包括，例如緩沖劑、防腐劑或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。試劑 盒還可以包括用于檢測可檢測標(biāo)記的必需組分，例如酶或底物。該試劑盒 也可以含有一個對照樣品或一系列對照樣品，其能夠進(jìn)行測定并與檢測樣
品相比較。試劑盒中的每個組分可以封閉在單個容器中且所有多個容器可
23以和用于解釋使用該試劑盒進(jìn)行檢測的結(jié)果的說明書一起放在單個包裝 內(nèi)?！矫妫景l(fā)明包括一或多個分離的多核苷酸。本發(fā)明還包括其 等位變體，也就是該分離多核苷酸的天然發(fā)生的可變形式，其編碼與該多 核苷酸所編碼的那些多肽相同、同源或相關(guān)的突變多肽?；蛘?，非天然發(fā) 生的變體可由由本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)或直接合成技術(shù)生產(chǎn)。因此，能夠在低嚴(yán)謹(jǐn)性下與編碼本發(fā)明突變多肽的核酸序列雜交 的核酸序列也認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍。標(biāo)準(zhǔn)分子生物克隆教科書中充分表 4i了才示〉焦嚴(yán)i堇小生^f^。參見例如Mofecw/tff C7ow/"g爿Za6orato/^ Afaw a/ 第二版，Sambrook， Fritsch， & Maniatis編著(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ) ; C7o肌'"g， Fio/M艦s /朋J //， D.TV. Glover編
著(1985 ); O"，"c/eo艦5^te&， M.J. Gait編著(1984); W"c/"c /0;6"V//zWo"， B.D. Hames & S.J. Higgins編著(1984 )。
差^衷這水"f時《在可能以多種方式進(jìn)行生物樣品(例如個體組織或體液)中基因表 達(dá)產(chǎn)物的水平的測定。術(shù)語"生物樣品"旨在包括分離自受試者的組織、 細(xì)胞、生物液體和其分離物，以及存在于受試者中的組織、細(xì)胞和液體。 許多表達(dá)檢測方法使用分離的RNA。對于體外方法，可以使用任何不針對 mRNA分離進(jìn)行選擇的RNA分離技術(shù)從細(xì)胞中純化RNA。參見例如 Ausubd等人編著,C"/r. /VW. Afo/.祝o/. (John Wiley & Sons, New York, 1987-1999)。
24[99]一個實(shí)施方式中，確定耙基因的mRNA表達(dá)產(chǎn)物水平。測定特定 mRNA水平的方法是本領(lǐng)域眾所周知的且包括Northern印跡分析、反轉(zhuǎn) 錄PCR和實(shí)時定量PCR或通過與寡核苷酸陣列或孩t陣列雜交。其它更多 優(yōu)選實(shí)施方式中，可通過測定體液或組織樣品(包括但不限于血液或血清) 中基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)或多肽的水平進(jìn)行表達(dá)水平的測定?？梢允褂帽绢I(lǐng) 域技術(shù)人員公知的技術(shù)容易地加工大量組織樣品，例如，美國專利No. 4,843,155的一步RNA分離方法。測定樣品中與本發(fā)明標(biāo)記相應(yīng)的mRNA水平的替代方法包括核 酸擴(kuò)增的方法，例如通過RT-PCR (美國專利No. 4,683,202提出的實(shí)驗(yàn)性 實(shí)施方式)；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barany等人，iVoc. A^/. Jaw/. USA 88:189-193 (1991 ));自主持續(xù)序列復(fù)制(Guatdli等人，iVoc. iVfl漢Jaw/. S". USA 87: 1874-1878 (1990 ));轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增體系(Kwoh等人，/Voc. TV"http://.
USA 86: 1173-1177 (1989 ) ) ; Q-Beta復(fù)制酶(Lizardi等人， 7^朋/柳6: 1197 (1988 ));滾環(huán)式復(fù)制(美國專利No. 5,854,033 ); 或任何其它核酸擴(kuò)增方法，接著使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)檢測擴(kuò)增 的分子。當(dāng)此類核酸分子以很低數(shù)目存在時，這些檢測方案特別適用于檢測核酸分子。如本文所使用的"擴(kuò)增引物，，定義為可以與基因(分別為正
鏈和負(fù)鏈，或反之亦然)的5，或3，區(qū)退火且在兩者間含有短的區(qū)域的核酸 分子對。通常，擴(kuò)增引物長度為約10-30個核苷酸并位于長度大約50-200 核苷酸區(qū)域的兩側(cè)。實(shí)時定量PCR (RT-PCR)是評估基因(例如本發(fā)明的基因，例 如含有目的SNP和多態(tài)性的那些)表達(dá)水平的一種方法。RT-PCR檢測法 利用RNA反轉(zhuǎn)錄酶催化從RNA鏈(包括mRNA鏈)合成DNA鏈?？商?異性檢測并定量產(chǎn)生的DNA并且這一方法可用于確定特定物種mRNA的 水平。如此4故的一種方法是TAQMAN⑧(PE Applied Biosystems， Foster City, Calif, USA)以及在PCR反應(yīng)期間利用AMPLITAQ GOLDTM DNA 聚合酶的5，核酸酶活性來切割特異形式的探針。這被稱作TAQMAN1, 針。參見Luthra等人，j附./ i^說o/. 153: 63-68 (1998 ) ; Kuimelis等人， 7Vmc/. ^"Vfe Ser. 37: 255-256( 1997 );和Mullah等人，7Vwc/及化
26 (4) :1026-1031 ( 1998))。反應(yīng)期間，探針的切割將報告染料和淬滅 染料分離，導(dǎo)致報告熒光的增加。通過監(jiān)控報告染料熒光的增加直接檢測 PCR產(chǎn)物的累積。Heid等人，Genome Res. 6 (6) :986-994 (1996))。 核酸耙標(biāo)的起始拷貝數(shù)越高，越快地觀察到熒光的顯著增加。參見Gibson, Heid & Williams等人，Genome Res. 6: 995-1001 (1996 )。測量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的其他技術(shù)產(chǎn)生有限復(fù)雜度的限制性片段庫 用于電泳分析，如組合限制性雙酶切和分型引物的方法(見例如EP 0 534858 Al)，或具有最接近于指定mRNA末端位點(diǎn)的選擇限制性片段的方 法(見例如Prashar & Weissman， /Voc. TV"拔Jc^/. 5W. fASJ 93(2) 659-663 (1996))?？梢酝ㄟ^可檢測標(biāo)記的或可以隨后標(biāo)記的探針檢測本發(fā)明基因 編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。對于探針或抗體而言的術(shù)語"標(biāo)記的"旨在包括通
以及通過與直接標(biāo)記的另一試劑反應(yīng)而間接標(biāo)記探針或抗體。間接標(biāo)記的 實(shí)例包括使用熒光標(biāo)記的二抗檢測一抗以及用生物素末端標(biāo)記的DNA探 針以便其可以用熒光標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行檢測。通常，探針是識別所表 達(dá)蛋白質(zhì)的抗體?？梢允褂枚喾N形式來確定樣品是否含有結(jié)合給定抗體的 耙蛋白質(zhì)。用于檢測本發(fā)明的靶多肽的免疫檢測法包括但不限于，例如， 點(diǎn)印跡、Western印跡、蛋白質(zhì)芯片、竟?fàn)幮院头蔷範(fàn)幮缘鞍踪|(zhì)結(jié)合檢測 法、酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)、免疫組化、熒光活化細(xì)胞分選(FACS ) 和其它常用的及科學(xué)和專利文獻(xiàn)中廣泛描述的方法，以及許多商業(yè)使用的 方法 熟練技術(shù)人員可以很容易利用已知的蛋白質(zhì)/抗體檢測方法確定細(xì)胞 是否表達(dá)本發(fā)明的標(biāo)記和該特定多tt達(dá)產(chǎn)物在血液或其身體組織中的相 對濃度?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)分離來自個體的蛋白質(zhì)。所 用的蛋白質(zhì)分離方法可以是例3口 Harlow & Lane, Jwft'6oWd'爿IflAomto^ ikffl聰fl/ ( Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988))中所述的那些。此夕卜，可以使用開發(fā)用于生產(chǎn)"嵌合抗體，，的技術(shù)(參見Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 81 : 6851-6855 (1984); Neuberger等人， Nature 312: 604-608( 1984 );和Takeda等人，Nature 314: 452-454( 1985 ))， 該嵌合抗體通過剪接具有合適抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與具有合 適生物學(xué)活性的人抗體分子基因而產(chǎn)生。嵌合抗體是這樣的分子，其中不 同部分來源于不同的動物物種，例如具有鼠單抗來源的可變區(qū)或高變區(qū)和 人免疫球蛋白恒定區(qū)的那些抗體。可以在諸如Western印跡或免疫熒光技術(shù)等方法中使用抗體或抗 體片段來檢測表達(dá)的蛋白質(zhì)。此種應(yīng)用中，通常優(yōu)選將抗體或蛋白質(zhì)固定 到固體支持物上。適合的固相支持物或載體包括任何能結(jié)合抗原或抗體的 支持物。熟知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡 聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和改良的纖維素、，聚丙烯酰胺、輝長巖和磁鐵 石。通過構(gòu)建微陣列可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的全基因組(即蛋白質(zhì)組)監(jiān)控， 其中結(jié)合位點(diǎn)包括，對多種由細(xì)胞基因組編碼的蛋白質(zhì)物質(zhì)特異的固定抗 體，優(yōu)選單克隆抗體。優(yōu)選地，對于編碼蛋白質(zhì)的大部分，或至少對于與 檢測或確認(rèn)目的生物網(wǎng)絡(luò)模型相關(guān)的蛋白質(zhì)存在抗體。如上所指出，用于 制造單克隆抗體的方法是眾所周知的。參見例如Harlow & Lane, J丄ff6om,， Ato柳/ ( Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988 ))。優(yōu)選的實(shí)施方式中，針對基于 細(xì)胞的基因組序列設(shè)計(jì)的合成肽片段產(chǎn)生單克隆抗體。用該抗體陣列，來 自細(xì)胞的蛋白質(zhì)與該陣列接觸并且用本領(lǐng)域已知的檢測法測定其結(jié)合。
/農(nóng)^^W: 二舉凝應(yīng)^泳 二維凝膠電泳是本領(lǐng)域眾所周知的且通常包括沿第一方向的等 電聚焦接著是沿第二方向的SDS-PAGE電泳。參見例如Hames等人，Ge/ ^7e"ra/^res/s" /Vote,'"*1: iVcr"/cfl/々/ /Y flc/r (IRL Press, New York, 1990) ; Shevchenko等人，iV",/.Sc/. USA 93: 14440-14445 (1996) ; Sagliocco等人，12: 1519-1533 (1996)和Lander, 274: 536-539 (1996 )。
顛斜力廣粉浙可以使用質(zhì)鐠分析技術(shù)(MS)確定靶多肽的特征以及表達(dá)水平。 基于MS的分析方法學(xué)可用于分析分離的靶多肽以及分析生物樣品中的靶 多肽。用于分析靶多肽的MS形式包括電離(I)技術(shù)，例如但不限于基質(zhì) 輔助激光解吸(MALDI)、連續(xù)或樂Pt電噴射電離(ESI)和相關(guān)方法， 例如離子噴射或熱噴射，以及massive cluster impact (MCI)。該離子源 可以與檢測形式相匹配，包括線性或非線性反射式飛行時間(TOF)、單極或多極、單或多個扇形磁場、傅里葉變換離子回旋共振(FTICR)、離 子阱及其組合，例如離子阱/TOF。對于電離，可以使用多種基質(zhì)/波長組 合(例如基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI))或溶劑組合(例如ESI)。對于質(zhì)i普(MS)分析，可以將靶多肽溶解在適合的溶液或試劑 系統(tǒng)。溶液或試劑系統(tǒng)的選擇(例如有機(jī)或無機(jī)溶劑)將取決于靶多肽的 性質(zhì)和所執(zhí)行的MS類型，以及基于本領(lǐng)域眾所周知的方法。例如對于 MALDI參見Vorm等人，Oie附.61 : 3281 (1994);和對于ESI見 Valaskovic等人，爿w"/. C&附.67: 3802 (1995 )。肽的MS也描述于例如 PCT國際申請No. WO 93/24834和美國專利No. 5，792，664。選擇使氣化過 程中引入的能量分解靶多肽的風(fēng)險最小化的溶劑。例如，通過在基質(zhì)中包 埋樣品可以實(shí)現(xiàn)靼多肽分解風(fēng)險的降低。適合的基質(zhì)可以是有機(jī)化合物，
例如糖(例如戊糖或己糖)或多糖例如纖維素。該化合物熱分解為C02和
H20以便不形成可以導(dǎo)致化學(xué)反應(yīng)的殘留物。基質(zhì)也可以是無機(jī)化合物， 例如銨的硝酸鹽，其分解后基本上無殘留。這些和其它溶劑的使用是本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的。參見例如美國專利No. 5,062,935。電噴霧MS描述于 Fenn等人，/ C/^附.88: 4451-4459 (1984 );和PCT申請No. WO 90/14148;且當(dāng)前的應(yīng)用在綜述中進(jìn)行總結(jié)。參見Smith等人，Jw"/. C7^附. 62:882-89 (1990);和Ardrey， 5^"r仍o /^ 4: 10-18 (1992)。
U8由MS確定的靶多肽的質(zhì)量可以與相應(yīng)的已知多肽質(zhì)量相比較。 例如，當(dāng)靶多肽是突變蛋白質(zhì)時，相應(yīng)的已知多肽可以是相應(yīng)的非突變蛋 白質(zhì)，例如野生型蛋白質(zhì)。用ESI確定飛摩爾量樣品的分子量是4艮精確的， 因?yàn)榇嬖诙鄠€離子峰，其全部可以用于質(zhì)量計(jì)算。例如已經(jīng)使用ESI MS (Valaskovic等人，Science 273: 1199-1202 (1996 ))和MALDI MS ( Li 等人，J. Am. Chem. Soc, 118: 1662-1663 (1996 ))檢測了阿托摩爾水平的 蛋白質(zhì)。
^W勿邀^席吸,i:d/)將對537位受試者的3-4年研究的逸艮為阿爾茨海默病數(shù)據(jù)用于 調(diào)查兩種LRRK2常見多態(tài)性對可能進(jìn)展為AD的影響。使用艾斯能 (InDDex)延遲,皮診斷為阿爾茨海默病的研究是安慰劑對照的、4年縱向 研究以評價Exelon⑥在輕度認(rèn)知損害(MCI)的個體中的效力。對患有輕 度認(rèn)知損害并給予多種劑量的Exelon ( rivastigmine )或給予安慰劑的患 者進(jìn)行臨床試驗(yàn)以及對于他們隨后轉(zhuǎn)變成阿爾茨海默病(AD)的患者進(jìn)行 臨床試驗(yàn)。FeldmanH等人，Neurology 62: 1199-1201 (2004)。該試驗(yàn)具 有任選的DNA收集組分。為了證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步在6個月的時間內(nèi)，于參加IDEAL 研究的178名安慰劑處理的AD患者中檢測這一常見LRRK2多態(tài)性和認(rèn) 知能力間的相關(guān)性。在IDEAL (AD )研究中，LRRK2多態(tài)性T1602S顯 示與在MCI研究中觀察到的相關(guān)性相同的傾向。具有T1602S TT基因型 的阿爾茨海默病患者在6個月中其認(rèn)知能力趨于更快速衰退，尤其是在 BuChE-K變體存在時。此外，在InDDeX研究中，T2352的CC基因型(或Thr/Thr) 顯示出與從輕度認(rèn)知損害轉(zhuǎn)變成阿爾茨海默病的較高比例的相關(guān)性傾向。 (表2)
表2、從MCI轉(zhuǎn)變?yōu)锳D的比例與T2352M基因型相關(guān) LRRK2基因型(T2352M)
Thr/Thr (n=188)
21.81 78.19
女Cox比例風(fēng)險。模型包括作為共變量的年齡、性別和教育年限。 **對轉(zhuǎn)變時間的Log-rank檢驗(yàn)。在具有重新測序確認(rèn)結(jié)果的患者篩選中發(fā)現(xiàn)對于帕金森病 (PD) : 483位患者中有6位攜帶G2019S突變(1.24%)。對于有癡呆 的帕金森病(PDD) , 391位患者中有1位攜帶G2019S突變(0.26%)。 對于阿爾茨海默病(AD) : 373位患者中沒有一位攜帶G2019S突變。對 于輕度認(rèn)知損害(MCI) : 448位患者中沒有一位攜帶G2019S突變。對 于肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS); 483位患者中沒有一位攜帶G2019S突變。結(jié)論是大約1.24%|^遲發(fā)性病例攜帶突變，其與文獻(xiàn)中報道 的頻率類似。只有約0.26%的PDD病例攜帶G2019S突變。這一突變在 AD、 MCI和ALS中并不常見。突變可能與運(yùn)動功能的較快衰退相關(guān)。
等同方案本發(fā)明的一或多個實(shí)施方式的細(xì)節(jié)在上面所附的說明書中列出。
發(fā)明，但現(xiàn)在描述了優(yōu)選的方法和材料。本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn) 將從說明書和權(quán)利要求中顯而易見。在說明書和所附權(quán)利要求中，除非上 下文明確另行規(guī)定，否則單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)對象。除非另有限定，本文使
本文引用的所有參考通過整體引用在此作為參考，并且為了所有的目的以 相同的程度在此引入，就如同每一單個出版物、專利或?qū)＠暾垶榱怂?目的具體及單獨(dú)地指示為以其整體引入作為參考一樣。 [138]本發(fā)明不限于這一申請中所述的具體實(shí)施方式
，這些實(shí)施方式僅作為本發(fā)明個別方面的舉例說明。如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以對這 一發(fā)明進(jìn)行許多修改和改變而不背離其精神和范圍。根據(jù)前面的說明，除 了本文列舉的那些以外，本發(fā)明范圍內(nèi)的功能性等效方法和工具對于本領(lǐng) 域技術(shù)人員而言也是顯而易見的。該修改和改變旨在落入所附權(quán)利要求的 范圍內(nèi)。本發(fā)明只被所附權(quán)利要求的用語，以及與該權(quán)利要求所主張的全 部范圍等同體所限定。
3權(quán)利要求
1. LRRK2調(diào)節(jié)劑在制備用于治療阿爾茨海默病選定患者群體的藥物中的用途，其中基于富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2(LRK2)基因的多態(tài)性選擇患者群體，該LRK2基因的多態(tài)性是從輕度認(rèn)知損害(MCI)進(jìn)展為阿爾茨海默病的指示。
2. 權(quán)利要求l的用途，其中該LRRK2調(diào)節(jié)劑是雜環(huán)化合物。
3. 權(quán)利要求l的用途，其中阿爾茨海默病的治療減緩了患者從輕度認(rèn) 知損害(MCI)到阿爾茨海默病的選艮。
4. 權(quán)利要求l的用途，其中阿爾茨海默病的治療減緩了患者從中度阿 爾茨海默病到重度阿爾茨海默病的 。
5. 權(quán)利要求1的用途，其中LRRK2基因的多態(tài)性選自T1602S和 T2352。
6. 權(quán)利要求5的用途，其中患者的T1602S基因座具有TT( Thr/Thr)基因型。
7. 權(quán)利要求5的用途，其中患者的T2352基因座具有CC (Thr/Thr) 基因型。
8. —種預(yù)測受試者阿爾茨海默病選艮的方法，包括步驟a) 從受試者獲得組織樣品；b) 測定樣品中指示受試者從輕度i/v知損害(MCI)進(jìn)展為阿爾茨海 默病的遺傳多態(tài)性的存在；其中受試者中存在的指示受試者從輕度認(rèn)知損 害逸艮為阿爾茨海默病的遺傳多態(tài)性預(yù)示該受試者處于從輕度認(rèn)知損害向 阿爾茨海默病*的增加的風(fēng)險中。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中組織樣品是血樣。
10. 權(quán)利要求8的方法，其中該遺傳多態(tài)性選自T1602S和T2352。
11. 權(quán)利要求8的方法，還包括步驟c )如果預(yù)測到該受試者具有指示受試者從輕度i人知損害i^艮為阿爾茨 海默病的遺傳多態(tài)性，則向該受試者施用LRRK2調(diào)節(jié)劑以減緩從輕度^人知損害向阿爾茨海默病的進(jìn)展或從中度阿爾茨海默病向重度阿爾茨海默病 的錄。
全文摘要
遺傳多態(tài)性LRRK2(富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2)-T1602S與輕度認(rèn)知損害(MCI)轉(zhuǎn)變?yōu)榘柎暮Ｄ?AD)顯著相關(guān)，同時TT基因型的患者進(jìn)展為阿爾茨海默病的風(fēng)險較大。LRRK2-T2352也顯示了轉(zhuǎn)變?yōu)榘柎暮Ｄ〉内厔?，同時CC基因型的患者有進(jìn)展為阿爾茨海默病的趨勢。類似于APOE-E4等位基因，在BuChE-K變體存在時，LRRK2-T1602S與LRRK2-T2352顯示出與從輕度認(rèn)知損害轉(zhuǎn)變?yōu)榘柎暮Ｄ〉谋壤蟮南嚓P(guān)性。在另一項(xiàng)對安慰劑處理的阿爾茨海默患者的研究中，LRRK2-T1602S與LRRK2-T2352顯示出相關(guān)性相同的趨勢。LRRK2-T1602S的TT基因型阿爾茨海默病患者或LRRK2-T2352的CC基因型患者認(rèn)知能力在6個多月里下降更迅速，尤其在BuChE-K變體存在時。這兩種常見的LRRK2多態(tài)性與阿爾茨海默病進(jìn)展的相關(guān)性顯示出LRRK2可能在阿爾茨海默病發(fā)病，尤其是疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用，并顯示出LRRK2多態(tài)性可用作這一進(jìn)展的生物標(biāo)記。
文檔編號C12Q1/68GK101473044SQ200780022902
公開日2009年7月1日 申請日期2007年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月20日
發(fā)明者B·戈麥斯-曼西利亞, G·比爾貝, G·羅夫利, J·邁耶, R·R·庫恩, Y·何 申請人:諾瓦提斯公司