專利名稱：：生產(chǎn)辛伐他汀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：'本發(fā)明涉及在宿主細(xì)胞中對(duì)HMG-CoA還原酶抑制劑辛伐他汀(simvastatin)的發(fā)酵生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
：膽固醇和其它脂類通過低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)在體液中運(yùn)輸。能實(shí)現(xiàn)降低LDL-膽固醇的機(jī)制的物質(zhì)可用作為有效的抗高膽固醇血試劑，因?yàn)長(zhǎng)DL水平與冠心病的風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)。斯汀類的降膽固醇試劑是醫(yī)藥上非常重要的藥品，因?yàn)樗鼈兡芡ㄟ^抑制HMG-CoA還原酶降低血中的膽固醇濃度。后一種酶催化膽固醇生物合成中的速率限制步驟，艮口，(3。-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)向甲羥戊酸的轉(zhuǎn)化。如今，在降低膽固醇的應(yīng)用中，辛伐他汀屬于處方最常見的藥物。辛伐他汀的合成并不直接，因?yàn)槠渖婕皬奶烊划a(chǎn)物洛伐他汀(lovastatin)(通過^s/ergz7/w5terreus合成)開始的半合成手段。洛伐他汀和辛伐他汀之間的分子區(qū)別在于C-8位上的側(cè)鏈。其中，洛伐他汀攜帶2-甲基丁酸酯基元(moiety)，而辛伐他汀則在該位置具有2,2-二甲基丁酸酯基元。從1984年發(fā)現(xiàn)辛伐他汀以來，世界范圍內(nèi)已經(jīng)報(bào)道了對(duì)辛伐他汀的多種化學(xué)合成方法。US4,444,784所述的一種途徑涉及對(duì)洛伐他汀的2-甲基丁酸酯側(cè)鏈的去酯化接著是數(shù)個(gè)不同的化學(xué)步驟，所述步驟涉及內(nèi)酯化、羥基保護(hù)/去保護(hù)和用合適的2,2-二甲基丁酸鹽/酯進(jìn)行再酯化。該工藝的總產(chǎn)率很低。US4,582,915描述的另一種方法涉及使用金屬烷基酰胺和甲基鹵化物對(duì)洛伐他汀側(cè)鏈直接甲基化。該方法會(huì)遇到與終產(chǎn)物濃度相關(guān)的問題，因?yàn)槠鋾?huì)導(dǎo)致產(chǎn)生若干種副產(chǎn)物，必須將這些副產(chǎn)物與目標(biāo)化合物分開。此外，使用的化學(xué)物質(zhì)是有毒的和/或致癌的，這使得工業(yè)規(guī)模的實(shí)施困難且有害。類似地，US4，820，850中描述的另一種方法雖然解決了低產(chǎn)率和純度的問題，但是其涉及了多達(dá)6個(gè)化學(xué)步驟，其中也利用了對(duì)于以工業(yè)規(guī)模的操作來說并不安全的試劑。US5，763，646中描述的方法涉及使用較少的化學(xué)步驟將洛伐他汀轉(zhuǎn)化為辛伐他汀。但是，該方法使用了非常昂貴的化學(xué)試劑并且總產(chǎn)率也很低。名稱R作為已有化學(xué)途徑的替代，WO03/010324描述了對(duì)參與洛伐他汀生物合成的兩種聚酮合酶(LovF)之一的代謝工程改造。但是，在宿主中直接發(fā)酵生產(chǎn)辛伐他汀的潛在問題是非天然側(cè)鏈一一2,2-二甲基丁酸酯的引入。通過交換LovF聚酮合酶的模塊與來自其它來源的模塊不能解決該問題，因?yàn)?，為了合?,2-二甲基丁酸酯側(cè)鏈，經(jīng)修飾的LovF酶需要在洛伐他汀生產(chǎn)生物(例如X^ergZ〃wsfe〃ews)中并不存在的底物(甲基丙二酰-CoA)。在WO00/037629中提出，可以修飾/ovS基因，以生產(chǎn)其它的HMG-CoA還原酶抑制劑。因?yàn)?ov5基因參與對(duì)莫那可林(monacolin)J核心的生物合成，事實(shí)上其它的HMG-CoA還原酶抑制劑可通過對(duì)該基因的修飾獲得，但是，并不能獲得辛伐他汀，因?yàn)镃-8位上的側(cè)鏈形成并不歸/ov^基因負(fù)責(zé)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于辛伐他汀合成的發(fā)酵工藝，由此避免轉(zhuǎn)化洛伐他汀所需的復(fù)雜的合成步驟，以及克服與WO03/010324相關(guān)的問題。本發(fā)明解決了上文列出的問題，這是通過提供下述宿主來實(shí)現(xiàn)的，所述宿主具有用于體內(nèi)合成辛伐他汀上的2,2-二甲基丁酸酯側(cè)鏈的必要構(gòu)造單元(buildingblock)。如所顯示的，只要甲基丙二酸鹽/酯、甲基丙二酰-CoA或2，2-二甲基丁酸鹽/酯被提供給宿主細(xì)胞，具有由一種或多種洛伐他汀生物合成基因構(gòu)成的基因簇的任何物種都可生產(chǎn)辛伐他汀。除了2,2-二甲基丁酸鹽/酯自身之外，也可使用它的衍生物，例如硫酯。這可以通過外界進(jìn)料來實(shí)現(xiàn)，或者備選地，可通過用甲基丙二酰-CoA合成途徑對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行工程改造來實(shí)現(xiàn)。其它的構(gòu)造單元，莫那可林J，由含有一種或多種洛伐他汀生物合成基因的該細(xì)胞生產(chǎn)或被供應(yīng)給該細(xì)胞。因此，本發(fā)明的上述目的和任何目的可通過本發(fā)明的方法來實(shí)現(xiàn)，其中，所述方法包括*提供能將2,2-二甲基丁酸酯側(cè)鏈并入辛伐他汀的宿主，g卩，通過定制針對(duì)2,2-二甲基丁酸鹽/酯的合成和/或并入優(yōu)化過的聚酮合酶來實(shí)現(xiàn)-，.*發(fā)酵所述宿主，以獲得辛伐他汀或其類似物或衍生物，即，通過以工業(yè)規(guī)模由補(bǔ)料分批工藝生產(chǎn)辛伐他汀來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及下述方法，該方法用于將所有形式的甲基丙二酸鹽/酯或2,2-二甲基丁酸鹽/酯或者這些化合物的衍生物(例如硫酯)供應(yīng)給宿主，以在細(xì)胞內(nèi)獲得2，2-二甲基丁酸酯側(cè)鏈和域用能體內(nèi)合成甲基丙二酸-CoA的代謝途徑工程改造宿主。甲基丙二酸-CoA生物合成途徑可由兩種酶加上丙酸鹽/酯進(jìn)料構(gòu)成，所述兩種酶即丙酰-CoA合成酶和丙酰-CoA羧化酶，其中，這兩種酶途徑從A^wgz7/wsmWw/a^(丙酰-CoA合成酶)和6Veptom少ceycoe/Zco/or(丙酰-CoA羧化酶)獲得，以及其中，兩種酶選自自然界中任何可獲得的丙酰-CoA合成酶和丙酰-CoA羧化酶同源基因。或者，甲基丙二酸鹽/酯生物合成途徑由一種酶，即丙二酰-CoA合成酶構(gòu)成，其中，所述一種酶途徑從^^o&wn的物種獲得，和/或所述一種酶選自自然界中任何可獲得的丙二酰-CoA合成酶同源基因。高效的甲基丙二酰-CoA工程改造的一個(gè)例子由Reevesetal.(2007;Metabol.Engineer.9:293-303)所公開。宿主是具備編碼洛伐他汀生物合成機(jī)制的一種或多種基因的任何宿主，其優(yōu)選是選自真菌的組的真核生物，優(yōu)選地，選自物種J^erg7'〃ws、尸em'c/〃/wm禾口5"accAarcw^yces。發(fā)明詳述術(shù)語洛伐他汀生物合成基因包括來自的任何野生型基因，還包括經(jīng)修飾的、失活的和截短的變體加上同源酶和具有相同功能的非同源酶(即，洛伐他汀酶系統(tǒng))。術(shù)語2，2-二甲基丁酸鹽/酯包括含有CH3CH2C(CH3)2C-R基元的所有生物可獲得的分子，其中，R可以是0H、(TX+，其中X+代表陽離子，例如金屬離子、氨或氮衍生的其它陽離子。特別合適的化合物是其中R代表活化基團(tuán)的那些。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何活化基團(tuán)都是合適的。特別合適的活化基團(tuán)是例如S-輔酶A(SCoA)或其衍生物、S-N-乙酰半胱胺(SNAC)或其衍生物、S-甲基硫代乙醇酸鹽/酉旨(SMTG)、硫代垸基等。本發(fā)明的第一個(gè)方面是向宿主提供2,2-二甲基丁酸酯側(cè)鏈的穩(wěn)定供應(yīng)。使用LC-MS分析表明，該化合物在天然的洛伐他汀生產(chǎn)者(例如^w^^7/m中不合成或不存在。第二，在被培養(yǎng)于洛伐他汀生產(chǎn)條件下的野生型A;e^/〃w5te庁ew5中，2，2-二甲基丁酸鹽/酯和辛伐他汀都不能被檢測(cè)到，無論是細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外的。第三，酶測(cè)量表明，甲基丙二酰-CoA——2,2-二甲基丁酸鹽/酯合成的假定前體，在生產(chǎn)洛伐他汀的野生型乂^ergz7/1^中也不存在。這些綜合在一起表明，wgz7/w^rew缺乏用以合成2，2-二甲基丁酸鹽/酯的甲基丙二酰-CoA。本發(fā)明的一種實(shí)施方式描述了將甲基丙二酰-CoA供應(yīng)給具有整套洛伐他汀生物合成基因簇或其中單個(gè)基因的生物(例如J^wgz7/^^re^)的無細(xì)胞提取物或者能通過遺傳改造生產(chǎn)洛伐他汀的任何其它生物的無細(xì)胞提取物。合適的生物是選自Bac"/w5amo/;^we/a"'e似、5ad//usra^z'fo和^yc/zer/c/n'aco//構(gòu)成的組的原核生物或選自爿印ergz'〃usmWw/a"s、pwr，mz、Sacc/^romjcescerevz/ae禾口《/w_yvenm_ycfcy/acto構(gòu)成的組的真核生物。生物被培養(yǎng)于WO98/37179所述的洛伐他汀生產(chǎn)條件下?；蛘撸赏ㄟ^外界進(jìn)料來增加洛伐他汀和/或中間產(chǎn)物的水平。存在其它必要的構(gòu)造單元和輔助因子(例如，莫那卡林J、乙酰-CoA、NADPH、ATP和S-腺苷甲硫氨酸)時(shí)，洛伐他汀生物合成酶可出人意料地使用甲基丙二酰-CoA來合成辛伐他汀。因此證實(shí)，野生型^^^^7/mte廳e^不能合成甲基丙二酸鹽/酯、甲基丙二酰-CoA和/或2，2-二甲基丁酸鹽/酯。本發(fā)明的另一實(shí)施方式描述了將辛伐他汀前體2，2-二甲基丁酸鹽/酯供應(yīng)給具有整套洛伐他汀生物合成基因簇或其中單個(gè)基因的生物(例如A^e《///1^^t^m)的培養(yǎng)物或者通過遺傳改造在洛伐他汀生產(chǎn)條件下培養(yǎng)時(shí)能生產(chǎn)洛伐他汀的任何其它生物(例如，尸em'd/"wmcAo^gem/m、Sacc/zaramyc&scereWsz'ae、5acz'〃ussw^'fo、五sc/zehc/n'aco/z')的培養(yǎng)物(見WO98/37179)。所述生物可具有洛伐他汀生物合成基因或經(jīng)修飾的/失活的洛伐他汀生物合成基因以及與洛伐他汀生物合成基因同源的生物合成基因(在本文中氨基酸水平上30-40%相同被認(rèn)為同源)的整套或一部分(如Xieaa/.在Chemistry&Biology13，1161(2006)和Appl.Environ.Microbiol.73，2054(2007)中所示)。具有與洛伐他汀生物合成基因"基本同源"的氨基酸序列的多肽被定義為具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與指定的氨基酸序列具有至少30%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少60%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少70%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少80%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少90%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少98%以及最優(yōu)選至少99%的同一性程度，所述基本同源的肽展示出朝著洛伐他汀和/或辛伐他汀合成的方向的活性。基本同源的多肽可包括多態(tài)性，這可存在于來自不同種群的細(xì)胞中或由于天然的等位或菌株內(nèi)變化而存在于種群中。基本同源的多肽還可源自并非是指定的氨基酸和/或DNA序列所來自的真菌的其它物種，或者可被人工設(shè)計(jì)并合成的DNA序列所編碼。與指定的DNA序列相關(guān)并且通過遺傳密碼簡(jiǎn)并獲得的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。同源體還可包括全長(zhǎng)序列的生物活性片段。就本發(fā)明的目的而言，兩條氨基酸序列間的同一性程度指兩條序列間相同的氨基酸的百分比。同一性程度是用BLAST算法測(cè)定的，該算法被描述于Altschul,etal.，J.Mol,Biol.215:403-410(1990)中。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件是可通過NationalCenterforBiotechnologyInformation(http:〃www.ncbi.nlm.nih.qov/)公開獲f導(dǎo)的。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對(duì)的敏感度和速度。BLAST程序默認(rèn)使用11的字長(zhǎng)(W)、BLOSUM62計(jì)分矩陣(見Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))、50的比對(duì)(B)、10的期望(E)、M=5、N二4和兩條鏈比較?；就吹亩嚯目珊兄付ǖ陌被嵝蛄械囊粋€(gè)或多個(gè)氨基酸的僅保守取代或者非必要氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非必要氨基酸是在這些序列之一可被改變而不會(huì)實(shí)質(zhì)上改變生物學(xué)功能的殘基。例如，關(guān)于如何進(jìn)行表位沉默氨基酸取代的指導(dǎo)被提供于Bowie，J.U.etal.，Science247:1306-1310(1990)中，其中作者指出，研究氨基酸序列對(duì)改變的耐受性有兩種主要手段。第一種方法依賴于進(jìn)化過程，其中突變被自然選擇接受或拒絕。第二種手段使用遺傳工程改造，以在克隆的基因的特定位置引入氨基酸改變，并且進(jìn)行選擇或篩選以鑒定出保持了功能性的序列。如作者所指出的，這些研究已經(jīng)揭示，蛋白對(duì)氨基酸取代有著令人吃驚的耐受性。作者還指出了在蛋白的某位置哪些改變可能是許可的。例如，埋在最里面的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而表面?zhèn)孺溚ǔ：苌儆刑卣魇潜Ｊ氐?。其它此類表型沉默取代被描述于Bowieetal和其中提到的參考文獻(xiàn)中。術(shù)語"保守取代"意欲表示這樣的取代，其中，氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基代替。這些家族是本領(lǐng)域已知的，其包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、無極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶&支鏈的側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。此外，可以使用并不同源但是遵循用于合成斯汀類的相同生物合成構(gòu)造原則的生物合成基因簇。當(dāng)向具有一個(gè)或多個(gè)洛伐他汀生物合成基因(例如，完整的二酮合酶基因，例如/ovF基因)的生物供給2，2-二甲基丁酸鹽/酯時(shí)，獲得大致比例為50:1的洛伐他汀和辛伐他汀的混合物。來自As^erg///^tore^的洛伐他汀生物合成基因/ovF被描述為編碼產(chǎn)生2-甲基丁酸鹽/酯基元的酶的基因(Hutchinson,C.R.etal.，爿wtom'eva打Zeawe"/zo^:2000,M,pages287-295)。因此，令人吃驚地，洛伐他汀酶系統(tǒng)除了展示出對(duì)2-甲基丁酸鹽/酯的天然偏好之外，還展示出對(duì)2,2-二甲基丁酸鹽/酯的相當(dāng)高的底物耐受性。通過加入由本領(lǐng)域已知的方法(例如定向進(jìn)化、基因改組(shuffling)或定點(diǎn)誘變)優(yōu)化過的、偏好于合成2，2-二甲基丁酸鹽/酯的/wF基因和/或通過插入點(diǎn)突變(人工終止密碼子)來失活A(yù)pergz7/uste^^的野生型/ov尸基因，可達(dá)成進(jìn)一步的改善。向具有洛伐他汀生物合成基因的微生物供給2，2-二甲基丁酸鹽/酯導(dǎo)致改善了辛伐他汀的生產(chǎn)。另一實(shí)施方式描述了用用于體內(nèi)甲基丙二酰-CoA生產(chǎn)的途徑對(duì)可能的宿主(例如^pergWwsterras)進(jìn)行的工程改造。這可以以三種方式來進(jìn)行。第一種途徑起始于丙酸鹽/酯。丙酸鹽/指被轉(zhuǎn)化為丙酰-CoA，隨后羧化為甲基丙二酰-CoA。用于該途徑的酶可從^"內(nèi)om少c^coe//co/or(Diacovich，L.etal.,J.Biol.Chem.2002，H，pages31228-31236)或攜帶同源基因的任何其他物種獲得。具備該途徑的^y/7^^7/wfe廳ew宿主在發(fā)酵期間需要丙酸鹽/酯進(jìn)料，以實(shí)現(xiàn)甲基丙二酰-CoA的最優(yōu)合成。在另一實(shí)施方式中，使用來自i/zfeo&wmsp.的丙二酰-CoA合成酶(Kim，Y.S.etal.,/1991,273，pages511-516)，其在正常情況下催化從丙二酸鹽/酯形成丙二酰-CoA。如Pohl,N丄.etal.,C&m.Soc.2001,ill,pages5822-5823所描述的，丙二酰-CoA合成酶具有不尋常的高的底物耐受性，并且易于以與野生型反應(yīng)相當(dāng)?shù)乃俾蕦⒓谆猁}/酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的CoA酉旨。因此，丙二酰-CoA合成酶基因的整合以及甲基丙二酸鹽/酯的外界供給導(dǎo)致產(chǎn)生了體內(nèi)生產(chǎn)甲基丙二酰-CoA的替代性途徑。在另一實(shí)施方式中，使用甲基丙二酰-CoA歧化酶-差向異構(gòu)酶途徑(Dayem，L.C.etal.，5ZocAew^^y2002,41,pages5193-5201)。這包括兩種酶(甲基丙二酰-CoA歧化酶和甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶)的順序作用，其將琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)化為(2R)-甲基丙二酰-CoA然后轉(zhuǎn)化為(2S)-甲基丙二酰-CoA。當(dāng)將B12前體羥鈷胺素和丙酸鹽/酯供應(yīng)給具有尸n9pz'om'Za"en'wws/ermaw'z'甲基丙二酰-CoA歧化酉每禾口《SVre/tom_ycescoe//co/or甲基丙二酰-CoA差向異構(gòu)酶的細(xì)胞時(shí)，產(chǎn)生甲基丙二酰-CoA。本發(fā)明的第二方面是用聚酮合成酶和/或洛伐他汀酶系統(tǒng)的其它酶來裝備宿主，所述酶是較之天然酶的低活性而言針對(duì)合成該2，2-二甲基丁酸鹽/酯和/或?qū)⑵溥B到莫那卡林J核心上優(yōu)化過的。如上文所述，除了通常接受的側(cè)鏈2-甲基丁酸鹽/酯之外，經(jīng)修飾的LovF蛋白還可合成辛伐他汀側(cè)鏈2，2-二甲基丁酸鹽/酯，雖然產(chǎn)率較低。經(jīng)修飾的LovF屬于真菌聚酮合酶的類。聚酮合成酶的一個(gè)顯著特征是結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。在細(xì)菌的I型聚酮合酶(Khosla，C.etal.,C/^m.iev.1997,22,pages2577-2590)中，結(jié)構(gòu)域被組織于模塊中，每個(gè)模塊僅催化一種縮合反應(yīng)。在真菌系統(tǒng)中，情況較為復(fù)雜。真菌的聚酮合酶是較大的蛋白，它們具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域。此外，在描述過的很多情況下，結(jié)構(gòu)域看似會(huì)多次使用，例如，僅具有一個(gè)酮-合酶結(jié)構(gòu)域的酶卻能產(chǎn)生九酮(見，例如，Hutchinson,C.R.etal"Jwtom'e丄ee詣ew/oeA:2000，3-4，pages287-295)。其中隱藏的機(jī)制尚未被完全理解。相反，A^wgz7/wte廳e^的LovF酶看起來是真菌聚酮合酶的最簡(jiǎn)單的情況。其由包含6個(gè)結(jié)構(gòu)域的單條多肽構(gòu)成。顯而易見地，每個(gè)結(jié)構(gòu)域僅用一次，產(chǎn)生2-甲基丁酸鹽/酯。為優(yōu)化使用能體內(nèi)合成甲基丙二酰-CoA的宿主進(jìn)行辛伐他汀發(fā)酵的產(chǎn)率，需要針對(duì)使用這種底物對(duì)LovF蛋白加以優(yōu)化，并將其轉(zhuǎn)化為2,2-二甲基丁酸鹽/酯。在這方面，簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)是有用的，因?yàn)槠湟韵喈?dāng)于I型PKS那樣發(fā)揮作用。這是對(duì)酶進(jìn)行朝向2，2-二甲基丁酸鹽/酯聚酮合酶的方向進(jìn)行工程改造的先決條件。在一種實(shí)施方式中，通過替換若干結(jié)構(gòu)域?qū)ovF酶進(jìn)行工程改造，這導(dǎo)致從甲基丙二酸-CoA對(duì)2,2-二甲基丁酸鹽/酯的生產(chǎn)增加，并且，當(dāng)被整合進(jìn)甲基丙二酰-CoA生產(chǎn)宿主的洛伐他汀生物合成基因簇(替代野生型Z^vF基因)時(shí)，辛伐他汀的生產(chǎn)增加。這些步驟的詳細(xì)描述在實(shí)施例中給出。實(shí)施例一般材料和方法按照其它文獻(xiàn)所述(Sambrook,J.etal.(1989),Mo/簡(jiǎn)/arc/om'wg..aA360rato/^wawwa/，2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NewYork)來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)流程。使用高保真聚合酶Turbo-Pfu-Polymerase或Herculase(Stratagene,TheNetherlands)，遵循廠商方案來擴(kuò)增DNA，而對(duì)構(gòu)建的菌株和質(zhì)粒的驗(yàn)證則使用Taq聚合酶來實(shí)現(xiàn)。限制性酶來自Invitrogen或NewEnglandBiolabs。對(duì)于常規(guī)克隆而言，使用^c/^n'c/n'aco/z'菌株T叩10和DH10B(Invitrogen)。對(duì)構(gòu)建的質(zhì)粒的驗(yàn)證通過限制性分析和隨后的測(cè)序(SeqiabGmbH，Goettingen，Germany)來進(jìn)行。有絲真菌J印ergz7/uyter^w菌株ATCC20542在進(jìn)料實(shí)驗(yàn)中被用作為洛伐他汀生產(chǎn)者，并被用作為遺傳工程改造試驗(yàn)的基礎(chǔ)(見下文描述)。提取和HPLC分析用1ml甲醇來提取凍干樣品。為達(dá)到此目的，向凍干材料中加入1ml甲醇，接著以最高速度對(duì)每份樣品進(jìn)行至少1分鐘的旋轉(zhuǎn)震蕩(vortexing)。小心確保Eppendorf管中的所有材料成為懸浮液，并且提取期間沒有留下塊狀物。以13,000rpm對(duì)管進(jìn)行5分鐘的離心，然后將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到HPLC樣品管中。HPLC分析如下所示洗脫液milliQ水中的60%乙腈梯度無梯度柱WatersXTerraRP18柱溫室溫流速1ml/分鐘注射體積10Ad槽溫至溫設(shè)備WatersAlliance2695檢測(cè)儀Waters996光二極管陣列波長(zhǎng)238nm駐留時(shí)間洛伐他汀3.8分鐘辛伐他汀4.7分鐘實(shí)施例1野生型Aspergillusterreus不產(chǎn)生甲基丙二酸鹽/酯和甲基丙二酰-CoA在洛伐他汀生產(chǎn)培養(yǎng)基中以10E5-10E6個(gè)分生孢子/ml接種分生孢子或v4^erg!7/"ste〃eus菌株ATCC20542(或通過突變以及針對(duì)更高的生產(chǎn)能力加以篩選從其獲得的菌株，優(yōu)選地，按照下文指出的方案之一進(jìn)行突變和篩選)，所述培養(yǎng)基含有(g/1):右旋塘，40;CH3COONH4，2.2;Na2S04，4;KH2P04，3.6;K2HP04.3H20，35.1;微量元素溶液(檸檬酸.1120，150;FeS04.7H20，15;MgS04.7H20，150;H3B03，0.0075;CuS04.5H20，0.24;CoS04.7H20，0.375;ZnS04.7H20，1.5;MnS04.H20，2.28;CaCl2.2H20，0.99)，10(ml/1)(WO98/037179)。于28。C在軌道搖床上以220rpm對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行144-168小時(shí)的培養(yǎng)。在發(fā)酵終點(diǎn)，通過離心或過濾除去菌絲體，用生理鹽水洗菌絲體。針對(duì)形成的丙二酸鹽/酯、丙二酸CoA、甲基丁酸鹽/酯、洛伐他汀、甲基丙二酸鹽/酯、甲基丙二酸-CoA、2,2-二甲基丁酸鹽/酯和辛伐他汀，通過本領(lǐng)域公知的LC-MS方法來檢驗(yàn)菌絲體和培養(yǎng)基。僅能檢測(cè)到前四種化合物，這驗(yàn)證了Ater^^不能從頭合成甲基丙二酸鹽/酯。實(shí)施例2通過將2,2-二甲基丁酸鹽/酯供應(yīng)給ferreuATCC20542來形成辛伐他汀按照實(shí)施例1所述來培養(yǎng)v^;wgz7/uy^re^。在48-96小時(shí)的預(yù)培養(yǎng)后，在新鮮培養(yǎng)基中以1:10的比例對(duì)培養(yǎng)物加以稀釋。此外，在培養(yǎng)基中加入0、0.1和1.0g/1的甲基丙二酸鹽/酯或2,2-二甲基丁酸鹽/酉旨、N-乙酰半胱胺。在水平搖床上對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行96-168小時(shí)的培養(yǎng)。隨后將培養(yǎng)基的上清液與細(xì)胞分開，針對(duì)洛伐他汀和辛伐他汀對(duì)細(xì)胞和培養(yǎng)基加以分析。除了洛伐他汀之后，還能檢測(cè)到辛伐他汀，但是僅在加入了2，2-二甲基丁酸鹽/酯前體的培養(yǎng)物中檢測(cè)到。在這些中，辛伐他汀典型地以洛伐他汀水平的1/50存在。實(shí)施例3用丙二酸合酶對(duì)Aperg!7/Mte^e^ATCC20542進(jìn)行代謝工程改造，以生產(chǎn)甲基丙二酸-CoA對(duì)來自i/^o&wmsp.(GenBank檢錄號(hào)H75771.1)的丙二酰-CoA合成酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在」^ergz7/wmV/w/awg/w"啟動(dòng)子的控制下克隆，隨后將其整合進(jìn)Ate廳e^的基因組。用am^S共選擇來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的真菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，以篩選出陽性轉(zhuǎn)化子(Ruiz-Diez，B.,^少/.Mz'cro&o/.2002,22，pages189-195)。用菌落PCR選出具有穩(wěn)定整合進(jìn)基因組的丙二酸合酶表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化子。按照實(shí)施例1和2所述對(duì)轉(zhuǎn)化子加以培養(yǎng)，此外，向培養(yǎng)基中加入甲基丙二酸鹽/酯。樣品加工后可以檢測(cè)到甲基丙二酰-CoA。實(shí)施例4用丙酰-CoA合成酶和丙酰-CoA羧化酶對(duì)七。^gz7/wferm^ATCC20542進(jìn)行代謝工程改造，以產(chǎn)生甲基丙二酸-CoA對(duì)分另ll來自￡^c/2en.c/n.flco//禾口S&印tom3;c&scoe/ico/or的丙酉先-CoA合成酶(GenBank檢錄號(hào)R88078.1)和丙酰-CoA羧化酶(GenBank檢錄號(hào)AL939113)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在A^ergz'〃wsmWw/a朋砂W啟動(dòng)子(GenBank檢錄號(hào)M19694)的控制下克隆，隨后將其整合進(jìn)Aterm^的基因組。用am^S或潮梅素B共選擇來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的真菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，以篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。用菌落PCR選出兩種表達(dá)盒均穩(wěn)定整合進(jìn)基因組的轉(zhuǎn)化子。按照實(shí)施例1和2所述對(duì)轉(zhuǎn)化子加以培養(yǎng)，此外，向培養(yǎng)基中加入丙酸鹽/酯。樣品加工后可以檢測(cè)到甲基丙二酰-CoA。實(shí)施例5將丙二酰-CoA和甲基丙二酰-CoA體外轉(zhuǎn)化為洛伐他汀和辛伐他汀按照實(shí)施例1所述，在28°C對(duì)^Tews進(jìn)行2天的培養(yǎng)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌、凍干，獲得無細(xì)胞提取物。為評(píng)估兩種菌株的合成能力，進(jìn)行下述檢驗(yàn)(在下表中概括)培養(yǎng)1-24小時(shí)后，對(duì)樣品進(jìn)行分析。在反應(yīng)1(對(duì)照)中沒有檢測(cè)到產(chǎn)物。在反應(yīng)2和3中可以容易地看到洛伐他汀和辛伐他汀的形成，雖然洛伐他汀的形成速率要高于辛伐他汀的形成速率。在樣品4和5中，由于仍然存在于細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)水平的莫那卡林J，所以僅能檢測(cè)到痕量。該結(jié)果表明，當(dāng)可獲得正確的底物時(shí)，^^^7/w的酶組能產(chǎn)生辛伐他汀。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例6使用LovF聚酮合酶體外生產(chǎn)2-甲基丁酸鹽/酯和2,2-二甲基丁酸鹽/酯構(gòu)建pSIMVAl(pENTR/SD/D-Topo-LDi^)禾QPSIMVA2(pET-DEST42陽H幻使用開放讀碼框(ORF)周圍緊鄰的寡核苷酸，使用來自在洛伐他汀生產(chǎn)條件下培養(yǎng)的fe/reusATCC20542的cDNA，通過PCR擴(kuò)增能編碼來自A/wgz'〃1^的LDKS蛋白的/ovF基因(GenBank號(hào)碼AAD34559.1)。從瓊脂糖凝膠純化得到的5kb的DNA片段，隨后用于克隆進(jìn)pENTR/SD/D-Topo(Invitrogen試劑盒)，這都按照廠商方案來進(jìn)行，產(chǎn)生了pSIMVAl。按照廠商方案，將由此獲得的GatewayEntry載體(Gatewaytechnology,Invitrogen,TheNetherlands)與目標(biāo)載體pET-DEST42重組，產(chǎn)生E.coli表達(dá)載體pET-DEST42-LDi^S，或pSIMVA2。通過DNA測(cè)序驗(yàn)證了pSIMVAl和pSIMVA2的序列。在五.co//BL21Star(Invitrogen,TheNetherlands)中重組生產(chǎn)聚酮合酶LovF質(zhì)粒pSIMVA2和pREP4-gsp質(zhì)粒(其編碼能修飾ACP基元的P-Pant-轉(zhuǎn)移酶，Mootz,H.D.etal.,尸rac.扁.爿cad2000,￡2,pages5848-5853)被轉(zhuǎn)化進(jìn)Aco//BL21Star細(xì)胞中。兩種質(zhì)粒可被共轉(zhuǎn)化，因?yàn)樗鼈兙哂胁煌目剐詷?biāo)記(分別針對(duì)氨芐青霉素和卡納霉素)。得到的菌株被用于重組生產(chǎn)聚酮合酶LovF。典型地，1升富含2YT(0.1mg/mL氨節(jié)青霉素)的培養(yǎng)基被10mL在相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的過夜培養(yǎng)物BL21Star/pSIMVA2接種。培養(yǎng)物被培養(yǎng)于37。C,直到OD600達(dá)到0.5-0.7。用0.5mMIPTG誘導(dǎo)蛋白生產(chǎn)，細(xì)胞在30°C培養(yǎng)4小時(shí)。由此獲得的LovF蛋白被用于體外實(shí)驗(yàn)。在大多數(shù)情況下，通過在50mM磷酸鹽緩沖液pH6.8、0.3mMNaCl、20%甘油、5mMDTT、+/-1mMETDA、1*完全蛋白酶抑制劑混合物(RocheDiagnostics,Germany)中對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行超聲處理來裂解五.co"'細(xì)胞。通過離心除去細(xì)胞殘骸后，獲得的CFE被用于實(shí)驗(yàn)?；蛘撸覀兺ㄟ^將CFE(在沒有EDTA的緩沖液中裂解的)應(yīng)用到Ni-NTA柱上來富集LovF蛋白。由于存在的C-末端HisTag，酶在基質(zhì)上結(jié)合，并可用200mM咪唑洗脫下來?？梢允褂贸瑸V將酶濃縮至毫摩爾的濃度，隨后將其用于酶檢驗(yàn)。對(duì)聚酮合酶LovF的體外2-甲基丁酸鹽/酯和2,2-二甲基丁酸鹽/酯形成檢驗(yàn)通過在體外反應(yīng)中針對(duì)2-甲基丁酸鹽/酯進(jìn)行篩選來驗(yàn)證LovF聚酮合酶的活性。在總體積為1mL的50mM磷酸鹽緩沖液pH6.8中，將10-100微摩爾LovF(或者，100微升含有LovF的CFE)與1mM丙二酰-CoA、1mMS-腺苷甲硫氨酸、5mMNAPDH、5mMDTT、1mM乙酰-CoA—起孵育。反應(yīng)在25。C進(jìn)行1小時(shí)。完成后，用乙酸乙酯(5%乙酸)萃取聚酮。收集有機(jī)相，在真空下除去溶劑(SpeedVac)。最后，將產(chǎn)物重新溶解于小體積(10-50微升甲醇或乙腈)中。對(duì)產(chǎn)物2-甲基丁酸鹽/酯和2,2-二甲基丁酸鹽/酯的分析用LC-MS/MS和NMR來進(jìn)行。典型地，2,2-二甲基丁酸鹽/酯以2-甲基丁酸鹽/酯水平的1%存在。實(shí)施例7使用經(jīng)工程改造的LovF聚酮合酶進(jìn)行的改善的對(duì)2,2-二甲基丁酸鹽/酯的體外生產(chǎn)質(zhì)粒構(gòu)建真菌聚酮合酶LovF由以下順序的下述結(jié)構(gòu)域構(gòu)成KS-AT—DH_MT—KR-ER-ACP(KS-酮合酶；AT二酰基轉(zhuǎn)移酶；DH-脫水酶；MT-甲基轉(zhuǎn)移酶；101=酮還原酶；EI^烯?；D(zhuǎn)移酶；ACP二?；d體蛋白)基于該蛋白，我們對(duì)兩種新的雜交體蛋白進(jìn)行了工程改造，這兩種蛋白都顯示出(增加的)形成2,2-二甲基丁酸鹽/酯的活性。第一種雜交體PKS被稱為雜交體1，其是通過用來自5"acc/zara;o/;;;yporaeo^"ae的脫氧紅霉內(nèi)酯B合酶模塊6的?；D(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域(GenBank檢錄號(hào)AAA26495.1)替換來自LovF的?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(AT)來構(gòu)建的。第二種雜交體PKS被稱為雜交體2，其是通過用來自！^^Wa;^幼's的耶爾森菌素(Yersiniabactin)合成酶的//M『尸7基因的同源片段MT(GenBank號(hào)碼AAC69588.1)替換LovF的MT片段來構(gòu)建的。//MW尸/基因的MT結(jié)構(gòu)域能產(chǎn)生產(chǎn)生偕二甲基，并因此能實(shí)現(xiàn)2,2-二甲基丁酸鹽/酯合成。對(duì)雜交體1的遺傳工程改造。用攜帶As^^7/wte廳ew的/ovF基因的質(zhì)粒pSIMVAl作為模板，以插入AT結(jié)構(gòu)域側(cè)翼的限制性位點(diǎn)。通過DNA序列比對(duì)(BLAST搜索，NCBI)來選擇AT邊界定義。合成分別含有^el禾n位點(diǎn)的正向和反向DNA寡核苷酸，用QuickchangeMutagenesis試劑盒(Stratagene)將限制性位點(diǎn)插入/ovF基因。實(shí)驗(yàn)流程按照廠商方案來進(jìn)行。隨后，對(duì)構(gòu)建體進(jìn)行完全測(cè)序，以排除寡核苷酸和聚合酶的誤差。平行地，還用攜帶^el和Pad位點(diǎn)的寡核苷酸，通過PCR擴(kuò)增來自Sflcc/^ropo/;^;wraeo^m7e的脫氧紅霉內(nèi)酯B合酶AT6結(jié)構(gòu)域基因，并將其克隆進(jìn)pCR-Blunt載體(Invitrogen,TheNetherlands)。寡核苷酸和限制性位點(diǎn)被制造為能確保將EryAT6結(jié)構(gòu)域以同框方式(inframe)克隆進(jìn)/ovF基因。對(duì)pSIMVA3(pCR-Blunt-EryAT6)的DNA序列加以驗(yàn)證后，通過首先使用SpelAPGcI除去洛伐他汀AT接著將經(jīng)S;el/尸flcl處理的EryAT6連接進(jìn)洛伐他汀構(gòu)建體，來構(gòu)建pSIMVA4(pENTR畫SD-D墨Topo-LovF(EryAT6))。使用廠商方案，用Gateway反應(yīng)來構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pSIMVA5(pET-DEST42-LovF(EryA6))。對(duì)雜交體2的遺傳工程改造。按照與雜交體1的設(shè)置相似的方式來實(shí)現(xiàn)雜交體2的構(gòu)建。使用Quickchange誘變?cè)噭┖?，通過攜帶下述限制性酶位點(diǎn)的寡核苷酸，插入MTLovF片段的^el/戶"cl側(cè)翼序列。此外，用相同的側(cè)翼限制性酶來擴(kuò)增來自r^^'m'flp^fe的耶爾森菌素合成酶/zmw;^基因的MT片段。交換兩條片段，產(chǎn)生質(zhì)粒pSIMVA6(pENTR-SD-D-Topo-LovF(MTHMWP1))。使用廠商方案，用Gateway反應(yīng)來構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pSIMVA7(pET-DEST42-LovF(MTHMWP1))。在五.co/z'B121Star中重組生產(chǎn)雜交體1和雜交體2以及體外檢測(cè)2,2-二甲基丁酸鹽/酯質(zhì)粒pSIMVA5或pSIMVA7(分別地)和質(zhì)粒pREP4-gsp(其編碼能修飾ACP基元的P-Pant-轉(zhuǎn)移酶，Mootz,H.D.etal.,Prac.扁.2000，22,pages5848-5853)被轉(zhuǎn)化進(jìn)五sc/zm'c/^co//BL21細(xì)胞中。得到的菌株被用于重組生產(chǎn)聚酮合酶LovF。典型地，1升富含2YT(0.1mg/mL氨芐青霉素)的培養(yǎng)基被10mL在相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的過夜培養(yǎng)物接種。培養(yǎng)物被培養(yǎng)于37。C，直到ODs。。達(dá)到0.5-0.7。用0.5mMIPTG誘導(dǎo)蛋白生產(chǎn)，細(xì)胞在22。C培養(yǎng)12-16小時(shí)。由此獲得的LcwF蛋白被用于體外實(shí)驗(yàn)。在大多數(shù)情況下，我們通過在50mM磷酸鹽緩沖液pH6.8、0.3mMNaCl、20%甘油、5mMDTT、+/-1mMETDA、1*完全蛋白酶抑制劑混合物(RocheDiagnostics,Germany)中對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行超聲處理來裂解五.co/Z細(xì)胞。通過離心除去細(xì)胞殘骸后，由此獲得的CFE被用于實(shí)驗(yàn)?；蛘?，我們通過將CFE(在沒有EDTA的緩沖液中裂解的)應(yīng)用到Ni-NTA柱上來富集LovF蛋白。由于存在的C-末端HisTag，酶在基質(zhì)上結(jié)合，并可用200mM咪唑洗脫下來。與野生性蛋白不同，雜交體蛋白不應(yīng)被濃度超過5mM的咪唑洗脫。這是由于雜交體酶與Ni-NTA樹脂的親和性較低導(dǎo)致的。最可能地，蛋白構(gòu)象的改變導(dǎo)致六組氨酸親和標(biāo)簽較難接近?？梢允褂贸瑸V將酶濃縮至0.1-0.5mM的濃度，隨后用于酶檢驗(yàn)。用于雜交體酶的酶檢驗(yàn)以與WT聚酮合酶LovF檢驗(yàn)(見實(shí)施例6)相似的方式進(jìn)行。使用LC-MS/MS和NMR來分析產(chǎn)物2，2-二甲基丁酸鹽/酯。實(shí)施例8使用Aspergillusterreus體內(nèi)生產(chǎn)辛伐他汀構(gòu)建表達(dá)盒PgpdA-LovF/雜交體PKS-TpenDE為構(gòu)建帶有PgpdA-LovF/雜交體PKS-T，DE盒的載體，使用多位點(diǎn)Gateway技術(shù)(Invitrogen,TheNetherlands)。用于這三種PKS(LovFWT和兩種雜交體PKS)的方法是等同的。因此，使用具有并入的5'-attB4和3'-attBl位點(diǎn)的寡核苷酸來對(duì)^per^7/wmV/w/a^的gpdj基因(GenBank檢錄號(hào)M19694)的啟動(dòng)子進(jìn)行PCR擴(kuò)增。與質(zhì)粒pDONRP4-PlR的重組導(dǎo)致產(chǎn)生了具有attL4和attRl側(cè)翼位點(diǎn)的ENTRY載體。已經(jīng)將LovF/雜交體PKS基因克隆進(jìn)具有側(cè)翼attLl和attL2位點(diǎn)的ENTR載體，其可直接用于多位點(diǎn)gateway反應(yīng)。用攜帶5'-attB2和3'-attB3位點(diǎn)的寡核苷酸，通過PCR擴(kuò)增來自尸e"/c/肌wmc/zo^oge肌m的青霉素生物合成途徑的酰基轉(zhuǎn)移酶(pe"A&)基因(GenBank檢錄號(hào)4379346)的終止子。與載體pDONRP2R-P3的重組導(dǎo)致產(chǎn)生具有側(cè)翼attR2禾口attR3位點(diǎn)的ENTR載體。然后在LR-Clonase反應(yīng)中將這三種ENTR載體與目標(biāo)載體pDEST-R4R3—起孵育，產(chǎn)生表達(dá)載體pSIMVA8(對(duì)于LovFWT而言)、pSIMVA9(對(duì)于雜交體l而言)和pSIMVA10(對(duì)于雜交體2而言)。最后對(duì)表達(dá)盒進(jìn)行測(cè)序，以排除由于PCR聚合酶或Gateway重組反應(yīng)造成的序列錯(cuò)誤。將。SIMVA8-10的表達(dá)盒隨機(jī)整合進(jìn)j犯erg/〃wfe〃eM菌株將質(zhì)粒pSIMVA8-10轉(zhuǎn)化進(jìn)^c/^;7'c/^co/z'ToplO細(xì)胞(Invitrogen,TheNetherlands)，進(jìn)行大規(guī)模的質(zhì)粒與100mL富集培養(yǎng)基(2YT+100嗎/mL氨芐青霉素)中過夜培養(yǎng)物的分離，從每種質(zhì)粒產(chǎn)生了200昭DNA。通過使用合適的限制性酶，例如J^oIM化I或^el，從質(zhì)粒主鏈上切下PgpdA-L0VF/雜交體PKS-TpenDE盒。對(duì)所述的盒進(jìn)行凝膠純化。每次轉(zhuǎn)化使用5-10pgDNA盒，并且使用處于g;^4啟動(dòng)子控制下的腐草霉素抗性基因(Punt,P丄etal.M"AoAo/Ewzj^o/ogy1992,2J^，p.447-457)作為選擇標(biāo)記，并按照Ruiz-Diez,B.,乂J;//.M/croZn'o/.2002，22,p.189-195所述，將其共轉(zhuǎn)化進(jìn)/ovF缺陷型A;ergz7/1^^Tews菌株ATCC20542?；蛘撸墒褂闷渲胁淮嬖诟?jìng)爭(zhēng)途徑(例如洛伐他汀生產(chǎn))的/ovF缺陷型爿5pergz7/Mte〃eus菌株。這可單獨(dú)進(jìn)行，或者與實(shí)施例3和4所述的甲基丙二酰-CoA合成途徑組合進(jìn)行。培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)4七的^wen"/1^tewet^菌株選擇腐草霉素抗性Aperg77/wbrew菌落，通過PCR和Southern雜交印跡技術(shù)，針對(duì)穩(wěn)定整合進(jìn)基因組的雜交體PKS基因或LovF來進(jìn)行進(jìn)一步篩選。然后按照實(shí)施例1所述，用0.5mM甲基丙二酸鹽/酉旨(在丙二酰-CoA合成酶整合的情況下)或1mM丙酸鹽/酉旨(在丙酰-CoA合成酶、羧化酶整合的情況下)，培養(yǎng)攜帶腐草霉素抗性基因和整合的PKS二者的陽性候選者。結(jié)果，我們鑒定發(fā)現(xiàn)*其中整合了WT/ov尸基因的Ay/^g/〃Mte/rew菌株導(dǎo)致洛伐他汀生產(chǎn)的完全恢復(fù)；以及*整合的雜交體PKS1和2兩者均可導(dǎo)致辛伐他汀的產(chǎn)生。當(dāng)雜交體PKS基因在整合的LovF缺陷型菌株中時(shí)，發(fā)現(xiàn)的洛伐他汀較少。通過LC-MS/MS和NMR技術(shù)的組合對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證和證實(shí)。權(quán)利要求1.使用具有Lov-生物合成基因簇或其一部分或與所述Lov-生物合成基因簇同源的基因的微生物來發(fā)酵生產(chǎn)辛伐他汀的方法。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是原核生物或真核生物。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述原核生物選自5"7/^awo/3^w咖cz.e"51、J5ac/〃W5swZ^z.fc禾口^&c/zen'c/z.aco//構(gòu)成的組4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述真核生物選自J^e^7/wM0wa5cws/wpwrecK<Sacc/^omyc&scem^z'ae禾口幻w"e;-omyces1構(gòu)成的組。5.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，添加2，2-二甲基丁酸或其鹽或酯。6.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，添加甲基丙二酸或其鹽或酯。7.—種微生物，該微生物具有Lov-生物合成基因簇或其一部分或與所述Lov-生物合成基因簇同源的基因，該微生物具備甲基丙二酰-CoA生物合成途徑。8.—種DNA序列，其與用于2,2-二甲基丁酸鹽/酯或辛伐他汀生產(chǎn)的洛伐他汀生物合成基因簇具有〉30%的同一性。9.一種蛋白序列，其與用于2,2-二甲基丁酸鹽/酯或辛伐他汀生產(chǎn)的洛伐他汀生物合成蛋白具有>30%的同一性。全文摘要本發(fā)明提供了合成辛伐他汀的發(fā)酵工藝，這通過下述過程來實(shí)現(xiàn)提供能將2，2-二甲基丁酸酯側(cè)鏈并入辛伐他汀的宿主，即，通過定制針對(duì)2，2-二甲基丁酸鹽/酯的合成和/或并入優(yōu)化過的聚酮合酶來實(shí)現(xiàn)；任選地，將針對(duì)2，2-二甲基丁酸鹽/酯合成的合適底物供應(yīng)給所述宿主；發(fā)酵所述宿主，以獲得辛伐他汀或其類似物或衍生物，即，通過以工業(yè)規(guī)模由補(bǔ)料分批工藝生產(chǎn)辛伐他汀來實(shí)現(xiàn)。文檔編號(hào)C12P17/02GK101473040SQ200780023350公開日2009年7月1日申請(qǐng)日期2007年6月18日優(yōu)先權(quán)日2006年6月20日發(fā)明者胡戈·斯特里科斯特羅,馬可·亞歷山大·伯格·范德,馬庫(kù)斯·漢斯申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司