專利名稱：：經(jīng)修飾的β-內(nèi)酰胺酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：多種抗生素已用于治療細菌感染。然而，抗生素不僅攻擊病原體，還影響正常菌群，從而導(dǎo)致不良副作用的產(chǎn)生(例如，對患者腸道產(chǎn)生的副作用)。這些副作用可通過施用能夠降解腸道內(nèi)殘存抗生素的酶而得到緩解。本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的金屬P-內(nèi)酰胺酶，其可用于治療和預(yù)防具有(3-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素所產(chǎn)生的副作用，或者可用于制備這樣的酶。本發(fā)明還涉及用于制備經(jīng)修飾的j3-內(nèi)酰胺酶的方法及可用于其中的核苷酸分子、載體和宿主細胞。
背景技術(shù)：
：P-內(nèi)酰胺酶代表了細菌耐受p-內(nèi)酰胺類抗生素(包括青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類)的主要機制之一。這些酶催化J3-內(nèi)酰胺環(huán)的酰胺鍵不可逆地水解，從而導(dǎo)致抗微生物試劑失效。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)類別和催化機制，j3-內(nèi)酰胺酶可分為四類A、B、C和D。A、C和D類是絲氨酸酶并包含大多數(shù)J3-內(nèi)酰胺酶(Ambler，1980)。這些酶通常使青霉素類或頭孢菌素類失活，并常常對這兩類抗生素之一類表現(xiàn)出偏好性。B類P-內(nèi)酰胺酶是金屬酶，其需要一個或兩個鋅離子作為酶活性的輔因子。按照Bush-Jacoby-Madeiros功能分類(Bush，1998)，金屬卩-內(nèi)酰胺酶屬于第3組。這種分類模式主要基于底物特征、其對EDTA的敏感性及其對絲氨酸P-內(nèi)酰胺酶抑制劑的抗性。根據(jù)配合鋅結(jié)合之區(qū)域的結(jié)構(gòu)相似性，金屬P-內(nèi)酰胺酶可分為三個亞組Bl、B2和B3(Galleni等，2001)。Bl亞組具有三個組氨酸和一個半胱氨酸作為關(guān)鍵的鋅配合殘基。已經(jīng)描述了許多Bl亞組酶的晶體結(jié)構(gòu)，例如蠟狀芽孢桿菌(丑"c/〃ws的BcII(Carfi等，1995和1998a)、脆弱擬桿菌(5fl"mwV/M/mgz7/s)的CcrA(Carfi等，1998b)和銅綠假單胞菌(/^ei/^附owfls)的IMP-1(Concha等，2000)。相應(yīng)地，B2內(nèi)酰胺酶亞組的主要鋅結(jié)合基序(NXHXD)中第一位殘基是精氨酸，而非組氨酸。最近，B2亞組酶的首個晶體結(jié)構(gòu)(CphA)已由Garau等解析出來(Garau等，2005)。B3亞組包括多聚結(jié)構(gòu)的酶(Walsh等，2005)。金屬P-內(nèi)酰胺酶顯示出廣鐠的底物(其包括青霉素類和頭孢菌素類)特征，并且它們對常規(guī)的絲氨酸J3-內(nèi)酰胺酶抑制劑的(例如，克拉維酸、舒巴坦(sulbactam)和他佐巴坦(tazobactam))作用具有抗性。此夕卜，與大多數(shù)絲氨酸|3-內(nèi)酰胺酶不同的是，金屬J3-內(nèi)酰胺酶具有水解碳青霉烯類(例如，美羅培南(meropenem)和泰寧(imipenem))的倉fe力。已知多種細菌產(chǎn)生金屬P-內(nèi)酰胺酶。其通常表達在如下細菌中腸桿菌屬(五w^n6tt"^7."e)(包括津占質(zhì)沙'雷氏菌(5^fr"ftVi附fl/rescews)、肺炎克雷伯氏菌(A/^s/e〃"/mew挑o"/"e)、弗氏梓樣酸桿菌(//r"rf,7)、弗氏志賀氏菌(T7^7i"/))、銅綠假單胞菌(尸s^w^附仰fls1am/g/"osfl)、5^fi06fl"e/"fYi附附fl/鄉(xiāng)Ai7fl、不動軒菌屬(」c/"e似6a"er)、脆弱擬桿菌(必""mfV/es/nigf7/s)、蠟狀芽孢桿菌(必a"7/ws1cem/s1)、氣味黃軒菌(/7"v(^i"m^/附0^yi似附)和脆弱擬桿菌(丑"c^wV/^/mgi7/s)(Walsh等，2005)。|3-內(nèi)酰胺酶可用作使胃腸道中未吸收的P-內(nèi)酰胺類失活的藥物蛋白質(zhì)，從而防止P-內(nèi)酰胺所引起的副作用(包括腸道中正常微生物環(huán)境(microbiota)的改變以及P-內(nèi)酰胺抗性細菌的過度生長(W093/13795、WO2004/016248))。為了使卩-內(nèi)酰胺酶治療在小腸腸道中有效地發(fā)揮作用，在存在膽汁酸的條件下該酶應(yīng)能夠抵抗腸道蛋白酶的作用，并在較寬的pH值(5.5-7.5)條件下保持高的酶活性。通過在胃腸外氨節(jié)青霉素藥物治療期間使用地衣芽孢桿菌(5"7/"s//c/ie"(/^/fi/s)絲氨酸P-內(nèi)酰胺酶，已證實了靶向酶治療在犬和小鼠模型中的可行性(Harmoinen等，2004;Mentula等，2004;Stiefel等，2003)。然而，該酶的底物特征基本上限制了其作為藥物材料的用途，因為當(dāng)(3-內(nèi)酰胺酶抑制劑存在時其水解頭孢菌素類、碳青霉烯類或青霉素類的能力很弱。因此，需要新的具有較寬P-內(nèi)酰胺譜的蛋白酶抗性p-內(nèi)酰胺酶來擴展P-內(nèi)酰胺酶治療(用多種j3-內(nèi)酰胺類進行靜脈內(nèi)藥物治療)在就醫(yī)患者中的用途。已知金屬P-內(nèi)酰胺酶使多種類型的P-內(nèi)酰胺類失活，并且它們對絲氨酸P-內(nèi)酰胺酶抑制劑具有抗性。已知蠟狀芽孢桿菌菌林產(chǎn)生Bl組的6金屬(3-內(nèi)酰胺酶。在小鼠模型中，經(jīng)重組產(chǎn)生的金屬(3-內(nèi)酰胺酶(來自臨床的蠟狀芽孢桿菌98ME1552分離物)半純化樣品能夠消除潛在致病菌的過度生長(Stiefel等，2005)。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該金屬P-內(nèi)酰胺酶制備物包含p-內(nèi)酰胺酶變體的混合物，這削弱了其作為藥物蛋白質(zhì)的價值，因為藥物材料的變化將降低生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性(robustness),增加批次間的變化并給臨床試驗增加困難，這些必然為其注冊為藥劑帶來負面影響。本發(fā)明提供了降低與重組生產(chǎn)金屬|(zhì)3-內(nèi)酰胺酶有關(guān)的氨基末端異質(zhì)性的方法。本發(fā)明還提供了可以基本純化的形式生產(chǎn)并可用于制備藥物組合物的經(jīng)修飾金屬P-內(nèi)酰胺酶。發(fā)明概述本發(fā)明提供了具有如下通式的經(jīng)修飾金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白NH2-K-T-E-ABL畫COOH(I)其中K代表賴氨酸T代表蘇氨酸E代表谷氨酸，以及ABL代表已在氨基末端被截短的金屬(3-內(nèi)酰胺酶蛋白，從而保留了所述蛋白質(zhì)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)中第一a-螺旋之前的四個P-鏈。本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的核苷酸分子，其包含編碼所述經(jīng)修飾金屬P-內(nèi)酰胺酶的核苷酸序列，以及包含該核苷酸分子的表達載體和能夠表達由該核普酸分子編碼的金屬j3-內(nèi)酰胺酶的宿主細胞。本發(fā)明還提供了具有如下通式的經(jīng)修飾金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白NH2-E-ABL-COOH(II)其中E和ABL如上定義。本發(fā)明還提供了制備經(jīng)修飾金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白的方法，該方法包括在使得具有如下通式的金屬(3-內(nèi)酰胺酶能夠表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞NH2-K-T-E-△BL國COOH，(I)其中K代表賴氨酸T代表蘇氨酸E代表谷氨酸，以及△BL代表已在氨基末端被截短的金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白，從而保留了所述蛋白質(zhì)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)中第一a-螺旋之前的四個P-鏈，并進行翻譯后修飾，以得到具有如下通式的經(jīng)修飾金屬P-內(nèi)酰胺NH2-E-ABL-COOH，(II)其中E和ABL如上定義，以及任選地，分離和純化所獲得的翻譯后修飾蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一些方面提供了包含式II的經(jīng)修飾金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白的藥物組合物、用作藥物的經(jīng)修飾金屬p-內(nèi)酰胺酶以及式II的經(jīng)修飾金屬p-內(nèi)酰胺酶用于制備消除P-內(nèi)酰胺類抗生素在腸道中引起的不良反應(yīng)的藥物中的用途。最后，本發(fā)明提供了治療p-內(nèi)酰胺類抗生素在腸道中引起的不良反應(yīng)的方法，其包括向有此需要的人施用有效量的式II的經(jīng)修飾金屬P-內(nèi)酰胺酶或含有該酶的藥物組合物。本發(fā)明的具體實施方案在從屬權(quán)利要求中提列出。通過以下附圖、詳述和實施例，本發(fā)明的其它目的、細節(jié)和優(yōu)點將變得更加明晰。圖l顯示了蠟狀芽孢桿菌(及98ME1552P-內(nèi)酰胺酶基因的完整核苷酸序列和經(jīng)推導(dǎo)的氨基酸序列。圖2顯示了源自pRSH315表達構(gòu)建體的蠟狀芽孢桿菌98ME1552P-內(nèi)酰胺酶基因的完整核苷酸序列和經(jīng)推導(dǎo)的氨基i^列。預(yù)測解淀粉芽孢桿菌(必""7/i/sflij^//^^/flc/e/fs)的31個氨基酸殘基長的信號序列的裂解位點位于-1位的丙氨酸和+1位的谷氨酰胺之間。在NHr末端延伸的源自H,7^in克隆位點的NH2-QAS三肽用粗體表示。圖3顯示了源自pRSH318表達構(gòu)建體的蠟狀芽孢桿菌98ME1552P-內(nèi)酰胺酶基因的完整核香酸序列和經(jīng)推導(dǎo)的氨基酸序列。預(yù)測解淀粉芽孢桿菌的31個氨基酸殘基長的信號序列的裂解發(fā)生在-1位的丙氨酸和+1位的谷氨酰胺之間。在NHr末端延伸的源自H/"dIII克隆位點的NH2-QAS三肽和KT插入物用粗體表示。發(fā)明詳述金屬P-內(nèi)酰胺酶制備物首先在包含完整金屬P-內(nèi)酰胺酶基因表達構(gòu)建體的枯草芽孢軒菌(5fl"7/i/ssm&i7/s)生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)出來，所述完整金屬|(zhì)3-內(nèi)酰胺酶基因編碼完整的金屬|(zhì)3酶。詳細的質(zhì)鐠分析表明，該金屬酶制備物包含多種具有不均一的氨基末端序列的酶變體。氨基末端序列的變化被認(rèn)為是宿主細胞蛋白酶進行翻譯后修飾的結(jié)果。所觀察到的該金屬酶氨基酸序列的改變增加了枯草芽孢桿菌生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)的酶在各批次間的差異，因此從調(diào)節(jié)角度來看阻礙其作為藥物蛋白質(zhì)的用途。因此，對于減少金屬(3-內(nèi)酰胺酶氨基末端序列中所觀察變化的分子生物學(xué)方法進行了研究。預(yù)計所述氨基末端區(qū)域?qū)γ傅拇呋阅軟]有實質(zhì)影響。此外，已發(fā)現(xiàn)該氨基末端區(qū)域受到枯草芽孢桿菌生產(chǎn)系統(tǒng)中蛋白酶的翻譯后修飾的影響，在所述生產(chǎn)系統(tǒng)中重組蛋白質(zhì)被分泌到細菌細胞外。為了減少所述氨基末端區(qū)域的這種微不均一性，通過PCR方法將編碼這一預(yù)測區(qū)域的核普酸序列缺失。但是，僅僅缺失本身并不會顯著降低氨基末端的異質(zhì)性。然而，出人意料的是，缺失連同插入二肽(其目的是協(xié)助翻譯后修飾)導(dǎo)致產(chǎn)生具有相同氨基末端修飾的單一金屬p-內(nèi)酰胺酶變體。本發(fā)明主要涉及用作藥物蛋白質(zhì)的經(jīng)修飾P-內(nèi)酰胺酶，還涉及重組|3-內(nèi)酰胺酶中間產(chǎn)物，后者是通過在其氨基末端截短并插入二肽而產(chǎn)生的，從而減少了P-內(nèi)酰胺酶變體的數(shù)目。這些修飾有助于同質(zhì)形式酶的重組生產(chǎn)，以用作j3-內(nèi)酰胺酶治療中的藥物材料，從而消除P-內(nèi)酰胺類(頭孢菌素類、碳青霉烯類和青霉素類，在存在或缺乏已知的P-內(nèi)酰胺酶抑制劑(如克拉維酸、舒巴坦和他佐巴坦)時)所引起的副作用。特別地，本發(fā)明涉及通過在氨基末端區(qū)域截短并插入二肽對活性金屬(3-內(nèi)酰胺酶進行有目的地翻譯后修飾，以降低枯草芽孢桿菌生產(chǎn)系統(tǒng)中氨基末端的異質(zhì)性。本文使用的"金屬P-內(nèi)酰胺酶"是指B類P-內(nèi)酰胺酶，即需要至少一個二價金屬離子(Zn2+)以發(fā)揮活性的P-內(nèi)酰胺酶；并且其構(gòu)成Bush-Jacoby-Madeiros功能分類的第3組(Bush，1998)?；谄渑浜箱\結(jié)合之區(qū)域的結(jié)構(gòu)相似性，金屬P-內(nèi)酰胺酶可分為三個亞組Bl、B2和B3(Galleni等，2001)。優(yōu)選地，本發(fā)明的金屬|(zhì)3-內(nèi)酰胺酶屬于Bl亞組。該亞組具有關(guān)鍵的鋅配合殘基三個組氨酸和一個半胱氨酸。有關(guān)亞組的更詳細信息已在本說明書
背景技術(shù)：
部分闡述。所述金屬P-內(nèi)酰胺酶是一個龐大的、多樣的具有類似的四層ap/l3a結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)超家族的成員。該多肽分為兩個結(jié)構(gòu)域，其分別包括順序如下的鏈和螺旋^p2J33P4l35a^6a2P7a3和P8P9pK)Pna4J3ua5(Carfi等，1995和1998a，以及Galleni等，2001)。^發(fā)明所述金屬|(zhì)3-內(nèi)酰胺酶在第二P鏈前的氨基末端被截短。優(yōu)選地，它們在第一和第二p鏈之間被截短，特別地，根據(jù)前述晶體結(jié)構(gòu)，在緊鄰第一和第二P鏈之間的谷氨酸之前被截短。通過類比針對絲氨酸P-內(nèi)酰胺酶的Ambler|3-內(nèi)酰胺酶編號方案(ABL)(Ambler，1980)，Garau等(2004),已建立了針對B類p誦內(nèi)酰胺酶的標(biāo)準(zhǔn)編號方案(BBL)。該BBL編號方案源自對已知的金屬p-內(nèi)酰胺酶X-射線結(jié)構(gòu)進行結(jié)構(gòu)比對，從而在一級氨基酸序列水平上同一性較低的金屬P-內(nèi)酰胺酶組中發(fā)現(xiàn)保守區(qū)域。Garau等的研究表明，第一個保守片段形成了蠟狀芽孢桿菌BcII金屬P-內(nèi)酰胺酶(由Carfi等，1995以及Carfi等，1998a提出)中第二卩-片層結(jié)構(gòu)。因此，蠟狀芽孢桿菌金屬l3-內(nèi)酰胺酶的Pr片層似乎不是酶功能所必需的，因為其不存在于其它金屬l3-內(nèi)酰胺酶的組中。然而，所有金屬P-內(nèi)酰胺酶的氨基末端區(qū)域均在第一a螺旋所形成片段之前具有四個保守p片層所形成之片段的二級結(jié)構(gòu)。因此，可將所述金屬P-內(nèi)酰胺酶的截短位點定義為不管是否最初存在l^鏈，保留所預(yù)測二級結(jié)構(gòu)中a螺旋之前的四個P鏈。在本文上下文中，使用常規(guī)的單字母代碼表示氨基酸。因此，A代表丙氨酸，R代表精氨酸，N代表天冬酰胺，D代表天冬氨酸，C代表半胱氨酸，E代表谷氨酸，Q代表谷氨酰胺，G代表甘氨酸，H代表組氨酸，I代表異亮氨酸，L代表亮氨酸，K代表賴氨酸，M代表甲硫氨酸，F(xiàn)代表苯丙氨酸，P代表脯氨酸，S代表絲氨酸，T代表蘇氨酸，W代表色氨酸，Y代表酪氨酸以及V代表纈氨酸。氨基酸序列表示為左邊是氨基末端，右邊是羧基末端。NH2-和-COOH可以標(biāo)明或不標(biāo)明。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，用能夠表達具有如下通式I的P-內(nèi)酰胺酶的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞NH2-K-T-E-ABL畫COOH，(I)其中K代表賴氨酸，T代表蘇氨酸，E代表谷氨酸，ABL代表在所述蛋白質(zhì)第二P-鏈之前的氨基末端被截短的金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白，由此具有通式II的蛋白質(zhì)NH2-E-ABL-COOH，(II)是由式I的蛋白質(zhì)經(jīng)過翻譯后修飾形成的。通式I的蛋白質(zhì)可通過將編碼KT的DNA序列與編碼E-ABL的DNA序列連接而方便地產(chǎn)生，其中E-ABL是芽孢桿菌(特別是蠟狀芽孢桿菌)的金屬(3-內(nèi)酰胺酶，其在氨基末端第二P鏈之前緊鄰谷氨酸殘基處被截短。特別地，所述核苷酸構(gòu)建體包含SEQIDNO:2的94-756位連續(xù)核苷酸。在金屬P-內(nèi)酰胺酶各組間以及各亞類間的不具有剛性結(jié)構(gòu)之氨基末端區(qū)域的長度是不同的。芽孢桿菌屬物種的金屬p-內(nèi)酰胺酶在第二p鏈之前的氨基末端序列也有不同，但大多數(shù)酶在+12位具有一個保守的谷氨酸(參見表l)。因此，在谷氨酸附近缺失連同插入KT可應(yīng)用至已知的金屬P-內(nèi)酰胺酶，在該情形中，從天然存在的成熟P-內(nèi)酰胺酶蛋白將前11個氨基末端氨基酸缺失。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，P-內(nèi)酰胺酶在氨基酸KT和E之間被截短，特別是在VIKN和E之間，或VMKN和E之間。表l.芽孢桿菌屬物種的金屬(3-內(nèi)酰胺酶與P2A之間氨基末端序列的比較蛋白質(zhì)P2AQ2AJV1P10425Q734F3P04190Q81AW2Q93T40Q6SPY5Q4MXZ5P14488Q6HFY5芽孢桿菌菌抹蠟狀芽孢桿菌98ME1552韋氏芽孢桿菌KBAB4芽孢桿菌屬物種(菌抹170)蠟狀芽孢桿菌ATCC10987蠟狀芽孢桿菌569/HfATCC14579/DSM31炭疽芽孢桿菌Steme青霉素抗性炭疽芽孢桿菌蠟狀芽孢桿菌G9241蠟狀芽孢桿菌5/B/6蘇云金芽3包桿菌97-27_氛基端區(qū)域EQKLiEQIY^EGKLEQKVISQKVEQIV工EQKLEQKVI:SQKVEKTV工:SQKVEKTVIEKKVEHKVIERKVEHKVI:SQKVEQ:—ERTVEHKVI:ERTVEHKVI''GTISISOLNKJTGT工S工SOLNKTGTISISOLNK.GTIS工SOLNKTISISOLNK'GT工SISOLNKTGTISISOUJKTISISOLNK.GTISISOLNKGTISISOLNKiTGT工SISOLNK*替換氨基酸用粗體標(biāo)示，保守的谷氨酸(E)用陰影標(biāo)示。金屬(3-內(nèi)酰胺酶的第一P-鏈用單下劃線標(biāo)示，第二P-鏈用雙下劃線標(biāo)示。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，E-ABL與SEQIDNO:3的6-221連續(xù)氨基酸殘基至少具有70%、80%、90%、95%、98%或99%的氨基酸序列同一性?？墒褂萌鏏ltschul等(1997)所描述的BLAST(基本局部比對搜索工具，BasicLocalAlignmentSearchTools)來確定序列同一性確。特別地，E-ABL是具有SEQIDNO:l所述序列的金屬P-內(nèi)酰胺酶的截短形式，或J3-內(nèi)酰胺酶活性變體或其片段。例如，它可以是蠟狀芽孢桿菌金屬P-內(nèi)酰胺酶BcII的截短形式。優(yōu)選地，E-ABL的氨基末端對應(yīng)于SEQIDNO:1的12-15、12-19或12-23位氨基酸殘基，另外在+13位的氨基酸可以是T(蘇氨酸)或A(丙氨酸)。針對氨基酸序列的特定氨基酸序列"變體"是指與該特定氨基酸序列不同、而包含至少某些氨基酸變化(即缺失、替換、倒位、插入等)的氨基酸序列，其中與該特定氨基酸序列相比，所述氨基酸變化基本不影響該蛋白質(zhì)的生物活性。本文所述生物活性是指P-內(nèi)酰胺酶活性。變體可以是天然存在的多肽，例如相同菌林、菌種或菌屬的等位基因變體，或者也可由突變產(chǎn)生。認(rèn)為"片段"是特定氨基酸序列的一部分，它足夠長以具有所需的生物活性(即(3-內(nèi)酰胺酶活性)。換言之，所述片段可以是例如具體公開的j3-內(nèi)酰胺酶的亞序列(subsequence),可以將所述編碼NH2-K-T-E-ABL-COOH的核苷酸構(gòu)建體插入表達載體中，并轉(zhuǎn)化到宿主細胞中。然后在使所述蛋白質(zhì)能夠表達并且翻譯后修飾為NH2-E-ABL-COOH的條件下培養(yǎng)宿主細胞，從而可獲得基本純化形式的蛋白質(zhì)(這意味著至少卯％、優(yōu)選至少95%、特別是至少99°/。的以NH2-E-ABL-COOH單一形式存在的金屬P-內(nèi)酰胺酶)。所表達蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(即切割KT二肽)通過宿主的蛋白酶進行催化。宿主可以是真核或原核細胞，如細菌、酵母或真菌細胞。例如，細菌宿主可以是大腸桿菌。優(yōu)選地，所述宿主屬于芽孢桿菌屬物種，特別是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，NH2-K-T-E-ABL-COOH可表達為含有信號肽的蛋白質(zhì)，由此該蛋白質(zhì)被分泌到培養(yǎng)基中，并且信號肽首先被切割，然后二肽被切割。在生產(chǎn)過程或儲存中，所述蛋白質(zhì)中可以發(fā)生另一些微小變化，如脫酰胺、氧化、二石克鍵斷裂或形成、異構(gòu)化、琥珀?；?succinimidation)、非二疏鍵交聯(lián)、美拉反應(yīng)(Maillardreaction)、去糖基化，只要其P-內(nèi)酰胺酶活性不受顯著影響即可接受。所述經(jīng)修飾|3-內(nèi)酰胺酶NH2-E-△BL-COOH可來自于任何能產(chǎn)生金屬P-內(nèi)酰胺酶的細菌。這樣的細菌包括例如腸桿菌屬(粘質(zhì)沙雷氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、弗氏志賀氏菌)、銅綠假單胞菌、5to^fl"m'扁扁/鄉(xiāng)緒"、不動桿菌屬、脆弱擬桿菌、蠟狀芽孢桿菌、氣味黃桿菌和脆弱擬桿菌。其它可能的來源包括氣單胞菌屬(Jen附0Wfls)、軍團菌屬()和寡養(yǎng)單胞菌屬(5tewWr—)物種。將該酶在成熟酶蛋白氨基末端第二p-鏈之前截短，使谷氨酸成為N-端氨基酸。如果細菌(3-內(nèi)酰胺酶中沒有合適的13殘基E，從該細菌只能得到ABL部分，則需要將KTE三肽偶聯(lián)到△BL之前以形成NH2-K-T-E-ABL-COOH蛋白。優(yōu)選地，所述經(jīng)修飾的j3-內(nèi)酰胺酶源自芽孢桿菌屬(尤其是蠟狀芽孢桿菌)。特別地，蠟狀芽孢桿菌P-內(nèi)酰胺酶的未經(jīng)修飾的成熟P-內(nèi)酰胺酶蛋白之N-端前11個氨基酸已被缺失。本發(fā)明的經(jīng)修飾P-內(nèi)酰胺酶可與任何可藥用的賦形劑或載體混合以形成藥物組合物。然后，將有效消除P-內(nèi)酰胺類抗生素在腸道內(nèi)產(chǎn)生不良反應(yīng)的劑量之經(jīng)修飾P-內(nèi)酰胺酶經(jīng)口服施用給正在接受一種或多種P-內(nèi)酰胺類抗生素治療的患者。所述P-內(nèi)酰胺酶制備物可在抗生素治療之前、同時或之后施用。因其對絲氨酸p-內(nèi)酰胺酶抑制劑不敏感，所以可用于在存在和缺乏所述抑制劑時消除抗生素。本發(fā)明通過以下非限制性的實例進行舉例說明。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，以上說明書中和實施例中給出的實施方案僅用于示例的目的，并且本發(fā)明的范圍可包括多種變化和修飾。實施例1.材料和方法細菌菌林及其生長條件所述細菌菌抹及其相關(guān)基因型與表型示于表2中。表2.細菌菌林及其相關(guān)基因型和表型<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>通常，將細菌于37匸以搖瓶模式在補充了適當(dāng)抗生素作為篩選試劑的復(fù)合Luria培養(yǎng)基(每升含5g酵母提取物、10g胰蛋白胨和10g氯化鈉)中進行培養(yǎng)。在發(fā)酵中使用補充了適當(dāng)抗生素的合成培養(yǎng)基。使用改良的合成培養(yǎng)基來獲得枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞。上述培養(yǎng)基的具體組合物在WO03/040352中描述。DNA技術(shù)根據(jù)Sambrook和Russell(2001)進行常規(guī)的DNA技術(shù)操作(包括例如限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳和連接)。利用Marmur法(Marmur，1961)來分離染色體DNA。使用Qiagen質(zhì)粒中提試劑盒并參照制造商的說明書(QiagenPlasmidPurificationHandbook,1999)來提取質(zhì)粒DNA，但是操作方法中加入了溶菌酶處理(lmg/ml)步驟以降解肽聚糖層。將溶菌酶補充到Pl緩沖液中，并將細胞在37X:孵育30分鐘。PCR通常根據(jù)WO03/040352所述進行操作。表征各種形式的金屬P-內(nèi)酰胺酶的氨基末端區(qū)域為了測定N-端氨基酸序列和質(zhì)鐠，將純化的金屬P-內(nèi)酰胺酶樣品進行反相色鐠處理，并以線性梯度(從0%到100%)的0.1%TFA(三氟乙酸)和0.075%TFA-乙腈對所述酶進行分級分離60分鐘。4吏用AppliedBiosystemsmodel494A蛋白質(zhì)測序儀，利用自動Edman降解法來確定金屬P-內(nèi)酰胺酶的NHr末端序列形式。使用雜交四極桿-飛行時間質(zhì)鐠儀(hybridquadrupole-time-of畫flight(Q-TOF)instrument)對金屬P-內(nèi)酰胺酶形式進行質(zhì)鐠分析。已假定金屬P-內(nèi)酰胺酶變體提供可比較的電離勢，可使用其來評估它們在樣品中的相對比例。使用自動DNA測序儀，利用雙脫氧鏈終止法來測定P-內(nèi)酰胺酶基因的核苷酸序列。實施例2.蠟狀芽孢桿菌98ME1552金屬P-內(nèi)酰胺酶基因的完整核普酸序列通過先后4吏用PCR和小載體技術(shù)(Vectorettetechniques)來確定編碼金屬P-內(nèi)酰胺酶的完整基因。對部分結(jié)構(gòu)基因進行PCR擴增，其中使用臨床分離的蠟狀芽孢桿菌98ME1552的經(jīng)分離染色體DNA作為模板，并使用設(shè)計成與蠟狀芽孢桿菌569/H金屬P-內(nèi)酰胺酶基因的SQKVEKTVI編碼區(qū)雜交(正向引物)以及與其HTLDLL編碼區(qū)雜交(反向引物)的引物。兩條引物均帶有H/m/III限制酶切位點。用H/"dIII消化經(jīng)擴增的DNA片段(約700bp),然后將其連接到分泌型載體pKTH141的Fi7h/III位點上。用該連接混合物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌IH6140感受態(tài)細胞。利用DNA測序?qū)Π磉_金屬P-內(nèi)酰胺酶之質(zhì)粒的克隆進行鑒定。該質(zhì)粒被命名為pRSH314。用pRSH314質(zhì)粒轉(zhuǎn)化如WO03/04052所述制備的枯草芽孢桿菌RS303感受態(tài)細胞，得到枯草芽孢桿菌RS314菌林。通過使用小載體PCR技術(shù)獲得的PCR片段來確定金屬(3-內(nèi)酰胺酶基因的完整DNA序列，具體如下用限制性內(nèi)切酶消化蠟狀芽孢桿菌98ME1552的染色體DNA，然后將其連接至經(jīng)K/wdIII處理的小栽體。在PCR反應(yīng)中通過使用MEBLSQ-F(5'-AGGAAATGTTGCGGATGC)或MEBLSQ-R(5'-CCTTCGTTAATTTGTTATCCC)起始引物來篩選所得到的小載體庫，所述起始引物設(shè)計自pRSH314的700bpDNA序列。用MEBLSQ-F引物對小載體文庫進行PCR篩選得到約1000bp的片段(MEBL1片段)，而用MEBLSQ-R引物則得到約1100bp的>段(MEBL2片段)。MEBL1和MEBL2片段經(jīng)電泳后從瓊脂糖凝膠中純化出來。通過DNA測序確定上述兩個片段的核苷酸序列，從而得到蠟狀芽孢桿菌98ME1552金屬P-內(nèi)酰胺酶基因的完整核苷酸序列。蠟狀芽孢桿菌98ME1552金屬卩-內(nèi)酰胺酶基因的完整核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列示于圖1中。該氨基酸序列也作為SEQIDNO:1。其開放讀碼框編碼257個氨基酸的多肽，其氨基末端序列(30個氨基酸殘基)表現(xiàn)出細菌信號肽的典型特征，所述細菌信號肽可通過一般的分泌途徑將蛋白質(zhì)分泌到細胞膜外。預(yù)測的信號肽切割位點在-30位的丙氨酸之后(參見圖1)。所計算的227個氨基酸殘基的成熟蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和pi值分別為24877.3Da和6.0。使用該98ME1552金屬|(zhì)3-內(nèi)酰胺酶序列作為BLAST搜索中的搜索模板以鑒定蛋白質(zhì)。使用瑞士生物信息研究所(SwissInstituteofBioinformatics)的SIBBLAST網(wǎng)絡(luò)月艮務(wù)(http:〃www.expasy.org/tools/blast/)來進行BLAST搜索。該搜索是針對基于UniProtKBKnowledge的數(shù)據(jù)庫、使用NCBIBLASTP2.2.13程序(Altschul等，1997)、利用BLOSUM62算法以及空隙罰分(gappenalties)為11、延伸(extension)為1來進行的。使用98ME1552金屬(3-內(nèi)酰胺酶進行BLAST搜索得出，其與其它Bl亞組的B類P-內(nèi)酰胺酶的相似性得分最高。如預(yù)期地，98ME1552P-內(nèi)酰胺酶與其它蠟狀芽孢桿菌的P-內(nèi)酰胺酶表現(xiàn)出高度的同一性(超過90%)。根據(jù)對多種蠟狀芽孢桿菌金屬P-內(nèi)酰胺酶進行結(jié)構(gòu)比對，預(yù)測蠟狀芽孢桿菌98ME1552內(nèi)酰胺酶中的氨基酸替換位于基本不影響該酶功能的區(qū)域。實施例3.在枯草芽孢桿菌中克隆和表達蠟狀芽孢桿菌98ME1552金屬P-內(nèi)酰胺酶基因基于從小載體文庫獲得的DNA序列，設(shè)計了如下的新引物BLC1-F(5'-CGCGAAGC丌CCGAACMMGCTAGAGCAAATAGTAATG),以及BLC1國R(5'-GCCGAAGCrnTATnTAAT/y\ATCCMTGTATGTAAMGTAATCCC)，設(shè)計上述引物用于在PCR中得到編碼完整金屬j3-內(nèi)酰胺酶的DNA插入片段。該引物的末端還帶有H/m/III位點，并使用經(jīng)純化的蠟狀芽孢桿菌98ME1552染色體DNA作為模板。用H/"dIII消化經(jīng)擴增的約0.7kb的PCR片段，并將其連接至pKTH141分泌型載體的ZT/"rfIII位點。將上述連接混合物轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌RS303感受態(tài)細胞中。將其中一個陽性克隆定名為RS315,其包含的表達構(gòu)建體稱為pRSH315。將pRSH315表達構(gòu)建體進行分離，并對插入?yún)^(qū)域進行測序。所克隆的金屬P-內(nèi)酰胺酶基因的核苷酸序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列與從小載體文庫確定的序列相同。所測定的DNA序列表明下述序列之間符合讀框地融合編碼解淀粉芽孢桿菌a淀粉酶的31個氨基酸長的信號肽核苷酸序列，H/"rfIII克隆位點和完整的蠟狀芽孢桿菌98ME1552金屬P-內(nèi)酰胺酶基因(參見圖2)。預(yù)計信號肽酶將切割-l位的丙氨酸(A)和+1位的谷氨酰胺(Q)之間的肽鍵。成熟的金屬|(zhì)3-內(nèi)酰胺酶氨基末端具有源自表達構(gòu)建體中的H/m/III克隆位點的NHrQAS-三肽延長。因此，根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列，成熟的經(jīng)修飾金屬P-內(nèi)酰胺酶由230個氨基酸殘基組成。實施例4.確定從枯草芽孢桿菌生產(chǎn)系統(tǒng)獲得的金屬P-內(nèi)酰胺酶變體的氨基末端氨基酸序列為了進一步進行表征，重組金屬P-內(nèi)酰胺酶通過使用合成生長培養(yǎng)基在搖瓶或發(fā)酵設(shè)備中培養(yǎng)進行生產(chǎn)。該金屬p-內(nèi)酰胺酶能夠有效地被分泌到培養(yǎng)上清中。通過離子交換色譜法將該酶從濃縮的培養(yǎng)上清中純化出來。在兩個單獨的級分中觀察到酶活性。對經(jīng)純化的酶級分進行氨基末端測序和質(zhì)鐠分析。分析顯示，這兩個級分均包含帶有異質(zhì)氨基末端的酶形式。各種酶形式及其相對比例示于表3中。參照推導(dǎo)出的氨基酸序列，所有酶形式在其氨基末端區(qū)域都有不同長度的缺失。通常，所有酶形式中似乎都有NHrQASEQKLE八肽缺失。此外，級分2中的最小酶形式還缺少IVIKN-五肽。所觀察到的NH2-末端區(qū)域的微不均一性可解釋為由不同的宿主細胞蛋白酶進行翻譯后修飾所造成的。表3.經(jīng)推導(dǎo)和確定的氨基末端序列以及經(jīng)確定的經(jīng)截短金屬P-內(nèi)酰胺酶形式的分子量<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例5.在枯草芽孢桿菌生產(chǎn)系統(tǒng)中構(gòu)建蠟狀芽孢桿菌98ME1552缺失金屬P-內(nèi)酰胺酶形式及其氨基末端變體為了設(shè)法減少NHr末端的異質(zhì)性，通過PCR將編碼金屬P-內(nèi)酰胺酶基因可變區(qū)NH2-EQKLEQIVIKN的DNA序列缺失。蠟狀芽孢桿菌98ME1552的完整金屬P-內(nèi)酰胺酶基因被用作PCR中的模板，其中正向引物與ETGTISISQ編碼序列雜交，反向引物與GLLLHTLDLLK編碼序列雜交并跟有翻譯終止密碼子TAA。這兩條引物均帶有III位點。將所獲得的約0.7kb的PCR片段克隆進pKTH141分泌型載體的歷/H/III位點，然后將上述連接混合物轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌RS303感受態(tài)菌林中。通過對分離自陽性克隆中的表達構(gòu)建體中插入的金屬p-內(nèi)酰胺酶基因進行DNA測序來驗證NHr末端缺失。該轉(zhuǎn)化菌株被定名為枯草芽孢桿菌RS317,該表達構(gòu)建體稱為pRSH317。經(jīng)截短的金屬P-內(nèi)酰胺酶在枯草芽孢桿菌生產(chǎn)宿主中進行生產(chǎn)，采用離子交換色鐠法將該酶從培養(yǎng)上清中純化出來，其中有活性的酶作為單一級分被洗脫下來。將該酶級分進行NHr末端測序和分子量分析。所觀察的結(jié)果(在表4中)表明，經(jīng)截短的金屬p-內(nèi)酰胺酶也具有異質(zhì)的氨基末端。大部分酶變體的氨基末端序列與推導(dǎo)的氨基酸序列(其包含編碼起始QAS-三肽的HiV^III位點)一致。發(fā)現(xiàn)少數(shù)酶變體缺失QA-二肽。由于氨基末端封閉，從任一變體均不能獲得氨基酸序列。氨基末端封閉可能是由于在生產(chǎn)過程中谷氨酰胺殘基環(huán)化形成焦谷氨酰殘基所致。總之，氨基末端的缺失并沒有從根本上減少氨基末端的微不均一性。表4.經(jīng)確定的經(jīng)截短金屬P-內(nèi)酰胺酶形式的氨基末端序列和分子量酶級分編號經(jīng)推導(dǎo)的NHr端氨基酸序列經(jīng)確定的NH2-端序列級分中酶形式的相對比例(w質(zhì)量分析(KDa)NH2-QASETGTISI1.a.谷氨酰胺的環(huán)狀形式—無M酸序列a.23.823b.NH2^QASETG"HSIc.NH2-SETGTISIb.90c.10b.23.840c>23.641實施例6.構(gòu)建包含KT編碼序列插入物的蠟狀芽孢桿菌98ME1552經(jīng)截短金屬j3-內(nèi)酰胺酶為了避免翻譯后修飾，設(shè)計金屬P-內(nèi)酰胺酶的分子截短形式包括將編碼NH2-EQKLEQIVIKN區(qū)域的DNA序列缺失以及在直接位于3，-H/"rfin克隆位點下游插入KT二肽編碼序列。如實施例5制備經(jīng)修飾的金屬P-內(nèi)酰胺酶基因，除了其正向引物包含編碼KT的DNA序列以外。用^T/"dIII對所述PCR片段進行酶切，并將其連接到pKTH141分泌型載體的H,VidIII位點中，然后將該連接20混合物轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌RS303感受態(tài)細胞中。通過DNA測序驗證表達構(gòu)建體中經(jīng)修飾金屬P-內(nèi)酰胺酶基因的核普酸序列的正確性。其中一個陽性克隆被定名為枯草芽孢桿菌RS318,其表達載體稱為pRSH318。來自pRSH318的蠟狀芽孢桿菌98ME1552P隱內(nèi)酰胺酶的核苷酸序列和經(jīng)推導(dǎo)的氨基酸序列示于圖3中，并分別作為SEQIDNO:2和3。如前所述生產(chǎn)、純化并分析經(jīng)截短的金屬P-內(nèi)酰胺酶。有活性的經(jīng)截短金屬酶作為一個單一峰從柱上洗脫下來。該單一級分包含具有同質(zhì)氨基末端谷氨酸殘基(NH2-E;參見表5)的金屬P-內(nèi)酰胺酶。因此，KT-二肽的插入導(dǎo)致翻譯后修飾的發(fā)生，從而產(chǎn)生氨基末端一致的氨基酸序列。所述經(jīng)截短的金屬l3-內(nèi)酰胺酶被命名為P2A蛋白。表5.經(jīng)截短金屬j3-內(nèi)酰胺酶的經(jīng)推導(dǎo)和確定的氨基末端序列和經(jīng)確定的分子量<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實施例7.P2A金屬P-內(nèi)酰胺酶的酶動力學(xué)參數(shù)使用不同類型的P-內(nèi)酰胺類(包括青霉素家族(存在或不存在絲氨酸j3-內(nèi)酰胺酶抑制劑)、第二代和第三代頭孢菌素類以及碳青霉烯類(美羅培南))對P2A酶的催化性能多樣性進行研究。該酶的動力學(xué)參數(shù)kcat和Km通過哈尼斯圖(Hanesplot)由初始速率來確定。該反應(yīng)于30匸在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中進行。除了美羅培南測定中使用1.7pmol的酶以外，其它反應(yīng)中反應(yīng)試管(1亳升)均含有約5pmol的酶。利用分光光度法，在特異性針對每種底物的波長處記錄對不同P-內(nèi)酰胺底物的水解。代表來自3次獨立測量之平均值的不同動力學(xué)參數(shù)值(keat、Km和kcat/Km)示于表6中。表6.P2A金屬P-內(nèi)酰胺酶的動力學(xué)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實施例8.P2A蛋白在人回腸食糜中的穩(wěn)定性對腸蛋白酶的耐受性是影響P2A蛋白作為藥物材料在小腸靶向P-內(nèi)酰胺酶治療中的可用性的最重要因素之一。通過向含有回腸食糜的試管中加入不同數(shù)量的活性酶來測試金屬P-內(nèi)酰胺酶對小腸蛋白酶作用的敏感性。通過在不同時間點測量回腸食糜樣品中|3-內(nèi)酰胺酶的活性來監(jiān)測金屬P-內(nèi)酰胺酶的水解。在所述活性測定中，使用美羅培南作為底物。來自4個獨立實驗所得的結(jié)果以及平均值示于表7中。P2A酶似乎是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，其在人回腸食糜中被清除的半衰期為55分鐘(平均值)。不同實驗之間觀察到的半衰期差異很大。然而，對P2A在人小腸食糜中的半衰期進行的評估認(rèn)為，該半衰期對于成功應(yīng)用P2A酶治療以消除腸道中殘存P-內(nèi)酰胺引起的不良反應(yīng)4X夠的。表7.人回腸食糜中P2A金屬P-內(nèi)酰胺酶的半衰期(體外)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>參考文獻AltschulS.F.,MaddenT丄.，Sch甜erA,A.,Zhang丄,ZhangZ.，MillerW.,LipmanDJ.1997,GappedBLASTandPS卜BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes.25:3389-3402Ambler,R.P.1980.Thestructureofbeta-lactamases.Phi,os.Trans.R.Soc.LondonB289:321-331.Bush,K,1998.Metallo~p-lactamases:aclassapartClin.Infe汰Dis,32:271-276.CarfjA，Du的E,GaleniM,FrereJM，andDidebergO.1998a.1.85Aresolutionstructureofthezinc(l，)beta-lactamasefromBacilluscer-eus.ActaCrystallogrDBiolCrystallogr.54:313-323.CarfiA，Du的E,Paul~SotoR,GalleniM，F(xiàn)rereJM,andDideberg0.1998b.X-raystructureoftheZnllbeta-lactamasefromBacteroidesfragilfsinanorthorhombiccrystalform.ActaCrystallogrDBiolCrystailogr.54:45~57.Carfi,A"Pares,S.，Duee，E"Gal，eni，M"Duez，C>tFrare，丄M.，andDidebergO.1995.The3-Dstructureofazincmetallo-beta-lactamasefromBacilluscereusrevealsanewtypeofproteinfold-EMBO丄14:49144921.Concha,N.O.，Janson，C,A.，RowUng，P.，Pearson,S"Cheever,C,A，Clarke,B.P.，L柳ls，C.，Gal，eni,M.，F(xiàn)r柳，丄M.，Payne,D丄，Bateson'丄H,，andAbde卜Meguld,S.S.2000.Crystalstructureofthe1MP-1metallobeta-lactamasefromPseucfomonasae/ug/nosaanditscomplexwithamer-captocarboxylateinhibitor:bindingdeterminantsofapotent,broad鄰ectruminhibitor.Biochemistry.39:4288-4298.Gal'eni,M,，Lamotte~Brasseur,J.,Rossolini,G.M,，Spencer,丄,Dideberg,O.,andFrere,丄M.2001.Metalfo-beta-lactamasesStandardnumberingschemeforclassBbeta-lactamsses,Antimicrob-AgentsChemother.45:660-663Garau，G.，GarciaSaez,l.，Bebrone，C.,Arine，C.，Mercuri，P.，Gall的i'M.,Frere,丄WI.，andDWeberg,O.2004.UpdateofthestandardnumberingschemeforclassBbet曰-lactamases.Antimicro—-AgentsChemother.48:2347-2349.Garau,G"Bebrone，C-,Anne，C.，Galleni,M.,Frere，丄M.，Dideberg,O.2005.Ametallo-beta-lactamaseenzymeinaction:crystalstructuresofthemonozinccarbapenemaseCphAanditscomplexwithbiapenem.JMolBiol.345:785-795.Harmoinen，丄，Mentula，S.，Heikk脂,M.，vanderRestM,，Rajaa-Schulfz，P.丄'Donskey，C.丄，F(xiàn)rlas，R.,Koskl，P.,Wfckstrand，N.，JousNmies-Somer，H.'Westermarck，E.,Lindevall，2004.OralTargetedRecombinantBeta-LactamasePreventsAmpiciH'in-nducedSelectivePressureontheGutMicrobiota:ANovelApproachtoReduceAntimicrobialResistanceAn-timicrob.AgentsandChemotherapy.48:75-79.Marmur，J.1961.Aprocedurefortheisolationofdeoxyribonucleicacidfrommicro-organisms.丄Mol.Biol,3:208-218.Mentula,S.，Harmoinen，丄，Koski，P.，Westermarck，E.'Huovi-nen，P.，andK3n6nen，E.2004.Inhibitionofampicillin掘ucedemergenceofresistanceinintestinalcoliformsbytargetedrecombinarrtbeta-lactamase.lnt,丄Antimicrob.Agente.24:555-561.Sambrook,J.，andRussell,D.W.2001.Molecularcloning,aLaboratoryManual.ColdSpringHaitourLaboratoryPressColdSpringHarbour,NewYork.Stiefel，U.，Pultz，N.丄，Harmoinen,丄，Kosk，P.，Lindevall,K.'Hdfand,M.S.,Donskey,C丄2003.Oralp-lactamaseadministrationpreservescolonizationresistanceofpiperacillin-treatedmice.JInfectDis.10:1605-1609.Stiefel,U.，Harmoin抓，丄,K。ski，P.，Kaariainen,S-，Wickstrand，N.,Lindeval，,K.，Pultz，N.J.,Bonomo，RA，Helfand，M.S.,andDonskey,C,丄2005.Orallyadministeredrecombinantmetallo-beta-lactamasepreservescolonizationresistanceofpiperaci川n-tazobactam誦treatedmice.Antimicrab.AgentsChemother.49:5190-5191.Walsh,T.R.，Toleman，MA，P6irel,L，andNordmlann,P.2005.Metallo-beta-lactamases:thequietbeforethestormCliniWicrobiolRev.18:306"32權(quán)利要求1.具有如下通式的經(jīng)修飾金屬β-內(nèi)酰胺酶蛋白NH2-K-T-E-ABL-COOH其中K代表賴氨酸T代表蘇氨酸E代表谷氨酸，以及ΔBL代表已在氨基末端被截短的金屬β-內(nèi)酰胺酶蛋白，從而保留了所述蛋白質(zhì)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)中第一α-螺旋之前的四個β-鏈。2.包含編碼權(quán)利要求1所述的金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白之核普酸序列的經(jīng)分離核苷酸分子。3.權(quán)利要求2所述的核苷酸分子，其包含SEQIDNO:2的94-756位連續(xù)核苷酸。4.含有權(quán)利要求2所述的核苷酸分子的表達載體。5.能夠表達由權(quán)利要求2所述的核苷酸分子所編碼的金屬p-內(nèi)酰胺酶蛋白的宿主細胞。6.權(quán)利要求5所述的宿主細胞，其分泌所述金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白。7.權(quán)利要求5或6所述的宿主細胞，其為芽孢桿菌屬物種(5fl"7/"s5/，/;.)，特別是地衣芽孢桿菌(及//c/^"(/i^附/s)或枯草芽孢桿菌(5.swM//51)。8.具有如下通式的經(jīng)修飾金屬(3-內(nèi)酰胺酶蛋白<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中E代表谷氨酸，以及ABL代表已在氨基末端被截短的金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白，從而保留了所述蛋白質(zhì)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)中第一a-螺旋之前的四個P-鏈。9.權(quán)利要求8所述的金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白，其屬于金屬P-內(nèi)酰胺酶的Bl亞纟且。10.權(quán)利要求9所述的金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白，其中經(jīng)截短的P-內(nèi)酰胺酶來源于芽孢桿菌屬，特別是來源于蠟狀芽孢桿菌(及"""s)。11.權(quán)利要求10所述的金屬P-內(nèi)酰胺酶，其中E-ABL源自缺失成熟金屬P-內(nèi)酰胺酶的前11個氨基末端氨基酸。12.權(quán)利要求9所述的金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白，其中E-ABL序列與SEQIDNO:3的6-221位連續(xù)氨基酸殘基所示氨基酸序列具有至少80%的同一性。13.權(quán)利要求9所述的金屬(3-內(nèi)酰胺酶蛋白，其中E-ABL序列是具有SEQIDNO:1所示序列的金屬卩-內(nèi)酰胺酶的截短形式，或(3-內(nèi)酰胺酶活性變體或其片段。14.權(quán)利要求9所述的金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白，其中E-ABL源自在氨基酸KN和E之間截短金屬J3-內(nèi)酰胺酶。15.—種制備經(jīng)修飾金屬(3-內(nèi)酰胺酶蛋白的方法，該方法包括在使具有如下通式的金屬P-內(nèi)酰胺酶能夠表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求5的宿主細胞NH2-K-T-E-ABL-COOH,其中K代表賴氨酸T代表蘇氨酸E代表谷氨酸，以及ABL代表已在氨基末端被截短的金屬P-內(nèi)酰胺酶蛋白，從而保留了所述蛋白質(zhì)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)中第一a-螺旋之前的四個P-鏈，并進行翻譯后修飾，以得到具有如下通式的金屬P-內(nèi)醜胺酶NH2國E畫ABL畫COOH,其中E和ABL如上定義，以及任選地，分離和純化所獲得的翻譯后修飾蛋白質(zhì)。16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述金屬(3-內(nèi)酰胺酶蛋白表達為包含信號序列的形式，由此該蛋白質(zhì)可從宿主細胞分泌出來。17.權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)在芽孢桿菌屬物種、特別是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌中產(chǎn)生。18.包含權(quán)利要求8的經(jīng)修飾金屬P-內(nèi)酰胺酶的藥物組合物。19.權(quán)利要求8所述的經(jīng)修飾金屬(3-內(nèi)酰胺酶用作藥物。20.權(quán)利要求8所述的經(jīng)修飾金屬P-內(nèi)酰胺酶用于制備消除|3-內(nèi)酰胺類抗生素在腸道中引起不良反應(yīng)之藥劑的用途。21.權(quán)利要求20所述的用途，其中所述P-內(nèi)酰胺類抗生素選自頭孢菌素類、碳青霉烯類和青霉素類，所述抗生素在存在或缺乏絲氨酸P-內(nèi)酰胺酶抑制劑時被清除。22.—種用于治療P-內(nèi)酰胺類抗生素引起的腸道不良反應(yīng)的方法，其包括向有此需要的人施用有效量的權(quán)利要求8所述經(jīng)修飾金屬P-內(nèi)酰胺酶或權(quán)利要求18所述藥物組合物。全文摘要本發(fā)明涉及通過在氨基末端截短并插入二肽而對金屬β-內(nèi)酰胺酶進行靶向翻譯后修飾，以降低重組DNA生產(chǎn)系統(tǒng)中氨基末端的異質(zhì)性。表達K-T-E-ΔBL蛋白，并經(jīng)宿主蛋白酶修飾成E-ΔBL。還描述了合適的核苷酸分子、載體和宿主。E-ΔBL可用于治療在使用β-內(nèi)酰胺類抗生素治療的患者腸中由抗生素所誘導(dǎo)之副作用的藥物組合物中。文檔編號C12N9/78GK101484577SQ200780023477公開日2009年7月15日申請日期2007年6月19日優(yōu)先權(quán)日2006年6月21日發(fā)明者佩爾蒂·科斯基,尼娜·維克斯特蘭德,蘇珊娜·卡里艾寧申請人:Ipsat治療公司