專利名稱：：植物轉(zhuǎn)化用粘粒載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)化用新型載體，及其使用方法。
背景技術(shù)：
：一直以來，人們?yōu)榱酥参镛D(zhuǎn)化而進行了各種載體的開發(fā)。近年來，擬南芥(Jra6Wopw'51f/za"awa)、稻((9ry加sa^Va)的全基因組序列被闡明，植物基因組研究的焦點已經(jīng)由積累堿基序列信息轉(zhuǎn)移到闡明基因功能。在基因功能的闡明中，將被克隆化的DNA導(dǎo)入植物、并解析其表型變化的實驗是必須的。這時，如果能夠?qū)氪笃蔚腄NA,那么研究效率就可以飛躍性地提高。因此，人們以向植物導(dǎo)入大片段的DNA為目標(biāo)開發(fā)了多種載體。作為代表性的載體，制成了如pOCA18(01szewski等，1988年，NucleicAcisRes,,16巻10765-10782頁)、pLZ03(Lazo等，1991年，Bio/Technology,9巻963-967頁)那樣的植物轉(zhuǎn)化用粘粒載體。使用粘粒的優(yōu)點在于可以利用來自^噬菌體的包裝反應(yīng)，由此可以容易地克隆比較大的基因組片段(SambrookJ和RussellD.W.，2001年，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,冷泉港，紐約，美國)。在利用粘粒載體與包裝反應(yīng)的克隆中，因為載體與插入片段總計為40kb50kb，所以根據(jù)載體的大小，插入片段的大小限制在一定的范圍內(nèi)，且載體與插入片段的大小是逆相關(guān)的關(guān)系。pOCA18、pLZ03是在載體pRK290(Ditta等，1980年，Proc.Narl.Acad.Sci.USA，77巻:7347-7351頁)中重組了T-DNA的邊界序列、選擇標(biāo)記(卡那霉素抗性基因)等植物轉(zhuǎn)化用因子的載體，所述載體pRK290是具有在大腸桿菌和農(nóng)桿菌兩者中發(fā)揮功能的IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV)的代表性載體。這些載體因為載體自身的大小為24.3~30.lkb，所以可以利用包裝反應(yīng)克隆化的DNA的大小平均為20kb左右(pOCA18)、或13~22kb(pLZ03)左右。這些載體具有IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV),但pCIT103、pCIT104等載，117巻161-167頁)是除了IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV)之外還攜帶來自ColEl的復(fù)制起點的載體。另外，pC22(Simoens等，1986年，NucleicAcidsRes,14巻8073-8090頁)是具有來自ColEl的復(fù)制起點和來自Ri質(zhì)粒的復(fù)制起點的載體。除了它們之外，作為可以轉(zhuǎn)化植物的粘粒載體，有pMON565(Klee等,1987年，MolGenGenet,210巻282-287頁)、pCLD04541(Bent等，1994年，Science,265頁1856-1860頁)，但載體自身的大小分別為24kb、29kb，不適合克隆25kb以上的DNA片段。而且，pE4cos(16kb,Klee等，1987年，MolGenGenet，210巻:282-287頁)、pMON565、pLZ03、pOCA18、pCLD04541、pC22等是cos位點在T-DNA中的結(jié)構(gòu)。然后，作為能夠克隆長達150kb左右的DNA片段、并能夠?qū)胫参锏妮d體，有人開發(fā)了BIBAC載體(二元細菌人工染色體；Hamilton,美國專利第5733744號；Hamilton等，1996年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93巻9975-9979頁；Hamilton,1997年，Gene，200巻107-116頁)。它是在能夠保持巨大DNA片段的BAC載體中，重組了T-DNA的邊界序列、選擇標(biāo)記等植物轉(zhuǎn)化用因子，和農(nóng)桿菌用復(fù)制起點的載體。另外，作為能夠克隆長達80kb左右的DNA、并能夠?qū)胫参锏妮d體，有人開發(fā)了TAC載體(轉(zhuǎn)化-感受態(tài)細菌人工染色體)、pYLTAC7(Liu等，1999年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96巻:6535-6540頁)。它們是在利用了PI噬菌體的復(fù)制機理的大容量PAC載體(P1衍生人工染色體)中，重組了T-DNA的邊界序列、選4^標(biāo)記等植物轉(zhuǎn)化用因子，和農(nóng)桿菌用復(fù)制起點的載體。在這些載體中，為了穩(wěn)定保持巨大外源基因，重組了來自在大腸桿菌、農(nóng)桿菌中以每細胞單拷貝存在的質(zhì)粒的復(fù)制起點(ori)。即，作為大腸桿菌用ori，使用了F因子的ori(BIBAC)、PI噬菌體的ori(TAC),作為農(nóng)桿菌用ori，使用了發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的Riori(BIBAC、TAC—同)。但是，有人報告了，利用單拷貝質(zhì)粒的復(fù)制起點未必是必須的，具有每細胞幾拷貝的IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV)的載體pSLJ1711、pCLD045410可以穩(wěn)定保持大小超過100kb的植物基因組DNA片段(Tao和Zhang，1998年，NucleicAcidsRes，26巻4901-4909頁)。另外，除了這些之外，有人報告了在通用二元質(zhì)粒載體pBI121中導(dǎo)入了Riori的pBIGRZ(特開平10-155485)。但是，雖然這些載體能夠克隆遠超過50kb的大DNA片段，但是其克6隆操作繁瑣。為了克隆大DNA,需要熟練的技術(shù)、以及相當(dāng)?shù)臅r間和勞力。既然在利用BIBAC的轉(zhuǎn)化中需要過表達virG等的特殊農(nóng)桿菌，那么150kb的片段的轉(zhuǎn)化效率(選擇愈傷組織數(shù)/接種葉切片)也就比利用通常的小型載體時顯著降低(Hamilton等，1996年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93巻9975-9979頁；Shibata和Liu,2000年，TrendPlantSci,5巻354-357)。因此，通過BIBAC、TAC的大片段的植物轉(zhuǎn)化停留于某些特定的少數(shù)大片段的例子(例如，Hamilton等，1996年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93巻:9975-9979頁；Liu等，1993年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96巻6535-6540頁；Lin等,2003年,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100巻:5962-5967頁;Nakano等,2005年,MolGenGenomics,273巻:123-129)。此外，如上所述pCLD04541雖然是粘粒，但是因為其大小為29kb，所以在利用來自人噬菌體的包裝反應(yīng)時，能夠克隆化的DNA片段大小為10-20kb。如上所述，要克隆比這更大的DNA片段，因為不能利用包裝反應(yīng)，所以克隆操作繁瑣，需要相當(dāng)?shù)臅r間和勞力。近年來，伴隨高等植物的基因組研究的進展，基于DNA序列的多態(tài)性的遺傳學(xué)標(biāo)記，即所謂DNA標(biāo)記的使用也有所進步。基于利用DNA標(biāo)記的遺傳圖譜信息，將僅知道表型的高等植物的未知基因克隆化，即所謂定位克隆已經(jīng)經(jīng)常被人們所嘗試。一般來說，定位克隆的基本流程如下。1.使用比較小規(guī)模的分離群體，使用通用性高的DNA標(biāo)記，進行大體定位，尋找染色體上的候選區(qū)域。2.使用大規(guī)模的分離群體，使用新設(shè)計的DNA標(biāo)記在候選區(qū)域內(nèi)壓縮基因區(qū)域。3.確定基因區(qū)域的堿基序列，推測候選基因。4.將含有候選基因的DNA片段導(dǎo)入植物，基于表型，確認基因的效果、功能。在到目前為止的多個成功例子中，多數(shù)情況下在3.的工序中壓縮到1~3個左右基因，在4.的工序中導(dǎo)入幾個幾kb以內(nèi)的DNA片段。但是，壓縮到狹窄的基因區(qū)域未必容易。例如，在接近著絲粒的染色體區(qū)域，因為雜交后的基因重組頻率低，所以多數(shù)情況下不能壓縮到150kb以內(nèi)。另外，即使在可以壓縮時，多數(shù)情況下也必須將2.的工序重復(fù)實施，需要大量時間。另外，即使在可以壓縮到50kb左右的情況下，在3.的工序中，當(dāng)沒有將關(guān)于表型的信息與基因序列的信息相關(guān)聯(lián)的有力信息時，推測候選基因也極為困難。這樣，在定位克隆中，直到進行某種程度的壓縮(50kb-幾百kb)、特定1個~幾個由BAC載體克隆化的DNA片段作為候選區(qū)域之前的操作比較容易，但進一步進行分析，實際鑒定基因，多數(shù)情況下技術(shù)上較困難，即使是可能的情況下也多需要大量的勞力和時間。專利文獻l:美國專利第5733744號專利文獻2:特開平10-155485專利文獻3:WO2005/040374非專利文獻l:Olszewski等，1988年，NucleicAcisRes.，16巻10765-10782頁非專利文獻2:Lazo等，1991年,Bio/Technology，9巻:963-967頁非專利文獻3:Ditta等，1980年，Proc.Narl.Acad.Sci.USA'77巻7347-7351頁非專利文獻4:Ma等，1992年,Gene，117巻:161-167頁非專利文獻5:Simoens等，1986年，NucleicAcidsRes,14巻8073-8090頁非專利文獻6:Klee等，1987年，MolGenGenet，210巻:282-287頁非專利文獻7:Bent等，1994年,Science,265頁:1856-1860頁非專利文獻8:Hamilton等，1996年，Pro"Natl.Acad.Sci.USA,93巻9975-9979頁非專利文獻9:Hamilton,1997年，Gene，200巻107-116頁非專利文獻10:Liu等,1999年,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,%巻:6535-6540頁非專利文獻ll:Tao和Zhang,1998年，NucleicAcidsRes,26巻:4901-4909頁非專利文獻12:Shibata和Liu，2000年，TrendPlantSci，5巻354-357非專利文獻13:Lin等，2003年，Proc,Natl.Acad.Sci.USA，100巻:5962-5967頁非專利文獻14:Nakano等，2005年，MolGenGenomics,273巻123-129非專利文獻15:Pansegrau等，1994年，JMolBiol,239巻623-663頁非專利文獻16:Knauf和Nester，1982年,Plasmid,8巻:45-54頁非專利文獻17:Komari等,1996年，PlantJ,IO巻:165-174頁非專利文獻18:Zambryski等，1980年，Science,209巻1385-1391頁非專利文獻19:Schmidhauser和Helinski,J.Bacteriol.,164巻446-455頁，1985年非專利文獻20:Winans等，1986年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83巻8278-8282頁非專利文獻21:Pazour等,1992年，J.Bac，174巻:4169-4174頁非專利文獻22:Ward等，1988年，JBiolChem，263巻:5804-5814頁非專利文獻23:Frame等，2002年，PlantPhysiol,129巻13-22非專利文獻24:Hansen等,1994年，ProNAS,91巻:7603-7607頁非專利文獻25:Ishida等，1996年,NatBiotechnol,14巻:745-750頁非專利文獻26:Close等,1984年,Plasmid,12巻:111-118頁非專利文獻27:Jin等，1987年，JBacteriol,169巻4417-4425頁非專利文獻28:Wang，2000年，Gene，242巻105-114頁非專利文獻29:Okaumura和Kado,1992年，MolGenGenet,235巻55-63頁非專利文獻30:Christensen等，1992年，PlantMolBiol,18巻:675-689非專利文獻31:Bilang等，1991年,Gene，100巻:247-250非專利文獻32:Hirsch和Beringer，1984年，Plasmid,12巻139-141非專利文獻33:Konieczny和Ausubel,1993年，PlantJournal,4巻:403-410非專利文獻34:Hiei等，1994年，PlantJ,6巻271-282頁非專利文獻35:Ishida等，2003年，PlantBiotechnology,20巻57-66頁非專利文獻36:Hiei禾口Komari,2006年，PlantCell,TissueandOrganCulture,85巻271-283頁非專利文獻37:Komori等，2004年,PlantJ,37巻:315-325頁非專利文獻38:Kazama和Toriyama，2003年,FEBSLett，544巻:99-102頁
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題法能夠效率良好地選擇大量基因組DNA片段，并以克隆化的DNA片段的形式進行選擇、制備，該方法可以改善被確認在雜種優(yōu)勢中表達的性狀及數(shù)量性狀。本發(fā)明者們使用WO2005/040374所記載的方法，進行了可以帶來農(nóng)業(yè)上有益的變異的大小較大的基因組DNA片段的選擇。但是，對于將在大腸桿菌中保持的克隆轉(zhuǎn)移至農(nóng)桿菌(^groZ)ac欲^m)的操作，成功率為80%左右。而且，將使用了保持有克隆的農(nóng)桿菌的植物進行了轉(zhuǎn)化，結(jié)果是可以得到轉(zhuǎn)化植物的農(nóng)桿菌菌抹為60%左右。研究該結(jié)果，本發(fā)明者們研究了能否通過變化使用的載體，來較大地改善WO2005/040374的方法的效率。但是，使用目前所知的載體不能改善該方法的效率。所以，本發(fā)明的課題是提供一種新型載體，其例如在WO2005/040374所記載的方法中，選擇比較大的基因組片段，并改善克隆效率。另外，本發(fā)明的課題優(yōu)選是提供滿足下述全部條件的載體*能夠?qū)?5~40kb左右大小的DNA片段效率良好地克隆化；*能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌細胞中穩(wěn)定地保持；.能夠效率良好地導(dǎo)入農(nóng)桿菌；.在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中每細胞的拷貝數(shù)為4-5;.能夠僅將克隆化的目的DNA片段效率良好地導(dǎo)入植物，優(yōu)選是單子葉才直物。而且，本發(fā)明提供使用這樣的載體、用于以極高的效率向植物進行基因?qū)氲幕驅(qū)敕椒?。另外，本發(fā)明提供使用這樣的載體、迅速進行用于容易且以短時間完成定位克隆的基因區(qū)域壓縮的方法。而且，本發(fā)明提供可以通過與上述載體共存來進一步提高轉(zhuǎn)化效率的質(zhì)粒。用于解決問題的方法粘粒載體本發(fā)明的粘粒載體是完全滿足以下條件的全長15kb以內(nèi)的載體(以下稱為"pLC載體")。含有1)IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV),并且不含有其它種質(zhì)粒的復(fù)制起點；'含有2)IncP質(zhì)粒的trfAl基因；含有3)IncP質(zhì)4立的才妄合轉(zhuǎn)移起點(originofconjugativetransfer)(oriT);含有4)IncP質(zhì)粒的incCl基因；含有5)X噬菌體的cos位點，且該cos位點位于T-DNA的外側(cè)；含有6)在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌屬細菌中表達的抗藥性基因；含有7)農(nóng)桿菌屬細菌的T-DNA右邊界序列；含有8)農(nóng)桿菌屬細菌的T-DNA左邊界序列；含有9)植物轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記基因，該基因配置在7)與8)之間，在植物中表達；而且，含有10)用于克隆外源基因的限制性酶識別位點，該位點配置在7)與8)之間。本發(fā)明的載體是含有人噬菌體的cos位點的粘粒載體。因此，可以通過包裝反應(yīng)克隆比較大的基因組片段(SambrookJ和RussellD.W.，2001年，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,冷泉港，紐約，美國)。在利用粘粒載體的包裝反應(yīng)的克隆中，因為載體與插入片段總計為40-50kb左右，所以根據(jù)載體的大小，插入片段的大小被限制在一定范圍內(nèi)。因為本發(fā)明的載體的目標(biāo)是將長達25~40kb、優(yōu)選為30~40kb左右大小的DNA片段克隆化，所以載體的全長為15kb以下，優(yōu)選為12~14kb。1)IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV):oriV在大腸桿菌和農(nóng)桿菌兩者中均發(fā)揮功能。對本發(fā)明的oriV的堿基序列，只要是具有oriV的功能、即IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點功能的序列即可，不特別限制。對于oriV的諸多分子生物學(xué)特性，在Pansegrau等，1994年，JMolBiol,239巻623-663頁有詳細的記載，其已確定為Genbank/EMBL登記編號L27758(全長60099bp)的序列的第12200~12750位堿基。這相當(dāng)于序歹'T編號1的第3451~4002位堿基(oriV的核心序列)。oriV可以通過常規(guī)方法從pVK102(Knauf和Nester，1982年，Plasmid,8巻45-54頁)等IncP質(zhì)粒中制備。例如，作為oriV,可以使用通過PCR從pVK102中擴增出的0.9kb的DNA(序列編號1的第3345~4247位堿基)。或者，可以使用含有下述堿基序列、并具有oriV的功能的核酸，所述堿基序列在嚴格條件下與上述序列編號1的第3451-4002位、更優(yōu)選為第3345-4247位的堿基序列的互補鏈雜交。或者，可以使用含有下述堿基序列、并具有oriV的功能的核酸，所述堿基序列與上述序列編號1的第3451~4002位、更優(yōu)選為第3345~4247位的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員確認，有可能可以選4奪序列編號1的第3451-4002位中更短的區(qū)域作為發(fā)揮同等功能的核酸。發(fā)明者們對于在使用WO2005/040374所記載的方法時，最終的轉(zhuǎn)化效率止于約50%(80%x60%=48%)的原因進行了各種研究，認為可能的原因是使用克隆載體pSB200。pSB200的復(fù)制起點來自Co正l，但具有來自ColEl的復(fù)制起點的質(zhì)粒在每個大腸桿菌細胞中存在30-40拷貝，是比較多的拷貝。Tao和Zhang(1998年，NucleicAcidsRes，26巻:4901-4909頁)推測,大腸桿菌能夠穩(wěn)定地保持的外源DNA為每細胞1200~1500kb。根據(jù)該前提，在用pSB200將30~40kb的DNA克隆化時，如果連同載體的大小則DNA量為每細胞1200~2000kb，有可能超過上述的值。作為另一個需要考慮的原因，可列舉pSB200是不能在農(nóng)桿菌中單獨復(fù)制的質(zhì)粒。因此，需要預(yù)先將具有稱為pSBl的IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV)的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，依靠在pBS200和pSBl兩者中保持的DNA序列之間的同源重組，制成pSB200與pSBl的共整合體(co-integrate),利用該操作，將pSB200導(dǎo)入農(nóng)桿菌。不可否認，在進行這樣的操作時，有時會發(fā)生某些不妥的現(xiàn)象，導(dǎo)致pSB200的導(dǎo)入失敗。另外，相反地，在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌中的拷貝數(shù)過少的情況下，就造成DNA的分析等沒有效率。本發(fā)明者們以如上的考察為基礎(chǔ)，制作了下述載體并供試驗，所述載體在大腸桿菌和農(nóng)桿菌兩者中發(fā)揮功能，且在這些細菌中為4~5拷貝，并具有IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV),而不含有其它種質(zhì)粒的復(fù)制起點。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過使用上述載體，在植物的轉(zhuǎn)化方法中，具體地說例如在WO2005/040374所記載的方法中，轉(zhuǎn)化效率提高，從而想到了本發(fā)明。2)IncP質(zhì)粒的trfAl基因trfAl基因作為IncP質(zhì)粒的交互復(fù)制因子是重要的，是為了oriV發(fā)揮其功能所必要的基因。對本發(fā)明的trfAl基因的堿基序列，只要是具有trfAl的功能、即交互復(fù)制因子(transactingreplicationfactor)功能的序列即可，不特別限制。對于諸多分子生物學(xué)特性，在Pansegrau等，1994年，JMolBiol，239巻623-663頁中有詳細記載，已確定為Genbank/EMBL登記編號L27758(全長60099bp)的序列的第16521~17669位堿基。這相當(dāng)于序列編號1的第6323~7471位堿基(trfAl的核心序列)。trfAl可以通過常規(guī)方法從pVK102(Knauf和Nester,1982年，Plasmid,8巻45-54頁)等IncP質(zhì)粒中制備。例如，作為trfAl基因，可以使用通過PCR從pVK102中擴增出的3.2kb的DNA片段(序列編號1的第5341~8507位堿基)?；蛘撸梢允褂煤邢率鰤A基序列、并具有trfAl基因的功能的核酸，所述堿基序列在嚴格條件下與上述序列編號1的第6323-7471位、更優(yōu)選為第5341-8507位的堿基序列的互補鏈雜交?；蛘?，可以使用含有下述堿基序列、并具有trfAl基因的功能的核酸，所述堿基序列與上述序列編號1的第6323~7471位、更優(yōu)選為第5341~8507位的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97°/。的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到，有可能可以選擇序列編號1的第6323~7471位中更短的區(qū)域作為發(fā)揮同等功能的核酸。3)質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移起點(oriT):oriT是與接合(mating)相關(guān)的因子。本發(fā)明的載體的目標(biāo)之一是效率良好地進行大量的轉(zhuǎn)化，因此大腸桿菌與農(nóng)桿菌的接合是必要的，oriT有助于接合。對本發(fā)明的oriT,只要是具有oriT的功能、即與接合(mating)相關(guān)的因子的功能的序列即可，不特別限制。對于oriT諸多分子生物學(xué)特性，在Pansegrau等，1994年，JMolBiol,239巻623-663頁中有詳細記載，已確定為Genbank/EMBL登記編號L27758(全長60099bp)的序列的第51097-51463位堿基。oriT可以通過常規(guī)方法從pVK102(Knauf和Nester，1982年，Plasmid,8巻45-54頁)等IncP質(zhì)粒中制備。例如，作為oriT，可以使用通過PCR從pVK102中擴增出的0.8kb的DNA片段(序列編號1的第1~816位堿基)?；蛘?，可以使用含有下述堿基序列、并具有oriT的功能的核酸，所述堿基序列在嚴格條件下與上述序列編號1的第1816位的堿基序列的互補鏈雜交。或者，可以使用含有下述堿基序列、并具有oriT的功能的核酸，所述堿基序列與上述序列編號1的第1-816的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到，有可能可以逸擇序列編號1的第1~816位中更短的區(qū)域作為發(fā)揮同等功能的核酸。4)IncP質(zhì)粒的incCl基因incCl基因有助于IncP質(zhì)粒的穩(wěn)定性。對本發(fā)明的incCl基因的堿基序列，只要是具有有助于IncP質(zhì)粒的穩(wěn)定性功能的序列即可，不特別限制。對于該基因的諸多分子生物學(xué)特性，在Pansegrau等，1994年，JMolBiol，239巻623-663頁中有詳細記載，已確定為Genbank/EMBL登記編號L27758(全長60099bp)的序列的第58260~59354位堿基。這相當(dāng)于序列編號1的第1179-2273位堿基(incCl基因的核心序列)。IncCl基因可以通過常規(guī)方法從pVK102(Knauf和Nester，1982年，Plasmid,8巻:45-54頁)等IncP質(zhì)粒中制備。例如，作為incCl基因，可以使用通過PCR從pVK102中擴增出的2.1kb的DNA片段(序列編號1的第817~2935位堿基)?；蛘撸梢允褂煤邢率鰤A基序列、并具有incCl基因的功能的核酸，所述堿基序列在嚴格條件下與上述序列編號1的第1179~2273位、更優(yōu)選為第817-2935位的堿基序列的互補鏈雜交?；蛘?，可以使用含有下述堿基序列、并具有incCl基因的功能的核酸，所述堿基序列與上述序列編號1的第1179-2273位、更優(yōu)選為第817-2935位的石威基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。此外本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到，有可能可以選擇序列編號1的第1179~2273位中更短的區(qū)域作為發(fā)揮同等功能的核酸。5)X噬菌體的cos位點因為本發(fā)明的載體利用粘粒載體的包裝反應(yīng)，所以具有X噬菌體的COS位點。對本發(fā)明的人噬菌體的COS位點的堿基序歹'j,只要是具有X噬菌體的COS位點的功能、即有助于粘粒載體的包裝反應(yīng)的功能的序列即可，不特別限制。對于X噬菌體的cos位點的諸多分子生物學(xué)特性，SambrookJ和RussellD,W.(2001年)有詳細記載，序列是5'-aggtcgccgccc-3，(序列編號9)(人噬菌體的cos位點的核心序列)。cos可以通過常規(guī)方法從例如pSBll(Komari等，1996年，PlantJ，10巻:165-174頁)那樣的質(zhì)粒中制備。例如，可以使用通過PCR從pSBll中擴增出的0.4kb的DNA片段(序列編號1的第2936-3344位堿基)?；蛘?，可以使用含有下述堿基序列、并具有X噬菌體的cos位點的功能的核酸，所述堿基序列在嚴格條件下與上述序列編號9的堿基序列、更優(yōu)選為序列編號1的第2936~3344位的堿基序列的互補鏈雜交?；蛘?，可以使用含有下述堿基序列、并具有人噬菌體的cos位點的功能的核酸，所述堿基序列與上述序列編號9的堿基序列、更優(yōu)選為序列編號1的第2936-3344位的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97。/。的同一性，進而優(yōu)選具有99°/。的同一性。另外，因為如果cos位點位于T-DNA的內(nèi)側(cè)，那么就會在才直物內(nèi)導(dǎo)入不需要的DNA，所以該cos位點配置在T-DNA的外側(cè)。6)在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌屬細菌中表達的抗藥性基因作為轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記而使用。該抗藥性基因是例如賦予抗生素抗性的基因，或者賦予獨立營養(yǎng)依賴性的基因，可以列舉出卡那霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、氨千青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、慶大霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等，但不限于這些。7)、8)農(nóng)桿菌屬細菌T-DNA的右邊界序列(RB)和左邊界序列(LB)對轉(zhuǎn)化不可或缺(Zambryski等，1980年，Science,209巻1385-1391頁)，在兩序列之間配置外源基因的克隆位點。對本發(fā)明的RB和LB的堿基序列，只要是具有各個農(nóng)桿菌屬細菌T-DNA的右邊界序列(RB)和左邊界序列(LB)的功能的序列即可，不特別限制。可以分別通過常身見方法從例如pBSll(Komari等，1996年，PlantJ，10巻165-174頁)等質(zhì)粒中制備?？梢苑謩e使用序列編號2的第13253-13277位堿基、序列編號2的第3479-3503位堿基?；蛘?，可以使用含有下述堿基序列、并具有各個RB、LB的功能的核酸，所述堿基序列在嚴格條件下與上述序列編號2的第13253-13277位、序列編號2的第34793503位堿基序列的互補鏈雜交?；蛘?，可以使用含有下述堿基序列、并具有各個RB、LB的功能的核酸，所述堿基序列與上述序列編號2的第13253~13277位、序列編號2的第3479-3503位堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到，有可能也可以選擇序列編號2的第13253~13277位、序列編號2的第3479-3503位中更短的區(qū)域作為發(fā)揮同等功能的核酸。含有9)植物轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記基因，該基因配置在7)與8)之間，在植物中表達。對植物轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記基因不特別限制，可以使用公知的選擇標(biāo)記基因。優(yōu)選潮霉素抗性基因、草胺膦抗性基因、卡那霉素抗性基因中的任一種。而且，對在單子葉植物的轉(zhuǎn)化中使用而言，優(yōu)選潮霉素抗性基因、草胺膦抗性基因中的任一種。含有10)用于克隆外源基因的限制性酶識別位點，該位點配置在7)與8)之間。對用于克隆外源基因的限制性酶識別位點不特別限制，可以使用公知的限制性酶識別位點，但優(yōu)選在該載體上的其它部分不存在與所配置的識別位點相同的識別位點。此外，在本發(fā)明的粘粒載體構(gòu)建體中，對上述1)6)的各個要素以及7)~10)整體，這全部7個要素的順序沒有限制。另外，對配置在7)與8)之間的9)與IO)的順序沒有限制。本申請發(fā)明的粘粒載體優(yōu)選滿足以下A-G中的1個或多個條件。A.l)的oriV的石威基序列含有以下石威基序列i)序列編號1的第3451-4002位、更優(yōu)選為第3345~4247位的堿基序列；ii)含有下述堿基序列、并具有oriV的功能的堿基序列，所述堿基序列在嚴格條件下與序列編號1的第3451-4002位、更優(yōu)選為第3345-4247位的堿基序列的互補鏈雜交；或者，iii)含有下述堿基序列、并具有oriV的功能的堿基序列，所述堿基序列與上述序列編號1的第3451-4002位、更優(yōu)選為第3345~4247位的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。B.2)的trfAl基因含有以下堿基序列i)序列編號1的第6323-7471位、更優(yōu)選為第5341~8507位的堿基序列；ii)含有下述堿基序列、并具有trfAl基因的功能的堿基序列，所述堿基在嚴格條件下與序列編號1的第6323-7471位、更優(yōu)選為第5341-8507位的堿基序列的互補鏈雜交；iii)含有下述堿基序列、并具有trfAl基因的功能的堿基序列，所述堿基與上述序列編號1的第6323-7471位、更優(yōu)選為第5341~8507位的石威基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。C.3)的oriT含有以下堿基序列i)序列編號1的第1-816位的堿基序列；ii)含有下述堿基序列、并具有oriT的功能的堿基序列，所述堿基在嚴格條件下與序列編號1的第1816位的堿基序列的互補鏈雜交；iii)含有下述堿基序列、并具有oriT的功能的堿基序列，所述堿基與上述序列編號1的第1816位的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。D.4)的incCl基因含有以下堿基序列i)序列編號1的第1179~2273位、更優(yōu)選為第817~2935位的i咸基序列；ii)含有下述堿基序列、并具有incCl基因的功能的堿基序列，所述堿基在嚴格條件下與序列編號1的第1179-2273位、更優(yōu)選為第817-2935位的堿基序列的互補鏈雜交；iii)含有下述堿基序列、并具有incCl基因的功能的堿基序列，所述堿基與上述序列編號1的第1179~2273位、更優(yōu)選為第817~2935位的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。E.5)的入噬菌體的cos位點含有以下堿基序列i)序列編號9的堿基序列、更優(yōu)選為序列編號1的第2936-3344位的;咸基序列；ii)含有下述堿基序列、并具有人噬菌體的COS位點的功能的堿基序歹iJ，所述堿基序列在嚴格條件下與序列編號9的堿基序列、更優(yōu)選為序列編號1的第2936-3344位的石威基序列的互補鏈雜交；iii)含有下述堿基序列、并具有X噬菌體的cos位點的功能的堿基序列，所述堿基序列與上述序列編號9的堿基序列、更優(yōu)選為序列編號1的第2936~3344位的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。F.7)的農(nóng)桿菌屬細菌T-DNA的右邊界序歹'j(RB)含有以下堿基序列i)序列編號2的第13253~13277位的石成基序列；ii)含有下述堿基序列、并具有RB的功能的堿基序列，所述堿基序列在嚴格條件下與序列編號2的第13253-13277位的堿基序列的互補鏈雜交。iii)含有下述堿基序列、并具有RB的功能的堿基序列，所述堿基序列與上述序列編號1的第13253-13277位的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。G.8)的農(nóng)桿菌屬細菌T-DNA的左邊界序列(LB)含有以下堿基序列i)序列編號2的第3479-3503位的石咸基序列；ii)含有下述堿基序列、并具有LB的功能的堿基序列，所述堿基序列在嚴格條件下與序列編號2的第3479~3503位的堿基序列的互補鏈雜交。iii)含有下述堿基序列、并具有LB的功能的堿基序列，所述堿基序列與上述序列編號1的第3479-3503位的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。通過完全滿足上述的本發(fā)明的粘粒載體所應(yīng)該滿足的1)~IO)的條件，可以制作滿足下述所有課題的載體.能夠?qū)?5~40kb、優(yōu)選為30~40kb左右大小的DNA片段效率良好地克隆化；能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌細胞中穩(wěn)定地保持；.能夠效率良好地導(dǎo)入農(nóng)桿菌；.在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中每細胞的拷貝數(shù)為4~5;而且，.能夠僅將克隆化的目的DNA片段效率良好地導(dǎo)入植物，優(yōu)選是單子葉植物。但是，即使在發(fā)現(xiàn)上述的課題之后，開發(fā)這樣的載體也并不容易。作為其中一個原因，可列舉質(zhì)粒的復(fù)制控制機理極為復(fù)雜。具體地說，作為上述目標(biāo)最適載體的基本骨架，具有IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV)的小型質(zhì)粒(12kb~15kb左右)是適合的。但是，雖然作為其基礎(chǔ)的60kb的IncP質(zhì)粒全基因序列已經(jīng)解讀出來，但質(zhì)粒的復(fù)制以及細胞分裂時的分配(partitioning)所涉及的基因很多，其機理極為復(fù)雜(Pansegrau等，J.Mol.Biol.，239巻623-663頁，1994年)。因此，制成在細菌中穩(wěn)定保持并含有IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV)的小型載體并不容易。實際上，研究了來自IncP質(zhì)粒的各種大小的質(zhì)粒，總體上小型質(zhì)粒不穩(wěn)定，且根據(jù)細菌的種類其穩(wěn)定性也大不相同(Schmidhauser和Helinski，J.Bacteriol.,164巻446-455頁，1985年)。pE4cos是由于小型化而變得在農(nóng)桿菌中缺乏穩(wěn)定性的質(zhì)粒的一例。對于其原因雖然進行了一定的考察(Klee等，1987年，MolGenGenet，210巻282-287頁)，但還不能說已經(jīng)闡明。Schmidhauser和Helinski(J.Bacteriol.，164巻446-455頁，1985年)進一步闡述"不存在說明在所有革蘭氏陰性細菌中穩(wěn)定保持的、質(zhì)粒RK2中的基因決定因子的通用位點("thereisnouniversalsetofgeneticdeterminantsinplasmidRK2thataccountsforstablemaintenanceinallgram-negativebacteria")"，可見制成小型且穩(wěn)定的載體極其困難。此外，質(zhì)粒RK2(很多時候也表述成pRK2)是一種代表性的IncP質(zhì)粒。另外，在這樣的載體的構(gòu)建過程中，很多時候使用利用其它載體將作為基礎(chǔ)的質(zhì)粒的構(gòu)成要素克隆化的工序。但是，也有時與細菌的質(zhì)粒、染色體的復(fù)制相關(guān)的DNA片段難以克隆化。在產(chǎn)生這樣的問題時，就需要開發(fā)解決方法，這也是構(gòu)建新型載體困難的一個重要原因。并非限定，但本發(fā)明的粘粒載體(pLC系列)包括下述載體。i)pLC40(序列編號2，圖6)全長13429bp的二元粘粒載體，具有下述特征含有1)IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV)，不含有其它種質(zhì)粒的復(fù)制起點，含有2)IncP質(zhì)粒的trfAl基因、3)oriT、4)incCl基因，含有5)X噬菌體的cos位點，且該cos位點位于T-DNA的外側(cè)，含有6)在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌屬細菌中表達的抗藥性基因nptIII(卡那霉素抗性基因)，含有7)農(nóng)桿菌屬細菌的T-DNA右邊界序列，含有8)農(nóng)桿菌屬細菌的T-DNA左邊界序列，含有9)植物轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記基因hpt(潮霉素抗性基因)，該基因配置在7)與8)之間，在植物中表達，含有10)用于克隆外源基因的、配置在7)與8)之間的限制性酶識別位點，例如NspV。pLC40是在p6FRG中導(dǎo)入含有pSB200PcHm(圖l)的T-DNA區(qū)域的區(qū)域而制成。此外，p6FRG是具有圖5所示結(jié)構(gòu)的全長8507bp的粘粒載體(序列表的序列編號1)，具有下述特征1)含有IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV)，不含有其它種質(zhì)粒的復(fù)制起點。2)含有IncP質(zhì)粒的trfAl基因、oriT、incCl基因、X噬菌體的cos位點。3)含有在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌屬細菌中表達的抗藥性基因nptIII(卡那霉素抗性基因)。ii)pLC40GWH(序列編號3，圖7)全長13174bp的二元粘粒載體。與pLC40的不同點是插入了attBl,2序列，和缺失了RB上游區(qū)域Sspl-Ball317bp。是在p6FRG中導(dǎo)入含有pSB200PcHmGWH(圖3)的T-DNA區(qū)域的區(qū)域而制成的。iii)pLC40bar(序列編號4，圖8)全長12884bp的二元粘粒載體。與pLC40的主要不同點是，植物轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記基因是bar(草胺膦抗性基因)，以及T-DNA上的同選擇標(biāo)記單元(泛素啟動子-泛素內(nèi)含子-植物轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記基因)的方向相反。是在p6FRG中導(dǎo)入含有pSB25UNpHm(圖2)的T-DNA區(qū)域的區(qū)域而制成的。iv)pLC40GWB(序列編號5，圖9)全長13026bp的二元粘粒載體。與pLC40的不同點是，植物轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記基因是bar(草胺膦抗性基因)，以及插入了attBl,2序列。是在p6FRG中導(dǎo)入含有pSB200PcHmGWB(圖4)的T-DNA區(qū)域的區(qū)域而制成的。v)pLC40GWHkorB(序列編號65，圖10)全長14120bp的二元粘粒載體。與pLC40GWH的不同點是含有korB基因的堿基序列。korB基因位于上述的IncCl附近，與IncCl同樣有助于IncP質(zhì)粒的穩(wěn)定性。本發(fā)明的korB基因的堿基序列只要是具有korB基因的有助于IncP質(zhì)粒的穩(wěn)定性的功能即可，不特別限制。對于該序列的諸多分子生物學(xué)特性，根據(jù)Pansegmu等，1994年，JMolBiol，239巻623-663頁有詳細記載，已確定為Genbank/EMBL登記編號L27758(全長60099bp)的序列的第57178-58263位堿基。這相當(dāng)于序列編號65的第6306~7382位堿基。korB可以通過常規(guī)方法從pVK102(Knauf和Nester，1982年，Plasmid,8巻45-54頁)等IncP質(zhì)粒制備。例如，作為korB基因,可以使用從pKV102通過PCR擴增的序歹'J(序列編號65的第6306-7382位堿基)?；蛘?，也可以使用含有下述堿基序列、并具有korB基因的功能的核酸，所述堿基序列與上述序列編號65的第6306-7382的堿基序列的互補鏈在嚴格條件下雜交?；蛘呖梢允褂煤邢率鰤A基序列、并具有korB基因的功能的核酸，所述堿基序列與上述序列編號65的第6306-7382的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。vi)pLCleo(序列編號66，圖11)全長14195bp的二元粘粒載體。與pLC40GWHkorB的不同點是，在多克隆位點有PspOMI位點，并在其上游有PI-SceI位點，而且在泛素啟動子上游有attB3位點。vii)pLC40GWHvGl(序列編號7,圖13)全長14222bp的二元粘粒載體。與pPLC40GWH的不同點是，插入了virG基因。是在pLC40GWH的T-DNA外側(cè)導(dǎo)入virG基因而制成的。即使與上述7種粘粒載體，即i)由序列編號2的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40;ii)由序列編號3的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWH;iii)由序列編號4的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40bar;iv)由序列編號5的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWB;v)由序列編號65的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWHKorB;vi)由序列編號66的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLCleo;以及，vii)由序列編號7的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWHvGl的堿基序列不100%相同，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以容易地得到與它們發(fā)揮同等的功能的同等物。所以，作為本發(fā)明的粘粒載體的優(yōu)選方案，也含有這些"同等物"。例如，可以認為在本發(fā)明的上述i)~vii)的各粘粒載體中的堿基序列中，特別是除上述1)~IO)的各條件相關(guān)的構(gòu)成要素(例如，條件l)中為oriV、條件2)中為trfAl基因)之外的部分的堿基序列即使變化，作為粘粒載體也發(fā)揮與各粘粒載體相同的功能。另外，即使在1)~IO)的條件中，對于6)的抗藥性基因、9)的植物轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記基因、和IO)的限制酶識別位點，已知有多個基因或限制酶位點，所述基因或限制酶位點盡管與i)-vii)的各粘粒載體中的堿基序列不完全相同，但卻發(fā)揮同樣的功能，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)對這些部分施加變更。所以，本發(fā)明的i)-vii)的各粘粒載體的"同等物"，優(yōu)選意味著下述物在與本發(fā)明的粘粒載體的條件1)~5)和7)8)的各條件相關(guān)的構(gòu)成要素、優(yōu)選特別是各條件的核心序列的堿基序列方面，與各載體中的堿基序列相同或與這些堿基序列具有至少為95%以上、97%以上、98%以上或99%以上、更優(yōu)選為99.5%以上的同一性，或者是與各粘粒載體的堿基序列的互補鏈在高嚴格條件下雜交；除此之外的部分的堿基序列雖有變異，但與各載體一樣發(fā)揮功能并起到相同的效果。更優(yōu)選意味著下述物在與本發(fā)明的粘粒載體的條件1)~IO)的各條件相關(guān)的構(gòu)成要素、優(yōu)選特別是各條件的核心序列的堿基序列方面，與各載體中的堿基序列相同；除此之外的部分的堿基序列雖有變異，但與各載體一樣發(fā)揮功能并起到相同的效果。對變異的程度不特別限制，"同等物"優(yōu)選由與i)-vii)的各粘粒載體更優(yōu)選為1~多個，進而優(yōu)選為1幾個(例如，可以用公知的定點突變方法實施變異的程度)。另外，"同等物"優(yōu)選含有與選自i)vii)的各粘粒載體的堿基序列中的石成基序列具有至少為95%以上、97%以上、98%以上或99%以上，更優(yōu)選為99.5°/。以上的同一性的石威基序列。2個核酸序列的同一性％可以通過目測檢查和數(shù)學(xué)計算來確定，或者更優(yōu)選使用計算機.程序比較序列信息來進行該比較。代表性的優(yōu)選計算機'l程序是遺傳學(xué)計算機.組(GCG，威斯康星州麥迪遜)的威斯康星"軟件包(Wisconsin'Package)、版本(Verskm)lO.O的程序"GAP"(Devereux等，1984年，Nucl.AcidsRes.，12巻387頁)。通過使用該"GAP"程序，除了比較2個核酸序列之外，還可以進行2個氨基酸序列的比較、以及核酸序列與氨基酸序列的比較。這里，"GAP"程序的優(yōu)選默認參數(shù)可以使用(1)對核苷酸的(包括對同一物為1，對非同一物為0的值)一元(unary)比較矩陣的GCG運行，以及如Schwartz和Dayhoff修訂"多肽的序列和結(jié)構(gòu)圖語(AtlasofPolypeptideS叫uenceandStructure)"國立生物醫(yī)學(xué)研究財團，353-358頁，1979年所i己載的Gribskov和Burgess,Nucl.AcidsRes.,14巻6745頁，1986年的加權(quán)氨基酸比較矩陣；或其它可比較的比較矩陣；(2)對氨基酸各空位的30個罰分和對各空位中的各記號追加的1個罰分；或?qū)塑账嵝蛄械母骺瘴坏?0個罰分和對各空位中的各記號追加的3個罰分；(3)對末端空位無罰分；和(4)對長空位無最大罰分。在本領(lǐng)域技術(shù)人員所使用的其它序列比較程序中，可以-使用例如，可以通過美國國立醫(yī)學(xué)圖書館的網(wǎng)站http:〃需w.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html使用的BLASTN程序、版本2.2.7,或者UW-BLAST2.0算法。對UW-BLAST2.0的標(biāo)準默認常數(shù)的設(shè)定在以下互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址http:〃blast.wustl.edu記載。而且，BLAST算法使用帶有BLOSUM62氨基酸評分的矩陣，可以使用的選擇參數(shù)如下(A)包括用于掩碼具有低組成復(fù)雜性的查詢序列的片段(根據(jù)Wootton和Federhen的SEG程序(ComputersandChemistry,1993年)確定，也可參考Wootton和Federhen,1996年"序列數(shù)據(jù)庫中的組分偏倚區(qū)域的解析(Analysisofcompositionallybiasedregionsinsequencedatebases)，，MethodsEnzymol.,266巻544-571頁。)、或含有短周期性的內(nèi)部重復(fù)的片段(根據(jù)Claverie和States(ComputersandChemistry,1993)的XNU程序確定)的濾波器；以及(B)用于報告對堿基序列的匹配的統(tǒng)計學(xué)顯著性的閾值，或E-評分(按照(Karlin和Altschul，1990年)的統(tǒng)計學(xué)模型，單純通過偶然發(fā)現(xiàn)的匹配的期待確率；當(dāng)起因于某個匹配的統(tǒng)計學(xué)顯著差異比E-評分大時，不報告該匹配)，優(yōu)選E-評分閾值的數(shù)值為0.5,或按照優(yōu)選程度遞增的順序為0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、le-5、le-lO、le-15、le-20、le-25、le-30、le-40、le-50、le-50、le-75、或le-lOO。植物的轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供利用本發(fā)明的粘粒載體的植物轉(zhuǎn)化方法。具體地說，本發(fā)明的植物轉(zhuǎn)化方法包括，使用含有在本發(fā)明的粘粒載體中導(dǎo)入植物的核酸片段而成的載體的農(nóng)桿菌屬細菌來轉(zhuǎn)化植物。對導(dǎo)入粘粒載體的核酸片段的種類不特別限制，可以使用基因組DNA片段、cDNA片段等任意片段。優(yōu)選基因組DNA片段，更優(yōu)選來自植物的基因組DNA片段。并非限定，但優(yōu)選導(dǎo)入的DNA片段的大小為lkb以上，更優(yōu)選為10kb以上的大小，更優(yōu)選為20kb以上，更優(yōu)選為25-40kb，更優(yōu)選為30~40kb。調(diào)制核酸片段和將其導(dǎo)入粘粒載體中等可以按照公知的方法，例如WO2005/040374所述的方法來進行。對核酸片段的供應(yīng)源不特別限制。在植物基因組的情況下，作為優(yōu)選勢的植物。例如，待導(dǎo)入的植物是日本稻時，優(yōu)選作為一種野生稻的普通野生稻(O3;加n^;70go"O^)、印度稻。待導(dǎo)入的植物是玉米的特定品種時，玉米的其它品種、野生種的大芻草(teosinte)等是優(yōu)選的供與源植物的例子。一般來說親緣關(guān)系越遠的植物可觀察到越大的雜種優(yōu)勢。物，也可以是同種的不同品種，還可以是同種的同一品種。作為優(yōu)選的植物的例子，可列舉實際上沒有限制的廣泛范圍的植物，即稻、大麥、小麥、玉米、高粱、或粟和珍珠粟等粟類等谷物，甘蔗等工藝作物，蘇丹草、蓋氏虎尾草等牧草，用于制造咖啡、可可、茶、煙等嗜好品的植物，蔬菜類，水果類，花等觀賞用植物，擬南芥等雜草，等等。本發(fā)明的粘粒載體是特別為了提高作為生物導(dǎo)入法的農(nóng)桿菌法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化效率而得到的。所以，植物的轉(zhuǎn)化方法優(yōu)選是農(nóng)桿菌法。但是，作為植物的轉(zhuǎn)化方法并不排除使用其它公知的方法。例如，作為物理導(dǎo)入法，知道微注射法、電穿孔法、基因槍法、碳化硅法、空氣注射法等，作為化學(xué)導(dǎo)入法知道聚乙二醇法等。對農(nóng)桿菌菌抹的種類只要其抗生素抗性是除構(gòu)建載體時使用的細菌用抗生素抗性(基因)之外的抗性即可，不特別限制，可以使用LBA4404、A281、EHA105、PC2760等公知的菌抹。定位克隆法另外，本發(fā)明提供利用了上述本發(fā)明的粘粒載體的、效率良好的定位克隆法。即，包含下述工序的定位克隆法。1)用限制性酶將含有與植物的表型相關(guān)的候選基因的BAC克隆部分地分解或完全地分解；2)使用粘粒載體，將工序l)所得DNA片段亞克隆化，從而構(gòu)建文庫；然后，3)將構(gòu)成文庫的克隆分別導(dǎo)入植物，評價轉(zhuǎn)化植物的表型。在本定位克隆法中，并非限定，但優(yōu)選工序l)所得DNA片段的大小為25~40kb。另外，而且，優(yōu)選工序2)的粘粒載體是上述"粘粒載體"項所述的粘粒載體。所謂"候選基因"是包括有可能與植物的表型相關(guān)的基因的一組基因。所謂"植物的表型"不特別限制，包括例如，整個植物體的活力(vigor)高、植物體和器官大、產(chǎn)量高、生長速度快、抵御病害蟲害能力強、對千燥高溫低溫等各種環(huán)境壓力抵御能力強、特定成分增減、特定酶活性增減、矮化等等農(nóng)業(yè)上有益的各種表型。例如，假設(shè)判明了在100200kb的多個BAC克隆中保持的DNA片段含有候選基因。用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇⑦@些克隆化的DNA部分分解或完全分解，調(diào)制40kb左右的重復(fù)片段，使用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化用載體進行亞克隆。這時，不必詳細研究亞克隆化的DNA片段的位置關(guān)系、重復(fù)狀態(tài)。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)計算，當(dāng)為200kb克隆時，通過隨機得到的21個亞克隆，原來片段的任意位點以99%的確率保持(例如，參考WO2005/040374的-)。接著，將各亞克隆導(dǎo)入植物，每個亞克隆制成IO個左右獨立的轉(zhuǎn)化體，分析基因的效果。利用該操作，首先可以通過確定具有候選基因的亞克隆，將候選區(qū)域壓縮在40kb,進而可以通過與相鄰亞克隆的實驗結(jié)果對照，將候選區(qū)域限定在極窄的區(qū)域。所以，大大提高候選基因鑒定操作的效率。進一步利用virG基因(和virB基因)的轉(zhuǎn)化方法在一個優(yōu)選的方式中，本發(fā)明的植物轉(zhuǎn)化方法的特征在于，使用含有以下要素的農(nóng)桿菌屬細菌。la)對于在本發(fā)明的粘粒載體中導(dǎo)入植物的核酸片段而成的載體、進一步導(dǎo)入農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因而成的載體，或者lb)在權(quán)利要求1-5的任1項所述的粘粒載體中導(dǎo)入了植物的核酸片段而成的載體，和，含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因、并且能夠在農(nóng)桿菌屬細菌的細胞中與IncP質(zhì)粒共存的質(zhì)粒；以及，2)農(nóng)桿菌屬細菌的Ti質(zhì)粒或者Ri質(zhì)粒。virG是在將T-DNA送入植物時發(fā)揮功能的農(nóng)桿菌的vir基因簇之一，被認為是virB基因等的轉(zhuǎn)錄因子(Winans等，1986年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83巻8278-8282頁)。作為virG的一例，virGN54D是virG蛋白的第54位氨基酸從天冬酰胺變成了天冬氨酸的變異體，與野生型virG相比，使virB基因表達進一步增力口(Pazour等，1992年，J.Bac,174巻:4169-4174頁)。在本轉(zhuǎn)化方法中，virG基因優(yōu)選為virGN54D。在本發(fā)明的一個方式la)中，virG基因可以進一步導(dǎo)入到在本發(fā)明的粘粒載體中導(dǎo)入了植物核酸片段而成的載體中。在本發(fā)明的粘粒載體已經(jīng)含有virG基因的方案(例如，pLC40GWHvGl)的情況下，不必進一步導(dǎo)入virG基因?；蛘撸部梢允箆irG基因與本發(fā)明的粘粒載體存在于分別獨立的質(zhì)粒中。這時，在本發(fā)明的方法中，農(nóng)桿菌細菌除了粘粒載體之外，還含有下述質(zhì)粒，所述質(zhì)粒是可以在農(nóng)桿菌屬細菌的細胞中與IncP質(zhì)粒共存的質(zhì)粒，并含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因(方案lb)另外，對于Ti質(zhì)粒或者Ri質(zhì)粒，不特別限制，但優(yōu)選除去了T-DNA的去攻擊型(disarm)的質(zhì)粒。lb)的含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因的質(zhì)粒也可以含有IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點。優(yōu)選是具有圖14所示結(jié)構(gòu)的pVGW。更優(yōu)選是具有圖15所示結(jié)構(gòu)的pVGW2。另外，lb)的含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因的質(zhì)粒也可以進一步含有農(nóng)桿菌屬細菌的virB基因。這時質(zhì)粒也可以含有IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點。這樣的質(zhì)粒優(yōu)選是pTOK47。對于農(nóng)桿菌屬細菌的virB基因，在Ward等，1988年，JBiolChem,263巻5804-5814頁有詳細記載?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法從例如pSBl(Komari等，1996年，PlantJ，10巻165-174頁)等質(zhì)粒制備。virB的堿基序列被確定為例如，Genbank/EMBL登記編號AB027255(pSBl)的堿基序列中第3416-12851位的堿基?？梢允褂煤性撔蛄谢蚺c它的互補鏈在嚴格條件下雜交的堿基序列的DNA作為virB基因，但并不限于這些。在作為對象的植物是一般被認為在利用農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化中轉(zhuǎn)化效率低的植物，例如并非限定，但在是玉米、大豆的情況下，這些轉(zhuǎn)化方法更有效。另外，在導(dǎo)入的核酸片段大的情況下(并非限定，但為25~40kb的情況)、具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)情況下(并非限定，但具有高度重復(fù)序列的情況)，優(yōu)選使用后述的pVGW作為含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因的質(zhì)粒。質(zhì)粒載體在像玉米那樣的不易發(fā)生轉(zhuǎn)化的植物的情況下，除了特殊情況(Frame等，2002年，PlantPhysio，129巻13-22)之外，如果使用重組了T-DNA的標(biāo)準二元載體，則利用農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化的效率極低。到目前為止，有人報告了，通過使二元載體與重組了作為virG基因的變異體的virGN54D基因在農(nóng)桿菌中共存，來提高在玉米中瞬時表達的效率(Hansen等，1994年，ProNAS,91巻7603-7607頁)，還有利用重組了virG和virB的二元載體的玉米高效率轉(zhuǎn)化體系(Ishida等，1996年，NatBiotechnol,14巻:745-750頁)。但是，通過使在二元載體中重組了virG或virGN54D的質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中共存，來提高玉米轉(zhuǎn)化效率的例子至今未有報告。本發(fā)明的粘粒載體(pLC載體)(IncP質(zhì)粒)也涉及玉米轉(zhuǎn)化，并期待進一步提高轉(zhuǎn)化效率。作為可以與IncP質(zhì)粒共存的質(zhì)粒，有例如IncW質(zhì)粒(Close等，1984年，Plasmid,12巻:111-118頁)。目前報告的導(dǎo)入了virG的IncW載體含有pBR322ori等其它質(zhì)粒的復(fù)制起點，大小較大。例如，pTOK47含有IncW(pSa)ori和pBR322ori(除了virG之外還含有virB)，全長約為28kb(Jin等,1987年，JBacteriol,169巻:4417-4425頁)。另外，pYW48含有IncW(pSa)ori和pBR322ori(除了virG之外還含有virA),全長約15.5kb(Wang，2000年，Gene，242巻105-114頁)。這樣的載體也可以在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法中使用。但因為是長載體，所以例如在使之與重組了大片段的pLC載體共存的情況下，有可能在細菌中的穩(wěn)定性會產(chǎn)生問題，故而要求能與pLC載體共存、含有virG、并且大小較小的載體。作為解決該問題的方法，在本發(fā)明中，提供小型質(zhì)粒載體，其通過與上述本發(fā)明的粘粒載體共存，可以進一步提高轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明的質(zhì)粒載體是具有下述全部條件的載體。含有l(wèi))IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點，不含有其它質(zhì)粒的復(fù)制起點；含有2)IncW質(zhì)粒復(fù)制所必要的repA基因；含有3)在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌屬細菌中表達的抗藥性基因；含有4)農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因。1)本發(fā)明的IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點的堿基序列只要是具有作為IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點的功能的序列即可，不特別限制。對于IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點的諸多分子生物學(xué)特性，Okaumum和Kado(1992年，MolGenGenet,235巻55-63頁)有詳細記載，已確定為Genbank/EMBL登記編號U30471(全長5500bp)的第2170~2552位的堿基。這相當(dāng)于序列編號8的第2832-3214位的堿基。IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點可以利用常規(guī)方法從pTOK47(Jin等，1987年，JBacteriol，169巻:4417-4425頁)等IncW質(zhì)粒制備。例如，在利用PCR從pTOK47中與后述的對IncW質(zhì)粒復(fù)制必需的repA—同擴增出的2.7kb的DNA中，可以使用序列編號8的第2832~3214位的堿基?；蛘撸部梢允褂煤邢率鰤A基序列、并具有IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點的功能的核酸，所述堿基序列與上述序列編號8的第2832-3214位的堿基序列的互補鏈在嚴格條件下雜交。或者含有下述44基序列、并具有IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點的功能的核酸，所述堿基序列與上述序列編號8的第2832~3214位的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。此外認識到，本領(lǐng)域技術(shù)人員有可能可以選擇序列編號8的第2832-3214位中更短的區(qū)域作為發(fā)揮同等功能的堿基序列。2)本發(fā)明的repA基因的堿基序列只要是具有作為IncW質(zhì)粒復(fù)制所必要的repA基因的功能的堿基序列即可，不特別限制。對于IncW質(zhì)粒復(fù)制所必要的repA的分子生物學(xué)諸多特性，在Okaumura和Kado(1992年)MolGenGenet，235巻55-63頁有詳細記載，已確定為Genbank/EMBL登記編號U30471(全長5500bp)的第1108-2079位的堿基。這相當(dāng)于序列編號8的第1770~2741位的A成基。IncW質(zhì)粒復(fù)制所必要的repA可以從pTOK47(Jin等，1987年，JBacteriol，169巻4417-4425頁)等IncW質(zhì)粒利用常規(guī)方法制備。例如，在利用PCR從pTOK47中與所述的IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點一同擴增的2.7kb的DNA中，可以使用序列編號8的第1770~2741位的石威基?；蛘撸部梢允褂煤邢率鰤A基序列、并具有IncW質(zhì)粒復(fù)制所必要的repA基因的功能的核酸，所述堿基序列含有與上述序列編號8的第1770-2741位的堿基序列的互補鏈在嚴格條件下雜交?；蛘咭部梢允褂煤邢率鰤A基序列、并具有IncW質(zhì)粒復(fù)制所必要的repA基因的功能的核酸，所述堿基序列與上述序列編號8的第1770~2741位的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。此外認識到，本領(lǐng)域技術(shù)人員有可能可以選擇序列編號8的第1770-2741位中更短的區(qū)域作為發(fā)揮同等功能的堿基序列。3)在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌屬細菌中表達的抗藥性基因作為轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記使用。該抗藥性基因是例如賦予抗生素抗性、或賦予獨立營養(yǎng)依賴性的基因，可列舉卡那霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、氨千青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、慶大霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等，但不限于這些。關(guān)于4)農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因，在Winans等，1986年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83巻8278-8282頁中有詳細記載，關(guān)于virGN54D,在Pazour等，1992年，J.Bac，174巻:4169-4174頁，Hansen等，1994年，ProNAS,91巻7603-7607頁中有詳細記載。virG是virB、virE等其它vir基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(活化)因子。virG接受來自virA的調(diào)節(jié)(磷酸化)而活化，但virGN54D不接受該調(diào)節(jié)，是通常處于活化狀態(tài)的變異體。對于virG基因，可以從pTOK47(Jin等，1987年,JBacteriol，169巻:4417-4425頁)等質(zhì)粒利用常規(guī)方法制備；對于virGN54D，可以由上述質(zhì)粒利用變異導(dǎo)入來制備。例如，可以使用利用PCR從pTOK47擴增的lkb的virGDNA(序列編號7的第4024~5069位堿基)，從pTOK47通過利用PCR的變異導(dǎo)入擴增、制備的lkb的virGN54DDNA(序列編號8的第1~1080位的堿基)?；蛘撸部梢允褂煤邢率鰤A基序列、并具有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基或者與上述DNA的堿基序列具有至少95%的同一性，更優(yōu)選具有97%的同一性，進而優(yōu)選具有99%的同一性。本發(fā)明的質(zhì)粒載體優(yōu)選全長為10kb以內(nèi)，更優(yōu)選為5kb以內(nèi)。并非限定，但本發(fā)明的質(zhì)粒載體優(yōu)選是具有圖14所述結(jié)構(gòu)的pVGW載體。更優(yōu)選是具有圖15所示結(jié)構(gòu)的pVGW2。pVGW、pVGW2是滿足上述1)~4)的全部條件的載體。序列編號8所述的pVGW的全長為4531bp，另外，序列編號67所述的pVGW2的全長是4836bp,具有下述特征。1)含有IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點，不含有其它質(zhì)粒的復(fù)制起點；2)含有IncW質(zhì)粒復(fù)制所必要的repA基因；3)含有作為在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌屬細菌中表達的抗藥性基因的慶大霉素抗性基因；4)含有農(nóng)桿菌屬細菌的virGN54D基因。各組件中，將IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點與IncW質(zhì)粒復(fù)制所必要的repA基因同時克隆，并將慶大霉素抗性基因與virGN54D基因分別克隆，然后組裝全部3個DNA片段(4個組件)，從而完成制作。作為本發(fā)明的質(zhì)粒載體，即使堿基序列與上述2個2種質(zhì)粒載體pVGW、pVGW2不100%相同，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以容易地得到與它們發(fā)揮同等的功能的同等物。所以，作為本發(fā)明的質(zhì)粒載體的優(yōu)選方案也包括這些"同等物"。例如，在本發(fā)明的各質(zhì)粒載體中的堿基序列中，特別是除了與上述1)4)的各條件關(guān)聯(lián)的構(gòu)成要素(例如在條件l)中為IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點)之外的部分的堿基序列即使變化，也認為作為質(zhì)粒載體與各載體發(fā)揮同等的功能。另外，在1)-4)的條件中，對于3)的抗藥性基因，已知雖然堿基序列與各質(zhì)粒載體中的不完全相同、但卻發(fā)揮同樣功能的多個基因，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)對這些部分施加變更。所以，本發(fā)明的各質(zhì)粒載體的"同等物"優(yōu)選意味下述物與本發(fā)明的質(zhì)粒栽體的1)~2)和4)的各條件關(guān)聯(lián)的構(gòu)成要素的堿基序列是與各質(zhì)粒載體中的堿基序列相同，或者與這些堿基序列具有至少95%以上、97%以上、98%以上或99%以上、更有選99.5%以上的同一性，或者是與各質(zhì)粒載體的堿基序列的互補鏈在高嚴格條件下雜交的堿基序列；而除此之外的部分的堿基序列雖有變異，但與各載體同樣地發(fā)揮功能，起到相同的效果。更優(yōu)選意味著下述物與本發(fā)明的質(zhì)粒載體的條件1)4)的各條件關(guān)聯(lián)的構(gòu)成要素的堿基序列與各質(zhì)粒載體中的堿基序列相同，而除此之外的部分的堿基序列雖有變異，但與各載體同樣地發(fā)揮功能，起到相同的效果。對變異的程度不特別限制，但"同等物"優(yōu)選優(yōu)與各質(zhì)粒載體的堿基序列的互補鏈在高嚴格條件下雜交的堿基序列構(gòu)成?？梢宰儺惖膲A基優(yōu)選為1~多個，更有選為1數(shù)個(例如，可以用公知的定點突變方法實施變異的程度)。另外，"同等物"優(yōu)選由與選自各質(zhì)粒載體的堿基序列中的堿基序列具有95%以上、97%以上、98%以上或99%以上，更有選為99.5%以上的同一性的堿基序列構(gòu)成。此外，本說明書中的"嚴格條件"意味著在中度或高度嚴格的條件下進行雜交。具體地說，中度嚴格的條件例如，可以基于DNA的長度，由具有一般技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定?；緱l件示于Sambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第三版,第6-7章,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001年中，而且對于硝酸纖維素薄膜，包括使用5xSSC、0.5%SDS、l.OmMEDTA(pH8.0)的前洗滌溶液，約40~50。C的、有或無50%曱酰胺的'2xSSC-6xSSC(或者約42。C的、約50%曱酰胺中的斯塔克斯溶液(Stark，ssolution)等其它同樣的雜交溶液)的雜交條件，以及例如約40~60°C、0.5-6SSC、0.1%SDS的洗滌條件。優(yōu)選中度嚴格包括約50°C、6xSSC的雜交條件(和洗滌條件)。另外，高嚴格條件也可以例如基于DNA長度，由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。一般地說，這種條件定義為，包括在比中度嚴格條件更高的溫度和/或低濃度下進行雜交(例如，在約65。C，6xSSC-0.2xSSC，優(yōu)選6xSSC，更優(yōu)選2xSSC，最優(yōu)選0.2xSSC進行雜交)和/或洗滌，并伴隨例如如上所述的雜交條件，和用約65°C~68°C、0.2xSSC、0.1。/。SDS洗滌。在雜交和洗滌的緩沖液中，可以用SSPE(lxSSPE為0.15MNaCl、10mMNaH2PO4、和1.25mMEDTA、pH7.4)代替SSC(lxSSC為0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)，洗滌在雜交結(jié)束之后進行15分鐘。另外，也可以使用探針不使用反射性物質(zhì)的市售雜交試劑盒。具體地i兌，可列舉4吏用ECLdirectlabeling&detectionsystem(Amersham一土制造)的雜交等。作為嚴格雜交，可列舉例如如下那樣的條件在試劑盒中的雜交緩沖液中加入封閉試劑使其為5%(w/v)、NaCl使其為0.5M,在42。C進行4小時，洗滌為在0.4。/。SDS、0.5xSSC中、在55。C、20分鐘進行兩次，在2xSSC中、室溫5分鐘進行一次。pVGW的特征是小型且穩(wěn)定。具體地說，通過使之與pLC共存，特別是在使用大片段的情況下，和/或使用玉米作為宿主的情況下，對提高轉(zhuǎn)化效率是有效的。即使在使之與除pLC之外的一般載體共存的情況下，對提高轉(zhuǎn)化玉米等時的轉(zhuǎn)化效率也是有用的。發(fā)明的效果通過本發(fā)明的載體(pLC載體)，可以獲得用公知的載體不能完成的下述效果。可以效率良好地克隆化下述大小的DNA片段，所述大小為25~40kb左右，優(yōu)選為30~40kb左右；可在大腸桿菌和農(nóng)桿菌細胞中穩(wěn)定保持；可以效率良好地導(dǎo)入農(nóng)桿菌；在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中每細胞的拷貝數(shù)為4~5;而且，可以僅將克隆化了的目標(biāo)DNA片段效率良好地導(dǎo)入植物，優(yōu)選是單子葉植物中(相對于pSB載體的轉(zhuǎn)化效率為60。/。，pLC載體的轉(zhuǎn)化效率為90%)。通過同時使用本發(fā)明的pLC載體與pVGW載體，連向玉米等轉(zhuǎn)化比較困難的植物導(dǎo)入基因也可以效率良好地進行。通過使用本發(fā)明的pLC載體來進行定位克隆，可以以較少勞動力和短時間來壓縮候選基因的位點。本發(fā)明即使在基因定位信息極匱乏的情況下也可以發(fā)揮較大效果。例如，假設(shè)僅有某染色體的末端部位存在候選基因這個信息。例如，如果整條染色體為40Mb,則可以-〖人為末端部位為2Mb左右。如果有排列好的BAC文庫(BAC跨疊克隆群，BACcontig),則插入BAC的片段平均為150kb,通過20個左右的BAC克隆，可以全部覆蓋該區(qū)域。所以，假設(shè)從各BAC制成20個亞克隆，則制成共400個片段、4000個重組體，就可以在短時間內(nèi)基本確定候選基因。這樣，使用本發(fā)明的技術(shù)，可以通過由現(xiàn)有的技術(shù)無法想像的極少勞動力和時間而確定基因。發(fā)明的具體實施例方式本發(fā)明優(yōu)選包括以下方式。[方式1]一種粘粒載體，其全長15kb以內(nèi)，具有下述的特征，含有1)IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV),不含有其它種質(zhì)粒的復(fù)制起點；含有2)IncP質(zhì)粒的trfAl基因；含有3)IncP質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移起點(oriT);含有4)IncP質(zhì)粒的incCl基因；含有5)i噬菌體的cos位點，且該cos位點位于T-DNA的外側(cè)；含有6)在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌屬細菌中表達的抗藥性基因；含有7)農(nóng)桿菌屬細菌的T-DNA右邊界序列；含有8)農(nóng)桿菌屬細菌的T-DNA左邊界序列；含有9)植物轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記基因，該基因配置在7)與8)之間，在植物中表達；而且，含有10)用于克隆外源基因的限制性酶識別位點，該位點配置在7)與8)之間。[方式2]根據(jù)方式1所述的粘粒載體，其中植物轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記基因選自由潮霉素抗性基因、草胺膦抗性基因和卡那霉素抗性基因構(gòu)成的組。[方式3]根據(jù)方式1或2所述的粘粒載體，其中含有IncP質(zhì)粒的korB基因。[方式4]根據(jù)方式1~3的任1項所述的粘粒載體，其選自以下的組由序列編號2的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40或其同等物；由序列編號3的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWH或其同等物；由序列編號4的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40bar或其同等物；由序列編號5的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWB或其同等物；由序列編號65的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWHKorB或其同等物；由序列編號66的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLCleo或其同等物；以及由序列編號7的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWHvGl或其同等物。[方式5]根據(jù)方式4所述的粘粒載體，其選自以下的組.由序列編號2的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40;由序列編號3的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWH;由序列編號4的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40bar;由序列編號5的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWB;由序列編號65的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWHKorB;由序列編號66的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLCleo;以及由序列編號7的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWHvG1。[方式6]一種植物的轉(zhuǎn)化方法，其包括使用下述農(nóng)桿菌屬細菌轉(zhuǎn)化植物，所述農(nóng)桿菌屬細菌含有在方式1~5的任1項所述的粘粒載體中導(dǎo)入了植物的核酸片段而成的表達載體。[方式7]根據(jù)方式6所述的轉(zhuǎn)化方法，其中所導(dǎo)入的核酸片段的大小為25~40kb。[方式8]根據(jù)方式6或7所述的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，在植物的轉(zhuǎn)化中使用包含以下要素的農(nóng)桿菌屬細菌la)在方式1-5的任1項所述的粘粒載體中導(dǎo)入了植物的核酸片段而成的載體中，進一步導(dǎo)入了農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因而成的載體，或者，lb)在權(quán)利要求1-5的任1項所述的粘粒載體中導(dǎo)入了植物的核酸片段而成的載體，和，含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因、并且能夠在農(nóng)桿菌屬細菌的細胞中與IncP質(zhì)粒共存的質(zhì)粒；以及，2)農(nóng)桿菌屬細菌的Ti質(zhì)粒或者Ri質(zhì)粒。[方式9]根據(jù)方式8所述的轉(zhuǎn)化方法，其中l(wèi)a)或lb)的農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因是virGN54D。[方式10]根據(jù)方式8所述的轉(zhuǎn)化方法，其中l(wèi)b)的含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因的質(zhì)粒含有IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點。[方式11]根據(jù)方式IO所述的轉(zhuǎn)化方法，其中l(wèi)b)的含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因的質(zhì)粒是具有圖14所示結(jié)構(gòu)的pVGW，或者具有圖15所示結(jié)構(gòu)的pVGW2。[方式12]根據(jù)方式8所述的轉(zhuǎn)化方法，其中l(wèi)b)的含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因的質(zhì)粒還含有農(nóng)桿菌屬細菌的virB基因。[方式13]根據(jù)方式12所述的轉(zhuǎn)化方法，其中l(wèi)b)的含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因的質(zhì)粒含有IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點。[方式14〗根據(jù)方式13所述的轉(zhuǎn)化方法，其中l(wèi)b)的含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因的質(zhì)粒是pTOK47。[方式15]一種定位克隆方法，其特征在于，包括下述工序1)用限制性酶將含有與植物的表型相關(guān)的候選基因的BAC克隆部分分解或完全分解；2)使用粘粒載體，將工序l)所得DNA片段亞克隆化，從而構(gòu)建文庫；然后3)將構(gòu)成文庫的克隆分別導(dǎo)入植物，評價轉(zhuǎn)化植物的表型。[方式16]根據(jù)方式15所述的定位克隆方法，其中工序l)所得DNA片段的大小為25~40kb。[方式17]根據(jù)方式16所述的定位克隆方法，其中2)的粘粒載體是方式1~5的任1項所述的粘粒載體。[方式18]一種質(zhì)粒載體，其具有下述的特征，1)含有IncW質(zhì)粒復(fù)制所必要的因子，不含有其它質(zhì)粒的復(fù)制起點；2)含有IncW質(zhì)粒復(fù)制所必要的repA基因；3)含有在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌屬細菌中表達的抗藥性基因；而且4)含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因。[方式19]根據(jù)方式18所述的質(zhì)粒載體，其全長為10kb以內(nèi)。[方式20]根據(jù)方式19所述的質(zhì)粒載體，其中農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因是virGN54D。[方式21〗根據(jù)方式18~20的任1項所述的質(zhì)粒載體，其選自下述的組由序列編號8所記載的堿基序列構(gòu)成的質(zhì)粒載體pVGW或其同等物；以及由序列編號67所記載的石咸基序列構(gòu)成的質(zhì)粒載體pVGW2或其同等物。[方式22]質(zhì)粒載體pVGW,其由序列編號8所記載的》威基序列構(gòu)成。[方式23]質(zhì)粒載體pVGW2，其由序列編號67所記載的堿基序列構(gòu)成。[方式24〗一種植物的轉(zhuǎn)化方法，其包括使用下述農(nóng)桿菌屬細菌轉(zhuǎn)化植物，所述農(nóng)桿菌屬細菌含有方式18~23的任1項所述的質(zhì)粒載體。(圖l)是載體pSB200PcHm的才莫式圖。(圖2)是載體pSB25UNpHm的才莫式圖。(圖3)是載體pSBMOPcHmGWH的模式圖。(圖4)是載體pSB200PcHmGWB的模式圖。(圖5)是顯示載體pLC40的構(gòu)建程序的圖。(圖6)是載體pLC40的模式圖。(圖7)是載體pLC40GWH的模式圖。(圖8)是載體pLC40bar的模式圖。(圖9)是載體pLC40GWB的模式圖。(圖10)是載體pLC40GWHkorB的模式圖。(圖ll)是載體pLCleo的模式圖。(圖12)是載體pLCSBGWBSWa的模式圖。(圖13)是載體pLC40GWHvGl的模式圖。(圖14)是載體pVGW的模式圖。(圖15)是載體pVGW2的模式圖。(圖16)顯示通過pLC載體克隆DNA片段的結(jié)果。顯示大芻草基因組DNA片段的例子。Ml:分子量標(biāo)準(lkb梯度)，M2:分子量標(biāo)準(X-hindIII),編號克隆編號，箭頭pLC40GWH的帶的位置(13.2kb)。從大芻草文庫中純化出11個克隆的質(zhì)粒DNA。用位于質(zhì)粒插入物的兩端的多克隆位點的限制性酶HindIII和Sacl切割，并進行瓊脂糖凝膠(0.8%)電泳。(圖17)顯示將基因組DNA片段導(dǎo)入稻的結(jié)果(B片^:中央部分)。M:分子量標(biāo)準，Yu:雪光，Ru:普通野生稻，Transgenic(轉(zhuǎn)基因)轉(zhuǎn)化稻(二倍體)。在轉(zhuǎn)化稻中，除了來自雪光的帶，還檢測到來自普通野生稻的帶。實施例以下，通過實施例具體地說明本發(fā)明，但這些并非用于限定本發(fā)明的技術(shù)范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本說明書的記載容易地對本發(fā)明進行修飾、變化，這些也包括在本發(fā)明的技術(shù)范圍中。實施例l:pLC系列粘粒載體的構(gòu)建在以下程序中，對分子生物學(xué)的實驗方法只要不特別指定，就依照"SambrookJ和RussellD.W.,2001年，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,冷泉港，紐約，美國"進行。l)T-DNA區(qū)域的構(gòu)建在pSB200(WO2005/040374)的EcoRV位點插入Pad接頭(gttaattaac)(序列編號10),構(gòu)建pSB200Pac。構(gòu)建了將pSB25(Ishida等，1996年)的花椰菜花葉病毒35S啟動子變換成玉米的泛素(ubiquitin)啟動子(Christensen等，1992年，PlantMolBiol,18巻675-689)而成的pSB25U。使具有限制性酶NspV和歸巢核酸內(nèi)切酶I-Scel的識別位點的適體HinNspISceRV、HinNspISceFW(表l)進行退火。使用多核苷酸激酶(PNK,Amersham公司)將其一部分進行磷酸化。將產(chǎn)物按照常規(guī)方法克隆到pSB200Pac的Sacl位點、以及pSB25U的HindIII位點。將制備成的質(zhì)粒分別命名為pSB200PacHml和pSB25UNpHml。在pSB200PacHml和pSB25UNpHml的Spel位點導(dǎo)入重組了歸巢核酸內(nèi)切酶I-CeuI位點的適體SpeICeuRV、SpeICeuFW(表1)。通過該操作制備成了在pSB200Pac的Sacl位點、Spel位點分別插入了歸巢核酸內(nèi)切酶位點I-Scel、I-Ceul而成的載體pSB200PcHm(圖1),以及在pSB25U的HindIII位點、Spel位點分別插入了歸巢核酸內(nèi)切酶位點I-Scel(+NspV位點)、I-Ceul而成的載體pSB25UNpHm(圖2)。確認可用I-Scel、I-Ceul切割，使用ABIPRISM熒光測序儀(Model310GeneticAnalyzer,PerkinElmer公司制造)，進行堿基序列檢查，確認插入了單一適體。在這些載體中，可以切割出I-Scel-選擇標(biāo)記單元-LB-I-CeuI。[表l]表1引物名序列長度HinNspISceRV5'-AgCTTTCgAATAgggATAACAgggTAAT-3'28merHinNspISceFW5'-AgCTATTACCCTgTTATCCCTATTCgAA-3'28merSpeICeuRV5'-CTAgTAACTATAACggTCCTAAggTAgCgAC-3'31merSpeICeuFW5'陽CTAggTCgCTACCTTAggACCgTTATAgTTA-3'31mer上起依次為序列編號23-26接著，用BamHI消化pSB200PcHm,除去潮霉素抗性基因(hpt)，然后進4亍平端化。將產(chǎn)物與aatRl-ccdB-Cm-aatR片段(Invitrogen)連接，導(dǎo)入大腸桿菌DB3.1選擇氯霉素抗性菌落，制成目的(Destination)載體pDEST3342。接著為了通過BP反應(yīng)在pDONR/Zeo質(zhì)粒(Invitrogen)中導(dǎo)入標(biāo)記基因，而合成含有aatB序列的以下引物(大寫字母為aatB序列)。[表2]表2_引物名_￡^_^aatB1-HPTggggACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTcaatgagatatgaaaaagec49merHPT-aatB2ggggACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTctattectttgecetcggacgag52meraatB1-barggggACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTccatggacccagaacgacgc49merbar-aatB2ggggACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTtcctagacgcgtgagateag49mer上起依次為序列編號27-30在Hpt基因的擴增中使用Bilang等，1991年，Gene,100巻247-250所述的hpt基因作為模板DNA。使用aatBl-HPT、HPT-aatB2作為引物，在草胺膦抗性基因(bar)的擴增中使用pSB25(Ishida等，1996年)作為模板DNA,使用aatB1-bar、bar-aatB2作為引物(表2)。PCR是在100jJl的反應(yīng)液中加入10ng模板DNA、25皮摩爾引物，循環(huán)數(shù)為35。反應(yīng)結(jié)束后用乙醇沉淀回收產(chǎn)物，按照BPClonaseEnzymeMix試劑盒(Invirogen)附帶的指南進行BP反應(yīng)(25。C,6小時)，導(dǎo)入大腸桿菌DH5a,在加入了抗生素Zeocin的低鹽LA平板上選擇重組了目標(biāo)質(zhì)粒的大腸桿菌。進行限制性酶分析并對最終得到的質(zhì)粒進行堿基序列確認，分別制備成了pENT-HPTwt和pENT-bar。使用制備好的目的載體(Destinationvector,pDEST3342)和中間載體(entryvector,pENT-HPTwt和pENT-bar),利用LR反應(yīng)制成最終目標(biāo)質(zhì)粒。按照GATEWAYLRClonaseEnzymeMix試劑盒附帶的指南，在20u1反應(yīng)液0吏用目的載體和中間載體各300ng),在25。C進行反應(yīng)4小時，然后用電穿孔法導(dǎo)入大腸桿菌DH5a。從在添加奇霉素的LA平板上生長的克隆中制備質(zhì)粒DNA，通過限制性片段圖譜選擇候選克隆。根據(jù)堿基序列分析確認重組了aatB序列和HPT基因序列或bar堿基序列，分別命名為pSB200PcHmGWH(圖3)和pSB200PcHmG篇(圖4)。2)粘粒載體pLC40的構(gòu)建作為擴增含有IncP質(zhì)粒pVK102(Knauf和Nester,Plasmid,8巻45-54頁，1982)的oriV的DNA片段、含有oriT的DNA片段、含有incC2基因的DNA片段、含有trfAl基因的DNA片段、含有來自pBI121的叩tIII基因和來自pSBll的cos的DNA片段的PCR引物，設(shè)計了OriV3，ClaFW、OriV5，PvNhEc、OriT5，BglRV、OriT3，SpEcFW、InC5,XbRV、InC3，BgEcFW、R5，XhoIRV、R3,BmEcFW、121KIII5，NspV、121KIII3,Sa11、COS5,BmRV、COS3，MunFW，使用PyrobestDNA聚合酶(Takara公司制造)進行PCR反應(yīng)(表3)。各引物中重組了后面使用的限制性酶位點。將除trfAl基因之外的PCR產(chǎn)物，即含有來自pVK102的oriV的DNA片段(884bp)、含有oriT的DNA片段(810bp)、含有incCl基因的DNA片段(2118bp)、含有來自pBI121的nptIII基因的DNA片段(1087bp)、含有來自pSBl1的cos的DNA片段，分別克隆到載體pCR2.1TopoBlunt(Invitrgen公司制造)中。其結(jié)果是，在含有oriV的DNA片段中，與公開數(shù)據(jù)庫(Genbank登記號L27758)中對應(yīng)的堿基序列比較，發(fā)現(xiàn)了2個堿基取代和1個堿基增加。因為這些變異也可以在模板質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)，所以其原因不是PCR產(chǎn)生的變異，而是模板質(zhì)粒具有與公開數(shù)據(jù)庫中的序列不同的堿基序列。oriT、incCl基因、cos與數(shù)據(jù)庫的堿基序列完全相同。此外，trfAl基因不能單獨克隆。所以用以下的方法進行構(gòu)建。將克隆化了含有oriV的DNA片段的質(zhì)粒用限制性酶EcoRI、Clal消化，純化0.9kb片段。同樣地將含有oriT的DNA片段用EcoRI和BglII消化，將含有nptIII的DNA片段用NspV和Sail消化，并進行純化。另外，對于含有trfAl基因的DNA片段，將PCR產(chǎn)物進行乙醇沉淀，然后用Xhol和BamHI消化，并進行純化。對于這4個片段(oriV、trfAl基因、nptIII、oriT),進行連接反應(yīng)，將所有4個片段一次克隆。對制備成的質(zhì)粒(命名為pVRKT)進行堿基序列分析，結(jié)果與公開數(shù)據(jù)庫(Genbank登記L27758)中對應(yīng)的堿基序列比較，在含有trfAl基因的DNA片段上檢測到伴隨移碼的變異，而在作為模板的pVK102上也發(fā)現(xiàn)同樣的變異，由此得出結(jié)論其原因不是PCR序列。將含有制備成了的4個片段的質(zhì)粒pVRKT用EcoRI、Spel消化，在其中插入含有incCl基因的DNA片段，所述含incCl基因的DNA片段是將重組了incCl基因的質(zhì)粒用EcoRI、Xbal消化并回收得到的。將制備成的質(zhì)粒進一步用EcoRI、BamHI消化，在其中導(dǎo)入含有cos的DNA片段，所述含有cos的DNA片段是將重組了含有cos的DNA片段的質(zhì)粒用Munl、BamHI消化并回收得到的，從而制備成了包含含有oriV的DNA片段、含有trfAl基因的DNA片段、含有nptIII的DNA片段、含有oriT的DNA片段、含有incCl基因的DNA片段、含有cos的DNA片段這6個片段的低拷貝載體的骨架p6FRG(約8.5kb)(序列表的序列編號1)。以上的克隆程序總結(jié)在模式圖5中。在p6FRG質(zhì)粒的PvuII、Nhel位點重組pSB200PcHm的T-DNA區(qū)域(SspI-SpeI片段)，從而制備成了載體pLC40(圖6,序列表的序列編號2)。[表3]表3引物名序列目標(biāo)基因長度121KIII5'NspV5'-TCgTTCgAATCgATACTATgTTATACgCCAAC-3'nptIII32mer121KII3'Sa115'-ATCgTCgACTgCACgAATACCAgCgACCC-3'29merCOS5'BmRV5'-gggggATCCTTCCATTgTTCATTCCACggAC-3'cos31merCOS3'MunFW5'.gggCAATTgACATgAggTTgCCCCgTATTC-3'30merOriV3'ClaFW5'-gATATCgATAgCgTggACTCAAggCTCTC-3'oriV29merOriV5'Pv廳c5'-AAAgAATTCgCTAgCCAgCTggCgCTgCCATTTTTggggTg-3'41merR5'XhoIRV5'-AAACTCgAgCAgCCgAgAACATTggTTCC-3'trfAl29merR3'BmEcFW5'-TAggAATTCggATCCAAAACAACTgTCAAAgCgCAC-3'36merOriT5'BglRV5'-CgTAgATCTggCgCTCggTCTTgCCTTg-3'oriT28merOriT3'SpEcFW5'-TgTgAATTCACTAgTgATATTCCACAAAACAgCAggg-3'37merInC5'XbRV5'-CCgTCTAgATTCgAgCCACggTagCggC-3'incC228證InC3'BgEcFW5'-CTTgAATTCAgATCTTCTCggCggCgATCACgAC-3'34mer上起依次為序列編號31-423)其它pLC系列的粘粒載體的構(gòu)建pLC40GWH位于pSB200PcHmGWH的骨架部分的2個Ball位點中，由于位于RB的左側(cè)的位點曱基化，故而不能被切斷。所以，將pSB200PcHmGWH導(dǎo)入大腸桿菌GM48菌林中，除去該位點的曱基化之后用于以下的實驗。將pSB200PcHmGWH用Ball、Spel處理而切出含有T-DNA的區(qū)域，克隆到上述的6FRG的PvuII、Nhel位點，從而制備成pLC40GWH(圖7,序列表的序列編號3)。與pLC40的不同點是插入了attB1,2序列和RB上游區(qū)域SspI-BalI317bp缺失。pLC40bar、pLC40GWB、pLC40GWBSW將pSB25UNpHm、pSB200PcHmGWB用限制性酶Spel、Sspl消化，并回收含有T-DNA的部分。將這些片段克隆到p6FRG的PvuII、Nhel位點，分別制備成了pLC40bar(圖8,序列表的序列編號4)、pLC40GWB(圖9，序列表的序列編號5)。將pSB200PcHmGWB用NspV處理，并進行平端化、41脫磷酸化。在其中重組pSwal接頭(linker)(表4)(pSB200PcHmGWBSW)。將該質(zhì)粒用限制性酶SpeI、Sspl消化，并回收含有T-DNA的部分。將這些片段克隆到p6FRG的PvuII、Nhel位點，從而制備成了pLC40GWBSW。pLC40:35S-IGUS、pLC40G職:35-IGUS將載體pSB24(Komari等，1996)用限制性酶HindIII、EcoRI處理，切下含有35S啟動子-I-GUS基因-NOS終止子的DNA片段。進而用Klenow處理進行平末端化之后，純化并回收3.1kb片段。將上述粘粒載體pLC40用限制性酶NspV處理，用Klenow酶平端化，然后進行脫磷酸化、純化。另外，將pLC40GWBSW用限制性酶Swal處理，脫磷酸化，然后進行凝膠純化。在這些載體中導(dǎo)入上述的含有GUS基因的DNA片段，分別制成pLC40:35S陽IGUS、pLC40G職:35S-IGUS。pLC40GWHKorB擴展pLC載體的IncCl的克隆區(qū)域，構(gòu)建了含有諸如korB基因的載體pLC40GWHKorB。設(shè)計擴增含有IncP系質(zhì)粒pVK102的IncCl-KorB的DNA片段的引物IncC3，BgEcFw(上述)、IncC/KorB-Xba弁l(表4)。各引物中重組了后面使用的限制性酶位點。PCR反應(yīng)如下進行在50pl的反應(yīng)液中，分別含有500ngpVK102質(zhì)粒DNA、5jj110xPyrobest緩沖液、4y12.5mMdNTPs、50皮摩爾引物、0.5MlPyrobestDNA聚合酶(Takara公司制造)，使用Mastercyclergradient(eppendorf公司)，96°C3分鐘進行1個循環(huán)，(96°Cl分鐘、55。Cl分鐘、72。C2分30秒)進行IO個循環(huán)。其結(jié)果是，擴增得到了IncCl-korB的PCR產(chǎn)物(3065bp),所以將它克隆到載體pCR2.1TopoBlunt(Invitrogen公司制造)中。連接反應(yīng)依照載體試劑盒附帶的說明書。使用電穿孔法在大腸桿菌DH5a中導(dǎo)入DNA，在含有抗生素Zeocin(25|ag/ml)的2xYT瓊脂培養(yǎng)基上在37。C培養(yǎng)一夜。以生長的菌落為模板，用與在IncCl-KorB擴增中所使用的相同的引物對進行菌落直接PCR，選擇候選克隆。PCR的條件是，調(diào)整使得20M1的反應(yīng)液中分別含有2ja110xExtaq緩沖液、1.6ju12.5mMdNTPs、5皮摩爾引物、0.4ju1ExtaqDNA聚合酶(Takara公司制造)，在反應(yīng)液中懸浮菌落之后，使用Wastercyclergradient,96°C3分鐘進行l(wèi)個循環(huán)，(96。Cl分鐘、55。C1分鐘、72。C2分30秒)進行30個循環(huán)。其結(jié)果是將擴增了約3kb的PCR產(chǎn)物的菌落作為候選克隆。對于這些克隆，使用ABIPRISM焚光測序儀(Model3100GeneticAnalyzer,AppliedBiosystems公司制造)，確定堿基序列。其結(jié)果是IncCl-KorB的堿基序列與數(shù)據(jù)庫的序列完全相同。接著，將所述質(zhì)粒pVRKT用EcoRI、Spel消化，在其中插入IncCl-KorB片段，所述IncCl-KorB片段是將重組了IncCl-KorB的質(zhì)粒用EcoRI、Xbal消化并回收而得到的。將制備成的質(zhì)粒進一步用EcoRI、BalII消化，重組所述的cos片段(MunI-BamHI片段)，從而制備成了含有oriV、trfAl、nptIII、oriT、IncCl-KorB、cos這6個片段的質(zhì)粒p6FRG2。在p6FRG2質(zhì)粒的PvuII、Nhel位點重組來自pSB3342GWH的T-DNA區(qū)域(BalI-SpeI片段)，從而制成載體pLCMOGWHKorB(圖10,序列編號65)。pLC40GWHKorBPI為了使得所克隆的基因組大片段以原樣不變的形態(tài)切下來，在多克隆位點上游追加了歸巢酶PI-SceI的識別位點。將pLC40GWHKorB用HindIII消化、并重組了PI-SceI適體(PI-SceIFw、PI-SceIRv,表4)，該質(zhì)粒為pLC40GWHKorBPI。pLC40GWHKorBPIattB3為了使得pLC40GWH的選擇標(biāo)記的啟動子可以通過Gateway系統(tǒng)(Gatewaysystem)與任意啟動子交換，在泛素啟動子上游追加了attB3位點。將pLC40GWHKorBPI用I-Scel消化、并重組了attB3適體(attB3Fw、attB3Rv，表4),該質(zhì)粒為pLC40GWHKorBPIattB3。pLCleo為了使得用Notl消化的基因組片段能夠克隆，在多克隆位點上制成PspOMI(生成與Notl同樣的粘性末端)的識別位點，同時破壞了位于泛素內(nèi)含子內(nèi)的Apal(PspOMI的異裂酶(neoschizomer))的識別位點。將pLC40GWHKorBPIattB3用Apal和Nhel消化、并重組了Apalm-Nhel適體(ApaIm-NheIFw、ApaIm-NheIRv,表4)，該質(zhì)粒為pLC40GWHKorBPIattB3Apalm。將該質(zhì)粒用HindIII和NspV消化、并重組了HindIII-PspOMI-NspV適體(HindIII-PspOMI-NspVFw、HindIII-PspOMI-NspVRv，表4),從而制備成了pLCleo(圖11,序列表的序列編號66)。[表4]表4引物/適體名序列(5，-3')IncC/KorB-Xba#lCGGTCTAGAGTGCGCAGCAGCTCGTTATCPI-SceIFwPI-SceIRvattB3FwCAGGGTAATCAACTTTGTATAATAAAGTTGATAAattB3RvCAACTTTATTATACAAAGTTGATTACCCTGTTATApaIm-NheIFwApalm-NheIRv長度29mer43mer43mer34mer34mer60merHindIII-PspOMI-NspVFwAGCTTGGGCCCTTHindlll-PspOMI-NspVRvAGGGCCCA66mer13mer8mcr上起依次為序列編號68-76p6FRGSwKp將p6FRG用PvuII處理，并進行脫磷酸化。使具有Swal和Kpnl的識別位點的適體SwaIKpnIRV、SwaIKpnIFW(表5)DNA退火。將其一部分用PNK(Amersham)進行磷酸化。將該Swal-Kpnl接頭重組到p6FRG的PvuII位點，從而制備成了p6FRGSwKp。Kpnl位點是為了在接下來步驟中的克隆具有來自農(nóng)桿菌菌抹A281的virB基因和virG基因的DNA片段的用途而設(shè)計，SwaI位點是為了在接下來的步驟中克隆T-DNA的用途而設(shè)計。[表5]表5接頭/適體名稱序列長度pSwal接頭5'-ccatttaaatgg-3'12merSwaIKpnIRV5'-ccatttaaatggtaccgg-3'18merSwaIKpnlFW5'-ccggtaccatttaaatgg-3'18mer上起依次為序列編號43■-45p6FRGSVR、p6FRGSVRF將載體pSBl(Komari等，1996)用Kpnl消化，并回收含有virB基因和virG基因的14.8kb的DNA片段。將該片段重組到將p6FRGSwKp進行了Kpnl處理、并脫磷酸化的載體中，從而制備成了p6FRGSVR以及p6FRGSVF。pLCSBGWBSW將pSB200PcHmGWBSW用Spel、Sspl消化，將含有T-DNA區(qū)域的DNA片段用Klenow酶平端化。將該片段重組到將p6FRGSVR進行了Swal消化、并脫磷酸化的載體中，從而制備成了pLCSBGWBSW(圖12，序列表的序列編號6)。本載體是全長約28kb的低拷貝載體，含有來自農(nóng)桿菌的菌抹A281的virB基因和virG基因，可以認為能夠在玉米的轉(zhuǎn)化中使用。另外，因為重組了cos位點，所以可以通過包裝反應(yīng)容易地克隆10-20kb左右的DNA。4)virG重組型pLC載體作為提高pLC40系列的粘粒載體的植物轉(zhuǎn)化效率的方法，按照下述程序，構(gòu)建了在pLC40GWH載體中重組了virG基因的載體pLC40GWHvG。virG基因的制備設(shè)計并合成擴增virG基因(包括啟動子、結(jié)構(gòu)基因、3'區(qū)域)的引物virGProSm、virGTerSm。使用這些引物和作為模板DNA的pTOK47(Jin等，1987年，JBacteriol，169巻:4417-4425頁)，用PCR擴增virG基因。其結(jié)果是擴增了約lkb的PCR產(chǎn)物。將其一部分用上述的同樣方法克隆到載體pCR2.1Topo(Invitrogen公司制造)中，確認石成基序列。virG基因的DNA序列中有NspV位點。該限制性位點在此后的載體中作為克隆位點使用。所以，通過基于PCR的變異導(dǎo)入消去了該位點。設(shè)計并合成了使NspV位點(ttcgaa)中的第一個腺噤呤變成鳥嘌呤(ttcgga)的引物virGonNspVRV和其互補序列virGonNspVFW。用virGonNspVFW和與virG基因啟動子上游結(jié)合的引物virGProSpe，以及virGonNspVRV和與virG基因終止子下游結(jié)合的引物virGTerSpe這2組引物組合進行PCR。使用克隆到pCR2.1T叩o中的virG基因作為模板。其結(jié)果是，前者的組合擴增出約400bp的產(chǎn)物，后者的組合擴增出約600bp的產(chǎn)物。將這些產(chǎn)物進行純化，用作接下來的PCR反應(yīng)的模板。以純化的2種PCR產(chǎn)物為模板，使用之前的引物virGProSpe、virGTerSpe進行PCR反應(yīng)。其結(jié)果是擴增出了lkb的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1T叩o載體中，確定堿基序列，從而確認了變異導(dǎo)入(ttcgaa—ttcgga)。另外，同樣地使用virGProSpe、virGTerSpe用PCR擴增無變異的virG基因，克隆到pCR2.1Topo中，確"i人4^基序列。將PCR所用引物總結(jié)在表6中。表6名稱序列5'-3'長度virGProSmTCAATACCCggggTAACCTCgAAgCgTTTCAC32mervirGTerSmTggTgACCCgggACCTATCggAACCCCTCAC31mervirGProSpeTCAATAACTAgTgTAACCTCgAAgCgTTTCAC32mervirGTerSpeTggTgAACTAgTACCTATCggAACCCCTCAC31mervirGonNspVRVCTTgAgATCgTTCggAATCTg21mervirGonNspWWCAgATTCCgAACgATCTCAAg21mer上起依次為序列編號46-51pLC40GWHvGl、pLC40GWHvGCl將載體pLC40GWH用限制性酶Pvu11消化，并進行脫磷酸化。在其中導(dǎo)入SpeI接頭(GACTAGTC,Takara公司制造)，從而制成pLC40GWHSpe。將該質(zhì)粒用限制性酶Spel消化，并進行脫磷酸化。在其中插入從載體上用Spel切下實施了變異導(dǎo)入的上述virG基因而得的約lkb的片段，從而制成了pLC40GWHvGl(圖13,序列表的序列編號7)。另外，同樣地將無變異的virG基因?qū)雙LC40GWHSpe,從而制成pLC40GWHvGC1。pLC40GWHvGl:35S-IGUS、pLC40G麗vGCl:35S-IGUS與上述同樣地，將載體pSB24(Komari等，1996)用限制性酶HindIII、EcoRI處理，切下含有GUS基因的DNA片段，克隆到具有SgfI-Hindin-EcoRI-Sgfl的排列的多克隆位點的載體的相同限制性位點。將制備成的質(zhì)粒用Sgfl消化，回收含有GUS基因的DNA片段。這時，含有GUS基因的DNA片段的兩端是Sgfl位點。將上述粘粒載體pLC40GWHvGl用限制性酶PacI進行處理、并脫磷酸化。在其中克隆3.1kbSgfl片段(含有GUS基因的DNA片段)，從而制備成了pLC40GWHvGl:35S-IGUS。另外同樣地，將35S-IGUS-NOS導(dǎo)入pLC40GWHvGCl中，從而制備成了pLC40GWHvGCl:35S-IGUS。5)可以與pLC共存的virG重組載體pVGWpTOK47是含有virG和virB的約28kb的大型IncW質(zhì)粒(Jin等，1987年，JBacteriol,169巻:4417-4425頁)。所以，設(shè)計并構(gòu)建了大小更小、且能與pLC載體共存的、具有復(fù)制起點IncWori、virG基因以及選擇標(biāo)記基因的載體(命名為pVGW)。設(shè)計了擴增含有來自pTOK47(Jin等，1987年，JBacteriol，169巻:4417-4425頁)的IncWori的片段的引物pSa5，EcT22、pSa3，Ba111，擴增來自pPHlJI(Hirsch和Beringer,1984年，Plasmid,12巻139-141)的慶大霉素抗性基因(慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)的引物Gm5，Bm、Gm3，XhJnd(表7)。各質(zhì)粒中重組了在之后使用的限制性酶位點。作為模板分別使用pTOK47、pPHlJI。使用PyrobestDNA聚合酶(Takara社制造)進行PCR。其結(jié)果是，作為含有l(wèi)ncWori片段擴增出了約2.7kb的DNA，作為慶大霉素抗性基因擴增出了約0.7kb的DNA。另一方面，設(shè)計了引物virGN54DFW及其互補序列virGN54DRV,所54位氨基酸殘基從N變成D(virGN54D,H肌sen等，1994年，Proc.Narl,Acad.Sci.USA，91巻7603-7607頁)。用virGN54DFW和與virG基因啟動子的5，側(cè)結(jié)合的引物virGProSal，以及virGN54DRV和與virG基因終止子的3，側(cè)結(jié)合的引物virGTerPst這兩組引物對(表7)進行PCR。使用pTOK47質(zhì)粒作為模板。其結(jié)果是，用前者的組合擴增出約0.4kb的產(chǎn)物，用后者的組合擴增出約0.7kb的產(chǎn)物。將這些產(chǎn)物純化后作為模板，使用之前的引物virGProSal、virGTerPst,進一步進行PCR反應(yīng)。其結(jié)果是，擴增出約l.lkb的產(chǎn)物(virGN54D)。將含有IncWori的片段、慶大霉素抗性基因、以及virGN54D的PCR產(chǎn)物克隆到PCR-BluntII-TOPO載體(Invitrogen公司)中。確定堿基序列，與公開序列(Genbank/EMBL登錄編號U30471)比較，結(jié)果在含有IncWori47的片段中有6個堿基缺失，該缺失在模板所使用的pTOK47中也發(fā)現(xiàn)。另一方面，慶大霉素抗性基因與數(shù)據(jù)庫的堿基序列完全一致。virGN54D在目標(biāo)位置確認了變異導(dǎo)入。將克隆了含有IncWori的片段的質(zhì)粒用EcoT221、BglII消化，并回收2.7kb的片段。同樣地將慶大霉素抗性基因用BamHI和Xhol消化，將virGN54D用SalI和PstI消化，并純化各片段。集合這3個片段進行連接反應(yīng)(BalII與BamHI、Xhol與Sall、Pstl與EcoT221分別具有相同的粘末端)，從而制備成了pVGW(圖14，序列表的序列編號8)。表7名稱序列長度pSa5'EcT225'-aaaatgcatggcatgtttaacagaatctg-3'29merpSa3'Bgl115'-tttagatctactcgttcgeggagetgg-3'27merGm5'Bm5'-aaaggatccttcatggettgttatgactg-3'29merGm3'Xh-2nd5'-tgcetcgagacaatttaccgaacaactccg-3'30mervirG隨FW5'-cgacctaaatctagateaacaac-3'23merviGN5備5'-gttgttgatetagatttaggtcg-3'23mervirGProSal5'-tttgtcgaccataggcgatctccttaatc-3'29mervirGTerPst5'-aaactgcaggtgaagagggacetategg-3'28mer自上依次為序列編號52—59pVGW2為了進一步提高pVGW的便利性，擴大了慶大霉素抗性基因的啟動子區(qū)域，并進一步構(gòu)建了重組了克隆位點的載體pVGW2。設(shè)計了擴增質(zhì)粒pPHlJI的慶大霉素抗性基因的引物BamSmaGmPro、NhelsiteGmRv，以及擴增pVGW的virG-IncW區(qū)域的引物'MscIsite-virG5，F(xiàn)w(以上表8)、'pSa3，BglII(上述)。各引物中重組了限制性酶位點。PCR反應(yīng)如下進行。在50nl的反應(yīng)液中，分別含有l(wèi)ng模板質(zhì)粒DNA、25ju12xPrimeSTARMaxPremix(Takara《、司制造)、15皮摩-爾引物，使用Mastercyclergradient(eppendorf乂〉司)，98°C30秒鐘進行1個循環(huán)，(98。C10秒鐘、55°C5秒鐘、72。Cl分鐘)進行35個循環(huán)。其結(jié)果是，擴增出了慶大霉素抗性基因(826bp)和virG-IncW區(qū)域(3840bp)的PCR產(chǎn)物。對于慶大霉素抗性基因，克隆到載體pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen公司)中，使用電穿孔法導(dǎo)入大腸桿菌TOP10(Invigtrogen公司)。在含有抗生素卡那霉素(50yg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上在37。C培養(yǎng)過夜，從得到的菌落純化質(zhì)粒。對于這些克隆(pCR-Gm)用ABIPRISM熒光測序4義(Model3100GeneticAnalyzer,AppliedBiosystems乂>司制造)確定堿基序列，確認沒有PCR錯誤產(chǎn)生的變異。將質(zhì)粒pCR-Gm用BamHI、PvuII消化并回收Gm片段，與用BglII消化的virG-IncW片段(一端是BalII末端，另一端是平末端)連接。將得到的克隆用電穿孔法導(dǎo)入大腸桿菌TOPIO，在含有抗生素慶大霉素(30jug/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上選擇。從生長的菌落純化質(zhì)粒，用測序儀確認沒有PCR錯誤，從而制備成pVGW2(圖15,序列表的序列編號67)。[表8]表8<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>自上依次為序列編號77-79實施例2:利用pLC載體的大片段克隆以用pLC40、pLC40G額、pLCleo、pLC40GWHvGl、pSB200、pSB200PcHmGW、或pSB25U制作的擬南芥04ra6Wo;w^，生態(tài)型哥〗侖比亞)、普通野生稻(Oj^flrw//70go")、蘇丹草(6brg/w附SMt/a"em^)、粟/to//C(2)、大芻草(Ze"d^/o/erew"z,力、雄卩谷(戶ewm.5e/M/w(y//20zWew附)、百喜草(Pasp(3/wmwo^3a^wi^Mgge)禾口甘嚴(5^cc/zarwmq^c/warMm)^J文庫為i^列進行敘述。1)基因組DNA的制備將約5g溫室培育的播種后約1個月的植物體的嫩葉用研缽在液氮下粉碎后，用CTAB法純化基因組DNA。產(chǎn)量是DNA約為500~600|ug。每liug植物基因組DNA用0.02~0.06U的Taql酶部分分解。部分分解之后，通過10~40%的蔗糖密度梯度離心回收含有30~45kb的基因組DNA片段的級分。2)載體的制備將粘粒載體pLC40、pLC40GWH、pLCleo、pLC40GWHvGl、pSB200、pSB200PcHmGW、pSB25U用限制性酶NspV(TOYOBO)完全消化，并進行脫磷酸化，然后純化。3)使用包裝反應(yīng)的克隆使用大腸桿菌GeneHogs(Invitrgen)進行培養(yǎng)。其結(jié)果如表7所示，對于任一種植物種、載體的組合，都可以制作1~10萬cfu(菌落形成單位，colony-forming-unit)的文庫(表9)。[表9]表9<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>4)克隆的基因組DNA片段的分析從各文庫12-24個克隆中純化質(zhì)粒，用位于插入片段的兩端的多克隆位點的限制性酶HindIII和Sacl切割，結(jié)果在pSB200、pSB25UNpHm、pSB200PcHmGW的情況下，分析的所有克隆中出現(xiàn)了相應(yīng)于載體(9.2~9.8kb)的帶，在pLC40、pLC40G麗、pLCleo、pLC40GWHvGl的情況下，分析的所有克隆中出現(xiàn)了相應(yīng)于載體(13.214.2kb)的帶。總計各克隆的插入片段的限制性片段長度，結(jié)果克隆的大片段的長度范圍為25kb45kb,pSB載體的情況下平均為約40kb，pLC載體的情況下平均為約35kb。圖16顯示大芻草基因組DNA/pLC40GWH的例子。接著將人類基因組(HumanGenomicDNA，男性，Promega公司制造，產(chǎn)品編號G1471)用Taql部分分解，制備30~40kb片段，克隆到載體pLC40GWH中，對于任意的12個克隆，從含有人類基因組片段的大腸桿菌中純化質(zhì)粒DNA，解讀插入片段兩端的堿基序列，進行數(shù)據(jù)庫搜索。數(shù)據(jù)庫使用NCBI的GenBank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),通過BLAST進行同源性檢索。其結(jié)果明確了，數(shù)據(jù)庫中的含有人類基因組片段的ll種單克隆中分別含有分離的12個克隆中的11個克隆。除含有重復(fù)序列的1個克隆之外，對其余IO個克隆從與數(shù)據(jù)庫中的人類基因組序列具有同源性的部分推測克隆的人類基因組片段的長度，為28023bp、31645bp、38265bp、39599bp、31965bp、3263lbp、34727bp、36925bp、38794bp、34364bp。平均為34693.8bp，與上述的克隆植物基因組時的情況很一致。接下來確定克隆化的植物基因組DNA片段的兩末端的堿基序列。對于得到的300~600堿基的序列數(shù)據(jù)，使用NCBI的GenBank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)、和北京基因組研究中心(genomicsinstitute)的凄t據(jù)庫(http:〃btn.genomics.org.cn:8080/rice/),通過BLAST進行同源性檢索。其結(jié)果是，在普通野生稻、擬南芥的情況下，在其全部克隆中至少100bp以上的范圍內(nèi)，分別顯示與稻、擬南芥的基因組序列87~100%的同源性。在其它植物種的文庫中，也顯示了與稻、擬南芥、玉米、高粱等的序列顯著的同源性。實施例3:通過三菌抹接合法導(dǎo)入農(nóng)桿菌1)通過三菌林接合法導(dǎo)入農(nóng)桿菌及其效率如下所述，利用三菌抹接合法將導(dǎo)入了植物基因組片段的各載體轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中。i)pLC40系列的粘粒載體pLC40系列的粘粒載體是卡那霉素(Km)和潮霉素(Hm)抗性的。使用GeneHogsTM(Invitrogen)作為宿主大腸桿菌。使用pRK2073(奇霉素(Sp)抗性)作為三菌抹接合時的輔助質(zhì)粒。輔助質(zhì)粒的宿主大腸桿菌使用HB101。農(nóng)桿菌菌4朱使用LBA4404(無抗藥性)。首先，使適量的包裝反應(yīng)稀釋液感染大腸桿菌GeneHogs,并涂布在含有Km(50ng/mL)的LA培養(yǎng)基上，在23。C培養(yǎng)3天。使用牙簽將出現(xiàn)的菌落中的菌涂布在含有Km的LA培養(yǎng)基上，在28。C培養(yǎng)。另一方面將LBA4404涂布在AB培養(yǎng)基上，在25。C培養(yǎng)5天。將HB101/pRK2073涂布在含有Sp(50jug/mL)的LA上，在37。C培養(yǎng)2夜。將這樣培養(yǎng)的、含有克隆化了基因組片段的pLC40系列的粘粒載體的GeneHogsTM、LBA4404、HB101/pRK2073三種菌林在NA培養(yǎng)基上混合，在28。C培養(yǎng)過夜。將全部三菌抹的混合物懸浮在250yl的滅菌水中，將5jul涂布在含有Km(50ug/mL)與Hm(25ng/mL)的AB培養(yǎng)基上，在28。C培養(yǎng)7天。將得到的重組農(nóng)桿菌用于植物轉(zhuǎn)化實驗。此外，將該單菌落在含有Km和Hm的AB培養(yǎng)基上再培養(yǎng)，將生長的菌落的一部分涂布在含有藥劑的LA培養(yǎng)基上，結(jié)果判明，大腸桿菌基本上不增殖。ii)pSB200系列的粘粒載體pSB200系列的粘粒載體是Sp和Hm抗性的。使用GeneHogs(Invitrogen)作為宿主大腸桿菌。使用pRK2013(Km抗性)作為輔助質(zhì)粒。使用HB101作為輔助質(zhì)粒的宿主大腸桿菌。使用含有pSBl的LBA4404(四環(huán)素(Tc)抗性)作為農(nóng)桿菌菌株。首先，使適量的包裝反應(yīng)稀釋液感染大腸桿菌GeneHog,并在含有Sp(50Mg/mL)的LA培養(yǎng)基上，在23。C培養(yǎng)3天。用牙簽挑取菌落，涂布在含有Sp的LA培養(yǎng)基上，在28。C培養(yǎng)2夜。另一方面將LBA4404/pSBl涂布在含有Tc(15Mg/mL)AB培養(yǎng)基上，在25。C培養(yǎng)5天。將HB101/pRK2013涂布在含有Km(50iJg/mL)的LA上，在37。C培養(yǎng)2夜。將這樣培養(yǎng)的、含有克隆化了基因組片段的pSB200系列的粘粒載體的GeneHogs、LBA4404/pSBl、HB101/pRK2013在NA培養(yǎng)基上混合，在28。C培養(yǎng)一夜。將全部三菌抹混合物懸浮在250ju1的滅菌水中，將25y1涂布在含有Sp(50pg/mL)與Hm(25jug/mL)的AB培養(yǎng)基上，在28。C培養(yǎng)7天。將得到的重組農(nóng)桿菌用于植物轉(zhuǎn)化實驗。iii)pCLD04541使用從TexasA&M大學(xué)的HongbinZhang博士獲得的、使用載體pCLD04541制成的基因組文庫(稻品種C039的基因組、和擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)，均為平均插入片段長度110kb，宿主大腸桿菌是DH10B)進行三菌林接合。pCLD04541載體是Km和Tc抗性的。使用pRK2073作為輔助質(zhì)粒，使用HB101作為輔助質(zhì)粒的宿主大腸桿菌。使用LBA4404作為農(nóng)桿菌菌林。將含有pCLD04541文庫的各克隆的大腸桿菌涂布在含有Tc(lOjag/mL)的LA培養(yǎng)基上，在28。C培養(yǎng)2夜。另一方面將LBA4404涂布在AB培養(yǎng)基上，在25。C培養(yǎng)5天。將HB101/pRK2073涂布在含有Sp(50ug/mL)的LA上，在37。C培養(yǎng)2夜。將這樣培養(yǎng)的、含有克隆化了基因組片段的pCLD04541的DH10B、LBA4404、HB101/pRK2073在NA培養(yǎng)基上混合，在28。C培養(yǎng)1夜。將全部三菌林混合物懸浮在250Ml的滅菌水中，將幾M1涂布在含有Km(50]ug/mL)的AB培養(yǎng)基上，在28。C培養(yǎng)7天。將得到的重組農(nóng)桿菌用于植物轉(zhuǎn)化實驗。如上操作，將使用pLC40系列的粘粒載體、pSB200系列的粘粒載體、和pCLD04541載體制成的文庫中所含有的基因組克隆導(dǎo)入農(nóng)桿菌。該三菌抹接合的全過程、以及三菌抹接合的效率如表7。在pLC系載體的情況下三菌抹接合效率為97%，在pSB系載體的情況下三菌林接合效率為79%,在pCLD04541的情況下三菌株接合效率為93%,pLC系載體為最高(表10)。表10DNA供體植物栽體三菌抹接合中獲得重組農(nóng)桿菌效率(％)使用的克隆的的克隆的數(shù)量b/a數(shù)量(a)(b)<pLC40系列的粘粒載體>普通野生稻pLC40GWH5657546996.7擬南芥plX401532141092.0蘇丹草pLC40GWH2301220195.7栗pLC40GWH2521240595.4大芻草pLC40GWH107391059398.6百喜草pIXIeo38438399.7合計231342246197.1<pSB200系列的粘粒載體>普通野生稻pSB20010375750472.3擬南芥pSB200PcHmGWH1332117988.5蘇丹草pSB200PcHmGWH2096203196.9粟pSB200PcHmGWH2336203287.0合計161391274679.0<pCLD04541>杣稻C039pCLD0454114912785.2擬南齊pCLD045"19219099.0合計34131793.02)基因組DNA的穩(wěn)定性為了分析在各克隆中保持的基因組DNA片段是否傳遞到農(nóng)桿菌中，使用全部基因組DNA片段作為探針進行DNA雜交。從大腸桿菌和農(nóng)桿菌中按照常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA,用限制性酶HindIII、Sacl消化。接著將消化物的一部分用瓊脂糖凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印到尼龍濾膜HybondN+上。接著對該薄膜使用ECL-rabellingkit(Amersham)標(biāo)記來自大腸桿菌的質(zhì)粒的HindIII、Sacl消化物的一部分(乙醇沉淀，再溶解到TE中的產(chǎn)物)，將它作為探針進行雜交。雜交、洗滌、信號檢測按照ECL附帶的試劑盒進行。使用在pLC40GWH中克隆了普通野生稻片段的4種質(zhì)粒，結(jié)果確認全部發(fā)生了基因組DNA片段從大腸桿菌到農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)移。實施例4:利用pCL載體的大片段的稻轉(zhuǎn)化1)稻轉(zhuǎn)化及其效率i)稻轉(zhuǎn)化方法稻品種使用雪光，使未成熟胚感染農(nóng)桿菌。對于稻的轉(zhuǎn)化，利用特愿2003-293125所述方法。但是，作為農(nóng)桿菌接種的前處理，對無菌地取出的全部未成熟胚實施離心處理。具體地說，將未成熟胚轉(zhuǎn)入加入了lml的滅菌水的Eppendorf管中，以20000xg進行處理10分鐘(^5。C)。作為選擇藥劑使用潮霉素B，在選擇培養(yǎng)基、再分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中分別添加50mg/l。在pLC40系列的粘粒載體、pSB200系列的粘粒載體的情況下，將每1種農(nóng)桿菌菌抹(l種DNA片段)接種到1個未成熟胚中。另一方面，在pCLD04541的情況下，將每1種農(nóng)桿菌菌林(l種DNA片段)接種到2個未成熟胚中。此外，選擇藥劑使用巴龍霉素，以400~800mg/l的濃度添加到選擇培養(yǎng)基、再分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中。ii)將植物基因組片段導(dǎo)入稻表11顯示轉(zhuǎn)化的結(jié)果。在pSB200系列的粘粒載體的情況下，從59.1%~62.7%的菌林獲得了潮霉素抗性個體。與此相對，在pLC40系列的粘粒載體中，可以從86.6%~95.4%的菌抹獲得轉(zhuǎn)化體。對于提供基因組DNA的3種植物(普通野生稻、蘇丹草、粟)的任一種而言，都是使用pLC40系列的粘粒載體的情況效率較高，要高出24%~36%。另一方面，在pCLD04541的情況下，是41~53.4%這樣的低效率。由此可以認為，與pSB200系列的粘粒載體或pCLD04541相比，pLC40系列的粘粒載體是能夠效率良好地將基因組DNA片段導(dǎo)入稻的載體。接下來，為了研究通常大小的基因表達元件的轉(zhuǎn)化效率，在導(dǎo)入的DNA片段是GUS基因時進行了載體的比較試驗。提供各25個雪光未成熟胚并實施試驗，其結(jié)果是，相對于用pSB134(WO2005/017169)每個未成熟胚平均得到11.7個潮霉素抗性再生個體，用pLC40:35S-IGUS平均得到了11.5個再生個體。表11使用pSB或pLC載體將隨機植物基因組片段導(dǎo)入稻的結(jié)果基因組供體植物載體通過農(nóng)桿菌進行導(dǎo)入的基因組片段數(shù)(A)再生了潮霉素抗性個B/A(%)體的基因組片段數(shù)(B)普通野生稻pSB2002246132759.1普通野生稻pLC40GWH2271216695.4蘇丹草pSB200PcHmG1997125262.7WH蘇丹草pLC40GWH1760152486.6粟pSB200PcHmG1940120061.9WH粟pLC40GWH2285198686.9百喜草pLCleo181688.9扭稻C039pCLD045411566441.0擬南芥pCLD0454118910153.42)大片段導(dǎo)入的確認i)片段的兩端外側(cè)的PCR使用上述方法從11個轉(zhuǎn)化體個體和雪光的嫩葉中提取基因組DNA。使用下表的2組引物對這些DNA進行PCR。pSB200-9531F、pSB200-4R是擴增RB~基因組DNA片段之間的139bp的區(qū)域的引物。HPTinRV、HPTinFW是擴增潮霉素抗性基因的內(nèi)部的引物(表12)。PCR進行35循環(huán)。其結(jié)果是，相對于從對照的雪光中兩引物均得不到PCR產(chǎn)物，在轉(zhuǎn)化體方面，在HPTinRV、HPTinFW的情況下從所有11個體均擴增出產(chǎn)物。另外，在pSB200-9531F、pSB200-4R的情況下從11個體中的IO個體中得到了PCR產(chǎn)物。由此明確了，在用pLC載體轉(zhuǎn)化的大多數(shù)植物體中，導(dǎo)入了基因組DNA片段的兩端外側(cè)，可以確認基因組DNA片段的導(dǎo)入。[表12]表12名稱序列長度pSB200匿9531F5'-ctgaaggcgggaaacgacaatctg-3'24merpSB200-4R5'-gettgctga魄getcctteaacg-3'24merpSB200-170R5'-aactgcactteaaacaagtgtgac-3'24merHPTinRV5-tatgtcctgegggtaaatag-3'20merHPTinFW5'-ttgttggagccgaaatecg-3'19mer上起依.次為序列編號60-64ii)片段兩末端與內(nèi)部序列的PCR對于試驗使用pLC40GWH載體導(dǎo)入雪光的3種普通野生稻片段(稱為A、B、C)，將每種提供2個體TO植物，利用PCR分析是否導(dǎo)入了各片段的兩末端和中央部分。PCR條件是，在94。C處理2分鐘之后，將包括在94'C30秒鐘的熱變性、在60°C30秒鐘的退火、在60°C30秒鐘的延伸反應(yīng)的循環(huán)重復(fù)35次，最后在72。C處理2分鐘。為了檢測A片段的RB側(cè)，利用pSB200-9531F和對A片段特異性的引物(5，-gttaatttcttgtgatcgaaggac-3，(序列編號1l))來進行PCR(PCR1)。為了檢測A片段的中央部分，利用對應(yīng)于A片段的日本晴序列AP004667(通過數(shù)據(jù)庫檢索鑒定)與普通野生稻序列之間所發(fā)現(xiàn)的堿基序列多態(tài)性，通過CAPS法(Konieczny和Ausubel,1993年，PlantJournal,4巻403-410)進行PCR檢定。具體地說，利用2種引物(5，-gggattctttatgetgggtttagg-3，(序列編號12)和5，-gcaagcaatacctctgttatgctg-3，(序列編號13))進行PCR(PCR2),將產(chǎn)物用SspI消化。為了檢測HPT側(cè)，利用pSB200-170R與對A片段特異性的引物(5，-gttttcagatggcgacctcagctttg-3，(序列編號14))進行PCR(PCR3)。對于B片段和C片段，也進行同樣的標(biāo)記檢定。即，為了檢測B片段的RB側(cè)，通過pSB200-9531F和對B片段特異性的引物(5，-caggtggetttattcetcetctca-3，(序列編號15)進行PCR。為了檢測B片段的中夾部分，利用對應(yīng)于B片段的日本晴序列AP005967(通過數(shù)據(jù)庫檢索鑒定)與普通野生稻序列之間所發(fā)現(xiàn)的堿基序列多態(tài)性，通過CAPS法進行PCR檢定。具體地說，利用2種引物(5，-ccgaaagttcgtgggcaatgccta隱3'(序列編號16)和5，-gccatecttagcatatgagtggca-3，(序列編號17))進行PCR,將產(chǎn)物用HaeIII消化。為了檢測B片段的HPT側(cè)，利用pSB200-170R與對B片段特異性的引物(5，-ggctatttacgtggcatgttacgt-3，(序列編號18))進行PCR。另外，為了檢測C片段的RB側(cè)，利用pSB200-9531F與對C片段特異性的引物(5，-tcgtaagtctacttccctttacga-3，(序列編號19))進行PCR。為了檢測C片段的中央部分，利用對應(yīng)于C片段的日本晴序列AL713907(通過數(shù)據(jù)庫檢索鑒定)與普通野生稻序列之間所發(fā)現(xiàn)的堿基序列多態(tài)性，通過CAPS法進行PCR檢定。具體地說，利用2種引物(5，-ccaaaccacatecttatagtgtgc-3，(序列編號20)和5，-cctcattgcatgeggteaetac-3，(序列編號21))進行PCR,將產(chǎn)物用Hinfl消化。為了檢測C片段的HPT側(cè)，利用對pSB200-170R與C片段特異性的引物(5，-gcagggtattaategateaacacc-3，(序列編號22))進行PCR。將B片段的分析結(jié)果歸納于圖17,另外將A~C片段的分析結(jié)果歸納于表13。對于A片段在所研究的2個轉(zhuǎn)化體個體中，雖然沒有得到導(dǎo)入了整個大片段的轉(zhuǎn)化體，但是得到了檢測到導(dǎo)入了中央與一端、或兩端的個體。另一方面，對于B片段和C片段，所調(diào)查的2個體中的1個體顯示攜帶整個普通野生稻片段，即兩端部分和中央部分。從以上結(jié)果可以確認，利用pLC載體，可以將大小為25~40kb的植物基因組片段導(dǎo)入植物。[表13]表l3<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>+:檢出了普通野生稻片段-:未檢出普通野生稻片段實施例5:通過pLC40系列的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化玉米1)pLC與pTOK47、或pLC與pVGW的共存對于玉米的轉(zhuǎn)化，使用通常的二元載體，除了特殊方法(Frame等，2002年，PlantPhysiol,129巻:13-22)之外，轉(zhuǎn)化效率非常低，所以為了提高該效率需要含有vir基因的載體(Ishida等，1996年，NatBiotechnol，14巻745-750頁)。因為pLC40系列的粘粒載體是通常的二元載體，所以需要利用vir基因來提高轉(zhuǎn)化效率的技術(shù)。所以，首先使用了能與pLC40系列的粘粒載體(IncP質(zhì)粒)在細菌中共存并表達vir基因的載體pTOK47(Jin等，1987年，JBacteriol,169巻4417-4425頁)、以及本發(fā)明新構(gòu)建的pVGW。pTOK47是具有含有來自農(nóng)桿菌菌抹A281的virB基因和virG基因的DNA片段(KpnI14.8kb片段)、并能夠與IncP質(zhì)粒共存的IncW質(zhì)粒。另外，pVGW是具有變異型virG(virGN54D)并具有IncWori的質(zhì)粒。利用三菌抹接合法將pTOK47(四環(huán)素抗性)導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404或EHA105(由Purdue大學(xué)的StantonGelvin博士惠贈)中。從該農(nóng)桿菌提取質(zhì)粒，用限制性酶分析確認存在pTOK47。進而利用三菌抹接合法向制備成的LBA4404/pTOK47、或EHA105/pTOK47(Tc抗性)中導(dǎo)入pLC40:35S-IGUS、或pLC40GWB:35S-IGUS。將這些農(nóng)軒菌記為LBA4404/pTOK47/pLC40:35S-IGUS、LBA4404/pTOK47/pLC40GWB:35S-IGUS、EHA105/pTOK47/pLC40:35S-IGUS、EHA105/pTOK47/pLC40GWB:35S陽IGUS。從農(nóng)桿菌中提取質(zhì)粒DNA,利用PCR進行分析，確認存在VirG、RB、hpt或bar、GUS基因。同樣地，用電穿孔法將pVGW導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404,用慶大霉素(Gm50lug/mL)選擇菌落。利用三菌林接合法在制備成的LBA4404/pVGW中導(dǎo)入pLC40:35S-IGUS、或pLC40GWB:35S-IGUS。將這些農(nóng)桿菌記為LBA4404/pVGW/pLC40:35S-IGUS、LBA4404/pVGW/pLC40GWB:35S-IGUS、將農(nóng)桿菌菌落(Km與Gm抗性)直接用于PCR分析，確認存在VirG、hpt或bar、GUS基因。而且，將作為IncP質(zhì)粒的來自pBI121的pIG121Hm(Hiei等，1994年,PlantJ,6巻271-282頁)導(dǎo)入LB4404/pTOK47，制成LB4404/pTOK47/pIG121Hm,作為玉米轉(zhuǎn)化實驗的對照。2)玉米的轉(zhuǎn)化從溫室栽培的植物中無菌地取出大小約1.2mm的玉米未成熟胚(品種A188),浸漬到農(nóng)桿菌懸浮用液體培養(yǎng)基(LS-inf,Ishida等，1996)中。在46。C熱處理3分鐘后，用相同的液體培養(yǎng)基洗滌未成熟胚1次。接著在4。C以15000rpm進行離心處理IO分鐘，然后將未成熟胚在以約1x109cfWml懸浮了各菌抹的LS-inf培養(yǎng)基(含有乙酰丁香酮IOOM)中浸漬過之后，培植在共存培養(yǎng)基(LS-AS(Ishida等，1996年，NatBiotechnol,14巻:745-750頁)中添力。AgN03、CuS04)中。在25。C、黑暗下培養(yǎng)3天后，對一部分未成熟胚進行GUS分析。將共存培養(yǎng)后的未成熟胚培植在含有潮霉素或草胺膦的選擇培養(yǎng)基(Ishida等，2003年，PlantBiotechnology,20巻:57-66頁)中進行培養(yǎng)。將增殖的愈傷組織切成小片，培植在含有潮霉素(Hm)或草胺膦(PPT)的再分化培養(yǎng)基(Ishida等,1996年，NatBiotechnol，14巻:745-750頁)中,在照明下培養(yǎng)。2周之后，調(diào)查顯示Hm或PPT抗性的再分化植物。首先，將各種菌抹接種到A188未成熟胚中，在共存培養(yǎng)的第3天觀察GUS基因的瞬時表達。在對照的接種了LBA4404/pSB134的未成熟胚中在廣泛的范圍發(fā)現(xiàn)了GUS基因的表達，與此相對，在接種了LBA4404/pLC40:35S-IGUS的未成熟胚中絕大多數(shù)不顯示表達，僅發(fā)現(xiàn)很少的呈現(xiàn)極小的點狀表達的未成熟胚。在宿主為EHA105的情況下也沒有發(fā)現(xiàn)表達增加。采用LBA4404/pTOK47/pLC40:35S-IGUS、LBA4404/pLC40GWHvGl:35S-IGUS、LBA4404/pVGW/pLC40:35S-IGUS、LBA4404/pVGW/pLC40GWB:35S-IGUS，雖然相對LBA4404/pSB134較差，但在絕大多數(shù)未成熟胚中觀察到顯示GUS基因的表達的點，確認了共存含有來自農(nóng)桿菌菌株A281的virB基因和virG基因的質(zhì)粒、或共存含有virGN54D的質(zhì)粒、或者添加virG基因，能夠提高基因?qū)胄省Ａ硗?，在pLC40GWHvGl:35S-IGUS和pLC40GWHvGC1:35S-IGUS中，GUS基因的表達沒有差異，明確了用于除去NspV識別位點的1個堿基取代不影響virG活性。接著，將共存培養(yǎng)后的未成熟胚用含有Hm或PPT的選擇培養(yǎng)基、再分化培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，來制作轉(zhuǎn)化植物。在以EHA105為宿主的情況下，用pLCSBGWBSW載體完全得不到PPT抗性植物。但是在以LBA4404為宿主的情況下，pLCSBGWBSW載體得到對PTT顯示抗性的植物，其效率與以同菌抹為宿主的超二元載體pSB131(T-DNA區(qū)域配置了GUS基因和bar基因，Ishida等,1996年,NatBiotechnol，14巻:745-750頁)等同(表14)。另一方面，明確了使用LBA4404/pTOK47/pLC40GWB:35S-IGUS,也與超二元載體pSB131同樣地以高效率得到PPT抗性植物。另外，即使在選擇標(biāo)記基因為潮霉素抗性基因的情況下，也用與pTOK47共存的pLC40系列的粘粒載體(pLC40:35S-IGUS)得到了潮霉素抗性植物(表13)。另夕卜，使用重組了virG基因的pLC40GWHvGl，也可以得到與超二元載體pSB134(在T-DNA區(qū)域配置了GUS基因和潮霉素抗性基因，Hiei和Komari，2006年，PlantCell,TissueandOrganCulture，85巻271-283頁)相同水平的效率(表14)。[表14]表14玉米轉(zhuǎn)化結(jié)果未成熟胚數(shù)再分化率實驗菌抹選擇接種(A)再分化(B)(B/A,%)1LBA4404(pLCSBGWBSW)PPT461021.7EHA105(pIXSBGWBSW)PPT4600LBA4404(pSB131)PPT45920.02LBA4404(pLC40GWB:35S-IGUS)PPT5600LBA4404(pLC40GWB:35S-lGUSPPT571424.6/pTOK47)LBA4404(pSB131)PPT591932.23LBA4404(pLC40:35S-IGUS)Hm4300LBA4404(pLC40:35S-IGUS/pTOK47)Hm4424.5LBA柳4(pIG12Hm)Hm4200LBA4404(pIG121Hm/pTOK47)Hm42004LBA4404(pLC40GWHvGl)Hm5958.5LBA4404(pSB134)Hm5758.8PPT:草胺膦、Hm:潮霉素接著，為了研究pVGW對玉米轉(zhuǎn)化的影響，用LBA4404/pLC40:35S-IGUS、LBA4404/pVGW/pLC40:35S陽IGUS、LBA4404/pVGW/pLC40G職:35S-IGUS、LBA4404/pSB134轉(zhuǎn)化玉米，分析再分化個體的GUS表達。其結(jié)果是，用pLC40:35S-IGUS的情況下GUS表達個體數(shù)為0%(0/16),相反在用共存了pVGW的pLC40:35S-IGUS、共存了pVGW的pLC40GWB:35S陽IGUS的情況下，每個接種的未成熟胚平均的GUS表達個體數(shù)的比率分別達到40%(6/15)、30%(6/20)，與超二元載體pSB134的41.2%(7/17)為相同水平。即，通過使用pVGW,可以通過pLC載體實現(xiàn)高效率玉米轉(zhuǎn)化。而且，通過使pLC載體與pVGW載體共存，將植物基因組片段轉(zhuǎn)化到玉米中。在載體pLC40GWB的NspV位點隨機克隆蘇丹草的基因組片段(30-35kb)。通過三菌系接合使所得大腸桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到具有pVGW的農(nóng)桿菌(LBA4404)中。這樣，制成了具有重組了蘇丹草的基因組片段的pLC40GWB與pVGW兩種質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，接種到玉米未成熟胚(品種A188)中。進行轉(zhuǎn)化細胞的選擇，結(jié)果接種的27個片段中的17個片段得到了再分化植物(表15)。由此顯示了，通過使pLC與pVGW共存，可以有效地將植物基因組片段轉(zhuǎn)化到玉米中。以上結(jié)果顯示，通過使例如pTOK47那樣的、含有具有來自農(nóng)桿菌菌抹A281的virB基因和virG基因的DNA片段的質(zhì)粒共存，或者通過使例如pVGW那樣的含有virGN54D基因的質(zhì)粒共存，或者通過將例如pLC40GWHvGl那樣的virG基因重組到pLC載體中，可以有效地進行玉米的轉(zhuǎn)化。表l5使用pLC/pVGW栽體系統(tǒng)將隨機植物基因組片段導(dǎo)入玉米的結(jié)果基因組供體植物菌林通過農(nóng)桿菌進行導(dǎo)入的基再生了PPT抗性個體的B/A(%)因組片段數(shù)(A)基因組片段數(shù)(B)蘇丹草LBA4404(pLC40GWB/pVGW)271763.0實施例6:使用pLC載體從BAC克隆分離目的基因Komori等(2004年)(PlantJ，37巻315-325頁)發(fā)現(xiàn)如果將從稻品種IR24分離的PPR791基因?qū)爰毎|(zhì)雄性不育系統(tǒng)則生育性恢復(fù)，證明了PPR791是生育性恢復(fù)基因Rf-l。PPR791基因與Kazama和Toriyama(2003)(FEBSLett，544巻99-102頁)以前報告為Rf-l候選的稻品種Milyang23的PPR8-1基因一致。所以，從克萊姆森大學(xué)獲得PPR8-1基因所來源的Milyang23的BAC克隆OSIMBb0046F08,進行從該BAC分離Rf-l的模型實驗。首先,<吏用HighPurityPlasmidMidiprepSystem(Marligen^A司),乂人OSIMBb0046F08提取質(zhì)粒。將該質(zhì)粒用Taql部分分解，利用蔗糖密度梯度超離心回收30kb左右的DNA片段。使用DNA連接試劑盒〈MightyMix〉(寶生物)，將該DNA片段與將pLC40GWH用BstBI消化并進行CIP處理的載體，或?qū)SB200用BstBI消化并進行CIP處理的載體連接。利用電轉(zhuǎn)化法將得到的構(gòu)建體導(dǎo)入大腸桿菌，在含有適當(dāng)?shù)目股?50嗎/ml卡那霉素或奇霉素)的LB平板上得到轉(zhuǎn)化體的菌落。接下來為了研究得到的質(zhì)粒中有無Rf-1基因，以這些菌落作為模板，使用對Rf-1基因所設(shè)計的《I物(WSF7T7R1和IR50226R,表16)進行直接PCR(參考實施例1、3)，將得到約2kb的擴增產(chǎn)物的克隆作為Rf-l陽性克隆，將未見該產(chǎn)物擴增的克隆作為陰性克隆來進行選擇。該PCR選擇中陽性克隆的出現(xiàn)率在pLC40GWH構(gòu)建體方面為5/39(12.8%)、在pSB200構(gòu)建體方面為6/96(6.3%)。即目的基因的克隆效率pLC載體與pSB相比較約為其2倍。從pLC40GWH構(gòu)建體中選擇1個陽性克隆，2個陰性克隆，另外，從pSB200構(gòu)建體中選擇1個陽性克隆，2個陰性克隆，利用三菌抹接合法從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中。利用Komori等(2004)所述的方法，使得到的農(nóng)桿菌感染作為細胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)的MS越光。將得到的轉(zhuǎn)化稻馴化后，在溫室進行栽培。在成熟期從各個個體采取標(biāo)準穗，調(diào)查結(jié)實率。其結(jié)果是，62來自不含Rf-l的構(gòu)建體(pLC-7、pLC-ll、pSB-l、pSB-7)的轉(zhuǎn)化體為不育,相反從包含Rf-l的構(gòu)建體pLC-8、pSB-37得到了結(jié)實個體(表17)。以上結(jié)果證實，通過使用植物轉(zhuǎn)化用粘粒載體從包含目的基因的BAC的DNA制成文庫，并導(dǎo)入植物，然后選擇顯示期待的表型的植物，從而可以有效地鑒定目的基因。[表16]表16<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>表17通過各構(gòu)建體的生育性恢復(fù)<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>綜上，作為pLC載體系的特征，可列舉1.可以容易地克隆25~40kb左右的DNA;2.在細菌中穩(wěn)定；而且，3.能夠以高效率轉(zhuǎn)化植物，特別是單子葉植物。pLC系載體在功能基因組學(xué)領(lǐng)域，作為處理中型DNA的載體是有用的。權(quán)利要求1.一種粘粒載體，其全長在15kb以內(nèi)，并且具有下述的特征含有1)IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點(oriV)，并且不含有其它種質(zhì)粒的復(fù)制起點；含有2)IncP質(zhì)粒的trfA1基因；含有3)IncP質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移起點(oriT)；含有4)IncP質(zhì)粒的incC1基因；含有5)λ噬菌體的cos位點，且該cos位點位于T-DNA的外側(cè)；含有6)在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌屬細菌中表達的抗藥性基因；含有7)農(nóng)桿菌屬細菌的T-DNA的右邊界序列；含有8)農(nóng)桿菌屬細菌的T-DNA的左邊界序列；含有9)植物轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記基因，該基因配置在7)與8)之間，并且在植物中表達；而且，含有10)用于克隆外源基因的限制性酶識別位點，該位點配置在7)與8)之間。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粘粒載體，其中植物轉(zhuǎn)化用選擇標(biāo)記基因選自由潮霉素抗性基因、草胺膦抗性基因和卡那霉素抗性基因構(gòu)成的組。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的粘粒載體，其含有IncP質(zhì)粒的korB基因。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任1項所述的粘粒載體，其選自以下的組由序列編號2的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40或其同等物；由序列編號3的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWH或其同等物；由序列編號4的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40bar或其同等物；由序列編號5的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWB或其同等物；由序列編號65的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWHKorB或其同等物；由序列編號66的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLCleo或其同等物；以及由序列編號7的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWHvGl或其同等物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的粘粒載體，其選自以下的組由序列編號2的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40;由序列編號3的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWH;由序列編號4的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40bar;由序列編號5的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWB;由序列編號65的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWHKorB;由序列編號66的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLCleo;以及由序列編號7的堿基序列構(gòu)成的粘粒載體pLC40GWHvGl。6.—種植物轉(zhuǎn)化方法，其包括使用下述農(nóng)桿菌屬細菌轉(zhuǎn)化植物，所述農(nóng)桿菌屬細菌含有在權(quán)利要求1~5的任1項所述的粘粒載體中導(dǎo)入植物的核酸片段而成的表達載體。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化方法，其中所導(dǎo)入的核酸片段的大小為25~40kb。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的轉(zhuǎn)化方法，其中，在植物的轉(zhuǎn)化中使用含有以下要素的農(nóng)桿菌屬細菌la)在將植物的核酸片段導(dǎo)入權(quán)利要求1~5的任1項所述的粘粒載體中而成的載體中、進一步導(dǎo)入農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因而成的載體，或者，lb)在權(quán)利要求1~5的任1項所述的粘粒載體中導(dǎo)入了植物的核酸片段而成的載體，和，含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因、并且能夠在農(nóng)桿菌屬細菌的細胞中與IncP質(zhì)粒共存的質(zhì)粒；以及，2)農(nóng)桿菌屬細菌的Ti質(zhì)?；蛘逺i質(zhì)粒。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化方法，其中l(wèi)a)或lb)的農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因是virGN54D。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化方法，其中l(wèi)b)的含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因的質(zhì)粒含有IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的轉(zhuǎn)化方法，其中l(wèi)b)的含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因的質(zhì)粒是具有圖14所示結(jié)構(gòu)的pVGW,或者具有圖15所示結(jié)構(gòu)的pVGW2。12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化方法，其中l(wèi)b)的含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因的質(zhì)粒還含有農(nóng)桿菌屬細菌的virB基因。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)化方法，其中l(wèi)b)的含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因的質(zhì)粒含有IncW質(zhì)粒的復(fù)制起點。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)化方法，其中l(wèi)b)的含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因的質(zhì)粒是pTOK47。15.—種定位克隆方法，該方法包括下述工序1)用限制性酶將含有與植物的表型相關(guān)的候選基因的BAC克隆部分分解或完全分解；2)使用粘粒載體，將工序l)所得DNA片段亞克隆化，從而構(gòu)建文庫；然后，3)將構(gòu)成文庫的克隆分別導(dǎo)入植物，評價轉(zhuǎn)化植物的表型。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的定位克隆方法，其中，工序l)所得DNA片段的大小為25-40kb。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的定位克隆方法，其中，2)的粘粒載體是權(quán)利要求1~5的任1項所述的粘粒載體。18.—種質(zhì)粒載體，其具有下述的特征1)含有IncW質(zhì)粒復(fù)制所必要的因子，并且不含有其它質(zhì)粒的復(fù)制起點；2)含有IncW質(zhì)粒復(fù)制所必要的repA基因；3)含有在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌屬細菌中表達的抗藥性基因；而且，4)含有農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的質(zhì)粒載體，其全長為10kb以內(nèi)。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的質(zhì)粒載體，其中，農(nóng)桿菌屬細菌的virG基因是virGN54D。21.根據(jù)權(quán)利要求1820的任1項所述的質(zhì)粒載體，其選自以下的組由序列編號8所記載的堿基序列構(gòu)成的質(zhì)粒載體pVGW或其同等物；以及，由序列編號67所記載的堿基序列構(gòu)成的質(zhì)粒載體pVGW2或其同等物。22.質(zhì)粒載體pVGW,其由序列編號8所記載的堿基序列構(gòu)成。23.質(zhì)粒載體pVGW2，其由序列編號67所記載的堿基序列構(gòu)成。24.—種植物轉(zhuǎn)化方法，其包括使用下述農(nóng)桿菌屬細菌轉(zhuǎn)化植物，所述農(nóng)桿菌屬細菌含有權(quán)利要求18-23的任1項所述的質(zhì)粒載體。全文摘要本發(fā)明的目的是提供一種植物轉(zhuǎn)化用新型載體。本發(fā)明的載體是具有下述特征的全長15kb以內(nèi)的粘粒載體含有1)IncP質(zhì)粒的復(fù)制起點，不含有其它種質(zhì)粒的復(fù)制起點；含有2)IncP質(zhì)粒的trfA1基因；含有3)IncP質(zhì)粒的oriT；含有4)IncP質(zhì)粒的incC1基因；含有5)λ噬菌體的cos位點，且該cos位點位于T-DNA的外側(cè)；含有6)在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌屬細菌中表達的抗藥性基因；含有7)農(nóng)桿菌屬細菌的T-DNA右邊界序列；含有8)農(nóng)桿菌屬細菌的T-DNA左邊界序列；含有9)植物轉(zhuǎn)化用篩選標(biāo)記基因，該基因配置在7)與8)之間，在植物中表達；而且，含有10)用于克隆外源基因的限制性酶識別位點，該位點配置在7)與8)之間。文檔編號C12N15/82GK101484580SQ200780023589公開日2009年7月15日申請日期2007年6月25日優(yōu)先權(quán)日2006年6月23日發(fā)明者今山輝之,小森俊之,小鞠敏彥,峰利喜,樋江井佑弘,石田佑二,高倉由光申請人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社