專利名稱：含有源自身體的多個(gè)細(xì)胞種類的、能形成原始的器官樣的細(xì)胞塊的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有源自身體的多個(gè)細(xì)胞種類的、能形成原始的器官樣的 細(xì)胞塊的制造方法，以及通過該方法制造的細(xì)胞塊。
背景技術(shù)：
由于近年來醫(yī)學(xué)的驚人進(jìn)步，通過除去病因，例如，癌癥的外科切除 等對(duì)癥療法的治療技術(shù)、或組織.臟器的生物體移植技術(shù)等，挽救人生命的
機(jī)會(huì)越來越高。但是，有時(shí)伴隨患部切除，患者被治療后的QOL大幅降 低所困擾。另外，依賴生物體移植的治療也存在移植供體不足、排斥反應(yīng) 等局限性。如果可以使由于外科治療或意外事故而失去的組織、器官、臟 器等再生，那么就可以大幅改善患者的QOL。另外，再生醫(yī)療還可以謀求 消除生物體移植所存在的問題。從該觀點(diǎn)出發(fā)，對(duì)再生醫(yī)療的期待度較高。
在再生醫(yī)療中獲得成功的技術(shù)，主要以人工皮膚、人工骨骼、人工牙 齒等從形態(tài)方面和功能方面來看比較簡(jiǎn)單的組織為中心。重構(gòu)成的人工皮 膚、人工骨骼有時(shí)已經(jīng)可以被細(xì)胞吸收，為組織構(gòu)建提供必要的信號(hào)。但 是，再生醫(yī)療技術(shù)所產(chǎn)生的人工皮膚.人工骨骼的分化的所有組成成分有 限。例如同種角質(zhì)形成細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞等，有時(shí)分化成作為表皮的 結(jié)構(gòu)物，被周圍的器官編入，及至具有有屏障性質(zhì)的角質(zhì)層、基底膜，但 是被指出不會(huì)派生毛嚢、脂肪腺和汗腺等二次衍生物。
生物體組織通常是具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞與具有體細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞共 存，通過兩者的相互作用而成立，所述具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞在自我復(fù)制 的同時(shí)，通過向分化的細(xì)胞傳導(dǎo)信號(hào)等來供給分化的細(xì)胞，從而維持組織 的穩(wěn)態(tài)，所述具有體細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞是接收來自所述具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)
4胞的各種信號(hào)等來接收指令的、已經(jīng)完成分化狀態(tài)的細(xì)胞。例如，在脊推 動(dòng)物的情況下，在大部分組織和器官形成中，間充質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞之間 的相互作用是必須的。在毛嚢的情況下，作為間充質(zhì)細(xì)胞的毛乳頭細(xì)胞承 擔(dān)干細(xì)胞的性質(zhì)，作為上皮細(xì)胞的角質(zhì)形成細(xì)胞在分化成毛千(毛質(zhì)本身) 的意義上，相當(dāng)于具有體細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞。
再生醫(yī)療所產(chǎn)生的器官形成時(shí)的難度在于，^泉在實(shí)際的生物體組織內(nèi)
的狀態(tài)。在現(xiàn)有技術(shù)中，即使將上皮細(xì)胞與間充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，也只能是 共同完成分化，或者共同保持未分化狀態(tài)中的一種，不會(huì)重現(xiàn)像才莫仿生物 體組織那樣未分化狀態(tài)與分化狀態(tài)的細(xì)胞共存。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題是，通過將多種分化的身體細(xì)胞進(jìn)行組合、培養(yǎng)，提供 可以形成原始的器官樣的細(xì)胞塊。 本申請(qǐng)包含以下發(fā)明。
(1) 含有源自身體的多個(gè)身體細(xì)胞種類的、能形成原始的器官樣的細(xì) 胞塊的制造方法，該方法包括，
準(zhǔn)備所述多種的含有身體細(xì)胞的培養(yǎng)液，
將所述多種身體細(xì)胞培養(yǎng)液混合，然后向該混合細(xì)胞培養(yǎng)液中添加
Wnt信號(hào)激活劑，
將所述含有Wnt信號(hào)激活劑的培養(yǎng)液進(jìn)行規(guī)定時(shí)間的非平面接觸性 培養(yǎng)，
將所述經(jīng)非平面接觸性培養(yǎng)的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基更換成不含有Wnt信 號(hào)激活劑的培養(yǎng)基，進(jìn)一步培養(yǎng)少見定時(shí)間，這里所述多種身體細(xì)胞中的至 少l種保持未分化狀態(tài)。
(2) 根據(jù)(1)所述的方法，所述多種身體細(xì)胞包含上皮系身體細(xì)胞和間充 質(zhì)系身體細(xì)胞的組合，該間充質(zhì)系身體細(xì)胞保持著未分化狀態(tài)。
(3) 根據(jù)(2)所述的方法，所述上皮系身體細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞，所述間充質(zhì)系身體細(xì)胞是毛乳頭細(xì)胞。
(4) 根據(jù)(3)所述的方法，從所述細(xì)胞塊形成具有毛嚢誘導(dǎo)功能的毛嚢。
(5) 根據(jù)(1) ~ (4)的任一項(xiàng)所述的方法，所述Wnt信號(hào)激活劑是6-溴靛 玉紅-3，-將(6-bromoindirubin-3'-oxime， BIO)。
(6) 根據(jù)(1) ~ (5)的任一項(xiàng)所述的方法，所述非平面接觸性培養(yǎng)方法是懸 滴方法。
(7) 含有源自身體的多個(gè)身體細(xì)胞種類的、能形成原始的器官樣的細(xì) 胞塊，該細(xì)胞塊是通過下述方法制造的，所述方法包括，
準(zhǔn)備所述多種的含有身體細(xì)胞的培養(yǎng)液，
將所述多種身體細(xì)胞培養(yǎng)液混合，然后向該混合細(xì)胞培養(yǎng)液中添加 Wnt信號(hào)激活劑，
將所述含有Wnt信號(hào)激活劑的培養(yǎng)液進(jìn)行規(guī)定時(shí)間的非平面接觸性 培養(yǎng)，
將所述經(jīng)非平面接觸性培養(yǎng)的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基更換成不含有Wnt信 號(hào)激活劑的培養(yǎng)基，進(jìn)一步培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間，這里所述多種身體細(xì)胞中的至 少l種保持未分化狀態(tài)。
(8) 根據(jù)(7)所述的細(xì)胞塊，所述多種身體細(xì)胞包含上皮系身體細(xì)胞和間 充質(zhì)系身體細(xì)胞的組合，該間充質(zhì)系身體細(xì)胞保持著未分化狀態(tài)。
(9) 根據(jù)(8)所述的細(xì)胞塊，所述上皮系身體細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞，所述 間充質(zhì)系身體細(xì)胞是毛乳頭細(xì)胞。
(10) 根據(jù)(9)所述的細(xì)胞塊，從所述細(xì)胞塊形成具有毛囊誘導(dǎo)功能的毛嚢。
(11) 根據(jù)(7) ~ (10)的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞塊，所述Wnt信號(hào)激活劑是6-溴靛玉紅-3，-肟(BI0)。
(12) 才艮據(jù)(7) ~ (ll)的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞塊，所述非平面接觸性培養(yǎng)方法 是懸滴方法。
(13) 篩選具有育毛效果的藥劑的方法，通過對(duì)(9) ~ (12)的任一項(xiàng)所述的 細(xì)胞塊應(yīng)用候選藥劑來進(jìn)行。(14)才艮據(jù)(13)所述的方法，將選自所述細(xì)胞塊的c-myc、 BMP4和 IGFBP3的1個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)量作為指標(biāo)。


圖l是通過本發(fā)明的方法制成的細(xì)胞塊的免疫染色圖(l)，顯示DP細(xì) 胞和NHEK細(xì)胞的染色。
圖2是通過本發(fā)明的方法制成的細(xì)胞塊的免疫染色圖(2)，顯示細(xì)胞塊 中毛乳頭細(xì)胞的定位。
圖3是通過本發(fā)明的方法制成的細(xì)胞塊的免疫染色圖(3)，顯示細(xì)胞塊 中的細(xì)胞增殖。
圖4是通過本發(fā)明的方法制成的細(xì)胞塊的免疫染色圖(4),顯示p-聯(lián)蛋
白(p-catenin)和NHEK細(xì)胞的染色。
圖5是通過本發(fā)明的方法制成的細(xì)胞塊的免疫染色圖(5)，顯示細(xì)胞塊
中的發(fā)角蛋白表達(dá)。
圖6是通過本發(fā)明的方法制成的細(xì)胞塊的免疫染色圖(6)，顯示細(xì)胞塊
中的毛芽標(biāo)志物表達(dá)。
圖7是來自本發(fā)明的細(xì)胞塊的RNA中各種基因的表達(dá)(l)。 圖8是來自本發(fā)明的細(xì)胞塊的RNA中Wnt3A基因的表達(dá)。 圖9是來自本發(fā)明的細(xì)胞塊的RNA中WntlOB基因的表達(dá)。 圖IO是來自本發(fā)明的細(xì)胞塊的RNA中各種基因的表達(dá)(2)。
具體實(shí)施例方式
通過本發(fā)明，可以提供含有多種身體細(xì)胞種類的、能形成原始的器官 樣的細(xì)胞塊。
本發(fā)明中所謂身體細(xì)胞，是指完成了向構(gòu)成生物體的各種器官的細(xì)胞 分化的細(xì)胞，即與未分化狀態(tài)的干細(xì)胞相反的細(xì)胞。在本發(fā)明中，其特征 在于使用2種以上的身體細(xì)胞，優(yōu)選可以是上皮細(xì)胞系與間充質(zhì)細(xì)胞的組 合、內(nèi)皮細(xì)胞與間充質(zhì)細(xì)胞的組合、或者上皮細(xì)胞與間充質(zhì)細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)
7胞的組合等各種組合。
作為可以由本發(fā)明所涉及的細(xì)胞塊形成的器官，并無特別限制，但可 以列舉例如，毛嚢、肺、腎臟、肝臟、胰臟、脾臟、心臟、膽嚢、小腸、 結(jié)腸、大腸、關(guān)節(jié)、骨骼、牙齒、血管、淋巴管、角膜、軟骨、嗅覺器官、 聽覺器官等各種器官。
例如，在希望形成毛嚢時(shí)，例如可以使用源自頭部的角質(zhì)化表皮細(xì)胞 作為上皮細(xì)胞系，使用毛乳頭細(xì)胞作為間充質(zhì)細(xì)胞。這里所謂"上皮細(xì)胞" 是構(gòu)成皮膚的表皮或上皮的大部分的細(xì)胞，是指由與真皮連接的1層基底 細(xì)胞生成的細(xì)胞。作為上皮細(xì)胞，既可以是源自新生兒(或胎兒)的上皮細(xì) 胞、源自成熟的皮膚例如休止期毛的表皮或生長(zhǎng)期毛的表皮的細(xì)胞，又可 以是處于角質(zhì)形成細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞的培養(yǎng)物?？捎玫募?xì)胞可以通過該領(lǐng)域 專業(yè)人員周知的方法從所要求的供體動(dòng)物的皮膚來調(diào)制。所謂"毛乳頭細(xì)
胞"，是指作為間充質(zhì)細(xì)胞而位于毛嚢最底部，為了毛嚢的自我再生而向毛 嚢上皮干細(xì)胞傳導(dǎo)激活信號(hào)，承擔(dān)所謂指揮塔臺(tái)功能的細(xì)胞。例如可以通
制細(xì)胞懸浮液，接著通過將該細(xì)胞懸浮液冷凍保存來殺死毛嚢上皮細(xì)胞， 從而調(diào)制"毛乳頭細(xì)胞"。
另外，例如，對(duì)于嗅覺器官的重構(gòu)建可以如下那樣來進(jìn)行調(diào)制。取出 哺乳動(dòng)物、例如小鼠的嗅覺上皮細(xì)胞群的存在組織部位。通過膠原酶處理 消化組織，經(jīng)離心分離、調(diào)制沉淀的細(xì)胞群。接著將細(xì)胞懸浮液注入用膠
原1或4被覆的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，為了使附著性優(yōu)異的嗅覺上皮細(xì)胞優(yōu)先附 著而在5分鐘左右迅速吸取懸浮液。殘留在該培養(yǎng)皿中的上皮細(xì)胞可以轉(zhuǎn) 移至細(xì)胞培養(yǎng)。進(jìn)而殘留的細(xì)胞中的大部分是上皮細(xì)胞。吸出后殘余的懸 浮液中存在間充質(zhì)細(xì)胞，但通過將懸浮液注入用纖連蛋白或明膠神皮覆的培 養(yǎng)皿中，在適當(dāng)?shù)臍夥障?，例如?7。C、 95%<:02下靜置4小時(shí)以上，可 以將間充質(zhì)細(xì)胞供給細(xì)胞培養(yǎng)。如上所調(diào)制的上皮和間充質(zhì)細(xì)胞可以通過 與毛嚢器官的重構(gòu)建同樣的方法供給新的嗅覺器官構(gòu)建。
進(jìn)而，例如對(duì)于腎小球的重構(gòu)建，可以如下那樣進(jìn)行調(diào)制。取出哺乳動(dòng)物、例如小鼠的腎臟的存在組織部位。通過膠原酶處理消化組織并離心
分離，用100nm網(wǎng)除去粗大物。接著用40jim網(wǎng)將腎小球收集在網(wǎng)中，用 胰蛋白酶處理制成細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞懸浮液注入用膠原1或4 ^皮覆的細(xì) 胞培養(yǎng)JQL中，使上皮細(xì)胞優(yōu)先附著。通過該處理，本細(xì)胞的大部分為源自 腎小球的上皮細(xì)胞。
另一方面，在腎臟中，發(fā)育時(shí)存在的間充質(zhì)細(xì)胞在生物體中消亡了。 所以在本發(fā)明中，為了再次誘導(dǎo)組織重構(gòu)建所必要的上皮間充質(zhì)相互作用， 可以采用如下的方法。上皮細(xì)胞使用上述的源自腎臟的細(xì)胞。進(jìn)而使用同 屬的毛乳頭細(xì)胞或源自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞作為失去的間充質(zhì)細(xì)胞的代替 細(xì)胞。如上的上皮和間充質(zhì)細(xì)胞可以通過與毛囊器官的重構(gòu)建同樣的方法 來供給新的腎臟器官構(gòu)建。
對(duì)本發(fā)明所涉及的細(xì)胞的起源，根據(jù)其目的可以將各種哺乳動(dòng)物作為 起源，沒有限制，源自人，黑猩猩，其它靈長(zhǎng)類，家畜動(dòng)物例如狗、貓， 畜產(chǎn)動(dòng)物例如牛、豬、馬、綿羊、山羊，實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物例如兔、大鼠、小鼠、 豚鼠，更優(yōu)選棵小鼠、SCID小鼠、棵大鼠等。另外，其組合既可以是同 種系也可以是異種系，但優(yōu)選同種系。
對(duì)本發(fā)明所涉及的身體細(xì)胞培養(yǎng)有效的培養(yǎng)液并不特別限制，可以使 用在細(xì)胞培養(yǎng)中慣用的培養(yǎng)液。例如，對(duì)于間充質(zhì)細(xì)胞，可以優(yōu)選使用 DMEM、 MEM、 F12、張氏培養(yǎng)基(Chang medium)等含有血清型的培養(yǎng) 基。這時(shí)，血清濃度為0~ 300/Q,優(yōu)選為100/。，作為必不可少的因子，添 加bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)和EGF(表皮生長(zhǎng)因子)、2mM L-谷氨 酰胺。
在上皮細(xì)胞的情況下，優(yōu)選Epilife(注冊(cè)商標(biāo))、HuMedia(注冊(cè)商標(biāo))(都 為夕，求々社制造)、Iiwitrogen SFM(Invitrogen公司)等無血清型的對(duì)角 質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行了最適化的培養(yǎng)基。角質(zhì)形成細(xì)胞根據(jù)情況可以用Green 法(Cell， 1975年11月，6巻(3): 331-343頁，Serial cultivation of strain of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Rheinwalf J. G.， Green H.)來調(diào)制，但這時(shí)其培養(yǎng)可以使用上述間充質(zhì)細(xì)胞所使用的含有血清型的培養(yǎng)基。此外，作為可以在上皮
細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)中通用的抗生素，可以列舉青霉素G、卡那霉素、 鏈霉素、兩性霉素B。
在本發(fā)明中，其特征在于，在上述多種身體細(xì)胞的混合物中添加Wnt 信號(hào)激活劑，進(jìn)行培養(yǎng)。作為Wiit信號(hào)，是指促進(jìn)p-聯(lián)蛋白核轉(zhuǎn)運(yùn)、發(fā)揮 作為轉(zhuǎn)錄因子的功能的一系列作用。本信號(hào)源于細(xì)胞間相互作用，包括例 如，從某細(xì)胞分泌的稱為Wnt3A的蛋白質(zhì)進(jìn)而作用于其它細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi) 的P-聯(lián)蛋白進(jìn)行核轉(zhuǎn)運(yùn)，作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的一系列流程。 一系列流 程引起以上皮間充質(zhì)相互作用為例的器官構(gòu)建的最初現(xiàn)象。人們知道Wnt 信號(hào)通過激活P-聯(lián)蛋白途徑、PCP途徑、Ca^途徑三個(gè)途徑，來控制細(xì)胞 的增殖和合化、器官形成和早期發(fā)育時(shí)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等各種細(xì)胞功能。由于 Wnt信號(hào)所具有的維持該未分化狀態(tài)的功能，可以為了抑制分化而在培養(yǎng) ES細(xì)胞時(shí)使用(例如，NoburoSato等，Nature Medicine, IO巻第I期， 2004年1月)，但是對(duì)于在身體細(xì)胞培養(yǎng)中其使用和效果完全不清楚。
作為Wnt信號(hào)激活劑，并不特別限制，只要顯示糖原合成酶激酶3 (GSK-3)的抑制活性即可，可以是任何物質(zhì)，可以列舉例如，雙巧l咮(靛玉 紅)化合物(BIO)((2，Z,3，E)-6-溴靛玉紅-3，-將)、其丙酮將類似物BIO-丙酮將 ((2，Z，3，E)-6-溴靛玉紅-3，-丙酮肟)、噻二唑烷(TDZD)類似物(4-節(jié)基-2-甲基 -1,2，4-噻二唑烷-3，5-二酮)、氧代噻二唑烷-3-硫酮類似物(2，4-二節(jié)基-5-氧代 噻二唑烷-3-硫酮)、噻吩基-01-氯甲基酮化合物(2-氯-1-(4，4-二溴噻吩-2-基)-乙酮)、苯基-a-溴甲基酮化合物(a-4-二溴苯乙酮)、含有噻唑的脲化合物 (N-(4-甲氧基千基)-N，-(5-硝基-l，3-噻唑-2-基)脲)，以及GSK-鄧肽抑制劑例 如HKEAPPAPPQSpP-NH2，等等。
對(duì)Wnt信號(hào)激活劑的添加量并不特別限制，只要其量能夠?qū)崿F(xiàn)激活 Wnt信號(hào)、換而言之實(shí)現(xiàn)抑制GSK-3,且不停止細(xì)胞增殖即可，依據(jù)所使 用藥劑的種類和應(yīng)該增殖的細(xì)胞的種類，由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)決定。例 如，在毛乳頭細(xì)胞中^f吏用BIO作為Wnt信號(hào)激活劑時(shí)，其量例如0.1jiM 10jiM左右為適量，但當(dāng)然不限于這樣的量。本發(fā)明的另 一特征是將在上述多種身體細(xì)胞的混合物中添加了 Wnt 信號(hào)激活劑的混合物進(jìn)行非平面接觸性培養(yǎng)。所謂非平面接觸性培養(yǎng)是在 具有球面的界面上培養(yǎng)細(xì)胞使得平面附著性細(xì)胞不附著的方法。作為非平 面接觸性培養(yǎng)方法的例子，有懸滴法(Kdler G. M.等，Curr. Opin. Cell Biol., 7巻，862-869頁，1995年)。所謂懸滴法是下述的方法將含有培 養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液的液滴(一般為25 ~ 3^L左右)點(diǎn)在培養(yǎng)皿蓋的頂部?jī)?nèi)側(cè)， 小心合上蓋使得培養(yǎng)液不要落下或流下，通過表面張力以倒置的液滴的狀 態(tài)來培養(yǎng)培養(yǎng)液內(nèi)的細(xì)胞。通過這樣培養(yǎng)，可以使細(xì)胞在平面培養(yǎng)等情況 下由于與平面接觸而受到的影響為最小限。作為其它非平面接觸性培養(yǎng)方 法的例子，有使用預(yù)先進(jìn)行了表面加工使得細(xì)胞不能附著的半球狀細(xì)胞培 養(yǎng)皿(例如住友X—夕，xf卜所銷售的"7:7工口< K")的形成方法(球狀體 形成方法)，通過在硝酸纖維素培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)以浮游狀態(tài)使細(xì)胞凝集的浮游 方法，等等。
用于非平面接觸性培養(yǎng)的溫度、時(shí)間可以依據(jù)所處理細(xì)胞的種類、傳 代次數(shù)而變化，例如在37T:進(jìn)行1 ~ 10天，優(yōu)選進(jìn)行3 ~ 7天，如果必要 用同樣的培養(yǎng)基進(jìn)行適當(dāng)更換。
最后通過將上述培養(yǎng)基換成不含有Wnt信號(hào)激活劑的培養(yǎng)液，從而將 細(xì)胞在不存在Wnt信號(hào)的狀態(tài)下進(jìn)一步進(jìn)行非平面接觸性培養(yǎng)。這時(shí)培養(yǎng) 時(shí)間和溫度也可以依據(jù)所處理細(xì)胞的種類、傳代次數(shù)而變化，例如在37。C 進(jìn)行1 ~ 10天，優(yōu)選進(jìn)行3 ~ 7天，如果必要用同樣的培養(yǎng)基進(jìn)行適當(dāng)更換。
根據(jù)本發(fā)明，可以效率良好地人工制成對(duì)例如毛嚢移植、各臟器移植、 以及不完成完全的臟器但構(gòu)成臟器的微小器官的部分移植等有用的細(xì)胞 塊，所述微小器官例如，角膜、腎小球、嗅覺上皮組織、軟骨部位。另夕卜， 人工制成的細(xì)胞塊通過供給藥劑評(píng)價(jià)，可以更正確地評(píng)價(jià)藥劑對(duì)生物體內(nèi) 器官的作用。另外，通過在像棵小鼠、SCID小鼠那樣的免疫缺陷動(dòng)物中 移植細(xì)胞塊，可以制成完成度更高的器官樣組織，例如通過異位地制成人 毛囊、小鼠腎等，可以制成能夠進(jìn)行新型藥劑評(píng)價(jià)和基因功能評(píng)價(jià)的模型 動(dòng)物。特別是在制成細(xì)胞塊時(shí)通過對(duì)細(xì)胞實(shí)施基因?qū)牖蚋淖儯梢院?jiǎn)便
ii地制成具有報(bào)告基因的重構(gòu)建器官，可以正確地把握調(diào)查組織和器官水平 上的生物體內(nèi)分子行為。
在本發(fā)明所涉及的細(xì)胞塊中，上皮系身體細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞，并且 間充質(zhì)系身體細(xì)胞是毛乳頭細(xì)胞，而且，在形成具有毛嚢誘導(dǎo)功能的毛嚢 的情況下，該細(xì)胞塊可以在顯示育毛效果的藥劑的評(píng)價(jià)中、例如這樣的藥 劑的篩選中使用。例如，將育毛藥劑的候選藥劑應(yīng)用于該細(xì)胞塊，與對(duì)照 比較，在細(xì)胞塊的生長(zhǎng)變得顯著時(shí)判定為具有育毛效果的藥劑，或者以促
進(jìn)毛生長(zhǎng)的基因、例如c-myc的表達(dá)增強(qiáng)為指標(biāo)，或以抑制毛生長(zhǎng)的基因、 例如BMP4、 IGFBP3基因等的表達(dá)抑制為指標(biāo)，可以判斷有無育毛效果。
實(shí)施例 毛乳頭細(xì)胞
通過供體所提供的頭皮組織來調(diào)制源自人的毛乳頭細(xì)胞。在除去真皮 組織之后，在立體顯微鏡下使用鑷子和眼科剪刀釆集脂肪組織內(nèi)所存在的 毛嚢部位。將采集的毛嚢移入加入了抗生素的培養(yǎng)液內(nèi)，進(jìn)一步在同樣顯 微鏡下目測(cè)分離采集毛乳頭細(xì)胞部位。分離的毛乳頭細(xì)胞在培養(yǎng)基內(nèi)于 10cm的圓形培養(yǎng)皿(TRP公司制造)中，在37°C 、 95 % C02下培養(yǎng)1周以 上，供給之后的實(shí)驗(yàn)。使用的培養(yǎng)基為Advanced-DMEM(Invitrogen)、 15 0/o胎牛血清、20ng/ml的bFGF、 10ng/ml的EGF、 2mM的L-谷氨酰胺、 青霉素'鏈霉素.兩性霉素混合液(IOO倍稀釋)、3.5pl/500ml的p巰基乙醇。 將細(xì)胞在相同的條件下適當(dāng)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，用0.5%胰蛋白酶 /EDTA溶液進(jìn)行細(xì)胞剝離，將細(xì)胞移入新的培養(yǎng)亞中，用同樣組成的新鮮 培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
在添加BIO(Calbiochem公司)時(shí)，用DMSO(二甲基亞砜)溶解成 lOmM,進(jìn)行添加使得其為0.1 ~ 5nM。 角質(zhì)形成細(xì)胞^
如下操作來調(diào)制源自人正常新生兒周皮的角質(zhì)形成細(xì)胞。將從供體采 集的周皮組織在存在介軟酶的PBS(-)內(nèi)以4。C處理一夜左右。通過該處理可以以片狀僅收集表皮，將其用與傳代時(shí)同樣的方法用0.25%胰蛋白酶進(jìn) 行消化調(diào)制，連同培養(yǎng)基移至膠原處理過的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行培養(yǎng)。使用 Humedia KG2(夕，求々社)作為培養(yǎng)基。將細(xì)胞在相同的條件下適當(dāng)進(jìn)行 傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，用0.5。/。胰蛋白酶/EDTA溶液進(jìn)行細(xì)胞剝離，將細(xì)胞 移入新的培養(yǎng)皿中，用同樣組成的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將進(jìn)行如上 所述操作收集的經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞供給之后的實(shí)驗(yàn)。
在添加BIO(Calbiochem公司)時(shí)，用DMSO(二曱基亞砜)溶解成 10mM，進(jìn)行添加4吏得其為0.1 ~ 5jiM。 懸滴培養(yǎng) 培養(yǎng)基組成
將30% Advanced曙DMEM(Invitrogen公司)、2mM的L-谷氨酰胺、 青霉素.鏈霉素混合液(Invitrogen公司)(100倍稀釋)、3.5nl/500ml的卩巰基 乙醇與Humedia KG-2(夕，求夕社)以1:1進(jìn)行混合。
在添加Bio(Calbiochem公司)時(shí)，用DMSO(二甲基亞砜)溶解成 10mM，進(jìn)行添加使得其為0.1 ~ 5nM。 制成方法
毛乳頭細(xì)胞為P3(將傳代數(shù)1記為Pl)以上有Bio負(fù)荷或無Bio負(fù)荷， 對(duì)表皮角化細(xì)胞準(zhǔn)備了 P3以內(nèi)的細(xì)胞。
在胰蛋白酶處理之后，用各自的培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使得各細(xì)胞為lxl05個(gè)。
在添加Bio(Calbiochem公司)時(shí)，用DMSO(二曱基亞砜)溶解成 10mM，進(jìn)行添加使得其為0.1 ~ 5pM。
在10cm見方的正方形培#^(蓋)的頂部?jī)?nèi)側(cè)滴加各培養(yǎng)液25~35jil 進(jìn)行混合，制成適當(dāng)大小的官頂上的水滴。
小心合上蓋，使得培養(yǎng)液不會(huì)落下，在37°C、 5%<:02氣氛下進(jìn)行培養(yǎng)。
3天后，用與上述所使用的相同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換。 再培養(yǎng)4天之后，將一部分供給下述的RT-PCR分析(l)。其余部分將全部培養(yǎng)基換成無Bio條件下的培養(yǎng)基。
在第3天進(jìn)行同樣的培養(yǎng)基更換，在第7天回收生成的細(xì)胞塊，供給 下述的免疫染色。 免疫組織熒光染色
將懸滴法所得各細(xì)胞塊用0.1%低聚甲醛固定5分鐘，供給之后的染 色。另外，將一部分細(xì)胞塊在未固定的狀態(tài)下包埋在OCT液中，用恒冷 切片機(jī)制作冷凍切片，進(jìn)行免疫組織染色。
在含有13。/。牛血清白蛋白(BSA)的PBS(-)內(nèi)進(jìn)行封閉6小時(shí)。
將下述表所示各種 一 次抗體用上述含有13 %牛血清白蛋白(BSA)的 PBS(-)稀釋成1/200，添加到各樣品中，在4。C反應(yīng)4小時(shí)。
用含有0.02 %吐溫20的PBS(-)洗滌3次。
將用上述含有13。/。牛血清白蛋白(BSA)的PBS(-)稀釋成1/200的熒光 二次抗體(參考EXCEL文件)添加到各樣品中。另夕卜，用DAPI(4，，6-二脒基
-2-苯基吲哚)將細(xì)胞核染成藍(lán)色。
用熒光顯微鏡(OLYMPUS)進(jìn)行觀察。 表l
目的蛋白質(zhì)制造公司詳細(xì)
一次抗體CD49fScrotcc大鼠抗人/ 小鼠CD49f
波形蛋白YLEM單克隆
P聯(lián)蛋白^<夕卜/，、一 y年:/y單克隆
名稱制造公司詳細(xì)
熒光山羊抗大鼠IgG^卞夕乂;x一厶/紅
二次抗體綴合有德克薩斯紅
兔抗小鼠IgGInvitrogen黃
ALEXAFLUOR488
這里，因?yàn)閷?duì)波形蛋白的單克隆抗體特異性地染色毛乳頭細(xì)胞，CD49f 多克隆抗體特異性地染色表皮細(xì)胞，所以應(yīng)用波形蛋白抗體和CD49f抗體 于免疫細(xì)胞染色中，可以評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)所生成的細(xì)胞塊內(nèi)的細(xì)胞的屬性。
圖l是顯示上述顯微鏡觀察結(jié)果的黑白照片圖。在同圖的彩色版中， 可以看清綠色的波形蛋白抗體產(chǎn)生的染色、紅色的CD49f抗體產(chǎn)生的染色,
14可以理解成分別為毛乳頭細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞。另外，如圖2所示，可以 確認(rèn)毛乳頭細(xì)胞凝集在細(xì)胞塊的中心部分。由這些圖的結(jié)果，觀察到細(xì)胞 在凝集化之后規(guī)則地排列，明確了通過本實(shí)驗(yàn)體系，上皮細(xì)胞與間充質(zhì)細(xì) 胞規(guī)則正確地排列。在添加BIO而生成細(xì)胞塊之后，觀察到在未添加BIO 的狀態(tài)下培養(yǎng)的細(xì)胞塊中，被染成紅色的角質(zhì)形成細(xì)胞規(guī)則正確地生長(zhǎng)成 分枝狀。進(jìn)而圖3表明了，在添加BIO而生成細(xì)胞塊的情況下，毛乳頭凝 集而存在的中心部分、和發(fā)展成分枝狀的細(xì)胞塊的尖端部分對(duì)增殖標(biāo)志物 Ki67為陽性。根據(jù)以上結(jié)果，通常慣例是凝集的身體細(xì)胞處于不生長(zhǎng)的休 眠狀態(tài)，但由于BIO的效果而在細(xì)胞塊中引起細(xì)胞的增殖可以說是令人驚 訝的發(fā)現(xiàn)。
另外，將p聯(lián)蛋白單克隆抗體用于干細(xì)胞性質(zhì)的標(biāo)志物。因?yàn)镻聯(lián)蛋 白在通常的身體細(xì)胞中少量存在于細(xì)胞膜附近，所以通過通常的熒光免疫 抗體染色僅能微弱地檢測(cè)到。但是，在具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞中，p聯(lián)蛋 白在核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，其量也增加。進(jìn)而，因?yàn)樵诤藘?nèi)積累， 所以即使用熒光免疫抗體染色法也可以確認(rèn)強(qiáng)局部化的狀態(tài)。在本實(shí)驗(yàn)中， 也因?yàn)樵诩?xì)胞塊的一部分特異性位置p聯(lián)蛋白被強(qiáng)烈染色而可以確認(rèn)聚集 的狀態(tài)，所以可以說，通過P聯(lián)蛋白抗體的染色適于檢測(cè)細(xì)胞塊內(nèi)的具有 干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞。
圖4是顯示通過上述p聯(lián)蛋白單克隆抗體染色的顯微鏡觀察結(jié)果的黑 白照片圖。同圖的彩色版用綠色顯示p聯(lián)蛋白抗體產(chǎn)生的染色部位，用紅 色顯示角質(zhì)形成細(xì)胞。確認(rèn)了發(fā)出強(qiáng)烈綠色光的部位的p聯(lián)蛋白陽性細(xì)胞， 顯示了細(xì)胞的千細(xì)胞性質(zhì)。應(yīng)該特別提到的是在細(xì)胞塊的球狀部位存在中 心部分發(fā)出黃色光的部分。顯示該部位是P聯(lián)蛋白陽性且是角質(zhì)形成細(xì)胞。 P聯(lián)蛋白陽性細(xì)胞如上所述可以說是具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞。另一方面， 可以觀察到，從細(xì)胞塊發(fā)展成枝狀的角質(zhì)形成細(xì)胞(紅)的部位沒有發(fā)出黃 色光的部位，即在同一細(xì)胞塊內(nèi)具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞與具有通常的體細(xì) 胞性質(zhì)的細(xì)胞(角質(zhì)形成細(xì)胞)共存。這是在通常的培養(yǎng)狀況中觀察不到的 情況，可以認(rèn)為上皮間充質(zhì)相互作用恰如在體內(nèi)那樣被重現(xiàn)，未分化和分
15化了的細(xì)胞群自主地形成細(xì)胞塊并生長(zhǎng)。
這里所謂未分化的角質(zhì)形成細(xì)胞，是指像毛母細(xì)胞那樣穩(wěn)定地制造出構(gòu)建毛的角質(zhì)形成細(xì)胞的、具有干細(xì)胞能力的細(xì)胞。另一方面分化了的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖次數(shù)是有限的，是指所謂的確定了變成毛的細(xì)胞命運(yùn)的細(xì)
胞。同時(shí)在圖4的彩色版中包圍發(fā)綠光的球體的細(xì)胞被認(rèn)為是毛乳頭細(xì)胞，在該細(xì)胞塊的環(huán)境下毛乳頭細(xì)胞是P聯(lián)蛋白陽性細(xì)胞，這與Wnt信號(hào)在體內(nèi)在毛嚢形成和開始生長(zhǎng)中是重要的類似，可以說是重要的一點(diǎn)。
使用針對(duì)表皮角化細(xì)胞、外毛根鞘細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞角蛋白14(K14)的抗體，用于確認(rèn)這些細(xì)胞沒有分化成毛干(紅色)。因?yàn)榕c發(fā)角蛋白特異性反應(yīng)的AE13單克隆抗體(Lynch等，JCellBiol， 103巻，2593頁，1986年)識(shí)別44K/46K的酸性發(fā)角蛋白二聚體，所以用于標(biāo)記分化成毛干的狀態(tài)(綠色)。發(fā)角蛋白是在通常的表皮角化細(xì)胞中基本完全不存在的、毛嚢特異性的 結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。圖5是顯示其顯微鏡觀察結(jié)果的黑白照片圖。在同圖的彩色版中，在用毛乳頭細(xì)胞與表皮角化細(xì)胞制作的細(xì)胞塊中不能看到被AE13抗體染色的部分，但如果用BIO刺激，則看到一部分染色。在用毛乳頭細(xì)胞與外毛根鞘細(xì)胞制作的細(xì)胞塊中，可以看到在無BIO刺激時(shí)被AE13抗體染色的部分，由于BIO刺激AE13抗體產(chǎn)生的染色性顯著提高。另一方面，因?yàn)椴荒芸吹皆谒械募?xì)胞塊中被K14抗體(紅)與AE13抗體(綠)兩者染色的部位(發(fā)黃色光的部位)，所以認(rèn)為發(fā)生了從表達(dá)細(xì)胞角蛋白14的未分化細(xì)胞向產(chǎn)生發(fā)角蛋白的細(xì)胞的變化。
使用針對(duì)生毛期的毛芽中特異性表達(dá)(Ogawa等，Exp Dermatol， 13巻，401頁，2004)的人上皮抗原的Ber-EP4抗體，用于標(biāo)記生毛期的毛芽(綠色)。圖6是顯示其顯微鏡觀察結(jié)果的黑白照片圖。在同圖的彩色版中，在用毛乳頭細(xì)胞與外毛根鞘細(xì)胞制作的細(xì)胞塊中，用BIO刺激時(shí)清晰地觀察到Ber-EP4抗體產(chǎn)生的免疫染色性(綠)。因?yàn)椴荒芸吹?皮K14抗體(紅)和Ber-EP4抗體(綠)二者染色的部位(發(fā)黃色光的部位)，所以可以認(rèn)為發(fā)生了從表達(dá)細(xì)胞角蛋白14的未分化細(xì)胞向分化成表達(dá)Ber-EP4的毛芽的細(xì)胞的變化。RT-PCR分析(l)
使用TRIZOL(Invitrogen)從各樣品提取RNA。將相當(dāng)于200ng各RNA在RevTraACE(TOYOBO)50nl的反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用下述的引物，在50fil的體系中，將lfil得到的樣品加入PCR反應(yīng)。使用的酶是KOD-DASH(TOYOBO)，使用[在95。C、 60秒，將(在95。C、 30秒，在63°C、 15秒，在72。C、 30秒)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在72。C、 60秒的反應(yīng)程序。
將10fU反應(yīng)液在2 %瓊脂糖凝膠(COSMOBIO)/TAE緩沖液內(nèi)以100V進(jìn)行電泳。使用的DNA大小標(biāo)記物是100bp隨才幾標(biāo)志物(TOYOBO)。
使用的引物如下所述，PCR的結(jié)果示于圖7。
表2
正義引物(正鏈)反義引物(反鏈)
Lef-lgctatcaaccaga"cttggcagaagg (序列編號(hào)1)cagctgtcattcttggacctgtacctg (序列編號(hào)2)
SHHctacgagtccaaggcacatatccactg (序列編號(hào)3)tccaggaaagtgaggaagtcgctgtag (序列編號(hào)4)
STAT3aagaccggcgtccagttcactactaaag (序列編號(hào)5)ggtcaagtgtttgaattctgcagagagg (序列編號(hào)6)
多功能蛋白聚糖(Versican)tccaagttatgttggtgcactttgtgag (序列編號(hào)7)tcaaacatcttgtcattgaggcctatcc (序列編號(hào)8)
TWIST-1ggccaggtacatcgacttcctctac (序列編號(hào)9)tctccttctctggaaacaatgacatc (序列編號(hào)10)
P-聯(lián)蛋白cgcg3g肌gatgacccag3tcatg (^列編號(hào)11)ccacaggactccatgcccacg (序列編號(hào)12)
使用p-聯(lián)蛋白作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。
Lef-l是Wnt信號(hào)的下游基因，如圖7所示，無論在存在BIO和不存在BIO的任一狀態(tài)下都可以在本實(shí)驗(yàn)體系中檢測(cè)到。在看到Lef-l的基因表達(dá)時(shí)，意味著細(xì)胞中Wnt信號(hào)發(fā)揮作用。所以，可以理解成在本實(shí)驗(yàn)體系中，由于添加BIO， Wnt信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。
SHH(Sonic Hedge Hog)是與組織形成時(shí)相關(guān)的基因，如圖7所示，在存在BIO和不存在BIO的任一狀態(tài)下在本實(shí)驗(yàn)體系中都檢測(cè)不到。SHH是接收Wnt和Lef-l的信號(hào)而轉(zhuǎn)錄表達(dá)的基因。本基因表達(dá)顯示，Wnt信號(hào)作用于細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)生像在體內(nèi)發(fā)生的那樣的連鎖基因表達(dá)。同時(shí)，SHH是承擔(dān)上皮間充質(zhì)之間的細(xì)胞間信號(hào)的蛋白質(zhì)，故而同時(shí)還提示發(fā)生了上皮間充質(zhì)相互作用。
STAT-3(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3， SIGNAL TRANSDUCER ANDACTIVATOR OF TRANSCRIPTION 3)是毛嚢誘導(dǎo)相關(guān)基因，如圖7所示，與不存在BIO情況下相比，在存在BIO情況下被顯著地檢測(cè)到。STAT-3是細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，據(jù)說與干細(xì)胞的自身增殖相關(guān)。該基因的增強(qiáng)^JI、性干細(xì)胞自身增殖與維持萬能性必不可少的因子，是顯示其千細(xì)胞性質(zhì)的標(biāo)志物之一。同時(shí)，如論文SanoS.等，Nature Med., 11巻43-49頁，2005年"Stat3 links activated keratinocytes and immunocytesrequired for development of psoriasis in a novel transgenic mouse model."所述那樣，SATA-3是向毛的生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)換中非常重要的基因，從這方面來看，在本實(shí)驗(yàn)體系中STAT-3的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，提示之后將踏入生長(zhǎng)成毛嚢時(shí)的正常階段。同時(shí)，STAT-3信號(hào)本身并不直接受BIO的影響(SatoN等，Nat Med.， 2004年1月，10巻(l): 55-63頁,電子版2003年12月21日，"Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cellsthrough activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specificinhibitor"),即，STAT-3在添加BIO時(shí)的增強(qiáng)顯示，由于上皮間充質(zhì)相互作用而在細(xì)胞塊內(nèi)生成干細(xì)胞維持系統(tǒng)。
TWIST-1是胚性間充質(zhì)系干細(xì)胞的標(biāo)志物，提示毛乳頭細(xì)胞具有極高的干細(xì)胞性質(zhì)。因?yàn)門WIST-1在身體細(xì)胞的表達(dá)僅限于包括骨髓性間充質(zhì)干細(xì)胞的極為稀少的細(xì)胞種類，所以毛乳頭細(xì)胞雖然作為身體細(xì)胞，但可以說是具有較高干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞。在圖7的RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，模板使用等量的總RNA來進(jìn)行RT-PCR。在BIO存在下看起來表達(dá)降低，這是因?yàn)槿缬蓤Dl和2可以觀察到的那樣，在總細(xì)胞數(shù)中毛乳頭細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)降低的原因。作為結(jié)論，即使在考慮表達(dá)量的多少之后，表達(dá)TWIST-1基因的細(xì)胞也持續(xù)存在，這提示，在本實(shí)驗(yàn)中能夠具有干細(xì)胞能力的毛乳頭細(xì)胞持續(xù)存在。
多功能蛋白聚糖基因是由于誘導(dǎo)生毛時(shí)在毛乳頭細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)而為人們所知的生毛標(biāo)志物(Kishimoto等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999年，7336-7341頁)。在圖7的RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，模板使用等量的總RNA來進(jìn)行RT-PCR。在BIO存在下看起來表達(dá)降低，這是因?yàn)槿缬蓤D1和2可以觀察到的那樣，在總細(xì)胞數(shù)中毛乳頭細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)降低的原因。作為結(jié)論，即使在考慮表達(dá)量的多少之后，表達(dá)多功能蛋白聚糖基因的細(xì)胞也持續(xù)存在，這提示，在本實(shí)驗(yàn)中能夠具有誘導(dǎo)生毛能力的毛乳頭細(xì)胞持續(xù)存在。
從各種基因的表達(dá)水平的變化可以說，由于在細(xì)胞塊內(nèi)BIO的直接效果，維持了上皮和間充質(zhì)細(xì)胞的未分化性，并且引起了疑似通過Wnt信號(hào)的上皮間充質(zhì)相互作用。另外，因?yàn)橄馭TAT-3那樣可以看到出現(xiàn)了與Wnt信號(hào)無關(guān)的干細(xì)胞性質(zhì)，所以可以說，BIO效果有助于創(chuàng)造具有自主的細(xì)胞間相互作用與增殖能力的細(xì)胞塊。Wnt3A RT-PCR
毛乳頭細(xì)胞為P3(將傳代數(shù)1記為Pl)有Bio負(fù)荷，對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞準(zhǔn)備了 P3以內(nèi)的細(xì)月包。
在胰蛋白酶處理之后，用各自的培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使得各細(xì)胞為3xl03個(gè)。
用DMSO(二甲基亞砜)將Bio(Calbiochem公司)溶解成10mM，進(jìn)行添加4吏得其為0.1 ~ 5jiM。
在10cm見方的正方形培養(yǎng)皿(蓋)的頂部?jī)?nèi)側(cè)滴加各培養(yǎng)液25~35fU進(jìn)行混合，制成適當(dāng)大小的官頂上的水滴。
小心合上蓋，使得培養(yǎng)液不會(huì)落下，在37。C、 5%<:02氣氛下進(jìn)行培養(yǎng)。
3天后，用與上述所使用的相同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換。在第7天回收樣品，供給如下所述的RT-PCR分析(2)(圖8的"0天")。進(jìn)而對(duì)剩余的同樣細(xì)胞將培養(yǎng)基更換成無Bio條件的培養(yǎng)基，進(jìn)行分化誘導(dǎo)，將在第3天回收的樣品同樣供給如下所述的RT-PCR分析(2)(圖8的"3天，，)。RT-PCR分析(2)
使用TRIZOL(Invitrogen)從各樣品提取RNA。將相當(dāng)于200ng各RNA在RevTraACE(TOYOBO)50fi1的反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用下述的引物，在50jil的體系中，將lpl得到的樣品加入PCR反應(yīng)。使用的酶是KOD-DASH(TOYOBO),使用[在94°C、 2分鐘，將(在94°C、 30秒，在63。C、 10秒，在72。C、 30秒)進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，在72。C、 2分鐘的反應(yīng)程序。
正義引物(正鏈)caggaactacgtggagatcatg (序歹'J編號(hào)13)反義引物(負(fù)鏈)ccatcccaccaaaactcgatgtc (序列編號(hào)14)將10jil反應(yīng)液在2 %瓊脂糖凝膠(COSMOBIO)/TAE緩沖液內(nèi)以100V進(jìn)行電泳。在用溴化乙錠可視化之后，檢測(cè)目的條帶。
將其結(jié)果示于圖8。圖中，用箭頭表示的是Wnt3A的條帶。人們知道Wnt3A自身表達(dá)稀少，主要由上皮細(xì)胞表達(dá)，是與器官形成、上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞相互作用相關(guān)的基因。如圖所示，在通過于BIO存在下培養(yǎng)而激活了 Wnt信號(hào)的細(xì)胞中，完全看不到Wnt3A表達(dá)，相反，在之后通過除去BIO而誘導(dǎo)了細(xì)胞分化的細(xì)胞中，看到了 Wnt3A表達(dá)。因此明確了，在本實(shí)驗(yàn)體系中，通過在BIO存在下培養(yǎng)之后除去BIO進(jìn)行培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分化，進(jìn)而誘導(dǎo)自主的器官形成。Wntl0B RT-PCR
毛乳頭細(xì)胞為P3(將傳代數(shù)1記為Pl)無Bio負(fù)荷，對(duì)外毛根鞘細(xì)胞準(zhǔn)備了 P3以內(nèi)的細(xì)胞。
在胰蛋白酶處理之后，用各自的培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使得各細(xì)胞為3xl03個(gè)。
用DMSO(二甲基亞砜)將Bio(Calbiochem公司)溶解成10mM，進(jìn)行添加使得其為0.1 ~ 5fiM。
在10cm見方的正方形培養(yǎng)皿(蓋)的頂部?jī)?nèi)側(cè)滴加各培養(yǎng)液25~35jil進(jìn)行混合，制成適當(dāng)大小的官頂上的水滴。
小心合上蓋，使得培養(yǎng)液不會(huì)落下，在37。C、 5。/。C02氣氛下進(jìn)行培養(yǎng)。
3天后，用與上述所使用的相同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換。在7天后回收樣品，供給如下所述的RT-PCR分析(3)(圖9的"7天")。進(jìn)而對(duì)剩余的同樣細(xì)胞將培養(yǎng)基更換成無Bio條件的培養(yǎng)基，進(jìn)行分化誘導(dǎo)，將在IO天后和14天后回收的樣品同樣供給如下所述的RT-PCR分析(3)(圖9的"IO天"和"14天")。RT-PCR分析(3)
使用TRIZOL(Invitrogen)從各樣品提取RNA。將相當(dāng)于200ng各RNA在RevTraACE(TOYOBO)50ji1的反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用下述的引物，在20jil的體系中，將化l得到的樣品加入定量PCR(LightCycler系統(tǒng)，Roche)。 4吏用LightCycler FastStart DNA Master SYBR GreenI (Roche)的反應(yīng)程序[將在95。C、 10秒，在63。C、 10秒，在72。C、 15秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
正義引物(正鏈)gaagttctctcgggatttcttggatcc (序列編號(hào)15)反義引物(負(fù)鏈)cggttgtgggtatcaatgaagatgg (序列編號(hào)16)將其結(jié)果示于圖9。數(shù)據(jù)全部表示為對(duì)在細(xì)胞塊中不負(fù)荷BIO時(shí)的3天后表達(dá)量的相對(duì)表達(dá)量。人們知道Wntl0B在毛嚢的形態(tài)形成期與生毛期主要由上皮細(xì)胞表達(dá)，是參與上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞相互作用的基因。如圖所示，在通過于BIO存在下培養(yǎng)而激活了 Wnt信號(hào)的細(xì)胞中，只要在BIO存在下培養(yǎng)，就看到Wntl0B的表達(dá)僅為與在BIO不存在下培養(yǎng)的對(duì)照相同的程度，相反，在之后通過除去BIO而誘導(dǎo)了細(xì)胞分化的細(xì)胞中，WntlOB表達(dá)經(jīng)時(shí)地升高。因此明確了，在本實(shí)驗(yàn)體系中，通過在BIO存在下培養(yǎng)之后除去BIO進(jìn)行培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)毛嚢上皮細(xì)胞(外毛根鞘細(xì)胞)分化，進(jìn)而誘導(dǎo)自主的器官形成。細(xì)胞塊對(duì)生毛藥劑環(huán)孢菌素A的反應(yīng)性
作為免疫抑制劑的環(huán)孢菌素A,是作為其副作用的多毛癥(Lutz等，Skin Pharmacol, 7巻101頁，1994年)為人們所知的藥劑，已經(jīng)明確其顯示生毛作用(Paus等，Lab Invest, 60巻，365頁，1989年)、促進(jìn)毛生長(zhǎng)作用(Taylor等，J Invest Dermatol, 100巻，237頁，1993年)。
毛乳頭細(xì)胞為P3(將傳代數(shù)1記為Pl)無Bio負(fù)荷，對(duì)外毛根鞘細(xì)胞準(zhǔn)
21備了 P3以內(nèi)的細(xì)胞。
在胰蛋白酶處理之后，用各自的培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使得各細(xì)胞為3xl03個(gè)。
在10cm見方的正方形培養(yǎng)皿(蓋)的頂部?jī)?nèi)側(cè)滴加各培養(yǎng)液25~35jil進(jìn)行混合，制成適當(dāng)大小的,頂上的水滴。
小心合上蓋，使得培養(yǎng)液不會(huì)落下，在37°C、 5。/。C02氣氛下進(jìn)行培養(yǎng)。
3天后，用與上述所使用的相同的含有環(huán)孢菌素A的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換。用乙醇將環(huán)孢菌素A(Novartis公司)溶解成lOmM，進(jìn)行添加使得其為0.1 ~ lOyiM。
在添加環(huán)孢菌素A的3天后回收樣品，供給如下所述的RT-PCR分析
(4)。
RT-PCR分析(4)
使用RNeasy試劑盒(QIAGEN)從樣品提取RNA。將相當(dāng)于2000ng各RNA在Superscript II (Invitrogen) 20jil的反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用下述的引物，在20nl的體系中，將ljil得到的樣品加入定量PCR(LightCycler系統(tǒng)，Roche)。 4吏用LightCycler FastStart DNA MasterSYBR Green I (Roche)的反應(yīng)程序[將在95°C 、 10秒，在58。C、 10秒，在72°C、 15秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。BMP4
正義引物(正鏈)gggcacctcatcacacgact (序歹'J編號(hào)17)反義引物(負(fù)鏈)ggcccaattcccactccctt (序列編號(hào)18)c-myc
正義引物(正鏈)ttctctccgtcctcggattctctg (序列編號(hào)19)反義引凈勿(負(fù)鏈)cagcagaaggtgatccagactctgac (序歹'J編號(hào)20)IGFBP3
正義引物(正鏈)acagccagcgctacaaagtt (序歹'J編號(hào)21)反義引物(負(fù)鏈)tagcagtgcacgtcctcctt (序列編號(hào)22)
22將其結(jié)果示于圖10。數(shù)據(jù)全部顯示為對(duì)不添加環(huán)孢菌素A時(shí)的相對(duì)表 達(dá)量。人們知道，BMP4在毛嚢的形態(tài)形成期和生毛期主要由毛乳頭細(xì)胞 表達(dá)，是對(duì)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞相互作用發(fā)揮抑制作用的基因(Hens等， Development, 134巻，1221頁，2007年)。如圖所示，BMP4的表達(dá)量達(dá) 到60%左右，表達(dá)顯著降低。另外，人們知道，c-myc在生毛期的突起區(qū) 域、生長(zhǎng)期的毛母細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，是對(duì)毛嚢上皮細(xì)胞的增殖發(fā)揮正面作 用的基因(Bull JJ等，Invest Dermatol, 116巻，617頁，2001年)。如圖所 示，c-myc表達(dá)增強(qiáng)到接近1.5倍。進(jìn)而，IGFBP3作為抑制毛生長(zhǎng)的因子 為人們所知(Weger等，J Invest Dermatol, 125巻，847頁，2005年)，明 確了其在休止期表達(dá)升高(Schlake等，Gene Expr. Patterns， 4巻，141頁， 2004年)。如圖所示，IGFBP3表達(dá)達(dá)到60%左右，表達(dá)顯著降低。因此 明確了，在本實(shí)驗(yàn)體系中，與生毛和毛生長(zhǎng)相關(guān)的基因由于環(huán)孢菌素A而 變化，從而明確了可以在影響生毛、毛生長(zhǎng)的藥劑的評(píng)價(jià)中使用本實(shí)驗(yàn)體 系。
權(quán)利要求
1. 含有源自身體的多個(gè)身體細(xì)胞種類的、能形成原始的器官樣的細(xì)胞塊的制造方法，所述方法包括，準(zhǔn)備所述多種的含有身體細(xì)胞的培養(yǎng)液，將所述多種身體細(xì)胞培養(yǎng)液混合，然后向該混合細(xì)胞培養(yǎng)液中添加Wnt信號(hào)激活劑，將所述含有Wnt信號(hào)激活劑的培養(yǎng)液進(jìn)行規(guī)定時(shí)間的非平面接觸性培養(yǎng)，將所述經(jīng)非平面接觸性培養(yǎng)的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基更換成不含有Wnt信號(hào)激活劑的培養(yǎng)基，進(jìn)一步培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間，這里所述多種身體細(xì)胞中的至少1種保持未分化狀態(tài)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述多種身體細(xì)胞包含上皮系身 體細(xì)胞和間充質(zhì)系身體細(xì)胞的組合，該間充質(zhì)系身體細(xì)胞保持著未分化狀 態(tài)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述上皮系身體細(xì)胞是角質(zhì)形成 細(xì)胞，所述間充質(zhì)系身體細(xì)胞是毛乳頭細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中從所述細(xì)胞塊形成具有毛囊誘導(dǎo) 功能的毛囊。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 4的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述Wnt信號(hào)激活 劑是6-溴靛玉紅-3，-肟(BI0)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非平面接觸性 培養(yǎng)方法是懸滴方法。
7. 含有源自身體的多個(gè)身體細(xì)胞種類的、能形成原始的器官樣的細(xì)胞 塊，該細(xì)胞塊是通過包括下述步驟的方法制造的，準(zhǔn)備所述多種的含有身體細(xì)胞的培養(yǎng)液，將所述多種身體細(xì)胞培養(yǎng)液混合，然后向該混合細(xì)胞培養(yǎng)液中添加 Wnt信號(hào)激活劑，將所述含有Wnt信號(hào)激活劑的培養(yǎng)液進(jìn)行規(guī)定時(shí)間的非平面接觸性 培養(yǎng)，將所述經(jīng)非平面接觸性培養(yǎng)的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基更換成不含有Wnt信 號(hào)激活劑的培養(yǎng)基，進(jìn)一步培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間，這里所述多種身體細(xì)胞中的至 少l種保持未分化狀態(tài)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞塊，其中所述多種身體細(xì)胞包含上皮系 身體細(xì)胞和間充質(zhì)系身體細(xì)胞的組合，該間充質(zhì)系身體細(xì)胞保持著未分化 狀態(tài)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞塊，其中所迷上皮系身體細(xì)胞是角質(zhì)形 成細(xì)胞，所述間充質(zhì)系身體細(xì)胞是毛乳頭細(xì)胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的細(xì)胞塊，其中從所述細(xì)胞塊形成具有毛嚢 誘導(dǎo)功能的毛嚢。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7~10的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞塊，其中所述Wnt信號(hào) 激活劑是6-溴靛玉紅-3，-肟(BI0)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求7~11的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞塊，其中所述非平面接 觸性培養(yǎng)方法是懸滴方法。
13. 篩選具有育毛效果的藥劑的方法，所述方法通過對(duì)權(quán)利要求9 12 的任 一 項(xiàng)所述的細(xì)胞塊應(yīng)用候選藥劑來實(shí)施。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，所述方法將選自所述細(xì)胞塊的 c-myc、 BMP4和IGFBP3的1個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)量作為指標(biāo)。
全文摘要
本發(fā)明提供含有源自身體的多個(gè)身體細(xì)胞種類的、能形成原始的器官樣的細(xì)胞塊的制造方法，該方法包括，準(zhǔn)備所述多種的含有身體細(xì)胞的培養(yǎng)液，將所述多種身體細(xì)胞培養(yǎng)液混合，然后向該混合細(xì)胞培養(yǎng)液中添加Wnt信號(hào)激活劑，將所述含有Wnt信號(hào)激活劑的培養(yǎng)液進(jìn)行規(guī)定時(shí)間的非平面接觸性培養(yǎng)，將所述非平面接觸性培養(yǎng)的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基更換成不含有Wnt信號(hào)激活劑的培養(yǎng)基，進(jìn)一步培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間，這里所述多種身體細(xì)胞中的至少1種保持未分化狀態(tài)。
文檔編號(hào)C12N5/071GK101479376SQ20078002420
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2007年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月27日
發(fā)明者岸本治郎, 相馬勤, 藤原重良 申請(qǐng)人:株式會(huì)社資生堂