專(zhuān)利名稱(chēng)：：在低等真核生物中生產(chǎn)唾液酸化n-聚糖的制作方法在低等真核生物中生產(chǎn)唾液酸化N-聚糖相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本發(fā)明涉及這樣的方法和組合物借助所述方法和組合物，可遺傳修飾非人真核宿主細(xì)胞，例如真菌或其它真核細(xì)胞，以產(chǎn)生糖基化蛋白(糖蛋白)，該糖基化蛋白所具有的糖基化模式類(lèi)似于動(dòng)物細(xì)胞，尤其是人細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白的糖基化模式，可用作人或動(dòng)物的治療劑。具體地說(shuō)，本申請(qǐng)涉及在一般不產(chǎn)生唾液酸化糖蛋白的非人真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生唾液酸化糖蛋白的方法和組合物。(2)相關(guān)技術(shù)的描述在人和低等真核生物中的糖基化途徑哺乳動(dòng)物型的寡糖結(jié)構(gòu)的合成以一組順序反應(yīng)開(kāi)始，在該反應(yīng)過(guò)程中，在蛋白沿著宿主生物中的分泌途徑前移的同時(shí)，糖殘基被添加和除去。沿著宿主生物或細(xì)胞的糖基化途徑存在的酶決定分泌蛋白所產(chǎn)生的糖基化模式。因此，在低等真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的蛋白所產(chǎn)生的糖基化模式與在高等真核生物如人和其它哺乳動(dòng)物中表達(dá)的蛋白的糖基化模式顯著不同(Bretthauer,1999)。典型的真菌W-聚糖的結(jié)構(gòu)示于圖1A。在幾乎所有的真核生物中，糖蛋白都來(lái)源于普通的脂連接寡糖前體Glc3Man9GlcNAcr多萜長(zhǎng)醇-焦磷酸酯。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，結(jié)合寡糖的多辟長(zhǎng)醇焦磷酸酯的合成和加工在所有已知的真核生物之間都是相同的。然而，真菌細(xì)胞(例如酵母)進(jìn)一步加工的核心寡糖一旦4皮轉(zhuǎn)移至離開(kāi)ER并進(jìn)入高爾基體的肽，就與人顯著不同，因?yàn)槠溲刂置谕緩角耙疲ㄌ砑訋讉€(gè)甘露糖。0006]在酵母中，這些步驟由存在于高爾基體中的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(如Ochlp、Mntlp和Mnnlp)催化，所述酶序貫添加甘露糖至核心寡糖。產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)對(duì)于產(chǎn)生人樣蛋白不合乎需要，因此需要降低或消除甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性。業(yè)已表明，甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性缺失的釀酒酵母(5"acc/2aram少cescerev7'sz'ae)(S.cereWs/ae)的突變體(例:i口oc/7或腳"9突變體)為非致命的，顯示出的酵母糖蛋白寡糖中的甘露糖含量降低。其它寡糖加工酶，例如甘露糖基磷酸轉(zhuǎn)移酶，也必須根據(jù)宿主的具體內(nèi)源糖基化模式而被去除。糖核苷酸前體動(dòng)物糖蛋白的7Z-聚糖通常包括半乳糖、巖藻糖和末端唾液酸。在酵母和絲狀真菌中產(chǎn)生的糖蛋白上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這些糖。在人和其它非人真核細(xì)胞中，所有糖核苷酸前體(例如UDP-W-乙酰葡糖胺、UDP-W-乙酰半乳糖胺、CMP-7V-乙酰神經(jīng)氨酸、UDP-半乳糖、GDP-巖藻糖等)都在胞質(zhì)中合成，并被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體中，在高爾基體中，它們通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶附著至核心寡糖(Sommers,1981;Sommers,1982;P證，1987)。在某些情況下，發(fā)現(xiàn)這些特異性相互作用在種間有功能。例如，已表明大鼠a2，6-ST(已知位于動(dòng)物的外側(cè)高爾基體中的一種酶)的跨膜區(qū)也將報(bào)告基因(轉(zhuǎn)化酶)定位于酵母高爾基體中(Schwientek,1995)。然而，作為全長(zhǎng)a2,6-ST組成部分的非常相同的跨膜區(qū)被保留在ER中，而沒(méi)有凈支進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)至酵母高爾基體(Krezdom,1994)。人的全長(zhǎng)GalT在酵母中甚至不合成，盡管可證實(shí)存在高轉(zhuǎn)錄水平。相反，與轉(zhuǎn)化酶報(bào)告體融合的相同人GalT跨膜區(qū)能夠?qū)⒍ㄎ粚?dǎo)向酵母高爾基體，雖然其處于低生產(chǎn)水平。Schwientek和同事們已表明，將酵母甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(MA77)的28個(gè)氨基酸、含胞質(zhì)尾的區(qū)域、跨膜區(qū)和莖區(qū)的8個(gè)氨基酸與人GalT的催化結(jié)構(gòu)域融合，足以進(jìn)行活性GalT的高爾基體定位。其它半乳糖基轉(zhuǎn)移酶似乎依賴(lài)于與特定細(xì)胞器中存在的酶的相互作用，因?yàn)樵诔ニ鼈兊目缒^(qū)后，它們?nèi)阅軌蛘_定位。分離自人或動(dòng)物的大量蛋白是翻譯后修飾的，糖基化是其中一種最有意義的修飾。估計(jì)所有治療性蛋白的70%都是糖基化的，因此目前依賴(lài)于能夠以類(lèi)似于人的方式糖基化的生產(chǎn)系統(tǒng)(即宿主細(xì)胞)。幾個(gè)研究已表明，糖基化對(duì)于確定(l)免疫原性、(2)藥代動(dòng)力學(xué)特性、(3)運(yùn)輸和(4)治療性蛋白的效率起重要作用。因此，醫(yī)藥工業(yè)已投入相當(dāng)大的精力來(lái)開(kāi)發(fā)獲得盡可能為"人形，，或"人樣"的糖蛋白的方法就不出人意料了。迄今為止，大部分糖蛋白在哺乳動(dòng)物宿主系統(tǒng)中制備。這可包括對(duì)這些哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造，以增強(qiáng)所述細(xì)胞表達(dá)的蛋白的唾液酸化(即末端添加唾液酸)程度，已知唾液酸化改善這些蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)特性?；蛘?，人們可以使用已知的糖基轉(zhuǎn)移酶及其各自的核苷酸糖(例如2,3-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和CMP-唾液酸)，通過(guò)體外添加這些糖改善唾液酸化程度。盡管大部分高等真核生物進(jìn)行的糖基化反應(yīng)類(lèi)似于在人中存在的那些糖基化反應(yīng)，但在以上提及的宿主系統(tǒng)中表達(dá)的重組人蛋白與其"天然的"人對(duì)應(yīng)物總是不同(Raju，2000)。因此，廣泛的開(kāi)發(fā)工作已投入到發(fā)現(xiàn)改善這些表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白的"人類(lèi)特征"的方法。這包括優(yōu)化發(fā)酵條件和通過(guò)導(dǎo)入?yún)⑴c人樣糖形形成的酶的編碼基因遺傳修飾蛋白表達(dá)宿主(Weraer,1998;Weikert,1999;Andersen,1994;Yang,2000)。還沒(méi)有解決與所有哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)的固有問(wèn)題。因此，目前產(chǎn)生的治療性糖蛋白即便不是全部也是大部分在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，已投入大量精力來(lái)改善(即"人源化")這些重組蛋白的糖基化才莫式。已成功使用培養(yǎng)基組成改變以及參與人糖基化的酶的編碼基因的共表達(dá)(參見(jiàn)例如Weikert，1999)。使用真核微生物進(jìn)行糖蛋白生產(chǎn)0016沒(méi)有適宜的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)是低成本且安全地生產(chǎn)用于治療用途的重組人糖蛋白的顯著障礙。在低等真核生物(真菌和酵母)中生產(chǎn)類(lèi)似于其哺乳動(dòng)物(例如人)對(duì)應(yīng)物的重組蛋白應(yīng)當(dāng)是合乎需要的。經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白將提供超越現(xiàn)有系統(tǒng)的眾多優(yōu)勢(shì)。盡管在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被轉(zhuǎn)移至蛋白的核心寡糖結(jié)構(gòu)在哺乳動(dòng)物和低等真核生物中基本相同，但已發(fā)現(xiàn)隨后于真菌和哺乳動(dòng)物的高爾基體中發(fā)生的加工反應(yīng)有顯著差異。實(shí)際上，即便在不同的低等真核生物中，也存在極為多樣的糖基化結(jié)構(gòu)。這一點(diǎn)在過(guò)去已阻礙了低等真核生物用作生產(chǎn)重組人糖蛋白的宿主，盡管具有超越哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的其它顯著優(yōu)勢(shì)。OOl刀在利用內(nèi)源宿主糖基化途徑的微生物宿主如酵母中生產(chǎn)的治療性糖蛋白在結(jié)構(gòu)上與在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的那些糖蛋白不同，通常表現(xiàn)為療效大幅降低。這些糖蛋白通常在人中是免疫原性的，在給藥后顯示出體內(nèi)半衰期降低(并因此生物活性降低)(Takeuchi,1997)。在人和動(dòng)物中的特定受體(即巨噬細(xì)胞甘露糖受體)可以識(shí)別末端甘露糖殘基，并促進(jìn)血流中的外源糖蛋白的快速清除。其它的副作用可包括蛋白折疊、溶解性、對(duì)蛋白酶的易感性、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)運(yùn)、區(qū)室化、分泌、被其它蛋白或因子的識(shí)別、抗原性或變態(tài)反應(yīng)性的改變。因此，需要生產(chǎn)以高胞內(nèi)MansGlcNAc2含量為特征的糖蛋白的方法，所述糖蛋白可在非人真核宿主細(xì)胞(尤其是在酵母和絲狀真菌)中被進(jìn)一步加工為人樣糖蛋白結(jié)構(gòu)。向N-聚糖添加唾液酸唾液酸(Sia)是N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)的N-或O-取代衍生物的特有基團(tuán)，所述衍生物普遍存在于由海星至人的后口動(dòng)物語(yǔ)系動(dòng)物中。在包括大部分植物、原生生物、古細(xì)菌和真細(xì)菌在內(nèi)的其它生物中，據(jù)認(rèn)為不存在這些化合物(Warren,1994)。已鑒定出例外，所有這些例外都在病原體生物中，包括某些細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌(Kelm,1997;Parodi,1993;Alviano,1999)。包括新型隱球菌(Qyptococcz^weo/o/7wam)和白色念珠菌(Ca"d/daa/Z^'cam")在內(nèi)的病原真菌在細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂上獲得唾液酸的機(jī)制仍未確定(Alviano，1999)。當(dāng)這些生物在無(wú)唾液酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，在細(xì)胞聚糖上發(fā)現(xiàn)唾液酸殘基，提示從頭合成唾液酸。迄今為止，還沒(méi)有在真菌中鑒定出參與唾液酸生物合成的酶。原生動(dòng)物唾液酸化細(xì)胞表面聚糖的機(jī)制已15被充分表征。諸如枯氏錐蟲(chóng)(77y/7a"o卵wacra。)的原生動(dòng)物具有以非CMP-Sia依賴(lài)性機(jī)制將唾液酸添加至細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂的外部反式唾液酸酶(Parodi，1993)。在真菌中鑒定出類(lèi)似的反式唾液酸酶應(yīng)有助于闡明唾液酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞聚糖上的機(jī)制，但迄今還沒(méi)有鑒定或分離出這沖羊的蛋白。已開(kāi)發(fā)出糖基化途徑被遺傳修飾的宿主細(xì)胞和細(xì)胞系，使得它們可以進(jìn)行特定順序的酶促反應(yīng)，這些反應(yīng)模擬在哺乳動(dòng)物(尤其是人)中的糖蛋白加工。在這些工程改造的宿主中表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)而且，可以產(chǎn)生具有特定所需聚糖結(jié)構(gòu)的大體上同源的糖蛋白群。修_16飾本發(fā)明的宿主細(xì)胞，例如在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的低等真核微生物和其它非人真核宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生沿著人糖基化途徑產(chǎn)生的W-聚糖。這使用工程改造的和/或選擇的菌抹實(shí)現(xiàn)，所述菌抹(l)不表達(dá)某些產(chǎn)生真菌糖蛋白的不需要結(jié)構(gòu)特征的酶；(2)表達(dá)任一選定的在要獲得活性的宿主細(xì)胞中存在的條件下具有最佳活性的異源酶；或(3)其組合；其中遺傳工程過(guò)的宿主細(xì)胞表達(dá)至少一種產(chǎn)生"人樣"糖蛋白所需的異源酶活性?？赏ㄟ^(guò)異源表達(dá)一種或多種活性，例如糖基轉(zhuǎn)移酶、糖普酶(例如甘露糖苷酶)、糖核苦酸轉(zhuǎn)運(yùn)體等，進(jìn)一步修飾本發(fā)明的宿主細(xì)胞，以變成用于生產(chǎn)哺乳動(dòng)物(例如人)治療性糖蛋白的菌株。0028本發(fā)明因此提供糖蛋白生產(chǎn)方法，該方法使用(l)低等真核宿主，例如單細(xì)胞或絲狀真菌，或(2)任何真核生物，例如非人真核細(xì)胞或具有與人不同的糖基化;漢式的生物，以修飾在宿主生物("宿主細(xì)胞")中產(chǎn)生的蛋白的糖基化組成和結(jié)構(gòu)，使得它們更密切地類(lèi)似于在哺乳動(dòng)物(例如人)蛋白中存在的糖結(jié)構(gòu)。該方法使人們可以獲得工程改造的宿主細(xì)胞，其中所需的基因，例如參與糖基化的基因，通過(guò)在科學(xué)文獻(xiàn)中充分確定的和在蛋白表達(dá)領(lǐng)域技術(shù)人員一般已知的方法表達(dá)，其產(chǎn)物靶向宿主細(xì)胞中的亞細(xì)胞位置。為了生產(chǎn)治療性蛋白，該方法可進(jìn)行修改，以工程改造細(xì)胞系，其中任何需要的糖基化結(jié)構(gòu)都可以在工程改造細(xì)胞中表達(dá)的蛋白上獲得。本發(fā)明進(jìn)一步提供分離的核酸分子和含有這類(lèi)分子的載體，所述核酸分子編碼分離自巴斯德畢赤氏酵母或乳克魯維氏酵母的起始al,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性。這些核酸分子含有的序列與釀酒酵母中的基因同源。這些序列和同源序列可用于構(gòu)建不高甘露糖基化糖蛋白的N-聚糖的宿主細(xì)胞。0034]在又一個(gè)實(shí)施方案中，例如通過(guò)將一種或多種編碼糖苦酶的核酸分子導(dǎo)入宿主中來(lái)工程改造宿主細(xì)胞，以表達(dá)異源糖苷酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼一種或多種甘露糖苷酶活性的核酸分子涉及由Man8GlcNAc2或Man9GlcNAc2產(chǎn)生Man5GlcNAc2。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種編碼的甘露糖苷酶活性具有的最佳pH在其中甘露糖苷酶活性定位的細(xì)胞器中的其它代表性酶的最佳平均pH的1.4pH單位之內(nèi)，或者于約5.1至約8.0的pH、優(yōu)選約5.5至約7.5的pH具有最佳活性。優(yōu)選地，將異源酶靶向宿主生物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或ER和高爾基體之間的轉(zhuǎn)運(yùn)嚢泡，在那里其修整iV-聚糖，例如Man8GlcNAc2，以產(chǎn)生高水平的Man5GlcNAc2。本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生融合構(gòu)建體的組合核酸文庫(kù)，所述融合構(gòu)建體可將需要的蛋白或多肽片段，例如參與糖基化的酶或其催化結(jié)構(gòu)域，靶向宿主細(xì)胞的選定亞細(xì)胞區(qū)域。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合核酸文庫(kù)含有(a)編碼不同細(xì)胞靶向信號(hào)肽的核酸序列和(b)編碼被靶向的不同多肽的核酸序列。將(a)和(b)的或來(lái)源于(a)和(b)的核酸序列連接在一起，產(chǎn)生融合構(gòu)建體，其至少一個(gè)編碼按讀框與異源細(xì)胞靶向信號(hào)肽連接的功能性蛋白結(jié)構(gòu)域(例如酶的催化結(jié)構(gòu)域)，即其一般不結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。|0041]本發(fā)明還提供使用參與修飾N-聚糖的酶(包括糖香酶和糖基轉(zhuǎn)移酶)修飾宿主細(xì)胞(例如任何真核宿主細(xì)胞，包括人宿主細(xì)胞)的糖基化途徑的方法；通過(guò)用本發(fā)明的核酸(例如，組合的)文庫(kù)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生表達(dá)至少一種和優(yōu)選兩種或更多種不同的嵌合糖基20群，所述嵌合糖基化酶具有的催化結(jié)構(gòu)域與一般不與該結(jié)構(gòu)域連接的細(xì)胞靶向信號(hào)肽按讀框連接?？扇芜x地由該群體選擇具有需要的糖基化表型的宿主細(xì)胞。使用本發(fā)明的文庫(kù)和相關(guān)方法修飾的宿主細(xì)胞用于例如生產(chǎn)糖蛋白，其具有類(lèi)似于或等同于在哺乳動(dòng)物(尤其是人)中產(chǎn)生的那些糖蛋白的糖基化模式。另一方面，本發(fā)明的組合文庫(kù)能夠產(chǎn)生一種或組合的催化活性的糖基化酶，其成功地定位于其中它們?cè)谔腔?分泌途徑中有效發(fā)揮作用的胞內(nèi)區(qū)室。優(yōu)選的酶在體內(nèi)以高效將(a-l，2-Man)3-9Maii5GlcNAc2轉(zhuǎn)變?yōu)镸an5GlcNAc2。另夕卜，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生以Man5GlcNAc2和/或GlcNAcMari5GlcNAc2作為主要A^聚糖的糖蛋白中間體或產(chǎn)物的真核宿主菌^t朱，尤其是酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、植物細(xì)胞、藻類(lèi)和昆蟲(chóng)細(xì)胞宿主。本發(fā)明的其它方面包括用于診斷和治療用途的方法、組合物和試劑盒，其中可以4企測(cè)在糖蛋白上有或無(wú)Man5GlcNAc2、21GlcMAcMan5GlcNAc2、Gal(M)GlcNAc(M)Maii3GlcMAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2和/或NANA(M)Gal(M)GlcNAc(M)Man3GlcNAc2。、GlcNAc、UDP-GlcNAc和ManNAc中的一種或多種。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括將一種或多種核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的步驟，所述核酸編碼一種或多種參與CMP-唾液酸的生物合成或轉(zhuǎn)運(yùn)的酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)重組唾液酸化糖蛋白的方法，所述宿主細(xì)胞進(jìn)行了選擇或工程改造，以產(chǎn)生包含Gal(1_4)GlcNAc(M)Man3GlcNAc2糖形的糖蛋白，所述方法包括將編碼具有唾液酸基轉(zhuǎn)移酶活性的酶的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的步驟，所述酶含有唾液酸基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞靶向信號(hào)肽，以將唾液酸基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域靶向宿主細(xì)胞的分泌途徑；其中，在重組糖蛋22白通過(guò)宿主細(xì)胞的分泌途徑時(shí)，產(chǎn)生含有NANA(M)Gal(M)GlcNAc(M)Man3GlcNA2糖形的重組糖蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞靶向信號(hào)肽將唾液酸基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域靶向分泌途徑中的位置，所述位置選自?xún)?nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和分泌嚢泡。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括將編碼一種或多種參與CMP-Sia的生物合成或轉(zhuǎn)運(yùn)的酶的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的步驟。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)重組唾液酸化糖蛋白的方法，所述宿主細(xì)胞進(jìn)行了選擇或工程改造，以產(chǎn)生包含Gal(")GlcNAc(M)Maii3GlcNAc2糖形的糖蛋白，所述方法包括將以下核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的步驟(a)編碼具有唾液酸基轉(zhuǎn)移酶活性的酶的核酸；和(b)編碼一種或多種參與CMP-Sia的生物合成或轉(zhuǎn)運(yùn)的酶的核酸；其中，在重組糖蛋白通過(guò)宿主細(xì)胞的分泌途徑時(shí)，產(chǎn)生含有NANA^)Gal(M)GlcNAc(w)Man3GlcNA2糖形的重組糖蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中具有唾液酸基轉(zhuǎn)移酶活性的酶包含唾液酸基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞靶向信號(hào)肽，以將唾液酸基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域把向宿主細(xì)胞的分泌途徑。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)重組唾液酸化糖蛋白的方法，所述宿主細(xì)胞進(jìn)行了選擇或工程改造，以產(chǎn)生包含GalGlcNAcMansGlcNAc2糖形的糖蛋白，所述方法包括將編碼具有唾液酸基轉(zhuǎn)移酶活性的酶的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的步驟，所述酶包含唾液酸基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞靶向信號(hào)肽，以將唾液酸基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域靶向宿主細(xì)胞的分泌途徑；其中，在重組糖蛋白通過(guò)宿主細(xì)胞的分泌途徑時(shí)，產(chǎn)生含有NANAGalGlcNAcMan5GlcNA2糖形的重組糖蛋白。在其它實(shí)施方案中，上述方法可進(jìn)一步包括將一種或多種額外的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的步驟，所述核酸編碼一種或多種選自糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶和糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的酶。0053在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法產(chǎn)生含有NANA<M)Gal(M)GlcNAc(M)Man3GlcNAc2糖形的重組糖蛋白。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法產(chǎn)生含有NANAGalGlcNAcMansGlcNA2糖形的重組糖蛋白。00541在某些實(shí)施方案中，可以選擇或工程改造用于要求保護(hù)的方法的宿主細(xì)胞，以包含細(xì)胞CMP-唾液酸群，或者可以在唾液酸供體(如CMP-唾液酸)存在下或在唾液酸供體的前體存在下培養(yǎng)。在某些實(shí)施方案中，可以選擇或工程改造宿主細(xì)^^，以產(chǎn)生CMP-唾液酸。在其它實(shí)施方案中，可以修飾宿主細(xì)胞，以表達(dá)一種或多種參與CMP-Sia途徑的酶活性。用于上述方法的宿主細(xì)胞可以為任何宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞沒(méi)有內(nèi)源唾液酸基轉(zhuǎn)移酶活性。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞沒(méi)有內(nèi)源CMP-Sia。在其它實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自低等真核宿主細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或植物細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自任何畢赤氏酵母屬酵母(尸/c//aw.)、任何釀酒酵母屬酵母(/S^cc/20raw7ces多形漢遜酵母(7/(mye"w/a;o/聲o/77/")、任何克魯維氏酵母屬酵母(f/矽veramyc^rsp.)、白色念珠菌(Ca"cfe/aa/6/ca朋)、任何曲霉屬物種(A戸g/tes/7.)、里氏木霉(7>/c/joiemjaree—、C7zrj^(w/7orz'w附/wc/^owe"se、4壬"f可嫌孑包菌屬^勿種(Fwsan'w附s/.)和;lB4造脈孑包霉(jVewmy/7oracnma)。0057]在其它實(shí)施方案中，用于上述方法的宿主細(xì)胞產(chǎn)生含有末端半乳糖的糖蛋白。在某些實(shí)施方案中，用于要求保護(hù)的方法的宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生含有末端半乳糖的糖蛋白。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生含有Gal(w)GlcNAc(M)Mari3GlcNAc2糖形的復(fù)合糖蛋白。在其它實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生含有GalGlcNAcMansGlcNAc2糖形的雜合糖蛋白。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括能夠產(chǎn)生含有復(fù)合NANA(M)Gal(w)GlcNAc(M)Man3GlcNAc2糖形或雜合NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2或NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重組糖蛋白的低等真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的糖蛋白組合物。在某些實(shí)施方案中，所述糖蛋白組合物可主要包含復(fù)合NANA(M)Gal(M)GlcNAc(M)Man3GlcNAc2糖形。在其它實(shí)施方案中，所述糖蛋白組合物可包含雜合NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。聚糖(Glyko,Novato,CA)和Man5GlcNAc2+Na+[b]。圖5B顯示了PNG酶由K3野生型釋放的聚糖。所示W(wǎng)-聚糖如下Man9GlcNAc2[d];Man10GlcNAc2[e];ManuGlcNA"〖f];Man12GlcNAc2[g]。圖5C圖示了導(dǎo)致產(chǎn)生Man8GlcNAc2[c]作為主要W-聚糖的ocW缺失。圖5D和5E表明，在用嵌合a-l，2-甘露糖普酶體內(nèi)修整Man8GlcNAc2后產(chǎn)生Man5GlcNAc2[b]。主要的從聚糖由質(zhì)量(m/z)為1253的峰指示，與其鑒定為Man5GlcNAc2[b]相一致。0074]圖6A-6F顯示了MALDI-TOF分析，證實(shí)了在巴斯德畢赤氏酵母中產(chǎn)生以MansGlcNAc2作為主要iV-聚糖結(jié)構(gòu)的IFN-P糖蛋白。圖6A顯示了標(biāo)準(zhǔn)Man5GlcNAc2[a]和作為標(biāo)準(zhǔn)的Man5GlcNAc2+Na+[b](Glyko,Novato,CA)。圖6B顯示了PNG酶由IFN-p野生型釋放的聚糖。圖6C表明，ocW敲除產(chǎn)生MansGlcNAc2[c];Man9GlcNAc2[d];Man1()GlcNAc2[e];MannGlcNA"[f];Man12GlcNAc2[g〗；不產(chǎn)生Man5GlcNAc2[b]。圖6D表明，在其它中間體W-聚糖Man8GlcNAc2[c〗至Man12GlcNAc2[g]中，Man5GlcNAc2[b]相對(duì)少量。圖6E表明，相對(duì)于pGC5(酉良酒酵母i^M^(m)/小鼠甘露糖普酶IBA99)產(chǎn)生的其它聚糖Man8GlcNAc2[c]和Man9GlcNAc2[d]，Man5GlcNAc2[b]的量顯著。圖6F表明，pFB8(釀酒酵母朋C"(m)/小鼠甘露糖苦酶IAA187)在分泌的糖蛋白IFN-|3上主要產(chǎn)生Man5GlcNAc2[b]。聚糖由質(zhì)量(m/z)為1254的峰指示，與其為Man5GlcNAc2[b]的身份相一致。圖9顯示了以下的高效液相層析(A)用2-AB標(biāo)記的Mari9GlcNAc2標(biāo)準(zhǔn)品(陰性對(duì)照)；(B)用pBC18-5甘露糖苷酶轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤氏酵母Joc/2/的培養(yǎng)基上清液，其證明在上清液中沒(méi)有胞外甘露糖苷酶活性；和(C)用pDD28-3轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤氏酵母Joc/j/的培養(yǎng)基上清液，其在上清液中顯示出活性(陽(yáng)性對(duì)照)。圖10A-10B顯示了UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)體在巴斯德畢赤氏酵母中生產(chǎn)GlcNAcMansGlcNAc2的活性。圖10A圖示了含有人GnTI但不含UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)體的巴斯德畢赤氏酵母菌林(YSH-3),這導(dǎo)致一定程度地產(chǎn)生GlcNAcMan5GlcNAc2[b],4旦主要產(chǎn)生Man5GlcNAc2[a]。圖10B圖示了在含有人GnTI的菌抹(PBP-3)中加入乳克魯維氏酵母(/acto)的UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)體，這導(dǎo)致主要產(chǎn)生GlcNAcMan5GlcNAc2[b]。質(zhì)量(m/z)為1457的單一主峰與其為GlcNAcMansGlcNAc2[b]的身份相一致，如在圖10B中所示。0079j圖11顯示了由在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)的pBB27-2(釀酒酵母A/AWM(s)/秀麗線蟲(chóng)(C.e/egam)甘露糖苷酶IBA31)編碼的異源甘露糖普酶的最佳pH。的身份相一致。圖12C顯示了在體外a-l，2-甘露糖苷酶消化后由ocWw朋/缺失細(xì)胞釋放的W-聚糖，對(duì)應(yīng)于與Man5GlcNAc2—致的峰。提供了含糖基化酶催化結(jié)構(gòu)域的T-DNA表達(dá)盒，所述結(jié)構(gòu)域與不同的前導(dǎo)序列按讀框融合。T-DNA的末端由右邊界(rb)和左邊界(lb)標(biāo)記。還可以使用多種啟動(dòng)子和終止子。植物選擇性標(biāo)記也是可變的。只有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化才需要右邊界和左邊界，而顆粒轟擊或電穿孔不需要。圖18顯示了小家鼠CMP-Sia合酶(GenbankAN:AJ006215;SEQIDNO:63)的ORF和氨基酸序列(SEQIDNO:64)。標(biāo)下劃線的DNA序列為已針對(duì)其設(shè)計(jì)引物來(lái)擴(kuò)增ORF的區(qū)域。圖24顯示了陽(yáng)性對(duì)照一在存在2-AB(氨基苯甲酰胺)標(biāo)記的受體聚糖并補(bǔ)加CMP-唾液酸的情況下在測(cè)定條件(實(shí)施例16)下溫育的菌林YSH99a的細(xì)胞提取物的HPLC。于23分鐘洗脫的峰對(duì)應(yīng)于雙觸角半乳糖基化N-聚糖的每個(gè)分支上的唾液酸化。于26.5分鐘洗脫的雙峰由雜質(zhì)細(xì)胞組分產(chǎn)生。圖25顯示了在存在受體聚糖且沒(méi)有外源CMP-唾液酸的情況下在測(cè)定條件(實(shí)施例16)下溫育的菌林YSH99a的細(xì)胞提取物的HPLC。于20和23分鐘洗脫的峰對(duì)應(yīng)于雙觸角半乳糖基化N-聚糖的單和雙唾液酸化。于26.5分鐘洗脫的雙峰由雜質(zhì)細(xì)胞組分產(chǎn)生。0094圖26顯示了唾液酸酶處理來(lái)自YSH99a提取物溫育的N-聚糖。示于圖25的樣品在100U唾液酸酶(NewEnglandBiolabs，Beverley,MA)存在下于37°C過(guò)夜溫育。圖25中于20和23分鐘洗脫的、對(duì)應(yīng)于單和雙唾液酸化N-聚糖的峰已被除去。保留了于26分鐘的雜質(zhì)峰。0095圖27顯示了市售的單和雙唾液酸化N-聚糖標(biāo)準(zhǔn)品。于20和23分鐘洗脫的峰對(duì)應(yīng)于單和雙唾液酸化的市售標(biāo)準(zhǔn)品Al和A2(GlykoInc.,SanRafael,CA)。圖33顯示了在實(shí)施例17中描述的密碼子優(yōu)化的hST6Gal前導(dǎo)序列53融合體的核酸序列(SEQIDNO:101)和氨基酸序列(SEQIDNO:102)。本文使用的縮寫(xiě)在本領(lǐng)域是通用的，參見(jiàn)例如以上糖的縮寫(xiě)。其它通用縮寫(xiě)包括"PNG酶"，其是指肽N-糖苷酶F(EC3.2.2.18);"GlcNAcTr"或"GnT"是指W-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶；"NANA"是指W-乙酰神經(jīng)氨酸。本文使用的"人源化糖蛋白"或"人樣糖蛋白"可交替地指具有低于4個(gè)甘露糖殘基的N-聚糖與其連接的蛋白和具有至少5個(gè)甘露糖殘基的合成糖蛋白中間體(其也是有用的，可在體內(nèi)或體外進(jìn)一步操作)。優(yōu)選地，按照本發(fā)明產(chǎn)生的糖蛋白至少短暫地含有至少3034mol%、優(yōu)選至少40moP/o及更優(yōu)選50-100mol。/。的Man5GlcNAc2中間體。這可以例如通過(guò)工程改造本發(fā)明的宿主細(xì)胞以表達(dá)"更好的"(即更有效的)糖基化酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，選擇甘露糖普酶，使得其在宿主細(xì)胞中對(duì)蛋白進(jìn)行糖基化的位置存在的條件下具有最佳活性，并優(yōu)選通過(guò)將該酶靶向需要活性的宿主細(xì)胞器導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。當(dāng)涉及核酸或其片段時(shí)，術(shù)語(yǔ)"顯著比對(duì)性"、"顯著同源性"或"顯著相似性"是指當(dāng)與另一個(gè)核酸(或其互補(bǔ)鏈)進(jìn)行含有適當(dāng)核苷酸插入或缺失的最佳比對(duì)時(shí)，如通過(guò)序列同一性的任一公知算法(如上述的FASTA、BLAST或Gap)所測(cè)量的，至少約50%、更優(yōu)選60%的核苷酸堿基，通常至少約70%、更通常至少約80%、優(yōu)選至少約90%以及更優(yōu)選至少約95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸堿基存在核普酸序列同一性。術(shù)語(yǔ)"分離的蛋白質(zhì)"或"分離的多肽"是這樣的蛋白質(zhì)或多肽根據(jù)其起源或衍生來(lái)源，其(l)不與在天然狀態(tài)中與其伴隨的天然結(jié)合組分結(jié)合，(2)當(dāng)以未見(jiàn)于自然界的純度存在時(shí)，其中純度可參照其它細(xì)胞材料的存在而得以判定(例如，不含來(lái)自相同物種的其它蛋白)，(3)被來(lái)自不同物種的細(xì)胞所表達(dá)，或者(4)不存在于自然界中(例如，其是在自然界中發(fā)現(xiàn)的多肽的片段，或其包含未見(jiàn)于自然界的氨基酸類(lèi)似物或衍生物，或包含除標(biāo)準(zhǔn)肽鍵之外的其它4定)。因此，化學(xué)合成的或在與其天然起源的細(xì)胞不同的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的多肽，將是與其天然結(jié)合的組分"分離的"。還可采用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，通過(guò)分離使多肽或蛋白質(zhì)基本上不含天然結(jié)合的組分。由此定義，"分離的"并非必然要求所迷蛋白質(zhì)、多肽、肽或寡肽已經(jīng)從其天然環(huán)境中物理地取出。當(dāng)"同源的"應(yīng)用于蛋白質(zhì)或肽時(shí)，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，不相同的殘基位置通常差別在于保守的氨基酸取代。"保守的氨基酸取代"43是其中一氨基酸殘基被另一具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的側(cè)鏈(R基團(tuán))的氨基酸殘基所取代。通常，保守氨基酸取代基本上不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能特性。當(dāng)兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列由于保守取代而彼此不同時(shí)，百分比序列同一性或同源性程度可^Jl調(diào)，以校正取代的保守特性。進(jìn)行這種調(diào)整的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參見(jiàn)例如Pearson等，1994，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。進(jìn)行同源性比較的多肽序列的長(zhǎng)度一般是至少約16個(gè)氨基酸殘基，通常至少約20個(gè)殘基，更通常至少約24個(gè)殘基，一般至少約28個(gè)殘基，以及優(yōu)選地多于約35個(gè)殘基。當(dāng)檢索包含源于大量不同生物的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，優(yōu)選比較氨基酸序列。采用氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的非blastp的算法進(jìn)行測(cè)量。例如，可以利用FASTA(GCG6.1版中的程序)來(lái)比較多肽序列。FASTA提供查詢(xún)和檢索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對(duì)和百分比序列同一性(Pearson,1990,通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。例如，氨基酸序列之間的百分比序列同一性可用采用其默認(rèn)參數(shù)(字長(zhǎng)為2和PAM250評(píng)分矩陣)的FASTA來(lái)確定，該程序在GCG6.1版中提供，通過(guò)引用結(jié)合到本文中。術(shù)語(yǔ)"融合蛋白"是指包含與異源氨基酸序列偶聯(lián)的多肽或片段的多肽。融合蛋白是有用的，因?yàn)樗鼈兛杀粯?gòu)建為含有來(lái)自?xún)煞N或更多種不同蛋白的兩種或更多種所需功能元件。融合蛋白包含來(lái)自目標(biāo)多肽的至少10個(gè)連續(xù)氛基酸，更優(yōu)選地至少20或30個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選地至少40、50或60個(gè)氨基酸，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少75、100或125個(gè)氨基酸。融合蛋白可如下重組生產(chǎn)構(gòu)建與編碼不同蛋白或肽的核酸序列符合讀框地編碼多肽或其片段的核酸序列，然后表達(dá)融合蛋白?；蛘?，可通過(guò)將多肽或其片段與另一蛋白交聯(lián)而化學(xué)生產(chǎn)融合蛋白。本文使用的術(shù)語(yǔ)"區(qū)域"是指生物分子一級(jí)結(jié)構(gòu)中的物理毗鄰部分。就蛋白而言，區(qū)域由該蛋白的氨基酸序列的毗鄰部分確定。本文使用的術(shù)語(yǔ)"分子"是指任何化合物，包括但不限于小分子、肽、蛋白質(zhì)、糖、核苦酸、核酸、脂質(zhì)等，且這種化合物可以是天然的或合成的。編碼UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶的基因縮寫(xiě)為"A^wC"。編碼唾液酸合酶的基因縮寫(xiě)為"A^mW。編碼CMP-唾液酸合酶的基因縮寫(xiě)為"A^""。和ManNAc。因此，提供已改變的宿主細(xì)胞從而可提供"唾液酸供體"，所述已改變的宿主細(xì)胞含有一種或多種糖核苷酸前體，例如UDP-GlcNAc或ManNAc,具有功能性酶活性從而將這些分子轉(zhuǎn)變?yōu)镃MP-唾液酸。宿主細(xì)胞可具有這樣的內(nèi)源性酶活性，或者可被工程改造，以表達(dá)能夠?qū)DP-GlcNAc或ManNAc轉(zhuǎn)變?yōu)镃MP-Sia的酶。在其它實(shí)施方案中，可在含有將前體分子轉(zhuǎn)變?yōu)橥僖核峁w必需的酶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供一種在非人真核宿主細(xì)胞中生產(chǎn)具有人樣糖基化作用的糖蛋白的方法。如下文更詳細(xì)的描述，選擇天然不表達(dá)或經(jīng)工程改造不表達(dá)一種或多種參與產(chǎn)生高甘露糖結(jié)構(gòu)的酶的真核宿主細(xì)胞作為起始宿主細(xì)胞。對(duì)此選定的宿主細(xì)胞進(jìn)行工程改造，以表達(dá)一種或多種酶或產(chǎn)生人樣糖蛋白需要的其它因子。每次可對(duì)所需宿主菌林進(jìn)行一種酶或一種以上的酶的工程改造。另外，可使用編碼一種或多種酶或活性的核酸分子工程改造本發(fā)明的宿主菌抹。優(yōu)選地，產(chǎn)生編碼潛在有用的酶(例如，含有按讀框與異源亞細(xì)胞把向序列連接的催化活性酶片段的嵌合酶)的核酸分子文庫(kù)(例如，通過(guò)連接含有酶促片段和亞細(xì)胞靶向序列的亞文庫(kù))，并可以通過(guò)用該文庫(kù)的一個(gè)或多個(gè)成員轉(zhuǎn)化靶宿主細(xì)胞，選擇含一種或多種具有最佳活性的酶或產(chǎn)生最"似人"或需要的糖蛋白的菌抹。因此，由選定的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的部分或全部Man5GlcNAc2必須是沿著哺乳動(dòng)物糖基化途徑的酶活性的生產(chǎn)性底物，例如可以在體內(nèi)用作GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I活性的底物，由此在宿主細(xì)胞中形成人樣N-聚糖中間體GlcNAcMaii5GlcNAc2。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的Man5GlcNAc2中間體的至少10%、更優(yōu)選至少30%、最優(yōu)選50%以上為體內(nèi)GnTI的生產(chǎn)性底物。要理解的是，例如，如果在靶蛋白上GlcNAcMansGlcNAc2以10%產(chǎn)49生，MansGlcNAc2以25%產(chǎn)生，則短暫產(chǎn)生的Man5GlcNAc2的總量為35%,因?yàn)镚lcNAcMansGlcNAc2為Man5GlcNAc2的產(chǎn)物。和唾液酸[例如唾液酸基轉(zhuǎn)移酶、CMP-Sia]的底物，以產(chǎn)生本發(fā)明的雜合N-聚糖。01721本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以由在體內(nèi)產(chǎn)生顯著水平的Man5GlcNAc2的天然(例如既有的)真菌或其它低等真核生物選擇宿主細(xì)胞。然而，迄今為止，還沒(méi)有低等真核生物顯示出在體內(nèi)以超過(guò)1.8%的總N-聚糖提供這類(lèi)結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)例如Maras,1997)?；蛘撸蓪?duì)這些宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造，以在體內(nèi)產(chǎn)生Mari5GlcNAc2結(jié)構(gòu)?？墒褂美缭诿绹?guó)專(zhuān)利第5,595,900號(hào)中描述的方法來(lái)鑒定目標(biāo)靶宿主細(xì)胞或生物中是否存在特定糖基轉(zhuǎn)移酶、甘露糖苷酶和糖核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。不需要的宿主細(xì)胞糖基化酶的失活本發(fā)明的方法涉及制備宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞產(chǎn)生具有改變的并優(yōu)選人樣的N-聚糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法涉及制備其中富含Man5GlcNAc2的寡糖前體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，使用不表達(dá)一種或多種參與產(chǎn)生高甘露糖結(jié)構(gòu)的酶的真核宿主細(xì)胞。此宿主細(xì)胞可天然存在，或者可以進(jìn)行工程改造，例如由酵母的許多已描述的這類(lèi)突變體中的一種起始或衍生。因此，根據(jù)選定的宿主細(xì)胞，可能必須缺失編碼已知為非人糖基化反應(yīng)特有的酶的一種或眾多基因。這類(lèi)基因及其相應(yīng)蛋白已在眾多低等真核生物(例如釀酒酵母、里氏木霉、構(gòu)巢曲霉(Am'^/a"力等)中廣泛表征，由此提供了在低等真核生物中已知的糖基轉(zhuǎn)移酶、它們的活性和它們各自的遺傳序列的清單。這些基因有可能選自甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，例如1,3甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(例如釀酒酵母中的MAW7)(Graham,1991)、1,2甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(例如釀酒酵母的f77/^R￡家族)、1,6甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(釀酒酵母的(9C/^)、甘露糖基磷酸轉(zhuǎn)移酶及其調(diào)節(jié)物(釀酒酵母的MVA^和A/AW6)和其它參與異常(即非人)的糖基化反應(yīng)的酶。這些基因有許多實(shí)際上已單獨(dú)缺失，產(chǎn)生糖基化譜改變的存活表型。實(shí)例示于表l?；蛘?，如果已知具體的目標(biāo)宿主細(xì)胞(例如真菌)的完整基因組序列，則人們可以通過(guò)檢索可由幾個(gè)來(lái)源如NCBI、Swissprot獲得的公眾可用的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)簡(jiǎn)單地鑒定這些基因。例如，通過(guò)用已知的1,6甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因(例如釀酒酵母的OCZ/7)的序列檢索給定的基因組序列或數(shù)據(jù)庫(kù)，人們可以在該宿主細(xì)胞基因組中鑒定可0旦不是必須地)編碼具有1,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的高同源性基因。然而，單獨(dú)的核酸序列同源性不足以證實(shí)人們已鑒定并分離出編碼具有相同活性的酶的同源物。例如，迄今為止，沒(méi)有數(shù)據(jù)表明(9C/i7缺失在巴斯德畢赤氏酵母中消除了至關(guān)重要的起始1,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性。(Martinet,1998;WO02/00856A2)。因此，沒(méi)有數(shù)據(jù)證實(shí)巴斯德畢赤氏酵母(9C7//基因同源物實(shí)際上編碼該功能。該證實(shí)在本文首次提供。已使用這些方法在巴斯德畢赤氏酵母中鑒定出幾種釀酒酵母甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的同源物。同源基因經(jīng)常與在釀酒酵母中參與甘露糖基化蛋白的基因具有類(lèi)似的功能，因此它們的缺失可用于在巴斯德畢赤氏酵母中操作糖基化才莫式，或者以此類(lèi)推，可用于在具有類(lèi)似糖基化途徑的任何其它宿主細(xì)胞如真菌、植物、昆蟲(chóng)或動(dòng)物細(xì)胞中操作糖基化一莫式。如果要敲除幾個(gè)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，則例如由Alani,1987開(kāi)發(fā)的方法能夠重復(fù)使用選擇性標(biāo)記(如酵母中的f/M3標(biāo)記)，以順序消除所有不需要的內(nèi)源甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性。該技術(shù)已由其它人改進(jìn)，但基本上包括使用兩個(gè)側(cè)接相對(duì)選擇性標(biāo)記的重復(fù)DNA序列。例如L/7M3可以用作標(biāo)記，以確保選擇已整合構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體。通過(guò)側(cè)接標(biāo)記和定向重復(fù)序列，人們可首先選擇已整合構(gòu)建體并因此破壞耙基因的轉(zhuǎn)化體。在分離轉(zhuǎn)化體并表征它們之后，人們可以在第二輪相反地選擇抗5-氟乳清酸(5-FOA)的那些轉(zhuǎn)化體。能夠在含有5-FOA的平板上存活的菌落再通過(guò)包含早前提及的重復(fù)序列的交換事件已失去WM3標(biāo)記。該方法因此允許重復(fù)使用同一標(biāo)記，并有利于破壞多個(gè)基因，而不需要另外的標(biāo)記。還可以使用采用其它選擇性和反選擇性標(biāo)記的類(lèi)似技術(shù)，順序消除適用于另一種真核宿主細(xì)胞的基因。消除巴斯德畢赤氏酵母中的特定甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，例如1,6甘露糖基轉(zhuǎn)移酶((9(:///)或甘露糖基磷酸轉(zhuǎn)移酶(^]^6,或補(bǔ)充突變體的基因)或調(diào)節(jié)物(MMW),能使人們產(chǎn)生該生物的工程改造菌林，這些菌林主要合成Mari8GlcNAc2,并可用于進(jìn)一步修飾糖基化才莫式，以類(lèi)似于更復(fù)合的糖形結(jié)構(gòu)，例如在哺乳動(dòng)物如人細(xì)胞中產(chǎn)生的糖形結(jié)構(gòu)。該方法的優(yōu)選實(shí)施方案利用編碼生物化學(xué)糖基化活性的DNA序列來(lái)消除巴斯德畢赤氏酵母中的類(lèi)似或相同生物化學(xué)功能，以修飾在遺傳改變的巴斯德畢赤氏酵母菌抹中產(chǎn)生的糖蛋白的糖基化結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的優(yōu)選宿主細(xì)胞為低等真核細(xì)胞，例如酵母、單細(xì)胞和多細(xì)胞或絲狀真菌。然而，設(shè)想了多種多樣可用于本發(fā)明方法的宿主細(xì)胞。例如，可工程改造植物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞，以表達(dá)本發(fā)明的人樣糖蛋白(實(shí)施例19和20)。同樣，可以使用本發(fā)明的方法改變多種非人哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，以表達(dá)更具人樣或改變的糖蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，任何真核宿主細(xì)胞(包括人細(xì)胞)都可與本發(fā)明文庫(kù)聯(lián)合使用，以表達(dá)一種或多種被靶向宿主細(xì)胞中的亞細(xì)胞位置如細(xì)胞器的嵌合蛋白，在所述亞細(xì)胞位置，蛋白的活性被改變，優(yōu)選被增強(qiáng)。這樣的蛋白優(yōu)選但不是必須地為參與蛋白糖基化的酶，如本文所例舉。設(shè)想可使用本文描述的方法在真核宿主細(xì)胞中使任何蛋白編碼序列被靶向并根據(jù)改變的活性對(duì)其進(jìn)行選擇。形成復(fù)合N-聚糖合成是一個(gè)順序過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程，特定的糖殘基被除去，并連接至核心寡糖結(jié)構(gòu)。在高等真核生物中，這通過(guò)使底物順序接觸多種加工酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些酶^f艮據(jù)其在整個(gè)加工級(jí)聯(lián)中的具體位置進(jìn)行特定的反應(yīng)。該"裝配線"由ER、(早期、中期和晚期)高爾基體和高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)組成，它們?nèi)慷季哂衅涮囟ǖ募庸きh(huán)境。為了在低等真核生物的高爾基體和ER中再建立人糖蛋白的加工，必須表達(dá)多種酶(例如糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶、磷酸酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體)，并將其特異性靶向這些細(xì)胞器，并優(yōu)選地處于使它們相對(duì)于它們的環(huán)境以及途徑中的其它酶更有效發(fā)揮作用的位置。添加的轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白將核苷酸糖由胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中，在那里核苷酸糖可通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，例如延長(zhǎng)W-聚糖。該反應(yīng)釋放核苷二》癢酸或一f壽酸，例如UDP、GDP或CMP。核苷一》岸酸可以通過(guò)反向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制直接由高爾基體輸出，交換核苦三磷酸糖。然而，核苷二磷酸的累積抑制糖基轉(zhuǎn)移酶的其它活性。由于該反應(yīng)似乎對(duì)有效的糖基化很重要，所以經(jīng)常需要提供編碼核苷酸二磷酸酶的基因的表達(dá)拷貝。二磷酸酶(視情況對(duì)UDP或GDP是特異性的)水解二磷酸核普，以產(chǎn)生核苷一磷酸和無(wú)機(jī)磷酸。0203以下描述了通常為哺乳動(dòng)物來(lái)源的適宜的轉(zhuǎn)運(yùn)體酶?？墒褂帽景l(fā)明的方法將這樣的酶工程改造入選定的宿主細(xì)胞中(另參見(jiàn)實(shí)施例7-10)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生含Maii5GlcNAc2的糖蛋白的方法。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將編碼一種或多種參與由MangGlcNAc2或Man9GlcNAc2產(chǎn)生Man5GlcNAc2的甘露糖苷酶活性的核酸分子導(dǎo)入宿主中。融合構(gòu)建體或蛋白的催化結(jié)構(gòu)域組分優(yōu)選來(lái)源于糖苷酶、甘露糖苷酶或糖基轉(zhuǎn)移酶活性，這些活性來(lái)源于以下成員GnTI、GnTII、GnTIII、GnTIV、GnTV、GnTVI、GalT、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸基轉(zhuǎn)移酶。催化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選具有在該酶定位的細(xì)胞器中的其它代表性酶的最適平均pH的1.4pH單位之內(nèi)的最適pH，或者于5.1-8.0之間的pH具有最佳活性。選擇糖基化酶pH優(yōu)化和亞細(xì)胞定位因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案將選定的糖基化酶(或其催化結(jié)構(gòu)域)如a-甘露糖苷酶靶向宿主細(xì)胞中的亞細(xì)胞位置(例如細(xì)胞器)，在那里所述酶或結(jié)構(gòu)域的最適pH在位于同一細(xì)胞器中的其它代表性標(biāo)記酶的最適平均pH的1.4pH單位之內(nèi)。被耙向特定細(xì)胞器的酶的最適pH應(yīng)與在同一細(xì)胞器中存在的其它酶的最適pH匹配，以最大化所獲得的每單位酶的活性。表3匯總了多種來(lái)源的甘露糖苷酶的活性及其對(duì)應(yīng)的最適pH。表4匯總了它們的典型的亞細(xì)胞定位。表3.甘露糖苷酶及其最適pH齋藤曲霉a-l,2-甘露糖苷酶5.0Ichishima，1999里氏木霉a-l，2-甘露糖普酶5.0M謹(jǐn)，2000柑桔青霉a-D-l,2-甘露糖苦5.0Yoshida,1993酶秀麗線蟲(chóng)a-l,2-甘露糖苦酶5.5參見(jiàn)圖11構(gòu)巢曲霉a-l,2-甘露糖苷酶6.0Eades和Hintz,2000人IA(高爾基體)a-l,2-甘露糖普酶6.0人IB(高爾基體)a-l，2-甘露糖普酶6.0鱗翅類(lèi)I型a-l,2-Maii6-甘6.0Ren，1995(丄ep油,ra")昆露糖香酶蟲(chóng)細(xì)月包人a-D-甘露糖苷酶6.0Chandrasekaran,1984a-l,2,3-甘露糖苷6.0美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,300,113酶66來(lái)源酶最適pH參考文獻(xiàn)體)芽孢桿菌屬a-D-l,2-甘露糖苷7.0Maruyama,1994泌的)本發(fā)明的某些方法優(yōu)選(但不是必須地)使用一個(gè)或多個(gè)核酸文庫(kù)進(jìn)行。本發(fā)明的組合核酸文庫(kù)的示例性特征在于其含有編碼細(xì)胞耙向信號(hào)肽的序列和編碼被靶向的蛋白(例如酶或其催化結(jié)構(gòu)域，包括但不限于介導(dǎo)糖基化的那些)的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合核酸文庫(kù)包含(a)至少兩個(gè)編碼不同細(xì)胞靶向信號(hào)肽的核酸序列；和(b)至少一個(gè)編碼被靶向的多肽的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合核酸文庫(kù)包含(a)至少一個(gè)編碼細(xì)胞靶向信號(hào)肽的核酸序列；和(b)至少兩個(gè)編碼;〖皮靶向到宿主細(xì)胞中的多肽的核酸序列。如下文進(jìn)一步描述，連接來(lái)源于(a)的核酸序列和來(lái)源于(b)的核酸序列，產(chǎn)生一種或多種編碼功能連接目標(biāo)多肽結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞靶向信號(hào)肽的融合構(gòu)建體。功能鍵的一個(gè)實(shí)例是當(dāng)細(xì)胞靶向信號(hào)肽以相同翻譯讀框("按讀框")連接至目標(biāo)多肽結(jié)構(gòu)域時(shí)。使用本發(fā)明的組合DNA文庫(kù)產(chǎn)生的融合構(gòu)建體的其它方面是，它們能夠在工程改造的宿主細(xì)胞中足量并經(jīng)常接近完全胞內(nèi)的W-聚糖修整活性。由本發(fā)明的組合DNA文庫(kù)產(chǎn)生的優(yōu)選融合構(gòu)建體編碼糖基化酶，例如甘露糖苷酶，該酶有效定位于胞內(nèi)宿主細(xì)胞區(qū)室，由此表現(xiàn)出非常小且優(yōu)選沒(méi)有胞外活性。編碼甘露糖苦酶的本發(fā)明的優(yōu)選融合構(gòu)建體顯示出定位于修飾//-聚糖的位置，即ER和高爾基體。本發(fā)明的融合酶被靶向分泌途徑中這樣的特定細(xì)胞器在那里融合酶定位并作用于A^聚糖，例如MangGlcNAc2，在目標(biāo)糖蛋白上產(chǎn)生Man5GlcNAc2。70|0234如分別在圖5和圖6中所示(另參見(jiàn)實(shí)施例2和11)，由本發(fā)明的組合DNA文庫(kù)產(chǎn)生的酶可以修飾目標(biāo)糖蛋白上的W-聚糖，如對(duì)巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)的K3或IFN-(3蛋白所顯示。然而，要認(rèn)識(shí)到的是，可以此方式進(jìn)行糖基化的其它類(lèi)型的糖蛋白，包括但不限于促紅細(xì)胞生成素、細(xì)胞因子(例如干擾素-a、干擾素-|3、干擾素-Y、干擾素-co和粒細(xì)胞-CSF)、凝血因子(例如VIII因子、IX因子)和人C蛋白、可溶性IgE受體a-鏈、IgG、IgG片段、IgM、白介素、尿激酶、凝乳酶和脲胰蛋白酶抑制劑、IGF結(jié)合蛋白、表皮生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)激素釋放因子、膜聯(lián)蛋白V融合蛋白、血管生成抑制素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-2、骨髓祖細(xì)胞抑制因子-1、骨保護(hù)素、ot-l抗胰蛋白酶、DNA酶II、oc-甲胎蛋白、AAT、rhTBP-l(奧那西普，akaTNF結(jié)合蛋白1)、TACWg(跨膜激活劑及鈣調(diào)節(jié)劑及親環(huán)蛋白配體相互作用分子)、FSH(促卵泡激素)、GM-CSF、GLP-1w/和w/oFC(胰高血糖素樣蛋白1)、IL-1受體激動(dòng)劑、sTNFr(依那西普，aka可溶性TNF受體Fc融合體)、ATIII、rhThrombin(重組人凝血酶)、葡糖腦苷脂酶和CTLA4-Ig(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4-Ig)。構(gòu)建融合構(gòu)建體的組合DNA文庫(kù)0235融合構(gòu)建體的組合DNA文庫(kù)的特征在于一種或多種細(xì)胞靶向信號(hào)肽("靶向肽")，其一般來(lái)源于天然蛋白的N-末端結(jié)構(gòu)域(例如通過(guò)產(chǎn)生C-末端缺失)。然而，某些靶向肽來(lái)源于天然蛋白(例如S五CJ2)的C-末端。ER或高爾基體的膜結(jié)合蛋白優(yōu)選用作靶向肽序列的來(lái)源。這些蛋白具有編碼胞質(zhì)尾(ct)、跨膜結(jié)構(gòu)域(tmd)和長(zhǎng)度可變的莖區(qū)(sr)的序列。這些區(qū)域可通過(guò)蛋白序列比對(duì)和與已知同源物和/或其它定位蛋白比較(例如比較疏水性圖)來(lái)識(shí)別。靶向肽相對(duì)于II型膜的部分在本文^皮標(biāo)示為短(s)、中(m)和長(zhǎng)(l)。標(biāo)示為短(s)的靶向肽序列對(duì)應(yīng)于膜結(jié)合蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域(tmd)。標(biāo)示為長(zhǎng)(l)的靶向肽序列對(duì)應(yīng)于跨膜結(jié)構(gòu)域(tmd)和莖區(qū)(sr)的長(zhǎng)度。標(biāo)示為中(m)的靶向肽序列對(duì)應(yīng)于跨膜結(jié)構(gòu)域(tmd)和約一半長(zhǎng)度的莖區(qū)(sr)。催化結(jié)構(gòu)域區(qū)在本文由相對(duì)于其野生型糖基化酶的核香酸缺失數(shù)指示。亞文庫(kù)在某些情況下，本發(fā)明的組合核酸文庫(kù)可由既有的或野生型基因直接組裝。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA文庫(kù)由兩個(gè)或更多個(gè)亞文庫(kù)的融合體組裝。通過(guò)亞文庫(kù)的按讀框連接，有可能產(chǎn)生大量新的遺傳構(gòu)建體，其編碼有用的被靶向的蛋白結(jié)構(gòu)域，例如具有糖基化活性的那些。編碼糖基化活性的催化結(jié)構(gòu)域亞文庫(kù)10238一個(gè)有用的亞文庫(kù)包括編碼諸如以下酶的DNA序列糖苷酶(例如甘露糖苷酶)、糖基轉(zhuǎn)移酶(例如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶)、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶和唾液酸基轉(zhuǎn)移酶。催化乳動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)、爬行動(dòng)物、藻類(lèi)或真菌酶全都是有用的，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行選擇，以提供就溫度和最適pH而言廣泛的生物化學(xué)特性譜。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因被截短，以產(chǎn)生其中一些編碼酶的催化結(jié)構(gòu)域的片段。通過(guò)除去內(nèi)源靶向序列，則可在其它細(xì)胞基因座中重定向和表達(dá)這些酶。0239這些催化結(jié)構(gòu)域的選擇可由其中催化結(jié)構(gòu)域隨后被活化的具體環(huán)境的信息指導(dǎo)。例如，如果特定的糖基化酶在晚期高爾基體中被活化，且宿主生物的所有已知酶在晚期高爾基體中都具有一定的最適pH,或者已知晚期高爾基體具有特定pH，則如上所述選擇在該pH表現(xiàn)出足夠的且優(yōu)選最大的活性的催化結(jié)構(gòu)域。靶向肽序列亞文庫(kù)0240j另一個(gè)有用的亞文庫(kù)包括編碼靶向信號(hào)肽的核酸序列，其導(dǎo)致蛋白定位于ER、高爾基體或高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的特定相關(guān)生物。一般而言，這些序列分為3類(lèi)(l)編碼胞質(zhì)尾(ct)、跨膜結(jié)構(gòu)域(tmd)以及部分或全部莖區(qū)(sr)的N-末端序列，其一起或單獨(dú)地將蛋白錨定至高爾基體的內(nèi)(腔)膜;(2)—般存在于C-末端的滯留信號(hào)，例如HDEL(SEQIDNO:5)或KDEL(SEQIDNO:6)四肽；和(3)多種蛋白的跨膜區(qū)，例如已知在高爾基體中定位的核苷酸糖轉(zhuǎn)運(yùn)體。0241]在其中靶向肽由多種元件(ct、tmd和sr)組成的第一種情況下，設(shè)計(jì)文庫(kù)，使得提供ct、tmd和莖區(qū)的多個(gè)部分。因此，耙向肽序列亞文庫(kù)的優(yōu)選實(shí)施方案包括ER或高爾基體的膜結(jié)合蛋白的ct、tmd和/或sr序列。在某些情況下，可能需要提供sr序列長(zhǎng)度可變的亞文庫(kù)。這可以使用結(jié)合編碼胞質(zhì)區(qū)的DNA的5，末端的引物并使用一系列結(jié)合莖區(qū)的多個(gè)部分的反向引物通過(guò)PCR實(shí)現(xiàn)。0242]靶向肽序列的其它有用的來(lái)源包括滯留信號(hào)肽，例如四肽HDEL(SEQIDNO:5)或KDEL(SEQIDNO:6)，它們通常存在于蛋白的C-末端，這些蛋白被逆行轉(zhuǎn)運(yùn)到ER或高爾基體中。耙向肽序列的其它來(lái)源包括(a)II型膜蛋白，(b)列于表3的酶，(c)位于高爾基體中的跨膜核普酸糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，和(d)在表5中提到的序列。(列1中的HDEL信號(hào)，在SEQIDNO:5中顯示的細(xì)胞8)。表5.有用的區(qū)室靶向序列的來(lái)源<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>在任何情況下都高度優(yōu)選的是，選擇這樣的靶向肽序列其適于一種或多種特定的酶活性，以在所需的糖基化反應(yīng)次序中最佳地發(fā)揮作用。例如，在開(kāi)發(fā)能夠末端唾液酸化初生W-聚糖(這是一種在人的晚期高爾基體中發(fā)生的過(guò)程)的改性微生物時(shí)，需要利用來(lái)源于晚期高爾基體蛋白的靶向肽序列的亞文庫(kù)。同樣，a-l，2-甘露糖苷酶修整MansGlcNAc2以產(chǎn)生MansGlcNAc2在人的復(fù)合W-聚糖形成中是早期步驟(圖1B)。因此，需要使該反應(yīng)在工程改造的宿主微生物的ER或早期高爾基體中發(fā)生。使用編碼ER和早期高爾基體滯留信號(hào)的亞文庫(kù)。當(dāng)轉(zhuǎn)化至宿主中的核酸如DNA文庫(kù)包含大量序列多樣性而由此增加至少一個(gè)轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出期望表型的可能性時(shí)，本實(shí)施方案的方法是最有效的。例如，單氨基酸突變可巨大地改變糖蛋白加工酶的活性(Romero等，2000)。因此，在轉(zhuǎn)化之前，可對(duì)DNA文庫(kù)或組成亞文庫(kù)實(shí)施一種或多種技術(shù)，以產(chǎn)生另外的序列多樣性。例如，可以實(shí)施一輪或多輪的基因改組、易錯(cuò)PCR、體外誘變或產(chǎn)生序列多樣性的其它方法，以在融合構(gòu)建體庫(kù)中獲得較大的序列多樣性。表達(dá)控制序列適宜的載體組分，例如選擇性標(biāo)記、表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子等)以及任選地在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制所需的序列，可根據(jù)所選的具體宿主細(xì)胞的功能進(jìn)行選擇。用于特定哺乳動(dòng)物或低等真核生物宿主細(xì)胞的適宜載體組分的選擇標(biāo)準(zhǔn)是常規(guī)的。本發(fā)明優(yōu)選的低等真核生物宿主細(xì)胞包括但不限于任何畢赤氏酵母屬酵母(尸/c//a^.)，包括但不限于巴斯德畢赤氏酵母(尸/c//apa^0^)、尸z'c/n'fl力"/a"血fl、喜海藻糖畢赤氏酵母(尸z'c/n'af^o/o;M(3)、尸/c/i/a！A:octomae、膜醭畢赤氏酵母(尸/c/2/a附ew6ra"ae》c/em)、尸/c/2/aopw/i"'ae、76尸/c//aAerwoto/era7W、杉卩畢赤氏酵母(尸/c/n'asa/Zcton'(7)、尸/c//agz/en:wwOT、皮杰普氏畢赤氏酵母(尸/c//a/z》en')、具柄畢赤氏酵母(尸/c/h力對(duì)z》to)和曱醇畢赤氏酵母(尸/c/2/a任何釀酒酵母屬(Sacdwraw少cM5/.)，包4舌j旦不卩艮于酉良酒酵母(5"acc/j"raw少ce5cerev/57'ae);多形漢遜氏酵母(//"""肌/0po(y歸rp/2");任何克魯維氏酵母屬(A7w"eraw^c^包括但不限于乳克魯維氏酵母(A7w少veraw少cm/acto);白色念珠菌(Ca"oWaa/6/cow);構(gòu)巢曲霉(Ay/ergz7/ws"/c/m/""j);黑曲霉(As/7erg7'〃w5"m'ger);米曲霉(As/erg7'〃M5"o，ae);里氏木霉(7Wc/0(5fenwamyee/);my/o尸/wm/wc^7ow/iye;任何鐮孢菌屬(Fw犯nww取)，包括但不限于禾赤鐮孢菌(fkycrn'wmgrar/m'"ew附)牙口vewe"af^/w;以及4且#造鏈孑包霉(A^w廠as/orarcms犯)。在宿主為巴斯德畢赤氏酵母(尸/c/2/apa對(duì)or&)的情況下，適宜的啟動(dòng)子包括例如」OY7、爿(9^2、GAPDH和PW啟動(dòng)子。選擇性標(biāo)i己0249]還優(yōu)選為每個(gè)構(gòu)建體提供至少一個(gè)選擇性標(biāo)記，諸如賦予抗藥性的基因或補(bǔ)足宿主代謝損傷的基因。標(biāo)記的存在可用于隨后轉(zhuǎn)化體的選擇；例如在酵母中，可使用L%43、/i7W、SUC2、GWS、5Z^或S/Z^^基因。多種選擇性標(biāo)記是已知的，并適用于酵母、真菌、植物、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物和其它真核生物宿主細(xì)胞。通過(guò)可選地失述于US2004/0229306、US2005/0170452和Nett,2005,這些文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。該方法包括(a)用第一個(gè)選擇性標(biāo)記失活參與合成氨基酸或核普酸的途徑中的第一個(gè)酵母基因，所述氨基酸或核苷酸選自腺噪呤、精氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸、曱硫氨酸、脯氨酸和尿嘧啶，由此使宿主成為該氨基酸或核苷酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型；然后(b)使用在(a)中失活的酵母基因作為第二個(gè)選擇性標(biāo)記失活第二個(gè)酵母基因，第二個(gè)酵母基因所來(lái)自的途徑與在(a)中失活的途徑不同，參與氛基酸或核苷酸的合成，所述氨基酸或核苷酸選自腺噪呤、精氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸、曱硫氨酸、脯氨酸和尿嗜啶。轉(zhuǎn)化然后將核酸文庫(kù)轉(zhuǎn)化入宿主生物中。在酵母菌中，可以使用任何方便的DNA轉(zhuǎn)移方法，諸如電穿孔、氯化鋰法或原生質(zhì)球法。在絲狀真菌和植物細(xì)胞中，方便的方法包括粒子轟擊、電穿孔和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。為了產(chǎn)生適于高密度培養(yǎng)(例如酵母發(fā)酵)的穩(wěn)定菌抹，需要將DNA文庫(kù)構(gòu)建體整合至宿主染色體中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，通過(guò)同源重組進(jìn)行整合。例如，給DNA文庫(kù)元件提供與宿主生物序列同源的側(cè)翼序列。以這種方式，整合發(fā)生在宿主基因組中的確定位點(diǎn)，而不破壞所需的或必需的基因。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將文庫(kù)DNA整合到宿主染色體中不需要的基因的位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)該基因的破壞或缺失。例如，整合到(9C/i7、MAW/或MAW4基因的位點(diǎn)允許表達(dá)所需文庫(kù)DNA，同時(shí)防止參與酵母糖蛋白高甘露糖基化的酶表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，文庫(kù)DNA可經(jīng)由核酸分子、質(zhì)粒、載體(例如病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)、染色體導(dǎo)入宿主中，并可以作為自主核酸分子或通過(guò)同源或隨機(jī)整合導(dǎo)入宿主基因組中。在任何情況下，對(duì)于每種文庫(kù)DNA構(gòu)建體一般都需要包括至少一個(gè)選擇性標(biāo)記基因，使得可以準(zhǔn)備選擇已穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主生物?？芍貜?fù)使用的標(biāo)記基因，如wraJ,可以進(jìn)行選擇或反選擇，是特別適合的。篩選和選擇方法02521用DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化宿主菌抹后，選擇表現(xiàn)出期望的糖基化表型的轉(zhuǎn)化體?？刹捎帽姸鄿y(cè)定或檢測(cè)方法中的任一種，以單一步驟或通過(guò)一系列表型富集和/或排除步驟進(jìn)行選擇。可以手動(dòng)或采用自78動(dòng)化高通量篩選設(shè)備進(jìn)行表型表征。通常，宿主微生物將蛋白質(zhì)W-聚糖展示在細(xì)胞表面上，在該處有多種糖蛋白定位。接著，可采用分析方法，諸如分光光度法、熒光測(cè)定法、熒光激活細(xì)胞分類(lèi)術(shù)或閃爍計(jì)數(shù)實(shí)施篩選。在其它情況中，可能需要分析從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中分離的糖蛋白或iV-聚糖?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)實(shí)施蛋白質(zhì)分離。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，報(bào)告蛋白質(zhì)被分泌至培養(yǎng)基中，然后通過(guò)親和層析(例如Ni-親和層析或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶親和層析)進(jìn)行純化。在優(yōu)選分離的iV-聚糖的情況中，諸如內(nèi)切-P-TV-乙酰氨基葡糖苦酶(GenzymeCo.,Boston,MA;NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)的酶可用于從糖蛋白切割iV-聚糖。然后，可通過(guò)液相層析(例如HPLC)、質(zhì)譜法或其它適宜的方法，分析分離的蛋白質(zhì)或W-聚糖。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,595,900教導(dǎo)了幾種可鑒定具有所需的胞外糖結(jié)構(gòu)的細(xì)胞的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用MALDI-TOF質(zhì)譜分析法分析切割的N-聚糖。優(yōu)選的組合DNA文庫(kù)的構(gòu)建圖示于圖2,并描述于實(shí)施例11。融合構(gòu)建體可與大量載體有效連接，例如本領(lǐng)域眾所周知的表達(dá)載體。使用如在表6中所示的代表性活性組裝多種多樣的這些融合構(gòu)建體?？砂凑毡景l(fā)明組裝靶向肽/催化結(jié)構(gòu)域的組合，用于在ER、高爾基體和高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中靶向糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶(例如甘露糖香酶)活性。令人驚訝的是，同一催化結(jié)構(gòu)域?qū)-糖基化模式?jīng)]有影響直至具有非常深刻的影響，這取決于所用靶向肽的類(lèi)型(參見(jiàn)例如表7、實(shí)施例11)。融合構(gòu)建體pGC5—釀酒酵母A/AW(m)/小鼠甘露糖普酶IBA99，是具有胞內(nèi)甘露糖苷酶修整活性的融合構(gòu)建體的另一個(gè)實(shí)例(實(shí)施例11;圖5D、圖8B)。融合構(gòu)建體pBC18-5(釀酒酵母F廁7(s)/秀麗線蟲(chóng)甘露糖苷酶IBA80)是能夠在體內(nèi)產(chǎn)生具有MansGlcNAc2結(jié)構(gòu)的N-聚糖的有效融合構(gòu)建體的又一個(gè)實(shí)例。通過(guò);J安照本發(fā)明產(chǎn)生這些和其它這樣的甘露糖苷酶融合構(gòu)建體的組合DNA文庫(kù)，技術(shù)人員可以區(qū)分并選擇具有最佳胞內(nèi)修整活性的那些構(gòu)建體和活性相對(duì)低或沒(méi)有的那些構(gòu)建體。使用本發(fā)明的組合DNA文庫(kù)的方法是有利的，因?yàn)橹挥羞x擇的少量甘露糖苷酶融合構(gòu)建體可以在體內(nèi)產(chǎn)生特別需要的W-聚糖。而且，顯而易見(jiàn)的是，可以使用諸如在實(shí)施例11示例的和本文所述的技術(shù)，產(chǎn)生其它這樣的定位的活性甘露糖苷酶催化結(jié)構(gòu)域(或者更一般地，任何酶的結(jié)構(gòu)域)的融合構(gòu)建體。制備和使用本發(fā)明的組合DNA文庫(kù)以便在導(dǎo)入到特定宿主細(xì)胞中的特定表達(dá)載體中優(yōu)化例如融合構(gòu)建體文庫(kù)的Man5GlcNAc2產(chǎn)生對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是常規(guī)的實(shí)驗(yàn)事件。糖基轉(zhuǎn)移酶融合構(gòu)建體0266]同樣，使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生糖基轉(zhuǎn)移酶組合DNA文庫(kù)。將來(lái)源于糖基轉(zhuǎn)移酶I(GnTI)活性的序列的組合DNA文庫(kù)與輩巴向肽組裝，并在低等真核宿主細(xì)胞中篩選標(biāo)記糖蛋白上GlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖結(jié)構(gòu)的有效生產(chǎn)。鑒定顯示出產(chǎn)生GlcNAcMan5GlcNAc2(pPB104)、釀酒酵母MAW9(s)/人GnTIA38的融合構(gòu)建體(實(shí)施例15)。組裝多種多樣的這些GnTI融合構(gòu)建體(實(shí)施例15，表10)。通過(guò)產(chǎn)生組合DNA文庫(kù)，可以容易地組裝其它靶向肽/GnTI催化結(jié)構(gòu)域的組合。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員還顯而易見(jiàn)的是，其它表現(xiàn)出糖基轉(zhuǎn)移酶活性的這些融合構(gòu)建體可以如在實(shí)施例15中所示范產(chǎn)生。使用選定的融合構(gòu)建體，在特定表達(dá)載體和宿主細(xì)胞系中，使用本文所述的組合DNA文庫(kù)方法優(yōu)化GlcNAcMan5GlcNAc2產(chǎn)生，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是一個(gè)常規(guī)實(shí)驗(yàn)事件。由本文描述的實(shí)驗(yàn)顯而易見(jiàn)使用特定的耙向肽序列和特定的催化結(jié)構(gòu)域序列的重要性。組合DNA文庫(kù)提供了構(gòu)建涉及修飾目標(biāo)糖蛋白上的iV-聚糖的酶融合體的工具，該工具尤其可用于產(chǎn)生人樣糖蛋白。(然而，可使用本發(fā)明的文庫(kù)和方法選擇任何酶融合體)。表達(dá)適宜地被靶向的活性a-l,2-甘露糖苷酶的所需轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生具有結(jié)構(gòu)M肌5GlcNAc2的iV-聚糖的K3,如在圖5D和5E中所示。根據(jù)在圖5C中MALDI-TOF質(zhì)謙的檢測(cè)，這使切割的聚糖的分子質(zhì)量與親代(9C7//缺失菌林的K3相比降低。同樣，使用相同的方法產(chǎn)生另一種分泌的糖蛋白主要含Man5GlcNAc2的IFN-P。通過(guò)PNG酶消化除去Man5GlcNAc2(P叩ac等，1998)，并進(jìn)行MALDI-TOF,如在圖6A-6F中所示。在圖6E(pGC5)(釀酒酵母MAW(m)/小鼠甘露糖苷酶IBA99)和6F(pFB8)(釀酒酵母(m)/小鼠甘露糖苷酶IAA1S7)中，于1254(m/z)的單一主峰證實(shí)在IFN-P上產(chǎn)生Man5GlcNA2。而且，在含有pFB8(釀酒酵母從C"(m)/小鼠甘露糖苷酶IA厶187)、pPBi04(酉良酒酵母MW9(s)/人GnTIA38)和pPB103(乳克魯維氏酵母MAW2-2基因)的巴斯德畢赤氏酵母菌4朱PBP-3中，通過(guò)MALDI-TOF4企測(cè)到雜合N-聚糖GlcNAcMan5GlcNAc2[b](圖10)。另一方面，本發(fā)明提供載體(包括表達(dá)載體)，其含有編碼活性糖基化酶的基因、啟動(dòng)子、終止子、選擇性標(biāo)記和耙向側(cè)翼區(qū)。這樣的啟動(dòng)子、終止子、選擇性標(biāo)記和側(cè)翼區(qū)在本領(lǐng)域容易獲得。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在每種情況下選擇的啟動(dòng)子都提供由特定ORF編碼的蛋白的最佳表達(dá)，以便足以催化所需的酶促反應(yīng)。該步驟需要選擇或組成型或誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子，并提供可調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇的終止子足夠終止轉(zhuǎn)錄。在又一個(gè)實(shí)施方案中，使用的選擇性標(biāo)記是每個(gè)ORF特有的，使得能夠隨后選擇含有要導(dǎo)入的ORF的特定組合的真菌菌抹。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)融合構(gòu)建體(編碼啟動(dòng)子、ORF和終止子)定位的基因座由選擇的側(cè)翼區(qū)確定。本發(fā)明不限于使用本文公開(kāi)的載體。整合位點(diǎn)因?yàn)樵撨z傳工程改造工作的一個(gè)最終目標(biāo)是能夠在工業(yè)化發(fā)酵方法中良好實(shí)施的強(qiáng)壯蛋白生產(chǎn)菌林，所以?xún)?yōu)選包括仔細(xì)計(jì)劃將多個(gè)基因整合入宿主(例如真菌)染色體中。工程改造菌抹有可能必須用一系列不同的基因轉(zhuǎn)化，這些基因必須以穩(wěn)定方式轉(zhuǎn)化，以確保在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中保持所需的活性。如本文所述，可以將多種所需酶活性的任何組合工程改造入真菌蛋白表達(dá)宿主中，例如唾液酸基轉(zhuǎn)移酶、甘露糖苷酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶、ER和高爾基體特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體(例如用于UDP-半乳糖和其它前體的協(xié)同和反向轉(zhuǎn)運(yùn)體)、涉及寡糖加工的其它酶和涉及活化的寡糖前體(例如UDP-半乳糖、CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸)合成的酶。已在眾多的低等真核生物(例如釀酒酵母、里氏木霉、構(gòu)巢曲霉、巴斯德畢赤氏酵母等)中廣泛表征了編碼已知為真菌宿主中的非人糖基化反應(yīng)特有的酶的基因及其相應(yīng)的蛋白，由此提供一組在低等真核生物中已知的糖基轉(zhuǎn)移酶、其活性及其各自的遺傳序列。這些基因可能選自甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，例如1,3甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(例如釀酒酵母中的MAW/)(Graham,1991)、1,2甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(例如釀酒酵母中的KTR/KRE家族)、1，6甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(釀酒酵母中的(X7i7)、甘露糖基磷酸轉(zhuǎn)移酶及其調(diào)節(jié)物(釀酒酵母中的A/AW4和MAW(5)以及涉及異常(即非人)糖基化反應(yīng)的其它酶。在低等真核宿主細(xì)胞(例如巴斯德畢赤氏酵母)中修飾糖基化的優(yōu)選方法的實(shí)例示于表6。(在第三列的第二行中的HDEL和KDEL信號(hào)肽分別示于SEQIDNO:5和6)。表6.用于在低等真核微生物中修飾糖基化的某些優(yōu)選實(shí)施方案需秉的結(jié)構(gòu)i適宜的催j定位序列的適宜J適宜的j適宜的轉(zhuǎn)運(yùn)<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>需要的結(jié)構(gòu)i適宜的催i定位序列的適宜i適宜的化活性來(lái)源l基因缺!失大鼠等)IMnnl(N-末端，酉良|J酒酵母)J>Mntl(N-末端，酉良J酒酵母)IIGDP酶(N-末端，Ii釀酒酵母)JGlcNAcMan:GlcNAc2甘露糖苷Ktrl!酶njMnnl(N-末端，酉良|MMV￥I酒酵母)JMMV<5lMntl(N-末端，酉良Jl酒酵母)II…量fKre2艇ntl(關(guān)|l酵母)IiKre2(巴斯德畢赤|J氏酵母)JI!Ktrl(釀酒酵母)IIJKtrl(巴斯德畢赤IJJ氏酵母)IIJMnnl(釀酒酵母)JGlcNAc(w)JGlcNAc|Mnnl(N國(guó)末端，酉良！OOT/Man3GlcNAc2j轉(zhuǎn)移酶|酒酵母)|A^V/WIII、m、lMntl(N-末端，釀l71^5JIV、Vj酒酵母)J(人、鼠)iKre2/Mntl(釀酒|適宜的轉(zhuǎn)運(yùn)體和/或磷酸多酶I氏酵母)iUDP酶(人)IUDP-GlcNAcI轉(zhuǎn)運(yùn)體(人、I鼠、乳克魯維i氏酵母)IUDP酶(人)JUDP-GlcNAcI轉(zhuǎn)運(yùn)體(人、I鼠、乳克魯維I氏酵母)UDP酶(人)88<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>需要的結(jié)構(gòu)適宜的催化活性定W立序列的適宜〖il宜的I適宜的-tH^來(lái)源J基因缺J體和/或磷酸::::::薩纏麵薩翻議議:S,酵母)IJKre2(巴斯德畢赤蕓I氏酵母)IlKtrl(釀酒酵母)IIKtrl(巴斯德畢赤IJ氏酵母)J|MNN1(釀酒酵母)JIMNN2(釀酒酵母)J為產(chǎn)生重組N-聚糖而產(chǎn)生CMP-Sia的方法0277本發(fā)明提供在沒(méi)有內(nèi)源CMP-Sia的宿主細(xì)胞(例如真菌細(xì)胞)中產(chǎn)生功能性CMP-Sia生物合成途徑的方法。本發(fā)明還提供產(chǎn)'生已凈皮修飾而表達(dá)新的或改變的CMP-Sia途徑的宿主細(xì)胞的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供產(chǎn)生含有細(xì)胞CMP-Sia庫(kù)的宿主細(xì)胞的方法。因此，本發(fā)明的方法包括在沒(méi)有內(nèi)源CMP-Sia的非人宿主細(xì)胞中通過(guò)導(dǎo)入功能性CMP-Sia生物合成途徑產(chǎn)生CMP-Sia庫(kù)。由于容易由遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(例如GenBank、Swissprot)獲得DNA序列信息，所以克隆涉及CMP-Sia途徑的酶和/或活性(實(shí)施例16)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將編碼涉及CMP-Sia的生物合成或轉(zhuǎn)運(yùn)的一種或多種酶(或其催化活性片段)的核酸分子插入適宜的表達(dá)載體中，處于能夠在選定的本發(fā)明宿主細(xì)胞(例如真菌宿主細(xì)胞)中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和/或其它表達(dá)控制序列的轉(zhuǎn)錄控制之下。可以檢測(cè)這些酶在選定的本發(fā)明宿主細(xì)胞中的功能性表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)由這些酶形成的中間體，可檢測(cè)這些酶在選定的本發(fā)明宿主細(xì)胞中的功能性表達(dá)。本發(fā)明的方法不限于使用本文公開(kāi)的具體酶源。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合文庫(kù)用于選擇和/或優(yōu)化選定宿主細(xì)胞中的CMP-Sia途徑活性。工程改造宿主細(xì)胞中的哺乳動(dòng)物CMP-唾液酸生物合成途徑在哺乳動(dòng)物途徑中的下一種酶CMP-Sia合酶最初通過(guò)功能補(bǔ)充缺失該酶的細(xì)胞系由鼠腦下垂體克隆(Munster,1998)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)存在于大腸桿菌(Mercker和Troy,1990)和人(Raju等，2001)中的同源物。該酶將唾液酸轉(zhuǎn)變?yōu)镃MP-Sia，CMP-Sia在高爾基體中的唾液酸基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中是供體底物。因此，在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞(例如沒(méi)有內(nèi)源CMP-Sia的非人宿主細(xì)胞，如真菌宿主細(xì)胞)中克隆和表達(dá)編碼功能性CMP-Sia合酶的基因，包括其同源物、變體和衍生物。CMP-Sia合酶在宿主中的表達(dá)可以使用功能測(cè)定來(lái)枱r測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，CMP-Sia合酶的功能性表達(dá)可通過(guò)監(jiān)測(cè)CMP-Sia的形成來(lái)檢測(cè)。技術(shù)人員知曉，僅僅CMP-唾液酸生物合成途徑中的一種或多種酶的可用性不能表明這些酶可以在沒(méi)有內(nèi)源CMP-Sia的宿主細(xì)胞(例如真菌宿主細(xì)胞)中功能性表達(dá)。迄今為止，還沒(méi)有描述這些宿主細(xì)胞表達(dá)這些哺乳動(dòng)物酶以建立功能性的從頭合成的CMP-Sia生物合成途徑的能力。本發(fā)明首次提供在真菌宿主中功能性表達(dá)參與CMP-Sia生物合成的至少一種哺乳動(dòng)物酶小鼠CMP-Sia合酶(實(shí)施例16)，表明經(jīng)由哺乳動(dòng)物途徑(全部或部分)產(chǎn)生CMP-Sia在真菌宿主中是有可能的，因此在沒(méi)有內(nèi)源CMP-Sia的其它非人宿主中也是有可能的。為在沒(méi)有內(nèi)源CMP-Sia的宿主細(xì)胞(例如真菌宿主，如巴斯德畢赤氏酵母)中或在需要增加的CMP-Sia水平或可以由增加的CMP-Sia水平獲益的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生唾液酸化的重組糖蛋白，可以使用本文公開(kāi)的組合DNA文庫(kù)法表達(dá)以上提及的哺乳動(dòng)物酶，產(chǎn)生CMP-Sia庫(kù)，其在唾液酸基轉(zhuǎn)移酶存在下被轉(zhuǎn)移至半乳糖基化的N-聚糖上。因此，本發(fā)明提供如下將CMP-Sia生物合成途徑工程改造入宿主細(xì)胞中的方法表達(dá)一個(gè)或多個(gè)每種所述酶，使它們?cè)谶x定的宿主細(xì)胞中它們被靶向的亞細(xì)胞位置發(fā)揮作用，優(yōu)選最佳地發(fā)揮作用。提供哺乳動(dòng)物、細(xì)菌或雜種#_工程改造的CMP-Sia生物合成途徑。工程改造宿主細(xì)胞中的細(xì)菌CMP-唾液酸生物合成途徑由大腸桿菌A^wC基因編碼的大腸桿菌UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶是涉及多唾液酸細(xì)菌合成的首種酶(Ringenberg,2001)。編碼該酶的A^wC基因(GenbankAN:M84026.1;SEQIDNO:57)分離自致病性大腸桿菌Kl菌抹，并編碼391個(gè)氨基酸的蛋白(SEQIDNO:58)(圖15)(Zapata，1992)。編碼的UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶催化UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)變?yōu)镸anNAc。已在幾種致病性細(xì)菌中鑒定出該酶的同源物，包括無(wú)乳鏈球菌(iSV邵tococcwsaga/ac"ae)、聚球藻屬(S少"ec/ococawsp.)95WH8102、熱纖梭菌(C7o對(duì)"W/wmAerwoce〃ww)、創(chuàng)傷弧菌(FZZwow/m)7cwi1)、嗜肺軍團(tuán)菌(丄eg/owe〃apwwewop/n'/a)和空腸彎曲菌(am/7_y/oZ)a"w"0。在一個(gè)實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞(例如非人宿主細(xì)胞，如真菌宿主)中克隆并表達(dá)編碼功能性大腸桿菌UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶的基因(A^wC),包括其同源物、變體和衍生物?？梢允褂霉δ軠y(cè)定檢測(cè)A^wC在宿主中的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)ManNAc的形成檢測(cè)7化wC的功能性表達(dá)。在PCR擴(kuò)增大腸桿菌iVe^4、和/《ewC基因后，將擴(kuò)增的片段連接至選擇性酵母整合載體中，處于啟動(dòng)子控制之下(實(shí)施例16)。在用攜帶臉M基因片段的每個(gè)載體轉(zhuǎn)化宿主菌抹(例如巴斯德畢赤氏酵母)后，通過(guò)對(duì)存在的載體應(yīng)用正選擇，然后針對(duì)A^/基因酶活性篩選轉(zhuǎn)化體，從而篩選菌落。本發(fā)明首次提供沒(méi)有內(nèi)源唾液酸化的非人宿主細(xì)胞表達(dá)涉及建立從頭開(kāi)始的CMP-Sia生物合成途徑的細(xì)菌酶的能力。在宿主細(xì)胞中工程設(shè)計(jì)雜合哺乳動(dòng)物/細(xì)菌CMP-唾液酸生物合成途徑102961哺乳動(dòng)物和細(xì)菌CMP-Sia生物合成途徑需要CTP和唾液酸二者均可供用于CMP-Sia合酶。盡管哺乳動(dòng)物CMP-Sia合酶在酶功能方面與相應(yīng)細(xì)菌酶類(lèi)似，但哺乳動(dòng)物CMP-Sia合酶可能包括一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基序，其確保正確定位至細(xì)胞核。因?yàn)檎婧松锞哂泻硕ㄎ坏腃TP庫(kù)，而原核生物CMP-Sia合酶不能定位至該區(qū)室，所以組合哺乳動(dòng)物和細(xì)菌酶的雜合CMP-Sia生物合成途徑對(duì)在沒(méi)有內(nèi)源唾液酸化的非人宿主細(xì)胞(例如真菌宿主細(xì)胞)中產(chǎn)生唾液酸及其中間體是優(yōu)選方法。為此，可以將該途徑工程改造入宿主細(xì)胞中，其涉及整合WewC和Wew5以及哺乳動(dòng)物CMP-Sia合酶的?？梢杂蓭追N已克隆并表征的哺乳動(dòng)物同源物選擇CMP-Sia合酶(GenbankAN:AJ006215;SEQIDNO:63)(Munster,1998)(參見(jiàn)例如鼠CMP-Sia合酶)(圖18)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶(大腸桿菌Z/ewC)和唾液酸合酶(大腸桿菌A^wS)連同小鼠CMP-Sia合酶轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。用該雜合CMP-Sia生物合成途徑工程改造的宿主產(chǎn)生供體分子CMP-Sia細(xì)胞庫(kù)(圖25)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇在宿主中表達(dá)的酶的組合，用于增強(qiáng)供體分子CMP-Sia的產(chǎn)生。工程改造替代途徑的酶，從而在宿主細(xì)胞中增強(qiáng)CMP-唾液酸途徑中間體的產(chǎn)生0297在本發(fā)明的再一方面，將涉及CMP-唾液酸生物合成的替代途徑的酶工程改造入沒(méi)有內(nèi)源唾液酸化的非人宿主細(xì)胞(例如真菌宿主細(xì)胞)中；或者工程改造入其中可改變(例如增強(qiáng))內(nèi)源唾液酸化的宿主細(xì)胞中。例如，設(shè)想一種上述方法中的某種中間體變成限制性時(shí)，導(dǎo)入使用替代機(jī)制來(lái)產(chǎn)生該中間體的酶將可以充分替代產(chǎn)生CMP-唾液酸或沿著該途徑的任何中間體。本文描述了用于產(chǎn)生中間體ManNAc和Sia的實(shí)施方案，不過(guò)可擴(kuò)展該方法來(lái)產(chǎn)生其它中間體。而且，在沒(méi)有先前提及的酶(即產(chǎn)生相同中間體的酶)或存在先前提及的酶(即增強(qiáng)整體產(chǎn)生)的情況下，這些酶中的任一種均可摻入到哺乳動(dòng)物、細(xì)菌或雜合途徑中。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，CMP-唾液酸的產(chǎn)生是高度可調(diào)的。CMP-唾液酸用作反饋抑制劑，作用于UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶/ManNAc激酶，以防止CMP-Sia的進(jìn)一步產(chǎn)生(Hinderlich,1997;Keppler,999)。相反，細(xì)菌CMP-Sia生物合成途徑(圖14B)似乎不具有會(huì)限制CMP-Sia產(chǎn)生的反饋抑制控制機(jī)制(Ringenberg,2001)。然而，將大腸桿菌唾液酸醛縮酶摻入以上提及的其中一個(gè)途徑中可使其催化的反應(yīng)方向根據(jù)反應(yīng)平衡移動(dòng)，由此潛在地引起Sia水解，變回ManNAc。因此，在快速將Sia轉(zhuǎn)變?yōu)镃MP-Sia的CMP-唾液酸合酶存在下，涉及以上概述的唾液酸醛縮酶的方法阻止該反向反應(yīng)發(fā)生。本發(fā)明提供在重組非人真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生唾液酸化糖蛋白的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，非人真核宿主細(xì)胞一般不表現(xiàn)出唾液酸基轉(zhuǎn)移酶活性。本文使用的人ST6Gal的同源物是指與人ST6Gal(NM—003032)具有顯著比對(duì)的核酸。人ST6Gal的同源物包括以以下GenBank登錄號(hào)標(biāo)識(shí)的酶AAH40009.1、CAF29492.1、CAI29584.1、CAA38246.1、CAA75385.1、AAH92222.1、P13721、Q64685、NP_990572.1、XP—535839.1、XP—517005.1、NP—775324.1、XP一516938.1、NP—001003853.1、CAB9643.1、CAI29183.1、CAG32836,1、XP545243.1、CAF29496.1、XP416927.1、CAF29497.1、101AAB22858.1、NP_671738.1、CAI29184.1、AAB22859.1、BAC24793.1、BAB47506.1、CAF29493.1、XP一515705.1、XP一614392.1、CAF29495.1、XP一236826.2、BAC87752.1、CAI29185丄CAF97336.1、CAI39644.1、CAD54408.1、CAG05808.1、XP—538436.1、BAC98272.1、XP—604448.1、AAD33059.1、BAC28828.1、BAB00636.1、AAH08680.1、NP一766417.1、EAA04038.2、CAH25390.1、NP—726474.1和NP—523853.1。本發(fā)明進(jìn)一步提供被遺傳工程改造的非人宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生含有NANA^)Gal(M)GlcNAc(w)Man3GlcNAc2的復(fù)合糖蛋白或含104有NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2的雜合糖蛋白。03171本發(fā)明還提供通過(guò)本文所述的任一種方法產(chǎn)生的重組糖蛋白。f0318j實(shí)施例17舉例說(shuō)明了要求保護(hù)的本發(fā)明的方法，由此在體內(nèi)產(chǎn)生唾液酸化糖蛋白。使用反式唾液酸酶體內(nèi)轉(zhuǎn)移唾液酸至N-聚糖的方法;GlcNAc、UDP-GlcNAc和ManNAc。如先前所迷，在其它實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞已#1〈'務(wù)改以包含一種或多種糖前體，例如葡糖胺或ManNAc、UDP-N-乙酰葡糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺、CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸或UDP-半乳糖。03251本發(fā)明還提供在重組非人真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生唾液酸化糖蛋白的方法，包括將具有反式唾液酸酶活性的酶和唾液酸供體引入用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中。唾液酸供體可為CMP-Sia,或者可以通過(guò)添加糖核苷酸前體，如CMP-Sia、葡糖胺、GlcNAc、UDP-GlcNAc和ManNAc,增加唾液酸供體的存在。另夕卜，可以修改宿主細(xì)胞，以包含一種或多種糖前體，例如葡糖胺或ManNAc、UDP-N-乙酰葡糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺、CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸或UDP-半乳糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本文所述方法的宿主細(xì)胞選自畢赤氏酵母屬(P/cA/"w.)，包括但不限于巴斯德畢赤氏酵母(尸/c/2/"/W加"》、P/c/2,'。力"/""血fif、喜海藻糖畢赤氏酵母^e/w/o;/^7a)、尸Zc/j/aAoc/amae、月莫醭畢赤氏酵母(尸/c/z/awew6rawae^rc/e"5)、尸/c/n'ao/n/wf/ae、尸z'c/j/af/ermoto/e^YWS、杉卩畢赤氏酵母(尸/c/j/a>s"fir//cto〃'<^、尸/cA/agwercwM附、皮,杰普氏畢赤氏酵母(尸/'c/z/a/7z》eh)、具柄畢赤氏酵母(尸/c/"勸》to)和曱醇畢赤氏酵母(尸/d2/awef/awo//ca);"[i^可酉良酒酵母屬(Sacc/2araAycess;.)，包4舌4旦不限于酉良酒酵母(Sacc/wmm少cescerev/s/ae);多形漢遜氏酵母(//a朋e"w/apoworp/w);任何克魯維氏酵母屬(《/wywram少c^罕.)，包括但不限于乳克魯維氏酵母(AT/wy^ra7w少c^/acto);白色念珠菌(C朋c/Zcfofa/6/o)7w);任何曲霉屬(力^e^/〃2^取)，包括但不限于構(gòu)巢曲霉04^wg/〃Mw'dwAms)、黑曲霉(y4s;erg/〃wsw/ge/"")和米曲霉(^4s/erg/〃us1o^yzae);里氏木霉(7h'c/20(ier願(yuàn)myee/);C7z/7my/7on'謂/wc/b，mye;任何鐮孑包菌屬(Fwra/7'wwj/.)，包括4旦不P艮于禾赤鐮孢菌CFi^w7力mgramZweww)和FMSGfn'M附vewewafww;以及4且較鏈孑包審(/VeMrosporafcrassa)。雖然本發(fā)明采用巴斯德畢赤氏酵母(尸./7fl對(duì)on為宿主生物進(jìn)行舉例說(shuō)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，其它真核生物宿主細(xì)胞，包括植物、藻類(lèi)、昆蟲(chóng)和其它酵母和真菌宿主物種，可按照本文所述進(jìn)行改變，以產(chǎn)生人樣糖蛋白。要理解的是，本文所描述的用于鑒定和破壞非所需宿主細(xì)胞糖基化基因(例如(9Q7/)的技術(shù)，可用于其它真核生物宿主細(xì)胞(諸如其它酵母和真菌菌林)中的這些基因和/或其它同源的或功能相關(guān)的基因。優(yōu)選地，選擇能夠在工業(yè)化發(fā)酵方法中良好實(shí)施的、高產(chǎn)蛋白的真菌宿主菌林。這些菌林包括但不限于任何畢赤氏酵母屬酵母(尸/c/2z'fl^.)，包括但不限于巴斯德畢赤氏酵母(尸/c/n'aposto^y)、尸/c/2,a刀"/朋cf/ca、喜海藻糖畢赤氏酵母(尸/c/2/"的/2a/o/M")、尸/c/z/atoc/am"e、膜醺畢赤氏酵母(尸/由'"we附Z)ra"(3e/ac/e7W)、尸/c/H.a0/ww"cre、尸z'c/]/aAermoto/eram1、湘p畢赤氏酵母(i^c/2/fifsa//cton'<3)、尸/c/n'agwe/rww附、皮,杏、普氏畢赤氏酵母(尸/c/z/a、具柄畢赤氏酵母(戶z'c/2/力幼》to)和甲醇畢赤氏酵母(乃'c/z/aweAawo/Zca);^f壬4可酉良酒酵母屬(Sacc/2Cfraw;/c^s包4舌《旦不卩艮于酉良酒酵母(Sacc/wramyc^cerev/w."e);多開(kāi)j漢遜氏酵母(//(3/weww/a/o(vwor//w);任何克魯維氏酵母屬(《/w"eram少ces包括〗旦不限于乳克魯維氏酵母(A7w^veraw少ces/acto);白色念珠菌(Ca"d/ciaa/Z)/cof"s);任何曲霉屬(J5^/^'〃mv.)，包括但不限于構(gòu)巢曲霉(A/erg/〃wsw'dw/am1)、,、曲霉(Asperg"/iw"&6/;)和米曲霉(^4>/^1^///2^o^zore);里氏木霉(7Wc/20t/er顧msee/);C7z，05po〃',/wc/b歸e"5^;任何鐮孑包菌屬(Fw^nww^.),包括4旦不限于禾赤鐮孢菌(Fwsan'wmgrawz力eww)和F"S(3〃'w附vewe"aw附；以及^04造鏈孑包霉(jVeMras/7orafcra^a)。03321因此，本發(fā)明的另一方面涉及表達(dá)糖蛋白的非人真核宿主菌林，所迷糖蛋白包含修飾的N-聚糖，其與人類(lèi)細(xì)胞所產(chǎn)生的相似。因此，本發(fā)明設(shè)想并包括在非酵母和真菌細(xì)胞的物種中實(shí)施本發(fā)明的方法。設(shè)想本發(fā)明的組合核酸文庫(kù)可用于選擇在任何真核宿主細(xì)胞系統(tǒng)中修飾糖基化途徑的構(gòu)建體。例如，本發(fā)明的組合文庫(kù)還可用于植109動(dòng)物和人類(lèi)細(xì)胞在內(nèi)的其它真核宿主細(xì)胞中，以將包含糖基化酶或其催化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)定位至沿宿主細(xì)胞分泌途徑的所需位置。優(yōu)選地，將糖基化酶或催化結(jié)構(gòu)域等耙向沿宿主細(xì)胞分泌途徑的亞細(xì)胞位置，在那里它們能夠起作用，優(yōu)選地，對(duì)它們進(jìn)行設(shè)計(jì)或選擇，使它們?cè)谀抢镒钣行У仄鹱饔?。本文所述的方法可用于產(chǎn)生糖蛋白，尤其是治療性用于人的糖蛋白，以及含有此類(lèi)糖蛋白的組合物。例如，具有特定糖形的糖蛋白在治療性蛋白靶向中尤為有用。本發(fā)明的糖蛋白組合物將主要含有特定糖形。例如，已表明甘露糖-6-磷酸引導(dǎo)蛋白質(zhì)至溶酶體，所述溶酶體是幾種溶酶體貯積疾病相關(guān)酶的正確功能所必需的，所述溶酵體貯積、疾病例如Gaucher氏病、Hunter氏病、Hurler氏病、Scheie氏病、Fabry氏病和Tay-Sachs病，所描述的僅為少數(shù)幾個(gè)。同樣，在聚糖側(cè)鏈上加入一個(gè)或多個(gè)唾液酸殘基，可以增加治療性糖蛋白給予后的體內(nèi)半衰期。因此，宿主細(xì)胞(例如低等真核生物或哺乳動(dòng)物)可經(jīng)過(guò)遺傳改造來(lái)增加細(xì)胞所表達(dá)的糖蛋白中末端唾液酸的程度。或者，在給予前，可以采用唾液酸轉(zhuǎn)移酶和適宜的底物將唾液酸與目標(biāo)蛋白質(zhì)體外綴合。除了表達(dá)人樣糖基化所涉及的酶活性之外，還可對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基組成進(jìn)行改變，以產(chǎn)生更密切類(lèi)似人形式的糖蛋白(Weikert,1999;Werner,1998;Andersen,1994;Yang,2000)。對(duì)單克隆抗體的特異性聚糖修飾(例如加入二等分GlcNAc)已經(jīng)顯示出改善抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(Umana,1999),該改善是抗體或其它治療性蛋白質(zhì)生產(chǎn)所需的。03381治療性蛋白質(zhì)通常采用注射、經(jīng)口、經(jīng)肺或其它方式給予?？筛鶕?jù)本發(fā)明生產(chǎn)的適宜靶糖蛋白的實(shí)例包括但不限于促紅細(xì)胞生成素；細(xì)胞因子，諸如干擾素-a、干擾素-p、干擾素-丫、千擾素-co、TNPa和粒細(xì)胞-CSF;凝血因子，諸如因子VIII、因子IX;以及人C蛋白、抗凝血酶III和血栓形成素、可溶性IgE受體oc-鏈、IgG、IgG片段、IgM、白細(xì)胞介素(如IL-lm)、尿激酶、糜蛋白酶、脲胰蛋白酶抑制劑、IGF-結(jié)合蛋白、表皮生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)激素釋放因子、膜聯(lián)蛋白V融合蛋白、制管張素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-2、骨髓祖細(xì)胞抑制因m子-1、骨保護(hù)素、a-l抗胰蛋白酶、DNA酶II、ot-蛋白、AAT、rhTBP-l(奧那西普，akaTNF結(jié)合蛋白1)、TACI-Ig(跨膜激活劑及鉀調(diào)節(jié)劑及親環(huán)蛋白配體相互作用分子)、FSH(促卯泡激素)、GM-CSF、GLP-1w/和w/oFC(胰高血糖素樣蛋白1)、IL-1受體激動(dòng)劑、sTNFr(依那西普,aka可溶性TNF受體Fc融合體)、ATIII、rhThrombin(重組人凝血酶)、葡糖腦苷脂酶和CTLA4-Ig(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4-Ig)。中，以敲除野生型OC/Z/基因。使用組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的初始篩選，之后進(jìn)行影印接種，以選擇溫度敏感性菌落。200個(gè)組氨酸陽(yáng)性菌落中有20個(gè)于37。C顯示出溫度敏感表型。為排除pBK9.1隨機(jī)整合入畢赤屬酵母基因組中，使用對(duì)整合位點(diǎn)的上游序列和7/ZWORF特異性的引物，對(duì)20個(gè)溫度敏感性分離抹進(jìn)行菌落PCR。20個(gè)菌落中有2個(gè)為ocW缺陷型，使用DNA印跡和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步分析，表明oc///敲除構(gòu)建體的功能性ocW破壞。使用兩個(gè)獨(dú)立的限制酶8^///和C/a/消化基因組DNA,以證實(shí)ocW敲除及證實(shí)在可讀框的整合。蛋白質(zhì)印跡表明，oc//突變體沒(méi)有在GS115野生型中產(chǎn)生的46.2kDa的分離條帶。實(shí)施例2用a-l，2-甘露糖苷酶工程改造巴斯德畢赤氏酵母，以產(chǎn)生含Man5GlcNAc2的IFN-P前體),對(duì)0.1。/。TFA徹底透析，并凍干至干燥。將蛋白再溶解于150)tiL的50mMMOPS,20mMMnCl2，pH7.4中。在加入32.5g(533nmol)UDP-半乳糖和4mU(31,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶后，將樣品于37。C溫育18小時(shí)。然后對(duì)0.1%TFA透析樣品，用于通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜法分析。在與不和酶一起溫育的類(lèi)似的蛋白樣品的譜相比時(shí)，與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的蛋白的譜顯示出質(zhì)量增加，與添加兩個(gè)半乳糖部分相一致。接著還原蛋白樣品，羧甲基化并用PNG酶F去糖基化?；厥盏腘-聚糖通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜分析。得自半乳糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)性蛋白的主要聚糖的質(zhì)量大于對(duì)照聚糖的質(zhì)量，就質(zhì)量而言與添加兩個(gè)半乳糖部分相一致(325.4Da)。Bobrowicz等(2004)公開(kāi)了工程改造的巴斯德畢赤氏酵母菌抹能夠產(chǎn)生含末端半乳糖的糖蛋白，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。該菌抹使用如本文公開(kāi)的本發(fā)明方法表達(dá)|31、4GalT、UDP半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和UDP-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶。另參見(jiàn)2005年4月15日申請(qǐng)的Davidson,USSN11/108,088的公開(kāi)內(nèi)容，該文獻(xiàn)的7>開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。實(shí)施例5118工程改造菌抹以表達(dá)功能性的和活性的甘露糖苷酶II0358]為產(chǎn)生人樣糖形，工程改造微生物，以表達(dá)甘露糖普酶II酶，該酶由結(jié)構(gòu)GlcNAcMaii5GlcNAc2除去兩個(gè)殘留的末端甘露糖(參見(jiàn)圖1B)。將包含編碼內(nèi)側(cè)和中間高爾基體定位信號(hào)的序列的DNA文庫(kù)按照讀框與編碼甘露糖苷酶II催化結(jié)構(gòu)域的文庫(kù)融合。宿主生物為例如酵母的菌4朱，其為高甘露糖基化缺陷型(例如ocW突變體)，并在高爾基體和/或ER中提供具有結(jié)構(gòu)GlcNAcMan5GlcNAc2的W-聚糖。在轉(zhuǎn)化后，選擇具有所需糖基化表型的生物。在一個(gè)方法中使用體外測(cè)定。需要的結(jié)構(gòu)GlcNAcMan3GlcNAc2(而不是不需要的GlcNAcMan5GlcNAc2)為酶GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II的底物(參見(jiàn)圖1B)。因此，可以在底物UDP-GlcNAc存在下在體外使用該酶測(cè)定單個(gè)菌落。UDP的釋放通過(guò)HPLC或用于UDP的酶測(cè)定來(lái)測(cè)定?；蛘?，可以使用放射性標(biāo)記的UDP-GlcNAc或MALDI-TOF。參見(jiàn)Davidson等，WO05/00584,其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。使用高通量篩選設(shè)備對(duì)單獨(dú)的菌落便利地進(jìn)行前述體外測(cè)定?；蛘呤褂媚亟Y(jié)合測(cè)定。在此情況下，對(duì)末端甘露糖特異性的凝集素的結(jié)合降低使得可以選擇具有所需表型的轉(zhuǎn)化體。例如，雪花蓮(Gfl/a"f^mVato)凝集素特異性結(jié)合末端oc-l，3-甘露糖，其濃度在可操作表達(dá)的甘露糖普酶II活性存在下降低。在一個(gè)適宜的方法中，使用連接至固體瓊脂糖支持體(得自SigmaChemical,St.Louis,MO)的雪花蓮(G.m'vafc)凝集素除去具有高水平末端a-l,3-甘露糖的細(xì)胞轉(zhuǎn)化群。實(shí)施例6工程改造菌林以表達(dá)唾液酸基轉(zhuǎn)移酶酶a2,3-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和a2,6-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶將末端唾液酸添加至初生人W-聚糖中的半乳糖殘基，產(chǎn)生成熟糖蛋白(參見(jiàn)圖1B中的"a2，3ST;a2,6ST")。在人細(xì)胞中，反應(yīng)發(fā)生在外側(cè)高爾基體或TGN中。因此，通過(guò)將編碼唾液酸基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域的序列與編碼外側(cè)高爾基體或TGN定位信號(hào)的序列(Malissard,2000;Borsig，1995)按讀框融合構(gòu)建DNA文庫(kù)。宿主生物為例如酵母的菌抹，其為高甘露糖基化缺陷型(例如oc/2/突變體)，在晚期高爾基體或TGN中提供具有末端半乳糖殘基的W-聚糖，并在晚期高爾基體或TGN中提供足夠濃度的CMP-唾液酸。在轉(zhuǎn)化后，選擇具有所需表型的轉(zhuǎn)化體，例如使用對(duì)具有末端唾液酸的iV-聚糖特異性的焚光抗體。另外，工程改造菌林，以產(chǎn)生如在實(shí)施例16中所述的CMP-NANA前體。P-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)體人高爾基體UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)體的cDNA已由Ishida和同事們克隆。(Ishida,N.等，1999J.說(shuō)oc/7e肌126(1):68-77)。Guillen和同事們已通過(guò)表型校正乳克魯維氏酵母突變體的高爾基體UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷而克隆了犬腎高爾基體UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)體。(Guillen,E.等，1998)。因此，哺乳動(dòng)物高爾基體UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)體基因具有要表達(dá)蛋白的所有必需信息，并被功能性靶向酵母的高爾基體。這些或其它克隆的轉(zhuǎn)運(yùn)體基因可被工程改造入宿主生物中，以便為宿主的高爾基體和/或ER中的有效GnT反應(yīng)提供UDP-GlcNAc底物。圖IOB證實(shí)了表達(dá)乳克魯維氏酵母UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)體的菌林的作用。與沒(méi)有UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)體的圖IOA相比，添加UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用顯示出GlcNAcMan5GlcNAc2的產(chǎn)生顯著地增加。實(shí)施例8工程改造菌林以表達(dá)GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體|0364大鼠肝臟高爾基體膜GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體已由Puglielli,L.和C.B.Hirschberg1999</.5,o/.C/綴274(50):35596-35600鑒定和純化。相應(yīng)的基因可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定，例如W-末端測(cè)序和使用變性DNA探針的DNA印跡。然后在還表達(dá)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的宿主微生物中表達(dá)完整的基因。實(shí)施例9工程改造菌林以表達(dá)UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體10365]已克隆了人UDP-半乳糖(UDP-Gal)轉(zhuǎn)運(yùn)體，其顯示出在釀酒酵母中有活性。(Kainuma,M.等，1999G(yco6/o/ogy9(2):133-141)。已克隆了第二個(gè)人UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(hUGTl)，并在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中功能表達(dá)。Aoki,K.等，1999,說(shuō)oc/iew.126(5):940-950。同樣，Segawa和同事們已由粟酒裂殖酵母克隆了UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Segawa,H,等，1999Fefe451(3):295-298)?？梢詫⒕幋aUDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的這些或其它序列直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，或者可以用作本發(fā)明亞文庫(kù)的組分，以工程改造具有增加的UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的菌抹。實(shí)施例10工程改造菌林以表達(dá)CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體0366]人CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(hCST)已由Aoki和同事們(1999)克隆并在Lec8CHO細(xì)胞中表達(dá)。也已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了倉(cāng)鼠CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的分子克隆(Eckhardt,1997)。Berninsone,1997在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了鼠CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能性表達(dá)?？梢詫⒕幋aCMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的這些或其它序列直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，或者可以用作本發(fā)明的亞文庫(kù)的組分，以工程改造具有增加的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的菌株。實(shí)施例11使用組合DNA文庫(kù)工程改造巴斯德畢赤氏酵母，以產(chǎn)生Man5GlcNA2作為主要yV-聚糖結(jié)構(gòu)03671工程改造巴斯德畢赤氏酵母的oc//突變體(參見(jiàn)實(shí)施例1和3),以表達(dá)和分泌處于誘導(dǎo)型JOW啟動(dòng)子控制之下的蛋白，例如人纖溶酶原的kringle3結(jié)構(gòu)域(K3)。人纖溶酶原的Kringle3結(jié)構(gòu)域(K3)用作模式蛋白。使用Pfuturbo聚合酶(Strategene,LaJolla,CA)擴(kuò)增編碼K3的DNA片段，并克隆入pPICZaA(Invitrogen,Carlsbad,CA)的五coi7和義6a/位點(diǎn)，產(chǎn)生C-末端6-His標(biāo)記。為了改善K3的N-聯(lián)糖基化效率(Hayes,1975)，使用定點(diǎn)誘變用Ser恥替代Pro46。產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱(chēng)為pBK64。通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)PCR構(gòu)建體的正確序列。通過(guò)將鼠a-l,2-甘露糖苷酶IB(Genbank:6678787)和IA(Genbank:6754619)催化結(jié)構(gòu)域與含有編碼表6的CopII嚢泡、ER和早期高爾基體定位肽的序列的亞文庫(kù)按讀框連接，構(gòu)建組合DNA文庫(kù)。使用該組合DNA文庫(kù)產(chǎn)生單獨(dú)的融合構(gòu)建體，然后將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入表達(dá)K3的宿主生物中，產(chǎn)生遺傳混合庫(kù)，其中每個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)化體都表達(dá)K3以及該文庫(kù)的定位信號(hào)/甘露糖苦酶融合基因。培養(yǎng)單個(gè)轉(zhuǎn)化體，通過(guò)轉(zhuǎn)移至含甲醇的培養(yǎng)基誘導(dǎo)K3產(chǎn)生。在這些條件下，在24小時(shí)誘導(dǎo)之后，培養(yǎng)基中90%以上的蛋白為K3。由上清液純化K3報(bào)告蛋白，以通過(guò)Ni-親和層析除去鹽和低分子量雜質(zhì)。在親和純化后，通過(guò)在SephadexG10樹(shù)脂(Sigma，St.Louis,MO)上進(jìn)行大小排阻層析脫鹽蛋白，并直接進(jìn)行下述的MALDI-TOF分析，或者通過(guò)如下所述的PNG酶消化除去W-聚糖(N-聚糖釋放)，并進(jìn)行MALDI-TOF分析(Miele,1997)。0369在該方法后，獲得不同組別的轉(zhuǎn)化體；與ocW敲除菌抹相比某些沒(méi)有顯示出iV-聚糖修飾；有些顯示出高度的甘露糖修整(圖5D、5E)。表達(dá)適宜被靶向的活性oc-l,2-甘露糖普酶的所需轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生具有結(jié)構(gòu)Man5GlcNAc2的ZZ-聚糖的K3。這使糖蛋白的分子量與親代oc/7缺失菌4^的K3相比降低，其差異通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜法易于檢測(cè)(圖5)。表7表明了相對(duì)的Man5GlcNAc2生產(chǎn)水平。表7.序列/催化結(jié)構(gòu)域定位的代表性組合DNA文庫(kù)表現(xiàn)出的相對(duì)Man5GlcNAc2生產(chǎn)水平催化結(jié)構(gòu)域耙向肽序列廢57(s)廳57(m)層,)腿C72(s)小鼠甘露糖苷FB4FB5FB6FB7FB8酶1AA187+++-++++++小鼠甘露糖苷GB4GB5GB6GB7GB8酶IBA58+++++++小鼠甘露糖苷GC4GC5GC6GC7GC8酶IBA99-++++++小鼠甘露糖苷GD4GD5GD6GD7GD8酶IBA170---++表8.另一個(gè)定位的組合DNA文庫(kù)表現(xiàn)出的序列/催化結(jié)構(gòu)域相對(duì)123MansGlcNAc2生產(chǎn)水平<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>0370由釀酒酵母中的MA^I(SwissProtP32906)(長(zhǎng)、中和短)(參見(jiàn)上文的核酸文庫(kù)、融合構(gòu)建體的組合DNA文庫(kù))以及釀酒酵母中的(SwissProtP11655)(988-1140個(gè)核苷酸短的)和(988-1296:中等的)選擇靶向肽。盡管大部分靶向肽序列為N-末端缺失的，但某些靶向肽序列如為C-末端缺失。由具有187個(gè)氨基酸的N-末端缺失的小鼠甘露糖苦酶1A以及具有58、99和170個(gè)氨基酸缺失的小鼠甘露糖苷酶1B選擇用于該實(shí)驗(yàn)的催化結(jié)構(gòu)域。本文使用的(+)的數(shù)量表示MansGlcNA2產(chǎn)生的相對(duì)水平。符號(hào)(-)表示沒(méi)有明顯的MansGlcNA2產(chǎn)生。符號(hào)(+)表示Man5GlcNA2產(chǎn)生少于10%。符號(hào)(++)表示約10-20%的Man5GlcNA2產(chǎn)生。符號(hào)(+十+)表示約20-40%的MansGlcNA2產(chǎn)生。符號(hào)(++++)表示約50%的Man5GlcNA2產(chǎn)生。符號(hào)(+++++)表示超過(guò)50%的MansGlcNA2產(chǎn)生。通過(guò)用EcoICRI(圖4F)切割pJN261(圖4F)產(chǎn)生///W標(biāo)記的表達(dá)質(zhì)粒。然后，將已使用引物GCCCAAGCCGGCCTTAAGGGATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATAAAAATACGG(SEQIDNO:28)和AGTTAAAATCTCTAA(SEQIDNO:29)擴(kuò)增、用WgoM/K和Swa/切割、然后使用T4DNA聚合酶平端的畢赤巴斯德酵母/7/W基因的2.7kb片段連接入開(kāi)放位點(diǎn)。該質(zhì)粒被命名為pJN337(圖4F)。為構(gòu)建適于融合文庫(kù)構(gòu)建的具有多個(gè)克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒，用vVW/和Pac/切割pJN337，將兩個(gè)已體外退火的寡核苷酸GGCCGCCTGCAGATTTAAATGAATTCGGCGCGCCTTAATfSEOIDNO:30)和TAAGGCGCGCCGAATTCATTTAAATCTGCAGGGC(SEQIDNO:31)連接入開(kāi)放位點(diǎn)，產(chǎn)生pJN347(圖4F)。在通過(guò)PNG酶消化釋放W-聚糖后，通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)鐠分析它們。采用VoyagerDEPRO線性MALDI-TOF(AppliedBiosciences)質(zhì)譜儀，利用延遲引出測(cè)定聚糖的分子量。將來(lái)自各孔的干燥聚糖溶于15jxL水中，將0.5^L點(diǎn)樣于不銹鋼樣品平板上，并與0.5pLS-DHB基質(zhì)(9mg/mL二羥基苯甲酸，1mg/mL5-曱氧基水楊酸，溶于1:1水/乙腈0.1%TFA中)混合，并使之千燥。使用4ns脈沖時(shí)間的脈沖氮激光器(337nm)照射產(chǎn)生離子。采用延遲引出模式以125ns延遲和20kV加速電壓操作該儀器。柵極電壓為93.00%,導(dǎo)線電壓為0.10%，內(nèi)壓小于5xl(T托，低質(zhì)量門(mén)(lowmassgate)為875Da。由總共100-200次激光脈沖生成譜，并用500MHz數(shù)字轉(zhuǎn)換器獲取所述譜。Mari5GlcNAc2寡糖用作外部分子量標(biāo)準(zhǔn)。全部譜均采用該儀器以正離子^f莫式生成。實(shí)施例13通過(guò)a-l，2-甘露糖苷酶體內(nèi)修整的降解，產(chǎn)生與MansGlcNAc2相關(guān)的峰。在圖7中，Man9GlcNAc2[b]標(biāo)準(zhǔn)品于24.61分鐘洗脫，Man5GlcNAc2[a]于18.59分鐘洗脫。在圖8中，Man9GlcNAc2于21.37分鐘洗脫，Man5GlcNAc2于15.67分鐘洗脫。在圖9中，顯示標(biāo)準(zhǔn)Man8GlcNAc2[b]于20.88分鐘洗脫。含有質(zhì)粒pFB8(釀酒酵母朋C"(m)/小鼠甘露糖苷酶IAA187)的巴斯德畢赤氏酵母細(xì)胞于30°C在BMGY中生長(zhǎng)至OD600約為10。通過(guò)離心收集細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至BMMY，以誘導(dǎo)在^9Z/啟動(dòng)子控制下的K3(得自人纖溶酶原的kringle3)的產(chǎn)生。在誘導(dǎo)24小時(shí)后，通過(guò)離心除去細(xì)胞，產(chǎn)生基本上澄清的上清液。取出等份的上清液試樣進(jìn)行甘露糖苷酶測(cè)定，余下的用于回收分泌的可溶性K3。使用CM-瓊脂糖層析和25mMNaAc,pH5.0至25mMNaAc,pH5.0,1MNaCl的洗脫梯度的單個(gè)純化步驟在300-500mMNaCl之間洗脫時(shí)產(chǎn)生95%純的K3。K3來(lái)源的聚糖的W-聚糖分析示于圖6F。進(jìn)一步測(cè)試了較早前取出的等份上清液試樣的分泌性甘露糖香酶活性的存在情況。將市售可得的2-氨基苯甲酰胺-標(biāo)記的N-聯(lián)-型寡甘露糖9(Man9-2-AB)(Glyko，Novato,CA)標(biāo)準(zhǔn)品加至BMMY(圖7A)、以上等份試樣的上清液(圖7B)和含有10ng75mU/mL里氏木霉的a-l,2-甘露糖苷酶的BMMY(得自Contreras等，WO02/00856A2)(圖7C)。在于室溫溫育24小時(shí)后，通過(guò)氨基二氧化硅HPLC分析樣品，以測(cè)定甘露糖普酶修整的程度。利用BeckmanBioMek2000實(shí)驗(yàn)室機(jī)器人以96孔形式通過(guò)Ni-親和層析由培養(yǎng)基純化K3。機(jī)器人純化是Novagen針對(duì)他們的HisBind樹(shù)脂提供的方案的改進(jìn)。另一個(gè)篩選方法可以使用特異性末端GlcNAc結(jié)合抗體或結(jié)合末端GlcNAc(EYLaboratories,SanMateo,CA)的凝集素(例如來(lái)自加納谷物(0#"&^7^/Wco//a>々GSII凝集素)進(jìn)行。這些篩選可以使用已用熒光標(biāo)記如FITC修飾的凝集素或抗體自動(dòng)化，或者可通過(guò)MALDI-TOF分析?？傊景l(fā)明的方法產(chǎn)生以高產(chǎn)量產(chǎn)生GlcNAcMansGlcNAc2的巴斯德畢赤氏酵母菌林，如在圖10B中所示。至少60%的7V-聚糖為GlcNAcMan5GlcNAc2。迄今為止，還沒(méi)有才艮告描述在任何酵母中的分泌性可溶糖蛋白上形成GlcNAcMan5GlcNAc2。本文提供的結(jié)果表明，同GnTI活性一起加入U(xiǎn)DP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)體產(chǎn)138生GlcNAcMansGlcNAc2為主的結(jié)構(gòu)，這由處于1457(m/z)的峰證實(shí)(圖IOB)。菌抹PBP-3的構(gòu)建—種用于將CMP-唾液酸生物合成途徑克隆入真菌宿主性的引物對(duì)(分別為以下的表12和圖17、16和15)由大腸桿菌基因組DNA擴(kuò)增大腸桿菌7Ve"、A^ew5和7VewC基因。將小鼠N-乙酰神經(jīng)氨酸-9-磷酸合酶基因的PCR擴(kuò)增片段連接入酵母整合載體pJN335中的A^/-Pac/位點(diǎn)，處于GAPDH啟動(dòng)子控制下，使用ADE作為正選擇標(biāo)記，產(chǎn)生pSH285。用攜帶以上基因片段的載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)生ManNAc-6-P的巴斯德畢赤氏酵母菌抹，并篩選轉(zhuǎn)化體。16.鑒定、克隆和表達(dá)編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸-9-磷酸酶的基因10407J已檢測(cè)了大鼠肝細(xì)胞的胞質(zhì)級(jí)分中的N-乙酰神經(jīng)氨酸-9-磷酸酶活性(VanRinsum,1984)。我們已重復(fù)了該方法，并分離出含143有選擇性針對(duì)NeuAc-9-P的磷酸酶活性的細(xì)胞提取物級(jí)分。該級(jí)分的SDS-PAGE電泳鑒定出單一蛋白條帶。隨后，將該樣品電印跡到PDVF膜上，通過(guò)Edman降解鑒定N-末端氨基酸序列。所鑒定的序列使得可以產(chǎn)生針對(duì)該分離蛋白的ORF的5'-末端的簡(jiǎn)并寡核苷酸。使用這些簡(jiǎn)并引物連同在大鼠肝Marathon-readycDNA文庫(kù)(Clontech)中提供的API引物，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，分離全長(zhǎng)ORF。隨后將完整的ORF連接入酵母整合載體pJN347中，處于GAPDH啟動(dòng)子控制下，使用HIS基因作為正選擇標(biāo)記。用攜帶所需基因片段的載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)生NeuAc-9-P的巴斯德畢赤氏酵母菌林，并如在本實(shí)施例的上文所述篩選轉(zhuǎn)化體。17.在巴斯德畢赤氏酵母中克隆和表達(dá)CMP-唾液酸合酶基因?qū)⑿∈驝MP-Sia合酶基因的PCR擴(kuò)增片段連接入酵母整合載體pJN346中的Notl-Pacl位點(diǎn)，處于GAPDH啟動(dòng)子控制下，用ARG基因作為正選擇標(biāo)記。用攜帶以上基因片段的載體轉(zhuǎn)化產(chǎn)生唾液酸的巴斯德畢赤氏酵母菌抹，并如在本實(shí)施例中的上文所述篩選轉(zhuǎn)化體。同樣，擴(kuò)增人CMP-Sia合酶基因(GenbankAN:AF397212),并連4矣入酵母表達(dá)載體pJN346的^^/-/\^/位點(diǎn)，處于GAPDH啟動(dòng)子控制下，用ARG作為正選擇標(biāo)記，產(chǎn)生載體pSH257。用pSH257通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化能夠產(chǎn)生唾液酸的巴斯德畢赤氏酵母菌^^朱，產(chǎn)生能夠產(chǎn)生CMP-Sia的菌抹。18.在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)雜合CMP-Sia途徑用20mg含有7VewC(pSH256)、Wew5(pSH255)和hCMP-Sia合酶(pSH257)的每種載體通過(guò)電穿孔超轉(zhuǎn)化或者同時(shí)轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤氏酵母菌林JC308(Cereghino,2001)。將產(chǎn)生的細(xì)胞鋪板在補(bǔ)加組氨酸的最小培養(yǎng)基(含有1.34g/1酵母氮源、200mg/1生物素、2g/1葡萄糖、20g/1瓊脂和20mg/1L-組氨酸)上。在于30°C溫育4天后，通過(guò)再貼在補(bǔ)加組氨酸的最小培養(yǎng)基平板(關(guān)于組成參見(jiàn)上文)上分離幾百個(gè)克隆。再貼的克隆生長(zhǎng)2天，之后對(duì)克隆進(jìn)行菌落PCR(如在本實(shí)施例中的上文所述)。使用對(duì)WewC、A^ewS和hCMP-Sia合酶特異性的引物證實(shí)在轉(zhuǎn)化克隆中存在每個(gè)ORF。將對(duì)全部3個(gè)ORF都為陽(yáng)性的12個(gè)克隆(稱(chēng)為YSH99a-I)在含有200ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基(含有2.68g/1酵母氮源、200mg/1生物素、20mg/1L-組氨酸和2g/1葡萄糖)的有擋板燒瓶中培養(yǎng)。通過(guò)在有或沒(méi)有20mMManNAc的情況下培養(yǎng)細(xì)胞研究生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)加ManNAc的作用。在有擋板的燒瓶中于30°C生長(zhǎng)4-6天后，沉淀細(xì)胞，并如本實(shí)施例中的下文所述分析唾液酸途徑中間體的存在情況。f0410j使用本實(shí)施例的下文概述的測(cè)定比較細(xì)胞提取物，在沒(méi)有外源CMP-Sia的情況下生長(zhǎng)的巴斯德畢赤氏酵母YSH99a的細(xì)胞提取物顯示出將Sia轉(zhuǎn)移到受體底物上，表明存在內(nèi)源CMP-Sia產(chǎn)生(圖25)。單和雙唾液酸化雙觸角N-聚糖于它們各自的相應(yīng)時(shí)間20分鐘和23分鐘洗脫。另外，隨后的唾液酸酶處理表明除去了唾液酸(圖26)。因此，用如上所述的雜合CMP-Sia生物合成途徑工程改造的、含有WeMC、iVewS和hCMP-Sia合酶的酵母菌林顯示出能夠產(chǎn)生內(nèi)源CMP-唾液酸庫(kù)。19.測(cè)定遺傳改變的巴斯德畢赤氏酵母中胞苷-5'-單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸的存在情況用冷的PBS緩沖液洗滌酵母細(xì)胞3次，并懸浮在100mM碳酸氫銨pH8.5中，并保持在水上。使用Frenchpressure細(xì)胞破石W義接著超聲裂解細(xì)胞。通過(guò)超離心使可溶性細(xì)胞內(nèi)容物與細(xì)胞碎片分離。將水冷的乙醇加至上清液，達(dá)到60%的終濃度，在冰上保持15分鐘，之后通過(guò)超離心除去不溶性蛋白。冷凍上清液，通過(guò)凍干濃縮。將干燥的樣品重懸浮在水中(確保pH為8.0),然后通過(guò)預(yù)沖洗的10,000MWCOCentricon柱過(guò)濾。濾過(guò)液在MonoQ離子交換柱上按照生產(chǎn)145商的說(shuō)明分離，合并與確實(shí)的CMP-唾液酸共洗脫的洗脫級(jí)分后凍干。在唾液酸基轉(zhuǎn)移酶存在下雙觸角半乳糖基化N-聚糖與巴斯德畢赤氏酵母YSH99a菌抹的提取物溫育產(chǎn)生唾液酸化N-聚糖，其隨后如下#1去唾液酸化使唾液酸化^f品通過(guò)10,000截留分子量的Microcon柱，以除去轉(zhuǎn)移酶。用100pl水洗滌該柱2次，將所述水與初始洗脫液合并。通過(guò)HPLC分析洗脫液(圖26)產(chǎn)生的譜類(lèi)似于Microcon處理之前的HPLC譜。將余下的樣品凍干至干燥，并重懸浮在25^lxNEBGl緩沖液中。在加入100U唾液酸酶(NewEnglandBiolabs#P0720L,Beverley,MA)后，于37°C過(guò)夜溫育重懸浮的樣品，之后如前所述進(jìn)行HPLC分析。實(shí)施例17工程改造能夠?qū)⑼僖核徂D(zhuǎn)移至N-聚糖的巴斯德畢赤氏酵母菌林已如本文詳述產(chǎn)生了能夠在體內(nèi)將唾液酸轉(zhuǎn)移至N-聚糖的巴斯德畢赤氏酵母菌林。21.產(chǎn)生用于表達(dá)人UDP-GlcNAc-2-差向異構(gòu)酶/N-乙酰甘露糖胺激酶0iGNK)和N-乙酰神經(jīng)氨酸-9-磷酸合酶(HsiaPsvn)的pSH321b140415]使用寡核苦酸引物GGGAGAATGCGGCCGCCACCATGGAGAAGAATGGAAATAACCGAAAGCTGCG(hGNENotl/Koz)(SEQIDNO:77)和CCTTAATTAACTAGTAGATCCTGCGTGTTGTGTAGTCCAGAAC(hGNEPaclrev)(SEQIDNO:78)和AdvantageDNA聚合酶(BDBiosciences),按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，作為Notl-Pacl片段由人肝臟cDNA擴(kuò)增編碼人UDP-GlcNAc-2-差向異構(gòu)酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(hGNE;Genbank登錄號(hào)AJ238764)的基因序列。用于熱循環(huán)的條件如下95°C，2分鐘，1個(gè)循環(huán)；97°C、30秒，60°C、30秒，72°C、5分鐘，25個(gè)循環(huán)；72°C,5分鐘。將產(chǎn)生的2.2Kb片段克隆入pCR2.1(Invitrogen)中，測(cè)序，稱(chēng)為pSH281。將hGNE作為Notl-Pacl片段由pSH281克隆入pJN348(如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)2004/0230042中所述)中，產(chǎn)生載體pSH284。在含200mLBMGY培養(yǎng)基的帶擋板燒瓶中培養(yǎng)得自菌落PCR的陽(yáng)性克隆，所述培養(yǎng)基由2.68g/L酵母氮源、200mg/L生物素和2g/L葡萄糖組成，根據(jù)菌抹補(bǔ)加氨基酸。將含有PMAhSiaPsyn表達(dá)盒的、得自pSH315的2.6KbXhol片段連接入pSH284的Xhol位點(diǎn)，產(chǎn)生雙表達(dá)盒載體pSH321b(圖28)。22.表達(dá)涉及產(chǎn)生半乳糖基化糖蛋白的基因的pJN711b的產(chǎn)生使用引物RCD192(5，-GCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCCCAAC-3，)(SEQIDNO:89)和RCD186(5'陽(yáng)CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCACTGT-3，)(SEQIDNO:90)由人腎臟cDNA(Marathon-ReadycDNA,Clontech)PCR擴(kuò)增人|3-1,4_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I基因(/2Ga/77，Genbank登錄號(hào)AH003575)。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆入pCR2.1栽體(Invitrogen，Carlsbad,CA)中，并測(cè)序。由該克隆進(jìn)行PCR重疊誘變，用于3個(gè)用途l)除去可讀框中的Notl位點(diǎn)，同時(shí)保持野生型蛋白序列；2)截短緊鄰內(nèi)源跨膜結(jié)構(gòu)域下游的蛋白；和3)在5，和3，末端導(dǎo)入AscI和PacI位點(diǎn)，用于分子克隆。為做到這些，使用引物RCD198(5，-CTTAGGCGCGCCGGCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCC-3，)(SEQIDNO:91)和RCD201(5，-GGGGCATATCTGCCGCCCATC-3，)(SEQIDNO:92)擴(kuò)增該基因的5'末端至Notl位點(diǎn)，用引物RCD200(5，-GATGGGCGGCAGATATGCCCC-3，)(SEQIDNO:93)和RCD199(5，-CTTCTTAATTAACTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3，)(SEQIDNO:94)擴(kuò)增3，末端。將產(chǎn)物與引物198和199重疊在一起，以再合成具有野生型氨基酸序列的ORF,同時(shí)消除NotI位點(diǎn)。將新截短的hGalTIPCR產(chǎn)物克隆入pCR2.1載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并測(cè)序。然后使用導(dǎo)入的Ascl/Pacl位點(diǎn)將所述片段亞克隆入為PpURA3/HYGR轉(zhuǎn)入(roll-in)載體的質(zhì)粒pRCD259中，產(chǎn)生pRCD260。將如本文所述的酵母靶向序列跨膜結(jié)構(gòu)域的文庫(kù)連接入位于/jG"/T7基因上游的Notl/AscI位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pXB20-pXB67。pXB53為按讀框連接至43個(gè)N-末端氨基酸缺失的人(31,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I(Genbank登錄號(hào)AH003575)的截短的釀酒酵母Mnn2(s)靶向肽(Genbank登錄號(hào)NP—009571的MNN2的1-108核普酸)。0421使用以上載體，構(gòu)建pJN"711b(圖29),其為含有/2Ga/7Y-53、P(9C///-5^a4L￡:和DwVGr的HYGR質(zhì)粒。23.產(chǎn)生用于表達(dá)人CMP-唾液酸合酶OiCMP-Siasvn)和小鼠CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(mCMP-SiaTr)的pSH326b使用以上對(duì)hGNE描述的條件，但使用2分鐘延伸時(shí)間而不是5分鐘，由大鼠肝臟cDNA擴(kuò)增N-末端缺失的大鼠ST6Gal(Genbank登錄號(hào)M18769)。引物為GGCGCGCCAGCAAGCAAGACCCTAAGGAAGACATTCC(rST6Ga11d63AscI)(SEQIDNO:101)和CCTTAATTAATCAACAACGAATGTTCCGGAAGCCAGAAAGG(rST6Ga11PacI)(SEQIDNO:102)。將產(chǎn)生的片段克隆入pCR2.1(Invitrogen)中，測(cè)序，并命名為pSH271。隨后，將含有編碼的rST6Gal催化結(jié)構(gòu)域的1kb片段亞克隆入諾爾絲菌素選擇載體(Hansen,2003)中，產(chǎn)生rST6Gal與Mnn2的前108個(gè)減基對(duì)(前導(dǎo)序列53)的融合體，其處于PMA啟動(dòng)子控制之下。產(chǎn)生的載體被命名為pSH370(圖31)。25.產(chǎn)生用于表達(dá)甘露糖苷酶II(MannID和GnTII的pSH373用Sfil消化pSH568，并轉(zhuǎn)化入菌抹YSH272中，該菌抹以類(lèi)似于YSH160的方式產(chǎn)生，只是省去了rST6Gal導(dǎo)入，并使用載體pSH505代替pSH373。在載體pSH505中,將MannII和GntII基因分別作為前導(dǎo)序列4和前導(dǎo)序列5的融合體導(dǎo)入。分別地，前導(dǎo)序列4含有釀酒酵母/ws"前導(dǎo)序列，而前導(dǎo)序列5含有釀酒酵母/ww/w。參見(jiàn)US2002/0137134。27.在酵母中工程改造唾液酸向N-聚糖的體內(nèi)轉(zhuǎn)移t0431j巴斯德畢赤氏酵母YSH1(Hamilton,2003)用作初始宿主菌林，以工程改造產(chǎn)生唾液酸化糖蛋白必需的糖基化機(jī)器。用Apal消化的pSH321(hGNE,hSiaPsyn,URA3;上文描述)轉(zhuǎn)化YSH1(Ura3-)，使用Ura3作為選擇性標(biāo)記鑒定出稱(chēng)為YSH103的陽(yáng)性克隆。然后，使用Hyg作為選擇性標(biāo)記，用Sfil消化的pJN711b(hGalTI-53,POCHl-SpGALE,DmUGT,Ahisl::Hyg;上文描述)轉(zhuǎn)化YSH103。選擇稱(chēng)為YSH116(Ahisl)的轉(zhuǎn)化體，并使用Kan作為選擇性標(biāo)記，用BspEI消化的pSH326(hCMP-Siasyn,mCMP-SiaTr;上文描述)轉(zhuǎn)化。選擇稱(chēng)為YSH125(Ahisl)的轉(zhuǎn)化體，并用EcoRI消化的pSH370(rST6Gal;上文描述)轉(zhuǎn)化，使用Nat作為選擇性標(biāo)記(Hansen,2003)選擇陽(yáng)性克隆。選擇稱(chēng)為YSH145(Ahisl)的轉(zhuǎn)化體，隨后用Sfil消化的pSH373(MannII,GnTII,(Aargl::Hisl);上文描述)轉(zhuǎn)化，使用其作為選擇性標(biāo)NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的糖蛋白，如在圖36中所示?；蛘撸x擇YSH125(Ahisl)，并用Sfil消化的pSH568(密碼子優(yōu)化的hST6Gal)轉(zhuǎn)化，使用Nat作為選擇性標(biāo)記選擇陽(yáng)性克隆。選擇轉(zhuǎn)化體，隨后用Sfil消化的pSH505(MannlI,GnTII,(Aargl::Hisl);上文描述)轉(zhuǎn)化。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體被稱(chēng)為YSH272(Aargl),其產(chǎn)生表現(xiàn)出寡糖結(jié)構(gòu)NANA2Gal2GlcNAc2Mari3GlcNAc2的糖蛋白，如在圖37中所示。所有的酵母菌林都通過(guò)電穿孔(按照電穿孔儀BioRad生產(chǎn)商所推薦的)轉(zhuǎn)化。通過(guò)PCR證實(shí)整合到宿主基因組中(Nett,2005)。28.聚糖分析使用MALDI-TOFMS分析在每個(gè)上述菌4^中表達(dá)的重組Kringle3糖蛋白上的寡糖。在菌林YSH126(其中菌抹YSH116用pSH326進(jìn)一步轉(zhuǎn)化)中產(chǎn)生的糖蛋白的聚糖分析顯示了與聚糖結(jié)構(gòu)GalGlcNAcMan5GlcNAc2—致的質(zhì)量，證實(shí)了末端半乳糖殘基的體內(nèi)轉(zhuǎn)移(圖35)。在菌林YSH145中產(chǎn)生的糖蛋白的聚糖分析顯示出與聚糖結(jié)構(gòu)NANAGalGlcNAcMansGlcNAc2—致的質(zhì)量，證實(shí)了唾液酸體內(nèi)轉(zhuǎn)移至至少一個(gè)寡糖分支上(圖35和36)。表13匯總了在按照本文公開(kāi)的本發(fā)明方法制備的工程改造的巴斯德畢赤氏酵母菌抹中唾液酸體內(nèi)轉(zhuǎn)移至重組糖蛋白上的程度。值代表了含有唾液酸并因此對(duì)唾液酸酶處理敏感的總聚糖的百分率。表13.在酵母中的體內(nèi)唾液酸轉(zhuǎn)移<table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table>用于實(shí)施例17中所述試驗(yàn)的材料和方法在含有150mlBMGY培養(yǎng)基的500ml帶擋板容量瓶中接種1ml種子培養(yǎng)物(參見(jiàn)搖瓶培養(yǎng))。使接種物于24°C生長(zhǎng)至OD6()()為4-6(大約18小時(shí))。然后離心來(lái)自接種培養(yǎng)物的細(xì)胞，并將其重懸于50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基CaS04.2H200.30g,K2S046.00g,MgS04.7H205.00g,甘油40.0g,PTMl鹽2.0ml，生物素4xl(T3g,H3P04(85%)30ml,PTM1鹽每升CuS04.H206.00,Nal0.08g，MnSO4,7H2O3.00g，NaMo04.2H200.20g，H3BO30.02g,CoCl2.6H200.50g，ZnCl220.0g,FeS04.7H2065.0g，生物素0.20g，H2S04(98%)5.00ml)中。在3升碟形底(1.5升初始裝料體積)Applikon生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵罐在溫度24。C以補(bǔ)料分批模式運(yùn)行，pH用300/。氫氧化銨控制在4.5±0.1。通過(guò)調(diào)整攪拌速度(450-900rpm)和純氧供應(yīng)，將溶解氧保持在相對(duì)于1大氣壓(atm)空氣飽和度的40%以上。將空氣流速保持在1wm。當(dāng)分批階段中的初始甘油(40g/W皮耗盡時(shí)(這可由DO增加指示)，以12ml/l/h的補(bǔ)料速率添加包含12ml/1PTM1鹽的50%甘油溶液，直至達(dá)到所需生物量濃度。在半小時(shí)的饑餓期后，開(kāi)始甲醇補(bǔ)料(含有12ml/lPTMl的100%甲醇)。用甲醇補(bǔ)料速率將發(fā)酵罐中的甲醇濃度控制在0.2%-0.5%之間。采用位于發(fā)酵罐尾氣處的TGS氣體傳感器(FigaroEngineeringInc.的TGS822)在線測(cè)量甲醇濃度。每隔8小時(shí)對(duì)發(fā)酵罐取樣并分析生物量(OD6(K)、細(xì)胞濕重和細(xì)胞計(jì)數(shù))、殘余碳源水平(采用Aminex87H通過(guò)HPLC分析甘油和甲醇)和胞外蛋白含量(通過(guò)SDSpage和Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定法)。155報(bào)告蛋白表達(dá)、純化和N-聯(lián)聚糖的釋放在BeckmanBioMek2000樣品處理機(jī)器人(Beckman/CoulterRanchCucamonga，CA)上使用96-孔形式純化Kringle3。使用C-末端六組氨酸標(biāo)記從表達(dá)培養(yǎng)基中純化Kringle3。機(jī)器人純化是對(duì)Novagen所提供的用于其HisBind樹(shù)脂的規(guī)程的改進(jìn)。簡(jiǎn)言之，將150uL(pL)沉降體積的樹(shù)脂注入96-孔裂解物結(jié)合平板的孔中，用3體積的水洗滌，加載5體積的50mMNiS04，并用3體積的結(jié)合緩沖液(5mM咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HClpH7.9)洗滌。以3:2培養(yǎng)基/PBS(60mMP04,16mMKC1,822mMNaClpH7.4)稀釋蛋白表達(dá)培養(yǎng)基，并加載到柱上。引流后，用10體積的結(jié)合緩沖液和6體積的洗滌緩沖液(30mM咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HClpH7.9)洗滌柱，并用6體積的洗脫緩沖液(1M咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HClpH7.9)洗脫蛋白。通過(guò)冷凍干燥將洗脫的糖蛋白蒸發(fā)至干燥。N-聯(lián)聚糖的釋放按照Laemmli(Laemmli1970)通過(guò)SDS/PAGE分離蛋白。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析法通過(guò)使用4ns脈沖時(shí)間的脈沖氮激光器(337nm)照射產(chǎn)生離子。采用延遲引出沖莫式以125ns延遲和20kV加速電壓操作該儀器。柵極電壓為93.00%,導(dǎo)線電壓為0.10%,內(nèi)壓小于5xl(^托，低質(zhì)量門(mén)為875Da。由總共100-200次激光脈沖生成譜，并用2GHz數(shù)字轉(zhuǎn)換器獲取所述譜。MansGlcNAc2寡糖用作外部分子量標(biāo)準(zhǔn)。全部譜均采用該儀器以正離子模式生成。譜的估計(jì)質(zhì)量精確度為0.5%。實(shí)施例18工程改造乳克魯維氏酵母細(xì)胞，以產(chǎn)生具有結(jié)構(gòu)Man5GlcNAc2的7V-聚糖鑒定和破壞乳克魯維氏酵母OC///基因芽殖酵母釀酒酵母的OC///基因編碼1,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶負(fù)責(zé)將首個(gè)高爾基體定位的甘露糖添加至分泌蛋白上的Man8GlcNAc2A^聚糖結(jié)構(gòu)(Nakanishi-Shindo，1993)。該甘露糖轉(zhuǎn)移一般被認(rèn)為是W-聚糖結(jié)構(gòu)的真菌特異性聚甘露糖基化中的關(guān)鍵起始步驟(Nakanishi-Shindo等，1993;Nakayama,1992;Morin曙Ganet，2000)。在釀酒酵母中缺失該基因產(chǎn)生不包含這種典型的聚甘露糖基化的顯著較短的W-聚糖結(jié)構(gòu)，或者在提升的溫度時(shí)產(chǎn)生生長(zhǎng)缺陷(Nakayama，1992)。在高嚴(yán)格性(Sambrook等，1989)下使用302bp的PCR產(chǎn)物探測(cè)乳克魯維氏酵母菌林(MGl/2)的基因組DNA的DNA印跡。觀測(cè)到雜交模式與單個(gè)基因一致，表明對(duì)應(yīng)于部分乳克魯維氏酵母基因組和乳克魯維氏酵母COOC7/7)的該302bp區(qū)段含有單個(gè)拷貝的該基因。為克隆完整的A70C/i7基因，使用DNA印跡作圖基因組基因座。因此，通過(guò)消化基因組DNA,并將這些在5.2kb范圍內(nèi)的片段連接入pUC19(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)中，克隆5.2kb的5awffl/尸M片段，以產(chǎn)生乳克魯維氏酵母亞基因組文庫(kù)。將此亞基因組文庫(kù)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，并使用RCD33/34通過(guò)菌落PCR檢驗(yàn)幾百個(gè)克隆。測(cè)序含有預(yù)測(cè)的幻(9C///基因的5.2kb克隆，1362bp的可讀框編碼的預(yù)測(cè)蛋白與釀酒酵母OC/^基因46.5%相同。使用該5.2kb序列制備引物，用于使用PCR重疊法(Davidson,2002)構(gòu)建ocW::&4A^缺失等位基因。將該缺失等位基因轉(zhuǎn)化入兩個(gè)乳克魯維氏酵母菌林中，并選擇G418抗性菌落。通過(guò)PCR和對(duì)溫度的敏感性篩選這些菌落，以獲得缺失OC7/70RF的菌抹。試驗(yàn)結(jié)果顯示了揭示突變體PCR模式的菌林，通過(guò)分析其于多個(gè)溫度的生長(zhǎng)和在PNG酶消化之后對(duì)分泌的蛋白和細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行7V-聚糖糖分析對(duì)所述菌林進(jìn)行表征。oc//突變賦予溫度敏感性，使菌林于30。C生長(zhǎng)，但在35。C不生長(zhǎng)。圖12A顯示了產(chǎn)生Mari8GlcNAc2[cj和更高的N-聚糖的野生型乳克魯維氏酵母菌^f朱的MALDI-TOF分析。鑒定、克隆和破壞乳克魯維氏酵母MMV/基因10451]釀酒酵母是高爾基體a-l,3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)基因。MMW的產(chǎn)物為762個(gè)氨基酸的II型膜蛋白(Yip，1994)。分離自w朋7突變體的AM關(guān)和6M關(guān)寡糖沒(méi)有a-l,3-甘露糖鍵(Raschke,1973)。0452使用釀酒酵母的Mw/p序列檢索乳克魯維氏酵母翻譯的基因組序列(PEDANT)。鑒定出1個(gè)405bp的DNA序列，其編碼與M""7p顯著相似的推定蛋白片段。隨后用引物KMN1(TGCCATCTTTTAGGTCCAGGCCCGTTC)(SEQIDNO:36)和KMN2該序列的內(nèi)部區(qū)段，并用于探測(cè)乳克魯維氏酵母菌林(MGl/2)的基因組DNA的DNA印跡?；贒NA雜交數(shù)據(jù)，通過(guò)如本文所述產(chǎn)生進(jìn)行了大小選擇的文庫(kù)克隆4.2Kb的片段。通過(guò)使用引物KMN1(SEQIDNO:36)和KMN2(SEQIDNO:37)進(jìn)行全菌落PCR鑒定出含有乳克魯維氏酵母MAW7基因的單個(gè)克隆，并測(cè)序。在該克隆中，鑒定出2241bpORF，其編碼的預(yù)測(cè)蛋白與釀酒酵母MAW/基因34%相同。設(shè)計(jì)引物，用于使用PCR重疊法(Davidson,2002)構(gòu)建m朋7::AC4缺失的等位基因。糖基化酶是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的內(nèi)在膜蛋白。靶向和定位信號(hào)一般包含在胞質(zhì)和/或跨膜結(jié)構(gòu)域中，在某些情況下包含在某些腔結(jié)構(gòu)域中。例如，將GFP靶向高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)需要組成跨膜結(jié)構(gòu)域的52個(gè)氨基酸、9個(gè)胞質(zhì)氨基酸和a-2，6-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶的26個(gè)腔氨基酸(Boevink,1998)。因此，如在實(shí)施例11中所述產(chǎn)生編碼細(xì)胞靶向信號(hào)肽的序列文庫(kù)，其或者僅含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體特異性蛋白的胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域，或者含有所述蛋白的胞質(zhì)、跨膜和腔結(jié)構(gòu)域?？梢杂蒃R和高爾基體駐留的植物、酵母或動(dòng)物蛋白選擇靶向肽序列。糖基化相關(guān)蛋白，例如酶(或其催化結(jié)構(gòu)域)，如糖基化酶或內(nèi)在膜酶，可以按讀框融合至靶向肽序列文庫(kù)，并導(dǎo)入植物中(圖13)。植物革巴向肽序列對(duì)于將嵌合酶定位于ER和高爾基體可能是最有效的，盡管真菌和哺乳動(dòng)物的靶向肽序列也可能是有效的。例如，業(yè)已表明，煙草iV-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶I的N-末端的77個(gè)氨基酸正確地將報(bào)告蛋白靶向高爾基體(Essl,1999)。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有這77個(gè)氨基酸(或這些氨基酸的一部分)的一個(gè)或多個(gè)N-末端片段與含有GlcNAc轉(zhuǎn)移酶IV的催化結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)片段融合。至少1個(gè)所獲融合蛋白正確地將功能性GlcNAc轉(zhuǎn)移酶IV定位于植物細(xì)胞中的高爾基體，這通過(guò)使用本文描述的技術(shù)監(jiān)測(cè)存在于或?qū)胫参锼拗骷?xì)胞中的報(bào)告糖蛋白的糖基化狀態(tài)來(lái)證實(shí)?；蚪痤w粒轟擊培養(yǎng)的植物細(xì)胞，而在電穿孔方法中，用刺穿細(xì)胞的電脈沖處理在DNA(啟動(dòng)子:耙向肽-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶IV-終止子::選擇性標(biāo)記)溶液中的植物細(xì)胞，使細(xì)胞攝取DNA。然后，培養(yǎng)細(xì)胞，并回收細(xì)胞。通過(guò)在適宜的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)和再生植》f朱選擇適宜的轉(zhuǎn)化體。使用大豆子葉節(jié)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)工程改造大豆，以表達(dá)GlcNAc轉(zhuǎn)移酶IVGlcNAc轉(zhuǎn)移酶I涉及將GlcNAc添加至末端a-l,3甘露糖殘基，以形成MansGlcNAc2，這是復(fù)合N-聚糖成熟必需的步驟。盡管已由植物分離出GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I，并似乎與其哺乳動(dòng)物同源物具有相同的功能，但其對(duì)于哺乳動(dòng)物或外源蛋白的糖基化可能不是最有效的酶，且可能不是存在于每個(gè)植物物種中。由于向末端a-l,3甘露糖殘基添加GlcNAc在哺乳動(dòng)物糖基化途徑中是受控的步驟，所以獲得可有效進(jìn)行該步驟的轉(zhuǎn)基因植物是有利的。為產(chǎn)生表達(dá)GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I(其可有效用于促進(jìn)復(fù)合N-聚糖的形成)的轉(zhuǎn)基因植物，按照本文描述的方法，將分離自或得自多種生物的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I的文庫(kù)按讀框融合至多個(gè)靶向#_物高爾基體的肽序列。如以上對(duì)GlcNAc轉(zhuǎn)移酶IV的描述，將由此產(chǎn)生的組合文庫(kù)導(dǎo)入植物細(xì)胞或生物中。使用顆粒轟擊工程改造玉米，以表達(dá)GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I卩l(xiāng),4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是一種重要的人糖基轉(zhuǎn)移酶，其在植物中不存在。Lerouge，1998。在哺乳動(dòng)物中，a-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶定位于高爾基體中，負(fù)責(zé)將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至復(fù)合N-聚糖的核心Man3GlcNAc2的末端N-乙酰葡糖胺。在植物中，Man3GlcNAc2核心含有pi,2-木糖和al，3-巖藻糖殘基，沒(méi)有(31,4-半乳糖。木糖和巖藻糖修飾涉及變態(tài)反應(yīng)，并用作抗原性表位，因此不是所需的治療性蛋白修飾。04711通過(guò)pi，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的半乳糖修飾可能對(duì)治療性蛋白正確發(fā)揮作用很重要。在哺乳動(dòng)物中，pi,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶I和N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶II之后起作用，已表明其啟動(dòng)復(fù)合N-聚糖的分支。Lerouge,1998;Palacpac,1999。在煙草細(xì)胞中，業(yè)已表明人pi,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)產(chǎn)生巖藻糖和木糖修飾減少的半乳糖基化N-聚糖。Bakker,2001;Fujiyama,2001;Palacpac,1999。在這些研究中，將人(31,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的1.2kb的片段克隆在花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(35SCaMV)的下游，導(dǎo)入二元載體pGA482中，并最終導(dǎo)入煙草細(xì)胞中。Palacpac,1999。0472使用Rempei等(Rempei,1995)描述的農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞。煙草細(xì)胞的轉(zhuǎn)化也已被描述(An,1985)。pi,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在35SCaMV之下的表達(dá)導(dǎo)致該基因在煙草細(xì)胞中遍在表達(dá)。表達(dá)人卩l(xiāng),4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的煙草細(xì)胞顯示出存在半乳糖基化N-聚糖。(Palacpac,1999;Bakker1991)表明，將表達(dá)人(31,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的煙草植抹與表達(dá)小鼠抗體的重鏈和輕鏈的植林雜交，產(chǎn)生其中抗體顯示出30。/o半乳糖基化的植抹(Bakker,2001)。[0473可以構(gòu)建組合DNA文庫(kù)，以獲得pi,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶植物細(xì)胞系，用于添加半乳糖殘基。組合DNA文庫(kù)可以有效產(chǎn)生更有效添加半乳糖殘基的細(xì)胞系。一旦產(chǎn)生這樣的細(xì)胞系，就可以容易地使表達(dá)其它糖基化酶的細(xì)胞系與表達(dá)治療性蛋白的細(xì)胞系雜交，產(chǎn)生具有人樣糖基化的治療性蛋白。然后，最終的細(xì)胞系可凈皮培育成植抹并收獲，以提取蛋白，或者可被培養(yǎng)成在懸浮培養(yǎng)物中的植物細(xì)胞，以在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)蛋白。通過(guò)使用信號(hào)肽文庫(kù)表達(dá)治療性蛋白，有可能將治療性蛋白保留在細(xì)胞中，或者使它們分泌到培養(yǎng)基中。表達(dá)pi,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的煙草細(xì)胞分泌半乳糖基化N-聚糖(Ryo,2002)。盡管在表達(dá)pi,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的煙草植林中表達(dá)的辣根過(guò)氧化物酶同工酶C包含木糖和巖藻糖修飾，但在表達(dá)pi,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的煙草細(xì)胞(GT6細(xì)胞)中表達(dá)的辣根過(guò)氧化物酶同工酶C中不能檢測(cè)到木糖或巖藻糖修飾。(Fujiyama,2001)。這表明，在細(xì)胞系而不是全抹中表達(dá)治療性蛋白可能是有利的。工程改造植物，以產(chǎn)生唾液酸基轉(zhuǎn)移酶[0474在哺乳動(dòng)物中，唾液酸基轉(zhuǎn)移酶為外側(cè)高爾基體酶，其將末端唾液酸殘基添加至糖基化多肽。迄今為止，還沒(méi)有在植物中檢測(cè)到末端唾液酸殘基(Wee,1998)。Wee等在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)大鼠a-2,6-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶，并表明該酶正確地定位于高爾基體且有功能。Wee等證實(shí)，分離自轉(zhuǎn)基因擬南芥的膜在與CMPJH-唾液酸和無(wú)唾液酸胎J求蛋白受體溫育時(shí)，導(dǎo)致唾液酸殘基添加，而分離自野生型擬南芥的膜不能。盡管在擬南芥中表達(dá)大鼠oc-2,6-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能夠摻入唾液酸殘基的功能性酶，？旦使用本發(fā)明的文庫(kù)法(il描述)將哺乳動(dòng)物酶a-2,3-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和a-2,6-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶與多種轉(zhuǎn)運(yùn)肽融合可以在其它植物物種中產(chǎn)生更有效的唾液酸化。Wee等不得不分離膜，并將它們與CMPJH-唾液酸和無(wú)唾液酸胎球蛋白受體溫育，因?yàn)閿M南芥不具有CMP-唾液酸或其轉(zhuǎn)運(yùn)體。為了克服此額外步驟并在植物中獲得唾液酸添加，可以在表達(dá)a-2,3-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和a-2，6-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因植物中共表達(dá)CMP-唾液酸生物合成途徑和CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(參見(jiàn)實(shí)施例6、16和17)。作為替代，CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體可以在植物細(xì)胞中與a-2,3-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和a-2,6-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶共表達(dá)，所述植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，并在所述培養(yǎng)基中提供CMP-唾液酸或CMP-唾液酸的其它前體。在浮萍(Xem加)中表達(dá)a-2,3-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和a-2,6-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶[0475J如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,040,498('"498專(zhuān)利")中所述，可以使用農(nóng)桿菌和生物導(dǎo)彈法轉(zhuǎn)化浮萍。使用在'498專(zhuān)利中描述的方案，用耙向高爾基體的a-2,3-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和/或a-2,6-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶的文庫(kù)和哺乳動(dòng)物CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的文庫(kù)轉(zhuǎn)化浮萍。可以按照本文論述的篩選技術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)基因植林中產(chǎn)生具有末端唾液酸殘基的蛋白的那些柏」4朱(實(shí)施例17)。在煙草細(xì)胞中表達(dá)a-2,3-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和a-2,6-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶[04761如對(duì)(31,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶所描述，還可以將a-2,3-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和/或a-2,6-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和/或哺乳動(dòng)物CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體文庫(kù)導(dǎo)入在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的煙草細(xì)胞中?？上蚺囵B(yǎng)基加入CMP-唾液酸。可按照本文論述的篩選技術(shù)測(cè)定細(xì)胞和培養(yǎng)基(分泌性蛋白)這二者的具有末端唾液酸殘基的蛋白(實(shí)施例17)。實(shí)施例20工程改造昆蟲(chóng)細(xì)^,以產(chǎn)生糖基轉(zhuǎn)移酶0477昆蟲(chóng)細(xì)胞提供了用于產(chǎn)生糖蛋白的另一種機(jī)制，但產(chǎn)生的糖蛋白不是復(fù)合人樣糖蛋白。(Marz,1995;Jarvis,1997)。本發(fā)明的另一個(gè)特征是提供昆蟲(chóng)細(xì)胞中的酶，該酶革巴向分泌途徑中的細(xì)胞器。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，諸如糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸基轉(zhuǎn)移酶的酶在鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)細(xì)胞(Sf9)中被靶向ER、高爾基體或高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。已在Sf9細(xì)胞中表明了哺乳動(dòng)物J31,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。Hollister,1998。這些酶利用含有一般與該酶不結(jié)合的細(xì)胞靶向信號(hào)肽的嵌合蛋白被靶向。通過(guò)構(gòu)建含有如本文所述的耙向序列和糖基化酶的核酸文庫(kù)制備嵌合蛋白。通常使用在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的桿狀病毒表達(dá)進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中添加哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶。(Hollister，2001)。表ll:DNA和蛋白序列來(lái)源1.歐洲生物信息研究所(EBI)(生物信息學(xué)的研究和服務(wù)中心)2.Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)3.已知糖基轉(zhuǎn)移酶及其來(lái)源的清單4.人cDNA,Kumar等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:9948-99525.人基因，Hull等，(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.176:608-6156.小鼠cDNA,Kumar等，(1992)Glycobiology2:383-3931687.小鼠基因，Pownall等，(1992)Genomics12:699-7048.鼠基因(5，側(cè)翼，非編碼的)，Yang等，(1994)Glycobiology5:703-7129.兔cDNA,Sarkar等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:234-23810.大鼠cDNA,Fukada等，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.58:200-2011,2(GnimEC2.4H11.人基因，Tan等，(1995)Eur.丄Biochem.231:317-32812.大鼠cDNA,D，Agostaro等，(1995)J.Biol.Chem.270:15211-1522113.擬南芥cDNA，Strasser等，(1999)J.Glycoconj.16:787-79114.秀麗線蟲(chóng)基因，Chen等，(2002)Biochim.Biophys.Acta.1573:271-279Bl,4(GnTIII、EC2.4.1.14415.人cDNA,Ihara等，(1993)J.Biochem.l13:692-69816.鼠基因，Bhaumik等，(1995)基因164:295-30017.大鼠cDNA,Nishikawa等，(1992)J.Biol.Chem.267:18199-18204Bl,4(GnTIV)EC2.4.1.14518.人cDNA,Yoshida等，(1998)GlycoconjugateJournal15:1115-112319.牛cDNA,Minowa等，歐洲專(zhuān)利EP090523220.pi,6(GnTV)EC2.4.1.15521.人cDNA,Saito等，(1994)Biochem.Biophys.Res.Commun.198:318-32722.大鼠cDNA,Shoreibah等，(1993)J.Biol.Chem.268:15381-15385(31,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，EC2.4.1.90(LacNAcsynthetase)EC2.4丄22(乳糖合成酶)23.牛cDNA,D，Agostaro等，(1989)Eur.J.Biochem.183:211-21724.牛cDNA(部分)，Narimatsu等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:4720-472425.牛cDNA(部分)，Masibay&Qasba(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5733-537726.牛cDNA(5，末端)，Russo等，(1990)J.Biol.Chem.265:332427.雞cDNA(部分)，Ghosh等，(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.1215-122228.人cDNA,Masri等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.157:657-66329.人cDNA,(HeLa細(xì)胞)Watzele&Berger(1990)Nucl.AcidsRes.18:717430.人cDNA,(部分)，Uejima等，(1992)CancerRes.52:6158-616331.人cDNA,(癌癥)，Appert等，(1986)Biochem.Biophys.Res.Commun.139:163-16832.人基因，Mengle-Gaw等，(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.176:1269-127633.鼠cDNA,Nakazawa等，(1988)J.Biochem.104:165-16834.鼠cDNA,Shaper等，(1988)J.Biol.Chem.263:10420-1042835.鼠cDNA(新的)，Uehara&Muramatsu未發(fā)表36.鼠基因，Hollis等，(1989)Biochem.Biophys.Res,Commun.162:1069-107537.大鼠蛋白(部分)，Bendiak等，(1993)Eur，J.Biochem.216:405-4172，3-唾液酸基轉(zhuǎn)移酶，(ST3GalII)(N-聯(lián)WGal-l,3/4-GlcNAc)EC2.4.99.638.人cDNA,Kitagawa&Paulson(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.194:375-38239.大鼠cDNA,Wen等，(1992)J.Biol.Chem.267:21011-2101940.鼠cDNA,Lee等，(1994)J.Biol.Chem.269:10028-100332,6-唾液醋轉(zhuǎn)移酶,(ST6GalI)EC2.4.99.141.雞，Kurosawa等，(1994)Eur.J.Biochem219:375-38142.人cDNA(部分)，Lance等，(1989)Biochem.Biophys.Res.Commim.164:225-23243.人cDNA,Grundmann等，(1990)Nucl.AcidsRes.18:66744.人cDNA，Zettlmeisl等，(1992)專(zhuān)利EP0475354-A/345.人cDNA,Stamenkovic等，(1990)J.Exp.Med.172:641-643(CD75)46.人cDNA,Bast等，(1992)丄CellBiol.116:423-43547.人基因(部分)，Wang等，(1993)J.Biol.Chem.268:4355-436148.人基因(5，側(cè)翼)，Aasheim等，(1993)Eur.J.Biochem.213:467-47549.人基因(啟動(dòng)子)，Aas-Eng等，(1995)Biochim.Biophys.Acta1261:166-16950.小鼠cDNA,Hamamoto等，(1993)Bioorg.Med.Chem.1:141-14551.大鼠cDNA,Weinstein等，(1987)丄Biol.Chem.262:17735-1774352.大鼠cDNA(轉(zhuǎn)錄片段)，Wang等，(1991)Glycobiology1:25-31,Wang等，(1990)J.Biol.Chem.265:17849-1785353.大鼠cDNA(5'末端)，O，Hanlon等，(1989)J.Biol.Chem.264:17389-17394;Wang等，(1991)Glycobiology1:25-3154.大鼠基因(啟動(dòng)子)，Svensson等，(1990)J.Biol.Chem.265:20863-2068855.大鼠mRNA(片段)，Wen等，(1992)J.Biol.Chem.267:2512-2518[0478可在修飾糖基化的方法中使用的其它方法和試劑描迷于文獻(xiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,955,422、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,775,622、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,017,743、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,925,796、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,766,910、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,834,251、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,910,570、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,849,904、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,955,347、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,962,294、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,135,854、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,935,349、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,707,828和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,047,335。適宜的酵母表達(dá)系統(tǒng)可以得自諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MD)的來(lái)源。載體可由多種來(lái)源商購(gòu)。[0479J序列表SEQIDNO:1-6可見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?9/892,591。SEQIDNO:7引物在1,6甘露糖基轉(zhuǎn)移酶中高同源性的區(qū)域5，-atggcgaaggcagatggcagt-3，SEQIDNO:8引物在1，6甘露糖基轉(zhuǎn)移酶中高同源性的區(qū)域5"4tagtccttccaacttccttc誦3'SEQIDNO:9內(nèi)部引物5'-actgccatctgccttcgccat-3，SEQIDNO:10內(nèi)部引物5，-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，T7SEQIDNO:11內(nèi)部引物5，-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3，T3SEQIDNO:12引物atgcccgtggggggcctgttgccgctcttcagtagcSEQIDNO:13引物tcatttctctttgccatcaatttccttcttctgttcacggSEQIDNO:14引物ggcgcgccgactcctccaagctgctcagcggggtcctgttccacSEQIDNO:15引物ccttaattaatcatttctctttgccatcaatttccttcttctgttcacggSEQIDNO:16引物ggcg犯ctcggcctocccggccgctgagatcatttgtccagcttcaga172SEQIDNO:17引物gcccacgtcgacggatccgtttaaacatcgattggagaggctgacaccgctactaSEQIDNO:18引物cgggatccactagtatttaaatcatatgtgcgagtgtacaactcttcccacatggSEQIDNO:19引物ggacgcgtcg3cggcctacccggccgtocgaggaatttctcggatgactcttttcSEQIDNO:20引物cgggatccctc四gagatcttttttgtagaaatgtcttggtgcctSEQIDNO:21引物ggacatgcatgcactagtgcggccgccacgtgatagttgttcaattgattgaaatagggacaaSEQIDNO:22引物ccttgctogcttaattaaccgcggcacgtccgacggcggcccacgggtcccaSEQIDNO:23引物ggacatgcatgcggatccctta犯犯ccggcagcttgcaaattaaagccttcg3gcgtcccSEQIDNO:24引物gaaccacetcgacggccattgcggccaaaaccttttttcctattca認(rèn)acaaggcattgcSEQIDNO:25引物ctccaatactagtcg,attatcttctacggtgcctggaetcSEQIDNO:26引物tgg鄉(xiāng)gttt肌ac咖gctagagtaaaatagatatagcgagattagagaatgSEQIDNO:27引物a犯aattcggctggaaggccttgtaccttgatgtagttcccgttttcatcSEQIDNO:28引4勿gccca犯ccggecttoagggatctcctgatgactgactcactgataataaSEQIDNO:29引物gggcgcgtotttaaatactagtggatctatcgaatctaaatgtaagttaaaatctctaa173SEQIDNO:30引物ggccgcctgcagatttaaatgaattcggcgcgccttoatSEQIDNO:31引物tcgccg犯ttc3ttt犯atctgc3gggcSEQIDNO:32引物5，-tggcaggcgcgcctcagtcagcgctctcg-3，SEQIDNO:33引物5，-aggttaattaagtgctaattccagctagg-3，SEQIDNO:34用于乳克魯維氏酵母OC/i7基因的引物ccagaagaattcaattytgycartggSEQIDNO:35用于乳克魯維氏酵母OC/i7基因的引物cagtgaaaatacctggnccngtccaSEQIDNO:36用于乳克魯維氏酵母MMW基因的引物tgccatcttttaggtccaggcccgttcSEQIDNO:37用于乳克魯維氏酵母MWW基因的引物gatcccacgacgcatcgtatttctttcSEQIDNO:38推定的ZT/(9C///基因的302bp區(qū)段的DNA序列g(shù)cccttcagtgaaaatacctggcccggtccagttcataatatcggtaccatctgtatttttggcggttttcttttgttgatgtttgtaatttttgttgaacttctttttatccctcatgttgacattataatcatctgcaatgtcttttaatacttcagcatcatctaaaggaatgctgcttttaacatttgccacgctctccaatgttgttgcggtgatatttgtgatcaattcgcgcaataatggatggccagattttgattgtattgtccactgacaaaattgaattctctggaagggcSEQIDNO:39推定的幻(9C/Z7基因的翁3譯(排除引物)NVNMRDKKKFNKNYKHQQKKTAKNTDGTDI畫(huà)SEQIDNO:40推定的K/MMW基因的405bp區(qū)段的DNA序列cccagcgtgccattaccgtatttgccgccgtttgaaatactcaatattcatgatggttgte鄉(xiāng)cgttttttatcattcgcgatataatatgccatcttttaggtccaggcccgttctcttagctatctttggtgtctgtgctaccgtgatatggtacctattc籠cc3gtct犯tctg3鄉(xiāng)tggc卿tttg咖肌ggtagc認(rèn)ttc3鄉(xiāng)t3tctttc3C33ga3ccgtcgtt3tca-g3a-Ctta-tgtc娜-tgtg肌g3tc犯gcct3ttg3ag犯accccggtttcgcc3ttt卿3犯tata犯tcgttC33cgatotg3tSEQIDNO:41用于乳克魯維氏酵母基因的DNA序列:atggggttaccaaagatttcaagaagaacgaggtacattattgtcattgtgctgatactgtacttattgttttctgtgcaatggaatectgcgaaagtgaatcaccatttctat犯cagcattggcacggtgcttcccagtacagctcgcgtggatcacttgaacttgaaaaacttggacttagcaggtacgagcaataacggtgatcatttgatggatctacgagttcaattggctagtcaattcccctacgattctcgagtacccatccccaaaaaggtatggC卿cctgg犯g3ttgatccc3gttc333gtc3c8ggtttcttccatttc犯3atgcc3g3atg3ttgg3犯catttc昭tgc3tccg鄉(xiāng)33ccgccatatc3atecc犯tte3tc3c昭a(bǔ)tg3tc肌atg她cc3cttctegagcagctatatggtggggtcccac鄉(xiāng)tgat雄ggcttttgaatccttgccacttccaattcttEiaagcagaetttttcagatacttgatcctttatgcaagaggtggtatatattctgacatggatacgttcccattaaagccattgtcgtcatggccatcgacttctcagtcctacttttctegttt犯agaatccacaa鄉(xiāng)tatagaaattccttggacaaccttgaaacgctagaagcttcagaacctggctttgtcattggtatcg鄉(xiāng)ctgatccggatagaagcgattgggc卿gtggt3cgcc郷3g犯tec犯ttctgtc鄉(xiāng)gg3C3atecaatc3犯3tctggccatccattattgcgcg3attgatcac肌3tatc3ccgc犯c肌cattgg3g3gcgtggc肌3tgtt3肌3gc3gcattcctttagatgatgctgaagtattaaaagacattgcagatgattataatgtcaacatgagggataaaaag犯gttc3ac犯認(rèn)ttec犯acatca3C3a3ag肌肌ccgcc3a犯atacag3tggteccgatattatg3actggactggtccaggtattttttcagatgttattttccagtatctteateacgttatccagaagaatgatgacatttta3ttttc33tg3t33tctt3atgtt3tc33C33ac3tgg3tcc3a3C3tgat3C3actetg3gattctataa3gacattgttaaaaatttacaaaacgacaaaccctcattgttctggggattcttttcattgatgacagagcctattctagtggacgacatcatggtacttccgattacttctttctcaccaggtatcagaacaatgggcgctaaagaagacaacgacgagatggcatttgtteagcatatttttga鄉(xiāng)aagttggaaagactgaSEQIDNO:42推定的乳克魯維氏酵母OC///基因的翻譯TATTLESVANVKSSIPLDDAEVLKDIADDYNVNMRDKKK—FNKNYEPILVDDIMVLPITSFSPGIRTMGAKEDNDEMAFVKHIFEGSWKDZSEQIDNO:43乳克魯維氏酵母A/MW基因的DNA序列atgatggttgtaaggcgttttttatcagcttcgcgatataatatgccatcttttaggtccaggcccgttctcttagctatctttggtgtctgtgctaccgtgatatggtacctattctttttccagtctaatctgaagatggcagatttg犯aa鄉(xiāng)tagcaacttcaaggtatctttcacaagaaccgtcgttatcagaacttatgtcaaatgtgaagatcaagcctattgaagaaaccccggtttcgccattggagttgattccagatatcgaaatatcgactagaaagaaatacgatgcgtcgtgggatctgttgttccgtggtagaaaatataaatcgttcaacgattatgatcttoatacgaaatgtgagttttatttccagaatttatacaatttgaacgaggattggaccaataatattcggacgttcactttcgatattaacgatgtagacacgtctacgaaaattgacgctcttaaagattccgatggggttc組ggtggeicgagaaggctatacgtttatacaagagaacgcataacgttgccttggctapggaaaggttacgtctttatgataaatgttttgtcaatagtccaggttcaaacccattgaaaatggatcaccttttcagatcgaacaagaagagtaagactacggctttggatgacgaagtcactgggaaccgtgatacttttaccaagacgaagaaaacttcgttcttaagcgatatggacacgagtagtttccagaagtacgatcaatgggatttcg幼catagaatgttccccatgatcccatatttcgaggaacacaatttcaccaacgtgatgcctattttcaccggctcaaacggtggggaacctttacctcaEigggaaattcccggtattagatccaaaatccggtgaattgttacgtgtagagactttcagatatgataaatcgaaatcgctttggaagaactggaatgatatgtcctctgcttctggtaaacgtggtattatcttggctgctggcgacggccaagtggaccaatgcatccgtcttattgctacgttgagagctcaaggaaacgctctacctattcaaatt3tcc3c肌c犯ccEiattg3atg鄉(xiāng)3atotgtg犯3ctgttetcgg鄉(xiāng)ccgct朋3tcteccg33ttctc3tccggtagagctcaatctctttggttagtgaatgtgggccccacgttggaatcttcaatgaagagcaattttgggagatttaagaataagtggttgtcagttattttcaacacttttgaagaatttatattcatagatacagatgccatctcctacattaatatggctgattatttcaacttcaaggagtacaaatctactggaacactcttctttaaggataggtctttggcaattggaactgaacagaaatgtggtcctttgttcgaaactcttgaaccaagaattcttgaaatgtactatttc船tactttacctatgatcaatggtgattacgtggaacagc犯tgtatgggcatgctcaccccagagg3幼肌gtttBC犯3CgtttCtttg肌gttggtC3tC肌C3C肌Cttgg3犯gtggatt3ttggCC3tC肌Caaaaacgaacacatcatgggattggttactgcaacagtcttaaatatcgcaccaaaggtcggaggttgcggttggggtgacaaagagtttttctggcttggtttgttggttgctggccaacgctactcgatctatgatatagatgc犯gtgc組ggtgttcctc肌c卿3gc犯tctetcgct犯cggag3cg3atttg站g3atategg3tttgttctttacaagtggcacatacttcatacgacggacatttaetatggataaatggtggctctcagtactgtaagaaaccagagacttttga鄉(xiāng)tgattggaccaacattaaggagcttcgtgaatcgtattctgatgataaaga犯鄉(xiāng)ctctgaaggcttategtg3tecagttaaggtgg助gc昭c犯tcgtgcc3gattcc3g肌gt3atggttggggt鄉(xiāng)gacgatcaaagatgtaa鄉(xiāng)ctacttctggtgcggc犯atttecttc犯agctg肌accgtatacttataacacggtggtaactaaaggtgatttgatccgtttcggagacgaggaaatcgaaagtatctcC鄉(xiāng)3tt33t肌gatctgg3atg3tgctattettcc卿cgg3gctt犯SEQIDNO:44推定的乳克魯維氏酵母MMV/基因的翻譯NEDWTNNIRTFTFDINDVDTSTKIDALKDSDGVQLVDEKAIRLYKRTHNVALATERLRLYDKCFVNSPGSNPLKMDHLFRSNKKSKTTALDESSMKSNFGRFKNKWLSVIFNTFEEFIFIDT固SYINMADYFKFKEYKSTGTLFFKDRSLAIGTEQKCGPLFETLEPRILEMYYFNTLPMINGKKPETFEGDWTNIKELRESYSDDKEKALKAYSDTVKVEAAIVPDSEEIESISK離IWNDAIIPDGASEQIDNO:45-56:參見(jiàn)表12。引物名稱(chēng)引物序列臉wA有義5'-ATGAGAACAAAAATTATTGCGATAATTCCAGCCCG-3'(SEQIDNO:45)臉z^4反義5'-TCATTTAACAATCTCCGCTATTTCGTTTTC-3'(SEQIDNO:46)5'國(guó)ATGAGTAATATATATATCGTTGCTGAAATTGGTTG誦3'(SEQIDNO:47)臉w5反義5'-TTATTCCCCCTGATTTTTGAATTCGCTATG-3'(SEQIDNO:48)A^wC有義5'-ATGAAAAAAATATTATACGTAACTGGATCTAGAG-3'(SEQIDNO:49)臉wC反義5'-CTAGTCATAACTGGTGGTACATTCCGGGATGTC-3'(SEQIDNO:50)小鼠CMP-Sia合酶有義5'-ATGGACGCGCTGGAGAAGGGGGCCGTCACGTC-3'(SEQIDNO:51)小鼠CMP-Sia合酶反義5'-CTATTTTTGGCATGAGTTATTAACTTTTTCTATCAG-3'(SEQIDNO:52)豬GlcNAc差向異構(gòu)酶有義5'-ATGGAGAAGGAGCGCGAAACTCTGCAGG-3'(SEQIDNO:53)豬GlcNAc差向異構(gòu)酶反義5'-CTAGGCGAGGCGGCTCAGCAGGGCGCTC-3'(SEQIDNO:54)大腸桿菌唾液酸醛縮酶有義5'-ATGGCAACGAATTTACGTGGCGTAATGGCTG-3'(SEQIDNO:55)大腸桿菌唾液酸醛縮酶反義5'-TCACCCGCGCTCTTGCATCAACTGCTGGGC-3'(SEQIDNO:56)SEQIDNO:57-68:在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)。SEQIDNO:69-76:參見(jiàn)表12。178小鼠雙功能UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向異構(gòu)酶/N-乙酰甘露糖胺激酵有義5'-ATGGAGAAGAACGGGAACAACCGAAAGCTCCG-3'(SEQIDNO:69)小鼠雙功能UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向異構(gòu)酶/N-乙酰甘露糖胺激酶反義5'-CTAGTGGATCCTGCGCGTTGTGTAGTCCAG-3'(SEQIDNO:70)小鼠Sia9Psyn有義5'-ATGCCGCTGGAACTGGAGCTGTGTCCCGGGC-3'(SEQIDNO:71)小鼠Sia9Psyn反義5'-TTAAGCCTTGATTTTCTTGCTGTGACTTTCCAC國(guó)3'(SEQIDNO:72)人N-乙酰神經(jīng)氨酸磷酸酶(NANP)有義5'-GGGAGAATGCGGCCGCCACCATGGGGCTGAGCCGCGTGCGGGCGGTTTTC-3'(SEQIDNO:73)人N-乙酰神經(jīng)氨酸磷酸酶(NANP)反義5'畫(huà)GTATAGACTGCAAAGTCAGTATGTCCACTTGATTAATTAACC-3，(SEQIDNO:74)人CMP-Sia合酶有義5'-ATGGACTCGGTGGAGAAGGGGGCCGCCACC瞬3'(SEQEDNO:75)人CMP-Sia合酶反義5'-CTATTTTTGGCATGAATTATTAACTTTTTCC-3'(SEQIDNO:76)SEQIDNO:77用于hGNE的引物GGGAGAATGCGGCCGCCACCATGGAGAAGAATGGAAATAACCGAAAGCTGCGSEQIDNO:78用于hGNE的引物CCTTAATTAACTAGTAGATCCTGCGTGTTGTGTAGTCCAGAACSEQIDNO:79用于hSiaPsyn的引物GGGAGAATGCGGCCGCCACCATGCCGCTGGAGCTGGAGCTGTGTCCCGSEQIDNO:80用于hSiaPsyn的引物CCTTAATTAATTAAGACTTGATTTTTTTGCCATGATTATCTACCSEQIDNO:81引物GGCTCGAGATTTAAATGCGTACCTCTTCTACGAGATTCSEQIDNO:82引物SEQIDNO:83引物GGCTCGAGCGGCCGCCACCATGAATAGCATACACATGAACGCCAATACGSEQIDNO:84引物CCCTCbAGTTAATTAACTAGACGCGCGGCAGCAGCTTCTCCTCATCG-3，)SEQIDNO:85引物ATGACTGGTGTTCATGAAGGGSEQIDNO:86引物TTACTTATATGTCTTGGTATGSEQIDNO:87引物TGGTTACTGGCGGCGCTGGTTATATAGGTTCTCATACGTGCGTTGTTTTGTTAGAAAASEQIDNO:88引物TTAATTAATTACTTATATGTCTTGGTATG3，)SEQIDNO:89引物GCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCCCAACSEQIDNO:90引物CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCACTGTSEQIDNO:91引物CTTAGGCGCGCCGGCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCCSE()IDNO:92引物GGGGCATATCTGCCGCCCATCSEQIDNO:93引物GATGGGCGGCAGATATGCCCCSEQIDNO:94引物CTTCTTAATTAACTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCACSEQIDNO:95引物GGGAGAATGCGGCCGCCACCATGGACTCGGTGGAGAAGGGGGCCGCCACCTCSEQIDNO:96引物CCTTAATTAACTATTTTTGGCATGAATTATTAACTTTTTCCATTA181SEQIDNO:97引物CGGAATTCCACCATGGCTCCGGCGAGAGAAAATGTCAGSEQIDNO:98引物CGGAATTCTCACACACCAATGATTCTCTCTTTTGAAGSEQIDNO:99引物GGCTCGAGATTTAAATGCGTACCTCTTCTACGAGATTCSEQIDNO:100引物CCCTCGAGATTTAAATCCAACCGATAAGGTGTACAGGAGSEQIDNO:101引物GGCGCGCCAGCAAGCAAGACCCTAAGGAAGACATTCCSEQIDNO:102引物CCTTAATTAATCAACAACGAATGTTCCGGAAGCCAGAAAGGSEQIDNO:103和104密碼子優(yōu)化的hST6Gal前導(dǎo)序列53融合體的核酸(SEQIDNO:103)和氛基酸序列(SEQIDNO:104)(圖33)0480參考文獻(xiàn)Abeijon(1996)A^/.爿cadSc/.t/.S.A93:5963-5968.AebiM.等，(1996)"CloningandcharacterizationoftheALG3geneofSaccharomycescerevisiae."G/少co/z'o/ogy6(4):439-444.Alani和Kleckner(1987)Gewe""116:541-545AltmannF.等,(1999)"Insectcellsashostsfortheexpressionofrecombinantglycoproteins."G7少coco"7'wgafe16(2):109-123.Altschul,S.F.等，(1990)/.Mo/.祝o/.215:403-410.182Altschul,S.F.等，(1997)A^c/e!c爿cz'&尺"25:3389-3402.AlvianoC.S.等，(1999)Sialicacidsinfungi:Aminireview.G(ycoco豐g她《/.16:545-554.AnG.1985.尸ta尸一'o/.79:568-570.AndersenD.C.和C.F.Goochee(1994)"Theeffectofcell-cultureconditionsontheoligosaccharidestructuresofsecretedglycoproteins."CwAre/7f(9p/w/o/5/o&c/w7o/ogy5:546-549.AnnunziatoP.W.等,(1995)"NucleotidesequenceandgeneticanalysisoftheneuDandneuBgenesinregion2ofthepolysialicacidgeneclusterofEscherichiacoliKl.'V.A"m'c/.177:312-319.Aoki(1999)J.5z'oc/^w.126(5):940-950BakkerH.等，(2001)尸rocM/".Jcad98(5):2899-904BallouC.E.(1990)"Isolation,chaiacterization,andpropertiesofSaccharomycescerevisiaemnnmutantswithnonconditionalproteinglycosylationdefects."A/eAo<is￡>223W7o/ogy185:440-470.BardorM.等，(1999)"AnalysisoftheN-glycosylationofrecombinantglycoproteinsproducedintransgenicplants."7>e"(iy尸/a"fSc,e羅4(9):376-380.BeaudetL.等，1998爿6c7"ra哪o/tera:WocAem/ca/,Ce〃w/ar，她/簡(jiǎn)/crr卻韭.292:397-413.BelliG.等,(1998)"Anactivator/repressordualsystemallowstighttetracycline-regulatedgeneexpressioninbuddingyeast.，，jVwc/e/c爿c/AM26:942-947.BerkaR.M.等，(1992)乂6Wr.尸a/e〃CAew.Soc.203:121-BIOT.BerninsoneP.等，(1994)丄說(shuō)o/.CAem.269(1):207-211.BerninsoneP.等，(1995)J.說(shuō)W.Oem.270(24):14564-14567.BeminsoneP.等，(1997)丄5zW.C/2ew.272(19):12616-12619.Bianchi等，(1987)O/n^WG^"",'cs12:185-192.BoehmT.等，(1999)15(7):563-72.Boevink等,(1998)P/。m丄15(3):441-7.Borsig等，(1995)5/oc/e附.5/0//>^."es.Cowmw".210(1):14-20.BonneaudN.等，(1991)J^o^7:609-615.BretthauerR,K.和F.J.Castellino(1999)"GlycosylationofPichiapastoris-derivedproteins"BZofec/wo/ogyandZpp/ZedBZoc/jeTm'W/^30:193-200.BrilesE.B.等,(1977)"Isolationofwheatgermagglutinin-resistantclonesofChinesehamsterovarycellsdeficientinmembranesialicacidandgalactose.，V.腸/.C/^w.252:1107-1116.BurdaP.和AebiM(1999)"ThedolicholpathwayofN國(guó)linkedglycosylation."_6/oc/u'w/ca￡f5/o//j>^/ca力cto-Ge"era/Sw^'ec^s1426(2):239-257.CaldwellR.C.和JoyceG.F.(1992)尸C尺M(jìn)e^oc^jpp//c.，2,pp.28-33.CereghinoG.P.等，(2001)"Newselectablemarker/auxotrophichoststraincombinationsformoleculargeneticmanipulationofPichiapastoris"G面263:159-169.CereghinoJ.L.和丄M.Cregg(2000)F五MSMcraZ^o/ogy24(1):45-66.Chandrasekaran等，(1984)Ca"cwA"44(9):4059-68.ChibaY.等，(1998)"Productionofhumancompatiblehighma皿ose-type(Man(5)GlcNAc(2))sugarchainsinSaccharomycescerevisiae.，，,S/o/.CTew.273(41):26298-26304.ChoiB.K.等，(2003)"UseofcombinatorialgeneticlibrariestohumanizeN-linkedglycosylationintheyeastPichiapastoris."尸rac.JVW/OS/U00(9):5022-7.ChowriraG.M.等，(1995)嵐胸ec/mo/.3(l):17-23.ChristouP.(1997)Mo/.說(shuō)'o/.35(l畫(huà)2):197-203.ColeE.S.等，(1994)"GlycosylationPatternsofHumanProteinsExpressedinTransgenicGoatMilk"o/Ce〃.腸c乃綴265:S18D.Colli,(1993)FASEBJ,7:1257-1264Cregg丄M.等，(2000)"Recombinantproteinexpressionin尸z'c/2/crpiston's"A^fo/.Zfec/zno/.16:23-52.Davidson等，(2002)A/zcra6/o/ogy148(Pt8):2607畫(huà)15.Davies等，(2001)5/o&c/2"o/說(shuō)oe"g.Aug20;74(4):288-294."ExpressionofGnTIIIinaRecombinantAnti-CD20CHOProductionCellLine:ExpressionofAntibodieswithAlteredGlycoformsLeadstoanIncreaseinADCCThroughHigherAffinityforFcgRIII"DenteL.等,(1988)."ExpressionofHumanAlpha-l-AcidGlycoproteinGenesinCultured-CellsandinTransgenicMice"Ge"es&Deve/o戸ew2(2》259-266.Dirnberger等，(2002)尸/a"fMo/.50(2):273-81.Eades和Hintz(2000)255(l):25-34.Eckhardt和GemrdySchahn(1997)J.248(1):187-192.EsslD.等，(19卯)F娜Z^"18;453(l-2):169-73.FrameB.R.等，(2002May)尸/aW尸/2^/oZ129(1):13國(guó)22.FritschM.等，(1996)"Determinationofcytidine5'-monophospho-N畫(huà)acetylneuraminicacidpoolsizeincellculturescaleusinghigh-performanceanion-exchangechromatographywithpulsedamperometricdetection",C7^owatogr.爿.727:223-230.FujiyamaK.等,(2001)_8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ào)肽將唾液酸基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域耙向宿主細(xì)胞的高爾基體。26.—種編碼融合蛋白的核酸，所述融合蛋白含有反式唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞靶向信號(hào)肽，所述細(xì)胞靶向信號(hào)肽使得將反式唾液酸酶催化結(jié)構(gòu)域耙向宿主細(xì)胞的分泌途徑、細(xì)胞壁或細(xì)胞膜。27.包含權(quán)利要求25或26的核酸的宿主細(xì)胞。28.權(quán)利要求27的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還產(chǎn)生CMP-唾液酸。29.權(quán)利要求27的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞能夠產(chǎn)生含有NANA(M)Gal(^GlcNAc(w)Man3GlcNAc2糖形的重組糖蛋白。30.權(quán)利要求27的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞能夠產(chǎn)生含有NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重組糖蛋白。31.—種用于在重組非人真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生唾液酸化糖蛋白的方法，該方法包括將反式唾液酸酶和唾液酸供體引入用于培養(yǎng)宿主的培養(yǎng)基中。32.—種用于在宿主細(xì)胞中增強(qiáng)CMP-唾液酸產(chǎn)生的方法，該方法包括將編碼具有GlcNAc差向異構(gòu)酶活性的酶的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的步驟。33.—種用于在宿主細(xì)胞中增強(qiáng)CMP-唾液酸產(chǎn)生的方法，該方法包括將編碼具有唾液酸醛縮酶活性的酶的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的步驟。34.權(quán)利要求10的方法，其中所述方法還包括將編碼一種或多種參與CMP-Sia的生物合成或轉(zhuǎn)運(yùn)的酶的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及真核宿主細(xì)胞，所述真核宿主細(xì)胞已被修飾，從而通過(guò)異源表達(dá)一組包括唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和/或反式唾液酸酶在內(nèi)的糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)唾液酸化糖蛋白，以變成用于生產(chǎn)哺乳動(dòng)物(例如人)治療性糖蛋白的宿主菌株。還提供用于生產(chǎn)唾液酸化糖蛋白的、表達(dá)CMP-唾液酸生物合成途徑的新的真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供可用于將哺乳動(dòng)物酶活性(例如涉及唾液酸化的那些酶活性)成功靶向并表達(dá)至真核宿主細(xì)胞中的胞內(nèi)區(qū)室的核酸分子和組合文庫(kù)。該方法提供可用于表達(dá)和靶向任何涉及糖基化的需要基因的已工程改造的宿主細(xì)胞。文檔編號(hào)C12P21/06GK101484585SQ200780025284公開(kāi)日2009年7月15日申請(qǐng)日期2007年5月4日優(yōu)先權(quán)日2006年5月5日發(fā)明者S·R·哈米爾頓申請(qǐng)人:格利科菲公司