專利名稱：脂肪酶活性的恢復(fù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使特定的固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組合物的 各種酯化能力和酯交換能力等脂肪酶活性恢復(fù)的方法和使用恢 復(fù)的固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組合物的酯化反應(yīng)、油脂的酯 交換方法等。
背景技術(shù)：
脂肪酶被廣泛使用于脂肪酸等各種羧酸與一元醇或多元醇 等醇類的酯化反應(yīng)、多個羧酸酯間的酯交換反應(yīng)等中。其中， 酯交換反應(yīng)以動植物油脂類的改質(zhì)為首，作為各種脂肪酸的酯、 糖酯或類固醇的制造方法，是十分重要的技術(shù)。若使用作為油 脂水解酶的脂肪酶作為這些反應(yīng)的催化劑，則可以在室溫至約
70。C左右的溫和條件下進行酯交換反應(yīng)，與以往的化學(xué)反應(yīng)相 比，不僅可抑制副反應(yīng)并減少能量成本，而且由于作為催化劑 的脂肪酶是天然物質(zhì)，因此安全性高。而且，根據(jù)其底物特異 性和位置特異性，可以有效生產(chǎn)目標產(chǎn)物。然而，一^:而言， 在酯交換反應(yīng)中直接使用脂肪酶粉末，不僅無法充分表現(xiàn)活性， 而且要使原本水溶性的脂肪酶均勻地分散于油性原料中十分困 難，其回收也困難。因此，以往一般是通過將脂肪酶固定在某 些載體例如陰離子交換樹脂(專利文獻l )、酚醛型吸附樹脂(專 利文獻2)、疏水性載體(專利文獻3)、陽離子交換樹脂(專利 文獻4)、螯合樹脂(專利文獻5)等上，再用于酯化或酯交換反 應(yīng)等中。
但是，由于一旦將脂肪酶固定在載體上，脂肪酶活性就會 降低，因此正逐步開發(fā)采用脂肪酶粉末的各種技術(shù)。具體而言，提出了在惰性有機溶劑的存在下或非存在下， 為了使酯交換反應(yīng)時分散脂肪酶粉末顆粒的90%以上保持在
1 ~ 100pm的粒徑范圍，將脂肪酶粉末分散于含有酯的原料中， 進行酯交換反應(yīng)的方法(專利文獻6)。另外，還提出了采用通 過干燥含有磷脂和脂溶性維生素的酶溶液而獲得的酶粉末(專 利文獻7 )。
另一方面，由于作為酶的脂肪酶價格昂貴，因此在反應(yīng)結(jié) 束后進行回收，再重復(fù)使用，在脂肪酶活性降至很低后才廢棄。 但是，如果可以使降低的脂肪酶活性得以恢復(fù)，脂肪酶的使用 效率顯著提高，從工業(yè)的觀點看來，期待開發(fā)出使脂肪酶活性 恢復(fù)的有效方法。
曰本凈爭開昭60 — 98984號/>才艮 曰本特開昭61 — 202688號/>才艮 日本特開平2 - 138986號公報 日本特開平3 - 61485號公報 日本特開平1 - 262795號公報 曰本特許第2668187號公凈艮 曰本凈爭開2000 _ 106873號^^才艮
專利文獻l: 專利文獻2 專利文獻3 專利文獻4 專利文獻5 專利文獻6 專利文獻
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以使已經(jīng)降低的脂肪酶活性 恢復(fù)的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種酯化方法和酯交換方法，其 采用具有已經(jīng)恢復(fù)的脂肪酶活性的固定化脂肪酶或脂肪酶粉末 組合物。
本發(fā)明是基于以下認識而進行的對于特定的固定化脂肪 酶或同時使用該固定化脂肪酶的粉碎物與助濾劑的脂肪酶粉末
5組合物，將脂肪酶活性已經(jīng)降低的酶用三酰甘油清洗，則可以 恢復(fù)初始的脂肪酶活性。
也就是說，本發(fā)明提供一種脂肪酶活性的恢復(fù)方法，其特 征在于，在酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng)中使用固定于載體上的嗜熱 真菌屬來源的脂肪酶、或含有固定于載體上的嗜熱真菌屬來源
的脂肪酶的平均粒徑為lpm以上、不到300(im的4分碎品和助 濾劑的脂肪酶粉末組合物后，用三酰甘油清洗。
本發(fā)明還提供了一種酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng)方法，其特征 在于，在酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng)中使用固定于載體上的嗜熱真 菌屬來源的脂肪酶、或含有固定于載體上的嗜熱真菌屬來源的 脂肪酶的平均粒徑為1 pm以上、不到300pm的粉碎品和助濾劑 的脂肪酶粉末組合物后，將其從反應(yīng)系中分離，用三酰甘油清 洗使脂肪酶活性恢復(fù)后，使用該固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組 合物進行酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng)。


圖1表示使用脂肪酶粉末組合物進行酯交換反應(yīng)時，酯交 換活性隨著時間的降低(實施例1 (3))。
圖2表示通過對酯交換活性已經(jīng)降低的脂肪酶粉末組合物 進行本發(fā)明的清洗，酯交換活性恢復(fù)(實施例1 (4))。
圖3表示通過對酯交換活性已經(jīng)降低的固定化脂肪酶進行 本發(fā)明的清洗，酯交換活性恢復(fù)(實施例3 (3-2))。
具體實施例方式
本發(fā)明中使用的脂肪酶來源于嗜熱真菌屬(7Tzwwomj;cw W.),是固定在載體、優(yōu)選固定在二氧化硅載體上的脂肪酶。 本發(fā)明中可以直接使用這種脂肪酶，或者使用將該脂肪酶粉碎
6成平均粒徑在lpm以上、不到300fim的粉碎品。這其中，優(yōu)選 固定在二氧化硅載體上的這種脂肪酶的平均粒徑在300 ~ lOOO[im左右。這種固定化脂肪酶可以從例如Novozymes A/S公 司作為Lipozyme TL-IM購買。
在將這種固定化脂肪酶制成粉碎品時，可以采用通常的粉 碎機，將其粉碎成平均粒徑在lpm以上、不到300pm,優(yōu)選平 均粒徑為l 200nm，更優(yōu)選平均粒徑為1 ~ lOOpm,尤為優(yōu)選 平均粒徑為20 ~ 100fim。這其中，粉碎機可以例舉研缽、剪切 摩擦式粉碎機、刀式粉碎機、石磨(研磨微?；瘷C MYCOLLOIDER、 MASCOLLOIDER )、咖啡研磨機(coffee mill)、動力磨(power mill )、鋼針研磨機、沖擊式粉碎機(錘 式粉碎機、球磨機)、輥式粉碎機和氣流式粉碎機、均化器、超 聲波破碎機等。
本發(fā)明中作為對象的脂肪酶為上述粉碎品時，優(yōu)選與助濾 劑組合使用。作為助濾劑，可以例舉硅藻土等無機助濾劑和纖 維素等纖維和其粉碎物等有機助濾劑。這其中優(yōu)選有機助濾劑，
尤為優(yōu)選有機高分子助濾劑，尤其優(yōu)選纖維素等，作為優(yōu)選例 子，可以例舉由Nippon Paper Chemicals Co., Ltd以商品名KC Flock出售的產(chǎn)品等。助濾劑也優(yōu)選為粉狀，優(yōu)選平均粒徑在 10 ~ 90,。
上述脂肪酶粉碎品和助濾劑的質(zhì)量比優(yōu)選為1/10~ 10/1， 尤為優(yōu)選為1/7~ 2/1。
本發(fā)明中使用的上述固定化脂肪酶、脂肪酶粉末組合物可 以直接在油脂的酯交換反應(yīng)、酯化反應(yīng)中使用，可以通過使之 與長鏈脂肪酸甘油三酯和中鏈脂肪酸甘油三酯相接觸，然后提 取，從而進行純化，與此同時可以使脂肪酶活性提高。
作為這里使用的長鏈脂肪酸甘油三酯和中鏈脂肪酸甘油三酶和脂肪酶粉末組合物的清洗 項目中所記載的物質(zhì)。
長鏈脂肪酸甘油三酯和中鏈脂肪酸甘油三酯優(yōu)選按95: 5~ 50: 50的質(zhì)量比使用，優(yōu)選相對于脂肪酶的總質(zhì)量，接觸2 倍~ 100倍質(zhì)量的甘油三酯。
作為使用上述固定化脂肪酶、脂肪酶粉末組合物的酯化反 應(yīng)，優(yōu)選在該固定化脂肪酶、脂肪酶粉末組合物的存在下進行 油脂的酯化反應(yīng)，然后回收固定化脂肪酶、脂肪酶粉末組合物， 進行再利用。
尤其是，上述脂肪酶粉末組合物由于其脂肪酶活性提高， 而且在酯化反應(yīng)和酯交換反應(yīng)中易用性(操作性)提高，通過 再循環(huán)可以在這些反應(yīng)中使用，因此能夠適當(dāng)用于以工業(yè)規(guī)模 通過油脂的酯交換等進行的油脂的改質(zhì)。
但是，將這種脂肪酶粉末組合物、固定化脂肪酶在酯化反 應(yīng)或酯交換反應(yīng)中再利用若干次的話，隨著使用次數(shù)，酯化能 力和酯交換能力等脂肪酶活性將下降。
本發(fā)明以特定條件清洗這種脂肪酶活性已經(jīng)降低的固定化 脂肪酶或脂肪酶粉末組合物，脂肪酶活性恢復(fù)，而且，就上述 脂肪酶粉末組合物而言，可以長期連續(xù)利用其提高的脂肪酶活 性和易用性(操作性)。
本發(fā)明中作為對象的固定化脂肪酶、脂肪酶活性已經(jīng)降低 的脂肪酶粉末組合物，可以以相對于初始活性稍有降低者為對 象，但從工業(yè)的觀點看來，優(yōu)選以活性降低為初始活性(100 % )的70~ 50%者為對象。
其中，作為用于清洗固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組合物的 三酰甘油，優(yōu)選在室溫下為液態(tài)。尤其優(yōu)選使用用于純化上述 脂肪酶粉末組合物的長鏈脂肪酸甘油三酯和中鏈脂肪酸甘油三
8酯的混合物。
作為這里使用的長鏈脂肪酸甘油三酯，優(yōu)選構(gòu)成脂肪酸的
碳原子數(shù)為14-24的甘油三酯，尤為優(yōu)選選自于菜籽油、大豆 油、葵花油、紅花油、玉米油所組成的組中的^L物油。
作為中鏈脂肪酸甘油三酯，優(yōu)選構(gòu)成脂肪酸的碳原子數(shù)為 6-12的甘油三酯。這種脂肪酸甘油三酯可以用公知的制法制 造，也可以使用市售品。作為市售品，例如由日清奧利友集團 抹式會社以商品名ODO出售。
長鏈脂肪酸甘油三酯和中鏈脂肪酸甘油三酯優(yōu)選按95: 5 ~ 50: 50的質(zhì)量比使用，優(yōu)選相對于脂肪酶的總質(zhì)量，接觸2 倍 100倍、更優(yōu)選5 ~ 50倍的質(zhì)量的甘油三酯。
尤其是，作為清洗時使用的三酰甘油，優(yōu)選為用于進行酯 交換的原料油。
優(yōu)選使固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組合物中的脂肪酶與上 述三酰甘油充分接觸來進行清洗，具體而言，優(yōu)選通過以下方 式來進行通過在三酰甘油中攪拌用于酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng) 后的固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組合物，使之分散，然后從三 酰甘油中分離。
接觸具體而言即攪拌，優(yōu)選在10 45。C、尤為優(yōu)選在室溫 下，優(yōu)選進行2小時以上、更優(yōu)選10小時以上、尤為優(yōu)選12 小時 48小時。另外，根據(jù)要求還可以進行48小時以上。
用于進行攪拌的攪拌機沒有特別限定，但優(yōu)選葉片式攪拌 機、磁力攪拌機、三一攪拌機(Threeone motor )等。
這樣一來，使固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組合物中的脂肪 酶與三酰甘油充分4妄觸后，根據(jù)常^L方法進行過濾，從三酰甘 油中分離固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組合物，再次在酯化或酯 交換反應(yīng)中4吏用。
9發(fā)明的效果
根據(jù)本發(fā)明，對于由于在各種反應(yīng)中使用而脂肪酶活性降 低的脂肪酶，迄今為止都是將其廢棄，而通過本發(fā)明的方法可 以使脂肪酶活性恢復(fù)，因此可以延長脂肪酶的4吏用壽命，可以 使采用脂肪酶而制造的制品成本降低，因此本發(fā)明從工業(yè)的觀 點來看有很大的優(yōu)點。
接著，通過實施例對本發(fā)明進行詳細的說明。
實施例1
(1 ) 采用Hosokawa Micron Corporation生產(chǎn)的鋼針研磨 才幾(Fine impact mill 100 UPZ )將1Kg的Novozymes A/S 7〉司 生產(chǎn)的Lipozyme TL-IM (平均粒徑800pm)以17600rpm進行 粉碎。用堀場制作所公司生產(chǎn)的粒度分布計LA-500測定粉碎 的脂肪酶粒徑，其平均粒徑為13.8pm。在該粉末中加入lkg作 為助濾劑的纖維素粉末(Nippon Paper Chemicals Co., Ltd:平 均粒徑30pm),制成脂肪酶粉末組合物。
(2)對5g這樣獲得的脂肪酶組合物加入90g菜籽脫色油 和lOgODO(日清奧利友集團抹式會社公司生產(chǎn)中鏈脂肪酸甘 油三酯)，于室溫下攪拌24小時后，過濾回收脂肪酶組合物。 用下述方法測定該脂肪酶組合物的酯交換活性，在以粉碎前的 Lipozyme TL-IM的活性為IOO時，其相對活性為714。 脂肪酶活性的測定方法
在油酸甘油酯和辛酸甘油酯按1: 1 (w)的比例混合而成 的油中添加脂肪酶組合物，然后于60。C下反應(yīng)。隨時間取樣 lO[il，用1.5ml己烷稀釋后，將過濾脂肪酶組合物的溶液作為 氣相色譜(GC)用試樣。通過GC(柱DB-lht)進行分析， 用下式求出反應(yīng)率。GC條件為柱溫初始150°C、升溫15°C/ 分、最終370°C。
10反應(yīng)率(％ ) = (C34area/ ( C24area+C34area ) }xlOO 式中，C24表示辛酸甘油酯，C34表示辛酸甘油酯的l個 脂肪酸:帔油酸:f又^后的物質(zhì)，area為它們的面積?；诟鲿r間 的反應(yīng)率，用分析軟件(origin ver.6.1)求出反應(yīng)速度常數(shù)k值。
脂肪酶活性用以Lipozyme TL-IM的k值作為100時的相 對活性來表示。
(3 )在85g菜籽脫色油(日清奧利友集團林式會社公司生 產(chǎn))和15gODO (日清奧利友集團林式會社公司生產(chǎn))中添加 上述(2)獲得的脂肪酶組合物1質(zhì)量％ ,于6(TC攪拌19小時 進行酯交換反應(yīng)。求出隨時間的酯交換率，確認反應(yīng)的進行。 此外，酯交換反應(yīng)使用氣相色傳分析甘油酯組成，通過計算求 出測定試樣中的酯交換反應(yīng)物的比率。
反應(yīng)后過濾回收脂肪酶組合物，將該回收的脂肪酶組合物 重復(fù)用于酯交換反應(yīng)中。重復(fù)進行數(shù)次反應(yīng)，通過相對比例確 認反應(yīng)率的變化，并示于圖1中。
根據(jù)圖1所示的結(jié)果，可知合計反應(yīng)時間達到約82小時時， 脂肪酶組合物的脂肪酶活性降低到約60%。
(4)過濾回收上述(3)中相對活性已經(jīng)降低到約60%的 脂肪酶組合物，在該回收的脂肪酶組合物中，添加18g菜籽脫色 油(日清奧利友集團抹式會社公司生產(chǎn))和2gODO (日清奧利 友集團抹式會社公司生產(chǎn))，于室溫下用磁力攪拌機攪拌24小 時。通過過濾回收脂肪酶組合物后，再與上述(3)同樣重復(fù)進 行酯交換反應(yīng)。通過相對比例確認反應(yīng)率的變化，結(jié)果示于圖2 中。
根據(jù)圖2所示的結(jié)果，可知通過對活性已經(jīng)降低的脂肪酶 組合物進行攪拌清洗，脂肪酶活性恢復(fù)到當(dāng)初的100%,脂肪酶組合物能夠再利用若干次。 實施例2
(2-1 )對于5g實施例1的(1 )中獲得的脂肪酶組合物添 加90g菜籽脫色油和10g ODO (日清奧利友集團抹式會社公司 生產(chǎn))，于60。C攪拌2小時后，過濾回收脂肪酶組合物。用與 實施例1同樣的方法測定該脂肪酶組合物的酯交換活性，其相 對活性為557。
(2-2)在100g大豆油和25g大豆極度硬化油(橫關(guān)油脂 工業(yè)(抹)公司生產(chǎn))中添加上述(2-1)中獲得的脂肪酶組合 物1.2質(zhì)量％,于7(TC下反應(yīng)120小時后，通過過濾回收脂肪 酶組合物。與實施例1同樣對回收的脂肪酶組合物中的一部分 測定其脂肪酶活性(2-2a)。使先前回收的脂肪酶組合物分散于 丙酮中，過濾后，再回收其濾渣，分散于50g菜籽脫色油ODO
(日清奧利友集團抹式會社公司生產(chǎn))=9: 1 (w)的混合油 中后，于室溫下通過過濾進行清洗、置換，回收脂肪酶組合物。 用與實施例1同樣的方法測定該脂肪酶組合物的酯交換活性
(2-2b),得到的活性以相對值示于表1。
表l
單位質(zhì)量脂肪酶制劑的
相對酯交換活性
粉碎前 (TL-IM)100
(2-1)557
(2-2a)11
(2-2b)200
實施例3
在85g菜籽脫色油(日清奧利友集團抹式會社公司生產(chǎn)) 和15gODO (日清奧利友集團抹式會社公司生產(chǎn))中添加5質(zhì) 量％的Lipozyme TL-IM (固定化脂肪酶Novozymes A/S ^>司 生產(chǎn))，于60。C攪拌19小時，進行酯交換反應(yīng)。求出隨時間的酯交換率，確認反應(yīng)的進行。另外，酯交換反應(yīng)使用氣相色譜 分析甘油酯組成，通過計算求出測定試樣中的酯交換反應(yīng)物的 比率。
過濾回收反應(yīng)后的上述固定化脂肪酶，將該回收的固定化 脂肪酶重復(fù)用于酯交換反應(yīng)中。重復(fù)進行數(shù)次反應(yīng)，通過相對 比例確認反應(yīng)率的變化，并示于圖3(3-l)。
過濾回收相對活性已經(jīng)降低到60 %左右的上述固定化脂 肪酶，在該回收的固定化脂肪酶中添加18g菜籽脫色油(日清 奧利友集團抹式會社公司生產(chǎn))和2gODO (日清奧利友集團 林式會社公司生產(chǎn))，于室溫下攪拌24小時。通過過濾回收固 定化脂肪酶后，再重復(fù)進行上述操作(3-1 ),進行酯交換反應(yīng)。 通過相對比例確認反應(yīng)率隨時間的變化，并示于圖3 (3-2)。
權(quán)利要求
1. 一種脂肪酶活性的恢復(fù)方法，其特征在于，在酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng)中使用固定于載體上的嗜熱真菌屬來源的脂肪酶、或含有固定于載體上的嗜熱真菌屬來源的脂肪酶的平均粒徑為1μm以上、不到300μm的粉碎品和助濾劑的脂肪酶粉末組合物后，用三酰甘油清洗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，三酰甘油在室溫下 為液態(tài)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，三酰甘油含有中鏈 脂肪酸甘油三酯。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法，其中，三酰 甘油為用于酯交換的原料油。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 ~ 4中任一項所述的方法，其中，在三 酰甘油中攪拌用于酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng)后的固定化脂肪酶或 脂肪酶粉末組合物，使之分散，然后從三酰甘油中分離，由此 進行清洗。
6. 才艮據(jù)^l利要求1~5中任一項所述的方法， 為二氧化硅。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項所述的方法， 品的平均粒徑為1 ~ 200jim。
8. 才艮據(jù)^l利要求1~7中任一項所述的方法， 劑為纖維素。
9. 才艮據(jù)計又利要求1~8中任一項所述的方法， 劑為平均粒徑10 ~ 90|^im的4分狀。
10. —種酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng)方法，其特征在于，在酯 化反應(yīng)或酯交換反應(yīng)中使用固定于載體上的嗜熱真菌屬來源的 脂肪酶、或含有固定于載體上的嗜熱真菌屬來源的脂肪酶的平 均粒徑為l(im以上、不到300pm的賴^爭品和助濾劑的脂肪酶其中，載體 其中，粉碎 其中，助濾 其中，助濾粉末組合物后，將其從反應(yīng)系中分離，用三酰甘油清洗而使脂 肪酶活性恢復(fù)后，使用該固定化脂肪酶或脂肪酶粉末組合物進 行酯4^反應(yīng)或酯交纟灸反應(yīng)。
全文摘要
一種脂肪酶活性的恢復(fù)方法，其包括在酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng)中使用固定于載體上的嗜熱真菌屬(Thermomyces)來源的脂肪酶、或含有固定于載體上的嗜熱真菌屬來源的脂肪酶的平均粒徑為1μm以上、不到300μm的粉碎品和助濾劑的脂肪酶粉末組合物后，用三酰甘油清洗。通過該方法，能夠有效地使已經(jīng)降低的脂肪酶活性恢復(fù)。
文檔編號C12N9/20GK101490254SQ20078002602
公開日2009年7月22日 申請日期2007年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月11日
發(fā)明者山內(nèi)良枝, 根岸聰, 鈴木順子 申請人:日清奧利友集團株式會社