專利名稱：蛋白的高分泌生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高水平分泌生產(chǎn)蛋白的方法，主要在酵母中實(shí)現(xiàn)。
背景技術(shù)：
迄今為止，通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)藥用蛋白主要包括將動(dòng)物細(xì)胞或
大腸桿菌細(xì)胞用作宿主。大腸桿菌細(xì)胞能低成本地生產(chǎn)粑蛋白；但是， 大腸桿菌細(xì)胞不能進(jìn)行以糖鏈修飾為代表的修飾，且以包涵體的形式生 成無活性的蛋白。這需要溶解過程，因而大腸桿菌細(xì)胞不適合復(fù)雜的蛋 白生產(chǎn)過程。相反，動(dòng)物細(xì)胞能生產(chǎn)靶蛋白作為活性蛋白。但是，不利 地，由于動(dòng)物細(xì)胞繁殖和培養(yǎng)的費(fèi)時(shí)操作，動(dòng)物細(xì)胞的使用會顯著增加 在設(shè)備和材料成本方面的生產(chǎn)成本。
在蛋白中，抗體已經(jīng)長時(shí)間地用作藥物產(chǎn)品。由于它們源自人以外 的來源，會新產(chǎn)生抗施用的抗體的抗體。因而，這樣的抗體不能施用超 過一次，其使用受到限制。近年來，已經(jīng)可以生產(chǎn)人源化的抗體，其中 抗原結(jié)合位點(diǎn)以外的氨基酸序列已經(jīng)被置換為源自人抗體的序列。此 外，可以生產(chǎn)其中已經(jīng)導(dǎo)入人抗體基因的人抗體生產(chǎn)小鼠。因而，抗體 作為藥物產(chǎn)品的用途變得廣泛?，F(xiàn)在，這樣的抗體由培養(yǎng)的、已經(jīng)導(dǎo)入 編碼雜交瘤或抗體的基因的細(xì)胞如CHO細(xì)胞生產(chǎn)。但是，這樣的生產(chǎn) 在成本、生產(chǎn)力、安全性等方面存在問題。
近年來，為了彌補(bǔ)上述缺點(diǎn)，已經(jīng)嘗試用使用酵母來生產(chǎn)藥用蛋白。 但是，這樣的嘗試基本上都沒有付諸實(shí)際應(yīng)用。更具體地，關(guān)于具有復(fù) 雜結(jié)構(gòu)的抗體，存在表達(dá)Fab (—種單鏈抗體(ScFv))等的實(shí)例(Biosci. Biotechnol. Biochem., 64: 2138-2M4, 2000)。但是，在全長抗體方面生產(chǎn) 力非常低(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 8678-8682, 1988)。最近報(bào)道了 使用生產(chǎn)哺乳動(dòng)物N-結(jié)合糖鏈的酵母(巴斯德畢赤氏酵母)來生產(chǎn)抗體的 實(shí)例(Nature Biotechnology, 24: 210-215, 2006)，盡管該4良道沒有提及產(chǎn) 率。因而，在酵母中高水平生產(chǎn)抗體是困難的。認(rèn)為其原因是，酵母的 分泌能力不足，由蛋白酶造成的降解等。
作為解決這些問題的一種手段，提出了包含使用蛋白酶缺陷菌抹的方法(Enzyme and Microbial Technology, 26: 671-677, 2000; Protein Expr. Purif., 20: 485-491, 2000， Biosci. Biotechnol. Biochem.， 66: 628-631， 2002)。發(fā)明人還已經(jīng)開發(fā)了使用蛋白酶(它是蛋白酶A (PEP4)、蛋白 酶B(PRB1)或酵母天冬酶(YPSl))基因缺陷菌抹來抑制抗體的降解的 方法(WO 2003/091431)。作為通過基因?qū)雭硖岣叩鞍咨a(chǎn)力的一種方 法，報(bào)道了通過共表達(dá)分子伴侶的部分來提高ScFv生產(chǎn)力的方法，所 述分子伴侶的部分會輔助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白如BiP (KAR2)/PDI的三維結(jié) 構(gòu)的形成(Nat. Biotechnol. 16: 773-777, 1998),盡管該方法僅僅生產(chǎn)單鏈 抗體的片段。
另外，已經(jīng)開發(fā)了許多誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子，且已經(jīng)用于生產(chǎn)外 源蛋白。但是，當(dāng)使用有效啟動(dòng)子使編碼外源蛋白的基因在細(xì)胞中高水 平表達(dá)時(shí)，或當(dāng)生產(chǎn)不太可能折疊的蛋白時(shí)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中會發(fā)生 聚集，產(chǎn)生的蛋白有時(shí)可能在細(xì)胞中積累。此外，分泌型蛋白和膜蛋白 會翻譯成蛋白，此后立即摻入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，進(jìn)行特定修飾，然后轉(zhuǎn)移至高爾 基體。在該情況下，未折疊的蛋白有時(shí)可能由于某種原因在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積 累。這稱作"內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激"。這樣的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的原因的實(shí)例包括，在內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生的修飾(例如添加糖鏈或二硫鍵)的干擾，和從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)?惡化。哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有"解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)"機(jī)制，作為反抗這樣 的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一種手段。例如，轉(zhuǎn)錄抑制、分子伴侶誘導(dǎo)的折疊加速、 變性蛋白的降解或經(jīng)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡會保護(hù)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累的蛋 白。
作為調(diào)節(jié)UPR的基因，已知IREla-XBPl、 PERK-eIF-2a和ATF6 動(dòng)物細(xì)胞的基因。在酵母的情況下，Irelp-Haclp是已知為這樣的基因的 唯一基因，Irelp-Haclp基因通過下述機(jī)制與UPR相關(guān)(參見
圖1)。首 先，Irelp通常結(jié)合抗體重鏈結(jié)合蛋白(BiP)。但是，當(dāng)生產(chǎn)解折疊的蛋 白(UFP)時(shí)，BiP會結(jié)合這樣的UFP。與BiP解離的Irelp通過自磷酸化 或二聚化而激活，且它表現(xiàn)出內(nèi)切核酸酶活性。盡管HACl基因通常以 未激活狀態(tài)存在，具有內(nèi)切核酸酶活性的Irelp使從HAC1基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA發(fā)生剪接，并生成有活性的Haclp (Cell， 87: 405-413, 1996; Cell, 90:1031-1039,1997; the EMBO Journal, 18: 3119-3132, 1999)。這種有活 性的Haclp遷移至細(xì)胞核，起轉(zhuǎn)錄因子的作用，并促進(jìn)編碼與稱作UPR 的一系列反應(yīng)有關(guān)的多種蛋白的基因的表達(dá)，所述反應(yīng)例如有關(guān)的糖鏈說
添加、蛋白折疊、蛋白降解(ER-相關(guān)的降解ERAD)、蛋白分選、脂類 代謝等(Cell, 101: 249-258, 2000)。
例，其中將編碼絲狀菌即里氏木霉(Trichodermareesei)的激活的Haclp 的基因?qū)肫【铺墙湍钢衼硖岣弋愒吹鞍譨-淀粉酶和內(nèi)源蛋白即轉(zhuǎn)化 酶的分泌(Appl. Environ. Microbiol. 69: 2065-2072， 2003)。但是，已知單 一蛋白，即a-淀粉酶或轉(zhuǎn)化酶是容易分泌的蛋白，產(chǎn)量的提高低至提高 以前的產(chǎn)量的約2倍。近年來，已經(jīng)報(bào)道在已經(jīng)單獨(dú)導(dǎo)入激活的HAC1 基因的菌抹中，使用巴斯德畢赤氏酵母生產(chǎn)抗體片段Fab (Biotechnology and Bioengineering, 94: 353-361)。通過導(dǎo)入激活的HAC1基因?qū)崿F(xiàn)的生 產(chǎn)力提高低至約1.3倍。
同時(shí)，已知這樣一個(gè)實(shí)例，其中將哺乳動(dòng)物來源的RRBP1 (核糖體 結(jié)合蛋白1,核糖體受體，pl80蛋白)基因單獨(dú)地導(dǎo)入酵母菌株中，從而 使分泌的蛋白(牛胰腺胰蛋白酶抑制劑(BPTI))的量變成5倍(The Journal of Cell Biology, 146: 273-284, 1999)。最初，從狗分離出RRBP1 基因，作為編碼核糖體結(jié)合蛋白的基因(Nature, 346: 540_544, 19卯)。 RRBP1具有180kDa的分子量和特殊結(jié)構(gòu)，使得在N-末端側(cè)包含10個(gè) 氨基酸殘基的序列重復(fù)54次，且該區(qū)域結(jié)合核糖體。已知RRBP1參與 膜結(jié)構(gòu)的擴(kuò)大和mRNA的穩(wěn)定化(the Journal of Cell Biology, 130: 29-39, 1995; the Journal of Cell Biology, 156: 993-1001, 2002)。前述BPTI的一 個(gè)成功實(shí)例具有6,500的分子量，它代表非常小的肽。這樣的結(jié)果不能 總是適用于其它高分子量蛋白或由不同蛋白(例如抗體的輕鏈或重鏈) 組成的蛋白聚集體。
已知蛋白O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(PMT)基因與酵母或霉菌固有的O-糖 鏈的形成有關(guān)。PMT基因產(chǎn)物位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，且具有將甘露糖添加至 分泌型蛋白的絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)的羥基殘基上的活性(在下文 中，這樣的活性稱作PMT活性)。有些已經(jīng)被PMT添加糖鏈的蛋白用作 酵母菌抹壁的基本組分，作為甘露糖蛋白。當(dāng)PMT活性非常低時(shí)，已 知細(xì)胞壁會變脆，并影響細(xì)胞的生長。
關(guān)于PMT基因，已知在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中存 在7種基因，即，PMTl， 2, 3, 4, 5, 6,和7 (Biochim. Biophys. Acta, 1426: 297-307, 1999)。將PMT基因分成3類；即，PMT家族，PMT2家族，和PMT4家族。已知PMTlp和PMT2p在形成異二聚體后表現(xiàn)出活性， PMT4p在形成同二聚體后表現(xiàn)出活性。因?yàn)榘被嵝蛄型葱缘?，?jù)稱 PMT5p與PMTlp互補(bǔ)，PMT3p與PMT2p互補(bǔ)。PMT6p與PMT2p和 PMT3p高度同源，盡管不知道表現(xiàn)出活性的組分的類型。還已知每種 PMT蛋白具有對底物蛋白的選擇性。
作為芽殖酵母的其它類型的PMT基因，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在白念珠菌的 情況下與啤酒糖酵母的PMT1, 2, 4, 5,和6基因高度同源的5種基因 (Mol. Microbiol., 55: 546-560, 2005)，在新型隱球菌的情況下至少與啤酒 糖酵母的PMT4基因高度同源的一種基因(Eukaryot. Cell, 6: 222-234, 2007)和在裂殖酵母即粟酒裂殖酵母的情況下與PMT1, 2,和4基因高度 同源的3種基因(omal, 2,和4) (Mol. Microbiol.， 57: 156-170, 2005)。此 外，在曱醇同化酵母Ogataeaminuta (O. minuta)中觀察到與哞酒糖酵母 的PMT1，2,4, 5，和6基因高度同源的5種基因的存在。
也在霉菌中發(fā)現(xiàn)了 PMT基因。在構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)了 PmtA基和2 種其它的基因，在里氏木霉中發(fā)現(xiàn)了與啤酒糖酵母的PMT2基因高度同 源的Pmtl基因(Curr. Genet, 43: 11-16, 2003)。
椐稱PMT活性具有影響肽疏水區(qū)、增強(qiáng)肽親水性、和抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 腔中的肽聚集的作用。但是，當(dāng)生產(chǎn)外源蛋白時(shí)，PMT活性有時(shí)會添
加不必要的o-糖鏈，這可能導(dǎo)致蛋白組分的不充分形成、降低的活性等。
對于多聚體蛋白，例如抗體，具體而言，可以抑制其聚集體的形成(在抗 體的情況下，這是指輕鏈和重鏈聚集體的形成)。
曰本專利號3630424和日本專利公開(kohyo)號H08-509867 (A) (1996)提出了通過抑制由PMT基因的修飾導(dǎo)致的O-糖鏈添加，生產(chǎn)重 組蛋白的方法。但是，這些專利文件沒有描述抗體的輕鏈和重鏈的聚集 體的形成。
在WO 2002/046437中提供了一個(gè)實(shí)例，其中將與O-糖鏈的形成有 關(guān)的PMT1和PMT2基因缺陷型菌抹用于抑制O-糖鏈的添加，使抗體輕 鏈和重鏈分子的聚集提高了約1.5倍。該數(shù)據(jù)是使用RI-標(biāo)記的氨基酸的 脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，但不是觀察整個(gè)培養(yǎng)過程的結(jié)果。另外，進(jìn)一步 降低了糖鏈添加的抑制程度，并惡化了抗體生產(chǎn)力。
盡管HAC1基因會誘導(dǎo)UPR,已知有些UPR誘導(dǎo)型基因是添加酵 母特異性的O-糖鏈的PMT基因(Cell， 101:249-258,2000)。因此，HAC1基因的導(dǎo)入可能不足以生產(chǎn)高質(zhì)量的多聚體蛋白，例如抗體。
如上所述，已經(jīng)提出許多種方法來作為在酵母中高水平分泌生產(chǎn)蛋 白的方法。但是，基本上所有方法在實(shí)踐水平都是不充分的。還沒有發(fā) 現(xiàn)有效生產(chǎn)蛋白、尤其是高分子量蛋白或蛋白聚集體(包括抗體)的方 法。當(dāng)通過基因?qū)?、基因破壞等將性狀?dǎo)入細(xì)胞中時(shí)， 一般而言，細(xì) 胞會經(jīng)歷某種應(yīng)激。因而，可以提供其它修飾，或可能發(fā)生相反作用。
當(dāng)希望高水平蛋白表達(dá)時(shí)，例如，激活UPR時(shí)，這會導(dǎo)致不利因素例 如糖鏈修飾、蛋白酶體的降解、或ER-相關(guān)的降解(ERAD)。因此，通過 單一過程例如導(dǎo)入單個(gè)基因，不能實(shí)現(xiàn)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的蛋白例如抗體的 高水平分泌生產(chǎn)。另外，僅有幾種常規(guī)方法的組合不總是會產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。
因此，本發(fā)明意在提供在酵母或其它宿主細(xì)胞中高水平分泌生產(chǎn)蛋 白(更具體地，具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的蛋白，例如抗體)的方法。
發(fā)明內(nèi)容
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了集中的研究。結(jié)果，他們發(fā) 現(xiàn)，與蛋白的高水平分泌生產(chǎn)有關(guān)的基因，即激活的HAC1 (Hacl蛋白， 它是在應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后由Irelp剪接mRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子)基因和 RRBP1 (核糖體結(jié)合蛋白1,核糖體受體，p180蛋白)基因在甲醇同化酵 母，即Ogataea minuta中共表達(dá)，且抗體分泌生產(chǎn)的量可以增加約10 倍。此外，他們發(fā)現(xiàn)，可以抑制與給酵母特異性蛋白添加O-糖鏈有關(guān)的 蛋白O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的活性(該活性抑制異多聚體例如抗體的 聚集)，以進(jìn)一步提高生產(chǎn)力。
他們也發(fā)現(xiàn)，可以表達(dá)與蛋白的高水平分泌生產(chǎn)有關(guān)的基因，即激 活的HAC1基因，且可以抑制與給酵母特異性蛋白添加O-糖鏈有關(guān)的蛋 白O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的活性(該活性抑制異多聚體例如抗體的聚 集)，以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)力的協(xié)同提高。
在這樣的發(fā)現(xiàn)后，已經(jīng)完成了本發(fā)明(參見圖2)。
具體而言，本發(fā)明包括下述發(fā)明。根據(jù)[l]的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含以下激活的HAC1基因(l) 和RRBP1基因(2):(1) 選自下面(a)至(d)的激活的HAC1基因
(a) 編碼由SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列組成的蛋白
的基因；
(b) 編碼由與SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少 70%同源性的氨基酸序列組成、且具有激活解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)的功 能的蛋白的基因；
(c) 編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從 SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有激活 UPR的功能的蛋白的基因;和
(d) 在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO: 22所示核苷酸序列或 其互補(bǔ)核苷酸序列組成的DNA雜交、且編碼具有激活UPR的功能的蛋 白的基因;和
(2) 選自下面(e)至(h)的RRBPl基因
(e) 編碼人或狗來源的RRBP1的基因；
(f) 編碼由與人或狗來源的RRBP1的氨基酸序列具有至少 70%同源性的氨基酸序列組成、且具有核糖體結(jié)合活性的蛋白的基因；
(g) 編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從 人或狗來源的RRBP1的氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有核 糖體結(jié)合活性的蛋白的基因;和
(h) 在嚴(yán)格條件下與由人或狗來源的RRBP1基因的核苷 酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列組成的基因雜交、且編碼具有核糖體結(jié)合活 性的蛋白的基因。根據(jù)[l]的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其包含以下激活的HACl基因(l)和 RRBP1基因(2):
(0選自下面(i)至(l)的激活的HACl基因
(i) 編碼啤酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HACl
蛋白的基因；
(j)編碼由與啤酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的 HACl蛋白的氨基酸序列具有至少70。/。同源性的氨基酸序列組成、且具 有激活UPR的功能的蛋白的基因；
(k)編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從 啤酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HACl蛋白的氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有激活UPR的功能的蛋白的基因；和
(1)在嚴(yán)格條件下與由編碼哞酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢 曲霉的激活的HAC1蛋白的基因的核普酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列組成 的基因雜交、且編碼具有激活UPR的功能的蛋白的基因;和 (2)選自下面(e)至(h)的RRBP1基因
(e) 編碼人泉狗來源的RRBP1的基因；
(f) 編碼由與人或狗來源的RRBP1的氨基酸序列具有至少 70%同源性的氨基酸序列紐成、且具有核糖體結(jié)合活性的蛋白的基因；
(g) 編碼由趙過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從 人或狗來源的RRBP1的氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有核 糖體結(jié)合活性的蛋白的基因;和
(h) 在嚴(yán)格條件下與由人或狗來源的RRBP1基因的核苷 酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列組成的基因雜交、且編碼具有核糖體結(jié)合活
性的蛋白的基因。根據(jù)[1]至[3]中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是 真核細(xì)胞。根椐[4]的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是酵母。 [6]根據(jù)[5]的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述酵母是曱醇同化酵母。 [7]根據(jù)[6]的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所迷甲醇同化酵母是Ogataea minut3。根據(jù)[5]的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述酵母是啤酒糖酵母。根據(jù)[1]至[8]中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含導(dǎo)入其中的編
碼外源蛋白的基因。根據(jù)[9]的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述外源蛋白是多聚體蛋白。 [11]根據(jù)[10]的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述多聚體蛋白是異多聚體。 [12]根椐[ll]的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述異多聚體是抗體或其功
能片段。 —種生產(chǎn)蛋白的方法，其包含，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)[9]至[12] 中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和從培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)4亍靶蛋白取樣。根據(jù)[13]的方法，其中在抑制蛋白O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(PMT) 活性的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)[14]的方法，其中通過向培養(yǎng)基中添加蛋白O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(PMT)活性的抑制劑，抑制PMT活性。編碼曱醇同化酵母的激活的HAC1蛋白的基因。 [17]選自下面(a)至(d)的基因
(a) 編碼由SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列組成的蛋白的基
因，
(b) 編碼由與SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少70% 同源性的氨基酸序列組成、且具有激活解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)的功能的 蛋白的基因；
(c) 編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有激活UPR的 功能的蛋白的基因;和
(d) 在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO: 22所示核苷酸序列或其互 補(bǔ)核苦酸序列組成的DNA雜交、且編碼具有激活UPR的功能的蛋白的 基因。包含根據(jù)[17]的基因的表達(dá)栽體。根據(jù)[18]的表達(dá)載體，它是pOMexPGHy/Hacl。包含激活的HAC1基因和RRBP1基因的表達(dá)栽體。根據(jù)[20]的表達(dá)載體，其中所述激活的HAC1基因是根據(jù)[17]
的基因。根據(jù)[20]的表達(dá)栽體，其中所述激活的HAC1基因是編碼啤酒 糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HAC1蛋白的基因或其同源基因。根據(jù)[20]的表達(dá)載體，它是YEp351GAP-II-aHACl/p180。根據(jù)[20]的表達(dá)栽體，其中所述RRBP1基因是人或狗來源的 RRBP1基因或其同源基因。 —種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)導(dǎo)入了根據(jù)[18]至[24]中的任
一項(xiàng)的表達(dá)載體。 —種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)導(dǎo)入了包含激活的HAC1基因 的表達(dá)栽體和包含RRBP1基因的表達(dá)栽體。根據(jù)[26]的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述包含激活的HAC1基因 的表達(dá)載體是根據(jù)[18]或[19]的表達(dá)栽體。根據(jù)[26]的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所迷激活的HAC1基因是編 碼啤酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HAC1蛋白的基因或其同源基因。根據(jù)[26]的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述RRBP1基因是人或狗 來源的RRBP1基因或其同源基因。 —種生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的方法，其包含下述步驟
(A) 向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入激活的HAC1基因；和
(B) 向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入RRBP1基因。根據(jù)[30]的方法，其中所迷激活的HAC1基因是下述基因中的 任一個(gè)
(1) 根據(jù)[17]的基因；
(2) 編碼啤酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HAC1蛋 白的基因；
(3) 編碼由與啤酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HAC1 蛋白的氨基酸序列具有至少70%同源性的氨基酸序列組成、且具有激活 UPR的功能的蛋白的基因；
(4) 編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從啤酒 糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HAC1蛋白的氨基酸序列衍生的 氨基酸序列組成、且具有激活UPR的功能的蛋白的基因；和
(5) 在嚴(yán)格條件下與由編碼哞酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉
因雜交、、且編碼具有激;UPR的功能的^白的基因。、 ^ a根據(jù)[30]的方法，其中所述RRBP1基因是下述基因中的任一
個(gè)
(1) 編碼人或狗來源的RRBP1的基因；
(2) 編碼由與人或狗來源的RRBP1的氨基酸序列具有至少 70%同源性的氨基酸序列組成、且具有核糖體結(jié)合活性的蛋白的基因；
(3) 編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從人或 狗來源的RRBP1的氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有核糖體 結(jié)合活性的蛋白的基因;和
(4) 在嚴(yán)格條件下與由人或狗來源的RRBP1基因的核苷酸序 列或其互補(bǔ)核苷酸序列組成的基因雜交、且編碼具有核糖體結(jié)合活性的 蛋白的基因。根據(jù)[30]至[32]中的任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。根據(jù)[33]的方法，其中所述真核細(xì)胞是酵母。根據(jù)[34]的方法，其中所述酵母是甲醇同化酵母。根據(jù)[35]的方法，其中所述曱醇同化酵母是Ogataeaminuta。根據(jù)[34]的方法，其中所述酵母是啤酒糖酵母。選自下面(a)至(d)的基因
(a) 編碼由SEQ1DNO:70所示氨基酸序列組成的蛋白的基因；
(b) 編碼由與SEQ ID NO: 70所示氨基酸序列具有至少70°/0同 源性的氨基酸序列組成、且具有激活解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)的功能的蛋 白的基因；
(c) 編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從SEQ ID NO: 70所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有激活UPR的 功能的蛋白的基因;和
(d) 在嚴(yán)才各條件下與由SEQ ID NO: 69所示核苷酸序列或其互 補(bǔ)核苷酸序列組成的DNA雜交、且編碼具有激活UPR的功能的蛋白的 基因。包含根據(jù)[38]的基因的表達(dá)栽體。根據(jù)[39]的表達(dá)載體，它是pOMexPGHy/PpHacl。 一種生產(chǎn)蛋白的方法，其包含，在抑制O-糖鏈合成的條件下， 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)已經(jīng)導(dǎo)入激活的HACl基因和/或RRBPl基因和編碼外 源蛋白的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，和從培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行靶蛋白取樣。根據(jù)[41]的生產(chǎn)蛋白的方法，其中通過插入滅活PMT基因來 抑制O-糖鏈合成。根據(jù)[41]的生產(chǎn)蛋白的方法，其中通過向培養(yǎng)基中添加PMT 活性的抑制劑來抑制O-糖鏈合成。根據(jù)[41]的生產(chǎn)蛋白的方法，其中通過插入滅活PMT基因和 向培養(yǎng)基中添加PMT活性的抑制劑來抑制O-糖鏈合成。根據(jù)[43]或[44]的生產(chǎn)蛋白的方法，其中所述PMT活性的抑制 劑是5-[[3,4-( 1 -苯基甲氧基)苯基]亞甲基-4-氧代-2-疏代-3-噻唑烷乙酸或 ((5Z)-4-氧代-5-[3-(l-苯基乙氧基)-4-(2-笨基乙氧基)亞爺基]-2-硫代-l,3-噻唑烷-3-基}乙酸。 —種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其具有插入滅活的PMT基因和導(dǎo)入其中的激活的HAC1基因。根據(jù)[46]的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是Ogataeaminuta。
附圖簡迷
圖1顯示了得到O. minuta的激活的HAC1基因的方法和其結(jié)構(gòu)。 圖2概要顯示了本發(fā)明的技術(shù)范圍。
圖3顯示了 0. minuta的激活的HAC1基因的表達(dá)載體 (pOMexPGHy/Hacl)、人RRBP1基因的表達(dá)載體(pOMexGPlA/pl80)和 人抗體基因的表達(dá)栽體(pOMexGAT-G/Ab)的結(jié)構(gòu)。
圖4顯示了在已經(jīng)導(dǎo)入0. minuta的激活的HAC1基因和人RRBP1 基因的產(chǎn)抗體酵母菌抹的培養(yǎng)上清液中分泌的抗體的蛋白印跡分析結(jié) 果。
圖5中的圖顯示了測量已經(jīng)導(dǎo)入O. minuta的激活的HAC1基因和 人RRBP1基因的產(chǎn)抗體酵母菌林分泌的抗體的量的結(jié)果。
圖6顯示了在已經(jīng)導(dǎo)入0. minuta的激活的HAC1基因和人RRBP1 基因的產(chǎn)抗體酵母菌抹的培養(yǎng)上清液中分泌的抗體的蛋白印跡分析結(jié) 果，所述菌抹已經(jīng)在抑制O-糖鏈形成的條件下培養(yǎng)。
圖 7顯示了哞酒糖酵母的活性 HAC1 的表達(dá)載體 (YEp351GAP-II-aHACl)、 人 RRBP1 基因的的表達(dá)栽體 (YEp351GAP-II-p180)、 人抗體基因的表達(dá)栽體(YEp352 GAP-II-alfHc/al化c)和激活的HAC1基因和RRBP1基因的共表達(dá)載體 (YEp3 51G AP-II-aH AC 1 /p 180)。
圖8A的圖顯示了已經(jīng)導(dǎo)入啤酒糖酵母的激活的HAC1基因的表達(dá) 載體和人RRBP1基因的表達(dá)載體的產(chǎn)抗體酵母菌株的抗體分泌生產(chǎn)能 力的對比結(jié)果。圖8B的圖顯示了在抑制O-糖鏈形成的條件下已經(jīng)導(dǎo)入 啤酒糖酵母的激活的HAC1基因的表達(dá)載體和人RRBP1基因的表達(dá)載 體的產(chǎn)抗體酵母菌抹的抗體分泌生產(chǎn)能力的對比結(jié)果。圖8C的圖顯示 了在添加或不添加PMT抑制劑的情況下已經(jīng)導(dǎo)入啤酒糖酵母的激活的 HAC1基因的表達(dá)栽體和人RRBP1基因的表達(dá)載體的產(chǎn)抗體酵母菌抹 的抗體分泌生產(chǎn)能力(絕對值)的對比結(jié)果。
圖9顯示了已經(jīng)導(dǎo)入合成抗體基因(其中密碼子已經(jīng)被置換)的產(chǎn) 抗體菌抹中抗體生產(chǎn)的蛋白印跡分析結(jié)果。圖10顯示了已經(jīng)導(dǎo)入酵母菌抹來源的激活的HACl基因的產(chǎn)抗體 菌株的培養(yǎng)上清液的蛋白印跡分析結(jié)果。
圖11顯示了已經(jīng)導(dǎo)入酵母菌抹來源的激活的HACl基因的產(chǎn)抗體 菌抹的抗體分泌生產(chǎn)量。
圖12顯示了具有插入滅活的PMT1基因-或PMT2基因的產(chǎn)抗體菌 抹的培養(yǎng)上清液的蛋白印跡分析結(jié)果，和已經(jīng)導(dǎo)入激活的HACl基因的 產(chǎn)抗體菌林的培養(yǎng)上清液的蛋白印跡分析結(jié)果。
圖13顯示了具有插入滅活的PMT1基因-或PMT2基因的產(chǎn)抗體菌 林的抗體分泌生產(chǎn)量，和已經(jīng)導(dǎo)入激活的HACl基因的產(chǎn)抗體菌株的抗 體分泌生產(chǎn)量。
圖14顯示了具有插入滅活的PMT4基因的產(chǎn)抗體菌抹的培養(yǎng)上清 液的蛋白印跡分析結(jié)果，和已經(jīng)導(dǎo)入激活的HACl基因的產(chǎn)抗體菌株的 培養(yǎng)上清液的蛋白印跡分析結(jié)果。
圖15顯示了具有插入滅活的PMT4基因的產(chǎn)抗體菌林的抗體分泌 生產(chǎn)量，和已經(jīng)導(dǎo)入激活的HAC1基因的產(chǎn)抗體菌抹的抗體分泌生產(chǎn)量。
圖16A顯示了 PMT5基因-或PMT6基因-缺陷型產(chǎn)抗體菌抹的培養(yǎng) 上清液的蛋白印跡分析結(jié)果。圖16B顯示了 PMT5基因-或PMT6基因-缺 陷 型 產(chǎn) 抗體菌抹的抗體分泌生產(chǎn)量。
圖17顯示了在添加PMT抑制劑(lc)的情況下，通過培養(yǎng)具有插入 滅活的PMT2或PM丁4基因和導(dǎo)入其中的激活的HAC1基因的產(chǎn)抗體菌 抹得到的培養(yǎng)上清液的蛋白印跡分析結(jié)果。
圖18A顯示了在添加PMT抑制劑(lc)的情況下，通過培養(yǎng)具有插 入滅活的PMT2和導(dǎo)入其中的激活的HAC1基因的產(chǎn)抗體菌抹得到的培 養(yǎng)上清液的抗體分泌生產(chǎn)量。圖18B顯示了在添加PMT抑制劑(lc)的 情況下，通過培養(yǎng)具有插入滅活的PMT4和導(dǎo)入其中的激活的HAC1基 因的產(chǎn)抗體菌抹得到的培養(yǎng)上清液的抗體分泌生產(chǎn)量。
圖19顯示了已經(jīng)在添加多種PMT抑制劑(繞丹寧-3-乙酸衍生物) 的情況下培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液的蛋白印跡分析結(jié)果。
圖20顯示了已經(jīng)在添加多種PMT抑制劑(繞丹寧-3-乙酸衍生物) 的情況下培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液的抗體分泌生產(chǎn)量。
下面詳細(xì)描述本發(fā)明。本專利申請要求2006年5月16日提交的曰 本專利申請?zhí)?006-136993的優(yōu)先權(quán)，且包括在其說明書中公開的全部或部分內(nèi)容。
本發(fā)明由下述兩部分組成u具體而言，(A)與蛋白的高水平分泌生 產(chǎn)有關(guān)的基因的導(dǎo)入和(B)酵母(和霉菌)固有的O-糖鏈添加的抑制的組 合，可以在蛋白的高水平分泌生產(chǎn)方面產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。
下面詳細(xì)描述本發(fā)明。
本發(fā)明提供了用于蛋白的高水平分泌生產(chǎn)的基因，包含這樣的基因 的表達(dá)載體，導(dǎo)入了這樣的表達(dá)栽體的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和使用這樣的 轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生產(chǎn)蛋白的方法。
1.用于蛋白的高水平分泌生產(chǎn)的基因
(l)HACl基因
在本發(fā)明中，用于蛋白的高水平分泌生產(chǎn)的基因是HAC1基因。 HAC1基因作為無活性的HAC1基因存在于基因組上；但是，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 應(yīng)激應(yīng)用后由HAC1基因轉(zhuǎn)錄的mRNA會被Irelp剪接，轉(zhuǎn)化成編碼轉(zhuǎn) 錄因子HAC1蛋白(Haclp)的mRNA。翻譯的Haclp然后激活解折疊蛋白 應(yīng)答(UPR)。在本發(fā)明中，將激活的HAC1基因定義為編碼HAC1蛋白 (Haclp)的cDNA (即，與mRNA互補(bǔ))。
因此，優(yōu)選使用激活的HAC1基因，以便進(jìn)一步提高本發(fā)明的效應(yīng)。 特定程度的效應(yīng)也可以通過導(dǎo)入滅活的HAC1基因來實(shí)現(xiàn)。
在下文中，描述了編碼實(shí)際上造成UPR起作用的Haclp的激活的 HAC1基因。HAClp的組分是，從N末端開始，在生物體中高度保守的 DNA-結(jié)合域、亮氨酸拉鏈區(qū)和在其中剪接mRNA且被Irelp新添加在C 末端的未知活性區(qū)。
在本發(fā)明中使用的激活的HAC1基因沒有特別限制，只要這樣的基 因會編碼激活的HAC1蛋白即可。實(shí)例包括在本發(fā)明中新獲得的編碼由 源自O(shè)gataea minuta (O. minuta)的SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列組 成的蛋白的DNA，和編碼由SEQ ID NO: 70所示的源自巴斯德畢赤氏酵 母的氨基酸序列組成的蛋白的DNA?？梢圆捎门c其同源的功能等價(jià) DNA。
術(shù)語"同源DNA"是指，例如，編碼由與SEQ ID NO: 23或70所示 的氨基酸序列具有至少70。/。同源性的氨基酸序列組成、且具有激活解折 疊蛋白應(yīng)答(UPR)的功能的蛋白的基因，編碼由通過缺失、置換和/或添 加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從SEQ ID NO: 23或70所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有激活UPR的功能的蛋白的基因，和在嚴(yán)格條件 下與由SEQ ID NO: 22或69所示核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列組成的 DNA雜交、且編碼具有激活UPR的功能的蛋白的基因。
術(shù)語"與SEQ ID NO: 23或70所示的氨基酸序列具有至少70°/。同源 性的氨基酸序列"是指具有優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%和最優(yōu)選至 少95%同源性的氨基酸序列。使用例如日本的DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ),通 過FASTA、 BLAST或其它程序，可以進(jìn)行蛋白同源性搜索。
前述"SEQ ID NO: 23或70所示氨基酸序列中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸" 中的術(shù)語"幾個(gè)，，指示的數(shù)目沒有特別限制。例如，術(shù)語"幾個(gè)"大約指20 或更少，優(yōu)選10或更少，更優(yōu)選7或更少，和進(jìn)一步優(yōu)選5或更少。
在前述的"嚴(yán)格條件"下，形成所謂的特異性雜交體，但是不形成非 特異性雜交體。在這樣的條件下，例如，高度同源的DNA,即由與SEQ ID NO: 22或69所示核苷酸序列具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選 至少95%同源性的核苷酸序列組成的DNA的互補(bǔ)鏈，會經(jīng)歷雜交，但 是具有更低同源性水平的DNA的互補(bǔ)鏈不會經(jīng)歷雜交。更具體而言， 鈉濃度是150至900 mM,優(yōu)選600至900 mM,溫度是60°C至68°C , 優(yōu)選65r。
通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如Kunkel方法或有缺口的雙鏈體方法， 或根據(jù)它們的技術(shù)，可以導(dǎo)入上述突變，例如缺失、置換和/或添加。例 如，可以使用定點(diǎn)誘變的誘變試劑盒，例如Mutant-K (Takara Bio), Mutant-G (Takara Bio)，或LA PCR體外誘變系列試劑盒(Takara Bio)。
術(shù)語"激活UPR的功能"是指，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的抗解折疊的蛋白積 累的防御反應(yīng)(例如轉(zhuǎn)錄的抑制，分子伴侶誘導(dǎo)的折疊加速，變性蛋白的 降解或細(xì)胞凋亡造成的細(xì)胞死亡)的功能。激活UPR的功能基本上等同 于編碼由SEQ ID NO: 23或70所示的氨基酸序列組成的蛋白的基因的 功能。
激活的HAC1基因可以是O. minuta、巴斯德畢赤氏酵母或另 一種甲 醇同化酵母的基因。其實(shí)例包括，編碼源自多形漢遜酵母(安格斯畢赤 氏酵母)、甲醇畢赤氏酵母和博伊丁假絲酵母的激活的HAC1蛋白的基 因。也可以是源自另一個(gè)生物物種的激活的HAC1基因，例如其它類型 的酵母或霉菌。其實(shí)例包括，編碼源自哞酒糖酵母的激活的HAC1蛋白 (GenBank登記號NPJ16622)的基因(YFL031W, GenBank登記號由Irelp從D26506剪接的DNA)，編碼源自里氏木霉激活的HAC1蛋白 (GenBank登記號CAC88374)的基因(GenBank登記號AJ413272)，和 編碼源自構(gòu)巢曲霉活性HacA蛋白(GenBank登記號CAC88375)的基因 (GenBank登記號AJ413273)。
編碼源自啤酒糖酵母、里氏木霉和構(gòu)巢曲霉的激活的HAC1蛋白的 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 39, 41 ，和43所示，對應(yīng)的氨基酸序列 如SEQ ID NO: 40, 42,和44所示。
本文分離的源自O(shè)gataea minuta和巴斯德畢赤氏酵母的激活的 HACl基因是從啤酒糖酵母以外的酵母菌抹分離的首個(gè)基因。這強(qiáng)烈暗 示著，目標(biāo)基因普遍存在于酵母菌抹中，例如甲醇同化酵母菌抹。因此， 這些基因是在本發(fā)明使用的激活的HACl基因的范圍內(nèi)。
此外，激活UPR的轉(zhuǎn)錄因子可以用作前述激活的HACl基因的替 代方案。 一個(gè)實(shí)例是，來自XBP-1基因(例如具有GenBank登記號: NM—005080的人-來源的基因)的、在被Irelp剪接后激活的基因，它是 從動(dòng)物細(xì)胞或其它物種來源的HACl同源物。也激活HACl (XBP-l)的 Irel的人工激活，也對應(yīng)著UPR的激活。因此，認(rèn)為與導(dǎo)入激活的HACl 基因等價(jià)。此外，認(rèn)為未激活的HACl基因的強(qiáng)制表達(dá)會產(chǎn)生與導(dǎo)入上 述激活的HACl等價(jià)的作用。
可以通過任意方法來得到激活的HACl基因，只要會誘導(dǎo)UPR即 可。例如，mRNA可以從下述細(xì)胞得到在其中高水平表達(dá)編碼難以折 疊的蛋白的基因的細(xì)胞，或用糖鏈修飾抑制劑例如衣霉素、氧化還原劑 例如DTT或過氧化氫、或UPR誘導(dǎo)物處理過，此后由其合成cDNA的 細(xì)胞。通過使用DNA合成儀合成其一部分或全長，也可以從已經(jīng)公開 的序列得到mRNA。
(2) RRBP1基因
在本發(fā)明中，用于蛋白的高水平分泌生產(chǎn)的另 一個(gè)基因的實(shí)例是 RRBPl基因u RRBP1基因是編碼稱作核糖體結(jié)合蛋白1的蛋白的基因， 它也稱作hES， ES130, ES/130,或DKFZp586A1420基因。哺乳動(dòng)物RRBP1 基因由N-末端跨膜區(qū)、富含堿性氨基酸的后續(xù)區(qū)域、包含10個(gè)氨基酸 殘基的序列的54個(gè)重復(fù)序列、和C-末端區(qū)組成。
在本發(fā)明中使用的RRBP1基因沒有特殊限制，只要它編碼核糖體 結(jié)合蛋白1即可。實(shí)例包括人-來源的RRBPl基因(編碼KIAA1398蛋白；GenBank登記號AB037819)和狗-來源的RRBP1基因(編碼核糖體受體 pl80; GenBank登記號X87224)。只要與前迷基因在功能上等價(jià)，可以 使用其同源基因。人-來源的RRBP1基因和狗-來源的RRBP1基因的核 苷酸序列如SEQ ID NO: 45和47所示,對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 46和48所示。
同源基因的實(shí)例包括編碼由與人或狗來源的RRBP1的氨基酸序 列具有至少70%同源性的氨基酸序列組成、且具有核糖體結(jié)合活性的蛋 白的基因；編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從人或狗 來源的RRBP1的氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有核糖體結(jié) 合活性的蛋白的基因;和在嚴(yán)格條件下與由人或狗來源的RRBP1基因的 核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列組成的基因雜交、且編碼具有核糖體結(jié) 合活性的蛋白的基因。同源性程度、嚴(yán)格條件和誘變方法如上所述。
這樣的同源基因的具體實(shí)例包括源自小鼠(登記號XM一622097, XM—91338,和XM—991888)、大鼠(登記號XM—230637)、非洲爪蟾(登記 號NM—001005671 )和斑馬魚(zebra danio)(登記號NM—19943l)的 RRBP1基因。
RRBP1基因也可以通過普遍已知的技術(shù)來得到。例如，可以從在其 中表達(dá)RRBP1基因的細(xì)胞制備mRNA，且可以進(jìn)一步合成cDNA。
在本發(fā)明中，通過制備mRNA和使用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的一般 技術(shù)，可以得到用于蛋白的高水平分泌生產(chǎn)的前述基因和編碼作為下述 高水平分泌生產(chǎn)的靶的外源蛋白的基因(這些基因在下文中稱作"靶基 因")。作為前述一般技術(shù)的一個(gè)實(shí)例，使用從靶基因片段合成的DNA 探針，篩選源自在其中表達(dá)靶基因的細(xì)胞或組織的cDNA文庫，以便分 離目標(biāo)基因。通過本領(lǐng)域普遍使用的技術(shù)，可以制備mRNA。例如，可 以用胍試劑或苯酚試劑處理前述細(xì)胞或組織，以得到總RNA，然后通過 親和柱方法，使用寡(dT)纖維素柱或聚尿苷酸-瓊脂糖凝膠，使用瓊脂糖 凝膠2B作為載體，或批式技術(shù)，得到聚腺苷酸十RNA(mRNA)。此外， 通過蔗糖密度梯度離心或通過其它方式，可以分離聚腺苷酸+RNA。隨 后，將得到的mRNA用作模板，使用寡dT引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈 cDNA,使用DNA合成酶I、 DNA連接酶、RNA酶H等從單鏈cDNA 合成雙鏈cDNA。使用T4DNA合成酶，將合成的雙鏈cDNA平端化， 進(jìn)行銜接子(例如EcoRI銜接子)的連接、磷酸化等，摻入入噬菌體例如入gtll，然后體外包裝，以制備cDNA文庫。除了人噬菌體以外，可以使 用質(zhì)粒載體來制備cDNA文庫。此后，可以從cDNA文庫選擇具有目標(biāo) DNA的菌林(即，陽性克隆)。
當(dāng)從基因組DNA分離靶基因時(shí)，或當(dāng)分離含有啟動(dòng)子區(qū)域和終止 子區(qū)域的片段時(shí)，從源生物的細(xì)胞菌抹提取基因組DNA，并根椐普通技 術(shù)選擇把基因(Molecular Cloning, 1989; Methods in enzymology 194, 1991)。例如通過Cryer等人的方法(Methods in Cell Biology, 12, 39-44， 1975)或P. Philippsen等人的方法 (Methods Enzymol., 194, 169-182, 1991)，可以提取基因組DNA。當(dāng)來源是酵母菌抹時(shí)，例如，制備酵母 原生質(zhì)體，然后對酵母原生質(zhì)體進(jìn)行常規(guī)技術(shù)，例如已知的DNA提取 技術(shù)、在高鹽濃度去除細(xì)胞殘余物后的醇沉淀技術(shù)或在苯酚或氯仿提取 后的醇沉淀技術(shù)。
通過例如PCR (PCR Technology, Henry A. Erlich， Stockton Press, 1989)，可以得到靶基因。當(dāng)通過PCR擴(kuò)增靶基因時(shí)，將合成的20聚體 至30聚體單鏈DNA用作引物，將基因組DNA用作模板。證實(shí)擴(kuò)增的 基因的核苷酸序列，然后使用。
通過下述方法可以得到含有序列未知的靶基因的片段(a)通過常 規(guī)技術(shù)制備基因文庫，和(b)從得到的要擴(kuò)增的基因文庫選擇目標(biāo)克隆。 通過下述方法可以制備基因文庫通過常規(guī)技術(shù)從源生物的細(xì)胞系得到 染色體DNA，用適當(dāng)?shù)臄嗔严拗泼覆糠值叵旧wDNA,將得到的 片段連接至適當(dāng)?shù)脑泽w，然后將該載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞?；蛘撸?以從細(xì)胞提取mRNA,可以從其合成cDNA，可以將合成的cDNA連接 至適當(dāng)?shù)妮d體，并且可以將該載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，從而可以制備 基因文庫。在該情況下，可以使用已知是基因文庫制備的常規(guī)載體的質(zhì) 粒，可以廣泛地使用噬菌體、粘?；蚱渌d體。根據(jù)載體類型，可以選 擇進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
通過菌落雜交、噬斑雜交或包含使用含有靶基因特異性序列的標(biāo)記 探針的其它方式，可以從上面的基因文庫選擇攜帶靶基因片段的克隆。
也可以對靶基因進(jìn)行化學(xué)全合成。例如，制備2對互補(bǔ)的寡核苷酸， 然后退火，在DNA連接酶的輔助下連接幾個(gè)退火的DNA鏈，或制備幾 個(gè)部分互補(bǔ)的寡核苷酸，通過PCR填充缺口。從而，可以合成基因。
通過常規(guī)技術(shù)，例如雙脫氧方法(Sanger等人，Proc. Natl. Acad.Sci.， U.S.A., 74, 5463-5467, 1977)，可以測定基因的DNA序列。此外， 使用可商業(yè)得到的測序試劑盒等，可以容易地測定上述DNA核苷酸序列。
2.表達(dá)載體
本發(fā)明提供了包含激活的HAC1基因或RRBP1基因的載體，或包 含激活的HAC1基因和RRBP1基因兩者的栽體。為了在宿主細(xì)胞中表 達(dá)激活的HAC1基因和RRBP1基因，可以將包含激活的HAC1基因或 RRBP1基因的栽體用于實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。或者，包含這兩個(gè)基因的載體可以用 于實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。這樣的表達(dá)栽體也可以包含編碼外源蛋白的基因?；蛘?， 可以分別制備包含編碼外源蛋白的基因的表達(dá)栽體。在該情況下，將載 體共轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞。
編碼外源蛋白的基因沒有特別限制。實(shí)例包括各種酶基因，例如 a-淀粉酶基因和a-半乳糖苷酶基因；可藥用的各種干擾素基因和生理活 性蛋白，例如干擾素a和干擾素y;各種白介素基因，例如IL1和IL2; 各種細(xì)胞因子基因，例如促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因和粒細(xì)胞集落刺激 因子(G-CSF)基因;和生長因子基因。這些基因可以通過任意方式來得到。
本發(fā)明對于高度疏水的蛋白和由于組分形成而分泌生產(chǎn)不足的蛋 白是特別有效的。因而，前述的外源蛋白包括多聚體蛋白，例如抗體或 它的功能片段，即，異多聚體。
可以將表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)適當(dāng)?shù)靥砑拥郊せ畹腍AC1基因、RRBP1基因或 編碼外源蛋白的基因，以將表達(dá)栽體構(gòu)成蛋白表達(dá)單元。蛋白表達(dá)單元 按照轉(zhuǎn)錄讀碼框的方向包含至少一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)、上述基因和轉(zhuǎn)錄終止子 區(qū)。這里可以使用的啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子或組成型表達(dá)啟動(dòng)
子，例如醇氧化酶(AOX)2因啟動(dòng)4r二^:丙酮合酶(D:S)基因啟動(dòng) 子，和甲酸脫氫酶(FDH)啟動(dòng)子。可以使用的另一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí) 例是銅-誘導(dǎo)型(CUP)啟動(dòng)子。組成型表達(dá)啟動(dòng)子的實(shí)例包括甘油醛-3-磷酸脫氫酶(TDH, GAP)基因、磷酸甘油激酶(PGK)基因、磷酸丙糖異構(gòu) 酶(TPI)基因、烯醇酶(ENO)基因、肌動(dòng)蛋白(ACT)基因、細(xì)胞色素c (CYC) 基因、海藻糖合酶(TPS)基因和醇脫氫酶(ADH)基因的啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄終止 子也可以是具有終止啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的活性的序列。它可以是啟動(dòng)子的相 同或不同基因的序列。為了實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高水平分泌生產(chǎn)，必須使用有效的啟動(dòng)子。當(dāng) 嘗試使用高活性啟動(dòng)子來生產(chǎn)不容易折疊或不容易分泌的蛋白時(shí)，可能 不利地發(fā)生分泌過少。這樣的分泌過少因?yàn)橄率鲈蚨l(fā)生。也就是說， 蛋白生產(chǎn)超過了在其中進(jìn)行翻譯的核糖體的容量和在其中進(jìn)行折疊和 分泌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的容量。這造成大量生產(chǎn)的蛋白在細(xì)胞中變性、積累、遍 在蛋白化，和被蛋白體降解。因此，可以適當(dāng)選擇達(dá)到下述程度的表達(dá)
水平的啟動(dòng)子得到的蛋白會變性，且不會發(fā)生聚集，或得到的蛋白不
會超過分泌容量?；蛘?，可以減弱啟動(dòng)子的活性，然后可以使用感興趣 的啟動(dòng)子?？梢匀缟显诙嗑垠w蛋白中所述，影響形成異多聚體的分子。
更具體地，分子例如抗體是包含2個(gè)分子的異四聚體，所述2個(gè)分子各 自是要聚集的重鏈和輕鏈。因而，表達(dá)水平是實(shí)現(xiàn)適當(dāng)足夠的重要因素。 當(dāng)激活的HAC1基因的表達(dá)強(qiáng)度非常強(qiáng)時(shí)，過度應(yīng)激會施加于細(xì)胞，這 可能不利地抑制生長。因而，如上所述需要啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)和優(yōu)化。
母的表達(dá)載體可以包含選自下述的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因Hisl， His2， His3， His4, His5, His6， Leu2, Algl, Alg2， Alg3, Trpl， Lys2, Adel， Ade2, Ura3,和Ura5基因。
作為選擇標(biāo)記，除了前述的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記以外，可以使用賦予對 藥物的抗性的抗藥標(biāo)記，所迷藥物例如淺藍(lán)菌素，金4旦子素，Zeocm,刀 豆氨酸，環(huán)己酰亞胺，潮霉素，殺稻瘟素，四環(huán)素，卡那霉素，氨芐西林， 四環(huán)素，和新霉素。從而，可以選擇轉(zhuǎn)化體。也可以將賦予對乙醇的溶劑 抗性、對甘油或鹽的滲透抗性、對銅的金屬離子抗性等的基因用作標(biāo)記， 從而選擇轉(zhuǎn)化體。
3.轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞包含導(dǎo)入其中的上面1所述的基因或上面 2所述的表達(dá)栽體。
要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的一個(gè)實(shí)例是真核細(xì)胞，優(yōu)選酵母菌抹。酵母菌 抹的實(shí)例包括甲醇同化酵母菌抹，例如Ogataea mmuta,巴斯德畢赤氏 酵母，多形漢遜酵母(安格斯畢赤氏酵母)，和博伊丁假絲酵母和酵母菌 林，例如啤酒糖酵母，乳酸克魯維酵母，解脂耶氏酵母,和粟酒裂殖酵 母。 更 具 體 地 ， Ogataea minuta YK3 菌 株 (AochlApep4AprblAypslAura3Aadel)可以用作Ogataea minuta菌抹，哞酒糖酵母BY4741菌抹(MATa厶his3A leu2Ametl5A ura3)可以用作嘩酒 糖酵母菌抹，盡管酵母菌林不限于此。
此外，本發(fā)明意在獲得其中增強(qiáng)了分泌必需的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的宿主細(xì)胞。 因此，本發(fā)明適用于動(dòng)物細(xì)胞或其它細(xì)胞。
在本發(fā)明中，可以通過任意方法將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，只要 導(dǎo)入的基因在宿主中穩(wěn)定存在且充分表達(dá)即可。常用的這樣的方法的實(shí)
例包括磷酸鉤方法(Ito等人，Agric. Biol. Chem.,48, 341, 1984),電穿孔 (Becker，D. M.等人，1990; Methods. Enzymol., 194, 182-187),使用原生 質(zhì)球(Creggh等人，Mol. Cell. Biol., 5， 3376, 1985),乙酸鋰方法(Itoh, H. 1983;丄Bacteriol. 153， 163-168),和脂轉(zhuǎn)染。 4.生產(chǎn)蛋白的方法
在本發(fā)明中，可以如下生產(chǎn)蛋白通過常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì) 胞，從培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行蛋白取樣，隨后純化。本文使用的術(shù)語"培養(yǎng)產(chǎn)物" 是指培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)的菌林或破碎的細(xì)胞或細(xì)菌，以及培養(yǎng)上清液。
根據(jù)用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的常規(guī)方法，可以在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿 主纟田月包。
當(dāng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是微生物例如酵母時(shí)，可以將天然的或合成的培 養(yǎng)基用作培養(yǎng)基，只要它含有可被微生物同化的碳源、氮源和無機(jī)鹽且 能有效培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體即可?？梢允褂每杀晃⑸锿娜我馓荚矗鋵?shí)例 包括碳水化合物例如葡萄糖，果糖，蔗糖,和淀粉；有機(jī)酸例如乙酸和 丙酸;和醇例如乙醇和丙醇。氮源的實(shí)例包括氨；無機(jī)酸或有機(jī)酸的銨 鹽例如氯化銨，硫酸銨，乙酸銨,和磷酸銨；其它含氮化合物；蛋白胨； 肉膏;和玉米漿。無機(jī)鹽的實(shí)例包括磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，磷酸鎂, 硫酸鎂，氯化鈉，硫酸鐵(I),硫酸錳，硫酸銅,和碳酸鈣。根據(jù)選擇標(biāo)記的 類型，可以向培養(yǎng)基中適當(dāng)添加抗生素試劑，例如金擔(dān)子素，氨芐西林, 或四環(huán)素。或者，可以去除可由補(bǔ)充輔源營養(yǎng)(例如Leu, Ura，或Trp)的
基因提供的氨基酸。
當(dāng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞時(shí)，在酵母的情況下，例如，優(yōu)選將培養(yǎng)基
的pH水平調(diào)節(jié)至4-7。培養(yǎng)溫度是15"C至32°C，優(yōu)選約28。C。當(dāng)表達(dá) 具有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的蛋白作為抗體時(shí)，優(yōu)選在低溫進(jìn)行培養(yǎng)，以便在細(xì) 胞中更有效地折疊這樣的蛋白。培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間通常是約24至1 ，000小時(shí)， 培養(yǎng)可以通過批式培養(yǎng)(例如靜止、搖動(dòng)、攪拌或通氣培養(yǎng))或通過連續(xù)培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)u
通過SDS-PAGE，蛋白印跡，ELISA等，可以證實(shí)來自培養(yǎng)產(chǎn)物(即， 培養(yǎng)液或培養(yǎng)的細(xì)胞)的外源蛋白的基因的表達(dá)產(chǎn)物。
通過常規(guī)的蛋白分離和純化技術(shù)，可以分離和純化生產(chǎn)的蛋白。當(dāng) 在培養(yǎng)后在細(xì)菌或細(xì)胞中生產(chǎn)靶蛋白時(shí)，使用例如超聲粉碎機(jī)、弗氏細(xì) 胞壓碎器、Manton-Gaulin勻漿器、Dinomil等，可以將細(xì)菌或細(xì)胞粉碎， 以獲得粑蛋白。當(dāng)在細(xì)菌或細(xì)胞外生產(chǎn)靶蛋白時(shí)，原樣使用培養(yǎng)液，或 通過離心等去除細(xì)菌或細(xì)胞。此后，根據(jù)需要如下收集靶蛋白使用有 機(jī)溶劑萃取，進(jìn)行各種色謙技術(shù)(例如疏水、反相、親和、或離子交換色 譜)，使用分子篩進(jìn)行凝膠過濾，使用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳等。這些 技術(shù)可以單獨(dú)地或兩種或多種組合地使用。從而，可以分離和純化靶蛋 白。
上述培養(yǎng)和純化技術(shù)是實(shí)例，方法不限于此。通過常規(guī)的氨基酸分 析方法，例如通過Edman降解技術(shù)實(shí)現(xiàn)的自動(dòng)化氨基酸測序，可以證實(shí) 純化的基因產(chǎn)物的氨基酸序列。
5.抑制O-糖鏈的方法(或抑制PMT活性的方法)
在本發(fā)明中，當(dāng)酵母用作宿主細(xì)胞時(shí)，前述的培養(yǎng)優(yōu)選在抑制蛋白 O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(PMT)活性的條件下進(jìn)行。
在通過肽O-GalNAc轉(zhuǎn)移酶(主要存在于高爾基體中)添加GalNAc 后，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中形成O-糖鏈。這樣的糖鏈添加發(fā)生在蛋白折疊之 后。相反，酵母和霉菌細(xì)胞中的O-糖鏈形成是在通過由蛋白-O-甘露糖 基轉(zhuǎn)移酶(PMT)基因編碼的PMT向蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基添加 甘露糖之后才啟動(dòng)。這樣的添加稱作PMT活性。甘露糖的添加與細(xì)胞 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的蛋白折疊并行進(jìn)行。從而，不必要的糖鏈可能不利地添 加到在表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白的情況下不應(yīng)發(fā)生這樣的添加的部位。結(jié)果， 這樣的不必要的修飾會造成聚集體的不充分形成和更低的活性。
因此，通過在抑制蛋白O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(PMT)活性的條件下進(jìn) 行培養(yǎng)，可以抑制不必要的O糖鏈的形成。這也會加速蛋白聚集，并維 持蛋白的天然物理性質(zhì)和活性。在本發(fā)明中，通過導(dǎo)入激活的HAC1基 因和/或RRBP基因來實(shí)現(xiàn)蛋白的高水平分泌生產(chǎn)作用，可以進(jìn)一步產(chǎn)生 協(xié)同效應(yīng)，這通過抑制PMT活性來調(diào)節(jié)URP增強(qiáng)的O-糖鏈形成來實(shí) 現(xiàn)。通過例如下述的兩種方法，可以抑制酵母或霉菌特有的O-糖鏈的添 加。這些方法可以組合進(jìn)4亍。
(1) 在其抑制參與酵母或霉菌特有的O-糖鏈的添加的PMT活性的 條件下，進(jìn)行培養(yǎng)和生產(chǎn)。
(2) 使用其中抑制參與酵母或霉菌特有的O-糖鏈的添加的PMT活 性的細(xì)胞。
通過例如向培養(yǎng)基中加入PMT活性的抑制劑(即，PMT抑制劑)， 可以抑制上面(l)的蛋白O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(PMT)活性?？梢允褂玫?PMT活性的抑制劑的一個(gè)實(shí)例是繞丹寧-3-乙酸衍生粉(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14, pp. 3975-3978， 2004)。繞丹寧-3-乙酸衍生 物的具體實(shí)例包括5-[[3,4-( 1 -苯基甲氧基)苯基]亞甲基]-4-氧代-2-硫代-3-p塞哇烷乙酸(在Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, p. 3975: 2004中所述的化合物(lc))和K5Z)-4-氧代-5-[3-(l-苯基乙氧基)-4-(2-苯 基乙氧基)亞爺基]-2-硫代-1，3-噻唑烷-3-基}乙酸(在Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, p. 3975， 2004中所述的化合物 (5a))。這樣的PMT活性的抑制劑(繞丹寧-3-乙酸衍生物)最初被視作抗 細(xì)菌劑，沒有為提高蛋白質(zhì)量或生產(chǎn)力目的而檢查它。在本發(fā)明中首次 發(fā)現(xiàn)了該作用。PMT對于構(gòu)成酵母菌抹壁的甘露糖蛋白的產(chǎn)生而言是重 要的。非常低的PMT活性會不利地影響酵母的生長。因此，當(dāng)使用誘 導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，隨著細(xì)胞生長在表達(dá)外源蛋白的基因時(shí)添加PMT活 性抑制劑是更有效的。從而，可以在最高水平生產(chǎn)其中抑制了 O-糖鏈修 飾的高質(zhì)量靶蛋白。
通過破壞PMT基因或抑制該基因的表達(dá),可以抑制上面(2)所述的蛋 白O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(PMT)活性。在啤酒糖酵母中，PMT由至少6個(gè) 基因編碼；即，PMT1基因(GenBank: L19169), PMT2基因(GenBank: L05146), PMT3基因(GenBank: X83797), PMT4基因(GenBank: X83798), PMT5基因(GenBank: X95644),和PMT6基因(GenBank: Z72984),這些基 因獨(dú)立地形成同二聚體(PMT4p)或異二聚體(PMTlp/PMT2p),且表現(xiàn)出 活性。已知效應(yīng)PMT隨糖蛋白而異。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)PMT蛋白在向 抗體添加O-糖鏈方面具有選擇性。具體而言，在PMT5或PMT6基因缺 陷型菌林中沒有發(fā)現(xiàn)抑制O-糖鏈添加的作用，如實(shí)施例所述。
因而，PMT對于酵母的生長而言是重要的基因。當(dāng)消除或極端降低活性、例如破壞PMT基因時(shí)，細(xì)胞壁會變脆。因而，PMT基因缺陷型 菌株的使用需要注意。在WO 2002/046437中公開的PMT基因的破壞不 總是有效的。它有時(shí)由于生長抑制而不利地影響外源蛋白的生長，希望 抑制具有最佳PMT活性的PMT基因的破壞或表達(dá)，這可以使對靶蛋白 的O-糖鏈添加和修飾最小化。抑制PMT基因的方法的實(shí)例包括，涉及 使用反義RNA或RNAi的方法，和減弱啟動(dòng)子的方法。在本發(fā)明中， 證實(shí)了在其中將DNA片段插入PMT結(jié)構(gòu)基因部分和啟動(dòng)子區(qū)來切割基 因的方法(在下文中，這樣的方法可以稱作"基因的插入滅活"，用于基因 的插入滅活的質(zhì)粒載體稱作"插入滅活載體")是減弱啟動(dòng)子的方式的一 個(gè)實(shí)例。也可以采用這樣的方法，其中導(dǎo)入不具有PMT活性但是作為 蛋白產(chǎn)生的PMT基因片段或其活性相關(guān)氨基酸殘基已經(jīng)突變的基因， 以抑制PMT活性(即，顯性失活方法)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳模式
在下文中，參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，盡管本發(fā)明的技術(shù)范圍不 限于實(shí)施例。在本發(fā)明的實(shí)施例中使用的質(zhì)粒、限制酶、DNA修飾酶等 是可商業(yè)得到的產(chǎn)品，這些產(chǎn)品可以根椐常規(guī)技術(shù)使用。DNA克隆、核 苷酸測序、宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)、從培養(yǎng)產(chǎn)物取樣和 純化酶等的操作也是本領(lǐng)域眾所周知的，可以從現(xiàn)有的出版物獲知。表達(dá)外源基因的質(zhì)粒的構(gòu)建
(1)構(gòu)建表達(dá)外源基因的串聯(lián)載體，其包含具有作為標(biāo)記的G418-抗性基因的A0X1基因啟動(dòng)子、終止子盒和GAP基因啟動(dòng)子和終止子
合
在WO 2003/091431中公開的pOMex3G和pOMexGPlU用作材*+。 用Xbal切割pOMex3G,平端化，然后導(dǎo)入SpeI接頭。得到的載體稱作 pOMex3GXS。單獨(dú)地，用EcoT221切割pOMexGPlU,并平端化，然后 導(dǎo)入Apal接頭。得到的栽體稱作pOMexGPlUTA。用HindIII和Kpnl 消化pOMexGPlUTA,并平端化。此后，用Apal消化分離的含有GAP 啟動(dòng)子和終止子的約2,0 kb的片段，然后導(dǎo)入平端化的pOMex3GXS。 得到的栽體稱作pOMexGAT-G。 pOMexGAT-G是包含A0X1表達(dá)盒內(nèi) 的SpeI-BamHI位點(diǎn)和GAP表達(dá)盒內(nèi)的Sall-Apal位點(diǎn)的串聯(lián)載體。(2) 使用ADE1基因作為選擇標(biāo)記，使用GAP基因啟動(dòng)子和終止子 構(gòu)建表達(dá)外源基因的栽體
在WO 2003/091431中公開的pOMex4A用作材料。用EcoT22I處理 前述的pOMexGPlU,并平端化，然后導(dǎo)入BamHI接頭。得到的載體稱 作pOMexGP2U。用Sail處理pOMexGP2U，并平端化，然后導(dǎo)入Spel 接頭。得到的載體稱作pOMexGP3U 。用HindIII和Kpnl消化 pOMexGP3U，分離含有GAP表達(dá)盒的約2.0 kb的片段。將得到的片段 連接至包含通過用HindIII-KpnI處理pOMex4A分離的ADE1標(biāo)記的約 5.0 kb片段。得到的載體稱作pOMexGPlA。 pOMexGPlA是包含GAP 表達(dá)盒內(nèi)的SpeI-BamHI位點(diǎn)的表達(dá)外源基因的載體。
(3) 使用潮霉素B-抗性基因作為選擇標(biāo)記，使用磷酸甘油激酶 (PGK1)啟動(dòng)子和終止子構(gòu)建表達(dá)外源基因的載體
從Ogataea minuta IFO10746菌抹得到編碼磷酸甘油激酶的PGK1 基因，并測定其核苷酸序列。 (3-1)探針的制備
以下述方式合成包含與源自啤酒糖酵母(GenBank登記號P00560) 和麥芽糖假絲酵母(GenBank登記號P41757)的保守氨基酸序列即 RVDFNVPLD和EGKELPGVA相對應(yīng)的核苷酸序列的DNA簡并引物。
PPG5: 5言-GN GTN GAY TTY AAY GTN CCN TTR GA-3' (SEQ ID NO: 1)
PPG3: 5'-GY NAC DCC NGG YAA YTC YTT DCC YTC-3' (SEQ ID NO: 2)
PPG5引物(SEQ ID NO: l)與氨基酸序列RVDFNVPLD相對應(yīng)，PPG3 引物(SEQ ID NO: 2)是與氨基酸序列EGKELPGVA相對應(yīng)的核苷酸序 列的互補(bǔ)鏈的序列。O. minuta IFO10746菌抹的染色體DNA用作模板, 使用PPG5和PPG3引物進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒，在50°C 進(jìn)行1分鐘，在72"C進(jìn)行1分鐘，該循環(huán)重復(fù)25次。回收擴(kuò)增的DNA 片段(約1.2 kb)，并使用TOPOTA克隆試劑盒克隆。從得到的克隆分離 質(zhì)粒DNA，并測定核苷酸序列。從而，選擇在質(zhì)粒插入的DNA片段中 含有編碼與源自啤酒糖酵母和麥芽糖假絲酵母的PGK1基因的氨基酸序 列具有高度同源性的氨基酸序列的核苷酸序列的克隆。在用EcoRI切割 質(zhì)粒后，回收1.2-kb插入DNA的片段，隨后進(jìn)4亍瓊脂糖凝膠電泳。(3-2)文庫的制備和篩選
用不同的限制酶切割0. mi她IFO10746菌抹的染色體DNA，并 進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳。將分離的DNA轉(zhuǎn)移到Hybond N+尼龍膜 (Amersham)上。使用AlkPhos DIRECT (Amersham)標(biāo)記在上面(l-3-l)中 得到的DNA片段，隨后進(jìn)行DNA印跡雜交。根據(jù)常規(guī)技術(shù)(Molecular cloning第2版，Sambrook, J.,等人編，Cold Spring Harbor Laboratory U.S.A., 1989)進(jìn)行雜交。結(jié)果，認(rèn)為PGK1基因存在于約9.0 kb的BamHI 片段中。為了克隆該DNA片段，制備了基因組文庫。用BamHI切割 O. minuta的染色體DNA,并進(jìn)行瓊脂糖電泳，從凝膠回收約9.0kb的 DNA片段。將回收的DNA片段連接至BamHI-切割的pUC118,并根據(jù) Hanahan的方法(Gene， 10, 63， 1980)轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5a菌株，以制備 文庫。使用前述的DNA片段作為探針，通過菌落雜交篩選約4,000個(gè) 克隆。從得到的陽性克隆中，選擇攜帶PGK1基因的pOMPGKl質(zhì)粒。
(3-3)核苷酸測序
通過引物步移方法，測定pOMPGKl質(zhì)粒的BamHI區(qū)域的核苷酸 序列，發(fā)現(xiàn)測定的序列具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列包括一個(gè)可讀框，后者包含從核苷酸4，766至 6,016的1,254個(gè)堿基對。檢查基于可讀框推導(dǎo)出的SEQ ID NO: 4所示 的氨基酸序列與源自啤酒糖酵母和麥芽糖假絲酵母的和磷酸甘油激酶 之間的同源性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)前一種同源性是74%,后一種同源性是81%。
(3-4)使用PGK1基因啟動(dòng)子和終止子構(gòu)建外源基因表達(dá)盒
制備表達(dá)盒，其將外源基因?qū)牒蠵GK1基因啟動(dòng)子的片段和含 有O. minuta的終止子的片段之間。為了在PGK1基因啟動(dòng)子和終止子 之間導(dǎo)入SpeI、 BglII和BamHI位點(diǎn)，合成了下述引物。
OPGK-P-F:
(SEQ ID NO: 5) OPGK-P-R:
GTGTTTACACTACGACAGCT-3' (SEQ ID NO: 6) OPGK-T-F:
5'-GGATCCGTGGGATTTGCGTGATCTACGTAGTGGTTATTTT-3' (SEQID NO: 7)
OPGK-T-R:
(SEQ ID NO: 8)
使用上述pOMPGKl作為模板，使用OPGK-P-F引物(SEQ ID NO: 5) 和OPGK-P-R引物(SEQ ID NO: 6)進(jìn)行PCR,在94。C進(jìn)行30秒，在55 。C進(jìn)行l(wèi)分鐘，在72。C進(jìn)行1分鐘，該循環(huán)重復(fù)20次。還使用OPGK-T-F 引物(SEQ ID NO: 7)和OPGK-T-R引物(SEQ ID NO: 8)進(jìn)行PCR，該P(yáng)CR 在94。C進(jìn)行30秒，在55。C進(jìn)行1分鐘，在72。C進(jìn)行1分鐘，該循環(huán)重 復(fù)20次。回收擴(kuò)增的1.5-kb和l.O-kbDNA片段，并使用TOPO TA克 隆試劑盒克隆。測定插入DNA片段的核苷酸序列，以選擇具有正確核 苷酸序列的克隆。將1.5-kb和l.O-kb插入DNA片段分別分離為 HindIII-BamHl片段和BamHI-KpnI片段。
將前述的l.O-kb BamHI-KpnI片段導(dǎo)入WO 2003/091431所迷的 pOMex5H的BamHI和Kpnl之間。此后，將前迷的1.5-kb HindIII-BamHI 片段導(dǎo)入得到的質(zhì)粒的HindIII和BamHI之間。得到的質(zhì)粒稱作 pOMexPGHy。 pOMexPGHy是表達(dá)外源基因的栽體，其包含PGK1基因 表達(dá)盒內(nèi)的Spel， BglII,和BamHI?？贵w基因表達(dá)栽體的構(gòu)建
為了克隆源自啤酒糖酵母的MF al (GenBank登記號P01149)的分 泌信號(下文稱作"aMF分泌信號")，合成了下述引物。
Sp-aMFs-F: 5'-ACTAGTATGAGATTTCCTTCAATTT-3' (SEQ ID NO:
9)
Sl-aMFs-F: 5'-GTCGACATGAGATTTCCTTCAATTT-3' (SEQ ID NO:
10)
Xb-aMFs-R: 5'-AGCTTCAGCCTCTCTTTTATCTAGAGA-3' (SEQ ID NO: 11)
以與上迷相同的方式得到的啤酒糖酵母的基因組DNA用作模板， i 使用Sp-aMFs-F引物(SEQ ID NO: 9)和Xb-aMFs-R引物(SEQ ID NO: 11) 進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR在94匸進(jìn)行30秒，在55。C進(jìn)行1分鐘，在72。C進(jìn) 行30秒，該循環(huán)重復(fù)20次。也使用Sl-aMFs-F引物(SEQIDNO: 10)和Xb-aMFs-R引物(SEQ ID NO: 1 l)進(jìn)行PCR，該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒， 在55。C進(jìn)行1分鐘在72。C進(jìn)行30秒，該循環(huán)重復(fù)20次?；厥赵诿總€(gè) PCR中的約0.3 kb的擴(kuò)增的DNA片段，并使用TOPO TA克隆試劑盒 進(jìn)行克隆。證實(shí)插入DNA序列的核苷酸序列，得到的質(zhì)粒分別稱作 TOPOaMFsSP和TOPOaMFsSL。
將抗-TRAIL受體抗體基因(WO 2002/094880)用作抗體基因。為了將 限制酶位點(diǎn)導(dǎo)入在輕鏈和重鏈基因的兩端處的位點(diǎn)，合成了下迷引物。
Xb-KREAEA-Hc-F:
GTC-3'(SEQ ID NO: 12) Hc-R-Bg:
5'-CCAGATCTGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3' (SEQ ID NO: 13)
Xb-KREAEA-Lc-F:
GTC-3'(SEQ ID NO: 14) Lc-R-Ap:
5'-AAAGGGCCCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCT-3' (SEQ ID NO: 15)
使用這些DNA引物進(jìn)行PCR，經(jīng)下述的20個(gè)循環(huán)擴(kuò)增輕鏈在 94。C進(jìn)行30秒，在55。C進(jìn)行1分鐘，在72。C進(jìn)行1分鐘，并經(jīng)下迷的 20個(gè)循環(huán)擴(kuò)增重鏈在94。C進(jìn)行30秒，在55。C進(jìn)行1分鐘，在72°C 進(jìn)行1分鐘30秒，并將擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆進(jìn)pCR2.1-TOPO。證實(shí)插入DNA 序列的核苷酸序列，得到的質(zhì)粒分別稱作TOPOHc-Trail和 TOPOLc-Trail。經(jīng)3片段連接，將通過Sail和Xbal消化從TOPOaMFsSL 分離的aMF分泌信號和通過Xbal和Apal消化從TOPOLc-Trail分離的 抗體輕鏈導(dǎo)入Sall-Apal-消化的pOMexGAT-G。得到的質(zhì)粒稱作 pOMexGAT-G/L。隨后，經(jīng)3片段連接，將通過Spel和Xbal消化從 TOPOaMFsSP分離的aMF分泌信號和通過Xbal和BglII消化從 TOPOHc-Trail 分離的抗體重鏈導(dǎo)入 Spel-BamHI-消化的 pOMexGAT-G/L 。 得到的栽體稱作pOMexGAT-G/Ab (圖3)。 pOMexGAT-G/Ab是包含抗體重鏈和輕鏈表達(dá)單元的抗體表達(dá)載體。[實(shí)施例3] 0. Minuta的激活的HAC1基因表達(dá)載體的構(gòu)建
如下得到激活的HAC1基因在27t:在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞(O. minutaYK2-3菌林)12小時(shí)，在培養(yǎng)基中加入衣霉素至10 jag/ml的濃 度，以便誘導(dǎo)UPR。在含有衣霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)另外12小時(shí)。收集 細(xì)胞后，使用YeastarRNA試劑盒(ZYMO research)制備mRNA。
使用DNA酶I Amplification Grade (Invitrogen),對得到的mRNA進(jìn) 行DNA酶處理。使用Super script III用于RT的第一鏈合成 (Invitrogen),從mRNA合成cDNA。使用下述的HACl-l DNA引物(SEQ ID NO: 16)和HAC1-12引物(SEQ ID NO: 17)，通過PCR擴(kuò)增得到的 cDNA:在94。C進(jìn)行30秒，在52。C進(jìn)行30秒，在72。C進(jìn)行1分鐘， 該循環(huán)重復(fù)30次。將擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆進(jìn)pCR2.1-TOPO (Invitrogen)。此 后，證實(shí)兩類PCR-擴(kuò)增的基因片段的核苷酸序列(SEQ ID NO: 18和19)。
HAC1-1: 5'-ATGAC丁TCCTTTTCAGCACCGCATC-3' (SEQ ID NO:
16)
HAC1-12: 5'-CAAAATTGCAAGCAAGTTAACCG-3' (SEQ ID NO:
17)
得到的兩類cDNA片段之一與基因組序列相一致；但是，另一個(gè)片 段是缺少其一部分的縮短的序列，即，由UPR激活的Irelp剪接的cDNA 片段。為了得到激活的HAC1的cDNA，使用cDNA合并物重復(fù)在94 。C進(jìn)行30秒、在55。C進(jìn)行1分鐘和在72。C進(jìn)行30秒的PCR循環(huán)20 次，推導(dǎo)出它含有speHAClFDNA引物(SEQIDNO: 20)、 bglHAClR引 物(SEQ ID NO: 2)和激活的HAC1的cDNA。
speHACIF: 5'-gactagtATGACTTCCTTTTCAGCACCG-3' (SEQ ID NO: 20)
bglHAClR: 5'-cagatctTCATGACAAGAAATCATCGAAT-3' (SEQ ID NO: 21)
得到的約1 kb的片段包含從激活的HAC1基因的起始密碼子至終止 密碼子的序列(SEQ ID NO: 22),它等同于包含320個(gè)氨基酸殘基的激活 的Haclp的氨基酸序列(SEQ ID NO: 23)。用Spel和BglII處理該序列， 分離，然后導(dǎo)入SpeI-BglII-處理過的pOMexPGHy。得到的載體稱作 pOMexPGHy/Hacl (圖3)。該栽體包含激活的HAC1基因表達(dá)單元。[實(shí)施例4]人RRBP1基因表達(dá)載體的構(gòu)建
使用由Kazusa DNA研究機(jī)構(gòu)提供的人RRBP1基因(KIAA1398, GenBank登記號AB037819)。為了在該基因的兩個(gè)末端部導(dǎo)入限制酶位 點(diǎn)，使用下述DNA引物，即pl80MSp-F和pl80UBg-R(SEQIDNO:24 和25)和人RRBP1基因，經(jīng)20個(gè)在94。C進(jìn)行30秒、在55。C進(jìn)行1分 鐘和在72t:進(jìn)行5分鐘的循環(huán)，通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因。
p180 MSp-F:
AACCTT-3' (SEQ ID NO: 24)
pi 80 UBg-R:
AGCTG-3' (SEQ ID NO: 25)
使用BD In-Fusion Dry-Down PCR克隆試劑盒(BD Science),將得到 的約4.5 kb的片段導(dǎo)入SpeI-BamHI-消化的pOMexGPlA。從Spel位點(diǎn) 確定包含編碼人RRBP1基因起始密碼子的區(qū)域的約500 bp序列，并從 BamHI位點(diǎn)確定包含編碼人RRBPl基因終止密碼子的區(qū)域的約500 bp 片段。得到的載體稱作pOMexGPlA/pl80PCR。用Ndel和Ascl消化 pOMexGPlA/pl80PCR,從質(zhì)粒去除包含人RRBP1基因的ORF中從110 bp至4541 bp的區(qū)域的片段。單獨(dú)地，用Ndel和Ascl消化由Kazusa DNA 研究機(jī)構(gòu)提供的人RRBP1基因，分離包含ORF的110 bp至4541 bp 的區(qū)域的片段，將分離的片段導(dǎo)入前迷的 Ndel-Ascl-消化的 pOMexGPlA/pl80PCR。得到的載體稱作pOMexGPlA/pl80 (圖3)。 pOMexGP 1 A/p 180是人RRBP1基因表達(dá)載體。表達(dá)抗體的酵母菌林(O. minuta)的制備 使用Notl-消化的pOMexGAT-G/Ab載體，通過電穿孔轉(zhuǎn)化O. minuta YK-3 菌抹 (在 WO 2003/091431 中所述的 AochlApep4AprblAypslAura3Aadel)。采用在WO 2003/091431中所述的 電穿孔條件。在含有50 ng/ml G418的YPD瓊脂平板培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化 的細(xì)胞，并培養(yǎng)。此后，提取基因組，使用前述的Xb-KREAEA-Hc DNA 引物(SEQIDNO: 12)和Hc-R-Bg引物(SEQ ID NO: 13),通過PCR證實(shí)重鏈的導(dǎo)入，并使用前述的Xb-KREAEA-Lc-F引物(SEQ ID NO: 14)和 Lc-R-Ap引物(SEQ IDNO: 15)，通過PCR證實(shí)輕鏈的導(dǎo)入。已經(jīng)觀察到 重鏈和輕鏈基因的導(dǎo)入的菌抹，稱作產(chǎn)抗體的O. minuta AOl菌抹。表達(dá)激活的HAC1基因和RRBP1基因的產(chǎn)抗體酵母菌 抹(O. minuta)的制備
通過電穿孔，將Sse8783I-消化的pOMexGPlA/p180導(dǎo)入在實(shí)施例5 中生長的產(chǎn)抗體的O. minuta AOl菌林。如下得到轉(zhuǎn)化的菌林在SD 瓊脂平板培養(yǎng)基中選擇ADE+菌林，培養(yǎng)該菌抹，提取基因組，使用上 迷的pi 80 MSp-F (SEQ ID NO: 24)和pi80 UBg-R (SEQ ID NO: 25)，通過 PCR證實(shí)RRBP1基因的導(dǎo)入。得到的轉(zhuǎn)化菌林稱作O. minuta AK2R菌 株。同時(shí)，使用Sse8783I-消化的pOMexGPlA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到O. minuta AK2A菌林作為對照。此外，通過電穿孔，將Aor51HI-消化的 pOMexPGHy-Hacl導(dǎo)入O. minuta AK2R菌林和O. minuta AK2A菌抹。 如下證實(shí)激活的HAC1基因向轉(zhuǎn)化菌林中的導(dǎo)入在包含50 pg/ml潮霉 素的YPD瓊脂平板培養(yǎng)基中選擇菌抹，培養(yǎng)該菌抹，提取基因組，并 使用speHACIF DNA引物(SEQ ID NO: 20)和bglHAClR引物(SEQ ID NO: 21),通過PCR確認(rèn)。得到的菌林分別稱作O. minuta AK3RH菌株 和O. minuta AK3AH菌林。同時(shí)，將Aor51HI-消化的pOMexPGHy導(dǎo)入 O. minuta AK2R菌林和O. minuta AK2A菌抹，以得到O. minuta AK3RHy菌抹和O. minuta AK3AHy菌抹作為對照。轉(zhuǎn)化的酵母菌林(O. minuta)分泌抗體的證實(shí) 在28°C,在BYPMG培養(yǎng)基(1%酵母提取物(Difco), 2%多聚胨 (Difco), 1.5%曱醇，0.5%甘油,和0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0))中培養(yǎng)O. minuta AK3RH、 O. minuta AK3AH、 O. minuta AK3RHy、和O. minuta AK3AHy菌株4天。從培養(yǎng)液制備培養(yǎng)上清液，并進(jìn)行SDS-PAGE。將 分離的蛋白在PVDF膜上印跡，使用標(biāo)記的抗-人抗體(抗-人Fc抗體和 抗-人k抗體)，進(jìn)行蛋白印跡分析。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)導(dǎo)入RRBP1基因 和激活的HAC1基因的菌抹會分泌比其它菌抹明顯更大量的抗體，如圖 4所示。[實(shí)施例8]轉(zhuǎn)化的酵母菌抹(0. minuta)的分泌抗體的生產(chǎn)力 使用蛋白A柱(Poros A 50 um 4.6 mm D/50 mml, Applied Biosystems),對在實(shí)施例7中制備的培養(yǎng)液進(jìn)行HPLC,以測量抗體產(chǎn) 量(分離條件平衡緩沖液10 mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.0);洗脫緩沖液: 10 mM磷酸鹽緩沖液(pH 3.4);流速4 ml/min;檢測210 nm)。使用在 動(dòng)物細(xì)胞(CHO)中生產(chǎn)的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。圖5顯示了按照OD 600 = 1的抗體生產(chǎn)力。與對照菌抹即O. minuta AK3AHy菌抹中的量相比， 在僅導(dǎo)入RRBP1基因的O. minuta AK3RHy菌株中和在僅導(dǎo)入激活的 HAC1基因的O. minuta AK3AH菌抹中，分泌的抗體的量趨向增加。但 是，在表達(dá)激活的HAC1基因和RRBPl基因兩者的O. minuta AK3RH 菌抹中的抗體生產(chǎn)量，顯著大于對照菌林即O. minuta AK3AHy菌林和 已經(jīng)單獨(dú)導(dǎo)入激活的HAC1基因或RRBPl基因的菌林。因而證實(shí)了， 激活的HAC1基因和RRBPl基因的共表達(dá)會對抗體生產(chǎn)力產(chǎn)生超過協(xié) 同效應(yīng)的作用。在抑制O-糖鏈形成的條件下使用轉(zhuǎn)化的酵母菌抹(O. minuta)生產(chǎn)抗體
在BYPG培養(yǎng)基(1%酵母提取物(Difco), 2。/。聚胨(Difco)， 0.5%甘 油，和0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0))中培養(yǎng)O. minuta AK3RH和O. minuta AK3AHy 2天，在28。C在BYPM培養(yǎng)基[1%酵母提取物(Difco), 2%聚 胨(Difco)， 1.5%曱醇，和0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)]中培養(yǎng)這些菌抹2 天，所述BYPM培養(yǎng)基中已經(jīng)加入了 0 nM, 1 5 ^M， 10 20 pM， 和50 一 PMT抑制劑(繞丹寧-3-乙酸衍生物:5-[[3，4- (l-苯基甲氧基) 苯基]亞曱基]-4-氧代-2-硫代-3-p塞唑烷乙酸(在Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, p. 3975， 2004中所述的化合物(lc)))。從培養(yǎng) 液制備培養(yǎng)上清液，并進(jìn)行SDS-PAGE。此后，將分離的蛋白在PVDF 膜上印跡，使用標(biāo)記的抗-人抗體(抗-人Fc抗體)進(jìn)行蛋白印跡分析。圖 6顯示了結(jié)果。要加入的PMT抑制劑的適當(dāng)濃度是5 jiM。在該情況下， 抗體分泌量和聚集體形成百分比都增加?？贵w基因表達(dá)栽體的構(gòu)建
為了表達(dá)源自啤酒糖酵母的MF al (GenBank 記號P01149)的分泌信號(下文稱作"aMF分泌信號")、抗-TRAIL受體抗體的輕鏈和其重鏈 的融合蛋白，使用下迷寡核苷酸引物，通過重疊延伸PCR，將aMF分 泌信號基因連接至抗-TRAIL受體抗體基因(WO 2001/083560)。
對于aMF分泌信號-抗TRAIL受體抗體的重鏈
EcoALF: 5'-GGAATTCATGAGATTTCCTTCAAT-3' (SEQ ID NO:
26)
Al腳2: 5'-CTCCACCAGCTGTACTTCTCTTTTCTCGAGAGATA曙3' (SEQ ID NO: 27) A腦3:
5'-TATCTCTCGAGAAAAGAGAAGTACAGCTGGTGGAG-3' (SEQ ID NO: 28)
AlfH04: 5'-GGTCGACTCAT丁TACCCGGGGACAG-3' (SEQ ID NO:
29)
對于aMF分泌信號-抗TRAIL受體抗體的輕鏈
EcoALF: 5'-GGAATTCATGAGATTTCCTTCAAT-3' (SEQ ID NO:
26)
AlfL02: 5'-TGGGTCATCTGAATGTCTCTTTTCTCGAGAGATA-3' (SEQ ID NO: 30)
AlfL03: 5'-TATCTCTCGAGAAAAGAGACATTCAGATGACCCA-3' (SEQ ID NO: 31)
AlfL04: 5'-GGTCGACCTAACACTCTCCCCTGT-3' (SEQ ID NO: 32) 使用用Y-DER酵母DNA提取試劑(PIERCE)制備的啤酒糖酵母的 基因組DNA作為模板，擴(kuò)增aMF分泌信號基因區(qū)。使用EcoALF引物 (SEQ ID NO: 26)和AlfH02引物(SEQ ID NO: 27),通過PCR得到重鏈的 aMF分泌信號，所述PCR在95。C進(jìn)行10秒，在55。C進(jìn)行30秒，在 68。C進(jìn)行60秒，該循環(huán)重復(fù)30次。使用EcoALF引物(SEQIDNO:26) 和AlfL02引物(SEQIDNO:30),通過PCR得到輕鏈的aMF分泌信號， 所述PCR在95。C進(jìn)行10秒，在55。C進(jìn)行30秒，在68。C進(jìn)行60秒， 該循環(huán)重復(fù)30次?；厥占s0.26 kb的擴(kuò)增的靶DNA片段。
使用抗-TRAlL受體抗體的cDNA(WO2001/083560)作為模板，擴(kuò)增 抗體基因區(qū)。使用AlfH03引物(SEQ ID NO: 28)和AlfH04引物(SEQ ID NO: 29),通過PCR得到重鏈片段，所述PCR在95匸進(jìn)行10秒，在該循環(huán)重復(fù)30次。使用AlfL03 引物(SEQD NO: 31)和AlfL04引物(SEQ ID NO: 32)，通過PCR得到輕 鏈片段，所述PCR在95'C進(jìn)行IO秒，在55。C進(jìn)行30秒，在68。C進(jìn)行 90秒，該循環(huán)重復(fù)30次。回收約1.35 kb的擴(kuò)增的重鏈區(qū)域的耙DNA 片段和約0.65 kb的輕鏈區(qū)域的靶DNA片段。
隨后，將重鏈的aMF分泌信號區(qū)域和約1.35kb的重鏈區(qū)域用作模 板，使用EcoALF引物(SEQIDNO:26)和AlfH04引物(SEQ ID NO: 29), 進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR在95X:進(jìn)行10秒，在55。C進(jìn)行30秒，在68。C進(jìn) 行90秒，該循環(huán)重復(fù)30次?；厥占s1.6 kb的擴(kuò)增的靶DNA片段。還 將輕鏈的aMF分泌信號區(qū)域和約0.65 kb的輕鏈區(qū)域用作模板，使用 EcoALF引物(SEQ ID NO: 26)和AlfL04引物(SEQ ID NO: 32)，進(jìn)行PCR, 該P(yáng)CR在95。C進(jìn)行10秒，在55X:進(jìn)行30秒，在68。C進(jìn)行60秒，該 循環(huán)重復(fù)30次。回收約0.9 kb的擴(kuò)增的靶DNA片段。將回收的DNA 片段克隆進(jìn)pCR2.1-TOPO?；诓迦隓NA片段的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)這 些序列具有這樣的基因，其中aMF分泌信號已經(jīng)框內(nèi)融合于抗體重鏈， aMF分泌信號已經(jīng)框內(nèi)融合于抗體輕鏈。得到的質(zhì)粒分別稱作 TOPO-alfflc和TOPO-alOx。將導(dǎo)入EcoALF引物(SEQ ID NO: 26)的 EcoRI限制酶位點(diǎn)和導(dǎo)入AlfH04引物(SEQ ID NO: 29)和AlfL04引物 (SEQ ID NO: 32)的Sail限制酶位點(diǎn)，用于通過TOPO-alfHc和 TOPO-aHLc的EcoRI-SalI消化，回收編碼aMF分泌信號和抗體重鏈的 融合產(chǎn)物和aMF分泌信號和抗體輕鏈的融合產(chǎn)物的DNA片段。
為了在哞酒糖酵母中表達(dá)抗體重鏈和抗體輕鏈，將通過EcoRI-Sall 消化回收的編碼aMF分泌信號和抗體重鏈的融合產(chǎn)物和aMF分泌信 號和抗體輕鏈的融合產(chǎn)物的DNA片段連接至甘油眵-3-磷酸脫氫酶基因 (TDH3, GAP)啟動(dòng)子-終止子盒中的EcoRI-Sall位點(diǎn)，該盒已經(jīng)導(dǎo)入 YEp352大腸桿菌-酵母穿梭栽體(Yeast 2, p. 163-167， 1986)。得到的質(zhì) 粒分別稱作YEp352GAP-II-alfHc和YEp352GAP-II-alfLc。'隨后，將在 GAP啟動(dòng)子-終止子盒的2個(gè)末端的BamHI限制酶位點(diǎn)用于分別從 YEp352GAP-II-alfHc和YEp352GAP-II-alfLc回收編碼BamHI-GAP啟動(dòng) 子-aMF分泌信號-抗體重鏈-GAP終止子-BamHI的基因片段(片段1) 和編碼BamHI-GAP啟動(dòng)子-aMF分泌信號-抗體輕鏈-GAP終止子 -BamHI的基因片段(片段2)。通過3片段連接，將片段1和2導(dǎo)入YEp352GAP-H-alfHc或Ep352GAP-II-alfLc的BamHI位點(diǎn)，從中切割片 段1或2。得到的載體稱作YEp352 GAP-II-禮c/alfLc (圖7)?；谙拗?酶切割圖譜，證實(shí)了片段1和2以正向在YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc中 的串聯(lián)導(dǎo)入。YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc是攜帶抗體重鏈和輕鏈表達(dá)單 元的抗體表達(dá)載體。啤酒糖酵母激活的HAC1基因表達(dá)載體的構(gòu)建
激活的IREI的RNA酶活性從啤酒糖酵母的HAC1前體mRNA去 除252個(gè)核芬酸，形成成熟的HAC1 mRNA。該成熟的HAC1 mRNA翻 譯成激活的HACl,從其C末端去除IO個(gè)氨基酸殘基，并新添加18個(gè) 氨基酸殘基(PNAS 97， pp. 4660-4665, 2000)。從而，使用下述寡核苷酸 引物，通過重疊延伸PCR,構(gòu)建編碼激活的HAC1的基因。
HAC-Sac-ATG: 5'-GGAGCTCATGGAAATGACTGATTTTG-3' (SEQ ID NO: 33)
HAC-內(nèi)部R:
AG-3' (SEQ ID NO: 34) HAC-內(nèi)部F:
;'-GCCCGGGTCATGAAGTGATGAAGAAATC-3'
TTC-3' (SEQ ID NO: 35)
HAC-Sma-STOP: (SEQ ID NO: 36)
將使用Y-DER酵母DNA提取試劑(PIERCE)制備的啤酒糖酵母基 因組DNA用作模板。使用HAC-Sac-ATG引物(SEQ ID NO: 33)和HAC-內(nèi)部R引物(SEQ ID NO: 34)進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR在95。C進(jìn)行10秒，在 55。C進(jìn)行30秒，在68。C進(jìn)行60秒，該循環(huán)重復(fù)30次。單獨(dú)地，使用 HAC-內(nèi)部F引物(SEQ ID NO: 35)和HAC-Sma-STOP引物(SEQ ID NO: 36)進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR在95。C進(jìn)行10秒，在55。C進(jìn)行30秒，在68 。C進(jìn)行60秒，該循環(huán)重復(fù)30次?；厥占s0.66 kb(片段A)和約0.06 kb (片段B)的擴(kuò)增的靶DNA片段。
隨后，將擴(kuò)增的片段A和片段B用作模板，使用HAC-Sac-ATG引 物(SEQ ID NO: 33)和HAC-Sma-STOP引物(SEQ ID NO: 36)進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR在95。C進(jìn)行IO秒，在55。C進(jìn)行30秒，在68。C進(jìn)行60秒，該 循環(huán)重復(fù)30次，以得到約0.7 kb的擴(kuò)增的靶DNA片段。將回收的DNA 片段克隆進(jìn)pCR2.1-T0P0。基于插入DNA片段的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)該 片段具有編碼含有238個(gè)氨基酸殘基的激活的HAC1的基因。該質(zhì)粒 稱作TOPO-aHacl。使用已經(jīng)導(dǎo)入HAC-Sac-ATG引物(SEQ ID NO: 33) 中的Sacl限制酶位點(diǎn)和已經(jīng)導(dǎo)入HAC-Sma-STOP引物(SEQ ID NO: 36) 中的SmaI限制酶位點(diǎn)，通過SacI-SmaI消化來回收編碼激活的HACl的 基因。
為了在啤酒糖酵母中表達(dá)激活的HAC1,將通過Sacl-Smal消化回 收的編碼激活的HAC1的基因連接至甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3， GAP)啟動(dòng)子-終止子盒中的Sacl-Smal位點(diǎn)位點(diǎn)，該盒已經(jīng)導(dǎo)入YEp35
大腸桿菌-酵母穿梭載體(Yeast 2, pp. 163-167, 1986)。得到的質(zhì)粒稱作 YEp351GAP-II-aHACl (圖7)。該載體包含激活的HAC1基因表達(dá)單元。人RRBP1基因表達(dá)載體的構(gòu)建
使用由Kazusa DNA研究機(jī)構(gòu)提供的人RRBP1基因(KIAA1398, GenBank登記號AB037819)。為了在上述基因的兩端都導(dǎo)入限制酶位 點(diǎn)，使用下述寡核苷酸引物P180kpnatg和P180xbastop(SEQIDNO: 37 和38)和人RRBP1基因，通過PCR擴(kuò)增基因，該P(yáng)CR在95。C進(jìn)行10 秒，在55。C進(jìn)行30秒，在68。C進(jìn)行6分鐘，該循環(huán)重復(fù)30次。
P180kpnatg: 5'-GGGTACCATGGATATTTACGACACTC-3' (SEQ ID NO: 37)
P180xbastop: 5'-GTCTAGATCAGACAGAGGTGCCCTCC-3' (SEQ ID NO: 38)
回收得到的約4.7 kb的片段，克隆進(jìn)pCR2.1-TOPO。基于插入DNA 片段的核菩酸序列，證實(shí)在插入片段的兩端的約600 bp的區(qū)域都適當(dāng)?shù)?包含目標(biāo)核苷酸序列。得到的質(zhì)粒稱作TOPO-P180。隨后，用Ndel和 Hpal限制酶消化TOPO-P180,回收含有與KIAA1398的110 bp至4524 bp 之間的區(qū)域等同的區(qū)域的片段。向取出的區(qū)域中導(dǎo)入KIAA 1398的約4.4 kb的Ndel-Hpal片段，以構(gòu)建TOPO-P180N,使用大腸桿菌SCSI 10菌 抹(Stratagene)使Xbal限制酶位點(diǎn)去曱基化。使用已經(jīng)導(dǎo)入P180kpnatg 引物(SEQ ID NO: 37)和P180xbastop引物(SEQ ID NO: 38)中的Kpnl-Xbal限制酶位點(diǎn)，回收包含編碼RRBP1的基因的Kpnl-Xbal片段。 為了在啤酒糖酵母中表達(dá)RRBPl,將上面回收的Kpnl-Xbal片段連 接至甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3， GAP)啟動(dòng)子-終止子盒中的 Kpnl-Xbal位點(diǎn)，該盒已經(jīng)導(dǎo)入YEp352大腸桿菌-酵母穿梭載體(Yeast 2, pp. 163-167, 1986)。得到的質(zhì)粒稱作YEp352GAP-II-p180。隨后，用Pvul 限制酶消化YEp352GAP-II-p180,回收含有GAP啟動(dòng)子-RRBPl基因 -GAP終止子的Pvul片段。將Pvul片段連接至包含標(biāo)記基因的Pvul片 段，即YEp351大腸桿菌-酵母穿梭載體(Yeast2, pp. 163-167, 1986)的復(fù) 制必需的區(qū)域，以構(gòu)建YEp351GAP-II-plS0 (圖7)。該載體包含RRBP1 基因表達(dá)單元。激活的HAC1基因和RRBP1基因的共表達(dá)載體的構(gòu)建 為了使用單一載體將激活的HAC1基因和RRBP1基因?qū)肫【铺?酵母，構(gòu)建了激活的HAC1基因和RRBP1基因的共表達(dá)栽體。用Hpal 限制酶消化在實(shí)施例11中構(gòu)建的YEp351GAP-II-aHACl。隨后，從在實(shí) 施例12中構(gòu)建的YEp352GAP-II-pl80回收含有GAP啟動(dòng)子-RRBPl基 因-GAP終止子的BamHI片段，使用T4 DNA聚合酶(Takara Bio)將兩 個(gè)末端平端化，將產(chǎn)物導(dǎo)入YEp351GAP-II-aHACl的HpaI位點(diǎn)。得到 的質(zhì)粒稱作YEp351GAP-II-aHACl/pl80 (圖7)。分析核苷酸序列，以確 定導(dǎo)入含有導(dǎo)入的GAP啟動(dòng)子-RRBP1基因-GAP終止子的BamHI片段 的方向。該載體包含激活的HAC1基因和RRBP1基因的表達(dá)單元。構(gòu)建表達(dá)抗體的酵母菌株和表達(dá)激活的HAC1基因和 RRBP1基因的表達(dá)抗體的酵母菌抹(啤酒糖酵母)
使用Frozen-EZ酵母轉(zhuǎn)化II試劑盒(ZYMO RES ARCH),制備啤酒 糖酵母BY4741菌林的感受態(tài)細(xì)胞(MATa厶his3厶leu2Ametl5A ura3)。 將啤酒糖酵母BY4741菌林接種進(jìn)5 ml YPAD培養(yǎng)基(含有0.04°/。腺嘌 呤(Sigma)的YPD培養(yǎng)基)，使用通過過夜培養(yǎng)(3(TC ,在310rpm)得到的 酵母細(xì)胞。使用Frozen-EZ酵母轉(zhuǎn)化II試劑盒(ZYMO RESARCH)，將 在實(shí)施例IO至實(shí)施例13中構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入啤酒糖酵母BY4741菌 抹。選擇在含有2。/。瓊脂的ST瓊脂培養(yǎng)基(酵母氮基和包含2。/。葡,萄糖、 0.04%腺。票呤和0.3 M KC1且缺少尿嘧啶和亮氨酸的^危酸銨培養(yǎng)基(Sigma))上生長的轉(zhuǎn)化體作為表達(dá)抗體的酵母菌林。
包含抗體重鏈和輕鏈表達(dá)單元的YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc具有 補(bǔ)充宿主的需尿嘧啶的突變的URA3標(biāo)記基因。YEp351 GAP-II(其中沒 有導(dǎo)入基因的對照載體)，YEp351GAP-II-aHACl (激活的HAC1表達(dá)載 體 )， YEp351GAP-II-p180 (RRBP1 表 達(dá)栽體)，和 YEp351 GAP-II-aHACl/pl80 (激活的HAC1基因和RRBP1的共表達(dá)載體) 各自包含補(bǔ)充宿主的需亮氨酸的突變的LEU2標(biāo)記基因。從而，將這些 栽體轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主，使得僅在如下所示聯(lián)合導(dǎo)入兩種載體時(shí)基因才生長， 以構(gòu)建4類表達(dá)抗體的酵母菌抹。
啤酒糖酵母T2K01 YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc (URA3)YEp351 GAP-I1 (LEU2)
啤酒糖酵母 T2K02 YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc (URA3)YEp351GAP-II-aHACl (LEU2)
啤酒糖酵母 T2K03 YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc (URA3)YEp351GAP-II-p180 (LEU2)
啤酒糖酵母 T2K04 YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc (URA3)YEp351GAP-II-aHACl/p180 (LEU2)轉(zhuǎn)化的酵母菌林(哞酒糖酵母)的抗體生產(chǎn)力 在3(TC,使用ST培養(yǎng)基培養(yǎng)在實(shí)施例14中制備的啤酒糖酵母 T2K01、啤酒糖酵母T2K02、啤酒糖酵母T2K03、和啤酒糖酵母T2K04 菌抹3天。將培養(yǎng)液接種進(jìn)YPAD培養(yǎng)基，在其中達(dá)到5%終濃度，在 30。C培養(yǎng)3天。從培養(yǎng)液制備培養(yǎng)上清液，產(chǎn)物稱作含有酵母分泌和生 產(chǎn)的抗體的樣品。通過夾心ELISA,對分泌和生產(chǎn)的抗體進(jìn)行定量測定。 將作為抗-TRAIL受體抗體的抗原的TRAIL受體蛋白吸附到96孔平板 上，加入酵母樣品，使用過氧化物酶-標(biāo)記的人IgG特異性的Fc抗體(過 氧化物酶標(biāo)記的親和純化的抗人IgG (Fc)抗體(KPL))和ABTS過氧化物 酶底物(KPL)進(jìn)行檢測。在動(dòng)物細(xì)胞中生成的抗體(NSO)用作標(biāo)準(zhǔn)樣品。
如圖8A所示，其中僅導(dǎo)入RRBP1基因的啤酒糖酵母T2K03菌林 在生產(chǎn)力方面沒有顯著不同于對照菌抹即哞酒糖酵母T2K01菌抹。但 是，在僅導(dǎo)入激活的HAC1基因的啤酒糖酵母T2K02菌抹的情況下，生 產(chǎn)力是對照菌抹即啤酒糖酵母T2K01菌抹的約2倍。此外，在共表達(dá)激活的HAC1基因和RRBP1基因的啤酒糖酵母T2K04菌抹的抗體生產(chǎn) 力，顯著高于對照菌林即啤酒糖酵母T2K01菌抹和單獨(dú)導(dǎo)入激活的 HACl基因或RRBPl基因的菌株(即，比對照高約7倍)。這表明，激活 的HACl基因和RRBPl基因的共表達(dá)會對抗體生產(chǎn)力產(chǎn)生等于或大于 協(xié)同效應(yīng)的作用。使用轉(zhuǎn)化的酵母菌抹(啤酒糖酵母)在抑制O-糖鏈形 成的條件下的抗體生產(chǎn)力
在30°C,使用ST培養(yǎng)基培養(yǎng)在實(shí)施例14中制備的啤酒糖酵母 T2K01、啤酒糖酵母T2K02、哞酒糖酵母T2K03、和啤酒糖酵母T2K04 菌林3天。以5%終濃度，將培養(yǎng)液接種進(jìn)在開始已經(jīng)加入10 pMPMT抑 制劑(繞丹寧-3-乙酸衍生物5-[[3,4-(l-苯基甲氧基)苯基]亞曱基]-4-氧 代-2-石危代-3-噻唑烷乙酸(在Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14， p. 3975， 2004中所述的化合物(lc))的YPAD培養(yǎng)基，在30。C培 養(yǎng)3天。從培養(yǎng)液制備培養(yǎng)上清液，產(chǎn)物稱作含有酵母分泌和生產(chǎn)的抗 體的樣品。以與實(shí)施例15相同的方式，使用在動(dòng)物細(xì)胞中生成的抗體 (NSO)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，通過夾心ELISA對樣品進(jìn)行定量測定。
如圖8B所示，導(dǎo)入激活的HAC1基因的啤酒糖酵母T2K02菌抹和 導(dǎo)入RRBP1基因的啤酒糖酵母T2K03菌株的抗體生產(chǎn)力明顯高于對照 菌林即啤酒糖酵母T2K01菌株。此外，共表達(dá)激活的HAC基因和RRBP1 基因的啤酒糖酵母T2K04菌抹的抗體產(chǎn)量，顯著高于對照菌抹即哞酒糖 酵母T2K01菌抹和單獨(dú)導(dǎo)入激活的HAC1基因或RRBP1基因的菌抹 (即，比對照高約8倍)。通過抑制O-糖鏈形成，進(jìn) 一 步增強(qiáng)了激活的HAC 1 基因和RRBP1基因的共表達(dá)對抗體生產(chǎn)的協(xié)同效應(yīng)。 Ogataea minuta蛋白酶YPS1基因缺陷型菌林 (Aoch 1 Ayps 1 Aura3 Aade 1 )的制備
用BamHI和ClaI切割在WO 2003/091431中公開的YPSl基因-缺陷 型載體pDOMYPl,通過電脈沖方法轉(zhuǎn)化進(jìn)WO 2003/091431中公開的 O. minuta TK5-3菌抹(AochlAura3Aadel)。為了確i人破壞了該基因的 YPS1基因，合成了下述引物。
DY5; 5,-CTCAAGGGCCTGGAGACTACG-3, (SEQ ID NO: 49)DY3; 5，-CGGGATTCCCGAGTCGCTCACC-3， (SEQ ID NO: 50) 從轉(zhuǎn)化菌抹分離的染色體DNA用作模板，使用DY5和DY3引物 進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR在9(C進(jìn)行30秒，在6CTC進(jìn)行1分鐘，在72。C進(jìn) 行2分鐘，該循環(huán)重復(fù)25次。從已經(jīng)將質(zhì)粒導(dǎo)入YPS1基因座中的菌 林，檢測擴(kuò)增的3.7-kb DNA片段。選擇的菌抹稱作O. minuta YK4菌林 (AochlAura3AadelAypsl::URA3)。在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)O. minuta YK4 菌抹至穩(wěn)定期后，獲得表現(xiàn)出對5-氟乳清酸(5-FOA)的抗性的菌林。將 5-FOA抗性菌抹的染色體DNA用作模板，使用DY5和DY3引物進(jìn)行 PCR，該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒，在6CTC進(jìn)行1分鐘，在72。C進(jìn)行3分 鐘，該循環(huán)重復(fù)25次。從缺少URA3的菌抹;f企測擴(kuò)增的1.2-kb DNA片 段。該Aochl厶ura3AadelAypsl菌抹稱作O. minuta YK5菌抹。合成抗體基因生產(chǎn)菌抹(O. minuta)的制備和抗體生產(chǎn) (1)合成抗體基因表達(dá)載體的構(gòu)建
用Spel切割在WO 2003/091431中公開的pOMexGPlU,平端化， 然后連接。將得到的質(zhì)粒的Sail位點(diǎn)和EcoT221位點(diǎn)分別用Spel位點(diǎn) 和BamHI位點(diǎn)進(jìn)行接頭變化。得到的質(zhì)粒稱作pOMexGPlUASp。
從抗-TRAIL受體抗體基因的氨基酸序列(WO2002/094880)設(shè)計(jì)基 因，同時(shí)考慮O. minuta的密碼子使用頻率，從而人工合成抗體基因 (TakaraBio)。將啤酒糖酵母SUC2信號或雞溶菌酶信號添加到輕鏈和重 鏈基因的N末端，將限制酶位點(diǎn)(在5'側(cè)上的Xbal位點(diǎn)和在3'側(cè)上的 BamHI位點(diǎn))的核苷酸序列添加到2個(gè)末端(核苷酸序列SEQ ID NO: 51， 53， 55,和57;氨基酸序列SEQ ID NO: 52， 54, 56,和58)。將已經(jīng)用XbaI 和BamHI消化的具有不同信號的兩類輕鏈基因片段導(dǎo)入在實(shí)施例1(2) 中制備的pOMexGPlA載體。得到的載體分別稱作pOMexGPA/AbSUC 和pOMexGPA/AbLys。將已經(jīng)用Xbal和BamH消化的發(fā)出不同信號的 兩類重鏈基因片段導(dǎo)入pOMexGPlUASp載體的Spel-BamHI位點(diǎn)。得 到的栽體稱作pOMexGPUASp/AbSUC和pOMexGPUASp/AbLys。
將pOMexPGHy (實(shí)施例1 (3-4))用作模板，使用PGKHy-F DNA引 物(SEQ ID NO: 59)和PGKHy-R DNA引物(SEQ ID NO: 60)進(jìn)行PCR, 該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒，在55"C進(jìn)行30秒，在72。C進(jìn)行1分鐘，該 循環(huán)重復(fù)20次。從而，擴(kuò)增潮霉素B-抗性基因。PGKHy-F:
5'-ATAGAACTAGCAACTAGATGAAAAAGCCTGAACTCAC-3， (SEQ ID NO: 59) PGKHy-R:
5，-CAAATCCCACGGATCACTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3' (SEQ ID NO: 60)
使用in-fusion試劑盒(BD Bioscience),將擴(kuò)增的基因片段導(dǎo)入 SpeI-BglII-消化的pOMexPGHy，并測定插入片^:的核苷酸序列。得到的 質(zhì)粒用作模板，使用PGKpUC-p DNA引物(SEQ ID NO: 61)和PGKpUC-t DNA引物(SEQIDNO: 62)進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒，在55 。C進(jìn)行30秒，在72。C進(jìn)行2分鐘，該循環(huán)重復(fù)20次。從而，擴(kuò)增含 有PGK啟動(dòng)子-潮霉素B抗性基因-PGK終止子的基因片段。
PGKpUC-p:
5，-AATTCGAGCTCGGTACAGGGATACATGGGATACCAAAG-3， (SEG ID NO: 61)
PGKpUC-t:
5,-GAGGATCCCCGGGTACCAGGGTCGATTTTCTTGGTCGA-3， (SEQ ID NO: 62)
使用in-fusion試劑盒(BD Bioscience),將擴(kuò)增的基因片段導(dǎo)入 Asp718I-消化的pUC118 (TakaraBio),并測定插入片段的核苷酸序列。 得到的質(zhì)粒稱作PGKHyg/pUC118 。用 HindIII和Kpnl消化 pOMexGPlUASp，分離包含GAP啟動(dòng)子-終止子的盒，將分離的盒插入 HindIII-KpnI 消化的 PGKHyg/pUCl 18 。 得到的質(zhì)粒稱作 GAP/HyG/pUCl 18。隨后，用Ndel和EcoRI消化pUC19 (Takara Bio), 平端化，然后連接，以去除在pUC19內(nèi)的Ndel-EcoRI區(qū)域。用 HindIII-SacI消化該質(zhì)粒，導(dǎo)入包含通過HindIII-SacI消化從 GAP/HyG/pUCl 18分離的GAP啟動(dòng)子-終止子和PGK啟動(dòng)子-潮霉素B 抗性基因-PGK終止子的基因片段。得到的質(zhì)粒稱作pOMexHy。
將已經(jīng)添加Xbal-BamH消化的雞溶菌酶信號的抗體重鏈基因片段 導(dǎo)入Spel-BamHI處理過的pOMexHy,得到的栽體稱作pOMexHy/AbLys。
(2)表達(dá)抗體基因的酵母菌抹的制備
通過電穿孔，使用NotI-消化的抗體表達(dá)載體即pOMexGPA/AbLys和 pOMexGPUASp/AbLys 來轉(zhuǎn)化 O. minuta YK5 菌株 (AochlAypslAura3Aadel)。使用在WO 2003/091431中描述的電穿孔條 件。在SD瓊脂平板培養(yǎng)基(2%葡萄糖，0.67%酵母氮基(Difco))中選 擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在27。C在B2YP4G培養(yǎng)基(1.34%酵母氮基(Difco)， 2% 酵母提取物(Difco), 4。/。聚胨(Difco), 4%甘油,和0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0))中培養(yǎng)單個(gè)菌落4天。從培養(yǎng)液制備培養(yǎng)上清液，按照實(shí)施例7所 述的方式進(jìn)行蛋白印跡分析，以選擇其中已經(jīng)導(dǎo)入抗體輕鏈和重鏈基因 的生產(chǎn)抗體的菌抹，得到的菌抹稱作O, minutaAAl菌抹。如圖9所示， O. minuta AA1菌林分泌的抗體的量顯著大于在實(shí)施例5中制備的O. minutaAOl菌抹分泌的量。
將Notl消化的抗體表達(dá)栽體即pOMexGPA/AbSUC和 pOMexGPUASp/AbSUC導(dǎo)入在WO 2003/091431中所述的O. minuta TK5-3菌抹(AochlAura3Aadel),以得到表達(dá)抗體的0. minuta YY1菌林。 采用上述的電穿孔和菌抹選擇方法。巴斯德畢赤氏酵母的激活的HAC基因的獲取和表達(dá) 載體的構(gòu)建
以與實(shí)施例3相同的方式，從細(xì)胞(巴斯德畢赤氏酵母的GS115菌 林)獲得巴斯德畢赤氏酵母的激活的HAC1基因。以與實(shí)施例3相同的方 式，從巴斯德畢赤氏酵母的GS115菌林合成cDNA。使用下示的HACpl-l DNA引物(SEQ ID NO: 63)和HACpl-12引物(SEQ ID NO: 64),通過PCR 擴(kuò)增該cDNA，該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒，52。C進(jìn)行30秒，在72。C進(jìn) 行1分鐘，該循環(huán)重復(fù)30次。將擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆進(jìn)pCR2.1-TOPO (Invitrogen)，證實(shí)從兩類PCR擴(kuò)增的基因片段衍生的核苷酸序列(SEQ ID NO: 65和66)。
HACpl-1: 5'-ATGCCCGTAGATTCTTCTCATAAGACAGC-3' (SEQ ID NO: 63)
HACpl-12: 5'腸CAAAGTCATTTAAATCAAATGCATTAGCGG-3' (SEQ ID NO: 64)
得到的兩類cDNA片段的核苷酸序列之一(SEQ ID NO: 65)與基因 組序列相一致；但是，另一個(gè)序列(SEQIDNO:66)是部分缺陷的，且縮 短。這表明，這樣的缺陷序列是已經(jīng)被UPR激活的Irelp剪接的cDNA片段。為了得到激活的HAC1的全長cDNA,進(jìn)行PCR，該P(yáng)CR在94 。C進(jìn)行30秒，在55r進(jìn)行30秒，在72。C進(jìn)行1分鐘，其中使用下示 的speHACplF DNA引物(SEQ ID NO: 67)和bglHACplR DNA引物(SEQ ID NO: 68)和被認(rèn)為含有上述HAC1的激活的cDNA的cDNA合并物， 該循環(huán)重復(fù)20次。
speHACplF: 5'-gactagtATGCCCGTAGATTCTTCTCATA-3' (SEQ ID NO: 67)
bglHACplR: 5'-cagatctCTATTCCTGGAAGAATACAAAGT-3' (SEQ ID NO: 68)
得到的約1 kb的片段含有位于巴斯德畢赤氏酵母的激活的HAC1 基因的起始密碼子和終止密碼子之間的區(qū)域(SEQ ID NO: 69),它等同于 包含304個(gè)氨基酸殘基的激活的Haclp的氨基酸序列(SEQ ID NO: 70)。 用Spel和BglII處理產(chǎn)物，分離，然后導(dǎo)入Spel-Bglll處理過的 pOMexPGHy (實(shí)施例1 (3-4))。得到的載體稱作pOMexPGHy/PpHacl 。 該載體包含源自巴斯德畢赤氏酵母的激活的HAC1基因表達(dá)單元。啤酒糖酵母激活的HAC1基因表達(dá)載體的構(gòu)建 將在實(shí)施例11中制備的含有啤酒糖酵母的激活的HAC1基因的 TOPO-aHacl用作模板，使用ScHAC-XbaF DNA引物(SEQ ID NO: 71) 和ScHAC-BamR DNA引物(SEQ ID NO: 72)進(jìn)行PCR，該P(yáng)CR在94°C 進(jìn)行30秒，在55。C進(jìn)行30秒，在72。C進(jìn)行1分鐘，該循環(huán)重復(fù)20次。 從而，擴(kuò)增啤酒糖酵母的激活的HAC1基因。
ScHAC-XbaF: 5'-gtctagaATGGAAATGACTGATTTTGAACT-3' (SEQ ID NO: 71)
ScHAC-BamR: 5'-cggatccTCATGAAGTGATGAAGAAATCAT-3' (SEQ ID NO: 72)
用Xbal和BamHI消化產(chǎn)物，回收編碼源自啤酒糖酵母的激活的 HAC的基因。分離后，將基因?qū)隨pel-Bglll處理過的pOMexPGHy (實(shí) 施例1 (3-4))。得到的載體稱作pOMexPGHy/ScHacl。該載體包含源自 啤酒糖酵母的激活的HAC1基因表達(dá)單元。已經(jīng)導(dǎo)入O. minuta、巴斯德畢赤氏酵母和啤酒糖酵母的激活的HAC1基因的 . minuta菌林對抗體的生產(chǎn)
(1) 已經(jīng)導(dǎo)入O. minuta、巴斯德畢赤氏酵母和啤酒糖酵母激活的 HACl基因的O. minuta菌抹的制備
通過電穿孔，將Aor5HI消化的O. minuta來源的激活的HACl基 因表達(dá)載體即pOMexPGHy/Hacl 、巴斯德畢赤氏酵母來源的激活的 HACl基因表達(dá)載體即pOMexPGHy/PpHacl、和啤酒糖酵母來源的激活 的HACl基因表達(dá)載體即pOMexPGHy/ScHacl導(dǎo)入在實(shí)施例18中生長 的產(chǎn)抗體的O. minuta AA1菌抹。如下證實(shí)激活的HACl基因向轉(zhuǎn)化菌 林中的導(dǎo)入在已經(jīng)加入濃度為50 pg/ml的潮霉素B的YPD瓊脂平板 培養(yǎng)基中選擇菌抹，培養(yǎng)它們，然后提取基因組。使用實(shí)施例3所述的 speHACIF DNA引物(SEQ ID NO: 20)和bglHAClR DNA引物(SEQ ID NO: 21)，對其中已經(jīng)導(dǎo)入O. minuta來源的激活的HACl基因表達(dá)載體 pOMexPGHy/Hacl的菌抹進(jìn)行PCR。使用speHACplFDNA引物(SEQ ID NO: 67)和bglHACplR引物(SEQ ID NO: 68),對其中已經(jīng)導(dǎo)入巴斯德畢 赤氏酵母來源的激活的HACl基因的菌抹進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR在94匸進(jìn) 行30秒，在55。C進(jìn)行30秒，在72。C進(jìn)行1分鐘，該循環(huán)重復(fù)30次。 除了使用ScHAC-XbaF DNA引物(SEQ ID NO: 71)和ScHAC-BamR引物 (SEQIDNO: 72)以外，在相同條件下，對其中已經(jīng)導(dǎo)入啤酒糖酵母來源 的激活的HACl基因的菌林進(jìn)行PCR。得到的菌林分別稱作O. minuta AA2omH菌株，O. minuta AA2ppH菌抹，和O. minuta AA2scH菌林。同 時(shí)，將Aor51HI-消化的pOMexPGHy導(dǎo)入O. minuta AA1菌抹，以得到 O. minuta AA2Hy菌抹作為對照。
(2) 已經(jīng)導(dǎo)入HAC1基因的生產(chǎn)抗體的菌抹分泌抗體的證實(shí) 以實(shí)施例18 (2)所述的方式，培養(yǎng)在上面(l)中制備的已經(jīng)導(dǎo)入
HACl基因的生產(chǎn)抗體的菌林，即O. minuta AA2omH菌抹、 . minuta AA2ppH菌抹、O. minuta AA2scH菌抹和O. minuta AA2Hy菌4朱，并 在非還原條件下進(jìn)行蛋白印跡分析。結(jié)果如圖10所示。也就是說，與 在上面(l)制備的對照 . minuta AA2Hy菌抹相比，在O. minuta AA2omH菌株、O. mmuta AA2ppH菌林和O. mmuta AA2scH菌林中觀 察到更顯著的糖鏈向抗體分子的添加，但是沒有觀察到抗體-H2L2聚集 體分泌的顯著加速作用。從而，通過導(dǎo)入源自不同于宿主的物種的 HAC1基因，可以預(yù)見到類似的生產(chǎn)效應(yīng)。(3) 已經(jīng)導(dǎo)入HAC1基因的產(chǎn)抗體的0. minuta菌抹的分泌抗體的生 產(chǎn)力(通過基于TR-FRET的均質(zhì)分析定量)
將包含12 ^ 0.97 ^g/ml LANCE Eu-W1024標(biāo)記的抗-人IgG (PerkinElmer)、 8.3 ug/ml生物素綴合的小鼠抗-人IgG (BD Bioscience)、 16.7 ug/ml Surelight APC鏈霉抗生物素(PerkinElmer)和10% Block Ace (Dainippon Pharmaceutical)的20 mM Tris-HCl緩沖液(pH 7'2)應(yīng)用于96-孔半?yún)^(qū)域平板(Cormng),向其中引入如下制備的2 pi樣品溶液用含有 10% Block Ace的20 mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.2)充分稀釋在上面(2)制 備的培養(yǎng)液，然后攪拌。使樣品溶液在室溫在黑暗中反應(yīng)1小時(shí)，然后 使用EnVision (PerkinElmer)測定熒光?；谠?65 nm/615 nm的值，測 定生成的聚集的抗體的量。在動(dòng)物細(xì)胞(CHO)中生產(chǎn)的抗體用作標(biāo)準(zhǔn)樣 品。如圖ll所示，與O. minuta AA2Hy菌沖木相比，在已經(jīng)導(dǎo)入激活的 HAC1基因的O. minuta AA2omH菌抹、O. minuta AA2ppH菌抹和O. minuta AA2scH菌林中，觀察到抗體分泌的顯著加速。但是，甚至通過 導(dǎo)入源自不同于宿主的物種的HAC1基因，也可以預(yù)見到類似的生產(chǎn)效 應(yīng)。
(4) 使用PMT抑制劑(lc),已經(jīng)導(dǎo)入HACl基因的O. mmuta菌抹 的抗體生產(chǎn)
將一鍋環(huán)量的O， minuta AA2omH菌株、O. minuta AA2ppH菌林、 O. minuta AA2scH菌林和O. minuta AA2Hy菌抹接種進(jìn)5 ml B2YP4G培 養(yǎng)基，在27。C培養(yǎng)1天，然后用B2YP4G培養(yǎng)基稀釋，調(diào)節(jié)OD600 -10。向其中加入在實(shí)施例9所迷的PMT抑制劑(lc:母液濃度10 mM), 至2 的濃度。在27匸培養(yǎng)另外3天，每隔24小時(shí)測定OD600,OD600 值每增加l，各加入0.04 PMT抑制劑(lc)。從培養(yǎng)液制備培養(yǎng)上清 液，通過實(shí)施例21 (3)所述的方法，測量抗體生產(chǎn)量。結(jié)果如圖11所示。 發(fā)現(xiàn)與對照O. minuta AA2Hy菌株相比，通過在加入PMT抑制劑的 情況下培養(yǎng)，已經(jīng)導(dǎo)入激活的HAC1基因的O. minuta AAhmH菌株、 O. minuta AA2ppH菌抹和O. minuta AA2scH菌抹可以表現(xiàn)出更顯著的 加速抗體分泌的作用。
從而，發(fā)現(xiàn)使用不同物種的HAC1基因，可以達(dá)到加速抗體分泌的 作用。[實(shí)施例22]源自0. minuta的PMT基因的分離
使用O. minuta IFO10746菌抹的染色體DNA作為模板，使用PM1-5 DNA引物(SEQ ID NO: 73)和PM1-3 DNA引物(SEQ ID NO: 74),通過 PCR得到源自O(shè). minuta的PMT1基因，該P(yáng)CR在94'C進(jìn)行30秒，在 55。C進(jìn)行l(wèi)分鐘，在72。C進(jìn)行2分鐘，該循環(huán)重復(fù)25次。
PM1-5: 5'-ATGGCGGGCAAAAATCAGAAATCTAGCGCG-3' (SEG ID NO: 73)
PM卜3: 5'-TTACAACTCGTCTTTGACTAGAGGCGGGGA國3' (SEQ ID NO: 74)
回收擴(kuò)增的約2.4 kb的DNA片段，使用TOPO TA克隆試劑盒進(jìn) 行克隆。從得到的克隆分離質(zhì)粒DNA，測定插入片段的核苷酸序列(SEQ ID NO: 75)。從而，從質(zhì)粒的插入DNA片段，選擇具有編碼氨基酸序列 (SEQIDNO: 76)的核普酸序列的克隆，所述氨基酸序列與源自啤酒糖酵 母的PMT1基因的氨基酸序列高度同源。分離的質(zhì)粒稱作pOmPMl。
以與在PMT1基因的情況下相同的方式，使用PM2-5 DNA引物 (SEQ ID NO: 77)和PM2-3 DNA引物(SEQ ID NO: 78)得到源自O(shè). minuta 的PMT2基因，使用PM4-5 DNA引物(SEQ ID NO: 79)和PM4-3 DNA引 物(SEQ ID NO: 80)得到PMT4基因，使用PM5-5 DNA引物(SEQ ID NO: 81)和PM5-3 DNA引物(SEQ ID NO: 82)得到PMT5基因，使用PM6畫5 DNA引物(SEQ ID NO: 83)和PM6-3 DNA引物(SEQ ID NO: 84)得到 PMT6基因。包含PMT2基因(核普酸序列SEQIDNO: 85;氨基酸序列 SEQIDNO:86)、 PMT4基因(核苷酸序列SEQ ID NO: 87;氨基酸序歹寸 SEQIDNO: 88)、 PMT5基因(核苷酸序列SEQ ID NO: 89;氨基酸序列: SEQ ID NO: 90)和PMT6基因(核苷酸序列SEQ ID NO: 91;氨基酸序列 SEQ ID NO: 92)的質(zhì)粒分別稱作pOmPM2， pOmPM4， pOmPM5,和 pOmPM6。
PM2-5: 5'-ATGGGCGAACGTACGGGCAAAAGTGCGCTC-3' (SEQ ID NO: 77)
PM2-3: 5'-CTAATCGGAAATTCTCCACGTGCTCAAGAG-3' (SEQ ID NO: 78)
PM4-5: 5'-ATGGGGCCCAAAATAAAGACCGGCAAGAAA-3' (SEQ ID NO: 79)PM4-3: 5'-CTATTTAGCAAAATGCAGTTTGATGTTGAG-3' (SEQ ID NO: 80)
PM5-5: 5'-ATGGACGAGAAAAACATCTCTGGCTTAGAA-3' (SEQ ID NO: 81)
PM5-3: 5'-CTACTCACTATAGACGGAGCAGTCGATCGA-3' (SEQ ID NO: 82)
PM6-5: 5'-ATGTCCGAGTCAGAGCTGAGAAACCGCAAA-3' (SEQ ID NO: 83)
PM6-3: 5'-CTAAGCTATACGCCAGGTGGAAACCCAGTT-3' (SEQ ID NO: 84) O. minuta的PMT基因插入滅活或破壞載體的制備 (1) PMT基因插入滅活載體的制備 (1-1)PMT1基因插入滅活載體的制備
為了使用在實(shí)施例22中得到的pOmPMl分離PMT1基因的部分序 列，使用下述的PMTlhm DNA引物(SEQ ID NO: 93)和PMTlKp DNA 引物(SEQIDNO: 94)進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒，在55。C進(jìn) 行30秒，在72。C進(jìn)行2分鐘，該循環(huán)重復(fù)15次。
PMTlhIII: 5'-caagcttGGACCTACAACACGTCCGAAGAA-3' (SEQ ID NO: 93)
PMTlKp: 5'-cggtaccGGTTTGATACCTTGGGTGGCACA-3' (SEQ ID NO: 94)
用Hindlll和Kpnl消化擴(kuò)增的約1.6 kb的DNA片段，并回收。隨 后，用BglII消化pPICZa (Invitrogen)，并平端化。將Hindlll接頭插入 其中，用BamHI進(jìn)一步消化，并平端化，隨后插入KpnI接頭。得到的 質(zhì)粒稱作pZ-Hd-Kp。用Hindlll和Kpnl消化pZ-Hd-Kp,分離含有zeocine 抗性基因的2.0-kb DNA片段，將PCR擴(kuò)增的PMTl基因的部分序列插 入其中。測定插入的PMT1基因的部分序列的核苷酸序列，然后將得到 的質(zhì)粒命名為pOmPMldZ。 pOmPMldZ能插入滅活O. minuta PMT1基 因的結(jié)構(gòu)基因(CDS)區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)，并抑制PMT1基因的轉(zhuǎn)錄。單獨(dú)地， 用Hindlll和Kpnl消化在實(shí)施例18中制備的Hindlll和Kpnl，回收含有 GAP啟動(dòng)子和終止子的基因片段，將回收的片段插入HindIII-KpnI-消化的含有zeocine抗性基因的2.0-kb DNA片段。得到的質(zhì)粒稱作GAP/Z。 (1-2) PMT2基因插入滅活載體的制備
為了使用在實(shí)施例22中得到的pOmPM2分離PMT2基因的部分序 列，使用下述的PMT2WII DNA引物(SEQ ID NO: 95)和PMT2Kp DNA 引物(SEQ1DN0: 96)進(jìn)行PCR，該P(yáng)CR在94°C進(jìn)行30秒，在55。C進(jìn) 行30秒，在72。C進(jìn)行2分鐘，該循環(huán)重復(fù)15次。
PM丁2hlII: 5'-gaagcttACTACATAATTCGTGTACGTGTTC -3' (SEQ ID NO: 95)
PMT2Kp: 5'-cggtaccGTCGCCGTATTGGTCAGCAA丁CTC -3' (SEQ ID NO: 96)
回收擴(kuò)增的約1.5 kb的DNA片段，用HmdIII和Kpnl消化，然后 回收消化的片段。將得到的DNA片段插入通過用HindIII和Kpnl消化 從pZ-Hd-Kp分離的、含有zeocine-抗性基因的2.0-kb DNA片段，測定 插入的PMT2基因的部分序列的核苷酸序列。將得到的質(zhì)粒命名為 pOmPM2dZ。 pOmPM2dZ能插入滅活O. minuta PMT2基因的結(jié)構(gòu)基因 (CDS)區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)，并抑制PMT2基因的轉(zhuǎn)錄。
(1-3) PMT4基因插入滅活栽體的制備
為了使用在實(shí)施例22中得到的pOmPM4分離PMT4基因的部分序 列，使用下述的PMT4FHdinf DNA引物(SEQ ID NO: 97)和PMT4RKpinf DNA引物(SEQIDNO:98)進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒，在55 。C進(jìn)行30秒，在72。C進(jìn)行2分鐘，該循環(huán)重復(fù)5次。
PMT4FHdinf:
NO: 97)
PMT4RKpinf:
ID NO: 98)
使用in-fusion試劑盒(BD Bioscience),將得到的約1.5 kb的DNA 片段插入通過用HindIII和Kpnl消化從pZ-Hd-Kp分離的、含有zeocine-抗性基因的2.0-kb DNA片段。測定插入的PMT4基因的部分序列的核 苷酸序列，然后將得到的質(zhì)粒命名為pOmPM4dZ。
(2) PMT基因破壞載體的制備(2-)PM丁5基因破壞載體的制備
用Hin細(xì)消化pROMUl,后者含有具有在WO 2003/091431中公開 的在0. minuta的URA3結(jié)構(gòu)基因上游和下游的約0.8 kb的重復(fù)序列的 基因片段，并平端化，隨后插入BamHI接頭。用BamHI和BglII消化得 到的栽體，將含有O. minuta的重復(fù)序列和URA3基因的約3.3 kb片段 導(dǎo)入BamHI消化的pBl腦ript KS- (Stmtagene)。得到的載體稱作 rURApBKS。
將O. minuta IFO10746菌抹的染色體DNA用作沖莫板，使用 PMT5maeF2 DNA引物(SEQ ID NO: 99)和PMT5maeR DNA引物(SEQ ID NO: 100)進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒，在55。C進(jìn)行1分鐘，在 72。C進(jìn)行2分鐘，該循環(huán)重復(fù)25次?；厥諗U(kuò)增的約1.5 kb的DNA片段， 使用in-fusion試劑盒(BD Bioscience)導(dǎo)入BamHI-Hindlll-消化的 rURApBKS。測定插入的基因片段的核苷酸序列。得到的栽體稱作 PMT5K/0/rURA3pre。
將O. minuta IFO10746菌抹的染色體DNA用作模板，使用 PMT5ushiroF DNA引物(SEQ ID NO: IOI)和PMT5ushiroR DNA引物 (SEQIDNO: 102)進(jìn)行PCR，該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒，在55。C進(jìn)行1 分鐘，在72。C進(jìn)行2分鐘，該循環(huán)重復(fù)25次?；厥諗U(kuò)增的約1.5kb的 DNA片段，使用in-fusion試劑盒(BD Bioscience)導(dǎo)入Notl消化的 PMT5K/0/rURA3pre。測定插入的基因片段的核苷酸序列。得到的載體 稱作PMT5K/0/rURA3。
PMT5maeF2:
5'-GACGGTATCGATAAGCTTGATGCGCGGCCTTCCGACCTT-3' (SEQ ID NO: 99)
PMT5maeR:
5'-CTGGGGAAGCTCGGATCCGGCTCGAGGTCTTCG丁TCAGA-3' (SEQ ID NO:闊
PMT5ushiroF:
5'-CTAGTTCTAGAGCGGCCCAGGTCGCTTTCAGGCAGCAG-3' (SEQ ID NO: 101)
PMT5ushiroR:
5'-CACCGCGGTGGCGGCCAAGCTTGGGTACCGGCTCGCGTAG-3'(SEQ ID NO: 102)
(2-2) PMT6基因破壞栽體的制備
將O. minuta IFO10746菌株的染色體DNA用作模板，使用 PMT6inf5'armF DNA引物(SEQ ID NO: 103)和PMT6inf5'armR DNA引物 (SEQIDNO: 104)進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR在94°C進(jìn)行30秒，在55°C進(jìn)行2分 鐘，在72'C進(jìn)行2分鐘，該循環(huán)重復(fù)25次?；厥諗U(kuò)增的約2.8 kb的 DNA片段，使用in-fusion試劑盒(BD Bioscience)導(dǎo)入BamHI消化的 rURApBKS。測定插入的基因片段的核普酸序列。得到的載體稱作 PMT6K/0/rURA3pre。
將O. mmuta IFO10746菌抹的染色體DNA用作模板，使用 PMT6inf3'armF DNA引物(SEQ ID NO: 105)和PMT6inf3'armR2 DNA引 物(SEQ ID NO: 106)進(jìn)行PCR，該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒，在55。C進(jìn) 行2分鐘，在72。C進(jìn)行2分鐘，該循環(huán)重復(fù)25次?；厥諗U(kuò)增的約2.5kb 的DNA片段，使用in-fusion試劑盒(BD Bioscience)導(dǎo)入NotI-SacII消 化的PMT6K/0/rURA3pre。測定插入的基因片段的核苷酸序列。得到的 載體稱作PMT6K/OMJRA3。
PMT6inf5'armF:
5'-GCAGCCCGGGGgatccACGAAACCACGTCCTACT-3' (SEQ ID NO: 103)
PMT6inf5'armR:
5'-GGGGAAGCTcggatcGACTCATCTTGAAACGCA-3' (SEQ ID NO: 104) PMT6inf3'armF:
5'-AGTTCTAGAGCGGCCTTACCACCATTACATGCC-3' (SEQ ID NO: 105)
PMT6inf3'armR2: 5'-AATTGGAGCTCCACCGCGGCCGCAACTTACTCGACGCTAA-3' (SEQ ID NO: 106)用插入滅活的或破壞的PMT基因制備產(chǎn)抗體的O. minuta菌林及其評價(jià)
(1)用插入滅活的PMT基因制備產(chǎn)抗體的O. minuta菌林 對于在實(shí)施例23中制備的PMT基因插入滅活載體，用Pstl消化PMT1基因插入滅活載體，用Xhol消化PMT2基因插入滅活載體，并用 HindIII消化PMT4基因插入滅活載體。通過電穿孔，將這些消化產(chǎn)物導(dǎo) 入在實(shí)施例18中生長的產(chǎn)抗體的O. minuta YY1菌抹。以下述方式證實(shí) 轉(zhuǎn)化菌4^中PMT基因的中斷。在已經(jīng)加入濃度為50 pg/ml的zeocine 的YPD瓊脂平板培養(yǎng)基中選擇菌林，并培養(yǎng)，隨后提取基因組。對PMT1 基因進(jìn)行PCR，該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒，在55。C進(jìn)行30秒，在72 。C進(jìn)行l(wèi)分鐘，該循環(huán)重復(fù)30次，其中使用DNA引物對Zeol (SEQID NO: 107)和PMTlzeol (SEQ ID NO: 109)和DNA引物對Zeo2 (SEQ ID NO: 108)和PMTlzeo2 (SEQ ID NO: 110)。在相同條件下對PMT2基因進(jìn) 行PCR，其中使用DNA引物對Zeol (SEQ ID NO: 107)和PMT2zeo1 (SEQ ID NO: Ul)和DNA引物對Zeo2 (SEQ ID NO: 108)和PMT2zeo2 (SEQ ID NO: 112)。在相同條件下對PMT4基因進(jìn)行PCR，其中使用DNA引物 對Zeol (SEQ ID NO: 107)和PMT4PCR3'armF (SEQ ID NO: 113)和DNA 引物對Zeo2 (SEQ ID NO: 108)和PMT4PCR5'armR3 (SEQ ID NO: 114)。 從而，證實(shí)了在導(dǎo)入插入滅活栽體后PMT基因的插入滅活。
Zeol: 5'-GAACGGCACTGGTCAACTTGGCCAT-3' (SEQ ID NO:
107)
Zeo2: 5'-CTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGA-3' (SEQ ID NO:
108)
PMTlzeol: 5'-GAATTCTAGCCGAGCATGAGCTA-3' (SEQ ID NO:
109)
PMTlzeo2: 5'-CGTTCAGACTCTTGTTGATTTTCCAC-3' (SEQ ID NO: 110)
PMT2zeol: 5'-GCTGTGCCACTGCACGCCTCGACTC-3' (SEQ ID NO: 111)
PMT2zeo2: 5'-CTTGTCCCTCTTGAATGGCGAGTG-3' (SEQ ID NO:
112)
PMT4PCR3'armF: 5'-GGAACACGCCAAACATCATG -3' (SEQ ID NO:
113)
PMT4PCR5'armR3: 5'-CACAAGCAGAATCAGGCAC -3' (SEQ ID NO: 114)
得到的菌抹分別稱作O. minuta YY2P1菌林(含有插入滅活的PMT1基因的菌抹)、0. minuta YY2P2菌抹(含有插入滅活的PMT2基因的菌林) 和0. minuta YY2P4菌株(含有插入滅活的PMT4基因的菌抹)。也將 Sse8387I-消化的GAP/Z導(dǎo)入O. minuta YY1菌抹，選擇zeocine-抗性菌 抹，以得到0. minuta YY2Z菌抹作為對照菌林。(2) 含有插入滅活的PMT基因的產(chǎn)抗體的O. minuta菌抹的分泌抗 體的生產(chǎn)力以實(shí)施例18(2)所述的方式，培養(yǎng)在上面(l)制備的含有插入滅活的 PMT基因的產(chǎn)抗體菌抹，然后進(jìn)行蛋白印跡分析。結(jié)果如圖12和圖14 所示。也就是說，與在上面(l)制備的O. minuta YY2Z菌抹相比，含有 插入滅活的PMT1基因的0. minuta YY2P1菌抹、含有插入滅活的PMT2 基因的O. minuta YY2P2菌抹和含有插入滅活的PMT4基因的O. minuta YY2P4菌抹達(dá)到的抗體聚集體的分泌量略有增加(圖12:泳道3和泳 道6;圖M:泳道3)。(3) 含有插入滅活的PMT基因的產(chǎn)抗體的0. minuta菌株的分泌抗體 的生產(chǎn)力(通過基于TR-FRET的均質(zhì)分析定量)通過在實(shí)施例21 (3)中所述的方法，測量在上面(2)中制備的培養(yǎng)液 中生成的抗體的量。使用在動(dòng)物細(xì)胞(CHO)中生產(chǎn)的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)樣 品。如圖13和圖15所示，與在上面(l)制備的O. minuta YY2Z菌林相 比，含有插入滅活的PMT1基因的O. minuta YY2P1菌林、含有插入滅 活的PMT2基因的O. minuta YY2P2菌抹和含有插入滅活的PMT4基因 的O. minuta YY2P4菌林分泌的抗體聚集體的量略有增加(圖13: YY2P1和YY2P2;圖15: YY2P4)。(4) PMT5和PMT6缺陷型菌抹的制備及其評價(jià)(4-1) 0. minuta PMT5 基 因 缺 陷 型 菌林 (△och 1 Ayps 1 Aura3Aade 1 Apmt5)的制備用HindIII消化在實(shí)施例23 (2-l)中制備的PMT5基因破壞栽體 PMT5K/0/rURA3 ,并通過電脈沖方法轉(zhuǎn)化進(jìn)在實(shí)施例17中制備的 Ogataea minuta YK5菌抹(Aochl厶ura3AadelAypsl)。為了i正實(shí)已經(jīng)石皮壞 了這些菌抹的PMT5基因，合成了下述引物。gPMT5-5: 5'-CGGTGACGACTTCGACTAGTCGAG-3' (SEQ ID NO:115)gPMT5-2: 5'-CGGTGCTGTTGGCGTCGTCATGGGTG-3' (SEQ IDNO: 116)gPMT5-3: 5'-GGCGCGTTCCAATTCCACTCTGCTG-3' (SEQ ID NO:117)gPMT5-4: 5'-CGACGAGTCCTCTCACCAGGAGGTTG-3' (SEQ ID NO: 118)將從轉(zhuǎn)化菌抹分離的染色體DNA用作模板，使用gPMT5-5引物 (SEQ ID NO: 115)和gPMT5-2引物(SEQ ID NO: 116)進(jìn)行PCR，該P(yáng)CR 在94匸進(jìn)行30秒，在6(TC進(jìn)行1分鐘，在72。C進(jìn)行2分鐘，該循環(huán) 重復(fù)25次。從已經(jīng)將質(zhì)粒摻入PMT5基因座中的菌抹，檢測4.9kb的擴(kuò) 增的DNA片段。類似地，將從轉(zhuǎn)化菌林分離的染色體DNA用作模板， 使用gPMT5-3引物(SEQ ID NO: 117)和gPMT5-4引物(SEQ ID NO: 118) 進(jìn)行PCR，該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒，在6(TC進(jìn)行1分鐘，在72。C進(jìn) 行2分鐘，該循環(huán)重復(fù)25次。從已經(jīng)將質(zhì)粒摻入PMT5基因座中的菌 株，檢測4.9kb的擴(kuò)增的DNA片段。選擇的菌林稱作O. minuta YK6菌 抹(AochlAura3AadelAypsl Apmt5::URA3)。(4-2) O. minutaPMT6基因缺陷菌抹(AochlAypslAura3AadelApmt6) 的制備用BamHI和NotI消化在實(shí)施例23 (2-2)中制備的PMT6基因破壞載 體PMT6K/0/rURA3，然后通過電脈沖方法轉(zhuǎn)化進(jìn)在實(shí)施例17中制備 的O. minuta YK5菌抹(AochlAura3AadelAypsl)。為了證實(shí)已經(jīng)破壞了 這些菌林的PMT6基因，合成了下迷引物。PMT6 PCR3'armF: 5'-TGTGGGTGCGATCCTGAG-3' (SEQ ID NO:119)PMT6 PCR3'armR: 5'-GCCGTCGTTGGAGCAAAACT-3' (SEQ ID NO:120)PMT6 PCR5'armF: 5'-GCATGTGCCACTGCTAAA-3' (SEQ ID NO:121)PMT6 PCR5'armR: 5'-GACCAACTTTCCCGTGTAA國3' (SEQ ID NO:122)將從轉(zhuǎn)化菌抹分離的染色體DNA用作模板，使用PMT6 PCR3'armF 引物(SEQ ID NO: 119)和PMT6 PCR3'armR引物(SEQ ID NO: 120)進(jìn)行 PCR,該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒，在60。C進(jìn)行1分鐘，在72。C進(jìn)行2分鐘，該循環(huán)重復(fù)25次。從已經(jīng)將質(zhì)粒摻入PMT6基因座中的菌抹，檢 測5. 8kb的擴(kuò)增的DNA片段。類似地，將從轉(zhuǎn)化菌抹分離的染色體DNA 用作模板，使用PMT6 PCR5'armF引物(SEQ ID NO: 121)和PMT6 PCR5'armR引物(SEQ ID NO: 122)進(jìn)行PCR，該P(yáng)CR在94。C進(jìn)行30秒， 在6(TC進(jìn)行1分鐘，在72。C進(jìn)行2分鐘，該循環(huán)重復(fù)25次。從已經(jīng)將 質(zhì)粒摻入PMT6基因座中的菌抹，檢測6.3kb的擴(kuò)增的DNA片段。選擇 的 菌 林 稱 作 0. mmuta YK7 菌 林(△och 1 Aura3 Aade 1 Ayps 1厶pmt6:: URA3)。(5) 其中的PMT5和PMT6基因已經(jīng)被破壞的產(chǎn)抗體的0. minuta 菌抹的制備通過電穿孔，使用Notl消化的抗體表達(dá)栽體pOMexGPA/AbLys(在 實(shí)施例18 (l)中制備)和Sse83871消化的抗體表達(dá)栽體pOMexHy/AbLys, (在實(shí)施例 18 (1)中制備)來轉(zhuǎn)化O. minuta YK6 菌林 (AochlAypslAura3厶adelApmt5::rURA3)和 O. minuta YK7 菌抹 (AochlAypslAura3AadelApmt6::rURA3)。在已經(jīng)加入濃度為50 jag/ml的 潮霉素B的SD瓊脂平板培養(yǎng)基(2。/。葡萄糖，0,67%酵母氮基(Difco)) 中選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在27。C在B2YP4G培養(yǎng)基(1.34%酵母氮基 (Difco), 2%酵母提取物(Difco)， 4。/o聚胨(Difco), 4%甘油，O.IM磷酸鹽 緩沖液(pH6.0))中培養(yǎng)單個(gè)菌落4天。從培養(yǎng)液制備培養(yǎng)上清液，按照 實(shí)施例7所述的方法進(jìn)行蛋白印跡分析，選擇其中已經(jīng)導(dǎo)入抗體輕鏈和 重鏈基因的生產(chǎn)抗體的菌株，得到的菌抹分別稱作O. mmuta AP5菌抹 (the PMT5基因缺陷型菌林)和O. minuta AP6菌林(the PMT6基因缺陷型 菌株)。單獨(dú)地，通過電穿孔，將Notl消化的抗體表達(dá)載體 pOMexGPA/AbLys和Sse83871消化的pOMexHy/AbLys導(dǎo)入O. minuta YK4菌抹(AochlAura3AadelAypsl::rURA3),以上述方式制備和選擇生產(chǎn) 抗體的菌抹為對照菌抹。得到的菌抹稱作0. mmuta Acon菌株。(6) 其中的PMT5和PMT6基因已經(jīng)被破壞的產(chǎn)抗體的O. minuta菌 抹的的分泌抗體的生產(chǎn)力以實(shí)施例18 (2)所述的方式，培養(yǎng)其中的PMT5基因已經(jīng)被破壞的 0. minuta AP5菌抹和其中的PMT6基因已經(jīng)被破壞的O. minuta AP6菌 抹和0. minuta Acon菌抹，并進(jìn)行非還原蛋白印跡分析。以實(shí)施例21 (3) 所述的方式，測量在培養(yǎng)液中生產(chǎn)的抗體的量。使用在動(dòng)物細(xì)胞(CHO)如圖16所示。也就是說，0. minuta AP5 菌林或O. minuta AP6菌林和對照O. minuta Acon菌抹之間的抗體聚 集體的生產(chǎn)力沒有顯著差異。[實(shí)施例25]含有插入滅活的PMT基因和導(dǎo)入其中的HAC1基因的 0. minuta菌抹的制備及其評價(jià)(1) 含有插入滅活的PMT基因和導(dǎo)入其中的HAC1基因的O. minuta菌沖朱的制備用Aor51HI消化在實(shí)施例3中制備的源自0. minuta的激活的HAC1 基因表達(dá)載體pOMexPGHy/Hacl，并通過電穿孔，導(dǎo)入已經(jīng)在實(shí)施例24 (l)中制備的0. mmutaYY2P2菌抹(含有插入滅活的PMT2基因的菌抹)、 0. minuta YY2P4菌林(含有插入滅活的PMT4基因的菌林)和0. mmuta YY2Z菌株(對照菌抹)。為了證實(shí)激活的HAC1基因已經(jīng)導(dǎo)入轉(zhuǎn)化的菌 林，在已經(jīng)加入濃度為50ng/ml的潮霉素B的YPD瓊脂平板培養(yǎng)基中 選擇菌林，培養(yǎng)菌抹，提取基因組，根據(jù)實(shí)施例6的方法進(jìn)行PCR。得 到的菌抹分別稱作0, mmuta YY3P2omH菌抹(含有插入滅活的PMT2基 因且含有導(dǎo)入其中的HAC1基因的菌株)、0. mmuta YY3P4omH菌抹(含 有插入滅活的PMT4基因且含有導(dǎo)入其中的HAC1基因的菌抹)和O. minuta YY3ZomH菌林(其中已經(jīng)導(dǎo)入HAC1基因的對照菌抹)。同時(shí)， 將Aor51HI消化的pOMexPGHy導(dǎo)入0. minuta YY2Z菌株，獲得0. rmnuta YY3ZHy菌抹(其中已經(jīng)導(dǎo)入載體的對照菌抹)作為對照菌株。(2) 含有插入滅活的PMT基因且含有導(dǎo)入其中的HAC1基因的O. minuta菌4朱的分泌抗體的生產(chǎn)力通過實(shí)施例18(2)所述的方法，培養(yǎng)在上面(l)制備的含有插入滅活 的PMT基因且含有導(dǎo)入其中的HAC1基因的生產(chǎn)抗體的菌株，并進(jìn)行 蛋白印跡分析。結(jié)果如圖12和圖14所示。發(fā)現(xiàn)含有插入滅活的PMT2 基因且含有導(dǎo)入其中的HAC1基因的0. minuta YY3P2omH菌抹會分泌 比僅導(dǎo)入HAC1基因的0. minuta YY3ZomH菌抹和含有插入滅活的 PMT2基因的0. minuta YY2P2菌林明顯更大量的抗體(圖12:泳道7)。 發(fā)現(xiàn)含有插入滅活的PMT4基因且含有導(dǎo)入其中的HAC1基因的0. minuta YY3P4omH菌林會分泌比僅導(dǎo)入HAC1基因的O. minuta YY3ZomH菌株和含有插入滅活的PMT4基因的O. minuta YY2P4菌抹明顯更大量的抗體(圖14:泳道6)。通過實(shí)施例8和實(shí)施例21 (3)所述的方法，測量在培養(yǎng)液中生產(chǎn)的 抗體的量。使用在動(dòng)物細(xì)胞(CHO)中生產(chǎn)的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。結(jié)果如 圖3和圖15所示。發(fā)現(xiàn)含有插入滅活的PMT2基因且含有導(dǎo)入其中的 HAC1基因的0. minuta YY3P2omH菌林會分泌比對照菌抹即〇.minuta YY3ZomH菌抹(其中僅導(dǎo)入HAC1基因的菌抹)、0. minuta YY2P2菌抹 (含有插入滅活的PMT2基因的菌株)和0. minuta YY3ZHy菌抹(其中導(dǎo) 入載體的對照菌林)明顯更大量的抗體聚集體(圖13: 0. minuta YY3P2omH菌抹)。也發(fā)現(xiàn)，含有插入滅活的PMT4基因且含有導(dǎo)入其 中的HAC1基因的0. minuta YY3P4omH菌抹會分泌比對照菌抹即0. minuta YY3ZomH菌林(其中僅導(dǎo)入HAC1基因的菌抹)、O. minuta YY2P4菌抹(含有插入滅活的PMT4基因的菌抹)和O. minuta YY3ZHy 菌抹(其中導(dǎo)入載體的對照菌抹)明顯更大量的抗體(圖15: . minuta YY3P4omH菌抹)。[實(shí)施例26]使用PMT抑制劑(lc)，由含有插入滅活的PMT基因 且含有導(dǎo)入其中的HAC1基因的0. minuta菌抹生產(chǎn)抗體將一鉑環(huán)量的在實(shí)施例25 (l)中制備的含有插入滅活的PMT基因且 含有導(dǎo)入其中的HAC1基因的產(chǎn)抗體菌林接種進(jìn)5 ml B2YP4G培養(yǎng)基， 在27。C培養(yǎng)1天，然后用B2YP4G培養(yǎng)基稀釋，調(diào)節(jié)OD600 = 10。向 產(chǎn)物加入在實(shí)施例9所述的PMT抑制劑(lc:母液濃度0.1 mM, 0.5 mM, 2.5mM,和10 mM),分別至0.016 ^M, 0.08 |nM, 0.4 iiM,和2.0 pM的 濃度。在27。C培養(yǎng)另外3天，每隔24小時(shí)測定OD600, OD600值每增 加1,分別加入量為0.00032 0.0016 jiM, 0.008 ^M,和0.04 pM的PMT 抑制劑(lc)。從培養(yǎng)液制備培養(yǎng)上清液，通過實(shí)施例18 (2)所述的方法， 進(jìn)行蛋白印跡分析。結(jié)果如圖17所示。此外，通過實(shí)施例2(3)所述的 方法，對分泌抗體的生產(chǎn)力定量。結(jié)果如圖18所示。當(dāng)隨著OD600值 增加1而加入約0.008 fxM PMT抑制劑(母液濃度2.5 mM)時(shí)，達(dá)到O. mmuta YY3P2omH菌抹(含有插入天活的PMT2基因的菌林且含有導(dǎo)入 其中的HAC1基因)的最高抗體生產(chǎn)力。當(dāng)隨著OD600值增加1而加入 約0.04 pM PMT抑制劑(母液濃度10 mM)時(shí)，達(dá)到O. minuta YY3P4omH菌抹(含有插入滅活的PMT4基因且含有導(dǎo)入其中的HAC1基因的菌抹)的最高抗體生產(chǎn)力?？梢酝普摚琍MT基因表達(dá)的抑制和 PMT抑制劑的聯(lián)合使用，會強(qiáng)烈抑制糖鏈添加。對于其中已經(jīng)導(dǎo)入HAC1 的菌林，為了抑制糖鏈添加，通過PMT基因表達(dá)的抑制和PMT抑制劑 的聯(lián)合使用來抑制PMT蛋白活性，可以預(yù)見到更高的聚集抗體的生產(chǎn) 力。[實(shí)施例27] PMT抑制劑(5a)的評價(jià)將一柏環(huán)量的已經(jīng)導(dǎo)入抗體基因的O. minuta YY1菌抹接種進(jìn)5 ml B2YP4G培養(yǎng)基，在27。C培養(yǎng)1天，然后用B2YP4G培養(yǎng)基稀釋，調(diào)節(jié) OD600 = 10。向其中加入不同于實(shí)施例9所述的PMT抑制劑(lc)的 PMT抑制劑({(兄)-4-氧代-5-[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)亞芐 基]-2-硫代-1，3-漆唑烷-3-基}乙酸(在Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol.4， p. 3975, 2004中所述的化合物5a),達(dá)到1 的濃度。 在27。C培養(yǎng)另外3天，每隔24小時(shí)測定OD600, OD600值每增加1， 加入量為0.02 的PMT抑制劑。從培養(yǎng)液制備培養(yǎng)上清液，通過實(shí) 施例18(2)所述的方法進(jìn)行蛋白印跡分析，通過實(shí)施例21 (3)所述的方法 對分泌抗體的生產(chǎn)力定量。結(jié)果如圖19和圖20所示。通過加入新檢查 的PMT抑制劑(5a)，認(rèn)為抗體聚集體的生產(chǎn)力傾向于增加。從而，認(rèn) 為PMT抑制劑(5a)具有與實(shí)施例9所迷的PMT抑制劑(lc)等效的作 用。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在酵母中高水平分泌生產(chǎn)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的蛋白，例如 抗體，以及普通蛋白。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含激活的HAC1基因和RRBP1基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含以下激活的HAC1 基因(l)和RRBP1基因(2):()選自下面(a)至(d)的激活的HAC1基因(a) 編碼由SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列組成的蛋白的基因；(b) 編碼由與SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少 70%同源性的氨基酸序列組成、且具有激活解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)的功 能的蛋白的基因；(c) 編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從 SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有激活 UPR的功能的蛋白的基因;和(d) 在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO: 22所示核苷酸序列或 其互補(bǔ)核苷酸序列組成的DNA雜交、且編碼具有激活UPR的功能的蛋 白的基因，和(2)選自下面(e)至(h)的RRBPl基因(e) 編碼人或狗來源的RRBPl的基因；(f) 編碼由與人或狗來源的RRBPl的氨基酸序列具有至少 70%同源性的氨基酸序列組成、且具有核糖體結(jié)合活性的蛋白的基因；(g) 編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從 人或狗來源的RRBPl的氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有核 糖體結(jié)合活性的蛋白的基因；和(h) 在嚴(yán)格條件下與由人或狗來源的RRBPl基因的核苷 酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列組成的基因雜交、且編碼具有核糖體結(jié)合活 性的蛋白的基因。 '
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其包含以下激活的HAC1基因(l) 和RRBPl基因(2):(1)選自下面(i)至(l)的激活的HAC1基因 (i)編碼啤酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HAC1蛋 白的基因；Cj)編碼由與啤酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HAC1蛋白的氨基酸序列具有至少70%同源性的氨基酸序列組成、且具有激活 UPR的功能的蛋白的基因；(k)編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從啤酒 糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HAC1蛋白的氨基酸序列衍生的 氨基酸序列組成、且具有激活UPR的功能的蛋白的基因；和(1) 在嚴(yán)格條件下與由編碼哞酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉 的激活的HAC1蛋白的基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列組成的基 因雜交、且編碼具有激活UPR的功能的蛋白的基因；和(2) 選自下面(e)至(h)的RRBP1基因(e) 編碼人或狗來源的RRBP1的基因；(f) 編碼由與人或狗來源的RRBP1的氨基酸序列具有至少 70%同源性的氨基酸序列組成、且具有核糖體結(jié)合活性的蛋白的基因；(g) 編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從 人或狗來源的RRBP1的氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有核 糖體結(jié)合活性的蛋白的基因;和(h) 在嚴(yán)格條件下與由人或狗來源的RRBP1基因的核苷 酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列組成的基因雜交、且編碼具有核糖體結(jié)合活 性的蛋白的基因。
4. 根椐權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì) 胞是真核細(xì)胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是酵母。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述酵母是甲醇同化酵母。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述甲醇同化酵母是 Ogataea minuta。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述酵母是啤酒糖酵母。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含導(dǎo)入其中 的編碼外源蛋白的基因。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述外源蛋白是多聚 體蛋白。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述多聚體蛋白是異多聚體。
12. 根椐權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述異多聚體是抗體 或其功能片段。
13. —種生產(chǎn)蛋白的方法，其包含，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求 9-12中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和從培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行把蛋白取樣。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中在抑制蛋白O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶 (PMT)活性的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中通過向培養(yǎng)基中添加蛋白O-甘 露糖基轉(zhuǎn)移酶(PMT)活性的抑制劑，抑制PMT活性。
16. 編碼甲醇同化酵母的激活的HAC1蛋白的基因。
17. 選自下面(a)至(d)的基因(a) 編碼由SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列組成的蛋白的基因；(b) 編碼由與SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少70% 同源性的氨基酸序列組成、且具有激活解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)的功能的 蛋白的基因；(c) 編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從SEQ ID NO: 23所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有激活UPR的 功能的蛋白的基因，和(d) 在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO: 22所示核苷酸序列或其互 補(bǔ)核苷酸序列組成的DNA雜交、且編碼具有激活UPR的功能的蛋白的 基因。
18. 包含根據(jù)權(quán)利要求n的基因的表達(dá)載體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的表達(dá)載體，它是pOMexPGHy/Hacl。
20. 包含激活的HACl基因和RRBP1基因的表達(dá)載體。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20的表達(dá)栽體，其中所述激活的HACl基因是根 據(jù)權(quán)利要求17的基因。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20的表達(dá)載體，其中所述激活的HACl基因是編 碼啤酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HACl蛋白的基因或其同 源基因。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20的栽體，它是YEp351GAP-II-aHACl/pl80。
24. 根據(jù)權(quán)利要求20的表達(dá)栽體，其中所述RRBP1基因是人或狗來源的RRBP1基因或其同源基因。
25. —種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)導(dǎo)入了根據(jù)權(quán)利要求18-24中 的任一項(xiàng)的表達(dá)栽體。
26. —種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)導(dǎo)入了包含激活的HAC1基因 的表達(dá)載體和包含RRBP1基因的表達(dá)栽體。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述包含激活的 HAC1基因的表達(dá)載體是根據(jù)權(quán)利要求18或19的表達(dá)載體。
28. 根據(jù)權(quán)利要求26的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述激活的HACl 基因是編碼啤酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HACl蛋白的基 因或其同源基因。
29. 根據(jù)權(quán)利要求26的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述RRBP1基因是人或狗 來源的RRBP1基因或其同源基因。
30. —種生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的方法，其包含下述步驟(A) 向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入激活的HACl基因；和(B) 向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入RRBP1基因。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述激活的HACl基因是下述基 因中的任一個(gè)(1) 根據(jù)權(quán)利要求17的基因；(2) 編碼啤酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HACl蛋 白的基因；(3) 編碼由與啤酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的H A C1 蛋白的氨基酸序列具有至少70%同源性的氨基酸序列組成、且具有激活 UPR的功能的蛋白的基因；(4) 編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從啤酒 糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉的激活的HACl蛋白的氨基酸序列衍生的 氨基酸序列組成、且具有激活UPR的功能的蛋白的基因；和(5) 在嚴(yán)格條件下與由編碼啤酒糖酵母、里氏木霉或構(gòu)巢曲霉 的激活的HAC1蛋白的基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列組成的基 因雜交、且編碼具有激活UPR的功能的蛋白的基因。
32. 根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述RRBP1基因是下迷基因中 的任一個(gè)(1)編碼人或狗來源的RRBP1的基因；(2) 編碼由與人或狗來源的RRBP1的氨基酸序列具有至少 70%同源性的氨基酸序列組成、且具有核糖體結(jié)合活性的蛋白的基因；(3) 編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸從人或 狗來源的RRBP1的氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有核糖體 結(jié)合活性的蛋白的基因;和(4) 在嚴(yán)格條件下與由人或狗來源的RRBP1基因的核苦酸序 列或其互補(bǔ)核苷酸序列組成的基因雜交、且編碼具有核糖體結(jié)合活性的 蛋白的基因。
33. 根據(jù)權(quán)利要求30-32中的任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是 真核細(xì)胞。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述真核細(xì)胞是酵母。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所迷酵母是曱醇同化酵母。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述甲醇同化酵母是Ogataea minu化。
37. 根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述酵母是啤酒糖酵母。
38. 選自下面(a)至(d)的基因(a) 編碼由SEQIDNO:70所示氨基酸序列組成的蛋白的基因；(b) 編碼由與SEQ ID NO: 70所示氨基酸序列具有至少70%同 源性的氨基酸序列組成、且具有激活解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)的功能的蛋 白的基因；(c) 編碼由通過缺失、置換和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸/人SEQ ID NO: 70所示氨基酸序列衍生的氨基酸序列組成、且具有激活UPR的 功能的蛋白的基因;和(d) 在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO: 69所示核苷酸序列或其互 補(bǔ)核苷酸序列組成的DNA雜交、且編碼具有激活UPR的功能的蛋白的 基因。
39. 包含根據(jù)權(quán)利要求38的基因的表達(dá)載體。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39的表達(dá)載體，它是pOMexPGHy/PpHacl。
41. 一種生產(chǎn)蛋白的方法，其包含，在抑制O-糖鏈合成的條件下， 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)已經(jīng)導(dǎo)入激活的HAC1基因和/或RRBP1基因和編碼外 源蛋白的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，和從培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行靶蛋白取樣。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41的生產(chǎn)蛋白的方法，其中通過插入滅活PMT基因來抑制o-糖鏈合成。
43. 根據(jù)權(quán)利要求41的生產(chǎn)蛋白的方法，其中通過向培養(yǎng)基中添加 PMT活性的抑制劑來抑制O-糖鏈合成。
44. 根據(jù)權(quán)利要求41的生產(chǎn)蛋白的方法，其中通過插入滅活PMT 基因和向培養(yǎng)基中添加PMT活性的抑制劑來抑制O-糖鏈合成。
45. 根據(jù)權(quán)利要求43或44的生產(chǎn)蛋白的方法，其中所述PMT活性 的抑制劑是5-[[3，4-( 1-苯基甲氧基)苯基]亞曱基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷 乙酸或((5Z)-4-氧代-5-3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)亞千基]-2-硫 代-1,3-噻唑烷-3-基}乙酸。
46. —種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其具有插入滅活的PMT基因和導(dǎo)入其中 的激活的HAC1基因。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是Ogataea minuta。
全文摘要
本發(fā)明提供了在宿主細(xì)胞例如酵母中高分泌生產(chǎn)蛋白、尤其具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的蛋白例如抗體的方法。根據(jù)本發(fā)明，提供了具有激活的HAC1基因和RRBP1基因的轉(zhuǎn)化的酵母，和外源蛋白的高分泌生產(chǎn)方法，其中使用轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，并且提供了對宿主細(xì)胞如酵母特異的O-型糖鏈。
文檔編號C12N1/19GK101605887SQ20078002686
公開日2009年12月16日 申請日期2007年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月16日
發(fā)明者千葉靖典, 地神芳文, 小林和男, 市川公久, 野中浩一, 鈴木健之, 黑田康介 申請人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社;第一三共株式會社