專(zhuān)利名稱(chēng)：在生物介質(zhì)中測(cè)定酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于診斷學(xué)領(lǐng)域，并具體涉及在血液和其它流體中測(cè)定蛋 白水解酶例如凝血酶的生物學(xué)活性形式的新方法，以及執(zhí)行該方法的 測(cè)試試劑盒。
背景技術(shù)：
生物化學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、診斷學(xué)等領(lǐng)域的許多實(shí)驗(yàn)室都對(duì)測(cè)定生 物介質(zhì)中產(chǎn)生的酶感興趣。為此，通常使用釋放發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)的信
號(hào)底物，因此在轉(zhuǎn)化后將產(chǎn)生可以即時(shí)(in time)跟蹤和測(cè)量的產(chǎn)色或 熒光信號(hào)。
在生物介質(zhì)中即時(shí)跟蹤酶的形成的方便方法是將底物直接加入到 生物介質(zhì)中，例如將熒光底物加入到其中形成了凝血酶的凝固血漿中。 其優(yōu)點(diǎn)是酶的生成在其生理介質(zhì)中被測(cè)定。
該方法的缺點(diǎn)是，酶對(duì)于任何也可存在于該介質(zhì)中的生理底物的 活性將與加入的信號(hào)底物發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，并且在酶的生成完成之前，底物 可能完全消耗了。為了最小化這些影響，通常選擇那些與酶的結(jié)合不
是太緊密(即Km低)并且轉(zhuǎn)化不是太快(即keat低)的底物。
另一個(gè)問(wèn)題是被測(cè)量的信號(hào)通常依賴(lài)于發(fā)生反應(yīng)的介質(zhì)的濁度和 顏色。因此，來(lái)自不同來(lái)源或供體的介質(zhì)中同樣的酶量可能產(chǎn)生不同 的信號(hào)量。此外，發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)的濃度可能不與信號(hào)的量直接成比 例。這使得在反應(yīng)的時(shí)程期間計(jì)算存在的酶的量更加困難。為了即時(shí) 精確定量酶濃度，所有這些影響都必須納入考慮。WO 03/093831公開(kāi)了在血液或血漿樣品中實(shí)時(shí)測(cè)定樣品中的蛋 白水解活性、特別是凝血酶活性在樣品出現(xiàn)并消失的過(guò)程的方法，該 方法包括在樣品中加入凝血酶底物，在每單位時(shí)間產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)， 信號(hào)的量與凝血酶的存在量具有相關(guān)性。同時(shí)，在沒(méi)有觸發(fā)凝血酶生 成的同樣血液或血槳的對(duì)照樣品中，測(cè)定了具有恒定凝血酶活性的標(biāo) 準(zhǔn)制備物的活性。通過(guò)將在凝固的血液中測(cè)量到的活性與同時(shí)測(cè)量的 校正物獲得的校正曲線(xiàn)進(jìn)行比較，獲得了在任何時(shí)候存在的凝血酶的 準(zhǔn)確摩爾量。該專(zhuān)利還公開(kāi)了如果介質(zhì)的顏色對(duì)信號(hào)有影響，那么該 校正曲線(xiàn)最好在使用的每種顏色的介質(zhì)中測(cè)定。
在不同顏色或濁度的另一種介質(zhì)中測(cè)量同樣量的校正的酶的方法 將產(chǎn)生非常相似的校正曲線(xiàn)，除了所謂的介質(zhì)依賴(lài)性效應(yīng)之外。
本發(fā)明提供了可選的方法，其中該校正曲線(xiàn)在一種介質(zhì)中僅測(cè)量 一次，在不同顏色或濁度的相似介質(zhì)中的測(cè)定不再通過(guò)測(cè)量全部曲線(xiàn) 來(lái)進(jìn)行，而是可以用"單點(diǎn)"測(cè)定來(lái)代替。
發(fā)明簡(jiǎn)述
根據(jù)本發(fā)明，提供了在凝固的血漿中測(cè)定即時(shí)的凝血酶過(guò)程的方 法，包括下列步驟
a) 將信號(hào)底物加入到含有預(yù)定量凝血酶活性的反應(yīng)混合物中，所 述信號(hào)底物在與所述凝血酶活性反應(yīng)后，產(chǎn)生了與形成的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物相 關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)；
b) 通過(guò)數(shù)學(xué)方法確定步驟a)中的即時(shí)信號(hào)曲線(xiàn)特征，以便計(jì)算 曲線(xiàn)的起始斜率，并對(duì)其曲率進(jìn)行估算；
c) 在其中出現(xiàn)凝血酶生成的血漿中加入信號(hào)底物，所述信號(hào)底物 在與凝血酶反應(yīng)后產(chǎn)生與形成的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物相關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)；
d) 向同樣的樣品或與其中出現(xiàn)凝血酶生成的相同血漿的另一個(gè) 樣品中加入熒光化合物，提供了可檢測(cè)的信號(hào)，用作血漿引起的濁度 和/或顏色對(duì)信號(hào)的影響的度量；e) 將步驟d)中的測(cè)量結(jié)果與步驟a)中的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行比較，以建 立一種關(guān)系，用于校正其中出現(xiàn)凝血酶生成的血漿的濁度和顏色；以 及
f) 使用在步驟b)中測(cè)定的l)的測(cè)量結(jié)果曲率來(lái)校正測(cè)量信號(hào)的系 統(tǒng)的非線(xiàn)性，并使用從步驟b)得到的起始斜率從步驟c)中測(cè)量的信號(hào) 來(lái)計(jì)算即時(shí)的凝血酶的濃度。
本發(fā)明還提供了用于執(zhí)行權(quán)利要求1的方法的試劑盒，其包括下 面的成分
-已知濃度的被測(cè)酶或與被測(cè)酶對(duì)信號(hào)底物的酶活性類(lèi)似的化合物。
-啟動(dòng)酶生成的觸發(fā)試劑。
-促進(jìn)測(cè)試的診斷值的添加物。
-能夠用于標(biāo)準(zhǔn)化和/或?qū)φ盏难獫{。
-試劑，含有信號(hào)底物或待添加產(chǎn)生信號(hào)的離去基團(tuán)的信號(hào)底物。 -可直接加載到計(jì)算機(jī)的內(nèi)存中的軟件程序，當(dāng)所述程序在計(jì)算機(jī) 中運(yùn)行時(shí)，用于計(jì)算通過(guò)本文公開(kāi)的方法測(cè)定的酶活性。 -指導(dǎo)手冊(cè)。
-校正量的熒光團(tuán)，其在其中出現(xiàn)酶生成的介質(zhì)的內(nèi)部或外部使用。
-熒光源，其可以在其中出現(xiàn)酶生成的介質(zhì)的內(nèi)部或外部使用。
第一個(gè)生物學(xué)樣品通常選自血液、血漿包括富血小板、貧血小板 或無(wú)血小板的血漿、唾液、血清、尿液、腦脊液、精液和糞便。
當(dāng)對(duì)血液樣品執(zhí)行本發(fā)明的方法時(shí)，血液通常被收集在含有檸檬 酸鈉或EDTA等的試管中，以便結(jié)合血液中游離的鈣離子被，阻止凝 血酶形成和凝血。因此，為了啟動(dòng)凝血酶生成，應(yīng)該在開(kāi)始測(cè)量前不 久加入鈣。但是，在血液沒(méi)有被收集在檸檬酸鈉等中的情況下，添加 鈣可能不是必需的。例如，當(dāng)使用該方法時(shí)的途徑可以在取得血液后幾分鐘內(nèi)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。
待測(cè)的蛋白水解活性通常選自活化的凝血因子活性包括凝血酶、 活化的纖溶因子活性、以及補(bǔ)體系統(tǒng)活化成分的活性。優(yōu)選的實(shí)施方 案是按照本發(fā)明的方法，從血液或血漿樣品實(shí)時(shí)測(cè)定凝血酶的活性過(guò) 程。
在本方法中使用的信號(hào)底物優(yōu)選選自含有離去基團(tuán)的化合物，所 述離去基團(tuán)在被形成的蛋白水解酶反應(yīng)后給出可檢測(cè)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。該
轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通常通過(guò)分光術(shù)、特別是熒光(優(yōu)選)、光密度以及NMR來(lái) 測(cè)定。因此，所述離去基團(tuán)通常是熒光基團(tuán)、發(fā)色基團(tuán)、釋放氫離子 的基團(tuán)等。用于執(zhí)行本發(fā)明方法的適合和優(yōu)選的信號(hào)底物是 Z-Gly-Gly-Arg-AMC。此外，適合的可檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物包括對(duì)-硝基苯胺 和7-氨基-4-甲基-香豆素。
用于執(zhí)行上述本發(fā)明方法的具有熟知的穩(wěn)定蛋白水解活性的適合 工具包括012-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物(優(yōu)選)、葡萄球菌凝固酶-凝血 酶原復(fù)合物以及，凝血酶。此外，任何其二級(jí)識(shí)別位點(diǎn)被修飾、使得 其活性中心保留完整、但與反應(yīng)混合物中的蛋白的功能性相互作用被 廢止的蛋白水解酶，都可以使用。
執(zhí)行本方法的有用的蛋白酶激活劑包括鈣離子、磷脂、組織因子、 可溶性組織因子、促凝血酶原激酶、高嶺土和鞣花酸(elagicacid)。
按照本發(fā)明的另一方面，所述第一個(gè)生物學(xué)樣品還含有要測(cè)定其 對(duì)研究中的蛋白水解系統(tǒng)、例如止血-凝血系統(tǒng)的影響的藥劑?？梢栽?本方法中測(cè)試的適合的藥劑是抗血栓劑例如抗血小板劑和抗凝血?jiǎng)?例如肝素、硫酸皮膚素，直接凝血酶抑制劑例如水蛭素、阿加曲班 (argatroban)或美拉加群(melagatran)，以及因子X(jué)a抑制劑例如厚 抗凝蛋白 (thick anticoagulant protein )。
7本發(fā)明的這些以及其它的目的將在下面更詳細(xì)地解釋。 附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示了含有凝血酶和信號(hào)底物的反應(yīng)混合物的即時(shí)信號(hào)。
圖2顯示了緩沖液和血漿中熒光團(tuán)(氨基甲基香豆素，AMC)的 濃度范圍。由于內(nèi)濾效應(yīng)(IFE),曲線(xiàn)彎曲。還可以看出，對(duì)于兩種 不同的介質(zhì)來(lái)說(shuō)，在相等的熒光團(tuán)濃度下信號(hào)的量有顯著不同。
圖3顯示了 a)校正曲線(xiàn)(彎曲的線(xiàn)，黑色)，b)已經(jīng)校正了 IFE 的相同曲線(xiàn)(虛線(xiàn))，以及c)已經(jīng)校正了 IFE并然后也校正了底物消 耗的相同曲線(xiàn)(直線(xiàn))。原始的曲線(xiàn)按照左手軸(left-hand axis)的數(shù) 值(熒光單位FU)作圖。虛線(xiàn)從圖2中顯示的熒光和AMC濃度之間 的關(guān)系計(jì)算。
圖4顯示了不同血漿中同樣濃度的凝血酶活性測(cè)量的圖。 圖5顯示了曲線(xiàn)的起始斜率和它們的終水平之間的關(guān)系。 圖6顯示了不同供體血漿的光密度與在同樣血漿中測(cè)量到的校正
曲線(xiàn)的終水平之間的關(guān)系。
圖7顯示了可能的設(shè)置圖，其中單點(diǎn)測(cè)量從放置在微孔板下方的
熒光源測(cè)定。
圖8A顯示了血漿中凝血酶生成測(cè)量的未校正和校正的熒光值。 圖8B顯示了緩沖液中凝血酶的測(cè)量，虛線(xiàn)顯示了針對(duì)IFE和底物
消耗的信號(hào)校正。
圖9顯示了在對(duì)2M-IIa的酰胺水解活性進(jìn)行校正之前(細(xì)線(xiàn))和
之后(粗線(xiàn))，按照本發(fā)明計(jì)算的凝血酶的即時(shí)值。
定義
本文中使用的術(shù)語(yǔ)"瞬時(shí)活性"，就血液或血漿樣品中出現(xiàn)的蛋 白水解酶來(lái)說(shuō)，是指一旦用本技術(shù)領(lǐng)域己知的方法起始生理過(guò)程后， 酶的活性首先升高然后又減退到結(jié)束時(shí)(接近)零活性的事實(shí)。
8本文中使用的術(shù)語(yǔ)"生物介質(zhì)"，在情況許可時(shí)也被稱(chēng)為"介質(zhì)"， 是指血漿、帶有血細(xì)胞的血漿或全血、或任何其它的身體來(lái)源或其他 來(lái)源的流體，其中發(fā)生酶的活化和失活的生物學(xué)過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)"單點(diǎn)測(cè)量"(SPM)是指在短時(shí)期的過(guò)程中測(cè)量信號(hào)的技 術(shù)，與跟蹤信號(hào)隨時(shí)間變化的系列測(cè)量相反。SPM可以重復(fù)測(cè)量，然 后進(jìn)行平均，或者可以只測(cè)量一次。
在本文中使用的術(shù)語(yǔ)"信號(hào)底物"意味著被介質(zhì)中存在的蛋白水
解酶裂解的底物，離去基團(tuán)被從中分離出去，這可以通過(guò)光學(xué)、NMR 或其它方法來(lái)檢測(cè)?？梢怨鈱W(xué)檢測(cè)的離去基團(tuán)是，例如，對(duì)硝基苯胺 和7-氨基-4-甲基-香豆素。對(duì)硝基苯胺在405 nm處有吸收，7-氨基-4-甲基-香豆素是發(fā)熒光的(在350 nm處激發(fā)，在460 nm處發(fā)射)。NMR-活性離去基團(tuán)的例子是含有31P、 13C或任何其它可以使用NMR或類(lèi)似 技術(shù)檢測(cè)的原子的離去基團(tuán)。H+離子也可以用作離去基團(tuán)，它可以通 過(guò)測(cè)量pH的變化來(lái)檢測(cè)。測(cè)定電流的底物也可以使用，其酶的濃度被 即時(shí)跟蹤，該酶負(fù)責(zé)加入到反應(yīng)混合物中的底物的變化，這種變化可 以通過(guò)測(cè)量電導(dǎo)來(lái)跟蹤。
發(fā)明詳述
正如本文前面提到的那樣，現(xiàn)有的在生物介質(zhì)的樣品中測(cè)定酶形 成的方法是將對(duì)該酶特異性的信號(hào)底物加入到介質(zhì)中，并按時(shí)跟蹤信 號(hào)。該信號(hào)不僅依賴(lài)于酶的變化濃度，而且依賴(lài)于各種介質(zhì)依賴(lài)性和 介質(zhì)非依賴(lài)性的參數(shù)。介質(zhì)依賴(lài)性參數(shù)包括所述介質(zhì)的濁度和吸收光 譜(例如顏色)。介質(zhì)非依賴(lài)性參數(shù)包括酶濃度、底物濃度、信號(hào)底 物對(duì)酶的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)(例如Km和keat)、測(cè)量技術(shù)、在測(cè)量過(guò)程中 存放介質(zhì)的材料、使用的體積等。
WO 03/093831公開(kāi)了為了校正這些影響，在介質(zhì)中加入校正量的 酶。然后加入的信號(hào)底物將產(chǎn)生信號(hào)，從中可以看出介質(zhì)依賴(lài)性以及介質(zhì)不依賴(lài)性的影響。然后使用該測(cè)量結(jié)果來(lái)計(jì)算生物介質(zhì)的(另一 個(gè)樣品)中形成的未知量的酶。也就是說(shuō)，該曲線(xiàn)被用作"校正曲線(xiàn)"， 它含有將信號(hào)翻譯成在同樣介質(zhì)的另一個(gè)樣品的生物反應(yīng)過(guò)程中形成 的即時(shí)酶濃度所需要的所有信息。在該設(shè)置中，校正曲線(xiàn)必需在與發(fā) 生酶形成的介質(zhì)具有同樣顏色和濁度的介質(zhì)中測(cè)量。這是校正對(duì)信號(hào) 的介質(zhì)依賴(lài)性影響的最佳方法。
本發(fā)明提供了可靠、快速和方便的方法，在信號(hào)底物的存在下， 即時(shí)測(cè)定生物學(xué)介質(zhì)中酶濃度的變化，其中對(duì)底物的消耗、信號(hào)的顏 色依賴(lài)性以及發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)的濃度與信號(hào)量之間的非線(xiàn)性關(guān)系進(jìn)行 了適當(dāng)?shù)男Ｕ?。被測(cè)量的信號(hào)將對(duì)兩種影響進(jìn)行校正， 一種影響對(duì)于 每個(gè)樣品來(lái)說(shuō)是不同的(依賴(lài)樣品的變化性)，另一種影響對(duì)于在相 似條件下測(cè)量的所有樣品來(lái)說(shuō)是相同的。這樣的變化性包括底物消耗 的影響、內(nèi)濾效應(yīng)、儀器特異性影響、實(shí)驗(yàn)計(jì)劃依賴(lài)性影響等。本發(fā) 明的關(guān)鍵是測(cè)量與依賴(lài)樣品的變化性分開(kāi)的不依賴(lài)樣品的變化性。然 后可以以更方便和更容易的方式測(cè)量依賴(lài)樣品的變化性。
該單點(diǎn)測(cè)量由某些其信號(hào)通過(guò)介質(zhì)傳播、以便使信號(hào)的量是介質(zhì) 的顏色和/或濁度的度量的信號(hào)產(chǎn)生源的測(cè)量構(gòu)成。方法主要包括在適 合的介質(zhì)例如緩沖液中測(cè)定校正曲線(xiàn)，以確定被測(cè)量的曲線(xiàn)的特征。 這些特征描述了不依賴(lài)樣品的變化性，然后將允許在出現(xiàn)酶生成的介 質(zhì)的樣品中，通過(guò)基于依賴(lài)樣品的變化性的單點(diǎn)測(cè)量的數(shù)學(xué)方法，再 次獲得該完整曲線(xiàn)或足夠部分的曲線(xiàn)。其的大優(yōu)點(diǎn)是不需要在每個(gè)個(gè) 體的介質(zhì)樣品中測(cè)量整個(gè)校正曲線(xiàn)，而是進(jìn)行單點(diǎn)測(cè)量就已足夠。單 點(diǎn)測(cè)量將是由介質(zhì)本身所引起的信號(hào)的變化性的測(cè)量。它可以包括在 生物介質(zhì)中測(cè)量固定濃度的熒光團(tuán)，其結(jié)果是血漿顏色中供體與供體 之間差異的度量。
在凝血過(guò)程中，凝血酶在血漿中出現(xiàn)和消失。當(dāng)將適合的熒光底 物加入到該反應(yīng)中時(shí)，可以即時(shí)跟蹤熒光，并且從該熒光可以計(jì)算出凝血酶的濃度。但是，被測(cè)量的信號(hào)受到系統(tǒng)的非線(xiàn)性的困擾，這是 由于底物消耗以及產(chǎn)生的熒光團(tuán)的量與熒光的量之間的非線(xiàn)性關(guān)系導(dǎo)
致的。這顯示在圖1中，其中在熒光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC的存在
下，在熒光計(jì)中測(cè)量緩沖液中固定量的凝血酶，該圖清楚地顯示出了 彎曲的曲線(xiàn)。通常這樣的曲線(xiàn)具有三個(gè)特征其起始斜率(l)，其終止 水平(2)及其曲率(3)。
起始斜率(l)
起始斜率特別依賴(lài)于被跟蹤反應(yīng)的介質(zhì)的的顏色、以及底物濃度 和凝血酶濃度。根據(jù)定義，起始斜率不受底物消耗和內(nèi)濾效應(yīng)的影響， 因?yàn)樵诹銜r(shí)沒(méi)有消耗底物，并且沒(méi)有形成熒光團(tuán)。因此，起始斜率給 出了每分鐘的熒光單位(FU)與酶的濃度之間的轉(zhuǎn)化FU/min x C =[凝 血酶]。當(dāng)信號(hào)被校正使得在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中C保持固定值時(shí)，該C只 能夠用于在出現(xiàn)凝血酶生成的樣品中計(jì)算即時(shí)的凝血酶。
終止水平(2)
當(dāng)達(dá)到平臺(tái)時(shí)，則底物被完全消耗和/或系統(tǒng)達(dá)到了其熒光限度， 即更多的熒光團(tuán)也不能產(chǎn)生更多的熒光。
因此，測(cè)量到的終止水平的熒光量依賴(lài)于熒光團(tuán)的濃度和系統(tǒng)的 限度。該終止水平也依賴(lài)于在其中測(cè)量熒光的介質(zhì)的顏色。
曲率(3)
曲率依賴(lài)于熒光團(tuán)的量與熒光信號(hào)的量之間的非線(xiàn)性以及底物的 消耗。熒光團(tuán)濃度與被測(cè)量的熒光量之間的關(guān)系通常是非線(xiàn)性的，這 是由于增加熒光團(tuán)濃度給出相對(duì)較少的熒光(內(nèi)濾效應(yīng))這個(gè)事實(shí)引 起的。第二種效應(yīng)是底物的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致了底物濃度的降低(參見(jiàn)圖2和3)。 當(dāng)這些底物濃度低于或接近底物的Km時(shí)，凝血酶轉(zhuǎn)化底物的速度就
將隨著底物的降低而下降。根據(jù)所選的底物、被測(cè)量的酶和測(cè)量系統(tǒng)， 曲率可以很強(qiáng)或沒(méi)有。圖4顯示了同樣濃度的凝血酶活性的測(cè)量例子(源自于不同供體
的血漿中測(cè)量的a2-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物(a2M-IIa))。從該圖中 可以明顯看出l)在這些不同血漿中相同的酶活性顯示出了大的差別， 以及2)所有的曲線(xiàn)都彎向平臺(tái)。這些曲線(xiàn)包含校正供體與供體之間血 漿顏色差異以及系統(tǒng)的非線(xiàn)性所必需的所有信息。圖4的曲線(xiàn)可以按 照下式進(jìn)行數(shù)學(xué)擬合
FU(t) = FU(O) + MAX*(1 - EXP(時(shí)間承K))，
其中
FU(t)是即時(shí)的熒光， FU(O)是起始熒光值， MAX是終止水平，以及 K描述曲率。
盡管該對(duì)數(shù)式通常能夠給出良好的近似擬合，但也可以使用可替 代的數(shù)學(xué)式，例如多項(xiàng)式函數(shù)、雙曲線(xiàn)或這些的組合、或其它可選公 式。所使用的公式不是關(guān)鍵的，它只需要能夠描述曲線(xiàn)，以便可以對(duì) 曲率和所使用的介質(zhì)顏色差異進(jìn)行校正。
圖5令人吃驚地顯示了每個(gè)曲線(xiàn)的起始斜率與其終止水平之間的 出色相關(guān)性。 一旦這種相關(guān)性建立起來(lái)，僅僅從終止水平值就可以計(jì) 算出起始斜率。由參數(shù)K描述的曲率，對(duì)于所有曲線(xiàn)來(lái)說(shuō)是相同的， 并且不受介質(zhì)顏色的影響。因此，受到系統(tǒng)的人為因素例如底物消耗 和內(nèi)濾效應(yīng)影響的K，只需要被測(cè)量一次。然后，可以?xún)H僅通過(guò)測(cè)量 終止水平來(lái)生成曲線(xiàn)。該終止水平在所有的底物都被轉(zhuǎn)化為熒光團(tuán)的 情況下測(cè)定。在每個(gè)個(gè)體血漿中加入該量的熒光團(tuán)而不是加入熒光底 物與酶的組合，也將產(chǎn)生同樣量的信號(hào)。這意味著一旦K已知，并且 從只加入熒光團(tuán)的單點(diǎn)測(cè)量得到終止水平，對(duì)于每個(gè)個(gè)體血漿來(lái)說(shuō)就 可以生成整個(gè)曲線(xiàn)，好像在所有這些個(gè)體血漿中測(cè)量了所有這些曲線(xiàn) 一樣。
12一旦K已知并測(cè)量了終止水平，就可以校正從酶生成曲線(xiàn)得到的 信號(hào)底物的轉(zhuǎn)化值。本發(fā)明提出只使用在每個(gè)個(gè)體血漿中測(cè)定的單點(diǎn) 測(cè)量結(jié)果，以便校正介質(zhì)顏色的影響。該單點(diǎn)測(cè)量結(jié)果也可用于校正 曲線(xiàn)的非線(xiàn)性。盡管終點(diǎn)水平測(cè)量結(jié)果可能是校正系統(tǒng)的非線(xiàn)性的最 精確參數(shù)，但曲線(xiàn)中的任何值都可用于描述整個(gè)曲線(xiàn)。例如，如果已 知曲線(xiàn)的信號(hào)值給出了 50%的終點(diǎn)水平，那么適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)公式就能夠 外推和內(nèi)推出剩余的曲線(xiàn)。值與終止水平越接近，擬合將變得越準(zhǔn)確。 在校正曲線(xiàn)沒(méi)有彎向平臺(tái)或系統(tǒng)的非線(xiàn)性被認(rèn)為是不重要的情況下，
單點(diǎn)測(cè)量結(jié)果仍然可僅用于校正顏色。在后一種情況下，不使用參數(shù)K的值。
測(cè)量凝血酶在血漿中的生成是評(píng)估凝血-止血系統(tǒng)功能性的極好
工具。上面提到，WO 03/093831公開(kāi)了在凝固的血漿中測(cè)量凝血酶生 成的方法。該方法現(xiàn)在被廣泛使用，并參與目前實(shí)際實(shí)施的熒光測(cè)定 檢測(cè)中。將血漿分為兩個(gè)樣品，在一個(gè)樣品中觸發(fā)凝血酶生成(TG-樣品)，在另一個(gè)樣品中加入校正量的a2M-IIa活性。這兩個(gè)樣品都接 受同樣量的熒光底物，在熒光計(jì)中跟蹤熒光。由于內(nèi)濾效應(yīng)和底物的 消耗，校正曲線(xiàn)(與圖1類(lèi)似)彎曲。從該校正曲線(xiàn)，可以計(jì)算出在 TG樣品中形成的即時(shí)的凝血酶量
a) "拉直"校正曲線(xiàn)所需的參數(shù)，可以用于校正TG樣品產(chǎn)生的 熒光信號(hào)。參見(jiàn)下圖8A。這種校正的準(zhǔn)確性隨著校正曲線(xiàn)測(cè)量的延長(zhǎng) 而增加，即測(cè)量離曲線(xiàn)的終止水平越近，校正所需的數(shù)學(xué)參數(shù)可以被 估算得越準(zhǔn)確。這意味著測(cè)量曲線(xiàn)需要有最小時(shí)間量，在實(shí)踐中通常 為至少20 分鐘。可以從荷蘭 Thrombinosc叩e BV
(www.thrombinoscope.com)商購(gòu)的軟件為T(mén)G曲線(xiàn)中的每個(gè)熒光量計(jì) 算出熒光的校正值。然后用校正值代替TG樣品中測(cè)定的熒光值。
b) 從校正曲線(xiàn)可以衍生出轉(zhuǎn)化曲線(xiàn)，通過(guò)該曲線(xiàn)，TG樣品中即 時(shí)的熒光的一階導(dǎo)數(shù)FU/min (每分鐘的熒光單位)，可以被放大到達(dá) 到凝血酶的濃度，因?yàn)樵撔Ｕ€(xiàn)是使用已知量的凝血酶活性測(cè)定的。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，a)下的參數(shù)事實(shí)上不依賴(lài)于介質(zhì)的顏色或濁度。但 是因?yàn)樾盘?hào)隨著介質(zhì)的顏色而變化，WO 03/093831中講授了在所公開(kāi) 的方法中，校正曲線(xiàn)應(yīng)該在與出現(xiàn)凝血酶生成的血漿(TG樣品)相同 的血漿(另一個(gè)樣品)中測(cè)定。由于血槳顏色的變化，信號(hào)在供體間 有顯著的差別，因此需要在每種個(gè)體血漿中測(cè)量校正曲線(xiàn)。在b)下提 到的轉(zhuǎn)化因子依賴(lài)于在其中測(cè)量熒光的血漿的顏色。
通過(guò)允許對(duì)血槳顏色和濁度進(jìn)行校正，本發(fā)明為WO 03/09831中
公開(kāi)的凝血酶生成測(cè)試提供了改進(jìn)。
根據(jù)本發(fā)明，只需要在血漿樣品中進(jìn)行一個(gè)測(cè)量就得足夠的信息 以校正樣品中的顏色變化和/或內(nèi)濾效應(yīng)和底物消耗。在使用的熒光計(jì) 中，需要在任何適合的介質(zhì)中測(cè)量一次以建立起校正曲線(xiàn)的特征。一 旦這些變?yōu)橐阎?，?duì)于每種顏色的介質(zhì)只需要進(jìn)行單點(diǎn)測(cè)量。該單點(diǎn) 測(cè)量可以以各種不同的方式進(jìn)行，例如
2. 測(cè)量介質(zhì)的光密度。在適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)下測(cè)量時(shí)，不同血漿之間的 光密度差異與校正曲線(xiàn)的不同終止水平或起始斜率之間具有良好的相 關(guān)性(圖6) 。 OD測(cè)量只花幾秒鐘或更少的時(shí)間，并且一旦這種相關(guān) 性建立起來(lái)之后，就可以進(jìn)行校正。
3. 可以在血漿中加入熒光團(tuán)，被測(cè)量的熒光量將依賴(lài)于血衆(zhòng)的顏 色。熒光的量對(duì)校正曲線(xiàn)的終止水平或起始斜率提供了出色的度量。 當(dāng)熒光團(tuán)的濃度等于底物的量時(shí)，測(cè)量到的值就將等于終止水平。較 低濃度的熒光團(tuán)也將會(huì)是適當(dāng)?shù)?，只要該單點(diǎn)測(cè)量與由于不同介質(zhì)的 顏色引起的熒光變化性之間的相關(guān)性被建立起來(lái)就行。即使在熒光團(tuán) 的濃度為零、即只測(cè)量血漿的熒光時(shí)，測(cè)量值也依賴(lài)于血漿的顏色。 但是，熒光團(tuán)的加入極大地增加了校正的準(zhǔn)確性。將熒光團(tuán)加入到每 個(gè)血漿中的便利方法是將熒光團(tuán)加到熒光底物本身中。例如，如果加 入的熒光團(tuán)濃度等于起始底物濃度的5%底物濃度的話(huà)，那么在零時(shí)， 測(cè)量將顯示出某種程度的熒光抵消。這種抵消將成為信號(hào)受到樣品的顏色和濁度的影響程度的極好的度量，并且可用于校正這些影響。這 將具有極大的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榕c其中出現(xiàn)凝血酶形成的血漿完全相同的樣
品也可用于校正。這將減少進(jìn)行測(cè)試所需的樣品的最小量，并將增加
4.熒光源可以被放置成使得激發(fā)光必須經(jīng)過(guò)樣品才能到達(dá)源，和 /或發(fā)射光必須經(jīng)過(guò)樣品才能到達(dá)檢測(cè)器。例如，裝有血漿的透明比色 杯可以放置得緊挨著裝有熒光團(tuán)的比色杯。當(dāng)發(fā)射光首先經(jīng)過(guò)樣品然 后打到熒光團(tuán)溶液時(shí)，則測(cè)量結(jié)果將與樣品顏色的變化成比例。也可 以使用其它的熒光源代替熒光團(tuán)溶液，例如與產(chǎn)生熒光并要加入血漿、 富含血小板的血漿或全血的適合材料或篩網(wǎng)或凝膠或迷宮或吸附性材 料結(jié)合的干的熒光團(tuán)。 一種使用微量滴定板的可能設(shè)置顯示在圖7中。 在該例子中，熒光源被放置在外部，位于微量滴定孔的下方。
本發(fā)明還提供用于執(zhí)行本文前面公開(kāi)的本發(fā)明方法的試劑盒。這
樣的試劑盒在適合的容器或其它常規(guī)的包裝工具中恰當(dāng)?shù)匕艘环N 或多種下列組分
-已知濃度的被測(cè)量的酶或?qū)τ谛盘?hào)底物具有與被測(cè)量的酶相似 的酶學(xué)活性的化合物。
-起始酶生成的觸發(fā)試劑。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)這樣的觸發(fā)劑被用于測(cè)量 全血、或富含血小板或貧血小板或無(wú)血小板血漿中的凝血酶活性時(shí)， 適合的觸發(fā)劑就是含有一種或多種下列化合物的試劑純化或重組的 組織因子，磷脂囊泡，微粒，凝血因子，膠原蛋白，血小板激活劑， 凝血酶。
-促進(jìn)測(cè)試的診斷值的添加劑。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)這樣的添加劑被用于 測(cè)量全血或富含血小板、貧血小板或無(wú)血小板血漿中的凝血酶活性時(shí)， 適合的添加劑是純化的或合成的(重組)凝血調(diào)節(jié)蛋白、活化的蛋白C、 抗血栓藥、抗血小板藥、純化的或合成的(重組)凝血因子。
-可用于標(biāo)準(zhǔn)化和/或作為對(duì)照的血漿。
-含有信號(hào)底物或添加生成信號(hào)的離去基團(tuán)的信號(hào)底物的試劑。 -可直接加載到計(jì)算機(jī)內(nèi)存中的軟件程序，當(dāng)所述程序在計(jì)算機(jī)中運(yùn)行時(shí)，用于計(jì)算通過(guò)本文公開(kāi)的方法測(cè)定的酶活性。 -指導(dǎo)手冊(cè)。
-校正量的熒光團(tuán)，其在其中出現(xiàn)酶生成的介質(zhì)的內(nèi)部或外部使用。
-可以在出現(xiàn)酶生成的介質(zhì)的內(nèi)部或外部使用的熒光源。這可以 是具有熒光的或已經(jīng)被制成具有熒光的液體、凝膠、吸附性材料、迷 宮或任何形式的材料。
-含有上面提到的化合物或添加劑的任何組合的試劑。 -為了方便執(zhí)行測(cè)量所需的一次性物品例如比色杯、微量滴定板或 其它材料。
-由軟件程序檢測(cè)的保護(hù)器(dongle)，使得在沒(méi)有它的情況下軟 件不能運(yùn)行。這樣的保護(hù)器可以被插入到運(yùn)行軟件的計(jì)算機(jī)的USB接 口上，用作復(fù)制保護(hù)。
試劑盒可以適當(dāng)含有冷凍干燥試劑。
通過(guò)下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，但是這些實(shí)施例 在任何情況下都不能被解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
圖8A顯示了從含有2/3血小板的貧血小板血漿、416nM熒光凝血 酶底物Z-G-G-R-AMC、 4pM促凝血的磷脂囊泡和5 pM重組組織因子 的反應(yīng)混合物測(cè)量到的未校正的熒光信號(hào)。在零時(shí)，通過(guò)在含有檸檬 酸的血漿中加入熒光底物和鈣來(lái)啟動(dòng)反應(yīng)。虛線(xiàn)顯示了該反應(yīng)的校正 信號(hào)，其中對(duì)內(nèi)濾效應(yīng)和底物消耗進(jìn)行了校正。
圖8B顯示了在pH 7,35的Hepes緩沖的鹽水中100納摩爾凝血酶 的測(cè)量。該校正曲線(xiàn)按照公式FU(t) = FU(O) + MAX"l-exp(K"))進(jìn)行
了數(shù)學(xué)擬合。與出現(xiàn)凝血酶生成的相同血清的另一個(gè)樣品中的底物濃 度相等的熒光團(tuán)濃度的單點(diǎn)測(cè)量結(jié)果，被用于使用下列公式校正圖8A
16中的熒光信號(hào)
FUj$E= -SPM*LN[FU(0) + SPM - FU] + SPM*LN(SPM) + FU(O)
其中
SPM是熒光的單點(diǎn)測(cè)量結(jié)果， FU(O)是反應(yīng)零時(shí)的熒光，以及 FU是未校正的熒光值。
使用該公式，校正曲線(xiàn)將變成直線(xiàn)(8B，虛線(xiàn))。該直線(xiàn)大致近 似曲線(xiàn)的起始斜率。圖8A中校正曲線(xiàn)的一階導(dǎo)數(shù)(圖9)需要從每分 鐘的FU轉(zhuǎn)變成即時(shí)的納摩爾凝血酶。為了這個(gè)目的，使用下面的公式 從單點(diǎn)測(cè)量結(jié)果SPM計(jì)算起始斜率起始斜率=-SPM*K，其中K從 圖8B中的測(cè)量結(jié)果計(jì)算。所以，在每種介質(zhì)中，校正熒光信號(hào)的非線(xiàn) 性行為以及對(duì)于熒光增加的速度(FU/分鐘)和凝血酶濃度之間進(jìn)行轉(zhuǎn) 換，只需要進(jìn)行單點(diǎn)測(cè)量。最后，凝血酶生成曲線(xiàn)需要對(duì)不是由凝血 酶引起而是由(x2M-IIa復(fù)合物的酰胺水解活性引起的底物轉(zhuǎn)化的比例 進(jìn)行校正。
在本實(shí)施例中，校正曲線(xiàn)被完全測(cè)量，直到達(dá)到終點(diǎn)水平，這意 味著公式中SPM的值等于終點(diǎn)水平。但是，不是必需完成測(cè)量，數(shù)學(xué) 擬合能夠通過(guò)外推作出合理近似的終點(diǎn)水平。或者，進(jìn)行校正所需的 所有信息可以通過(guò)只測(cè)量校正曲線(xiàn)的起始斜率V(0)來(lái)收集，這只花幾 分鐘就能完成，此外對(duì)等于反應(yīng)混合物中的底物濃度的熒光團(tuán)量進(jìn)行 測(cè)定，該反應(yīng)混合物含有的緩沖液與測(cè)定校正曲線(xiàn)中的相同。該測(cè)定 將產(chǎn)生一個(gè)值FU—max,其立即給出了校正曲線(xiàn)的終點(diǎn)水平下的熒光的 量。上面描述的參數(shù)K等于-V(0)/FU一max。通過(guò)這種方式在幾分鐘內(nèi) 測(cè)定了 K。前面解釋過(guò)，該K不依賴(lài)于介質(zhì)的顏色差異。這里也不需 要測(cè)量與底物濃度精確匹配的熒光團(tuán)的濃度，該濃度與底物的濃度越 接近，就可以對(duì)整個(gè)曲線(xiàn)進(jìn)行越精確的描述。
本發(fā)明提供了方便的測(cè)試方法，以實(shí)時(shí)測(cè)定生物介質(zhì)的樣品中蛋白水解活性的過(guò)程，特別是血液或血漿或富含血小板的血漿中的凝血 酶活性，該方法校正不依賴(lài)介質(zhì)的參數(shù)以及依賴(lài)介質(zhì)的參數(shù)例如介質(zhì) 的濁度和顏色，從而提供了通過(guò)在每個(gè)樣品中進(jìn)行單點(diǎn)測(cè)量并在適當(dāng) 的介質(zhì)例如緩沖液中只測(cè)量一次校正曲線(xiàn)，而在樣品中測(cè)量蛋白水解 活性的可靠、精密和簡(jiǎn)單的方法。
該測(cè)試方法可用于，例如，在體外測(cè)量凝血酶活性的時(shí)間過(guò)程， 即在凝血酶生成后、或當(dāng)其在全血或含有血小板的血漿或不含血小板 的血漿的凝血樣品中產(chǎn)生時(shí)，測(cè)定樣品中的活性凝血酶。它也可以用 于監(jiān)測(cè)患者的狀況，包括檢測(cè)或監(jiān)測(cè)與凝血缺陷有關(guān)的病理狀況。它 還可用于篩選物質(zhì)，包括用于篩選能夠與凝血過(guò)程、特別是凝血酶活 性相互作用的藥物。
本公開(kāi)內(nèi)容在所有方面將被看做是說(shuō)明性的而不是限制性的，本 發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)指明，所有在等效性的意義和范圍內(nèi) 的改變都被認(rèn)為包含在本發(fā)明中。
權(quán)利要求
1. 在凝固的血漿中測(cè)定即時(shí)的凝血酶過(guò)程的方法，其包括下列步驟a)將信號(hào)底物加入到含有預(yù)定量凝血酶活性的反應(yīng)混合物中，所述信號(hào)底物在與所述凝血酶活性反應(yīng)后，產(chǎn)生與所形成的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物相關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)；b)通過(guò)數(shù)學(xué)方法確定步驟a)中的即時(shí)信號(hào)曲線(xiàn)的特征，以便計(jì)算曲線(xiàn)的起始斜率，并對(duì)其曲率進(jìn)行估算；c)在其中出現(xiàn)凝血酶生成的血漿中加入信號(hào)底物，所述信號(hào)底物在與凝血酶反應(yīng)后產(chǎn)生與所形成的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物相關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)；d)向同樣的樣品或其中出現(xiàn)凝血酶生成的相同血漿的另一個(gè)樣品中加入熒光化合物，提供可檢測(cè)的信號(hào)，以供用作血漿引起的濁度和/或顏色對(duì)信號(hào)的影響的度量；e)將步驟d)中的測(cè)量結(jié)果與步驟a)中的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行比較，以建立一種相關(guān)性來(lái)校正其中出現(xiàn)凝血酶生成的血漿的濁度和顏色；以及f)使用在步驟b)中測(cè)定的1)的測(cè)量結(jié)果的曲率，來(lái)校正在其中測(cè)量信號(hào)的系統(tǒng)的非線(xiàn)性，并使用從步驟b)得到的起始斜率，從步驟c)中測(cè)量的信號(hào)來(lái)計(jì)算即時(shí)的凝血酶濃度。
2. 在第一個(gè)生物學(xué)樣品中實(shí)時(shí)測(cè)定蛋白水解活性從樣品中出現(xiàn)并 消失的過(guò)程的方法，所述蛋白水解活性主要是凝血酶活性，所述方法 包括下面的步驟a) 在所述第一個(gè)樣品中加入蛋白酶激活劑以生成蛋白水解活性；b) 在步驟a)中加入信號(hào)底物，所述信號(hào)底物在被生成的蛋白水解 活性反應(yīng)后，產(chǎn)生與形成的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的量相關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)；c) 在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)例如緩沖液中加入對(duì)步驟b)中定義的信號(hào)底物具 有已知的穩(wěn)定的蛋白水解活性的工具，其中所述具有熟知的穩(wěn)定的蛋 白水解活性的工具選自012-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物、葡萄球菌凝固酶-凝血酶原復(fù)合物、，凝血酶和凝血酶；d) 在步驟C)中加入與步驟bj中的定義相同的信號(hào)底物，所述信號(hào) 底物在被具有已知的穩(wěn)定的蛋白水解活性的工具反應(yīng)后，產(chǎn)生可檢測(cè) 的信號(hào)；e) 使用b)中測(cè)量的信號(hào)源，以便該信號(hào)經(jīng)過(guò)所述第一個(gè)樣品，使 得信號(hào)的量受到所述第一個(gè)樣品的顏色或濁度的影響；f) 在c)中測(cè)量到的信號(hào)量與e)中測(cè)量到的信號(hào)量之間建立起相關(guān)性；g) 使用f)中的所述相關(guān)性計(jì)算c)中的即時(shí)信號(hào)的發(fā)展，以預(yù)測(cè)如 果在所述第一個(gè)樣品中測(cè)量信號(hào)，該信號(hào)將會(huì)如何；h) 將g)中預(yù)測(cè)的曲線(xiàn)與b)中測(cè)量的曲線(xiàn)進(jìn)行比較，以推導(dǎo)出在第 一個(gè)樣品中即時(shí)蛋白水解活性的過(guò)程。
3. 執(zhí)行權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法的試劑盒，其包括下面的 成分-已知濃度的被測(cè)量的酶或與被測(cè)量的酶對(duì)信號(hào)底物的酶活性類(lèi) 似的化合物；-啟動(dòng)酶生成的觸發(fā)試劑；-促進(jìn)測(cè)試的診斷值的添加物；-能夠用于標(biāo)準(zhǔn)化和/或?qū)φ盏难獫{；-試劑，其含有信號(hào)底物或添加有生成信號(hào)的離去基團(tuán)的信號(hào)底物；-可直接加載到計(jì)算機(jī)內(nèi)存中的軟件程序，當(dāng)所述程序在計(jì)算機(jī)中運(yùn)行時(shí)，用于計(jì)算通過(guò)本文公開(kāi)的方法測(cè)定的酶活性；-指導(dǎo)手冊(cè)；-校正量的熒光團(tuán)，以供在出現(xiàn)酶生成的介質(zhì)的內(nèi)部或外部使用； -熒光源，在出現(xiàn)酶生成的介質(zhì)的內(nèi)部或外部使用。
4. 權(quán)利要求3的試劑盒，其含有冷凍干燥的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了可靠、快速和方便的方法，在信號(hào)底物的存在下即時(shí)測(cè)定生物學(xué)介質(zhì)中酶濃度的變化，其中對(duì)底物的消耗、信號(hào)的顏色依賴(lài)性以及信號(hào)底物的離去基團(tuán)濃度與信號(hào)量之間的非線(xiàn)性進(jìn)行了校正。該方法包括在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)例如緩沖液中測(cè)量校正曲線(xiàn)，以確定被測(cè)量的曲線(xiàn)的特征。然后，這些特征允許在出現(xiàn)酶生成的介質(zhì)的樣品中，通過(guò)基于單點(diǎn)測(cè)定的數(shù)學(xué)方法，再次獲得該完整的曲線(xiàn)或足夠部分的曲線(xiàn)。該方法的大優(yōu)點(diǎn)是不需要在每個(gè)個(gè)體介質(zhì)中測(cè)量整個(gè)校正曲線(xiàn)，因?yàn)閱吸c(diǎn)測(cè)定就已足夠。
文檔編號(hào)C12Q1/56GK101512011SQ200780027551
公開(kāi)日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2007年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月6日
發(fā)明者C·P·蒂莫西·范阿斯藤, 彼得·L·A·吉森 申請(qǐng)人:凝血酶測(cè)量有限公司