專利名稱：能夠與內(nèi)化素b或內(nèi)化素a結(jié)合的核酸配體的制作方法
能夠與內(nèi)化素B或內(nèi)化素A結(jié)合的核酸配體
背景 領(lǐng)域
本公開(kāi)涉及新的核酸配體(適配子)，其結(jié)合至耙標(biāo)即李斯特菌(Listeria) 上的內(nèi)化素B (inlB)及內(nèi)化素A (inlA)和其它特定的外膜蛋白。所述的適 配子試劑可以用于對(duì)樣本如食物樣本、臨床樣本及環(huán)境樣本篩查內(nèi)化素B、內(nèi) 化素A和其它特定蛋白質(zhì)的存在。這種新的DNA適配子也可以潛在地用于需 要確定李斯特菌存在或不存在的多種應(yīng)用中。 相關(guān)技術(shù)的描述
每年在美國(guó)估計(jì)出現(xiàn)七千六百萬(wàn)例食源性疾病，其中325,000例住院并且 5000例死亡(見(jiàn)Mead等，"在美國(guó)食品相關(guān)的疾病和死亡(Food-Related Illness and Death in the United States),"新傳染病(Emerg. Infect. Dis. ) 5， 607-625(1999))。單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes )已經(jīng)在世界 范圍內(nèi)涉及至少11種人類食源性流行病并且與作為即食型且可以不烹調(diào)而消 費(fèi)的食物相關(guān)(見(jiàn)Ben Embarek, P.K.，"單核細(xì)胞增生李斯特菌在海產(chǎn)食品中 的存在、才企觀寸和生長(zhǎng)評(píng)i侖(Presence, Detection and Growth of Listeria Monocytogenes in Seafoods: a review,)，，國(guó)際食品微生物學(xué)雜志(Int. J. Food Microbiol.) 23, 17-34(1994))。雖然單核細(xì)胞增生李斯特菌每年僅引起2500 例食源性疾病，然而它導(dǎo)致食源相關(guān)性總死亡的10%。大部分的人李斯特菌病 病例出現(xiàn)在新生、年老及免疫受損的個(gè)體中，具有20-40%的病例病死率(見(jiàn) Farber，等，"單核細(xì)胞增生李斯特菌，食源性致病菌(丄/Wen'a wowoc少toge"&s， a Food-Borne pathogen),，，微生物學(xué)評(píng)論(Microbiol. Rev.) 55， 476-511(1991); Schuchat，等"人李斯特氏菌病的流行病學(xué)(Epidemiology of Human Listeriosis,)，，臨床微生物學(xué)評(píng)論(Clin. Microbiol. Rev.) 4, 169-183(1991);"更 新——李斯特氏菌病的多州爆發(fā)Update — Multistate Outbreak of Listeriosis," 美國(guó)疾病預(yù)防控制中心，發(fā)病率和死亡率周報(bào)(Morbid. Mortal. Weekly Rep. 47,
51117-1118(1999)); Jacquet,等"涉及有關(guān)1992年法國(guó)李斯特氏菌病爆發(fā)流行 抹的研究■ (Investigations related to the epidemic strain involved in the French Listeriosis outbreak in 1992 )，"應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl. Environ. Microbiol.) 61， 2242-2246(1995))。因?yàn)樵摷膊〉膰?yán)重性并且與可以不加熱而消費(fèi)的食物相 關(guān)，故美國(guó)食品藥物管理局(FDA)及食品安全監(jiān)察署(FSIS)在1989年建 立對(duì)即食型(RTE)食物中單核細(xì)胞增生李斯特菌存在的零容忍政策。
日益增加的政府管理和不斷變化的食品加工及制造狀況已經(jīng)促進(jìn)開(kāi)發(fā)更 快速、更靈敏和更節(jié)省成本的技術(shù)用于病原體檢測(cè)。目前，市場(chǎng)上存在可用于 檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌或李斯特菌屬細(xì)菌(Listeria spp )的眾多不同方法。 就成本和靈敏度而言，使用最廣泛的方法學(xué)是傳統(tǒng)微生物平板法。雖然這些方 法有效用于從多種樣本中復(fù)原單核細(xì)胞增生李斯特菌，然而獲得陽(yáng)性結(jié)果的時(shí) 間是在收集樣本后5-7日。與基于培養(yǎng)的方法相比，使用核酸擴(kuò)增和免疫化學(xué) 技術(shù)的快速方法改進(jìn)了獲得結(jié)果的時(shí)間并且提供高通量自動(dòng)化的可能性。目前 市場(chǎng)上的快速方法包括PCR法、探針雜交法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)、酶 聯(lián)熒光測(cè)定法(ELFA)、基于側(cè)流和》茲珠的方法。對(duì)這些測(cè)定法而言，獲得結(jié) 果的時(shí)間減少至2-4日，但是大多需要富集步驟以改善靈壽文度并使得受損或 受應(yīng)激的生物恢復(fù)。
更快的獲得結(jié)果時(shí)間和高通量能力已經(jīng)催生PCR方法日益用于食品檢
前一般限制了分子生物學(xué)方法的廣泛使用。基于PCR的方法也有幾個(gè)局限性。 理論上，基于PCR的技術(shù)應(yīng)當(dāng)提供由零容忍政策所強(qiáng)制要求的《1 CFU/25g 食物樣本的4企測(cè)水平。然而，分析靈敏度受眾多因素困擾，所述因素包括低污 染水平、相對(duì)于微小反應(yīng)容積的龐大樣本體積以及食物基質(zhì)組分抑制PCR反 應(yīng)，并且因而未達(dá)到理論值(見(jiàn)Norton, D.M.(2002)美國(guó)分析化學(xué)家組織雜志 (JAOACInt) 85,505-515 )。另外，PCR僅檢測(cè)DNA的存在并且不能指出 病原體是否為死的或活的。
相對(duì)而言，免疫學(xué)方法依賴在選擇性地捕獲、標(biāo)記或檢測(cè)靶生物的特異性 抗體之間的相互作用，并且被廣泛使用及接受用于檢測(cè)及證實(shí)特定的微生物。 基于免疫學(xué)的方法的廣泛使用和接受已經(jīng)產(chǎn)生龐大系列的用于檢測(cè)食品中常
6見(jiàn)食源性細(xì)菌(包括沙門(mén)氏菌屬(Salmondla)、李斯特菌屬、彎桿菌屬 (Campylobacter)和大腸桿菌(E.coli)0157:H7)的商業(yè)檢測(cè)試劑盒，這是用于免 疫學(xué)檢測(cè)的最常見(jiàn)形式，具有10、1()Scfu/mL的檢測(cè)限(見(jiàn)Churchill,等"單 核細(xì)胞增生李斯特菌以及食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌素O的檢測(cè)(Detection of Listeria monocytogenes and the toxin listeriolysin O in food),，，微生物學(xué)方法 雜志(J. Microbiol. Meth.) 64,141-170(2006))。為實(shí)現(xiàn)該檢測(cè)限，在樣本足 夠用于通過(guò)ELISA檢測(cè)之前，往往需要富集病原體至少24小時(shí)(見(jiàn)deBoer 等，"用于食源性微生物檢測(cè)和分型的方法學(xué)(Methodology for detection and typing of food borne microorganisms)，，，國(guó)際食品樣l生物學(xué)雜志('Int. J. Food Microbiol.) 50， 119-130(1999))。
盡管改進(jìn)了眾多快速檢測(cè)系統(tǒng)獲得結(jié)果的時(shí)間，然而需要常規(guī)培養(yǎng)富集仍 是這些方法的限制性特征。另外，這些方法缺少實(shí)時(shí)4企測(cè)生物分子的能力。對(duì) 分析食物樣本的簡(jiǎn)單、價(jià)廉及可靠試驗(yàn)法的需要日益增長(zhǎng)。生物傳感器技術(shù)具 有實(shí)時(shí)或近乎實(shí)時(shí)地滿足這些需求的潛力(見(jiàn)Alocilja，等，"用于食品安全的生 物傳感器的市場(chǎng)分析(Market analysis of biosensors for food safety,)"生物傳感 器與生物電子學(xué)(Biosensors and Bioelectronics) 18, 841-846(2003); Hall，"用 于檢測(cè)微生物食源性公害的生物傳感器技術(shù)(Biosensor technologies for detecting microbiological foodborne hazards),"微生物與感染(Microbes and Infection ) 4, 425-432(2002); Deisingh，等"用于檢測(cè)細(xì)菌的生物傳感器 (Biosensors for the detection of bacteria)，"加拿大微生物學(xué)雜志(Can. J. Microbiol) .50,69-77(2004))。研究已經(jīng)證實(shí)生物傳感器可以在最少的樣品預(yù) 處理?xiàng)l件下檢測(cè)復(fù)雜樣本中廣泛類型的分析物(見(jiàn)Hall "用于檢測(cè)微生物食源 性公害的生物傳感器技術(shù)(Biosensor technologies for detecting microbiological foodborne hazards ),，，微生物與感染(Microbes and Infection) 4， 425-432(2002); Deisingh,等"用于檢測(cè)細(xì)菌的生物傳感器(Biosensors for the detection of bacteria,)"加拿大微生物學(xué)雜志(Can. J. Microbiol) .50,69-77(2004))。
用于細(xì)菌檢測(cè)的生物傳感器通常包括與物理或化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)物(transducer) 接觸的生物識(shí)別構(gòu)件如受體、核酸或抗體。取決于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，生物傳感 器可以分成5個(gè)基本類型電化學(xué)型、光學(xué)型、壓電型、熱學(xué)型和磁力型。最
7李斯特菌的傳感器(見(jiàn)Geng等，"通過(guò)使 用光導(dǎo)纖維術(shù)免疫傳感器檢測(cè)低水平單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞(Detection of Low Levels of Zisten'a /wowocy/ogeway Cells by Using a Fiber-Optic Immunosensor ),，， 應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué) (Applied and Environmental Microbiology) 70， 6138-6146(2004); Leonard, P" Hearty, S.， Wyatt, G.， Quinn, J" O，Kennedy, R.(2005)食品保護(hù)雜志(J. Food Prot.) 68, 728-735; Leonard,等，"使 用表面等離子體共振檢測(cè)被污染的樣品中的全部單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞 的 一 般方法 (A generic approach for the detection of whole ZiWm'a wowoqytogew&s cells in contaminated samples using surface plasmon resonance)，" 生物傳感器與生物電子學(xué)(Biosensors and Bioelectronics ) 19 1331-1335(2004); Tims, T.B.， Dickey， S.S., Demarco, D.R., Lim, D.V.，"使用漸消失波生物傳感器 在20小時(shí)內(nèi)檢測(cè)低水平單核細(xì)胞增生李斯特菌(Detection of low levels of Listeria monocytogenes within 20 hours using an evanescent wave biosensor) ,"(2001)美國(guó)臨床試驗(yàn)(Am. Clin. Lab. ) 20,28-29)。這些測(cè)定法 的靈敏度和特異性依賴用于檢測(cè)的抗體。測(cè)量光纖免疫傳感器的靈敏度閾值 (被分析物(Analyte ) 2000;國(guó)際研究(Research International) , Woodinville, WA)對(duì)于單核細(xì)胞增生李斯特菌的純培養(yǎng)物是大約103CFU/mL,并且單核細(xì) 胞增生李斯特菌與乳酸細(xì)菌一起培育時(shí)是104 CFU/mL ( Geng等，"通過(guò)使用光 導(dǎo)纖維術(shù)免疫傳感器檢測(cè)低水平單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞(Detection of Low Levels of丄/他n'(3 mo"oc,gewas Cells by Using a Fiber-Optic Immunosensor)，" 應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué) (Applied and Environmental Microbiology ) 70, 6138-6146(2004))。檢測(cè)的水平是如預(yù)期那樣與免疫學(xué)方法可比較的，因?yàn)榭?體是與轉(zhuǎn)導(dǎo)物接觸的捕獲劑。多克隆及單克隆抗體均已用于生物傳感器研究。 幾十年來(lái)已經(jīng)使用多克隆抗體作為檢測(cè)試劑(見(jiàn)Breitling, R, Dubd， S.(1999) 重組抗體(Recombinant Antibodies ) John Wiley and Sons Inc.,紐約(New York )， 第154頁(yè))。供應(yīng)是有限的并且需要重復(fù)免疫以補(bǔ)充消耗的庫(kù)存。另一方面， 單克隆抗體提供持續(xù)供應(yīng)的均一、充分表征的抗體。高成本、低產(chǎn)率和需要熟 練實(shí)^^員是與單克隆抗體生產(chǎn)相伴的某些難題。
最初在1990年報(bào)道(見(jiàn)Tuerk, C.， Gold, L.(1990)科學(xué)(Science) 249，
8505-510; Ellington等，"結(jié)合特異性配基的RNA分子的體外選擇(/" wYro selection of RNA molecules that bind specific ligands)，，自纟求(Nature ) 346，
者，它擁有對(duì)于傳感器中用途而言勝過(guò)傳統(tǒng)抗體的優(yōu)勢(shì)(見(jiàn)Jayasena，"適配子 診斷中竟?fàn)幙贵w的分子的新型種類(Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics)，"臨床化學(xué)(Clin. Chem. ) 45:9, 1628-1650(1999))。適配子是可以針對(duì)氨基酸、藥物、蛋白質(zhì)和復(fù)雜靶標(biāo)(如 細(xì)胞)產(chǎn)生的核酸配體(見(jiàn)Gopinath, S.C.， Misono, T.S., Kawasaki, K.， Mizuno， T.， Imai, M., Odagiri， T.， Kumar, P.K.,"區(qū)分接近的相關(guān)人流感病毒并抑制血球凝 集素介導(dǎo)的膜融合的RNA適配子(An RNA apt amer that distinguishes between closely related human influenza viruses and inhibits hemagglutanin-mediated membrane fbsion )，"(2006)普通病毒學(xué)雜志(J. Gen. Virol.) 87, 479-487; Cerchia, L.等，"來(lái)源于全細(xì)胞指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化的中和抗體抑制RET受體酪氨 酸激酶(Neutralizing Aptamers from Whole-Cell SELEX Inhibit the RET Receptor Tyrosine Kinase)，"公共科學(xué)圖書(shū)館.生物學(xué)(PLoS Biol.) 3, el23(2005); Duconge， F., Pestourie, C., Boulay， J., Aissouni， Y.， Gombert, K.， Tavitian， B.， de Franciscis, V" Libri, D.(2005)公共科學(xué)圖書(shū)館 生物學(xué)(PLos Biol.) 3, el23; Mori，T.等，"選擇的抗NF-kB受體激活劑的RNA適配子檢測(cè)對(duì)腫瘤壞死因子受 體家族的蛋白的總親和力RNA aptamers selected against the receptor activator of NF-kB acquire general affinity to proteins of the tumor necrosis factor receptor family,"核酸研究(Nuc. Acids Res.) 32,6120-6128(2004); Daniels, D.A.等，"通 過(guò)腫瘤細(xì)胞SELEX鑒定的結(jié)合腕蛋白-C適配子指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(A tenascin-C aptamer identified by tumor cell SELEX: Systematic evolution of ligands by exponential enrichment),，，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.) 100,15416-15421(2003)。已經(jīng)使用此項(xiàng)技術(shù)針對(duì)類型廣泛的耙標(biāo)選出眾 多的適配子，它們具有等同于或有時(shí)優(yōu)于針對(duì)這些靶標(biāo)的抗體的選棒f生、特異 性和親合力。獲得這些寡核苷酸配體的技術(shù)稱作SELEX (指數(shù)富集配體系統(tǒng) 進(jìn)化技術(shù))，其在美國(guó)專利號(hào)5,475,096和美國(guó)專利號(hào)5,270,163中描述。對(duì)于 體外測(cè)定法而言，使用適配子勝過(guò)傳統(tǒng)抗體的優(yōu)勢(shì)包括l)能夠多次進(jìn)行變
9性/復(fù)性(可再用)，2)對(duì)長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定并且可以在環(huán)境溫度下運(yùn)輸，3)調(diào)整
選擇條件以獲得具有對(duì)于體外測(cè)定法想要的特性的適配子，4)通過(guò)幾乎無(wú)批 間變異的化學(xué)合成法產(chǎn)生，5)通過(guò)不需要使用動(dòng)物的體外過(guò)程進(jìn)行選擇，6) 能夠在精確位置處連接報(bào)道分子(見(jiàn)O，Sullivan， C.K.,"適配子傳感器-生物傳 感器的未來(lái)？ Aptasensors-the fbture of biosensing )，"分析化學(xué)和生物分析化 學(xué)(Anal. Bioanal. Chem.) 372,44-48(2002))。
用。分離的針對(duì)李斯特菌中外膜蛋白的適配子可以用在針對(duì)食物樣本、臨床樣
本或環(huán)境樣本的診斷性檢測(cè)技術(shù)和生物傳感器檢測(cè)技術(shù)中。
發(fā)明簡(jiǎn)述
一項(xiàng)實(shí)施方案提供了分析樣本中單核細(xì)胞增生李斯特菌存在性的方法，所 述方法包括使該樣本暴露于以下適配子，該適配子特異性結(jié)合選自由單核細(xì) 胞增生李斯特菌內(nèi)化素B蛋白質(zhì)及單核細(xì)胞增生李斯特菌內(nèi)化素A蛋白質(zhì)所 組成的組中的蛋白質(zhì)；并且當(dāng)所述適配子結(jié)合所述樣本中存在的所述蛋白質(zhì) 時(shí)，確定單核細(xì)胞增生李斯特菌存在于該樣本中。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含以下核酸分子，所述核酸分子包含序列 gggnzggghxgggnggg (SEQIDNO:l至SEQIDNO:5),其中"n"表示a、 c、 g 或t， "h"表示a、 c或t, z是l或2，并且x是l或2。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含選自由SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2所 組成的組中的序列。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含選自由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO: 16 所組成的組中的序列。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含選自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所 組成的組中的序列。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含選自由SEQIDNO:ll、 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO:15所組成的組中的序列。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含SEQIDNO:5的序列。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含SEQIDNO:12的序列。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含選自由SEQIDNO:21、 SEQIDNO:22和
10SEQIDNO:23所組成的組中的核酸序列。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含以下核酸分子，所述核酸分子包含序列g(shù)ggyaggggrgggwggg ( SEQ ID NO: 18 )，其中"y"表示c或t; "r"表示g或a;并且"w"表示t或a。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含選自由SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所組成的組中的核酸序列。
在實(shí)施方案中，提供治療哺乳動(dòng)物中單核細(xì)胞增生李斯特菌感染的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物給藥濃度足以降低單核細(xì)胞增生李斯特菌感染的適配子，該適配子特異性結(jié)合選自由單核細(xì)胞增生李斯特菌內(nèi)化素B蛋白質(zhì)及單核細(xì)胞增生李斯特菌內(nèi)化素A蛋白質(zhì)所組成的組中的蛋白質(zhì)。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含以下核酸分子，所述核酸分子包含序列g(shù)ggnzggghxgggnggg (SEQIDNO:l至SEQIDNO:5)，其中"n"表示a、 c、 g或t， "h"表示a、 c或t， z是l或2，并且x是l或2。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含選自由SEQ IDNO:l和SEQ ID NO:2所組成的組中的序列。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含選自由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16所組成的組中的序列。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含選自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所組成的組中的序列。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含選自由SEQIDNO:ll、 SEQIDNO:14和SEQ ID NO:15所組成的組中的序列。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含SEQIDNO:5的序列。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含SEQIDNO:12的序列。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含選自由SEQ ID NO:21 、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所組成的組中的核酸序列.
在又一個(gè)方面，所述適配子包含以下核酸分子，所述核酸分子包含序列g(shù)ggyaggggrgggwggg ( SEQ ID NO:18 )，其中"y"表示c或t; "r"表示g或a;并且"w"表示t或a。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含選自由SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25
ii所組成的組中的核酸序列。
在實(shí)施方案中，提供包含以下核酸分子的適配子，所述的核酸分子包含序
列g(shù)ggn、ggghxgggn2ggg ( SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:5 )，其中n1是a， z是1,
h是c， x是l并且n2是g。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含SEQIDNO:ll的序列。
在實(shí)施方案中，提供包含以下核酸分子的適配子，所述的核酸分子包含序
列g(shù)ggn、ggghxgggn2ggg ( SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:5 )，其中n1是a， z是1,
h是a， x是2并且n2是t。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含SEQIDNO:12的序列。
在實(shí)施方案中，提供包含以下核酸分子的適配子，所述的核酸分子包含序
列g(shù)ggn^gghxgggn2ggg ( SEQ ID NO:l至SEQ ID NO:5 ),其中n1是c或t, z
是2， h是a， x是l并且i^是t。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含SEQIDNO:13的序列。
在實(shí)施方案中，提供包含以下核酸分子的適配子，所述的核酸分子包含序
列g(shù)ggn、ggghxgggn2ggg ( SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:5 )，其中n!是t， z是l，
h是a， x是1并且n2是a。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含SEQIDNO:14的序列。
在實(shí)施方案中，提供包含以下核酸分子的適配子，所述的核酸分子包含序
列g(shù)ggn'zggghxgggn2ggg (SEQ ID NO: I至SEQ ID NO:5 ),其中n1是g, z是1,
h是t, x是1并且n2是a。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含SEQIDNO:15的序列。
在實(shí)施方案中，提供包含以下核酸分子的適配子，所述的核酸分子包含序
列g(shù)ggn、ggghxgggn2ggg ( SEQIDNO:l至SEQIDNO:5 ),其中n是t, z是2，
h是a， x是1并且n2是c。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含SEQIDNO:16的序列。
在實(shí)施方案中，提供包含以下核酸分子的適配子，所述的核酸分子包含選
自由SEQ ID NO:21 、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所組成的組中的序列。在實(shí)施方案中，提供包含以下核酸分子的適配子，所述的核酸分子包含序
列g(shù)ggyaggggrgggwggg (SEQ ID NO: 18),其中"y"表示c或t; "r"表示g
12或a;并且"w"表示t或a。
在又一個(gè)方面，所述適配子包含選自由SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所組成的組中的核酸序列。附圖簡(jiǎn)述


圖1是旨在獲得針對(duì)內(nèi)化素B的高親合力適配子的體外選擇過(guò)程(29,美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0050142582)第15輪后所得到DNA序列的列表。突出顯示每一序列中4個(gè)三G重復(fù)序列。
圖2是顯示ELISA結(jié)果的圖，其中所述ELISA用來(lái)篩選與連接到微量平板上的加組氨酸標(biāo)簽的內(nèi)化素B結(jié)合的所選寡核苷酸。使用先前鑒定針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子TTF的適配子(TTFapt)作為對(duì)照(29,美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0050142582)。使用初始寡核苷酸文庫(kù)(TTFAL, inlBAL)作為陰性對(duì)照，其中加組氨酸標(biāo)簽的TTF和加組氨酸標(biāo)簽的inlB蛋白結(jié)合于微量平板。數(shù)據(jù)顯示為n = 3的平均數(shù)土S.D.。
圖3是顯示ELISA結(jié)果的圖，其中所述ELISA用來(lái)測(cè)試所選適配子的特異性。加組氨酸標(biāo)簽的TTF 、 inlB或肽 D (氨基酸序列QQQTAPKAPTEHHHHHH, SEQ ID NO:17 )連接于微量平板。通過(guò)測(cè)量的吸光度確定與inlB或肽D結(jié)合的所選適配子的量。數(shù)據(jù)顯示為n = 3的平均數(shù)± S.D.。
圖4是使用針對(duì)內(nèi)化素B適配子克隆3.2的竟?fàn)幮訣LISA所獲得的數(shù)據(jù)。將此數(shù)據(jù)輸入S形(Sigmoidal)模型等式a +(b-a)/(l + 1()A(x-c))以獲得EC50 =82.7 pM。
圖5是在10% SDS-PAGE凝膠上展開(kāi)并用生物素化內(nèi)化素B適配子克隆3.2所探測(cè)的5pg純化inlB及10mL單核細(xì)胞增生李斯特菌提取物的蛋白質(zhì)印跡分析。所述的適配子用鏈霉抗生物素標(biāo)記的HRP和化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)。
圖6是顯示ELISA結(jié)果的圖，其中所述ELISA用來(lái)篩選與連接到微量平板上的加組氨酸標(biāo)簽的內(nèi)化素A結(jié)合的所選寡核苦酸。使用初始適配子文庫(kù)作為陰性對(duì)照。數(shù)據(jù)顯示為n = 3的平均數(shù)土S.D.。
圖7顯示基于與用適配子文庫(kù)的結(jié)合作用相比的在ELISA篩選法中的強(qiáng)烈信號(hào)，與內(nèi)化素A結(jié)合的適配子序列(SEQIDNO:21至SEQIDNO:25)。
13圖8是顯示ELISA結(jié)果的圖，其中所述ELISA用來(lái)測(cè)試名為A8的所選適配子(具有SEQ ID N0:21的DNA序列)的結(jié)合作用。大約107cfU的單核細(xì)胞增生李斯特菌(LM)、無(wú)害李斯特菌(Listeria innocua， LI)和威爾斯李斯特菌(Listeria welshimeri， LW)重懸在碳酸鹽緩沖液中并使之吸附于各孔內(nèi)。不向適宜的孔施加適配子(B )或?qū)ζ涫┘訚舛葹?.5 ng/|aL A8適配子或適配子文庫(kù)(AL )。使用TMB和HRP檢測(cè)結(jié)合作用。數(shù)據(jù)顯示為n = 3的平均數(shù)土S.D.。與LI和LW相比，A8適配子限制對(duì)LM的偏好性結(jié)合。
圖9顯示針對(duì)無(wú)寡聚物、適配子文庫(kù)(AL)、與加組氨酸標(biāo)簽的inlA蛋白結(jié)合的內(nèi)化素A8適配子(A8, SEQIDNO:21)、 0610蛋白和肽D (自p60蛋白獲得的氨基酸序列QQQTAPKAPTEHHHHHH( SEQ ID NO:17))的ELISA數(shù)據(jù)。通過(guò)測(cè)量的吸光度確定與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的所選適配子的量。數(shù)據(jù)顯示為n = 3的平均數(shù)士S.D.。基于與0610蛋白和肽D相比的與inlA孵育時(shí)所獲得的更高信號(hào)，A8適配子顯示一定特異性。
圖IO是使用針對(duì)內(nèi)化素A8適配子(SEQIDNO:21)的竟?fàn)幮訣LISA所獲得的數(shù)據(jù)。將此數(shù)據(jù)輸入S型(Sigmoidal)模型等式a +(b~a)/(l + 10A(x-c))以獲得EC5(T 543.5 jiM。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述
本公開(kāi)涉及分離因針對(duì)內(nèi)化素B或內(nèi)化素A的結(jié)合特征而被選出的新試劑。In舊是單核細(xì)胞增生李斯特菌中位于表面的蛋白質(zhì)，其結(jié)合并活化受體酪氨酸激酶Met (見(jiàn)Bierne， H.等，"InIB，單核細(xì)胞增生李斯特菌的表面蛋白表現(xiàn)為4曼襲和生長(zhǎng)因子(InIB， a surface protein of ZiWen'a wowoc_ytogewas thatbehaves as an invasion and a growth factor)，"纟田月包牙牛學(xué)雜志(J. Cell Sci. ) 115,3357-3367(2002); Cabanes， D.等，"單核細(xì)胞增生李斯特菌的表面蛋白和致病可能'I"生(Surface proteins and the pathogenic potential of ZiWen'a附owocj^ogewas),，，微生物學(xué)趨勢(shì)(Trends Microbiol.) 10， 238-245(2002))并且引起該細(xì)菌的肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)內(nèi)化作用活化。InlA屬于李斯特菌基因組中所鑒定的一大類位于表面的富亮氨酸重復(fù)序列(LRR)蛋白質(zhì)。InlA能使單核細(xì)胞增生李斯特菌侵襲非吞噬性細(xì)胞，如人腸上皮非吞噬性細(xì)胞(見(jiàn)Gaillard， J丄.，Berche, P., Frehel, C.,Gouin, E., Cossart, P.，"來(lái)自于革蘭氏陽(yáng)性球菌表面抗原的重復(fù)蛋白表明，單核
14細(xì)胞增生李斯特菌通過(guò)內(nèi)化素介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞(Entry of L. monocytogenes intoCells Is Mediated by Internalin， a Repeat Protein Reminiscent of Surface Antigensfrom Gram-Positive Cocci) ，"(1991)細(xì)胞(Cell) 65， 1127-1141 )并且足以黏著于上皮細(xì)胞并且誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的攝入(見(jiàn)Schubert W.D.， Urbanke， C.， Ziehm， T.，Beier, V" Machner, MP" Domann, E., Wehland, J., Chakraborty, T., Heinz, D,W""單核細(xì)胞增生李斯特菌的主要侵襲蛋白一一內(nèi)化素在與其人類受體E-鈣粘蛋白的復(fù)合體中的結(jié)構(gòu)(Structure of Internalin, a Major Invasion Protein of Listeriamonocytogenes, in Complex with Its Human Receptor E-Cadherin) ，，，(2002)纟田月包(Cell) 111,825-836)。
所才皮露的41"對(duì)內(nèi)化素B和內(nèi)化素A的核酸配體可以用于確定內(nèi)化素B、內(nèi)化素A或李斯特菌在食物樣本、臨床樣本或環(huán)境樣本中的存在或不存在；它們也可以用作藥物用以通過(guò)與促進(jìn)感染的inlB或inlA蛋白結(jié)合并使其失活而對(duì)付李斯特菌感染。 一個(gè)目的是將這些核酸配體并入體外診斷平臺(tái)或生物傳感器平臺(tái)，其中設(shè)計(jì)所述的平臺(tái)旨在檢測(cè)內(nèi)化素B、內(nèi)化素A或李斯特菌在食物樣本、臨床樣本或環(huán)境樣本中的存在或不存在。另一個(gè)目的是在用于治療或預(yù)防李斯特菌感染的方法中使用這些核酸配體。
在本文中披露了結(jié)合內(nèi)化素B和內(nèi)化素A蛋白的寡核苷酸。對(duì)內(nèi)化素B特異的適配子的具體寡核苷酸序列在圖1中顯示為SEQ ID NO:ll至SEQ IDNO:16。此外，對(duì)內(nèi)化素A特異的適配子的具體寡核苷酸序列在表1中顯示為SEQIDNO:21至SEQIDNO:25。這些寡核苷酸可以用作生物傳感器平臺(tái)和/或體外診斷測(cè)定法中的生物識(shí)別元件或用作針對(duì)李斯特菌病病例的治療劑。與內(nèi)化素B相關(guān)的寡核苷酸包含18-41個(gè)核苷酸，而與內(nèi)化素A相關(guān)的那些寡核苦酸包含47個(gè)核苷酸。所述的寡聚物由核苷酸、修飾的核苷酸或其組合組成。修飾的核苷酸可以包括但不限于添加生物素、硫、溴、磷、氟或氨基。優(yōu)選地，寡核苷酸由DNA組成，不過(guò)也可以是RNA或合成性核苷酸類似物。若寡核苷酸將用于生物傳感器應(yīng)用中，可以使用對(duì)核苷酸的5'、 3'或內(nèi)部修飾以將所述寡核苷酸結(jié)合至生物傳感器平臺(tái)，其中所述的生物傳感器平臺(tái)可以是電化學(xué)型、光學(xué)型、壓電型、熱學(xué)型和磁力型的。
I.針對(duì)內(nèi)化素B的適配子
15針對(duì)內(nèi)化素B的適配子的每條分離的序列含有富G序列，其中所述的富G序列形式為在圖1中突出顯示的4個(gè)三dGTP重復(fù)序列。基于使用ELISA對(duì)適配子3.2的截短研究，富G序列似乎對(duì)內(nèi)化素B的結(jié)合作用是必需的。基于結(jié)合親合力，已經(jīng)推導(dǎo)了提供針對(duì)inlB的高水平結(jié)合親和力的幾個(gè)富G序列并披露如下。
gggnzgggnxgggnggg
gggnzggghxgggnggg
gggdggghxgggdggg
gggyygggrgggyggg ( SEQ ID NO: 1 )
gggytgggagggyggg ( SEQ ID NO:2 )
gggnggghgggrggg ( SEQ ID NO:3 )
gggdggghgggrggg ( SEQ ID NO:4 )
gggdggghgggrggg (SEQIDNO:5)在這些序列中，"n"表示a、 c、 g或t; "y"表示c或t; "d"表示g，t或a; "h"表示a、 c或t;并且x和z是l或2。A.適配子試劑的分離和表征
下文描述用來(lái)分離并表征所述內(nèi)化素B適配子試劑的方法。
1. 重組內(nèi)化素B的制備
使用來(lái)自GenBank登錄號(hào)AJ012346的單核細(xì)胞增生李斯特菌序列設(shè)計(jì)針對(duì)inlB的引物。該引物序列的5'端包括LIC序列用于簡(jiǎn)化稍后步驟中的克隆。PCR引物的序列如下inlB-S， 5'-GGT ATT GAG GGT CGC GCG AAAGTACAA GCG- 3'( SEQ ID NO:6 )， inlB-AS， 5'畫(huà)AGA GGA GAG TTA GAG CCT TTCTGT GCC CTT AAA T- 3' ( SEQ ID NO:7 )。通過(guò)PCR從單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組DNA (ATCC， 19115D)擴(kuò)增In舊。將PCR產(chǎn)物為L(zhǎng)IC克隆而處理并以符合可讀框方式插入pET-30Xa/LIC載體(Novagen中His-標(biāo)簽序列上游。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證擴(kuò)增的inlB片段的核苦酸序列。為表達(dá)該重組蛋白，將所得質(zhì)粒pET30/inlB轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichia coli)菌抹BLR (DE3)。
2. 重組內(nèi)化素B的純化
用pET30/inlB轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌抹BLR(DE3 )在37。C培育直至OD600
16是0.7并且隨后用lmMIPTG誘導(dǎo)3小時(shí)。通過(guò)離心法收集誘導(dǎo)的細(xì)菌并且將沉淀物在-80。C保持過(guò)夜。將沉淀物重懸在柱結(jié)合緩沖液(50mMHEPES， pH7.9, 5mM咪唑，500mMNaCl)和蛋白酶抑制劑中，隨后在冰上超聲波處理。通過(guò)離心除去殘片并且將蛋白質(zhì)通過(guò)金屬親和層析法(Novagen)純化。蛋白質(zhì)濃度由BCA測(cè)定法確定并且純度使用SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法分析。3.適配子的體外選擇
如下方法在Murphy, M.D.， Fuller, S.T., Richardson, P.M. & Doyle, S.A.,"用于適配子體外進(jìn)化的改良方法以及在蛋白質(zhì)檢測(cè)和純化中應(yīng)用(An improvedmethod for the in vitro evolution of aptamers and applications in protein detectionand purification) ,"(2003)核酸研究(Nuc. Acids Res.) 31, No. 18 e 100并在美國(guó)專利申請(qǐng)
發(fā)明者山本辛迪, 托希特·森 申請(qǐng)人:日立化成工業(yè)株式會(huì)社;日立化成研究中心公司