專利名稱：用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的高細胞密度補料-分批發(fā)酵方法
技術領域：
概括來說，本申請案是關于可提高細菌系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)表達的新穎補料-分批發(fā)酵方法，以及高密度蛋白質(zhì)組合物和所述新穎補料-分批發(fā)酵方法中所用的組合物。

背景技術：
已利用多種發(fā)酵策略來生產(chǎn)供實驗室、臨床或商業(yè)使用的足量蛋白質(zhì)。利用補料-分批發(fā)酵所提供的蛋白質(zhì)產(chǎn)量比通過簡單分批發(fā)酵方法所提供的產(chǎn)量高。補料-分批發(fā)酵方法在最初分批階段后進行將一或多種營養(yǎng)物通過補加補充到培養(yǎng)物中的階段。
通常，在分批階段期間，細胞最初生長到期望濃度。在此階段，細胞生長旺盛且通常不產(chǎn)生靶蛋白質(zhì)，除非我們視啟動子添加諸如阿拉伯糖、乳糖或異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等誘導物或啟動子有些泄漏。在補料期期間，通常將碳源和其它必需物質(zhì)以相對濃縮的液體流形式以一定補料速度補加到發(fā)酵罐中。在達到目標細胞密度后，開始補加誘導物或誘導物和其它營養(yǎng)物。在此階段期間，重點是由所培育的細胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)。補加到發(fā)酵罐中的底物(即，營養(yǎng)物和誘導物)在此階段通常用于細胞生長和產(chǎn)物合成。通過補料速度來控制細胞生長以獲得最佳細胞生長和蛋白質(zhì)產(chǎn)生。在蛋白質(zhì)產(chǎn)生階段期間，必須為重組生物體添加誘導物。
在于補料期結束時出現(xiàn)限制條件以前包含常見碳源(例如葡萄糖或另一種基于糖的碳源)和誘導物的培養(yǎng)基上的蛋白質(zhì)表達令人滿意。限制條件的實例包括生長培養(yǎng)基中的氧濃度降低、諸如維生素、碳、氮等營養(yǎng)物減少和累積毒性化合物。
補料-分批發(fā)酵策略通常涉及不同反饋控制形式，包括控制營養(yǎng)物補充的間接和直接反饋。一種所述補料-分批發(fā)酵方法涉及應用通過補加營養(yǎng)物以將過程參數(shù)控制在規(guī)定設定點的反饋控制算法。例如，補料的直接控制可基于營養(yǎng)物濃度的量度。隨后在整個發(fā)酵期間反饋控制與細胞活性直接相關。已用于發(fā)酵反饋控制的控制參數(shù)包括pH值、在線測量的細胞密度或溶解氧張力(DOT)。
然而，應用反饋算法會伴隨許多缺點。一個所述缺點是補料速度依賴于當前的過程參數(shù)。對過程的任何干擾都可能影響參數(shù)，由此歪曲補料速度和所得蛋白質(zhì)產(chǎn)量。當將所述方法按比例放大以生產(chǎn)增量蛋白質(zhì)時，所述缺點被擴大。
先前所用補料-分批策略的另一個缺點是當使用反饋控制時，不能準確地預先確定或控制具體生長速度，導致在產(chǎn)物形成依賴于生長的情況下方法產(chǎn)量達不到最佳。
此外，當進入到中心代謝途徑中的碳通量(例如，高葡萄糖濃度)超過三羧酸(TCA)循環(huán)的最大容量后，可能累積副產(chǎn)物。副產(chǎn)物累積可能抑制發(fā)酵期間的細胞生長和蛋白質(zhì)產(chǎn)生。
另外，補料-分批發(fā)酵方法的所述多個缺陷通常會導致營養(yǎng)物組份利用效率低。因此，這些方法在經(jīng)濟上不利，尤其在大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)蛋白質(zhì)時。
如上所述，通過補料-分批發(fā)酵表達重組蛋白質(zhì)的先前途徑具有多個缺陷。考慮到以成本有效方式生產(chǎn)用于各種用途的足量蛋白質(zhì)的重要性，當前需要可達成較高細胞生長、增多的產(chǎn)物形成(即，蛋白質(zhì)產(chǎn)量較高)和較少的副產(chǎn)物累積的有效補料-分批發(fā)酵方法。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是關于可達成出乎意料高的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量的新穎補料-分批發(fā)酵方法。
本發(fā)明實施例提供生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，其包含培養(yǎng)表達重組蛋白質(zhì)的重組細菌細胞，此包含向包含重組細菌細胞的培養(yǎng)物中連續(xù)添加碳源并在培養(yǎng)物達到閾值參數(shù)后向培養(yǎng)物中連續(xù)添加誘導物；和自細胞培養(yǎng)物中分離重組蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的又一實施例提供生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，其包含(a)在誘導型啟動子控制下將編碼重組蛋白質(zhì)的表達載體引入到細菌宿主細胞中以形成重組細菌細胞；(b)將所述重組細菌細胞引入到培養(yǎng)基中以形成細胞培養(yǎng)物；(c)將碳源以連續(xù)補料形式添加到細胞培養(yǎng)物中；(d)監(jiān)測細胞培養(yǎng)物中的細胞生長是否達到閾值光密度(OD600)；(e)在達到閾值光密度(OD600)后，將誘導型啟動子的誘導物以連續(xù)補料形式添加到細胞培養(yǎng)物中；和(f)自細胞培養(yǎng)物收獲重組蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的再一實施例提供生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，其包含培養(yǎng)表達重組蛋白質(zhì)的重組細菌細胞，其是通過在包含所述細菌細胞的培養(yǎng)物達到閾值參數(shù)后向所述培養(yǎng)物中連續(xù)添加誘導物來培養(yǎng)，其中所述細菌細胞包含對應于腦膜炎奈瑟菌血清群B(N.meningitidis serogroup B)基因的核酸序列。
根據(jù)再一實施例，本發(fā)明提供生產(chǎn)重組2086蛋白質(zhì)(rP2086)的方法，其包含(a)在誘導型啟動子控制下將編碼重組腦膜炎球菌(meningococcal)2086蛋白質(zhì)的表達載體引入到細菌宿主細胞中以形成重組細菌細胞；(b)將所述重組細菌細胞引入到培養(yǎng)基中以形成培養(yǎng)物；(c)向培養(yǎng)物中添加碳源；(d)監(jiān)測培養(yǎng)物中的細胞生長是否達到閾值光密度(OD)；(e)在培養(yǎng)物的細胞密度達到約70至110的光密度后，向培養(yǎng)物中連續(xù)添加誘導型啟動子的誘導物；和(f)在開始連續(xù)添加誘導物后約3小時至約6小時后，自培養(yǎng)物收獲重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)。
根據(jù)另一實施例，本發(fā)明提供一種包含細菌培養(yǎng)物的組合物，所述細菌培養(yǎng)物包含基于細菌培養(yǎng)物的總體積，密度為至少約1.5g/L的重組2086蛋白質(zhì)(rP2086)。
根據(jù)再一實施例，本發(fā)明提供一種包含細菌培養(yǎng)基的組合物，所述細菌培養(yǎng)基包含按照本發(fā)明方法所制備的重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)(rP2086)。



圖1無誘導時不同恒定補料速度下的補料-分批發(fā)酵。
圖2無誘導時不同恒定補料速度下的補料-分批發(fā)酵。
圖3在不同光密度下進行誘導。
圖4用不同量的阿拉伯糖進行誘導。
圖5阿拉伯糖添加方法對rLP2086產(chǎn)量的影響。
圖6阿拉伯糖補料速度對rLP2086產(chǎn)量的影響。
圖7誘導時間對表達的影響。
圖8用于生產(chǎn)亞科B rLP2086的補料-分批發(fā)酵。
圖9a和9b分別為rLP2086亞科B誘導的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)。
圖10用于生產(chǎn)亞科A rLP2086的補料-分批發(fā)酵。
圖11a和11b分別為rLP2086亞科A誘導的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡。
圖12a、12b和12c在誘導期間雙重補加葡萄糖和阿拉伯糖。
圖13a100L規(guī)模的rLP2086亞科B大腸桿菌補料-分批發(fā)酵。
圖13b100L規(guī)模的rLP2086亞科A大腸桿菌補料-分批發(fā)酵。
圖14a100L規(guī)模的葡萄糖和阿拉伯糖雙重補料的rLP2086亞科B大腸桿菌補料-分批發(fā)酵。
圖14b100L規(guī)模的葡萄糖和阿拉伯糖雙重補料的rLP2086亞科A大腸桿菌補料-分批發(fā)酵。

具體實施例方式 本發(fā)明方法是基于以下驚人發(fā)現(xiàn)通過在誘導期間向培養(yǎng)基中連續(xù)補加誘導物的補料-分批發(fā)酵可獲得出人意料高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。任選地，碳源是在連續(xù)誘導物補料之前和/或期間連續(xù)補加。當由阿拉伯糖誘導時，按照本發(fā)明實施例可產(chǎn)生約2-3g/L的重組2086脂蛋白(rLP2086)(其由具有對應于腦膜炎奈瑟菌血清群B中的2086基因的序列的微生物所表達)。此表示與相當分批發(fā)酵方法相比通過補料-分批發(fā)酵2086蛋白質(zhì)的亞科A和B二者的rLP2086產(chǎn)量均有2-3倍增加。而且，本發(fā)明方法可容易地適應所述和其它蛋白質(zhì)的商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。
為促進對本文所述實施例的理解，可參考多個實施例且將使用特定語言來闡述其。本文所用的術語僅用于闡述具體實施例，而不意欲限制本發(fā)明的范圍。除非上下文另外明確說明，否則在整篇揭示內(nèi)容中所用的單數(shù)形式“一”和“所述”包括多個指示物。同樣，諸如“培養(yǎng)基(medium)”等術語的單數(shù)形式包括“培養(yǎng)基”的復數(shù)形式指示物，且反之亦然。因此，例如，“培養(yǎng)基(culture medium)”指示物包括多種所述培養(yǎng)基以及單一培養(yǎng)基；且“培養(yǎng)基”指示物包括多種培養(yǎng)基以及單一培養(yǎng)基。
本文所用的術語“誘導物”是指可誘導、增強或促進重組蛋白質(zhì)表達的任何試劑，由此在誘導型啟動子控制下的基因表達可由所述試劑的濃度直接調(diào)節(jié)。
本文所用的術語“碳源”是指用于細胞的碳和能量來源。
術語“補料(feed)”、“補料(fed)”、“補加(feeding)”或“連續(xù)添加”在本文中可交換使用，其是指經(jīng)一段時間連續(xù)地而非同時添加物質(zhì)。此術語涵蓋在發(fā)酵過程期間用于連續(xù)添加物質(zhì)的單個開始和/或終止或多個起點和/或終點。
本文所用的術語“重組蛋白質(zhì)”是指不為自編碼氨基酸的重組遺傳物質(zhì)所表達的報道基因或標記基因(例如，綠色熒光蛋白)的任何蛋白質(zhì)或其生物活性部分(例如，保留完整蛋白質(zhì)的生物活性的部分)，其包括肽、多肽、蛋白質(zhì)、寡聚蛋白質(zhì)和/或融合蛋白質(zhì)。重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物可包括治療性、預防性或診斷性產(chǎn)物。
本發(fā)明方法 本發(fā)明方法可通過涉及在培養(yǎng)物達到閾值參數(shù)后向培養(yǎng)基中連續(xù)添加誘導物(例如阿拉伯糖)的新穎補料-分批發(fā)酵方法提供出人意料高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。通常在誘導期之前將諸如葡萄糖等碳源添加到包含重組細菌細胞的培養(yǎng)物中?？蓪⑻荚磁c誘導物一起補加。誘導物也可作為第二碳源。
按照本發(fā)明實施例，在向培養(yǎng)基中連續(xù)補加誘導物之前和/或期間向培養(yǎng)基中連續(xù)添加諸如葡萄糖等碳源。因此，根據(jù)一實施例，連續(xù)補加碳源與連續(xù)補加誘導物交疊。連續(xù)補加碳源可在連續(xù)補加誘導物的全部持續(xù)時間段期間或僅在所述持續(xù)時間段的一部分期間繼續(xù)。在另一實施例中，連續(xù)補加碳源與連續(xù)補加誘導物不交疊。根據(jù)本發(fā)明一實施例，可以恒定速度將誘導物和/或碳源補加到培養(yǎng)物中。
按照本發(fā)明實施例，所述補料-分批發(fā)酵方法涉及可產(chǎn)生期望蛋白質(zhì)的數(shù)個步驟。在起始步驟中，制備在誘導型啟動子控制下編碼重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達載體并隨后將其引入到細菌宿主細胞中。將細菌宿主細胞引入到培養(yǎng)基中。將誘導型啟動子的誘導物補加到培養(yǎng)物中(即，將誘導物經(jīng)一段時間連續(xù)添加到培養(yǎng)物中)?？梢院愣ㄋ俣葘⒄T導物補加到培養(yǎng)物中。隨后，自培養(yǎng)物收獲重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物。隨后可將以此方式產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)視需要進行純化和/或以任何適宜方式(例如以預防性、治療性或診斷性調(diào)配物形式)使用。
通過以恒定速度補加誘導物的補料-分批發(fā)酵可出乎意料地達成高細胞密度和增加的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，如下文提供實例中所闡釋，與分批發(fā)酵相比所述補料-分批發(fā)酵使重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物的產(chǎn)量增加約2-3倍。本發(fā)明方法適于大規(guī)模發(fā)酵以及小規(guī)模發(fā)酵。本文所用的“大規(guī)?！卑l(fā)酵是指在體積容量(即，工作體積)至少為約1,000L的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，其中已留出足夠的頂部空間。“小規(guī)?！卑l(fā)酵通常是指在體積容量通常不大于約100L(例如5L、10L、50L或100L)的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。本發(fā)明補料-分批發(fā)酵方法的證實優(yōu)點是其可用于以5-10L發(fā)酵罐規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物且可按比例縮放到任何體積，例如(但不限于)100L、150L、250L、500L、1000L或更大。
誘導物 本文所述方法是關于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，其中重組蛋白質(zhì)的表達是在誘導型啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下進行，由此在誘導型啟動子控制下的基因表達可由存在于培養(yǎng)基中的誘導物的濃度直接調(diào)節(jié)。將誘導物任選地以恒定速度連續(xù)提供到培養(yǎng)基中。在達到閾值參數(shù)后，將誘導物添加到培養(yǎng)基中。例如，重組蛋白質(zhì)可受araB啟動子(例如，ParaB)的控制，此可由以恒定速度添加到培養(yǎng)基中的阿拉伯糖的濃度直接調(diào)節(jié)。適于與本發(fā)明結合使用的誘導物已為所屬領域的技術人員所熟知。下文提供本發(fā)明誘導物的實例，此并不具有限制意義。


碳源 如所屬領域的技術人員所了解，本發(fā)明涵蓋使用諸如甘油、琥珀酸酯、乳酸酯或基于糖的碳源(例如，葡萄糖、乳糖、蔗糖和果糖)等任何適宜碳源。例如，可用于本發(fā)明的基于糖的碳源包括(但不限于)具支鏈或非具支鏈多糖，其包含糖類單體D-甘露糖、D-和L-半乳糖、巖藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如，聚甘露糖醛酸或海藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神經(jīng)氨酸，包括同多糖和雜多糖，例如，乳糖、支鏈淀粉、淀粉、羥乙基淀粉、直鏈淀粉、葡聚糖硫酸酯、葡聚糖、糊精、糖原、或酸性粘多糖的多糖亞單元(例如，透明質(zhì)酸)；糖醇的聚合物，例如聚山梨醇和聚甘露醇；肝素或類肝素；或其任何組合，此并不具有限制意義。葡萄糖是本發(fā)明實施例的第一碳源。當阿拉伯糖用作誘導物時，其也作為第二碳源，盡管其也可作為第一碳源。根據(jù)一實施例，所述碳源包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、蔗糖、L-肌醇、D-甘露醇、β-D-果糖、α-L-鼠李糖、D-木糖、纖維素、或其任何組合中的任何一種。本發(fā)明可使用一種或多于一種碳源。
細菌表達系統(tǒng)和質(zhì)粒 本發(fā)明也提供包含表達載體(例如質(zhì)粒)的重組細菌細胞，所述表達載體包含具有啟動子序列和起始子序列的表達控制序列和編碼期望多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于所述啟動子和起始子序列的3′端。所屬領域的技術人員基于本文所提供的揭示內(nèi)容應了解，本發(fā)明涵蓋任何適宜表達控制序列和宿主細胞/克隆載體。
適宜表達控制序列和宿主細胞/克隆載體組合已為所屬領域的技術人員所熟知，且闡述于(例如)薩姆布魯克(Sambrook，J.)，弗里奇(E.F.Fritsch)和瑪尼蒂斯(T.Maniatis)，1989，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold SpringHarbor)，紐約(NY)。通常，重組DNA技術涉及通過合成或分離獲得編碼所關注重組蛋白質(zhì)的DNA序列并將其引入到合適載體/宿主細胞表達系統(tǒng)(所述序列在其中表達)中，優(yōu)選地在阿拉伯糖誘導型啟動子的控制下。所述用于將DNA插入到表達載體中的任何方法都可用于將啟動子和其它調(diào)節(jié)控制元件連接到所選重組載體內(nèi)的特異性位點中。隨后通過習用技術用所述載體或質(zhì)粒將適宜宿主細胞轉(zhuǎn)化、感染、轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染。
多種宿主細胞-載體(質(zhì)粒)系統(tǒng)可用于表達所關注的重組蛋白質(zhì)。載體系統(tǒng)(例如包括阿拉伯糖誘導型啟動子的系統(tǒng))與所用宿主細胞相容。將編碼所關注重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物的DNA插入到表達系統(tǒng)中，并將啟動子(優(yōu)選為阿拉伯糖誘導型啟動子)和其它控制元件連接到載體內(nèi)的特異性位點中，以使當將載體插入到宿主細胞(視所用宿主細胞-載體系統(tǒng)通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染進行)中時編碼所關注重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物的DNA被宿主細胞表達。
載體可選自上文所述病毒載體或非病毒載體中的一種，但必須與所用宿主細胞相容。可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染等(視載體/宿主細胞系統(tǒng)而定)將重組DNA載體引入到合適宿主細胞(細菌、病毒、酵母、哺乳動物細胞或其類似物)中。宿主載體系統(tǒng)包括但不限于經(jīng)噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細菌。
所關注重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物在原核生物中的表達可在任何適宜細菌種類或菌株(例如大腸桿菌)中用含有引導融合或非融合蛋白質(zhì)表達的組成型或誘導型啟動子的載體來實施。
融合載體添加多個氨基酸到在其中編碼的蛋白質(zhì)上，到重組蛋白質(zhì)的氨基或羧基末端上。所述融合載體通常用于三個目的1)增強重組蛋白質(zhì)的表達；2)提高重組蛋白質(zhì)的溶解性；和3)通過在親和純化中作為配體幫助重組蛋白質(zhì)純化。通常，在融合表達載體中，在融合部分與重組蛋白質(zhì)的連接點處引入蛋白水解切割位點以使在融合蛋白質(zhì)純化后重組蛋白質(zhì)能夠與融合部分分開。所述酶和其同源識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。
典型融合表達載體包括Pgex(法瑪西亞生物技術公司(Pharmacia Biotech Inc)；史密斯(Smith)和約翰遜(Johnson)，1988)、Pmal(新英格蘭生物實驗室(New EnglandBiolabs)，貝弗利(Beverly)；馬薩諸塞州(Mass.))和Prit5(法瑪西亞(Pharmacia)，皮斯卡塔韋(Piscataway)，新澤西州(N.J.))，其分別使谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)A融合到靶重組蛋白質(zhì)上。
適宜誘導型非融合大腸桿菌表達載體的實例包括pTrc(阿曼(Amann)等人，(1988)可用于在大腸桿菌中表達非融合和融合蛋白的緊密調(diào)節(jié)的tac啟動子載體(Tightlyregulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins inEscherichia coli)，基因(Gene)，69，301-315)和Pet lid(斯達迪爾(Studier)等人，(1990)使用T7RNA聚合酶引導克隆基因表達(Use of T7 RNA polymerase to direct expressionof cloned genes)，酶學方法(Methods in Enzymology)，185，60-89)。由pTrc載體表達靶基因依賴于雜合體trp-lac融合啟動子的宿主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。由Pet lid載體表達靶基因依賴于由共表達的病毒RNA聚合酶J7gnl介導的T7gnl 0-lac融合啟動子轉(zhuǎn)錄。此病毒聚合酶是在lacUV5啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下由宿主菌株BL21(DE3)或HMS I74(DE3)自含有T7gnl基因的駐留原噬菌體提供。
根據(jù)一實施例，載體構建體的調(diào)節(jié)序列是誘導型啟動子。使用誘導型啟動子允許在常規(guī)培養(yǎng)和擴展添加期間由細胞產(chǎn)生較低基本量的激活蛋白質(zhì)。隨后，可對細胞進行誘導以在產(chǎn)生或篩選期間表達大量期望蛋白質(zhì)。誘導型啟動子可自細胞或病毒基因組分離。
可由外源提供的化合物調(diào)節(jié)的誘導型啟動子包括(但不限于)阿拉伯糖啟動子、鋅誘導型羊金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(dexamethasone)(Dex)誘導型小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統(tǒng)(WO98/10088)；蛻皮激素昆蟲啟動子(諾(No)等人，1996，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，933346-3351)、四環(huán)素抑制型系統(tǒng)(高森(Gossen)等人，1992，美國國家科學院院刊，895547-5551)、四環(huán)素誘導型系統(tǒng)(高森等人，1995，科學(Science)，2681766-1769，也可參見哈維(Harvey)等人，1998，化學生物學新觀點(Curr.Opin.Chem Biol)，2512-518)、RU486誘導型系統(tǒng)(王(Wang)等人，1997，自然生物技術(Nat.Biotech.)，15239-243和王(Wang)等人，1997，基因治療(Gene Ther.)，4432-441)和雷帕霉素(rapamycin)誘導型系統(tǒng)(瑪噶瑞(Magari)等人，1997，臨床研究期刊(J.Clin.Invest.)，1002865-2872)。根據(jù)本發(fā)明一實施例，啟動子是阿拉伯糖誘導型啟動子。
所屬領域的技術人員基于本文所提供的揭示內(nèi)容應了解，本發(fā)明涵蓋使用任何適宜細菌宿主細胞。例如，適用于此目的的細菌包括(但不限于)埃希氏桿菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、固氮菌屬(Azotobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷菌屬(Serratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、根瘤菌屬(Rhizobia)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)、副球菌屬(Paracoccus)或其組合。本發(fā)明也涵蓋任何所述適宜細菌的任何適宜菌株。此外，所屬領域的技術人員應認識到，本發(fā)明也涵蓋使用適宜突變細胞。所屬領域的技術人員基于本文所提供的指導能夠容易地選擇適于在特定環(huán)境中使用的宿主細胞。
適宜誘導型大腸桿菌表達載體的實例包括但不限于pTrc(阿曼(Amann)等人，1988，基因(Gene)，69301-315)、阿拉伯糖表達載體(例如，Pbad18，古茲曼(Guzman)等人，1995，細菌學雜志(J.Bacteriol.)，1774121-4130)和pETIId(斯達迪爾(Studier)等人，1990，酶學方法(Methods in Enzymology)，18560-89)。由pTrc載體表達靶基因依賴于雜合體trp-lac融合啟動子的宿主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。由pETIId載體表達靶基因依賴于由共表達的病毒RNA聚合酶T7gn1介導的T7gn10-lac融合啟動子轉(zhuǎn)錄。此病毒聚合酶是在lacUV5啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下由宿主菌株BL21(DE3)或HMS I74(DE3)自含有T7gn1基因的駐留原噬菌體提供。PBAD系統(tǒng)依賴于由araC基因調(diào)節(jié)的誘導型阿拉伯糖啟動子?？稍诎⒗谴嬖谙抡T導所述啟動子。
本發(fā)明的其它實施例使用阿拉伯糖調(diào)節(jié)的表達載體或其中所關注重組蛋白質(zhì)的表達是在阿拉伯糖啟動子(例如，用于大腸桿菌阿拉伯糖操縱子的啟動子)控制下進行的載體PBAD或PARA，此并不具有限制意義。
本發(fā)明涵蓋編碼任何期望蛋白質(zhì)的核酸(核苷酸)序列。核苷酸序列可為完整或部分天然存在的核苷酸序列或完整或部分經(jīng)改變的核苷酸序列、或在嚴格條件下與其雜交的任何序列。本文中提及對應于基因的核酸序列是指可以期望蛋白質(zhì)表達的任何核酸序列。
例如，所述經(jīng)改變的核酸序列包括一個核苷酸缺失、取代(包括轉(zhuǎn)換和顛換)、或插入，且其中所述改變可能發(fā)生在參考核苷酸序列的5′或3′末端位置或介于所述末端位置之間的任何地方，其各散布于參考序列中的核苷酸中或散布于參考序列內(nèi)的一或多個鄰近基團中。核苷酸改變的數(shù)量是通過以下來測定將任何序列中核苷酸的總數(shù)與各自一致性百分比的數(shù)值百分比(除以100)相乘并從所述序列中的所述核苷酸總數(shù)中減去乘積。
例如，本發(fā)明涵蓋使用與某一核酸序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；其簡并變體或其片段，其中所述序列在核酸序列的整個聚核苷酸區(qū)域內(nèi)可包括至多nn個核酸改變，其中nn是改變的最大數(shù)且通過下式來計算 nn＝xn-(xn·y)， 其中xn是任何序列的核酸總數(shù)且y值為0.70，其中在將xn和y的任何非整數(shù)乘積四舍五入到最接近的整數(shù)之后從xn中減去所述乘積。當然，y值也可為0.80(對于80％)、0.85(對于85％)、0.90(對于90％)、0.94(對于94％)、0.95(對于95％)、0.96(對于96％)、0.97(對于97％)、0.98(對于98％)、或0.99(對于99％)等。序列改變可在所述編碼序列中產(chǎn)生無義、誤義或移碼突變且在所述改變后由此改變聚核苷酸所編碼的多肽。
本發(fā)明涵蓋使用其簡并變體或片段。本文所定義的“簡并變體”是由遺傳密碼的簡并性所產(chǎn)生的不同于核苷酸序列(及其片段)但仍編碼相同蛋白質(zhì)的聚核苷酸。
所述核酸可包含DNA、染色體DNA、cDNA和RNA且可進一步包含異源核苷酸。按照各個實施例，所述核酸可在高度嚴格雜交條件下與某一核酸、其補體、其簡并變體、或其片段雜交。在再一些實施例中，聚核苷酸可在中等嚴格雜交條件下雜交。
應了解，所述核酸可自天然、合成或半合成來源獲得；而且，核苷酸序列可為天然存在的序列，或可通過突變(包括單或多堿基取代、缺失、插入和倒位)與所述天然存在的序列相關聯(lián)。核酸分子可為RNA、DNA、單鏈或雙鏈、線性或共價閉環(huán)形式。
嚴格條件的實例顯示于下表嚴格條件中高度嚴格條件是至少如(例如)條件A-F一樣嚴格者；嚴格條件是至少如(例如)條件G-L一樣嚴格者；且降低的嚴格條件是至少如(例如)條件M-R一樣嚴格者。
嚴格條件 bpI雜合體長度是雜交聚核苷酸的雜交區(qū)的預計長度。當將聚核苷酸與未知序列的靶聚核苷酸雜交時，雜合體長度假定為雜交聚核苷酸的長度。當雜交已知序列的聚核苷酸時，雜合體長度可通過比對聚核苷酸序列并識別出具有最佳序列互補性的一或多個區(qū)域來測定。
緩沖液H可用SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mMEDTA，pH值為7.4)代替雜交和洗滌緩沖液中的SSC(1xSSC是0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)；在雜交完成后實施洗滌15分鐘。
TB至TR長度預計小于50個堿基對的雜合體的雜交溫度應較所述雜合體的解鏈溫度(Tm)低5-10EC，其中Tm可根據(jù)以下等式確定。對于長度小于18個堿基對的雜合體來說，Tm(EC)＝2(A+T堿基的數(shù)量)+4(G+C堿基的數(shù)量)。對于長度介于18與49個堿基對之間的雜合體來說，Tm(EC)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是所述雜合體中堿基的數(shù)量，且[Na+]是雜交緩沖液中鈉離子的濃度(對于1×SSC來說，[Na+]＝0.165M)。
用于聚核苷酸雜交的嚴格條件的額外實例提供于薩姆布魯克(Sambrook，J.)，弗里奇(E.F.Fritsch)和瑪尼蒂斯(T.Maniatis)，1989，分子克隆實驗室手冊(MolecularCloningA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，紐約(NY)，第9和11章和最新分子生物學實驗方法匯編(Current Protocols in Molecular Biology)，1995，奧蘇貝爾(F.M.Ausubel)等人，編輯，約翰威立父子(John Wiley & Sons)公司，第2.10和6.3-6.4部分，其以引用方式并入本文中。
本發(fā)明涵蓋使用與所述聚核苷酸完全互補的聚核苷酸以及反義序列。反義序列也稱為反義寡核苷酸，其包括阻斷編碼本發(fā)明多肽的聚核苷酸表達的內(nèi)部產(chǎn)生和外部投與的序列二者。本發(fā)明的反義序列包含(例如但不限于)約15-20個堿基對。可對反義序列進行設計以(例如)通過阻止啟動子與上游非轉(zhuǎn)譯序列結合或通過阻止編碼本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)譯(通過阻止核糖體結合)抑制轉(zhuǎn)錄。
所屬領域的技術人員應了解，所述聚核苷酸可以任何適宜方式(例如，通過化學合成、自DNA庫、自生物體本身)制備或獲得且可采取多種形式(例如，單鏈、雙鏈、載體、探針、引物)。術語“聚核苷酸”包括DNA和RNA、以及其類似物，例如含有經(jīng)修飾主鏈者。隨著本發(fā)明的進一步實施，所述聚核苷酸包含DNA庫，例如cDNA庫。
2086蛋白質(zhì)表達系統(tǒng) 本發(fā)明實施例提供能夠表達腦膜炎奈瑟菌血清群B(Neisseria meningitidisserogroup B)2086多肽的重組微生物。所述重組微生物包含具有啟動子序列和起始子序列的表達控制序列和編碼2086多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于啟動子和起始子序列的3′端。又一方面，本發(fā)明提供包含如本文和WO 03/063766和WO04/094596中所述的重組2086聚核苷酸的宿主細胞，所述專利案的全部內(nèi)容均以引用方式并入本文中。因此，本發(fā)明提供產(chǎn)生如(例如但不限于)WO 03/063766和WO04/094596中所述的重組2086蛋白質(zhì)的方法。
在通過用含有對應2086聚核苷酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染宿主細胞以構建表達本發(fā)明期望蛋白質(zhì)或多肽的宿主細胞后，按照本發(fā)明方法在可表達多肽的條件下對宿主細胞進行培養(yǎng)。隨后可通過所屬領域的技術人員所熟知的技術將多肽分離出來，所分離出來的多肽基本上不含雜質(zhì)宿主細胞組份。
閾值參數(shù) 可使用數(shù)個參數(shù)來監(jiān)測和控制培養(yǎng)進程的細胞生長和重組蛋白質(zhì)表達。所述參數(shù)包括(但不限于)光密度(OD)、溶解氧(DO)、pH值、營養(yǎng)物/能量消耗(例如碳源)、代謝副產(chǎn)物(例如，乙酸)累積、收獲時間、和溫度。所屬領域的技術人員基于本文所提供的指導應了解，本發(fā)明涵蓋使用任何適宜參數(shù)或參數(shù)的組合。
確立閾值參數(shù)以確定將誘導物連續(xù)添加到培養(yǎng)物中的時間(即，經(jīng)一段時間補加到培養(yǎng)物中)。閾值參數(shù)是預定參數(shù)。所屬領域的技術人員基于本文所提供的指導按照本發(fā)明的各個實施例可容易地確定合適閾值參數(shù)(例如預定光密度)?？墒褂靡粋€閾值參數(shù)或閾值參數(shù)的組合。
可在培養(yǎng)期間以任何適宜時間間隔對參數(shù)或參數(shù)的組合予以監(jiān)測。例如，OD600和葡萄糖濃度可以一小時、半小時或四分之一小時間隔予以監(jiān)測，此并不具有限制意義。
按照本發(fā)明實施例，光密度可用作開始連續(xù)補加誘導物的閾值參數(shù)。當培養(yǎng)物的細胞密度達到預定閾值參數(shù)(例如光密度為約70至約110)時，則如本文所述向培養(yǎng)物中補加誘導物?？纱_立較為狹窄的閾值參數(shù)范圍。例如，按照本發(fā)明實施例，本發(fā)明涵蓋當培養(yǎng)物的細胞密度達到約70至約105、約75至約100、約75至約95、約75至約85、約76至約84、約78至約82、或約80的光密度時我們開始向培養(yǎng)物中連續(xù)添加誘導物。
本發(fā)明也涵蓋使用可指示開始和/或結束補加碳源的閾值參數(shù)。
所屬領域的技術人員應了解，本發(fā)明涵蓋使用任何適宜裝置或裝置的組合來監(jiān)測一或多個閾值參數(shù)。例如，可以任何適宜方式將用于測量閾值參數(shù)的探針或探針組合安裝在發(fā)酵裝置(“發(fā)酵罐”)上，此并不具有限制意義。
恒定補料速度 恒定補料速度是指以此速度將一或多種誘導物和/或一或多種碳源添加到培養(yǎng)物中。在達到閾值參數(shù)后，將誘導物添加到培養(yǎng)物中。也可在達到閾值參數(shù)后將碳源添加到培養(yǎng)物中(且同樣，在達到閾值參數(shù)后停止添加碳源)。這些閾值參數(shù)包括(但不限于)光密度(OD)、溶解氧(DO)、pH值、培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的濃度、添加到培養(yǎng)基中的第一碳源的總濃度、或其任何組合。
所屬領域的技術人員基于本文所提供的指導應了解，可使用任何適宜恒定速度將誘導物和/或碳源添加到培養(yǎng)物中。按照本發(fā)明的各個實施例，如下文實例中所述，通過DO恒定來確定適宜恒定速度。例如，可通過每小時添加足量葡萄糖使?jié)舛雀哌_15和24g/L來選擇等效于DO恒定控制器的補料速度，此并不具有限制意義。
例如，可將誘導物和/或碳源以恒定速度添加到培養(yǎng)物中直到已將一定量的誘導物和/或碳源添加到培養(yǎng)物中，例如基于培養(yǎng)物的總體積約4g/L至約40g/L，例如，4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、9.5g/L、9.75g/L、10g/L、10.25g/L、10.5g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L.25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、31g/L、32g/L、33g/L、34g/L、35g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L，此并不具有限制意義。根據(jù)各個實施例，補加到培養(yǎng)物中的誘導物和/或碳源的總量為約5g/L至約20g/L、7g/L至約15g/L、8g/L至約14g/L、9g/L至約11g/L、或約10g/L。
擬添加到培養(yǎng)物中的誘導物的總量可被已添加到培養(yǎng)物中的碳源的總量抵消。例如，當碳源是葡萄糖且誘導物是阿拉伯糖時，添加葡萄糖可使所添加誘導物的量減小。例如，在實施例中，向培養(yǎng)物中總共添加10g/L誘導物(即，例如阿拉伯糖)且添加11g/L碳源(例如葡萄糖)。以此方式獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)量近似于使用總量為20g/L的阿拉伯糖(即，在1,000L培養(yǎng)物中總共20,000g或20kg阿拉伯糖)且不使用葡萄糖時的產(chǎn)量。因此，考慮到相對于葡萄糖來說阿拉伯糖價格較高，本發(fā)明方法提供的此抵消甚為有利。
根據(jù)本發(fā)明的各個實施例，將誘導物和/或碳源添加到培養(yǎng)物中的恒定速度可設定在每小時約1.5g/L至約24g/L范圍內(nèi)。例如，在碳源是葡萄糖的情況下，用于添加葡萄糖的恒定速度可包括(但不限于)1.8g葡萄糖/L/h、3.3g葡萄糖/L/h、6.7g葡萄糖/L/h、15g葡萄糖/L/h、16.4g葡萄糖/L/h、18g葡萄糖/L/h、24g葡萄糖/L/h等。根據(jù)各個實施例，可以約1.5g/L/h至約16g/L/h的恒定速度添加諸如阿拉伯糖等誘導物。
根據(jù)各個實施例，在達到閾值參數(shù)后，可繼續(xù)、停止或暫時中斷碳源補加。在其中在達到開始補加的閾值后將重新開始以恒定速度補加的情況下可能中斷碳源補加。因此，根據(jù)一實施例，可利用開始閾值和停止閾值來調(diào)節(jié)碳源到培養(yǎng)物中的補加。根據(jù)另一實施例，基于閾值參數(shù)以恒定速度補加葡萄糖和阿拉伯糖二者而沒有停止或重新開始補加的情況。
所屬領域的技術人員基于本文所提供的指導可容易地確定擬添加到任何特定培養(yǎng)物中的碳源的合適總量。根據(jù)本發(fā)明一實施例，添加到培養(yǎng)物中的碳源的總量可在約1g/L至約100g/L(基于以升計培養(yǎng)物的總體積)范圍內(nèi)。例如，根據(jù)一實施例，在生長期期間添加50g/L葡萄糖，此以培養(yǎng)基中的10g/L開始，在葡萄糖含量達到零時開始以恒定速度補加葡萄糖，并繼續(xù)以恒定速度補加葡萄糖直到OD達到80，此時除開始的10g/L葡萄糖外已補加約40g/L葡萄糖。根據(jù)一實施例，以濃縮形式提供總量碳源以便于衡量?？扇菀椎貙⑦@些量轉(zhuǎn)化成擬在特定環(huán)境中使用的碳源的總質(zhì)量。例如，當擬向1,000L培養(yǎng)物中添加10g/L碳源時，擬添加的碳源的總量可容易地確定為10g/LX1.000L＝10,000克(或10kg)總碳源。按照本文所述的各個實施例，所添加碳源的總量可作為閾值參數(shù)。
所屬領域的技術人員基于本文所提供的指導可容易地確定擬添加到任何特定培養(yǎng)物中的誘導物的合適總量。按照各個實施例，添加到培養(yǎng)物中的誘導物的總量可在約4g/L至約40g/L(基于以升計培養(yǎng)物的總體積)范圍內(nèi)。根據(jù)各個實施例，基于培養(yǎng)物的總體積，添加到培養(yǎng)物中的碳源的總量為約5g/L至約20g/L、7g/L至約15g/L、8g/L至約14g/L、9g/L至約11g/L、或約10g/L。根據(jù)一實施例，以濃縮形式提供總量誘導物以便于衡量?？扇菀椎貙⑦@些量轉(zhuǎn)化成擬在特定環(huán)境中使用的誘導物的總質(zhì)量。例如，當擬向1,000L培養(yǎng)物中添加10g/L誘導物時，擬添加的誘導物的總量可容易地確定為10g/L X 1.000L＝10,000克(或10kg)總誘導物。
新鮮培養(yǎng)基在接種宿主細胞時通常含有起始量的第一碳源，由此產(chǎn)生培養(yǎng)物?？杀O(jiān)測此起始濃度且第一碳源的濃度用作閾值參數(shù)。
也可將合適量的除碳源之外的任何適宜補充物或營養(yǎng)物補加到培養(yǎng)物中?？蓪ζ渌鼱I養(yǎng)物或補充物予以監(jiān)測并適當設定閾值。本發(fā)明涵蓋使用諸如氮或無機磷酸鹽來源等補充物。本發(fā)明方法所涵蓋使用的化合物的非限制性實例包括KH2PO4、K2HPO4、檸檬酸鈉二水合物、(NH4)2SO4、MgSO4、(Na)2SO4、CaCl2、FeSO4、氯霉素或其任何組合。也涵蓋使用其它碳源或來源。
光密度和對數(shù)生長期 將細菌宿主細胞引入到新鮮培養(yǎng)基中可產(chǎn)生通常經(jīng)歷以下四個或多或少不同的生長期的培養(yǎng)物(i)滯后期，(ii)對數(shù)(對數(shù)或指數(shù))期，(iii)靜止期，和(iv)衰亡(死亡)期。對數(shù)期本身又可分成多個階段，例如對數(shù)生長期早期、對數(shù)生長期中期和對數(shù)生長期晚期。光密度與對數(shù)生長期有關。對數(shù)生長期和光密度也可用作指示開始和/或停止連續(xù)補加碳源和/或誘導物的閾值參數(shù)。
例如，誘導或連續(xù)添加誘導物可開始于對數(shù)生長期早期、對數(shù)生長期中期和對數(shù)生長期晚期。對數(shù)生長期晚期可在OD為約70至約110時發(fā)生。在本發(fā)明實施例中，按照各個實施例，以恒定速度補加誘導物開始于培養(yǎng)基的對數(shù)生長期晚期或OD為約70至約110、約70至約105、約75至約85、或約80時。
可在所屬領域的技術人員通常使用的多個波長下測量OD。通常，OD600用作培養(yǎng)物中細胞生長和細胞密度的指標。除非另外說明，否則本文所用的“OD”是指OD600。
溶解氧 可用作用于開始和/或停止補料控制器的觸發(fā)因素的另一參數(shù)是溶解氧(DO)(即，DO恒定補料分批發(fā)酵)。DO可通過調(diào)節(jié)攪動、空氣流、氧氣補充和含有培養(yǎng)基的容器中的壓力予以控制?？蓪O的閾值設定在5％至80％DO范圍內(nèi)，例如，20％、40％或80％。在達到閾值后，開啟碳源或誘導物的補料控制器，直到達到指示停止控制補加的閾值。所述停止閾值可為另一DO閾值或另一參數(shù)，例如碳源或誘導物的量。例如，按照本發(fā)明的各個實施例，每當培養(yǎng)基中的DO上升到30％或40％以上時，補料控制器即開啟，直到DO降到20％，或另一選擇為，直到新近添加了0.5g/L或1g/L碳源或誘導物。
pH值 可用作用于開始和/或停止補料控制器的觸發(fā)因素的另一參數(shù)是pH值(即，pH值恒定補料-分批發(fā)酵)。pH值可通過向培養(yǎng)基中添加堿或酸來控制?？蓪H值的閾值設定在6.8至7.2范圍內(nèi)，例如7.0。在達到閾值后，開啟碳源或誘導物的補料控制器，直到達到指示停止控制補加的閾值。所述停止閾值可為另一pH值閾值或另一參數(shù)，例如碳源或誘導物的量。例如，按照本發(fā)明的各個實施例，每當培養(yǎng)基的pH值上升到6.97時，補料控制器即開啟，直到pH值降到6.95，或另一選擇為，直到新近添加了1g/L碳源或誘導物。
收獲時間 收獲時間代表在開始誘導或添加誘導物后經(jīng)歷時間的量。本發(fā)明涵蓋任何適宜收獲時間。按照本發(fā)明的各個實施例，收獲時間可在約2小時至約10小時、約2小時至約8小時、約2.5小時至約7小時、約3小時至約6小時等范圍內(nèi)。使用所述恒定補料速度、收獲時間和誘導物總量，所屬領域的技術人員應了解如何對每個參數(shù)進行調(diào)節(jié)以達成期望結果。因為所屬領域的技術人員基于補料速度和時間段可容易地確定補料的量，所以他們應了解基于所補加的阿拉伯糖的量何時收獲。以此方式，在3小時內(nèi)補加的誘導物的最終濃度可達到(例如但不限于)5、10、20、30和40g/L。
誘導物的濃度 本發(fā)明涵蓋誘導物的任何適宜濃度?？捎糜谡T導宿主細胞的誘導物的濃度可在約0.00001％至約20％(v/v)范圍內(nèi)，此并不具有限制意義。
溫度 本發(fā)明實施例的培養(yǎng)物可在允許細胞生長的任何溫度下進行培育。與充足生長有關的培育培養(yǎng)物的多個溫度包括(但不限于)22℃、28℃、37℃、或其任何組合。
發(fā)酵裝置 所屬領域的技術人員應了解，本發(fā)明涵蓋使用任何適宜發(fā)酵裝置(即，“發(fā)酵罐”)。例如，發(fā)酵罐可含有任何數(shù)量的槳葉(例如，魯施頓(Rushton)槳葉)、進口和/或測量探針。按照一實施例，發(fā)酵罐經(jīng)構造以包括三片魯施頓槳葉和用于將空氣引入到發(fā)酵罐中的環(huán)式或管式分布器。本發(fā)明涵蓋使用手動和/或基于計算機的系統(tǒng)。因此，發(fā)酵系統(tǒng)可與計算機化系統(tǒng)連接以監(jiān)測和控制發(fā)酵。以此方式，按照本發(fā)明實施例，所述系統(tǒng)可完全或部分自動化。
本發(fā)明組合物 按照本發(fā)明實施例，本發(fā)明提供包含重組蛋白質(zhì)的組合物，例如按照本發(fā)明方法所制備的組合物。本發(fā)明組合物在培養(yǎng)物中包含高密度的重組蛋白質(zhì)，例如(并不意欲限于此)按照本發(fā)明方法制備的重組蛋白質(zhì)。
所述組合物包含一種培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物具有基于培養(yǎng)物的總體積，密度為至少約1.5g/L的重組蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的又一實施例，基于培養(yǎng)物的總體積，重組蛋白質(zhì)的密度為至少約1.7g/L。根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，基于培養(yǎng)物的總體積，重組蛋白質(zhì)的密度為至少約2.0g/L。根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，基于培養(yǎng)物的總體積，重組蛋白質(zhì)的密度為至少約3.0g/L。
本發(fā)明實施例提供包含重組2086蛋白質(zhì)的組合物。如本文所提及的2086蛋白質(zhì)是由對應于腦膜炎奈瑟菌血清群B中的2086基因的聚核苷酸表達的蛋白質(zhì)，包括其任何片段、衍生物或突變體。非限制性實例性2086蛋白質(zhì)和聚核苷酸闡述于WO03/063766和WO 04/094596中。
所述重組2086蛋白質(zhì)組合物包含培養(yǎng)物中的重組2086蛋白質(zhì)，其中基于培養(yǎng)物的總體積，重組2086蛋白質(zhì)的密度為至少約1.5g/L。根據(jù)本發(fā)明的又一實施例，基于培養(yǎng)物的總體積，重組2086蛋白質(zhì)的密度為至少約1.7g/L。根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，基于培養(yǎng)物的總體積，重組2086蛋白質(zhì)的密度為至少約2.0g/L。根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，基于培養(yǎng)物的總體積，重組2086蛋白質(zhì)的密度為至少約3.0g/L。
本發(fā)明組合物可包含任何蛋白質(zhì)，例如按照本發(fā)明方法所制備的蛋白質(zhì)。重組蛋白質(zhì)可為脂化或未脂化蛋白質(zhì)。在本發(fā)明實施例中，重組蛋白質(zhì)是脂化或未脂化重組2086蛋白質(zhì)。重組2086蛋白質(zhì)可為2086亞科A或亞科B蛋白質(zhì)、或其組合。本發(fā)明組合物可包括一種蛋白質(zhì)或多于一種蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)可為相關或無關蛋白質(zhì)。例如，本發(fā)明組合物可包括對應于一或多種亞科A菌株和/或一或多種亞科B菌株的2086蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也提供包含可用于實施本發(fā)明方法的物質(zhì)的組合物。按照本發(fā)明實施例，所述組合物包括培養(yǎng)物的必需組份，必需組份包括重組細胞和營養(yǎng)物。按照本發(fā)明實施例，多種組合物可以試劑盒形式一起提供。例如，可方便地將所需量的用以形成培養(yǎng)物的組份進行預先包裝以便于在實驗室或工業(yè)環(huán)境中使用，此并不具有限制意義。按照本發(fā)明的各個實施例，所述試劑盒也可包括有助于使用每一組份和合并組份方式的標簽、標記和說明書。
本發(fā)明包括以下實例以闡釋本發(fā)明的各個實施例。所屬領域的技術人員應了解，下列實例中所揭示的技術代表本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的可良好用于實施本發(fā)明的技術，且因此可認為這些技術構成用于實施本發(fā)明的多種模式。然而，所屬領域的技術人員根據(jù)本揭示內(nèi)容應了解，在所揭示具體實施例中可實施許多改變且仍可獲得類似或同樣結果，此并不背離本發(fā)明的精神和范圍。
實例 實例1恒定補料速度的補料-分批發(fā)酵 大腸桿菌(pPW62)亞科B用作補料-分批發(fā)酵方法的模型菌株?；诮Y果，此方法適用于亞科A大腸桿菌(pPW102)。
使用下表中所列示的組份來制備用于補料-分批發(fā)酵的培養(yǎng)基和補料溶液。
培養(yǎng)基和補料溶液 表1基礎培養(yǎng)基
表21000x痕量金屬貯存液

表3葡萄糖濃縮物補料溶液
表4阿拉伯糖濃縮物補料溶液
方法 利用恒定補料速度的補料-分批發(fā)酵來達成高細胞密度大腸桿菌發(fā)酵。培養(yǎng)基中的起始葡萄糖濃度是10g/L。將發(fā)酵培養(yǎng)基中的(NH4)2SO4濃度增加到3g/L，但種子培養(yǎng)基中保持在1g/L。為確定補料速度，首先實施DO恒定的補料-分批發(fā)酵。借助可使攪動速度增加到最大并隨后利用氧氣補充的級聯(lián)控制器將DO含量控制在20％下。當葡萄糖耗盡時，DO急劇上升(大于40％)并將葡萄糖濃縮物添加到發(fā)酵罐中使其最終濃度為1g/L。在每次添加葡萄糖后，在允許進行下一次添加之前，使泵保持不工作達設定時間段。當實施DO恒定補料-分批發(fā)酵時，OD最大值可達到約160。隨后通過每小時添加足量葡萄糖使?jié)舛雀哌_18g/L或24g/L來選擇等效于DO恒定控制器的恒定速度。在以恒定速度補料的補料-分批發(fā)酵期間，當DO急劇上升到40％時開始以期望恒定速度補加葡萄糖。
使用1小瓶大腸桿菌(pPW62)/升基礎培養(yǎng)基+15μg/mL氯霉素在2800mL馮巴赫燒瓶(Fernbach flask)中開始種子培養(yǎng)。將燒瓶在32℃、150rpm下培育過夜(約16hr)。最終的OD600一般約等于3。使用10％接種量來接種每個發(fā)酵罐。每個發(fā)酵罐使用3片魯施頓槳葉和環(huán)式分布器。起始設定點溫度36℃，pH值7.00±0.05(用7.4N NH4OH控制)，空氣流約1vvm，DO20％。DO是由攪動(最小值150rpm，最大值1000rpm)和經(jīng)由氣體混合單元添加O2的級聯(lián)來控制。如果需要，通過手動添加PPG-2000來控制泡沫。在滅菌之前向培養(yǎng)基中添加0.35mL/L AF。在發(fā)酵期間，每小時取樣一次以監(jiān)測葡萄糖、pH值和OD600離線值。自1mL樣品制備上清液并儲存用于以后通過HPLC分析有機酸。
結果 恒定補料速度的補料-分批發(fā)酵 圖1顯示恒定補料速度下OD、葡萄糖消耗和乙酸累積的時間進程。在24g葡萄糖/L/h和18g葡萄糖/L/h恒定補料速度下獲得的OD最大值分別為158和150。當使用24g/L/h補料速度時，實驗期間葡萄糖累積較多，為28g/L。當使用18g/L/h補料速度時，葡萄糖累積到12g/L。在兩種情況下均產(chǎn)生較少乙酸(即，小于1.5g/L)。指數(shù)生長期結束時OD接近100。在兩種情況下具體生長速度約為0.60(hr-1)。
為減少葡萄糖累積，對16.4g/L/h和15g/L/h的低恒定補料速度進行研究。圖2顯示上文提及恒定補料速度下OD、葡萄糖消耗和乙酸累積的時間進程。OD的最大值分別為142和147。與先前實驗一樣，補料速度較快的培養(yǎng)物葡萄糖累積較多，盡管葡萄糖累積的量比先前實驗少很多。在16.4g/L/h期間累積約8g/L葡萄糖，而在15g/L/h發(fā)酵期間累積5.4g/L葡萄糖。在兩種情況下均產(chǎn)生較少乙酸(例如小于1.5g/L)(參見圖2)。在兩種情況下具體生長速度約為0.60(hr-1)。因此，具體生長速度不受介于15g/L/h與24g/L/h之間的補料速度影響。
在不同生長OD下進行誘導 因為15g葡萄糖/L/h的恒定補料速度達成較高細胞密度和較低葡萄糖和乙酸累積，所以使用其進行阿拉伯糖誘導研究。在此實驗中，將在對數(shù)生長期中期OD約為55時和在對數(shù)生長期晚期OD約為80時實施誘導進行比較。通過簡單地用阿拉伯糖補料代替葡萄糖補料并以13.4g/L/h的恒定速度補加阿拉伯糖來誘導培養(yǎng)物。經(jīng)3小時時間段將總共40g/L阿拉伯糖添加到每一培養(yǎng)物中。誘導后，每小時取樣一次以用于通過SDS-PAGE分析rLP2086、通過HPLC分析有機酸和阿拉伯糖。
圖3顯示在OD約為55和約為80下誘導時OD和rLP2086產(chǎn)生的時間進程。在OD約為80下誘導細胞時，OD的最大值和rLP2086產(chǎn)量二者均較高(OD的最大值101相對于84；最大產(chǎn)量1.8g/L相對于1.2g/L)。
用不同量的阿拉伯糖進行誘導 以下實驗的目的是對補加到培養(yǎng)物中的阿拉伯糖的總量進行評價并檢驗降低補加到培養(yǎng)物中的阿拉伯糖的總量是否仍然達成較高的rLP2086表達。將阿拉伯糖濃縮物分別以不同補料速度經(jīng)3小時時間段補加到4份不同的培養(yǎng)物中，使最終阿拉伯糖濃度為10、20、30和40g/L。所有培養(yǎng)物都在OD600約為80下進行誘導。圖4顯示OD和rLP2086產(chǎn)生的時間進程。表5概述四種條件中每一種條件的OD和rLP2086產(chǎn)量。其顯示，添加總共10g/L阿拉伯糖時rLP2086的最大產(chǎn)量為1.2g/L；添加總共20g/L阿拉伯糖時為1.6g/L；添加總共30g/L阿拉伯糖時為1.7g/L；添加總共40g/L阿拉伯糖時為2.0g/L。介于20g/L與40g/L之間的阿拉伯糖補料達成類似的rLP2086產(chǎn)量，然而，10g/L阿拉伯糖產(chǎn)生很少rLP2086(即，1.2g/L)。這些結果表明，添加用于誘導的阿拉伯糖的總量可自40g/L降低到20g/L，此并不會降低rLP2086的生產(chǎn)量。因此，尤其考慮到阿拉伯糖的價格較高(約為500美元/kg US)，阿拉伯糖使用量降低將更具成本有效性。
表5在不同阿拉伯糖含量下進行誘導
阿拉伯糖添加方法的比較 實施以下實驗以檢驗當使用阿拉伯糖進行誘導時連續(xù)補加策略是否優(yōu)于簡單分批添加策略。在X-BRN05-039實驗中，當OD為約80時，將20g/L阿拉伯糖同時添加到發(fā)酵罐中，而非經(jīng)一段時間補加。圖5顯示OD、葡萄糖和阿拉伯糖消耗、和rLP2086產(chǎn)生的時間進程。最多獲得1.3g/L rLP2086。雖然分批添加阿拉伯糖的操作較為簡單，但其較連續(xù)補加產(chǎn)生較少rLP2086。因此，連續(xù)阿拉伯糖補加策略優(yōu)于簡單分批添加。
為檢驗通過降低阿拉伯糖補料速度能否使阿拉伯糖的使用更加有效，對3.3g阿拉伯糖/L/h和6.7g阿拉伯糖/L/h補料速度進行比較。圖6顯示OD和rLP2086產(chǎn)生的時間進程。將阿拉伯糖濃縮物經(jīng)3小時時間段以6.7g/L/h補料速度補加到一份培養(yǎng)物中，并經(jīng)6小時時間段以3.3g/L/h速度補加到第二份培養(yǎng)物中。對于兩份培養(yǎng)物，所添加阿拉伯糖的總量均為20g/L。如圖6中所示，兩種條件能夠產(chǎn)生的rLP2086的最大量相同(即，2.2g/L)，但其產(chǎn)生動力學有所差異。較高的補料速度達成較高的產(chǎn)生速度。分別在6.7g/L/h和3.3g/L/h補料速度誘導后3小時和6小時時達到rLP2086的最大量。使用較高補料速度(即，6.7g/L/h)的優(yōu)勢在于使用較高補料速度比使用較低補料速度生產(chǎn)成本(例如，效用成本)低。
誘導時間對rLP2086表達產(chǎn)量的影響 為確定最佳收獲時間，將通常的補料分布(經(jīng)3小時補加20g/L阿拉伯糖)延長到經(jīng)6小時補加40g/L。在實驗X-BRN05-028和X-BRN05-029中，分別在OD約為55和OD約為80時誘導細胞。圖7顯示OD和rLP2086產(chǎn)生的時間進程。盡管阿拉伯糖補加自3小時延長到6小時，但有趣的是，仍在誘導后約3小時時獲得峰值效價。在較高OD下誘導的培養(yǎng)物中，產(chǎn)物效價略微較高。在OD約為55下誘導時rLP2086的最大產(chǎn)量為2.0g/L(X-BRN05-028)，而在OD約為80下誘導時最大產(chǎn)量為2.4g/L(X-BRN05-029)。此結果表明，應在誘導后3小時收獲細胞。
含鹽和不含鹽補料溶液的比較 為檢驗所添加的鹽在葡萄糖和阿拉伯糖補料溶液中是否必需，將普通葡萄糖和阿拉伯糖補料與標準葡萄糖+鹽(即，K2HPO4/KH2PO4+(NH4)2SO4)和阿拉伯糖+鹽補料進行比較。對于兩種培養(yǎng)物，均經(jīng)3小時時間段補加20g/L阿拉伯糖。生長分布和rLP2086產(chǎn)量分布非常類似。當向補料中添加鹽時rLP2086的最大產(chǎn)量為1.8g/L，且當所制備的葡萄糖和阿拉伯糖補料不含鹽時最大產(chǎn)量為2.0g/L。這些結果表明，沒有必要向葡萄糖和阿拉伯糖補料溶液中添加鹽。
亞科B菌株的恒定補料速度的補料-分批發(fā)酵 通過用1ml已解凍的工作種子接種含有15μg/mL氯霉素的1L基礎培養(yǎng)基開始種子培養(yǎng)。使培養(yǎng)物在2.8L馮巴赫燒瓶中生長并在32℃和150rpm下培育約16小時。最終OD600約為3.0。在無菌條件下將350mL種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有3g/L(NH4)2SO4但不含氯霉素的3.15L基礎培養(yǎng)基中。發(fā)酵物控制如下pH值為7.0±0.05(借助7.4N NH4OH控制)，溫度為36℃，DO為20％，且空氣流為1vvm。通過攪動(最小值150rpm，最大值1000rpm)和氧氣添加的級聯(lián)來控制DO。自動添加消泡劑PPG-2000以控制泡沫。在發(fā)酵期間，每小時取樣一次以監(jiān)測葡萄糖和OD離線值。接種后，DO自約100％降低到20％且隨后保持在20％。當DO自20％急劇上升到大于40％時(通常為6小時耗用發(fā)酵時間(EFT))，葡萄糖(不含鹽)補料泵開啟為15g/L/h速度。如圖8中所示，經(jīng)6小時EFT葡萄糖完全耗盡，導致DO急劇上升。當OD達到約40時每半小時取樣一次。在OD為90時停止葡萄糖補加并開始以13.4g/L/h速度補加阿拉伯糖。在補加3小時阿拉伯糖(不含鹽)(即，總共添加20g/L阿拉伯糖)后，停止補加阿拉伯糖并再繼續(xù)發(fā)酵1小時。如圖8中所示，所達成的OD為102且基于SDS-PAGE分析2.0g/L MnB rLP2086被表達(參見圖9)。在誘導后3小時(即，約12小時EFT)出現(xiàn)峰值。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡顯示所表達的蛋白質(zhì)確實為亞科B rLP2086。
補料-分批發(fā)酵方法應用于MnB rLP2086亞科A菌株 為測試用于rLP2086亞科B的所述補料-分批發(fā)酵方法是否適用于rLP2086亞科A，利用對于亞科B菌株所確立的程序?qū)嵤┐朔椒?。圖10顯示OD、葡萄糖和阿拉伯糖消耗、和rLP2086產(chǎn)生的時間進程。亞科A的生長分布和rLP2086產(chǎn)量分布與亞科B所獲得者類似(與圖8相比)。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡顯示所表達的蛋白質(zhì)確實為亞科A rLP2086(參見圖11)。表6列示六個不同亞科A實驗的OD最大值和rLP2086的最大表達產(chǎn)量。rLP2086的最大表達產(chǎn)量的范圍是1.5-2.1g/L(平均最大產(chǎn)量1.8±0.2g/L)，與來自用于生產(chǎn)rLP2086亞科B的補料-分批發(fā)酵的結果接近。因此，提出用于亞科B菌株的所述補料-分批發(fā)酵也適用于亞科A菌株。
表6亞科A rLP2086的最大表達產(chǎn)量和OD最大值
在阿拉伯糖誘導期間雙重補加葡萄糖和阿拉伯糖 為在不降低rLP2086產(chǎn)量的情況下降低所需阿拉伯糖的量，對誘導階段期間雙重補加葡萄糖和阿拉伯糖進行研究。策略為經(jīng)3hr補加10g/L阿拉伯糖(通常量的一半)，同時在誘導期期間以標準葡萄糖補料速度的25％(3.75g/L/h)、50％(7.5g/L/h)和100％(15g/L/h)繼續(xù)補加葡萄糖。所制備的所有補料(葡萄糖和阿拉伯糖)均不含添加劑。
圖12a、12b和12c顯示亞科B細胞生長、葡萄糖、阿拉伯糖、乙酸濃度、和rLP2086產(chǎn)生的時間進程。所有三個實驗均在OD約為80時進行誘導。如圖12a中所示，100％葡萄糖補料實驗的OD在誘導后繼續(xù)上升，峰值為117，而50％實驗的峰值為106(圖12b)且25％實驗的OD在誘導后保持在100左右(圖12c)。100％葡萄糖補料實驗在誘導后3小時時開始累積葡萄糖和阿拉伯糖。50％葡萄糖實驗僅在最后樣品中顯示微量葡萄糖(讀數(shù)為0.21g/L)。在25％葡萄糖實驗中無葡萄糖累積。三個實驗中均無任何阿拉伯糖累積。100％(圖12a)和50％(圖12b)葡萄糖補料實驗分別產(chǎn)生約1.5和1.7g/L rLP2086，而25％(圖12c)實驗產(chǎn)生超過2.1g/L的rLP2086。在阿拉伯糖用盡之前100％實驗產(chǎn)量達到峰值，表明rLP2086表達可能被葡萄糖和乙酸累積所抑制。50％實驗產(chǎn)量約在阿拉伯糖用盡時達到峰值且25％實驗產(chǎn)量在阿拉伯糖用盡之后達到峰值，此表明只要將葡萄糖濃度控制在最低水平(在圖12b和12c中無葡萄糖累積)2086表達可不受抑制。盡管僅10g/L阿拉伯糖補加到這些培養(yǎng)物中，但其rLP2086產(chǎn)量與補加20g/L時所獲得者接近。當在誘導期間將葡萄糖濃度控制在較低水平時，同時補加葡萄糖和阿拉伯糖可使阿拉伯糖消耗降低50％且仍然達成相同rLP2086產(chǎn)量。因此，可顯著降低化學品的成本。
為檢驗我們能否進一步降低阿拉伯糖消耗并提高rLP2086產(chǎn)量，對不同葡萄糖補料速度、阿拉伯糖補料的總量、和誘導OD進行研究。表7列示這些條件的不同組合。已顯示葡萄糖補料速度介于2.25與7.5g/L/h之間和阿拉伯糖補料速度介于1.7和6.7g/L/h之間不會顯著影響rLP2086的產(chǎn)量。誘導OD介于80與105之間獲得的rLP2086產(chǎn)量接近。
表7在不同葡萄糖補料速度、不同阿拉伯糖添加量、和于不同OD下進行誘導時OD的最大值和rLP2086的最大量
實例3按比例放大到100L規(guī)模的補料-分批發(fā)酵 通過用1ml(即，1小瓶)已解凍的工作種子接種含有15μg/mL氯霉素的2X1L基礎培養(yǎng)基開始種子培養(yǎng)。將2.8L馮巴赫燒瓶中的培養(yǎng)物在32℃和150rpm下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培育約16小時。
在無菌條件下將兩份1L過夜馮巴赫燒瓶種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有70L基礎培養(yǎng)基但不含氯霉素的150L發(fā)酵罐中?；A培養(yǎng)基中的150L發(fā)酵物控制如下pH值為7.0±0.05(借助7.4N NH4OH控制)，溫度為36℃，DO為20％，且空氣流為1vvm。通過攪動和氧氣添加的級聯(lián)來控制DO。自動添加消泡劑PPG-2000以控制泡沫。在發(fā)酵期間，DO自約100％降低到20％且保持在20％下。當DO自20％急劇上升到大于40％(通常在OD約為20下)時，指示葡萄糖已耗盡，開動補料泵以用15g葡萄糖/L發(fā)酵液/h的速度遞送葡萄糖濃縮物(即，500g/L)。在發(fā)酵期間，每小時取樣一次以監(jiān)測葡萄糖和OD離線值。當OD達到約40時，每半小時取樣一次。在OD達到約80后，停止補加葡萄糖并開始以6.7g阿拉伯糖/L發(fā)酵液/h的速度補加阿拉伯糖(例如，500g/L阿拉伯糖濃縮物)，持續(xù)3小時。
圖13a顯示100L規(guī)模時亞科B細胞生長、葡萄糖消耗、乙酸累積、和rLP2086產(chǎn)生的時間進程。100L規(guī)模的發(fā)酵分布與所觀察到的小規(guī)模的發(fā)酵分布類似。所獲得OD的最大值為99且rLP2086的最大產(chǎn)量為1.9g/L。這些結果表明補料-分批發(fā)酵可按比例縮放。
圖13b顯示100L規(guī)模時亞科A細胞生長、葡萄糖消耗、乙酸累積、和rLP2086產(chǎn)生的時間進程。100L規(guī)模的發(fā)酵分布與所觀察到的小規(guī)模的發(fā)酵分布類似。所獲得OD的最大值為96且rLP2086的最大產(chǎn)量為2.0g/L。這些結果表明補料-分批發(fā)酵可按比例縮放并且切實可行。
圖14a顯示100L規(guī)模時葡萄糖和阿拉伯糖雙重補料下亞科B細胞密度、葡萄糖、阿拉伯糖、乙酸濃度、和rLP2086產(chǎn)量的時間進程。在誘導期間，對于葡萄糖和阿拉伯糖補料，補料速度分別控制在3.75和1.67g/L/h。經(jīng)5小時雙重補加阿拉伯糖和葡萄糖。所獲得OD的最大值為90且rLP2086的最大產(chǎn)量為1.8g/L。在誘導4小時后rLP2086達到最大產(chǎn)量。對于亞科B來說，OD的平均最大值和rLP2086的平均最大產(chǎn)量分別為84.8±6.8和1.6±0.3g/L。這些結果表明，在誘導期期間雙重補加葡萄糖和阿拉伯糖的補料-分批發(fā)酵可按比例縮放。
圖14b顯示100L規(guī)模時亞科A細胞生長、葡萄糖消耗、乙酸累積、和rLP2086產(chǎn)生的時間進程。在與上一段落相同的條件下進行發(fā)酵并將細胞誘導6小時。所獲得OD的最大值為89且rLP2086的最大產(chǎn)量為1.8g/L。在誘導4小時后rLP2086達到最大產(chǎn)量。對于亞科A來說，OD的平均最大值是87.9±10.5且rLP2086的平均最大產(chǎn)量是1.8±0.2g/L。這些結果表明所述補料-分批發(fā)酵可按比例縮放并且切實可行。
盡管已參照多個實施例和實例對本發(fā)明予以闡述，但所屬領域的技術人員應認識到，可在不背離本發(fā)明精神和范圍下對其進行各種修改。
權利要求
1、一種生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，其包含
培養(yǎng)表達重組蛋白質(zhì)的重組細菌細胞，此包含向包含所述重組細菌細胞的培養(yǎng)物中連續(xù)添加碳源并在所述培養(yǎng)物達到閾值參數(shù)后向所述培養(yǎng)物中連續(xù)添加誘導物，和自所述培養(yǎng)物中分離所述重組蛋白質(zhì)。
2、如權利要求1所述的方法，其中所述閾值參數(shù)是光密度(OD)、溶解氧(DO)、培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的濃度、添加到培養(yǎng)基中的碳源的總濃度、或其任何組合。
3、如權利要求2所述的方法，其中所述閾值參數(shù)是所述培養(yǎng)物的光密度(OD)。
4、如權利要求3所述的方法，其包含當所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約70至約110OD600時向所述培養(yǎng)物中連續(xù)添加所述誘導物。
5、如權利要求4所述的方法，其包含當所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約70至約105OD600時向所述培養(yǎng)物中連續(xù)添加所述誘導物。
6、如權利要求5所述的方法，其包含當所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約75至約85OD600時向所述培養(yǎng)物中連續(xù)添加所述誘導物。
7、如權利要求6所述的方法，其包含當所述培養(yǎng)物的細胞密度達到約80OD600時向所述培養(yǎng)物中連續(xù)添加所述誘導物。
8、如權利要求1所述的方法，其包含以恒定速度將所述誘導物添加到所述培養(yǎng)物中、通過DO恒定補料將所述誘導物添加到所述培養(yǎng)物中或通過pH值恒定補料將所述誘導物添加到所述培養(yǎng)物中。
9、如權利要求1所述的方法，其包含以約3.35g/L/h至約16g/L/h的恒定速度將所述誘導物添加到所述培養(yǎng)物中、通過DO恒定補料或通過pH值恒定補料將所述誘導物添加到所述培養(yǎng)物中。
10、如權利要求1所述的方法，其中添加到所述培養(yǎng)物中的所述誘導物的總量為約4g/L至約40g/L。
11、如權利要求10所述的方法，其中在誘導物補料期間添加到所述培養(yǎng)物中的所述誘導物的總量為約5g/L至約20g/L。
12、如權利要求11所述的方法，其中在誘導物補料期間添加到所述培養(yǎng)物中的所述誘導物的總量為約7g/L至約15g/L。
13、如權利要求12所述的方法，其中在誘導物補料期間添加到所述培養(yǎng)物中的所述誘導物的總量為約10g/L。
14、如權利要求1所述的方法，其包含在所述方法開始后將所述誘導物連續(xù)添加到所述培養(yǎng)物中達約2至約8小時。
15、如權利要求14所述的方法，其包含在開始后將所述誘導物連續(xù)添加到所述培養(yǎng)物中達約3至約6小時。
16、如權利要求1所述的方法，其包含在開始將所述誘導物添加到所述培養(yǎng)物中之后約2至約8小時分離所述重組蛋白質(zhì)。
17、如權利要求16所述的方法，其包含在開始將所述誘導物添加到所述培養(yǎng)物中之后約3至約6小時分離所述重組蛋白質(zhì)。
18、如權利要求1所述的方法，其中所述誘導物是阿拉伯糖。
19、如權利要求1所述的方法，其包含在誘導之前將所述碳源連續(xù)添加到所述培養(yǎng)物中。
20、如權利要求1所述的方法，其包含在誘導之前和期間將所述碳源連續(xù)添加到所述培養(yǎng)物中。
21、如權利要求1所述的方法，其包含在將所述誘導物連續(xù)添加到所述培養(yǎng)物中的同時將所述碳源連續(xù)添加到所述培養(yǎng)物中。
22、如權利要求1所述的方法，其包含將所述碳源連續(xù)添加到所述培養(yǎng)物中直到所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約70至約110OD600。
23、如權利要求1所述的方法，其中所述碳源是基于糖的碳源。
24、如權利要求23所述的方法，其中所述基于糖的碳源是葡萄糖。
25、如權利要求24所述的方法，其中所述誘導物是阿拉伯糖。
26、如權利要求25所述的方法，其包含在將所述阿拉伯糖連續(xù)添加到所述培養(yǎng)基中的同時將所述葡萄糖連續(xù)添加到所述培養(yǎng)基中。
27、如權利要求25所述的方法，其包含連續(xù)添加所述葡萄糖直到所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約80OD600。
28、一種生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，其包含
a)在誘導型啟動子控制下將編碼重組蛋白質(zhì)的表達載體引入到細菌宿主細胞中以形成重組細菌細胞；
b)將所述重組細菌細胞引入到培養(yǎng)基中以形成細胞培養(yǎng)物；
c)以連續(xù)補料形式將碳源添加到所述細胞培養(yǎng)物中；
d)監(jiān)測所述細胞培養(yǎng)物中的細胞生長是否達到閾值光密度(OD600)；
e)在達到所述閾值光密度(OD600)后，以連續(xù)補料形式將所述誘導型啟動子的誘導物添加到所述細胞培養(yǎng)物中；和
f)自所述細胞培養(yǎng)物中分離所述重組蛋白質(zhì)。
29、如權利要求28所述的方法，其包含在所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約70至約110OD600時向所述培養(yǎng)物中連續(xù)添加所述誘導物。
30、如權利要求29所述的方法，其包含在所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約70至約105OD600時向所述培養(yǎng)物中連續(xù)添加所述誘導物。
31、如權利要求30所述的方法，其包含在所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約75至約85OD600時向所述培養(yǎng)物中連續(xù)添加所述誘導物。
32、如權利要求31所述的方法，其包含在所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約80OD600時向所述培養(yǎng)物中連續(xù)添加所述誘導物。
33、如權利要求28所述的方法，其中所述誘導物是以恒定速度添加到所述培養(yǎng)物中、所述誘導物是通過DO恒定補料添加到所述培養(yǎng)物中或所述誘導物是通過pH值恒定補料添加到所述培養(yǎng)物中。
34、如權利要求33所述的方法，其中所述誘導物是以約3.35g/L/h至約16g/L/h的恒定速度添加到所述培養(yǎng)物中、所述誘導物是通過DO恒定補料添加到所述培養(yǎng)物中或所述誘導物是通過pH值恒定補料添加到所述培養(yǎng)物中。
35、如權利要求28所述的方法，其中添加到所述培養(yǎng)物中的誘導物總量為約4g/L至約40g/L。
36、如權利要求35所述的方法，其中添加到所述培養(yǎng)物中的誘導物總量為約5g/L至約20g/L。
37、如權利要求36所述的方法，其中添加到所述培養(yǎng)物中的誘導物總量為約7g/L至約15g/L。
38、如權利要求37所述的方法，其中添加到所述培養(yǎng)物中的誘導物總量為約10g/L。
39、如權利要求28所述的方法，其包含在開始誘導物補料后約2小時至約8小時自所述培養(yǎng)物中分離所述重組蛋白質(zhì)。
40、如權利要求39所述的方法，其包含在開始誘導物補料后約3小時至約6小時自所述培養(yǎng)物中分離所述重組蛋白質(zhì)。
41、如權利要求28所述的方法，其中在所述碳源和所述誘導物二者的恒定速度補料期間、在所述碳源和所述誘導物二者的DO恒定補料期間或在所述碳源和所述誘導物二者的pH值恒定補料期間將所述碳源添加到所述細胞培養(yǎng)物中。
42、如權利要求28所述的方法，其中所述誘導物是阿拉伯糖。
43、如權利要求28所述的方法，其中所述碳源是基于糖的碳源。
44、如權利要求43所述的方法，其中所述基于糖的碳源是葡萄糖。
45、如權利要求28所述的方法，其中所述碳源是葡萄糖且所述誘導物是阿拉伯糖。
46、如權利要求45所述的方法，其包含在將所述阿拉伯糖連續(xù)添加到所述細胞培養(yǎng)物中的同時將葡萄糖連續(xù)添加到所述細胞培養(yǎng)物中。
47、如權利要求45所述的方法，其包含向所述細胞培養(yǎng)物中連續(xù)添加葡萄糖直到所述細胞培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約80OD600。
48、一種生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，其包含
培養(yǎng)表達重組蛋白質(zhì)的重組細菌細胞，其是通過在包含所述細菌細胞的培養(yǎng)物達到閾值參數(shù)后向所述培養(yǎng)物中連續(xù)添加誘導物來培養(yǎng)，其中所述細菌細胞包含對應于腦膜炎奈瑟菌血清群B(N.meningitidis serogroup B)基因的核酸序列。
49、如權利要求48所述的方法，其中所述閾值參數(shù)是光密度(OD)、溶解氧(DO)、pH值、培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的濃度、添加到培養(yǎng)基中的碳源的總濃度、或其任何組合。
50、如權利要求49所述的方法，其中所述閾值參數(shù)是所述培養(yǎng)物的光密度(OD)。
51、如權利要求50所述的方法，其中當所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約70至約110OD600時開始所述誘導物連續(xù)補料。
52、如權利要求51所述的方法，其中當所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約70至約105OD600時開始所述誘導物連續(xù)補料。
53、如權利要求52所述的方法，其中當所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約75至約85OD600時開始所述誘導物連續(xù)補料。
54、如權利要求53所述的方法，其中當所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約80OD600時開始所述誘導物連續(xù)補料。
55、如權利要求48所述的方法，其中所述誘導物是以約3.35g/L/h至約16g/L/h的恒定速度添加到所述培養(yǎng)物中、所述誘導物是通過DO恒定補料來添加或所述誘導物是通過pH值恒定補料來添加。
56、如權利要求48所述的方法，其中在誘導期間添加到所述培養(yǎng)物中的誘導物總量為約4g/L至約40g/L。
57、如權利要求56所述的方法，其中在誘導期間添加到所述培養(yǎng)物中的誘導物總量為約5g/L至約20g/L。
58、如權利要求57所述的方法，其中在誘導期間添加到所述培養(yǎng)基中的誘導物總量為約7g/L至約15g/L。
59、如權利要求58所述的方法，其中在誘導期間添加到所述培養(yǎng)物中的誘導物總量為約10g/L。
60、如權利要求48所述的方法，其中在所述方法開始后所述誘導物補料持續(xù)約2小時至約8小時。
61、如權利要求60所述的方法，其中在所述方法開始后所述誘導物補料持續(xù)約3小時至約6小時。
62、如權利要求48所述的方法，其中在開始誘導物補料后約2小時至約8小時收獲所述重組蛋白質(zhì)。
63、如權利要求62所述的方法，其中在開始誘導物補料后約3小時至約6小時分離所述重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
64、如權利要求48所述的方法，其中在將誘導物補加到所述培養(yǎng)物中期間繼續(xù)將所述碳源補加到所述培養(yǎng)基中。
65、如權利要求48所述的方法，其中所述誘導物是阿拉伯糖。
66、如權利要求48所述的方法，其中所述碳源是基于糖的碳源。
67、如權利要求66所述的方法，其中所述基于糖的碳源是葡萄糖。
68、如權利要求67所述的方法，其中所述誘導物是阿拉伯糖。
69、如權利要求68所述的方法，其中在將阿拉伯糖以恒定速度補加到所述培養(yǎng)物中期間、在所述葡萄糖和所述誘導物二者的DO恒定補料期間或通過所述葡萄糖和所述誘導物二者的pH值恒定補料，將葡萄糖以恒定補料速度補加到所述培養(yǎng)物中。
70、如權利要求68所述的方法，其中在將阿拉伯糖以恒定速度補加到所述培養(yǎng)物中期間，通過所述葡萄糖和所述誘導物二者的DO恒定補料直到所述培養(yǎng)物中的所述細胞密度達到約80OD600或通過所述葡萄糖和所述誘導物二者的pH值恒定補料直到所述培養(yǎng)物中的所述細胞密度達到約80OD600，將葡萄糖以恒定補料速度補加到所述培養(yǎng)物中。
71、如權利要求68所述的方法，其中所述重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)包含脂蛋白(rLP2086)。
72、如權利要求68所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含未脂化蛋白質(zhì)。
73、如權利要求68所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含腦膜炎球菌2086亞科A蛋白質(zhì)。
74、如權利要求68所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含腦膜炎球菌2086亞科B蛋白質(zhì)。
75、一種生產(chǎn)重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)(P2086)的方法，其包含
(a)在誘導型啟動子控制下將編碼重組2086蛋白質(zhì)的表達載體引入到細菌宿主細胞中以形成重組細菌細胞；
(b)將所述重組細菌細胞引入到培養(yǎng)基中以形成培養(yǎng)物；
(c)向所述培養(yǎng)物中添加碳源；
(d)監(jiān)測所述培養(yǎng)物中的細胞生長是否達到閾值光密度(OD)；
(e)在所述培養(yǎng)物的所述細胞密度達到約70至110的光密度后，將所述誘導型啟動子的誘導物連續(xù)添加到所述培養(yǎng)物中；和
(f)在開始連續(xù)添加所述誘導物后約3小時至約6小時后，自所述培養(yǎng)物中分離所述重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)。
76、一種組合物，其包含
細菌培養(yǎng)物，所述細菌培養(yǎng)物包含基于所述細菌培養(yǎng)物的總體積，密度為至少約1.5g/L的重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)。
77、如權利要求76所述的組合物，其中所述重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)是脂化蛋白質(zhì)。
78、如權利要求76所述的組合物，其中所述重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)是未脂化蛋白質(zhì)。
79、如權利要求76所述的組合物，其中所述重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)是2086亞科A蛋白質(zhì)。
80、如權利要求76所述的組合物，其中所述重組蛋白質(zhì)是2086亞科B蛋白質(zhì)。
81、如權利要求80所述的組合物，其中所述培養(yǎng)物包含第二重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)。
82、如權利要求81所述的組合物，其中所述第二2086重組腦膜炎球菌蛋白質(zhì)是2086亞科A蛋白質(zhì)。
83、如權利要求76所述的組合物，其中基于所述細菌培養(yǎng)物的總體積，所述重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)的密度為至少約1.7g/L。
84、如權利要求76所述的組合物，其中基于所述細菌培養(yǎng)物的總體積，所述重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)的密度為至少約2.0g/L。
85、如權利要求76所述的組合物，其中基于所述細菌培養(yǎng)物的總體積，所述重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)的密度為至少約3.0g/L。
86、一種組合物，其包含
細菌培養(yǎng)物，所述細菌培養(yǎng)物包含按照如權利要求1-75中任一權利要求所述的方法所制備的重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供生產(chǎn)蛋白質(zhì)(例如，重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì))的方法、以及高密度蛋白質(zhì)組合物和用于本發(fā)明方法的組合物，所述方法利用補料-分批發(fā)酵并在達到閾值參數(shù)后連續(xù)投入誘導物且任選地連續(xù)投入碳源(例如，恒定速度投入)以提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。
文檔編號C12P21/06GK101535493SQ200780027778
公開日2009年9月16日 申請日期2007年7月21日 優(yōu)先權日2006年7月27日
發(fā)明者衛(wèi)強·威利·孫, 厄爾·珀塞爾 申請人:惠氏公司