專利名稱：：用于顆粒狀淀粉水解的酶組合物中天然的谷物淀粉酶的制作方法
技術領域：
：02本發(fā)明涉及淀粉水解方法，其用于在溫度低于淀粉膠凝溫度下，從在碾碎的植物材料中的淀粉獲得可發(fā)酵糖，并且進一步涉及糖發(fā)酵以生產最終產品，例如乙醇。
背景技術：
：03淀粉是重要的原料，廣泛用于工業(yè)目的，例如高果糖漿和乙醇的生產。在植物種子中淀粉形成主要儲存糖類成分，并且淀粉顆粒通常是抗降解的。傳統(tǒng)上，高溫和/或酶的組合物己經被用于水解淀粉。淀粉水解酶，例如(x-淀粉酶(E.C.3.2丄l.)——其是內切作用水解酶，水解淀粉分子內部的a-l，4鍵，在工業(yè)中是最經常使用的。a-淀粉酶由植物、動物和微生物產生。用源自微生物源的a-淀粉酶，從植物種子進行淀粉水解、特別是從谷粒進行淀粉水解，在很多工業(yè)方法中是常規(guī)的，其中淀粉降解的第一步是淀粉水解為葡萄糖或淀粉水解為麥芽糖糊精。傳統(tǒng)上，這些方法在高溫下進行(例如，高于包含底物的淀粉的初始膠凝溫度)(Corn:ChemistryandTechnology,WatsonS.A.等人編輯，(1991)AmericanAssociationofCerealChemists,Inc.禾卩TheAlcoholTextbook,第三版，Jacques等人編輯，(1999),NottinghamUniversityPress)。最近，工業(yè)上已經探索通過發(fā)酵使用低能量方法進行淀粉水解和生產醇(例如在低于植物材料中包含的淀粉的初始膠凝溫度的溫度下)(USP4,514,496、WO03/066826;WO04/081193;WO04/106533;04本發(fā)明涉及從磨碎的植物材料水解淀粉的方法，包括在溫度低于該磨碎的植物材料中的顆粒狀淀粉的初始膠凝溫度下，使磨碎的植物材料與外源性植物(x-淀粉酶、葡糖淀粉酶和任選的微生物a-淀粉酶的組合物接觸，以獲得可發(fā)酵糖。本發(fā)明進一步涉及在發(fā)酵微生物的存在下發(fā)酵該可發(fā)酵糖為最終產品。05在一個方面，本發(fā)明包括從磨碎的植物材料水解淀粉的方法，該磨碎的植物材料包含顆粒狀淀粉，通過在溫度低于顆粒狀淀粉的淀粉膠凝溫度下使磨碎的植物材料與外源性植物(x-淀粉酶和葡糖淀粉酶接觸而進行，以生產寡糖和生產可發(fā)酵糖。該方法也可以包括在發(fā)酵微生物存在下，在l(TC和4(TC之間的溫度下，發(fā)酵可發(fā)酵糖10小時至250小時的一段時間，以生產醇。所述磨碎的植物材料可以為具有顆粒狀淀粉的漿狀物，該漿狀物具有5。/。至60。/。之間的DS，或者可選地25%至40%之間的DS，或者可選地15n/。至45M之間的DS。a淀粉酶可以被加入0.001至30AAU/DS之間的量。06在其它方面，接觸步驟也包括使磨碎的植物材料與微生物a-淀粉酶接觸。溫度可以在50。C至7CTC之間。植物a-淀粉酶可以是來自植物的a-淀粉酶，所述植物包括大麥、小麥、白高粱、黑麥、高梁、稻米、黍、小黑麥、木薯、馬鈴薯、甘薯、甜菜、甘蔗、大豆和豌豆。優(yōu)選地，所述植物材料是玉米、高粱、大麥、小麥、稻米或其組，物。在一些重要的方面，所述植物是分級玉米(fractionatedcorn)。在一些方面，所述醇是乙醇，并且方法進一步包括回收乙醇。07在其它方面，本發(fā)明包括用于生產乙醇的方法，該方法通過如下進行在溫度低于顆粒狀淀粉的膠凝溫度下，使從植物材料獲得的、包含顆粒狀淀粉的漿狀物與能溶解顆粒狀淀粉的外源性植物a-淀粉酶接觸5分鐘至24小時的一段時間，獲得底物，以及在發(fā)酵微生物的存在下，在10'C至40'C之間的溫度下，發(fā)酵該底物10小時至250小時的一段時間，產生乙醇。在一些方面，所述方法也包括回收乙醇。所述a-淀粉酶可以是例如包括下述的a-淀粉酶大麥、小麥、白高粱、黑麥、高梁、6稻米、黍、小黑麥、木薯、馬鈴薯、甘薯、甜菜、甘蔗、大豆和豌豆。在一些方面，所述方法包括使?jié){狀物與微生物a淀粉酶接觸。所述接觸步驟可以在50'C至7(TC之間的溫度下進行。所述方法也可以包括，在發(fā)酵步驟之前使底物澄清。在一些方面，所述方法可以包括在接觸步驟添加另外的酶，如葡糖淀粉酶、植酸酶、蛋白酶、纖維素酶和/或半纖維素酶。在一些優(yōu)選的方面，所述另外的酶是植酸酶和/或蛋白酶。在一些方面，所述漿狀物具有5-60%DS之間的顆粒狀淀粉，或者可選地20-40"/。DS之間。在一些方面，所述方法包括使底物與水溶液接觸，該水溶液包含渦流以在發(fā)酵步驟之前稀釋。/。DS。所述顆粒狀淀粉可以從玉米、高粱、大麥、小麥、稻米或其組合物獲得。08圖1說明從大麥面粉(32。/。DS)經發(fā)酵時間(小時)產生乙醇(％v/v)，其經各種處理，包括STARGEN001(--);大麥AA+AnGA(-■-);大麥AA+TrGA(-*-)和大麥AA+HGA(-▲-)";09圖2說明從大麥面粉(32。/。DS)經發(fā)酵時間(小時)產生乙醇(％v/v)，其經各種處理，包括STARGENOOl(--);HGA(-□-);大麥AA+STARGEN001(-)K-);大麥AA+HGA(-隱-);和對照(未添加酶)(--)。發(fā)明詳述10除非另有定義，本發(fā)明所用的技術和科學術語，與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員所通常理解的具有相同意義。11盡管與本文中所述的那些類似或等價的任何方法和材料可以在本發(fā)明的實踐或測試中使用，但是描述的是優(yōu)選的方法和材料。12現(xiàn)在，使用下面的定義和實施例，僅通過參考的方式對本發(fā)明進行詳細描述。本文中提及的所有專利和出版物，包括在這些專利和出版物中公開的所有序列，被明確地引入作為參考。定義13如本文中所使用，術語"淀粉(starch)"是指由植物復合多糖碳水化合物組成的任何物質，由具有式(C6H,oO丄的直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，其中X可以是任何數(shù)。14術語"顆粒狀淀粉(granularstarch)"是指粗淀粉，即在植物材料(例如，谷粒和根莖類)中發(fā)現(xiàn)的、自然形態(tài)的淀粉。15術語"干固體含量(ds)"是指基于干重以百分比(％)計的漿體中的總固體。術語"漿體(slurry)"是指含有不溶性固體的含水混合物。16術語"可發(fā)酵糖(fermentablesugars)"是指寡糖和單糖，其能通過使用發(fā)酵微生物的發(fā)酵被轉化為最終產品?！?7術語"糊精(dextrins)"是指短鏈的葡萄糖聚合物(例如，2至IO個單位)。18術語"寡糖"是指具有2至IO個以糖苷鍵連接的單糖單元的任何化合物。簡單糖的這些短鏈聚合物包括糊精。19術語"a-淀粉酶(alpha-amylase)(例如E.C.類另iJ3.2丄1)"是指催化(x-l，4-糖苷鍵水解的酶。20術i吾"糖化酶(saccharifyingenzyme)"和"淀粉水解酶(starchhydrolyzingenzymes)"是指能轉化淀粉為單糖或寡糖(例如，己糖或戊糖)的任何酶。21術語"顆粒狀淀粉水解(GSH)酶"和"具有顆粒狀淀粉水解(GSH)活性的酶"是指能水解顆粒狀形態(tài)淀粉的酶。22術語"淀粉的水解"是指糖苷鍵因加入水分子而斷裂。23術語"內源性植物a-淀粉酶"是指具有a-淀粉酶活性的、由植物材料表達和產生的酶。如在此使用的內源性植物a-淀粉酶可以是異源的或同源的。24術語"外源性植物a-淀粉酶"是指具有a-淀粉酶活性的酶，其源自植物(x-淀粉酶并且獨立于用作淀粉水解底物的植物材料而提供。25術語"微生物的a-淀粉酶"是指具有a-淀粉酶活性的、源自微生物源(例如細菌或真菌)的酶，并包括修飾的酶、活性片段和其雜種。26涉及多核苷酸或蛋白質的術語"異源的(heterologous)"是指在宿主細胞中非天然發(fā)生的多核苷酸或蛋白質。該術語意圖包括由天然發(fā)生的基因、突變基因、合成基因和/或過表達基因編碼的蛋白質。27涉及多核苷酸或蛋白質的術語"同源的(homologous)"是指在宿主細胞中天然發(fā)生的多核苷酸或蛋白質。28術語"葡糖淀粉酶(glucoamylase)"是指淀粉葡糖苷酶類的酶(例如，E.C.3.2丄3，葡糖淀粉酶、1,4-a-D-葡聚糖葡糖水解酶)。這些是外切作用酶，其從直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的非還原端釋放葡糖基殘基。29在此使用的術語"磨碎的(milled)"是指尺寸被減小的植物材料，例如，通過碾碎、壓碎、分級或任何其它減小顆粒尺寸的方法。30術語"膠凝(gelatinization)"是指淀粉分子的增溶作用，通常通過烹煮形成粘稠懸液進行。31術語"膠凝溫度(gelatinizationtemperature)"是指包含底物的淀粉開始膠凝的最低溫度。確切的膠凝溫度取決于具體淀粉，并且可以依賴于例如植物種類和環(huán)境以及生長條件這些因素而變化。對于可以根據(jù)在此所述方法使用的許多顆粒狀淀粉，初始淀粉膠凝溫度的范圍包括大麥(52。C至59。C)、小麥(58。C至64匸)、黑麥(57。C至70。C)、玉米(62。C至72。C)、高直鏈淀粉玉米(67t:至80'C)、稻米(68i:至77。C)、高梁(68°〇至77°0、馬鈴薯(58。C至68°C)、木薯(59。C至69°C)和甘薯(58。C至72°C)(J丄M.Swinkels的STARCHCONVERSIONTECHNOLOGY中32-38頁，VanBeynum等人編輯(1985)MarcelDekkerInc.NewYork禾QTheAlcoholTextbook第三版，Jacques等人編輯，AReferencefortheBeverage,FuelandIndustrialAlcoholIndustries(1999)NottinghamUniversityPress,-UK)。32術語"低于膠凝溫度"是指溫度小于膠凝溫度。33如本文中所使用，術語"干固體含量(ds)"是指基于干重以百分比(％)計的漿體中的總固體，包括水分。34術語"漿狀物"是指包含不溶固體(例如，顆粒狀淀粉)的含水混合物。35術語"醪液(mash)"是指液態(tài)的可發(fā)酵底物的混合物，其被用于產生發(fā)酵產物，并且該術語被用于指從初始混合可發(fā)酵底物與一種或多種淀粉水解酶和發(fā)酵有機體至發(fā)酵實驗完成的任意發(fā)酵階段。36術語"發(fā)酵(fermentation)"是指通過微生物酶分解和厭氧分解有機底物，以生產更簡單的有機化合物。雖然發(fā)酵發(fā)生在缺氧條件下，但該術語不意圖僅限于嚴格缺氧條件，因為發(fā)酵也在氧存在下發(fā)生。37短語"同步糖化和發(fā)酵(SSF)"是指產生最終產品的過程，其中發(fā)酵有機體例如產乙醇微生物和至少一種酶例如糖化酶在同一工藝步驟中結合在同一容器中。38術語"糖化(saccharification)"是指不可直接使用的多糖被酶轉化為單糖或寡糖，以便發(fā)酵轉化為最終產品。39術語"最終產品"是指從可發(fā)酵底物酶轉化的任何碳源衍生產品。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述最終產品是醇，例如乙醇。40在此使用的術語"發(fā)酵有機體"是指任意的微生物或細胞，其適合用于發(fā)酵，以便直接或間接生產最終產品。41在此使用的術語"產乙醇者"或"產乙醇微生物"是指能從單糖或寡糖生產乙醇的發(fā)酵生物。42如在此使用的術語"回收(recovered)"、"分離(isolated)"和"分開(separated)"是指蛋白質、細胞、核酸或氨基酸從至少一種與其天然相關的成分中去除。43術語"源自(derived)"包括術語"起源自(originatedfrom)"、"得自(obtained)"或"可得自(obtainablefrom)"和"分離自(isolatedfrom)",并且在一些實施方式中，如在此使用的，是指從細胞產生核苷酸序列編碼的多肽，在所述細胞中核苷酸是天然存在的或核苷酸已經被插入所述細胞中。44術語"酶促轉化(enzymaticconversion)"通常是指底物通過酶作用修飾。45術語"產量(yield)"是指使用本發(fā)明的所述方法生產的最終產品的量。在一些實施方式中，該術語是指最終產品的體積，并且在其它實施方式中，該術語是指最終產品的濃度。46在此使用的術語"酶單位(enzymeunit)"是指在特定測定條件下每分鐘生產1微摩爾產品的酶的量。例如，在一個實施方式中，術語"葡糖淀粉酶活性單位(GAU)"定義為在測定條件6(TC和pH4.2下，從可溶淀粉底物(4。/。DS)每小時生產lg葡萄糖所需要的酶的量。在另一實施方式中，對"可溶淀粉單位(SSU)"，l單位的酶活性等價于在特定培養(yǎng)條件下每分鐘釋放的葡萄糖中l(wèi)mg的還原力，并且是基于10等份的酶樣品在pH4.5、5(TC下水解可溶馬鈴薯淀粉底物(4%DS)的程度。DS是指"干固體(drysolids)"。47如本文中所使用，術語"包括(comprising)"和其同源詞以其包含性意義使用；也就是說，等價于術語"包含(including)"及其相應的同源詞。48"一個(a)"、"一個(an)"和"這個(the)"包括復數(shù)形式，除非上下文中另外明確指出。"49數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)。50本文所提供的標題不是對本發(fā)明的不同方面或實施方式的限制，其可以通過整體上參考說明書而被理解。實施方式51在植物細胞以及微生物的細胞中，a-淀粉酶也涉及淀粉的水解，并且在谷類種子的發(fā)芽期間，淀粉降解的起始伴隨大量的a-淀粉酶的從頭合成。因此，谷類種子有其自己的內源性淀粉水解a-淀粉酶，其涉及產生用于發(fā)芽和生長的簡單糖。52在低于初始淀粉膠凝溫度的溫度條件下(例如低于80°C)，淀粉水解酶的酶組合物，包括那些來自微生物源的和那些來自天然植物a-淀粉酶的，提供了水解顆粒狀淀粉并獲得可發(fā)酵糖以及其它最終產品的改進方法。磨碎的植物材料53包含顆粒狀淀粉的植物材料可以得自，但不僅限于，小麥、玉米、黑麥、高梁(買羅高粱)、稻米、黍、大麥、小黑麥、木薯(木薯粉)、馬鈴薯、甘薯、甜菜、甘蔗和豆類如大豆和豌豆。優(yōu)選的植物材料包括玉米、大麥、小麥、稻米、高粱及其組合。植物材料可以包括雜交品種和遺傳改良品種(例如，包含異源基因的轉基因玉米、大麥或大豆)。植物任意部分可以被用作植物材料，包括但不僅限于植物的各部分，例如葉、莖、莢、外果殼、根莖、穗軸、谷粒和類似物。在一個實施方式中，整谷?？梢员挥米黝w粒狀淀粉源。優(yōu)選的整谷粒包括玉米、小麥、黑麥、大麥、高梁和其組合。54優(yōu)選情況下，所述整谷粒的尺寸通過本領域已知的方法被減小，其包括碾磨(例如錘碾磨或滾筒碾磨)；乳化技術；旋轉脈動；分級和類似方法。在一些實施方式中，所述植物材料被磨細，以至至少70%將通過具有0.5毫米濾網的篩。在一些實施方式中，磨細的植物材料的至少90%將通過具有0.5毫米濾網的篩。55在其它實施方式中，所述植物材料是分級的谷類谷粒，其包括纖維、胚乳和/或芽孢部分。在一些實施方式中，某些級分將被用于本發(fā)明的淀粉水解方法。用于分級植物材料例如玉米、大麥和小麥的方法是本領域公知的。植物a-淀粉酶56在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明，用于磨碎的植物材料的淀粉水解的酶組分是外源性植物(x-淀粉酶。57外源性植物a-淀粉酶可以從各種植物和植物部分獲得，例如玉米、大麥、小麥、稻米和高粱。至少一種植物(x-淀粉酶已經被純化，并且可以從例如Sigma-Aldrich的來源商業(yè)獲得。優(yōu)選的植物淀粉酶包括那些源自大麥和高粱的。58很多植物(x-淀粉酶已經被純化，并且這些酶中的一些已經被測序。植物a-淀粉酶的實例包括那些在擬南芥(Arabidopsis)(GenBankNP564977);稻米(Karrer等人(1992)ThePlanU.2:51,7-532;和Karrer等人(簡)PlantMol.Biol.16:797-805);玉米(美國專利2005/0138688;Warner等人(1991)PlantSci.78:143—150和Subbarao等人(1998)Phytochem.49:657-666);大麥(Xavier等人(2003)Structure11:973-984;MacGregor等人(2001)Biochim.Biophys.Acta1546:1—20;和GenBankX05166)中發(fā)現(xiàn)的。59在本方法進行的溫度下，可以相信內源性植物a-淀粉酶未被滅活并且也可以促進顆粒狀淀粉水解。60根據(jù)本發(fā)明的外源性植物a-淀粉酶可以被單獨添加或與其它酶結合添加。葡糖淀粉酶-61在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述方法包括使磨碎的植物材料與外源性植物a-淀粉酶和葡糖淀粉酶的組合物接觸。62葡糖淀粉酶(E.C.3.2丄3.)可以源自細菌、植物和真菌源的異源或內源蛋白質表達。優(yōu)選的，對本發(fā)明有用的葡糖淀粉酶通過數(shù)個絲狀真菌和酵母菌的菌株生產。特別是，從曲霉G^/7^^7/""和木霉菌(7h'c/20^"廳)的菌株分泌的葡糖淀粉酶是商業(yè)上重要的。適合的葡糖淀粉酶包括天然產生的野生型葡糖淀粉酶以及變體和基因工程突變體葡糖淀粉酶。以下的葡糖淀粉酶是可以用于本發(fā)明考慮的方法中的葡糖淀粉酶的非限制性實例。黑曲霉04^wg///^"/gw)Gl和G2葡糖淀粉酶(Boel等人(1984)EMBOJ.3:1097-1102;WO92/00381、WO00/04136和USP6,352,851);泡盛曲霉(ApeA^7/wavrawon')葡糖淀粉酶(WO84/02921);米曲霉(Aperg/〃^co^ae)葡糖淀粉酶(Hata等人(1991)Agric.Biol.Chem.55:941-949)禾口當ra應m/(見Chen等人(1996)Prot.Eng.9:499-505;Chen等人(1995)Prot.Eng.8:575-582;和Chen等人(1994)BiochemJ.302:275-281)。63葡糖淀粉酶也從踝節(jié)菌屬(ra/aram;^")的菌株獲得，例如那些源自埃默森籃狀菌(ewe"om7)、7:/e_yce"am、！T^po^/和嗜熱籃狀菌(7:AmwopM"力的(WO99/28488;USPNo.RE:32,153;USPNo.4,587，215);木霉屬(7h'c/20fifema)菌株例如里氏木霉(7:/"ee"/)，特別是與公開在US專利發(fā)明者M·庫瑪申請人:美國丹尼斯克有限公司杰能科子公司