專(zhuān)利名稱(chēng)：：病原體抗性改進(jìn)的植物的產(chǎn)生的制作方法病原體抗性改進(jìn)的植物的產(chǎn)生與相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2006年6月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/813,662的權(quán)益，該臨時(shí)申請(qǐng)的全文在此引為參考。扭旦冃^由植物病原體引起的感染可以抑制果實(shí)、種子、葉和花的產(chǎn)生，并導(dǎo)致收獲作物的質(zhì)量和產(chǎn)量降低，對(duì)這種感染的控制具有顯著的經(jīng)濟(jì)重要性。病原體每年引起全世界作物的危害達(dá)到幾十億美元(Baker等1997,Science276:726-733)。因此，越來(lái)越多的研究致力于開(kāi)發(fā)控制植物疾病的新方法。這些研究集中于植物天生抵抗病原體侵襲的能力，以試圖加強(qiáng)植物自身的防御力來(lái)對(duì)抗病原體的攻擊(Staskawicz等1995，Science268:661-667;Baker等，同上)。盡管大多數(shù)作物用農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑處理，例如抗真菌和抗細(xì)菌劑，但來(lái)自病原體感染的危害仍然常規(guī)性導(dǎo)致農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的收益損失。此外，許多用于控制這類(lèi)感染或侵襲的藥劑對(duì)植物和/或?qū)Νh(huán)境造成了不利的副作用。對(duì)于病原體感染的抗性增強(qiáng)的植物，將減少或消除對(duì)應(yīng)用化學(xué)殺蟲(chóng)劑、抗真菌和抗細(xì)菌劑的需要。在開(kāi)發(fā)對(duì)寬范圍的病原體顯示出抗性增加的轉(zhuǎn)基因植物上，已經(jīng)有了了相當(dāng)?shù)呐d趣(Atkimon等，2003:Annu.Rev.Phytopathol.41:615-639;Williamson禾口Gleason,2003,Curr.Opin.PlantBiol"6:327-333;Stuiver禾口Custers,2001，Nature411:865-8;Melchers禾口Stuiver，2000，Curr.Opin.PlantBiol.3:147-152;Rommens禾口Kishore,2000，Curr.Opin.Biotechnol.11:120-125;Williamson,1999,Curr.Opin.PlantBiol.2:327-331;Mourgues等1998,TrendsBiotechnol.16:203-210)。植物病原性線(xiàn)蟲(chóng)是以植物根為食的小無(wú)脊椎動(dòng)物，造成植物損傷和作物產(chǎn)量降低。在植物的寄生線(xiàn)蟲(chóng)中，異皮科(Heteroderidae)線(xiàn)蟲(chóng)造成經(jīng)濟(jì)危害最大(Williamson,1999,Curr.Opin.PlantBiol.2:327-331)。該科的寄生線(xiàn)蟲(chóng)可以分成兩類(lèi)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)屬(Meloidogyne))和胞囊線(xiàn)蟲(chóng)(胞囊線(xiàn)蟲(chóng)屬(Heterodera)和球胞囊線(xiàn)蟲(chóng)屬(Globodera))。根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)宿主植物的感染通常導(dǎo)致根癭或"根結(jié)"的形成，并造成許多作物產(chǎn)量的嚴(yán)重?fù)p失。相反，胞囊線(xiàn)蟲(chóng)通常具有較窄的宿主范圍。擬南芥(Ambidopsisthaliana)可以修改以用于分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，它是為植物-線(xiàn)蟲(chóng)的相互作用提供了解的重要模型，因?yàn)樗菐追N根結(jié)和胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的宿主(Sijmons等，1991,PlantJ.，1:245-254)。在幾個(gè)品種的作物中，已經(jīng)鑒定到許多其異常表達(dá)與對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的抗性改變有關(guān)的基因。例如，番茄的Mi基因賦予了對(duì)幾個(gè)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)種類(lèi)的抗性(Williamson,1998,A醒.Rev.Phytopathol.36:277-293)。Mi蛋白含有NBS(核苷酸結(jié)合位點(diǎn))和LRR(富亮氨酸的重復(fù))結(jié)構(gòu)域(Kaloshian等，1998,Mol.Gen.Genet"257:376-385;Milligan等，1998,PlantCell10:1307-1319)。甜菜的野生近緣種的Hsl，1基因賦予了對(duì)胞囊線(xiàn)蟲(chóng)甜菜胞囊線(xiàn)蟲(chóng)(Heteroderaschachtii)的抗性(Cai等，1997，Science,275:832-834)。Hsl，1蛋白含有預(yù)測(cè)的信號(hào)序列、預(yù)測(cè)的跨膜區(qū)和富亮氨酸區(qū)域。馬鈴薯的Gpa2基因賦予了對(duì)胞囊線(xiàn)蟲(chóng)馬鈴薯白線(xiàn)蟲(chóng)(Globoderapallida)的一些分離株的抗性(vanderVoort等，1999,Mol.Plant-MicrobeInt.,12:187-206;vanderVossen，2000,PlantJ.，23:567-576)。番茄的Hero基因賦予了對(duì)馬鈴薯胞囊線(xiàn)蟲(chóng)例如馬鈴薯金線(xiàn)蟲(chóng)(Globoderarostochiensis)和馬鈴薯白線(xiàn)蟲(chóng)的抗性(Ernst等，2002,PlantJ.，31:127-136)。Gpa2和Hero蛋白與Mi蛋白類(lèi)似，也含有NBS和LRR結(jié)構(gòu)域。最后，小麥的Crel基因賦予了對(duì)大多數(shù)歐洲線(xiàn)蟲(chóng)和唯一的澳大利亞致病型的抗性；而小麥的Cre3基因賦予了對(duì)澳大利亞線(xiàn)蟲(chóng)的抗性(deMajnikJ等，2003,Mol.PlantMicrobeInteract.16:1129-1134)。Crel和Cre3基因還沒(méi)有被克隆。由于植物對(duì)病原體抗性的重要性，產(chǎn)生的病原體抗性增加的植物的方法是合乎需要的。發(fā)明簡(jiǎn)述本公開(kāi)提供了相對(duì)于對(duì)照植物來(lái)說(shuō)，對(duì)病原體的抗性增加的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中整合(例如穩(wěn)定地整合)了DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有編碼具有病原體抗性活性的蛋白的核苷酸序列。該核苷酸序列可以是在表3和4的第3列中鑒定的核苷酸序列，或其互補(bǔ)序列；與表3和4的第3列中鑒定的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，或其互補(bǔ)序列；編碼的多肽含有表3和4的第4列中鑒定的氨基酸序列的核苷酸序列；或編碼的多肽具有與表3和4的第4列中鑒定的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。所述核苷酸序列與驅(qū)動(dòng)編碼序列在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作連接。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物選自油菜籽、大豆、玉米、向日葵、棉花、可可、紅花、油棕、椰子樹(shù)、亞麻、蓖麻和花生、番茄、胡蘿卜、萵苣、蠶豆、蘆筍、花椰菜、胡椒、甜菜、巻心菜、茄子、苣荬菜、韭菜、長(zhǎng)黃瓜、甜瓜、豌豆、蘿卜、砧木(rootstock)、短黃瓜(Bei'ta)、倭瓜、西瓜、白皮洋蔥、菊苣、黃洋蔥、花莖甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、葉蔥、芹菜、纈草(mache)、黃瓜、茴香、葫蘆、南瓜、甜玉米和小胡瓜。轉(zhuǎn)基因植物可以如下產(chǎn)生在植物或其細(xì)胞中導(dǎo)入至少一個(gè)植物轉(zhuǎn)化載體，所述載體含有核苷酸序列或其變異體，所述核酸序列是表3和4的第4列中鑒定的NMR多肽的編碼序列或其互補(bǔ)序列，并使轉(zhuǎn)化的植物或細(xì)胞生長(zhǎng)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出對(duì)至少一種病原體的抗性增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，NMR多肽與表3和4的第4列中提到的氨基酸序列具有至少大約70%的序列同一性。在其它實(shí)施方案中，NMR多肽與表3和4的第4列中提到的氨基酸序列具有至少大約80%或90%的序列同一性(或更高)或具有該氨基酸序列。提供了產(chǎn)生病原體抗性增加、包括線(xiàn)蟲(chóng)抗性增加的植物的方法，包括鑒定NMR基因改變的植物以及產(chǎn)生該植物的后代，其中所述后代的病原體抗性增加，并且其中NMR基因是在表3和4的第4列中鑒定的基因。還提供了鑒定病原體抗性增加的植物的方法，包括分析來(lái)自植物的至少一個(gè)NMR基因并鑒定NMR基因改變的植物，其中所述植物的病原體抗性增加。本發(fā)明還提供了通過(guò)本文描述的方法獲得的植物和植物的部分。序列列表在隨附的序列表中列出的核酸和/或氨基酸序列，使用37C.F.R.1.822中定義的標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸堿基字母縮寫(xiě)和氨基酸的三字母編碼來(lái)顯示。每個(gè)核酸序列只顯示一條鏈，但是應(yīng)該理解對(duì)于任何所顯示的鏈的引用包含了互補(bǔ)鏈。在隨附的序列列表中SEQIDNO:1和2是擬南芥(Arabidopsisthaliana)ATCHX10;單價(jià)陽(yáng)離子質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATCHX10)的mRNA(GI18407880|reflNM—114362.1|)和蛋白(gi|15230551|reflNP—l90079.l)序列。SEQIDNO:3和4是擬南芥未知蛋白(AT3G44935)的mRNA(GII22331603lreSNM—148843.1l)和蛋白(gil22331604lreflNP—680096.l)序列。SEQIDNO:5禾卩6是擬南芥未知蛋白(AT3G44940)的mRNA(GII30692415lre^NM一114363.2l)和蛋白(gil30692416lref]NP—190080.2)序列。SEQIDNO:7禾口8是擬南芥未知蛋白(AT3G44950)的mRNA(GI|18407884|reflNM_l14364.11)和蛋白(gill5230556lref!NP—190081.l)序列。SEQIDNO:9禾B10是擬南芥未知蛋白(AT5G23340)的mRNA(GI|30688921|reflNM—122240.2i)和蛋白(gi|15237286|reflNP—197725.l)序列。SEQIDNO:11和12是擬南芥未知蛋白(AT5G23350)的mRNA(GII22327006lref]NM—122241.2l)和蛋白(gill5237287lreflNP—197726.1)序列。SEQIDNO:13和14是擬南芥未知蛋白(AT5G23360)的mRNA(GII42568032lref]NM一122242.3l)和蛋白(gill5237288lreflNP—197727.1)序列。SEQIDNO:15和16是擬南芥未知蛋白(AT5G23370)的mRNA(GII22327007lref]NM—122243.2l)和蛋白(gill5237301lre^NP—197728.l)序列。SEQIDNO:17和18是擬南芥未知蛋白(AT5G23380)的mRNA(GII30688942lreflNM—122244.2l)和蛋白(gill5237306lre^NP—197729.1)序列。SEQIDNO:19和20是擬南芥未知蛋白(AT5G23390)的mRNA(GI|30688951|ref]NM—122245.31)和蛋白(gill5237309lref]NP—197730.1)序列。SEQIDNO:21和22是擬南芥未知蛋白(AT5G23395)的mRNA(GII42570036lre^NM—147卯6.3l)和蛋白(gil22327010lref]NP—68021l.l)序列。SEQIDNO:23和24是擬南芥ATMKK7;激酶(ATMKK7)的mRNA(GI|18394598|ref]NM—101693.1|)和蛋白(gi|15221060|reflNP_l73271.1)序列。SEQIDNO:25和26是擬南芥的催化/水解酶(AT1G18360)的mRNA(GI|30685820|reflNM—101694,3|)禾B蛋白(gi|22329651|ref]NP—173272.2)序列。SEQIDNO:27和28是擬南芥HIK(HINKEL);ATP結(jié)合/微管發(fā)動(dòng)蛋白(HIK)的mRNA(GII30685823lreflNM一101695.3l)和蛋白(gi|22329653|re0NP—173273.2)序列。SEQIDNO:29和30是擬南芥未知蛋白(AT1G18380)的mRNA(GI|18394601|ref]NM—101696.11)和蛋白(gill5221762lref]NP—173274,1)序列。SEQIDNO:31和32是擬南芥的ATP結(jié)合/激酶/蛋白激酶/蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶/蛋白-酪氨酸激酶(AT1G18390)的mRNA(GI|18394602|reflNM_101697.1i)和蛋白(gi|15221764|ref]NP—173275.1)序列。SEQIDNO:33和34是擬南芥轉(zhuǎn)錄因子(AT1G18400)的mRNA(GI|30685839|ref]NM—101698.21)和蛋白(gil30685840lreflNP—173276.2)序列。SEQIDNO:35和36是擬南芥ATP結(jié)合/蛋白激酶/蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶/蛋白-酪氨酸激酶(AT3G53590)的mRNA(GII18409867lreflNM—115219.1l)和蛋白(gill5231843lref]NP—1卯927.1)序列。SEQIDNO:37和38是擬南芥核酸結(jié)合/轉(zhuǎn)錄因子/鋅離子結(jié)合(AT3G53600)的mRNACGI|18409871|reflNM—115220.1|)和蛋白(gi|15231845|reflNP—190928.1)序列。SEQIDNO:39和40是擬南芥的ATRAB8，GTP結(jié)合(ATRAB8)的mRNA(GI|42570491|reflNM_l80365.2|)和蛋白(gil30693873lre^NP—850696.1)序列。SEQIDNO:41禾P42是擬南芥的ATRAB8，GTP結(jié)合(ATRAB8)的mRNA(GI|30693869|re3NM—115221.2|)禾口蛋白(gi|15231847|reflNP—l90929.l)序列。SEQIDNO:43和44是擬南芥無(wú)機(jī)二磷酸酶/鎂離子結(jié)合/焦磷酸酶(AT3G53620)的mRNA(GI|18409875|ref]NM_l15222.1|)和蛋白(gi|15231849|reflNP—190930.l)序列。SEQIDNO:45和46是擬南芥未知蛋白(AT3G53630)的mRNA(GII42565899lref]NM一115223.4l)和蛋白(gil22331772lreflNP—190931.2)序列。SEQIDNO:47和48是擬南芥的ATP結(jié)合/激酶/蛋白激酶/蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶/蛋白-酪氨酸激酶(AT3G53640)的mRNA(GI|18409886|reflNM—115224.1|)和蛋白(gi|15231853|ref]NP—，932.1)序列。SEQIDNO:49和50是擬南芥的DNA結(jié)合(AT3G53650)的mRNA(GII184O9888lref]NM—115225.1l)和蛋白(gill5231854lre0NP—190933.l)序列。SEQIDNO:51和52是擬南芥ATOPT2;寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATOPT2)的mRNA(GI|18391089|ref]NM—100867.1!)禾Q蛋白(gill5218331lref]NP—172464.1)序列。SEQIDNO:53和54是擬南芥催化(AT1G09932)的mRNA(GII30681449lref]NM—179297.1l)和蛋白(gil30681450lreflNP—849628.l)序列。SEQIDNO:55和56是擬南芥催化(AT1G09935)的mRNA(GII42570079lref]NMJ48453.2l)和蛋白(gi|42570080|ref]NP—683294.2)序列。SEQIDNO:57和58是擬南芥的HEMA2;谷氨酰tRNA還原酶(HEMA2)的mRNA(GI|30681461|ref]NM—100868.2|)禾B蛋白(gi|15218333|ref]NP—172465.l)序列。SEQIDNO:59和60是擬南芥未知蛋白(AT1G09950)的mRNA(GII30681468lref]NM—100869.2l)和蛋白(gill5218335lreflNP—172466.1)序列。SEQIDNO:61和62是擬南芥的SUT4(蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4);碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/蔗糖:氫同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SUT4)的mRNA(GI|3O681472|re0NM—100870.21)和蛋白(gill5218362lreflNP—172467.1)序列。SEQIDNO:63和64是擬南芥轉(zhuǎn)錄因子(AT1G75250)的mRNA(GI|18410812|ref]NM—106181.1|)和蛋白(gi|15222161|ref]NP—177661.l)序列。SEQIDNO:65和66是擬南芥鈣調(diào)蛋白結(jié)合/翻譯延伸因子(AT1G07930)的mRNA(GI|30680419|reflNM—100667.2|)和蛋白(gi|18390829|re《NP_563800.1)序列。SEQIDNO:67和68是擬南芥轉(zhuǎn)錄因子(AT1G17880)的mRNA(vj丄j:)U08:):)/:)ireii丄、丄v丄—iuico丄.zi)々w'蟲(chóng)h(giii:>zz0876|ref|NP—173230.l"予列。SEQIDNO:69和70是擬南芥未知蛋白(AT1G15270)的mRNA(GII30684274lreflNM101396.2l)和蛋白(gill8394220lref]NP—563969.1)序列。SEQIDNO:71和72是擬南芥的RNA結(jié)合/核酸結(jié)合(AT2G37220)的mRNA(GI|3O687O74|re0NM_129278.2|)和蛋白(gi|15228102|ref]NP—181259.l)序列。SEQIDNO:73和74是擬南芥CSD2(銅/鋅超氧化物歧化酶2);銅、鋅超氧化物歧化酶(CSD2)的mRNA(GI|30683800|ref]NM—128379.2|)和蛋白(gill8401659lref]NP—565666.l)序列。SEQIDNO:75和76是擬南芥蘋(píng)果酸脫氫酶/氧化還原酶(AT5G58330)的mRNA(GI|42573723|ref]NM_203229.1|)和蛋白(gil42573724lref]NP—974958.1)序列。SEQIDNO:77和78是擬南芥蘋(píng)果酸脫氫酶/氧化還原酶(AT5G58330)的mRNA(GI|42568623|reflNM—125218.3|)和蛋白(gi|3O697O51|re0NP—568875.2)序列。SEQIDNO:79和80是擬南芥蘋(píng)果酸脫氫酶/氧化還原酶(AT5G58330)的mRNA(GI|42570606|reflNM—180883.2|)和蛋白(gil30697049lref]NP—851214.1)序列。SEQIDNO:81和82是擬南芥LHCB5(光系統(tǒng)II的捕光復(fù)合體5);葉綠素結(jié)合(LHCB5)的mRNA(GI|42566395|ref]NM—117102.3|)和蛋13白(gi|15235029|ref]NP—192772.l)序列。SEQIDNO:83和84是擬南芥HOG1(同源依賴(lài)性基因沉默1);腺苷高半胱氨酸酶(HOG1)的mRNA(GI|30682653|ref]NM—117468.2|)和蛋白(gill5236376lreflNPJ93130.1)序列。SEQIDNO:85和86是擬南芥的AHUS5;泛素結(jié)合酶./泛素樣活化酶(AHUS5)的mRNA(GI|18410828|ref]NM—115649.1|)和蛋白(gi|15230881|ref]NP—191346.l)序列。SEQIDNO87和88是擬南芥DNA結(jié)合/轉(zhuǎn)錄因子(AT5G54680)的mRNA(GI|3O6965O3|re0NM—124849.2|)禾P蛋白(gi|15239706|ref]NP_200279,1)序列。發(fā)明詳述定義除非另有指明，所有本文使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都與本發(fā)明
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的專(zhuān)業(yè)人員所理解的具有同樣的意義。對(duì)于本
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的定義和術(shù)語(yǔ)來(lái)說(shuō)，從業(yè)者可以特別參考Sambrook等，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第二版)(MolecularCloning:ALaboratoryManual(SecondEdition),ColdSpringHarborPress,Plainview，N.Y.)，以及AusubelFM等，1993,《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.)。應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于所描述的具體方法、方案和試劑，因?yàn)檫@些是可以改變的。本文使用的術(shù)語(yǔ)"載體"或"轉(zhuǎn)化載體"是指被設(shè)計(jì)用于不同宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體。"表達(dá)載體"是指有能力在外源細(xì)胞中整合并表達(dá)異源DNA片段的載體。許多原核和真核載體，包括示例的表達(dá)載體，是可商購(gòu)的。選擇適合的載體屬于本
技術(shù)領(lǐng)域：
專(zhuān)業(yè)人員的知識(shí)范疇。14"異源"核酸構(gòu)建體或序列具有至少一部分序列對(duì)于表達(dá)它的植物細(xì)胞來(lái)說(shuō)不是天然的。對(duì)于控制序列來(lái)說(shuō)，異源是指控制序列(例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)在天然狀態(tài)下對(duì)于調(diào)控目前它正調(diào)控的同樣基因的表達(dá)不起作用。一般情況下，異源核酸序列對(duì)于它們所存在的細(xì)胞或部分天然基因組來(lái)說(shuō)不是內(nèi)源的，并通過(guò)感染、轉(zhuǎn)染、微注射、電穿孔等被加入到細(xì)胞中。"異源"核酸構(gòu)建體可以包含與天然植物中發(fā)現(xiàn)的控制序列/DNA編碼序列組合相同或不同的控制序列/DNA編碼序列組合。本文使用的術(shù)語(yǔ)"基因"是指參與生產(chǎn)多肽鏈的DNA片段，可以包含或可以不包含編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，例如5'非翻譯(5'UTR)或"前導(dǎo)"序列和3'UTR或"尾隨"序列，以及個(gè)體編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)和不轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列。本文使用的術(shù)語(yǔ)"核酸分子"旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸類(lèi)似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類(lèi)似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA。"互補(bǔ)"是指核苷酸序列與給定的核苷酸序列足夠互補(bǔ)，使得它可以與該給定的核苷酸序列雜交，從而形成穩(wěn)定的雙鏈體。本文使用的"重組"包括指稱(chēng)已經(jīng)通過(guò)引入異源核酸序列進(jìn)行修飾的細(xì)胞或載體，或從這樣修飾的細(xì)胞衍生的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在天然(未重組)形式的細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一致形式的基因，或者作為人類(lèi)特意干預(yù)的結(jié)果，在表達(dá)天然基因時(shí)則是表達(dá)異常、低表達(dá)或完全不表達(dá)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"基因表達(dá)"是指基于基因的核苷酸序列生產(chǎn)多肽的過(guò)程。該過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此，"表達(dá)"可以指稱(chēng)多核苷酸或多肽序列，或者二者。有時(shí)多核苷酸序列的表達(dá)不導(dǎo)致蛋白的翻譯。"過(guò)表達(dá)"是指多核苷酸和/或多肽序列相對(duì)于在其野生型(或其它參照物[例如非轉(zhuǎn)基因])植物來(lái)說(shuō)表達(dá)增加，并可能涉及天然存在的或非天然存在的序列。"異位表達(dá)"是指表達(dá)的時(shí)間、位置和/或增加的水平并非天然存在于未改變的或野生型植物中的表達(dá)。"低表達(dá)"是指核苷酸和/或多肽序列、通常是內(nèi)源基因相對(duì)于其在野生型植物中的表達(dá)來(lái)說(shuō)表達(dá)降低。術(shù)語(yǔ)"異常表達(dá)"和"改變的表達(dá)"包含過(guò)表達(dá)、低表達(dá)和異位表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"導(dǎo)入"在將核酸序列插入到細(xì)胞中的背景中，包括例如"轉(zhuǎn)染"、或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，包括指核酸序列摻入到真核或原核細(xì)胞中，在細(xì)胞中核酸序列可以整合到細(xì)胞的基因組中(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線(xiàn)粒體DNA)、轉(zhuǎn)變成自主復(fù)制子、或被瞬時(shí)表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。本文使用的"植物細(xì)胞"是指任何源自于植物的細(xì)胞，包括來(lái)自未分化組織(例如愈傷組織)以及植物種子、花粉、繁殖芽體和胚胎的細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)"天然的"和"野生型"在涉及給定的植物性狀或表現(xiàn)型時(shí)，是指同樣品種的植物在自然界中發(fā)現(xiàn)的性狀或表現(xiàn)型形式。本文使用的術(shù)語(yǔ)"修飾的"對(duì)于植物性狀來(lái)說(shuō)，是指轉(zhuǎn)基因植物相對(duì)于類(lèi)似非轉(zhuǎn)基因植物來(lái)說(shuō)表現(xiàn)型的改變。"目標(biāo)表現(xiàn)型(性狀)"對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物來(lái)說(shuō)，是指Tl和/或隨后世代的植物表現(xiàn)的可觀(guān)察到或可測(cè)量的表現(xiàn)型，而該表現(xiàn)型在相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物(例如在類(lèi)似的條件下栽培或分析的基因型相似的植物)中不表現(xiàn)。目標(biāo)表現(xiàn)型可以代表植物的改進(jìn)，或可以提供在其它植物中產(chǎn)生改進(jìn)的手段。"改進(jìn)"是通過(guò)給植物提供獨(dú)特的和/或新的品質(zhì)，可以增加植物物種或品種的用途的特征。"病原體抗性改變表現(xiàn)型"或"病原體抗性改變"是指遺傳修飾的植物與類(lèi)似的但未修飾的植物相比，對(duì)病原性感染的應(yīng)答的可檢測(cè)變化。表現(xiàn)型可以在植物自身中看出(例如植物的生長(zhǎng)、生存力或特定組織的形態(tài)中)，或可以在病原體在植物上增殖和/或感染植物的能力中看出。本文使用的"病原體抗性改進(jìn)"是指對(duì)病原體的抗性增加。測(cè)量病原體抗性的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。參見(jiàn)，例如，Epple等,PlantCell,1997，9:509-520;Jach等，PlantJ.,1995,8:97-109;Lorito等,ProcNatlAcadSciUSA,1998，95:7860-7865;McDowell等，PlantJ,，2000，22:523-529.;McDowell等，MolPlantMicrobeInteract"2005,18:1226-1234;Schweizer等，PlantPhysiol.，1993,102:503-511;Simons等，PlantCell,1998,10:1055-1068;Stein等，PlantCell,2006，18:731-746,Epub2006Feb2006;Thomma等，CurrOpinImmunol"2001,13:63-68。因此，"病原體抗性活性"或"病原體抗性"是指在病原體感染過(guò)程中生長(zhǎng)或存活的能力。"線(xiàn)蟲(chóng)抗性表現(xiàn)型改變"或"線(xiàn)蟲(chóng)抗性改變"是指遺傳修飾的植物與類(lèi)似的但未修飾的植物相比，對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)感染的應(yīng)答的可檢測(cè)變化。表現(xiàn)型可以在植物自身中看出(例如植物的生長(zhǎng)、生存力或特定組織的形態(tài)中)，或可以在病原體在植物上增殖和/或感染植物的能力中看出，或這兩者中。本文使用的"改進(jìn)的線(xiàn)蟲(chóng)抗性"是指對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的抗性增加。測(cè)量線(xiàn)蟲(chóng)抗性的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。參見(jiàn)，例如，Cai等，Science,1997,275:832-834;Kaloshian等，MolGenGenet"1998,257:376-385;Milligan等，PlantCell,1998,10:1307-1319。因此，"線(xiàn)蟲(chóng)抗性活性"或"線(xiàn)蟲(chóng)抗性"是指在線(xiàn)蟲(chóng)感染過(guò)程中生長(zhǎng)或存活的能力。本文使用的"突變型"多核苷酸序列或基因與相應(yīng)的野生型多核苷酸或基因在序列或表達(dá)方面不同，其中所述不同促成了修飾的植物表現(xiàn)型或性狀。相對(duì)于植物或植物種系，術(shù)語(yǔ)"突變型"是指具有修飾的植物表現(xiàn)型或性狀的植物或植物種系，其中修飾的基因型或性狀與野生型多核苷酸序列或基因的修飾的表達(dá)相關(guān)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"T1"是指來(lái)自TO植物的種子的植物世代。Tl世代是通過(guò)使用選擇劑例如抗生素或除草劑篩選的第一批轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)基因植物含有針對(duì)所述選擇劑的相應(yīng)抗性基因。術(shù)語(yǔ)"T2"是指之前被篩選為轉(zhuǎn)基因的T1植物的花通過(guò)自花受精產(chǎn)生的植物世代。本文使用的術(shù)語(yǔ)"植物部分"包括任何植物器官或組織，包括但不限于種子、胚胎、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子。植物細(xì)胞可以從任何植物器官或組織以及從它們制備的培養(yǎng)物獲得?？捎糜诒竟_(kāi)方法的植物類(lèi)別總的來(lái)說(shuō)與適合轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物的門(mén)類(lèi)同樣廣泛，包括單子葉和雙子葉植物。本文使用的"轉(zhuǎn)基因植物"包括指稱(chēng)在其基因組中包含異源多核苷酸的植物。異源多核苷酸能夠穩(wěn)定地整合到基因組中，或能夠在染色體外。優(yōu)選本公開(kāi)的多核苷酸穩(wěn)定地整合在基因組中，使得多核苷酸傳遞到后續(xù)的世代。其中導(dǎo)入了異源多核苷酸的植物細(xì)胞、組織、器官或植物被認(rèn)為是"轉(zhuǎn)化的"、"轉(zhuǎn)染的"或"轉(zhuǎn)基因的"。也含有異源多核苷酸的轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的直接或間接后代，也被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因的。"分離的"或"純化的"核酸分子或蛋白或其生物活性部分，當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)時(shí)基本上沒(méi)有其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上沒(méi)有化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。優(yōu)選"分離的"核酸在核酸所源自的生物體的基因組DNA中，沒(méi)有天然位于核酸側(cè)翼的序列(例如位于核酸的5'和3'末端的序列)(優(yōu)選蛋白編碼序列)。出于本公開(kāi)的目的，"分離的"當(dāng)用于指稱(chēng)核酸分子時(shí)，除外分離的染色體。例如，在各種不同的實(shí)施方案中，分離的NMR核酸分子可以含有少于大約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的、在核酸所源自的細(xì)胞的基因組DNA中天然位于核酸分子側(cè)翼的核苷酸序列?；旧蠜](méi)有細(xì)胞物質(zhì)的NMR蛋白包括含有的非NMR蛋白(在本文中也稱(chēng)為"污染蛋白")少于大約30%、20%、10%或5%(干重)的蛋白制備物。鑒定具有改進(jìn)的病原體抗性表現(xiàn)型的植物植物中的激活標(biāo)簽(activationtagging)是指通過(guò)將含有調(diào)控序列(例如增強(qiáng)子)的異源核酸構(gòu)建體插入到植物基因組中以產(chǎn)生隨機(jī)突變的方法。調(diào)控序列可作用于增強(qiáng)一個(gè)或多個(gè)天然植物基因的轉(zhuǎn)錄；因此，激活標(biāo)簽法是產(chǎn)生功能獲得型、通常是顯性突變型的富有成效的方法(參見(jiàn)例如Hayashi等，Science,1992，258:1350-1353;Weigel等，PlantPhysiology,2000,122:1003-1013)。插入的構(gòu)建體為快速鑒定其異常表達(dá)產(chǎn)生了突變表現(xiàn)型的天然植物提供了分子標(biāo)簽。激活標(biāo)簽也可以產(chǎn)生功能喪失的表現(xiàn)型。插入可以導(dǎo)致天然植物基因的破壞，在這種情況下表現(xiàn)型一般是隱性的。激活標(biāo)簽已經(jīng)使用于各種不同的物種、包括煙草和擬南芥中，以鑒定了許多不同種類(lèi)的突變表現(xiàn)型以及與這些表現(xiàn)型相關(guān)的基因(Wilson等，PlantCell,1996，8:659-671;Schaffer等,Cell,1998,93:1219-1229;Fridborg等，PlantCell,1999,11:1019-1032;Kardailsky等,Science,1999,286:1962-1965;Christensen等，2000,Cell100:469-478)。在一個(gè)例子中，激活標(biāo)簽法被用于鑒定疾病抗性改變的突變型(Weigd等，同上)。擬南芥激活標(biāo)簽(ACTTAG)突變型篩選被用于鑒定負(fù)責(zé)病原體抗性改變表現(xiàn)型(特別是線(xiàn)蟲(chóng)抗性表現(xiàn)型)的基因[在(下面的)表3和4的第1列中列出的指定NMR#]。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，正如在實(shí)施例中進(jìn)一步描述的那樣，使用pSKI015載體對(duì)大量擬南芥植物進(jìn)行突變，該載體包含來(lái)自根瘤土壤桿菌19(Agrobacteriumtumefaciens)Ti質(zhì)粒的T-DNA、病毒增強(qiáng)子元件以及選擇性標(biāo)記基因(Weigel等，PlantPhysiology,2000,122:1003-1013)。當(dāng)T-DNA插入到轉(zhuǎn)化植物的基因組中時(shí)，增強(qiáng)子元件可以導(dǎo)致鄰近的、通常在插入位點(diǎn)的大約IO千堿基(kb)內(nèi)的基因上調(diào)。將T1植物暴露于選擇性藥劑中，以便特異性回收表達(dá)選擇性標(biāo)記物、因而蘊(yùn)藏T-DNA插入片段的轉(zhuǎn)化植物。使T1植物生長(zhǎng)到成熟期、自體受精并產(chǎn)生種子。收獲T2種子、標(biāo)記并儲(chǔ)存。在"正向遺傳學(xué)"或"反向遺傳學(xué)"篩選中鑒定顯示出對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(Meloidogynejavanica)抗性增加的ACTTAG種系。通過(guò)在爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)感染后比較ACTTAG苗和野生型苗的表現(xiàn)型，鑒定顯示出對(duì)爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)抗性增加的ACTTAG種系。通過(guò)分析鑒定的種系中T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼的基因組DNA序列，發(fā)現(xiàn)了NMR基因與病原體抗性表現(xiàn)型之間的關(guān)聯(lián)。因此，NMR基因和/或多肽可用于開(kāi)發(fā)具有修飾的病原體(例如線(xiàn)蟲(chóng))抗性表現(xiàn)型("NMR表現(xiàn)型")的遺傳修飾植物。NMR基因可以用于產(chǎn)生對(duì)爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、其它的寄生性根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)和其它寄生性線(xiàn)蟲(chóng)(例如寄生性胞囊線(xiàn)蟲(chóng))感染的抗性增加的作物和/或其它植物物種，并且也可用于產(chǎn)生對(duì)真菌、細(xì)菌和/或其它病原體的抗性增加的植物。因此，NMR基因的異常表達(dá)可能降低了對(duì)殺真菌劑和/或殺蟲(chóng)劑的需求。修飾的病原體抗性表現(xiàn)型還可以增強(qiáng)植物的整體健康。NMR核酸和多肽在"正向遺傳學(xué)"激活標(biāo)簽篩選和"反向遺傳學(xué)"激活標(biāo)簽篩選中發(fā)現(xiàn)的NMR基因分別列于表3和4的第1列中。第2列中提供了擬南芥信息源(ArabidopsisInformationResource(TAIR))識(shí)別編號(hào)。第3-4列分別提供核苷酸和多肽序列的GenBank標(biāo)識(shí)符編號(hào)(GI#s);每個(gè)引用的發(fā)表序列在此引為2006年6月13日為止的參考。第5列列出了生物化學(xué)功能和/或蛋白名稱(chēng)。第6列列出了保守的蛋白結(jié)構(gòu)域。第7列提供了來(lái)自其它植物物種的直系同源基因的核酸和多肽序列的GI#S;每個(gè)引用的發(fā)表序列在此引為本申請(qǐng)?zhí)峤蝗掌跒橹沟膮⒖?。本文使用的術(shù)語(yǔ)"NMR多肽"是指表3和4的第1列中列出的全長(zhǎng)NMR蛋白。其"功能活性的"片段、衍生物(變異體)或直系同源物，是指表現(xiàn)出與全長(zhǎng)NMR多肽相關(guān)的一種或多種或功能活性的蛋白片段、衍生物或直系同源物，也可以用于本文公開(kāi)的方法或組合物中。"片段"是指NMR蛋白或NMR蛋白的部分氨基酸序列的編碼核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以編碼NMR蛋白的生物活性部分、生物活性核酸(例如反義或小抑制性核酸)，或它可以是使用本領(lǐng)域已知的方法能夠用作雜交探針或PCR引物的片段。根據(jù)目標(biāo)用途，作為NMR核苷酸序列的片段的核酸分子，含有至少大約15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1400、1500、2000、2500、3000個(gè)連續(xù)核苷酸，或者直至本文公開(kāi)的全長(zhǎng)NMR編碼核苷酸序列中存在的核苷酸數(shù)量。"連續(xù)的"核苷酸或氨基酸是指彼此直接相鄰的核苷酸或氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，功能活性NMR多肽當(dāng)在植物中異常表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生了病原體抗性改變表現(xiàn)型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能活性NMR多肽的異常表達(dá)導(dǎo)致了對(duì)爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)和/或其它寄生性線(xiàn)蟲(chóng)的抗性增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能活性NMR多肽當(dāng)在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，能夠拯救內(nèi)源NMR活性的缺陷(包括缺乏)；拯救多肽可以來(lái)自與具有活性缺陷的物種相同或不同的物種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，全長(zhǎng)NMR多肽(例如具有NMR多肽或其天然存在的直系同源物的序列的天然多肽)的功能活性片段，保留了與全長(zhǎng)NMR多肽相關(guān)的一種或多種生物學(xué)性質(zhì)，例如信號(hào)傳導(dǎo)活性、結(jié)合活性、催化活性、或細(xì)胞或細(xì)胞外定位活性。術(shù)語(yǔ)信號(hào)傳導(dǎo)活性是指蛋白在誘導(dǎo)植物對(duì)病原體攻擊的遺傳學(xué)、生物化學(xué)或生理學(xué)應(yīng)答的信號(hào)的介導(dǎo)過(guò)程中起作用的能力。參見(jiàn)，例21如Apd&Hirt,AnnuRevPlantBiol"2004，55:373-399;Beckers&Spoel,PlantBiol(Stuttg)2006,8:1-10;Chisholm等，Cell,2006,124:803-814;以及Shah,AnnuRevPhytopathol.，2005,43:229-260。術(shù)語(yǔ)結(jié)合活性是指蛋白與另一種蛋白、DNA片段或某些其它分子結(jié)合的能力(例如Bogda麗e，PlantMolBiol"2002,50:981-989;Inohara等，AnnuRevBiochem.，2005,74:355-383禾卩Testerink&Munnik,TrendsPlantSci.,2005,10:368-375)。術(shù)語(yǔ)催化活性是指蛋白催化化學(xué)反應(yīng)的能力。參見(jiàn)，例如Bhatia等，CritRevBiotechnol"2002,22:375-407;Pedley&Martin，CurrOpinPlantBiol"2005,8:541-547;Rosahl，ZNaturforsch[C]，1996,51:123-138禾口Stone&Walker,PlantPhysiol"1995,108:451-457。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞或細(xì)胞外定位活性是指蛋白的部分與細(xì)胞的其它成分相互作用，以將蛋白定位到特定的亞細(xì)胞或細(xì)胞外位置(Crofts等，PlantPhysiol"2004，136:3414-3419;Matsuoka&Bednarek，CurrOpinPlantBiol"1998，1:463-469;Rusch&Kendall,MolMembrBiol"1995,12:295-307;Schnell&Hebert,Cell,2003，112:491-505)。NMR片段特別優(yōu)選包含NMR結(jié)構(gòu)域，例如C-或N-末端或催化結(jié)構(gòu)域，并且可以包含NMR蛋白的至少大約15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400或450個(gè)連續(xù)氨基酸，或者直至本文公開(kāi)的全長(zhǎng)NMR蛋白中存在的氨基酸總數(shù)量。NMR基因的代表性功能結(jié)構(gòu)域列于表3和4的第6列中，并可以使用INTERPRO程序(Mulder等，2003NucleicAcidsRes.31，315-318;Mulder等，2005NucleicAcidsRes.33:D201-D205)鑒定。全長(zhǎng)NMR多肽或其片段的功能活性變異體包括具有氨基酸插入、缺失或取代且保留了與全長(zhǎng)NMR多肽相關(guān)的一種或多種生物學(xué)活性的多肽。"保留生物學(xué)活性"是指變異體具有至少大約30%、優(yōu)選至少大約50%、更優(yōu)選至少大約70%、更加優(yōu)選至少大約80%的天然蛋白生物學(xué)活性，例如抗線(xiàn)蟲(chóng)活性。在某些情況下，產(chǎn)生了NMR多肽的翻譯后加工被改變的變異體。例如，與天然多肽相比，變異體可以具有改變的蛋白運(yùn)輸或蛋白定位特性，或改變的蛋白半衰期。本文使用的術(shù)語(yǔ)"NMR核酸"涵蓋了具有表3和4的第3列中引用的GenBank條目提供的序列的核酸。與表3和4的第3列中引用的GenBank條目互補(bǔ)的核酸序列，以及其功能活性片段、衍生物或其直系同源物，也可用于本文公開(kāi)的方法和組合物中。本公開(kāi)的NMR核酸可以是源自于基因組DNA或cDNA的DNA,或RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，功能活性NMR核酸編碼或互補(bǔ)于編碼功能活性NMR多肽的核酸。在該定義中包括了用作初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物(例如mRNA前體)的模板的基因組DNA，該初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物在編碼功能活性NMR多肽之前需要加工，例如剪接。NMR核酸可以包括其它非編碼序列，它們可以轉(zhuǎn)錄或可以不轉(zhuǎn)錄；這樣的序列特別包括5'和3'UTR、多聚腺苷化信號(hào)和控制基因表達(dá)的調(diào)控序列，這是本領(lǐng)域中已知的。某些多肽需要加工事件，例如蛋白水解切割、共價(jià)修飾等，以變得完全活化。因此，功能活性核酸可以編碼成熟的或加工前的NMR多肽，或中間形式。NMR多肽也可以包含異源編碼序列，例如包含編碼標(biāo)記物的序列以便于融合多肽的純化，或者包含轉(zhuǎn)化標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能活性NMR核酸能夠用于通過(guò)例如反義抑制、共抑制等，產(chǎn)生功能失去病原體抗性表現(xiàn)型。在本公開(kāi)的方法中使用的NMR核酸可以包含的核酸序列編碼的NMR多肽與表3和4的第4列中引用的GenBank條目的多肽序列具有大約60%、大約70%、大約75%、大約80%、大約85%、大約90%、大約91%、大約92%、大約93%、大約94%、大約95%、大約96%、大約97%、大約98%或大約99%的序列同一性，或?yàn)樗龊怂嵝蛄械幕パa(bǔ)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的NMR多肽可以包含NMR多肽的保守蛋白結(jié)構(gòu)域，例如在表3和4的第6列中列出的蛋白結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NMR多肽含有的多肽序列與表3和4的第4列中引用的GenBank條目的多肽的功能活性片段具有至少大約50%、大約60%、大約70%、大約80%、大約85%、大約90%或大約95%或更高的序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NMR多肽含有的多肽序列在其全長(zhǎng)范圍內(nèi)與表3和4的第4列中引用的GenBank條目的多肽序列具有至少大約50%、大約60%、大約70%、大約80%或大約90%同一性，并包含表3和4的第6列中列出的保守蛋白結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本公開(kāi)的方法中使用的NMR核酸序列含有與表3和4的第3列中引用的GenBank條目的核苷酸序列具有至少大約60%、大約70%、大約75%、大約80%、大約85%、大約90%、大約91%、大約92%、大約93%、大約94%、大約95%、大約96%、大約97%、大約98%或大約99%的序列同一性的核酸序列，或與這樣的NMR序列或其功能活性片段互補(bǔ)的核酸序列。本文使用的"序列同一性百分比(％)"對(duì)于特定的目標(biāo)序列或其特定部分來(lái)說(shuō)，定義為候選衍生序列中的核苷酸或氨基酸與目標(biāo)序列(或其特定部分)中的核苷酸或氨基酸一致的百分比，如果需要獲得最大的百分序列同一性，則在將序列比對(duì)并引入間隙后進(jìn)行，這通過(guò)程序WU-BLAST-2.0al9(Altschul等，J.Mol.Biol"215:403-410,1990)、將搜索參數(shù)設(shè)定為缺省值產(chǎn)生。HSPS和HSPS2參數(shù)是動(dòng)態(tài)值，由程序本身根據(jù)具體序列的組成和針對(duì)要搜索的目的序列的具體數(shù)據(jù)庫(kù)的組成來(lái)建立。"％同一性值"通過(guò)用匹配的一致核苷酸或氨基酸的數(shù)量除以要報(bào)告百分同一性的序列長(zhǎng)度來(lái)確定。"氨基酸序列相似性百分比(％)"通過(guò)進(jìn)行與確定％氨基酸序列同一性相同的計(jì)算來(lái)確定，但是在計(jì)算中除了一致的氨基酸之外還包含了保守氨基酸取代。"保守氨基酸取代"是指氨基酸殘基被具有類(lèi)似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代。在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有類(lèi)似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括帶有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)，帶有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，帶有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，帶有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，帶有(3-分枝側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和帶有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。NMR編碼核苷酸序列的"變異體"包括編碼本文公開(kāi)的NMR蛋白、但是由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而具有保守差別的序列，以及具有上面討論的特定序列同一性的序列。例如，優(yōu)選在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的、優(yōu)選非必需的氨基酸殘基上可以進(jìn)行保守的氨基酸取代。"非必需"的氨基酸殘基是可以從NMR蛋白的野生型序列中改變而不改變生物學(xué)活性的殘基，而"必需的"氨基酸殘基為生物學(xué)活性所需。可以在非保守區(qū)中進(jìn)行氨基酸取代而仍保留功能。一般來(lái)說(shuō)，不對(duì)保守的氨基酸殘基或位于保守基序內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行這種取代，因?yàn)檫@些殘基為蛋白活性所必需。目標(biāo)核酸分子的衍生的核酸分子包括與表3和4的第3列中引用的GenBank條目的核酸序列選擇性雜交的序列。雜交的嚴(yán)緊性可以通過(guò)雜交和清洗過(guò)程中的溫度、離子強(qiáng)度、pH和變性劑例如甲酰胺的存在來(lái)控制。常規(guī)使用條件是眾所周知的(參見(jiàn)例如《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》，CurrentProtocolinMolecularBiology,Vol.1,Chap.2.10,JohnWiley&Sons,Publishers(1994);Sambrook等，同上)。在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的核酸分子能夠在嚴(yán)緊的雜交條件下與含有表3和4的第3列中引用的GenBank條目的核酸序列的核酸分子雜交，該嚴(yán)緊條件包括將含有核酸的濾膜(filter)在含有6X單倍強(qiáng)度檸檬酸鹽(SSC)(IXSSC是0.15MNaCl、0.015M檸檬酸鈉;pH7.0)、5XDenhardt's溶液、0.05%焦磷酸鈉和100pg/ml鯡魚(yú)精子DNA的溶液中，65°C預(yù)雜交8小時(shí)到過(guò)夜；在含有6XSSC、IXDenhardt's溶液、100pg/ml酵母tRNA和0.05%焦磷酸鈉的溶液中65°C雜交18-20小時(shí)；以及在含有0.2XSSC和0.iy。SDS(十二垸基硫酸鈉)的溶液中65。C清洗濾膜l小時(shí)。在其它實(shí)施方案中，使用了中度嚴(yán)緊的雜交條件，包括將含有核酸的濾膜在含有35%甲酰胺、5XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.1%PVP、0.1%菲可(Ficoll)、1%BSA和500|ig/ml變性的鮭魚(yú)精子DNA的溶液中，40。C預(yù)處理6小時(shí)；在含有35%甲酰胺、5XSSC、50mMTris隱HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.02%PVP、0.02%菲可、0.2%BSA、100pg/ml鮭魚(yú)精子DNA禾卩10%(wt/vol)硫酸葡聚糖的溶液中，40。C雜交18-20小時(shí)；然后在含有2XSSC和0.1%SDS的溶液中55。C清洗1小時(shí)，共清洗兩次?？蛇x使用低嚴(yán)緊條件，包括在含有20%甲酰胺、5xSSC、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5XDenhardt's溶液、10%硫酸葡聚糖和20pg/ml變性的剪切過(guò)的鮭魚(yú)精子DNA的溶液中，37°C溫育8小時(shí)到過(guò)夜；在同樣的緩沖液中雜交18到20小時(shí)；以及在1xSSC中于大約37。C清洗濾膜1小時(shí)。作為遺傳密碼簡(jiǎn)并的結(jié)果，可以產(chǎn)生許多編碼NMR多肽的多核苷酸序列。例如，可以按照具體宿主生物體確定的最適密碼子用法(參見(jiàn)例如Nakamura等，1999,NucleicAcidsRes"27:292)選擇密碼子，以增加在該具體宿主物種中發(fā)生的多肽表達(dá)的速度。這樣的序列變異體可用于本公開(kāi)的方法中。本公開(kāi)的方法可以使用擬南芥NMR基因的直系同源物。每個(gè)擬南芥NMR基因的直系同源物的例子鑒定在表3和4的第7列中。在其它植物物種中鑒定直系同源物的方法在本領(lǐng)域中是已知的。通常，由于存在一個(gè)或多個(gè)蛋白基序和/或三維結(jié)構(gòu)，不同物種中的直系同源物保留了同樣的功能。在進(jìn)化中，當(dāng)在物種形成后發(fā)生基因復(fù)制事件時(shí)，一個(gè)物種例如擬南芥中的單個(gè)基因可以對(duì)應(yīng)于另一個(gè)物種中的多個(gè)基因(旁系同源物)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"直系同源物"涵蓋了旁系同源物。當(dāng)特定植物物種有可用的序列數(shù)據(jù)時(shí)，一般使用蛋白誘餌序列通過(guò)序列同源性分析例如BLAST分析來(lái)鑒定直系同源物。如果來(lái)自正向BLAST結(jié)果的最佳命中序列在反向BLAST中檢索到了原始的查詢(xún)序列，則序列被指定為潛在的直系同源物(MA和BorkP，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,95:5849-5856;HuynenMA等，GenomeResearch(2000)10:1204-1210)。用于多序列比對(duì)的程序例如CLUSTAL(ThompsonJD等，1994,NucleicAcidsRes.22:4673-4680)，可用于突出直系同源蛋白的保守區(qū)域和/或殘基，并產(chǎn)生系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。在代表來(lái)自多樣物種的多個(gè)同源序列(例如通過(guò)BLAST分析檢索到的)的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中，來(lái)自?xún)蓚€(gè)物種的直系同源序列，對(duì)于來(lái)自這兩個(gè)物種的所有其它序列來(lái)說(shuō)，通常顯得在樹(shù)上最接近。蛋白折疊的結(jié)構(gòu)穿引(structuralthreading)或其它分析(例如使用ProCeryon,Biosciences,Salzburg,Austria的軟件)也可以識(shí)別潛在的直系同源物。核酸雜交方法也可用于發(fā)現(xiàn)直系同源基因，并且當(dāng)沒(méi)有序列數(shù)據(jù)可用時(shí)是優(yōu)選的。簡(jiǎn)并PCR和cDNA或基因組DNA文庫(kù)篩選是發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因序列的常用方法，在本領(lǐng)域是眾所周知的(參見(jiàn)，例如Sambrook,同上；Dieffenbach和Dveksler主編的《PCR引物實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，PCRPrimer:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY,1989)。例如，從目標(biāo)植物物種產(chǎn)生cDNA文庫(kù)以及用部分同源的基因探針探測(cè)文庫(kù)的方法，描述在Sambrook等，同上中。擬南芥NMR編碼序列的高度保守部分可以用作探針。在高度、中度或低度嚴(yán)緊條件下，NMR直系同源核酸可以與表3和4的第3列中引用的GenBank條目的核酸雜交。在擴(kuò)增或分離推定的直系同源物片段后，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)該片段進(jìn)行克隆和測(cè)序，并用作探針來(lái)分離完整的cDNA或基因組克隆?；蛘?，可以啟動(dòng)EST工程，為目標(biāo)植物物種產(chǎn)生序列信息的數(shù)據(jù)庫(kù)。在另一種方法中，特異性結(jié)合已知NMR多肽的抗體被用于直系同源物分離。Western印跡分析可以確定特定植物物種的粗提取物中存在NMR直系同源物(例如直系同源蛋白)。當(dāng)觀(guān)察到反應(yīng)性時(shí)，可以通過(guò)篩選代表特定植物物種的表達(dá)文庫(kù)來(lái)分離編碼候選直系同源物的序列。表達(dá)文庫(kù)可以按照Sambrook等，同上中的描述，構(gòu)建到各種不同的可商購(gòu)載體中，包括Xgtll。一旦通過(guò)這些方法的任何一種鑒定到候選直系同源物后，使用候選直系同源序列作為誘餌("查詢(xún)")，用于針對(duì)擬南芥或其中已經(jīng)鑒定到NMR核酸和/或多肽序列的其它物種的序列進(jìn)行反向BLAST。NMR核酸和多肽可以使用任何可用的方法來(lái)獲得。例如，以前描述的通過(guò)篩選DNA文庫(kù)或通過(guò)使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)分離目標(biāo)cDNA或基因組DNA序列的技術(shù)，在本領(lǐng)域是眾所周知的。或者，可以合成核酸序列。任何已知的方法，例如位點(diǎn)定向誘變(KunkelTA等，1991,MethodsEnzymol.,204:125-39)或PCR介導(dǎo)的誘變，可用于在克隆的核酸中導(dǎo)入所需的改變?？偟膩?lái)說(shuō)，本公開(kāi)的方法涉及將所需形式的NMR核酸引入用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物表達(dá)載體中，以及在宿主植物中表達(dá)NMR多肽。產(chǎn)生具有病原體抗性表現(xiàn)型的遺傳修飾植物NMR核酸和多肽可用于產(chǎn)生具有修飾的病原體抗性表現(xiàn)型的遺傳修飾植物；一般來(lái)說(shuō)，關(guān)注的是抗性改進(jìn)的表現(xiàn)型。在一個(gè)實(shí)施方案中，NMR基因在植物中的表達(dá)改變被用于產(chǎn)生對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)抗性增加的植物。在其它實(shí)施方案中，異常表達(dá)NMR的植物也可以表現(xiàn)出對(duì)寄生線(xiàn)蟲(chóng)病原體的抗性改變，這些寄生線(xiàn)蟲(chóng)病原體包括但不限于根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(Meloidogynespp.)、胞囊線(xiàn)蟲(chóng)(Heteroderaspp.)、球胞囊線(xiàn)蟲(chóng)(Globoderaspp.)、珍珠線(xiàn)蟲(chóng)(Nacobbusspp.)、刺線(xiàn)蟲(chóng)(Belonolaimusspp.)、輪線(xiàn)蟲(chóng)(Criconemoidesspp.)、螺方定線(xiàn)蟲(chóng)(Helicotylenchusspp.)、劍線(xiàn)蟲(chóng)(Xiphinemaspp.)、長(zhǎng)針線(xiàn)蟲(chóng)(Longidorusspp.)、短體線(xiàn)蟲(chóng)(Pratylenchusspp.)、擬毛刺線(xiàn)蟲(chóng)(Paratrichodomsspp.)、矮化線(xiàn)蟲(chóng)(Tylencho勿nchusspp.)、莖線(xiàn)蟲(chóng)(Ditylenchusspp.)、紐帶線(xiàn)蟲(chóng)(Hoplolaimusspp.)和腎狀線(xiàn)蟲(chóng)(Rotylenchulusspp.)。還關(guān)注對(duì)真菌病原體的抗性增加。真菌病原體包括但不限于蕓薹生鏈格孢(Altemariabrassicicola)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、二孢白粉菌(Erysiphecichoracearum)、尖抱嫌刀菌(Fusariumoxysporum)、根月中菌(Plasmodiophorabrassica)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、朿U盤(pán)孢菌(Colletotrichumcoccode)、核盤(pán)菌(Sclerotiniaspp.)、曲霉(Aspergillusspp.)、青霉(Penicilliumspp.)、黑粉菌(Ustilagospp.)和腥黑菌(Tilletiaspp.)。關(guān)注的細(xì)菌病原體包括但不限于根癌土壤桿1^1fAO"T"八ko/"+0"，"tv+，，*vr(c>、t^ifTT(/*R^"f^Tfnio+voo，v\V11。、|不|、i"lg丄UUUHHLU111V1UV1V11l37、>^乂"、i￡y、^^X^|不|乂_L/iV\llilCiC4VllVljJllilti/、玉米歐文氏菌(Erwiniastewartii)、菜豆黃單胞菌(Xanthomonasphaseoli)、梨歐文氏菌(Erwiniaamylovora)、胡蘿卜歐文氏菌(Erwiniacarotovora)、丁香假單孢菌(Pseudomonassyringae)、天竺葵(Pelargoniumspp.)、菊苣假單胞菌(Pseudomonascichorii)、草莓黃單胞菌(Xanthomonasfragariae)、李假單胞菌(Pseudomonasmorsprunorum)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)。病原性感染可以影響種子、果實(shí)、花、葉、莖、塊莖、根等。因此，抗性可以在植物的任何部分中觀(guān)察到。本文描述的方法一般來(lái)說(shuō)可用于所有植物，因?yàn)镹MR基因(或其直系同源物、變異體或片段)可以在任何類(lèi)型的植物中表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)針對(duì)作物，例如玉米、大豆、棉花、水稻、小麥、大麥、番茄、油菜(canola)、草坪草和亞麻。其它的作物包括苜蓿、煙草和其它飼料作物。本公開(kāi)也特別涉及產(chǎn)水果或蔬菜的植物，包括番茄、胡蘿卜、萵苣、蠶豆、蘆筍、花椰菜、胡椒、甜菜、巻心菜、茄子、苣荬菜、韭菜、長(zhǎng)黃瓜、甜瓜、豌豆、蘿卜、砧木、短黃瓜(BeYta)、倭瓜、西瓜、白皮洋蔥、菊苣和黃洋蔥、葉蔥、花莖甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、芹菜、纈草、黃瓜、茴香、南瓜、甜玉米和小胡瓜，在插花業(yè)中使用的植物、產(chǎn)谷物植物、產(chǎn)油植物以及產(chǎn)堅(jiān)果植物等。專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，在本領(lǐng)域中存在廣泛多樣的轉(zhuǎn)化技術(shù)，并且新的技術(shù)層出不窮。任何適合靶宿主植物的技術(shù)都可以在本公開(kāi)的范圍內(nèi)運(yùn)用。例如，構(gòu)建體可以以各種形式導(dǎo)入，包括但不限于作為DNA鏈、在質(zhì)粒中或在人工染色體中。將構(gòu)建體導(dǎo)入耙植物細(xì)胞可以通過(guò)各種技術(shù)來(lái)完成，包括但不限于異源核酸的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔、微注射、微粒轟擊、磷酸鈣-DNA共沉淀、或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。植物的轉(zhuǎn)化優(yōu)選為永久性的，即將導(dǎo)入的表達(dá)構(gòu)建體整合到宿主植物基因組中，使得導(dǎo)入的構(gòu)建體傳遞到后續(xù)的植物世代。根據(jù)所計(jì)劃的應(yīng)用，含有NMR多核苷酸的異源核酸構(gòu)建體可以編碼完整的tf3^甘生物、)壬'葉卻XVibkl~l;^fiyjtHl丄WIJ乂J。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于Ti的二元載體系統(tǒng)可用于轉(zhuǎn)移多核苷酸。標(biāo)準(zhǔn)的土壤桿菌二元載體對(duì)于本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員來(lái)說(shuō)是已知的，并有許多可以商購(gòu)(例如pBIl21ClontechLaboratories,PaloAlto,CA)。用土壤桿菌載體轉(zhuǎn)化植物的最適步驟將隨著被轉(zhuǎn)化的植物類(lèi)型而變化。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的示例性方法包括轉(zhuǎn)化從無(wú)菌幼苗和/或小植株衍生的下胚軸的外植體、芽尖、莖或葉組織。這樣轉(zhuǎn)化的植物可以有性繁殖，或通過(guò)細(xì)胞或組織培養(yǎng)。以前已經(jīng)描述了對(duì)大量不同類(lèi)型植物的土壤桿菌轉(zhuǎn)化，這種轉(zhuǎn)化的方法可以在科學(xué)文獻(xiàn)中找到。其中特別相關(guān)的是轉(zhuǎn)化具有商業(yè)重要性的作物的方法，例如玉米(Fromm等，Biotechnology,1990,8:833-839;Ishida等，1996，NatureBiotechnology14:745—750)、油菜籽(DeBlock等，1989，PlantPhysiol"91:694-701)、向日葵(Everett等，1987,Bio/Technology,5:1201)和大豆(Christou等，1989,Pro"Natl.Acad.SciU.S.A.，86:7500-7504,1989;Kline等，1987,Nature,327:70)。NMR基因的表達(dá)(包括轉(zhuǎn)錄和翻譯)可以根據(jù)表達(dá)水平、發(fā)生表込tTJ矢坐々W/現(xiàn)衣仏H'、J次7反剛—權(quán)術(shù)近1丁調(diào):K。T十少開(kāi)游、'阿/卞少ll(伊j如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)可用于控制NMR核酸的表達(dá)。它們包括組成型、誘導(dǎo)型和調(diào)控型啟動(dòng)子，以及以組織-或時(shí)間-特異性方式控制表達(dá)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。示例的組成型啟動(dòng)子包括E4啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利No.5,783,393和5,783,394)、35SCaMV(JonesJD等，1992,TransgenicRes"1:285-297)、CsVMV啟動(dòng)子(VerdaguerB等，1998，PlantMol.Biol"37:1055-1067)和甜瓜肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(公布的PCT申請(qǐng)WO00/56863)。示例的組織特異性啟動(dòng)子包括番茄E4和E8啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利No.5,859,330)和番茄2AII基因啟動(dòng)子(VanHaarenMJJ等，1993，PlantMol.Biol.，21:625-640)。在一個(gè)實(shí)施方案中，NMR基因表達(dá)在病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下(Rushton等，2002，ThePlantCell,14:749-762)。'^E~^頭中jNMR因的^(b自與CsV》vlV啟^tj子相關(guān)的基因的調(diào)控序列的控制之下。另一方面，可能希望在宿主細(xì)胞中抑制內(nèi)源NMR基因的表達(dá)。用于實(shí)踐本公開(kāi)的這個(gè)方面的示例性方法包括但不限于反義抑制(Smith,等，1988,Nature,334:724-726;vanderKrol等，1988,Biotechniques，6:958-976)、共抑制(Napoli等，1990,PlantCell,2:279-289)、核酶(PCT公布WO97/10328)以及正義和反義的組合(Waterhouse等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，95:13959-13964)。用于在宿主細(xì)胞中抑制內(nèi)源序列的方法一般利用待抑制的序列的至少一部分的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻譯。這樣的序列可以與內(nèi)源序列的編碼區(qū)和非編碼區(qū)同源。反義抑制可用于完整cDNA序列(Sheehy等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:8805-8809)、包含5'編碼序列(Cannon等,1990，PlantMol.Biol"15:39-47)或3'非編碼序歹iJ(Ch'ng等，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86:10006-10010)片段的部分cDNA序列。共抑制技術(shù)可用于完整cDNA序列(Napoli等，同上；vanderKrol等,1990,ThePlantCell,2:291-299)或部分cDNA序列(Smith等，1990,Mol.Gen.Genetics,224:477-481)。可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的分子和遺傳測(cè)試，以進(jìn)一步分析基因和觀(guān)察到的表現(xiàn)型之間的關(guān)聯(lián)。示例的技術(shù)在下面描述。1.DNA/RNA分析可以通過(guò)例如原位雜交來(lái)測(cè)定突變型對(duì)野生型種系中階段和組織特異性基因的表達(dá)形式?？梢赃M(jìn)行基因、特別是側(cè)翼調(diào)控區(qū)的甲基化狀態(tài)分析。其它適合的技術(shù)包括過(guò)表達(dá)、異位表達(dá)、在其它植物物種中表達(dá)和基因敲除(反向遺傳學(xué)，定向敲除，病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)(參見(jiàn)Baulcombe，1999,Arch.Virol.Suppl.15:189-201))。在代表性的應(yīng)用中，通常通過(guò)微陣列分析進(jìn)行的表達(dá)情況分析(expressprofiling)，被用于同時(shí)測(cè)量許多不同基因表達(dá)中的差異或被;悉旦的奪/Tk田不;Sfrltt:萬(wàn)il^V古F;的站^"7t"7fc令帀+B&旦眾恥固4n的f參IJ1j、jhjJ>Cruo/ijji,外r丁zy乂j'畫(huà)/injj人zi、.u^'卞、ai^_//i/口j力hhj、—>例如Schena等，1995,Science,270:467-470;Baldwin等，1999,Cur.Opin.PlantBiol"2(2):96-103;Dangond,2000,Physiol.Genomics,2:53-58;vanHalNL等，2000,J.Biotechnol.,78:271-280;Richmond和Somerville,2000，Cur.Opin.PlantBiol.，3:108-116)?？梢赃M(jìn)行個(gè)體被標(biāo)簽的種系的表達(dá)情況分析。這種分析可以鑒定作為目的基因過(guò)表達(dá)的結(jié)果而被協(xié)同調(diào)控的其它基因，這將有助于未知基因放置到特定途徑中。2.基因產(chǎn)物分析基因產(chǎn)物分析可以包括重組蛋白表達(dá)、抗血清的生產(chǎn)、免疫定位、催化或其它活性的生物化學(xué)分析、磷酸化狀態(tài)分析，以及通過(guò)酵母雙雜交分析與其它蛋白的相互作用分析。3.途徑分析途經(jīng)分析可以包括根據(jù)基因的異常表達(dá)表現(xiàn)型或與相關(guān)基因的序列同源性，將基因或基因產(chǎn)物放置在特定生物化學(xué)、代謝或信號(hào)傳導(dǎo)途徑中。或者，分析還可以包括與野生型種系和其它突變型種系進(jìn)行遺傳雜交(產(chǎn)生雙重突變型)，以將基因在途徑中排序，或確定突變對(duì)途徑中下游"報(bào)告"基因表達(dá)的影響。產(chǎn)生具有病原體抗性表現(xiàn)型的突變植物本公開(kāi)還提供了病原體抗性增加的植物、特別是在賦予這些抗性的內(nèi)源NMR基因中具有突變的植物的鑒定方法。該方法包括從植物種群中分析至少一個(gè)NMR基因，并鑒定具有改變的(例如突變的)NMR基因的植物。NMR基因可以具有賦予病原體抗性的突變，或者它與野生型植物相比可以具有表達(dá)改變?？梢援a(chǎn)生這些沒(méi)有被遺傳修飾的植物的病原體抗性后代。產(chǎn)生和鑒定具有賦予病原體抗性的突變的植物的方法在本領(lǐng)域中是已知的。在一種被稱(chēng)為"TILLING"(在基因組中革巴定誘導(dǎo)的局部損傷(targetinginducedlocallesionsingenomes))的方法中，例如使用EMS處理在目標(biāo)植物的種子中誘導(dǎo)突變。使獲得的植物生長(zhǎng)并自體受精，將后代用于制備DNA樣品。使用NMR基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序來(lái)鑒定突變的植物是否在NMR基因中具有突變。然后可以測(cè)試具有NMR突變的植物的病原體抗性，或者可選地，可以測(cè)試植物的病原體抗性，然后使用NMR基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序來(lái)確定病原體抗性增加的植物是否具有突變的NMR基因。TILLING能夠鑒定可以改變特定基因的表達(dá)或這些基因編碼的蛋白的活性的突變(參見(jiàn)Colbert等，2001，PlantPhysiol.126:480-484;McCallum等，2000，NatureBiotechnology18:455-457)。在另一種方法中，可以在標(biāo)記物輔助的育種程序中使用候選基因/數(shù)量性狀基因座(QuantitativeTraitLoci，QTL)方法來(lái)鑒定NMR基因或NMR基因的直系同源物中可以賦予病原體抗性的突變(參見(jiàn)Foolad等，Theor.Appl.Genet"2002,104(6隱7):945國(guó)958;Rothan等，2002,Theor.Appl.Genet"105(1):145-159;Dekkers和Hospital,2002，Nat.Rev.Genet.，3:22-32)。因此，在本公開(kāi)的另一方面，NMR核酸被用于鑒定病原體抗性植物是否在內(nèi)源NMR基因中具有突變，或具有引起病原體抗性表現(xiàn)型的特定等位基因。盡管已經(jīng)參考具體的方法和實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)該理解，在不背離本發(fā)明之下可以進(jìn)行各種不同的修飾和改變。所有本文引用的出版物，出于描述和公開(kāi)可以與本發(fā)明關(guān)聯(lián)使用的組合物和方法的目的，在此明確地引為參考。所有引用的專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)以及參考的公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息(到本申請(qǐng)?zhí)峤恢諡橹?，也引為參考。實(shí)施例實(shí)施例1通過(guò)用激活標(biāo)簽構(gòu)建體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有病原體抗性表現(xiàn)型的植物使用激活標(biāo)簽(ACTTAG)載體pSKI015(GI6537289;WeigelD等，同上)產(chǎn)生突變體。使用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生擬南芥轉(zhuǎn)基因植物，該方、、/±其太k始昭/入先i^由；害dptw,nm/82a07cbi^說(shuō)4太輸te夾4g田帶有pSKI015載體的土壤桿菌轉(zhuǎn)化TO擬南芥(Col-0)植物，該載體含有源自土壤桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA、除草劑抗性選擇標(biāo)記基因、以及4XCaMV35S增強(qiáng)子元件。在Tl代根據(jù)除草劑抗性篩選轉(zhuǎn)基因植物。從T1植物收集T2種子，并儲(chǔ)存為編目的收集物，一部分T2種子進(jìn)行正向遺傳篩選。將T3種子用于反向遺傳篩選。將T2種子播種于土壤中，將植物暴露于除草劑以殺死缺少ACTTAG載體的植物。將T2植物生長(zhǎng)至成熟期，使其自體受精和結(jié)籽。對(duì)于每個(gè)種系大量收獲T3種子(來(lái)自T2植物)，對(duì)一部分T3種子進(jìn)行反向遺傳篩選(參見(jiàn)下文)。使用T3種子通過(guò)反向PCR確定ACTTAG元件在每個(gè)種系的基因組中的位置。使用基本BLASTN搜索和/或搜索擬南芥信息源(TAIR)數(shù)據(jù)庫(kù)(可以在arabid叩sis.org網(wǎng)站上獲得)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析和基因組定位。在反向遺傳篩選中考慮了38,090個(gè)具有回復(fù)的側(cè)翼序列的種系。實(shí)施例2對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)具有抗性的種系的正向遺傳篩選正向遺傳篩選作為初級(jí)和次級(jí)篩選進(jìn)行。在初級(jí)篩選中，將大約8顆來(lái)自擬南芥ACTTAG收集物的種系的T2種子和2顆來(lái)自野生型Col-0的種子種植在土壤中。種子在4°C砂藏2天，然后在25°C和60-70%相對(duì)濕度的生長(zhǎng)箱中，以10小時(shí)光照和14小時(shí)黑暗的短日照周期生長(zhǎng)8天。在每棵秧苗周?chē)耐寥乐薪臃N5000個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的卵，使植物再生長(zhǎng)20-25天。然后將每棵植物從土壤中取出并評(píng)估線(xiàn)蟲(chóng)引起的應(yīng)激。任何不顯示應(yīng)激的植物種系被交付進(jìn)一步分析。在次級(jí)篩選中，將大約40顆T2種子與野生型Col-0種子一起種植。植物的生長(zhǎng)與接種線(xiàn)蟲(chóng)卵與初級(jí)篩選中相同。在接種后20-25天對(duì)34植物進(jìn)行應(yīng)激評(píng)估。令至少有一棵植物沒(méi)有顯示應(yīng)激的所有種系再生長(zhǎng)5周。這之后，將植物從土壤中取出，清洗根系，對(duì)植物在根系上發(fā)現(xiàn)的根結(jié)進(jìn)行評(píng)估。如果在植物在其根系上的結(jié)少于20個(gè)，則被評(píng)定為有抗性。作為這些分析的結(jié)果，48個(gè)ACTTAG種系被鑒定為對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)具有抗性。實(shí)施例3顯示出線(xiàn)蟲(chóng)抗性表現(xiàn)型的植物中T-DNA插入片段的表征ACTTAG基因座數(shù)目測(cè)定和ACTTAG拷貝數(shù)測(cè)定因?yàn)锳CTTAG種系可能在超過(guò)一個(gè)遺傳基因座具有插入片段，因此在實(shí)施例2鑒定的每個(gè)種系中評(píng)估了含有ACTTAG插入片段的遺傳基因座數(shù)目。在Tl植物中，ACTTAG插入片段以半合子狀態(tài)存在(也就是說(shuō)，它們以插入到二倍體植物基因組兩個(gè)拷貝中的一個(gè)的形式存在)。由于遺傳分離，在T2植物中每個(gè)含有ACTTAG插入片段的遺傳基因座的存在比率為3:1;75%的T2植物在該基因座具有ACTTAG插入片段，25%沒(méi)有。如果Tl植物在獨(dú)立分離性基因座含有兩個(gè)ACTTAG元件，則含有任何ACTTAG元件的T2植物的數(shù)量將是87.5。/。，12.5%的植物將不含有插入片段。因?yàn)槊總€(gè)ACTTAG元件含有賦予對(duì)除草劑BASTA抗性的基因，因此可以通過(guò)測(cè)定對(duì)BASTA具有抗性的T2植物的百分率來(lái)估算含有ACTTAG元件的遺傳基因座的數(shù)量。為了確定每個(gè)種系中帶有ACTTAG插入片段的遺傳基因座的數(shù)量、對(duì)選擇性藥劑具有抗性的T2植物的比率，將50-100顆T2種子播種在土壤中，使其發(fā)芽，并記錄萌發(fā)的T2秧苗的數(shù)量。在2周時(shí)間內(nèi)對(duì)T2秧苗6次噴灑60mg/L除草劑BASTA，以殺死缺少ACTTAG插入片段的植物。測(cè)定BASTA抗性T2秧苗的數(shù)量，并計(jì)算BASTA抗性植物的百分率。有60-80%的BSATA抗性T2秧苗的種系估計(jì)其在單一遺傳基因座上帶有ACTTAG插入片段。有超過(guò)80%的BASTA抗性T2秧苗的種系估計(jì)其在超過(guò)一個(gè)遺傳基因座上帶有ACTTAG插入片段。因?yàn)槊總€(gè)遺傳基因座可以含有一個(gè)以上插入片段，因此估算了實(shí)施例2鑒定的每個(gè)種系中ACTTAG元件的數(shù)量。為了確定每個(gè)種系中存在的ACTTAG插入片段的數(shù)量，使用了基于TaqMan⑧聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，使用TaqManUniversalPCRmasterMix(AppliedBiosystems)和ABIPRISM7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(AppliedBiosystems)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，從至少18株T2秧苗的并集中分離基因組DNA。使用ACTTAG種系的DNA作為模板，在反應(yīng)混合物中同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)PCR反應(yīng)。一個(gè)PCR反應(yīng)使用特異性針對(duì)BAR基因的PCR引物，檢測(cè)了BAR基因的存在，該基因賦予了對(duì)除草劑草銨膦的抗性。另一個(gè)PCR反應(yīng)使用特異性針對(duì)ELF3基因的PCR引物，檢測(cè)了擬南芥ELF3基因的存在。在反應(yīng)過(guò)程中積累的兩個(gè)PCR產(chǎn)物的相對(duì)量被用于確定ACTTAG拷貝數(shù)。根據(jù)這些分析，選擇了5個(gè)ACTTAG種系進(jìn)行進(jìn)一步分析(參見(jiàn)實(shí)施例4)。對(duì)這些種系的ACTTAG基因座數(shù)估算值和ACTTAG拷貝數(shù)估算值顯示在下面的表1中。表1.5個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)抗性種系的ACTTAG基因座數(shù)估算值和ACTTAG拷貝數(shù)估算值。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實(shí)施例4顯示出線(xiàn)蟲(chóng)抗性表現(xiàn)型的植物中T-DNA插入片段的表征確定ACTTAG在擬南芥基因組中的插入位點(diǎn)質(zhì)粒拯救(Weigel等，同上)和/或反向PCR(iPCR;Triglia等，1988，NucleicAcidRes.,16:8186)被用于回收在正向遺傳篩選中鑒定的種系的T-DNA插入片段側(cè)翼的擬南芥基因組DNA。通過(guò)DNA測(cè)序?qū)@些分析的產(chǎn)物進(jìn)行了分析，并將序列對(duì)Exelixis數(shù)據(jù)庫(kù)或擬南芥信息源(TAIR)數(shù)據(jù)庫(kù)(可以在arabidopsis.org網(wǎng)站獲得)中的擬南芥基因組進(jìn)行基本BLASTN搜索。NMR1、NMR2、NMR3、NMR4和NMR5中ACTTAG的位置描述如下。NMR1:ACTTAG插入片段的右邊界剛好位于擬南芥DNA染色體3，BAC克隆F14D17(>gi|7671394|emb|AL353992.1|ATF14D17)的5042位核苷酸的上游。該插入片段的另一側(cè)被確定為左邊界，剛好位于擬南芥DNA染色體3，BAC克隆F14D17(〉gil7671394l)的5042位核苷酸的下游。NMR2:ACTTAG插入片段的左邊界剛好位于擬南芥基因組DNA，染色體5，BAC克隆T32G24Ogil4589451ldbJIAB025642.1IAB025642)的931位核苷酸的上游。NMR3:ACTTAG插入片段的左邊界剛好位于擬南芥基因組DNA，染色體1，BAC克隆:F15H18(>別6684172)的51143位核苷酸的下游。另一側(cè)是左邊界，剛好位于擬南芥DNA染色體1，BAC克隆:F15H18(>別6684172)的~51333位核苷酸的上游。NMR4:ACTTAG插入片段的左邊界剛好位于擬南芥基因組DNA染色體3，BAC克隆:F4P12(>別6434215)的~120310位核苷酸的上游。另一側(cè)是左邊界，剛好位于擬南芥DNA染色體3，BAC克隆:F4P12(>別6434215)的~120307位核苷酸的下游。NMR5:ACTTAG插入片段的右邊界剛好位于擬南芥基因組DNA，染色體1，BAC克隆F21M12(>別2160155)的~126494位核苷酸的上游。另一側(cè)是右邊界，剛好位于擬南芥基因組DNA染色體1，BAC克隆:F21M12(>別2160155)的~126507位核苷酸的下游。實(shí)施例5候選基因在表現(xiàn)出病原體抗性改變表現(xiàn)型的ACTTAG植物中的鑒定和表達(dá)分析線(xiàn)蟲(chóng)抗性種系中，翻譯起始密碼子位于A(yíng)CTTAG插入片段的大約10kbp內(nèi)的基因，被認(rèn)為位于"激活空間"內(nèi)。由于A(yíng)CTTAG插入片段中的4XCaMV35S增強(qiáng)子元件，這些候選基因的表達(dá)在線(xiàn)蟲(chóng)抗性種系中可能被上調(diào)。ACTTAG種系NMR1、NMR2、NMR3、NMR4和NMR5的候選基因列于表2的第2列中。在conviron箱中10小時(shí)光照14小時(shí)黑暗周期下生長(zhǎng)的30日齡BASTA抗性T2植物的葉片中，分析這些候選基因的表達(dá)改變。在同樣平臺(tái)中、因而在同樣環(huán)境條件下生長(zhǎng)的野生型植物用作對(duì)照，進(jìn)行SYBR綠色染料實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析。具體來(lái)說(shuō)，從來(lái)自表現(xiàn)出病原體抗性表現(xiàn)型的植物和野生型COL-0植物的組織中提取RNA。使用特異性針對(duì)具有表2第3列中顯示的序列ID的基因和針對(duì)組成型表達(dá)的肌動(dòng)蛋白基因(ACT2，陽(yáng)性對(duì)照)的引物，進(jìn)行了SYBR綠色染料實(shí)時(shí)定量RT-PCR。ACTTAG種系NMR1、NMR2、NMR3、NMR4和NMR5的候選基因的表達(dá)分析結(jié)果顯示在表2的第5列中。表2.ACTTAG種系NMR1、NMR2、NMR3、NMR4和NMR5的候選基因的表達(dá)分析1<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>實(shí)施例6擬南芥NMR序列的分析使用BLAST(Altschul等，19卯，J.Mol.Biol.215:403-410)、PFAM(Bateman等，1999,NucleicAcidsRes.27:260-262)禾口/或INTERPRO(Mulder等,2003NucleicAcidsRes.31,315-318;Mulder等，2005NucleicAcidsRes.33:D201-D205)進(jìn)行NMR序列分析。這些分析的結(jié)果列于表3中。40表3.在正向遺傳篩選中鑒定的擬南芥NMR序列的分析<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>1.基因別名TAIR3.核酸序列GI#4.多肽序列GI#5.生物化學(xué)功倉(cāng)g/蛋白名稱(chēng)6.保守蛋白結(jié)構(gòu)域7.直系同源基因核酸/多肽序列GI#核酸GI#多肽GI#物種NMR5CAtlg09935gi|42570079gi|42570080磷酸甘油酸/二磷酸甘油酸歧化酶家族蛋白IPR001345磷酸甘油酸/二磷酸甘油酸歧化酶gi|21700764gi|21700765黃豆gi|21700766gi|21700767黃豆gi|50921188gi|50921189粳稻(日本晴)薩R5DAtlg09940gi|30681461gi|15218333谷氨酰-tRNA還原酶2/GIuTR(HEMA2)IP畫(huà)0343谷氨酰-tRNA還原酶gi|30696246gi|15217924擬南芥IPR006151莽草酸/奎尼酸5-脫氫酶gi|4324494gi|4324495黃豆PF00745谷氨酰-tRNAGlu還原酶，二聚化結(jié)構(gòu)域gi|1694925gi|1694926黃瓜(Cucumissativus)IPR004455NADP氧化還原酶，輔酶F420依賴(lài)性麗R5EAtlg09950gi|30681468gi|15218335轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)gi|30696249gi|18406255擬南芥gi|49333382gi|49333398棉花gi|42566935gi|30684489擬南芥麗R5FAtlg09960gi|30681472gi卩5218362庶糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/蔗糖-質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SUT4)IPR011701主要協(xié)助因子超家族MFS—1gi|49609487gi|49609488北美假大麻(Datiscaglomemta)IPR005989蔗糖/H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白gi|52078040gi|52078041蓖麻(Ricinuscommunis)IPR011010DNA斷裂-重新連接酶，催化核心gi|38327322gi|38327323蘋(píng)果47實(shí)施例7使用"反向遺傳學(xué)"篩選鑒定擬南芥線(xiàn)蟲(chóng)抗性基因使用"反向遺傳學(xué)"篩選來(lái)鑒定擬南芥線(xiàn)蟲(chóng)抗性(NMR)基因。在該方法中，擬南芥基因被當(dāng)作候選線(xiàn)蟲(chóng)抗性基因。為了確定這些基因的異常表達(dá)是否引起線(xiàn)蟲(chóng)抗性表現(xiàn)型，從實(shí)施例1中描述的放置了FST的38,0卯個(gè)ACTTAG種系中，鑒定了在這些基因的翻譯起始密碼子的9kbp內(nèi)("激活空間")具有預(yù)測(cè)的CaMV35S增強(qiáng)子元件的ACTTAG種系。按照實(shí)施例2中的描述對(duì)在候選基因附近具有插入片段的ACTTAG種系進(jìn)行了線(xiàn)蟲(chóng)(爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng))抗性表現(xiàn)型評(píng)估。在11個(gè)候選基因的"激活空間"內(nèi)含有ACTTAG插入片段逝—ACTTAG種系被確定對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)有抗性。這些基因列于表4中。PFAM(Bateman等，1999,NucleicAcidsRes.27:260-262)禾口/或INTERPRO(Mulder等，2003NucleicAcidsRes.31,315-318;Mulder等，2005NucleicAcidsRes.33:D201-D205)分析的結(jié)果顯示在表4中。表4.在反向遺傳篩選中鑒定的擬南芥NMR序列的分析1.基因別名2.TAIR3.核酸序列GI#4.多肽序列GI#5.生物化學(xué)功能/蛋白名稱(chēng)6.保守蛋白結(jié)構(gòu)域7.直系同源基因核酸/多肽序列GI#核酸GI#多肽GI#物種畫(huà)謂OlAtlg75250gil18410812gi|15222161myb家族轉(zhuǎn)錄因子IPR001005Myb,DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域gi|30686408gi|30686409擬南芥gi|42569222gi|15226604擬南芥gi|18420407gi|15234999擬南芥NMR1002Atlg07930gi|30680419gi|18390829延伸因子l-a/EF-l-aIPR000795蛋白合成因子，GTP-結(jié)gi|30680422gi|18390831擬南芥IPR004160延伸因子Tu，C-末端gi|927382gi|1864017煙草IPR004161延伸因子Tu,結(jié)構(gòu)域2gi|439576gi|439577煙草IPR002917GTP結(jié)合蛋白，HSR1相關(guān)IPR004539翻譯延伸因子EF隱l,a亞基IPR004535翻譯延伸因子，硒代半胱氨酸特異性IPR004541翻譯延伸因子TuIPR005225小GTP結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域IPR006297GTP結(jié)合蛋白LepA49<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>1.基因別名2.TAIR3.核酸序列GI#4.多肽序歹!jGI#5.生物化學(xué)功能/蛋白名稱(chēng)6.保守蛋白結(jié)構(gòu)域7.直系同源基因核酸/多肽序列GI#核酸GI#多肽GI#物種gi|397474gi|397475豌豆顧R1007At5g58330gi|42570606gi|30697049蘋(píng)果酸脫氫酶[NADP]，葉綠體，推定的IP畫(huà)1252蘋(píng)果酸脫氫酶，活性位點(diǎn)gi|42568623gi|30697051擬南芥IP謹(jǐn)1236乳酸/蘋(píng)果酸脫氫酶gi|2827075gi|2827076紫花苜蓿gi|397474gi!397475豌豆NMR1008At4gl0340gi|42566395gi|15235029葉綠素A-B結(jié)合蛋白CP26,葉綠體/捕光復(fù)合物II蛋白5/LHCIIc(LHCB5)IPR001344葉綠素A-B結(jié)合蛋白gi|1644288gi|1644289芥菜(Brassicajuncsa)gi|19183gi|19184番茄gi:42794111gi:62733869粳稻(曰本晴)麗R訓(xùn)9At4gl3940gi|30682653gi|15236376腺苷高半胱氨酸水解酶/s-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶/AdoHcyass(SAHH)IPR000043S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶gi|30687216gi|15229522擬南芥IPR006140D-異構(gòu)體特異性2-羥基酸脫氫酶，NAD結(jié)合gi|441216gi|441217美花煙草52<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>實(shí)施例8線(xiàn)蟲(chóng)抗性表現(xiàn)型的再現(xiàn)對(duì)正向和反向遺傳篩選中鑒定的基因進(jìn)行測(cè)試，以鑒定直接的過(guò)表達(dá)是否可以賦予對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的抗性。為此，將表3和4的第2列中列出的基因克隆到植物轉(zhuǎn)化載體中組成型CsVMV啟動(dòng)子的后面，并使用花浸泡方法轉(zhuǎn)化到擬南芥植物中。植物轉(zhuǎn)化載體含有RE4啟動(dòng)子發(fā)動(dòng)的選擇性標(biāo)記物的編碼基因，以提供對(duì)細(xì)胞毒性藥劑的抗性，并用作選擇性標(biāo)記物。將來(lái)自轉(zhuǎn)化植物的種子放在含有細(xì)胞毒性藥劑的瓊脂培養(yǎng)基上。10天后，轉(zhuǎn)基因植物被鑒定為健康的綠色植物，并移植到土壤中。非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植物在瓊脂培養(yǎng)基上發(fā)芽，使其生長(zhǎng)10天，然后移植到土壤中。從含有每種構(gòu)建體的20個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)化子收集T2種子。在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)試T2植物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的抗性。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將來(lái)自轉(zhuǎn)基因事件的大約13個(gè)T2種子種植在IO行盤(pán)的土壤中。每個(gè)盤(pán)中8行種有8個(gè)轉(zhuǎn)基因種系(每行一個(gè)事件)，2行種有野生型Col-0種子；對(duì)含有Col-0的1行進(jìn)行接種并用作陰性對(duì)照，另一行不接種而用作陽(yáng)性對(duì)照。種子在4。C砂藏2天，然后在25°<:和60-70%相對(duì)濕度的生長(zhǎng)箱中，以10小時(shí)光照和14小時(shí)黑暗的短日照周期生長(zhǎng)8天。在每棵轉(zhuǎn)基因秧苗和用作陰性對(duì)照的Col-0植物周?chē)耐寥乐薪臃N5000個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)爪哇根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的卵，使植物再生長(zhǎng)40-50天。這時(shí)將植物從土壤中取出，清洗根系并記錄每棵植物的根結(jié)數(shù)量。建立評(píng)分系統(tǒng)來(lái)比較每棵植物上根結(jié)的數(shù)量。有0到5個(gè)根結(jié)的植物給分為1，6到IO個(gè)根結(jié)的植物給分為2，11到15個(gè)根結(jié)的植物給分為3，16到20個(gè)根結(jié)的植物給分為4，超過(guò)20個(gè)根結(jié)的植物給分為5。一般來(lái)說(shuō)，如果植物的根結(jié)少于20個(gè)，它被評(píng)定為有抗性。每個(gè)抗性植物(根結(jié)少于20個(gè))根據(jù)其根系上根結(jié)的數(shù)量打分。表5中的基因顯示了陽(yáng)性再現(xiàn)結(jié)果。表5TAIRID別名克隆名稱(chēng)Atlgl8350NMR3隱ApNT-4581At3g53620函R4隱DpNT-45卯Atlg09960麗R5陽(yáng)FpNT-4599Atlg07930畫(huà)R1002pNT-4942Atlgl5270NMR1004pNT-4944At2g37220NMR1005pNT-4945At4gl0340NMR1008pNT國(guó)4948At4gl3940NMR1009pNT-494954實(shí)施例9Atlgl8350過(guò)表達(dá)賦予線(xiàn)蟲(chóng)抗性通過(guò)培育含有CsVMV啟動(dòng)子的T2植物，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)20個(gè)上述獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件中的Atlgl8350表達(dá)，測(cè)試了Atlg18350(NMR3-A)過(guò)表達(dá)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)抗性的影響。每種構(gòu)建體在4份重復(fù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)試，對(duì)每棵植物的根結(jié)計(jì)數(shù)。按照上面的描述對(duì)每棵植物的根結(jié)數(shù)量進(jìn)行打分。對(duì)于5個(gè)轉(zhuǎn)化事件來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因植物的得分與接種的野生型對(duì)照植物有顯著差別，雙因素ANOVA檢驗(yàn)確定它們具有的根結(jié)明顯少于轉(zhuǎn)基因植物(p50.05)，并表明它們對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)感染具有抗性。表6顯示了事件號(hào)碼、ANOVAp值、轉(zhuǎn)基因植物(樣品)的平均得分和對(duì)照植物的平均得分。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>實(shí)施例10At3g53620過(guò)表達(dá)賦予線(xiàn)蟲(chóng)抗性通過(guò)培育含有CsVMV啟動(dòng)子的T2植物，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)20個(gè)上述獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件中的At3g53620表達(dá)，測(cè)試了At3g53620(NMR4-D)過(guò)表達(dá)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)抗性的影響。每種構(gòu)建體在4份重復(fù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)試，對(duì)每棵植物的根結(jié)計(jì)數(shù)。按照上面的描述對(duì)每棵植物的根結(jié)數(shù)量進(jìn)行打分。對(duì)于7個(gè)轉(zhuǎn)化事件來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因植物的得分與接種的野生型對(duì)照植物有顯著差別，雙因素ANOVA檢驗(yàn)確定它們具有的根結(jié)明顯少于轉(zhuǎn)基因植物(p50.05)，并表明它們對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)感染具有抗性。表7顯示了事件號(hào)碼、ANOVAp值、轉(zhuǎn)基因植物(樣品)的平均得分和對(duì)照植物的平均得分。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>實(shí)施例11Atlg09960過(guò)表達(dá)賦予線(xiàn)蟲(chóng)抗性通過(guò)培育含有CsVMV啟動(dòng)子的T2植物，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)20個(gè)上述獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件中的Atlg09960表達(dá)，測(cè)試了Atlg09960(NMR5-F)過(guò)表達(dá)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)抗性的影響。每種構(gòu)建體在4份重復(fù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)試，對(duì)每棵植物的根結(jié)計(jì)數(shù)。按照上面的描述對(duì)每棵植物的根結(jié)數(shù)量進(jìn)行打分。對(duì)于ll個(gè)轉(zhuǎn)化事件來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因植物的得分與接種的野生型對(duì)照植物有顯著差別，雙因素ANOVA檢驗(yàn)確定它們具有的根結(jié)明顯少于轉(zhuǎn)基因植物(pS0.05)，并表明它們對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)感染具有抗性。表8顯示了事件號(hào)碼、ANOVAp值、轉(zhuǎn)基因植物(樣品)的平均得分和對(duì)照植物的平均得分。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>實(shí)施例12Atlg07930過(guò)表達(dá)賦予線(xiàn)蟲(chóng)抗性通過(guò)培育含有CsVMV啟動(dòng)子的T2植物，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)20個(gè)上述獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件中Atlg07930表達(dá)，測(cè)試了Atlg07930(NMR1002)過(guò)表達(dá)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)抗性的影響。每種構(gòu)建體在4份重復(fù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)試，對(duì)每棵植物的根結(jié)計(jì)數(shù)。按照上面的描述對(duì)每棵植物的根結(jié)數(shù)量進(jìn)行打分。對(duì)于6個(gè)轉(zhuǎn)化事件來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因植物的得分與接種的野生型對(duì)照植物有顯著差別，雙因素ANOVA檢驗(yàn)確定它們具有的根結(jié)明顯少于轉(zhuǎn)基因植物(p50.05)，并表明它們對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)感染具有抗性。表9顯示了事件號(hào)碼、ANOVAp值、轉(zhuǎn)基因植物(樣品)的平均得分和對(duì)照植物的平均得分。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>實(shí)施例13Atlgl5270過(guò)表達(dá)賦予線(xiàn)蟲(chóng)抗性通過(guò)培育含有CsVMV啟動(dòng)子的T2植物，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)20個(gè)上述獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件中的Atlgl5270表達(dá)，測(cè)試AUgl5270(NMR1004)過(guò)表達(dá)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)抗性的影響。每種構(gòu)建體在4份重復(fù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)試，對(duì)每棵植物的根結(jié)計(jì)數(shù)。按照上面的描述對(duì)每棵植物的根結(jié)數(shù)量進(jìn)行打分。對(duì)于IO個(gè)轉(zhuǎn)化事件來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因植物的得分與接種的野生型對(duì)照植物有顯著差別，雙因素ANOVA檢驗(yàn)確定它們具有的根結(jié)明顯少于轉(zhuǎn)基因植物(pS0.05),并表明它們對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)感染具有抗性。表10顯示了事件號(hào)碼、ANOVAp值、轉(zhuǎn)基因植物(樣品)的平均得分和對(duì)照植物的平均得分。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實(shí)施例14At2g37220過(guò)表達(dá)賦予線(xiàn)蟲(chóng)抗性通過(guò)培育含有CsVMV啟動(dòng)子的T2植物，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)20個(gè)上述獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件中的At2g37220表達(dá)，測(cè)試了At2g37220(NMR1005)過(guò)表達(dá)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)抗性的影響。每種構(gòu)建體在4份重復(fù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)試，對(duì)每棵植物的根結(jié)計(jì)數(shù)。按照上面的描述對(duì)每棵植物的根結(jié)數(shù)量進(jìn)行打分。對(duì)于6個(gè)轉(zhuǎn)化事件來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因植物的得分與接種的野生型對(duì)照植物有顯著差別，雙因素ANOVA檢驗(yàn)確定它們具有的根結(jié)明顯少于轉(zhuǎn)基因植物(pS0.05)，并表明它們對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)感染具有抗性。表ll顯示了事件號(hào)碼、ANOVAp值、轉(zhuǎn)基因植物(樣品)的平均得分和對(duì)照植物的平均得分。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>實(shí)施例15At4gl0340過(guò)表達(dá)賦予線(xiàn)蟲(chóng)抗性通過(guò)培育含有CsVMV啟動(dòng)子的T2植物，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)20個(gè)上述獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件中的At4gl0340表達(dá)，測(cè)試了At4gl0340(NMR1008)過(guò)表達(dá)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)抗性的影響。每種構(gòu)建體在4份重復(fù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)試，對(duì)每棵植物的根結(jié)計(jì)數(shù)。按照上面的描述對(duì)每棵植物的根結(jié)數(shù)量進(jìn)行打分。對(duì)于5個(gè)轉(zhuǎn)化事件來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因植物的得分與接種的野生型對(duì)照植物有顯著差別，雙因素ANOVA檢驗(yàn)確定它們具有的根結(jié)明顯少于轉(zhuǎn)基因植物(p50.05)，并表明它們對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)感染具有抗性。表12顯示了事件號(hào)碼、ANOVAp值、轉(zhuǎn)基因植物(樣品)的平均得分和對(duì)照植物的平均得分。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>實(shí)施例16At4gl3940過(guò)表達(dá)賦予線(xiàn)蟲(chóng)抗性通過(guò)培育含有CsVMV啟動(dòng)子的T2植物，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)20個(gè)上述獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件中的At4gl3940表達(dá)，測(cè)試了At4g13940(NMR1009)過(guò)表達(dá)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)抗性的影響。每種構(gòu)建體在4份重復(fù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)試，對(duì)每棵植物的根結(jié)計(jì)數(shù)。按照上面的描述對(duì)每棵植物的根結(jié)數(shù)量進(jìn)行打分。對(duì)于7個(gè)轉(zhuǎn)化事件來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因植物的得分與接種的野生型對(duì)照植物有顯著差別，雙因素ANOVA檢驗(yàn)確定它們具有的根結(jié)明顯少于轉(zhuǎn)基因植物(pS0.05)，并表明它們對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)感染具有抗性。表13顯示了事件號(hào)碼、ANOVAp值、轉(zhuǎn)基因植物(樣品)的平均得分和對(duì)照植物的平均得分。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>權(quán)利要求1.在其基因組中穩(wěn)定整合DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物，所述構(gòu)建體含有的核苷酸序列編碼具有病原體抗性活性的蛋白，其中所述核苷酸序列選自a)在表3和4的第3列中鑒定的核苷酸序列，或其互補(bǔ)序列；b)與表3和4的第3列中鑒定的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，或其互補(bǔ)序列；c)編碼的多肽含有表3和4的第4列中鑒定的氨基酸序列的核苷酸序列；以及d)編碼的多肽與表3和4的第4列中鑒定的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；其中所述核苷酸序列與驅(qū)動(dòng)編碼序列在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作連接。2.權(quán)利要求1的植物，其中所述植物對(duì)至少一種線(xiàn)蟲(chóng)的抗性增加。3.權(quán)利要求1的植物，其中所述植物對(duì)至少一種細(xì)菌的抗性增加。4.權(quán)利要求l的植物，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。5.權(quán)利要求l的植物，其中所述植物選自油菜籽、大豆、玉米、向日葵、棉花、可可、紅花、油棕、椰子樹(shù)、亞麻、蓖麻和花生、番茄、胡蘿卜、萵苣、蠶豆、蘆筍、花椰菜、胡椒、甜菜、巻心菜、茄子、苣荬菜、韭菜、長(zhǎng)黃瓜、甜瓜、豌豆、蘿卜、砧木、短黃瓜(BeltoO、倭瓜、西瓜、白皮洋蔥、菊苣、黃洋蔥、花莖甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、葉蔥、芹菜、纈草、黃瓜、茴香、葫蘆、南瓜、甜玉米和小胡瓜。6.產(chǎn)生病原體抗性增加的植物的方法，所述方法包括a)在植物或其細(xì)胞中導(dǎo)入至少一種植物轉(zhuǎn)化載體，所述載體含有核苷酸序列或其變異體，所述核酸序列是表3和4的第4列中鑒定的NMR多肽的編碼序列或其互補(bǔ)序列，以及b)培育轉(zhuǎn)化的植物或細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出對(duì)至少一種病原體的抗性增加。7.權(quán)利要求6的方法獲得的植物。8.從權(quán)利要求7的植物獲得的植物部分。9.權(quán)利要求7的植物的轉(zhuǎn)化種子。10.產(chǎn)生病原體抗性增加的植物的方法，包括鑒定NMR基因改變的植物以及產(chǎn)生該植物的后代，其中所述后代的病原體抗性增加，并且其中NMR基因是在表3和4的第4列中鑒定的基因。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述植物的線(xiàn)蟲(chóng)抗性增加。12.權(quán)利要求10的方法，其中NMR基因的表達(dá)被改變。13.權(quán)利要求10的方法，其中NMR基因具有突變。14.權(quán)利要求10的方法，其中所述植物使用候選基因/QTL方法學(xué)來(lái)鑒定。15.權(quán)利要求10的方法，其中所述植物使用TILLING方法學(xué)來(lái)鑒定。16.鑒定病原體抗性增加的植物的方法，包括分析植物的至少一個(gè)NMR基因，并鑒定NMR基因改變的植物，其中該植物的病原體抗性增加。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述植物的線(xiàn)蟲(chóng)抗性增加。18.權(quán)利要求16的方法，其中NMR基因的表達(dá)被改變。19.權(quán)利要求16的方法，其中NMR基因具有突變。20.權(quán)利要求16的方法，其中所述植物使用候選基因/QTL方法來(lái)鑒定。全文摘要本公開(kāi)涉及由于NMR核酸的表達(dá)改變而顯示出病原體抗性改變表現(xiàn)型(例如線(xiàn)蟲(chóng)抗性增加)的植物。本發(fā)明還涉及病原體抗性改變表現(xiàn)型的植物的產(chǎn)生方法。文檔編號(hào)C12N15/82GK101501200SQ200780028871公開(kāi)日2009年8月5日申請(qǐng)日期2007年6月13日優(yōu)先權(quán)日2006年6月13日發(fā)明者D·利·瓦格納,紹尚·哈蘭申請(qǐng)人:農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)有限責(zé)任公司