專利名稱：能夠與肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子結(jié)合的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與細(xì)胞膜結(jié)合的肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子
(在后文稱為"HB-EGF ")、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF結(jié)合 的單克隆抗體或其抗體片段。
HB-EGF由Higashiyama等在1992年從巨噬細(xì)胞分化的人類巨噬 細(xì)胞樣細(xì)胞系U-937的培養(yǎng)上清液中分離和純化(非專利文獻(xiàn)1)。 HB-EGF帶有在表皮生長(zhǎng)因子(EGF)家族中保留的6個(gè)共有的半胱氨 酸殘基，并屬于EGF家族，與屬于EGF家族的其它蛋白情況相類似， 被合成為I型膜蛋白(非專利文獻(xiàn)1和2)。膜型的HB-EGF被金屬蛋 白酶轉(zhuǎn)化成14到22千道爾頓(在后文中稱為"kDa")的分泌型HB-EGF， 該金屬蛋白酶由各種不同的生理刺激例如由于熱或滲透壓導(dǎo)致的應(yīng) 力、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)溶血磷脂酸(LPA) 所激活(非專利文獻(xiàn)1到3)。分泌型HG-EGF結(jié)合EGF受體 (EGFR/ErbBl)(非專利文獻(xiàn)1) 、 ErbB4 (非專利文獻(xiàn)4)和N-精氨 酸二堿轉(zhuǎn)化酶(N-arginine dibasic convertase)(非專利文獻(xiàn)5)，并對(duì) 于成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)1)、角質(zhì)細(xì)胞(非專利文獻(xiàn) 6)、肝細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)7)和系膜細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)8)具有生長(zhǎng) 加速活性。此外，也已知道HB-EGF與例如心臟瓣膜的器官發(fā)生(非 專利文獻(xiàn)28、 29和31)、傷口愈合(非專利文獻(xiàn)9和10)、動(dòng)脈粥 樣硬化引起的平滑肌細(xì)胞增生(非專利文獻(xiàn)11)、再狹窄(非專利文 獻(xiàn)12和13)、肺動(dòng)脈高血壓(非專利文獻(xiàn)14)、肝再生(非專利文 獻(xiàn)15)、腦病(非專利文獻(xiàn)16)和癌癥(非專利文獻(xiàn)28到35)有關(guān)。
另一方面，己經(jīng)報(bào)道有相當(dāng)數(shù)量的在細(xì)胞表面上表達(dá)的膜型HB-EGF沒有被消化成其分泌型(非專利文獻(xiàn)17)。已知膜型的HB-EGF 在細(xì)胞表面上與CD9等四次跨膜蛋白(tetraspanin)或整合素a3pi形 成復(fù)合物，并且也已經(jīng)報(bào)道它作為近分泌生長(zhǎng)因子與鄰近的細(xì)胞相互 作用(非專利文獻(xiàn)17到22)。此外，Naglich等己經(jīng)報(bào)道，膜型HB-EGF 起白喉毒素受體的作用，與白喉毒素進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)化作用有關(guān)(非專 利文獻(xiàn)23)。
當(dāng)Mekada等通過制備HB-EGF敲除(KO)小鼠分析HB-EGF的 生理功能時(shí)，HB-EGF KO小鼠顯示出心室膨大、心功能降低和心瓣 膜肥大癥狀，超過一半的動(dòng)物在出生后幾天中死去。該事實(shí)顯示出 HB-EGF是對(duì)于心臟的發(fā)育和功能維持來說必要的蛋白(非專利文獻(xiàn) 24)。
接下來，Mekada等制備了兩個(gè)HB-EGF的基因， 一個(gè)HB-EGF由 于在蛋白酶消化位點(diǎn)中引入了突變而變得不能轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谛?在后文 中稱為"HBue")，另一個(gè)HB-EGF缺少跨膜區(qū)的HB-EGF被分泌， 并且其分泌不依賴于蛋白酶消化(在后文中稱為"HBAtm")。通過制 備表達(dá)相應(yīng)HB-EGF突變體的轉(zhuǎn)基因小鼠，分析了膜型和分泌型 HB-EGF的生理功能(非專利文獻(xiàn)25)。結(jié)果，因?yàn)楸磉_(dá)HBue的小鼠 顯示出的癥狀與HB-EGF KO小鼠類似，因此認(rèn)為分泌型HB-EGF起 活性型蛋白的作用。大多數(shù)表達(dá)HBAtm的小鼠在新生期之前或新生期 死亡。此外，在突變僅被引入到一個(gè)等位基因中的表達(dá)HBA^+的小鼠 中，發(fā)現(xiàn)了角質(zhì)細(xì)胞增生和心室肥大。這些癥狀是與HB-EGFKO小鼠 和HBue小鼠的癥狀直接相反的表現(xiàn)型。CRM197已知是白喉毒素的突 變體(非專利文獻(xiàn)26)，特異性抑制HB-EGF的細(xì)胞生長(zhǎng)加速活性， 并且不透過細(xì)胞膜。因?yàn)樵揅RM197抑制了作為表達(dá)HBA^小鼠的表 現(xiàn)型的增生和心室肥大，因此認(rèn)為在表達(dá)HBA^的小鼠中形成的HBAt"1 不通過在其分泌前與其細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合而起作用，而是通過在分泌到 細(xì)胞外后與細(xì)胞表面上的受體結(jié)合而起作用。因此，在活體中膜型的 HB-EGF與分泌型HB-EGF之間的定量平衡，對(duì)于維持正常的生理功能是必要的，據(jù)認(rèn)為，從HB-EGF的膜型轉(zhuǎn)化為分泌型的過程在活體 中是受控的。
Higashiyama等發(fā)現(xiàn)，在通過縮窄胸主動(dòng)脈誘導(dǎo)心臟肥大的小鼠心 臟中，心臟中的分泌型HB-EGF蛋白增加。已經(jīng)報(bào)道，當(dāng)給該小鼠施 用能夠抑制將膜型HB-EGF轉(zhuǎn)化為分泌型的蛋白酶的低分子量化合物 時(shí)，作為在心臟中抑制膜型HB-EGF向分泌型轉(zhuǎn)化的結(jié)果，心臟肥大 被抑制了 (非專利文獻(xiàn)27)。
到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了與正常組織相比，HB-EGF在各種不同 的癌癥中以高水平表達(dá)，例如乳腺癌、肝癌、胰腺癌和膀胱癌(非專 利文獻(xiàn)28到31)。此外，最近也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，HB-EGF對(duì)于癌癥的增殖 是一種重要因子(非專利文獻(xiàn)32和33)。Mekada等已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HB-EGF 的小干擾RNA (siRNA)被導(dǎo)入到癌細(xì)胞系中時(shí)，或在將人類卵巢癌 細(xì)胞系移植到裸鼠的模型系統(tǒng)中，將CRM197施用于移植了癌細(xì)胞系 的小鼠時(shí)，識(shí)別到明顯的腫瘤生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。此外，Higashiyama等 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)入了 HB-EGF基因的膀胱癌細(xì)胞系中，細(xì)胞生長(zhǎng)、集 落形成能力、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)和周期蛋白Dl的表 達(dá)等體外增加。此外，已經(jīng)報(bào)道，在體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了致瘤性的增加和腫 瘤血管生成的增加。這樣的生長(zhǎng)刺激活性只有當(dāng)膜型HB-EGF基因或 分泌型HB-EGF基因表達(dá)時(shí)才能發(fā)現(xiàn)，但是當(dāng)強(qiáng)制表達(dá)具有蛋白酶抗 性的膜型HB-EGF基因時(shí)沒有被發(fā)現(xiàn)。因此，提示了這樣的可能性， 即分泌型HB-EGF是與卵巢癌和膀胱癌的腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的重要因子。 關(guān)于臨床患者中HB-EGF的表達(dá)，Mekada等已經(jīng)在卵巢癌患者的腫瘤 組織和腹水中分析了 HB-EGF mRNA的表達(dá)量和分泌型HB-EGF的濃 度，并報(bào)道了在EGF家族中只有HB-EGF被表達(dá)(非專利文獻(xiàn)32)。 此外，Miyamoto等已經(jīng)報(bào)道，在腫瘤的HB-EGF mRNA高表達(dá)的卵巢 癌患者中，預(yù)后比低表達(dá)的患者更差(非專利文獻(xiàn)34)。上述的結(jié)果 顯示出，至少在卵巢癌中，癌癥產(chǎn)生的分泌型HB-EGF通過自分泌或 旁分泌機(jī)制與癌癥生長(zhǎng)相關(guān)(非專利文獻(xiàn)35)。至于與分泌型HB-EGF結(jié)合并抑制其活性的抗體，己經(jīng)知道一些多克隆抗體和一種單克隆抗
體(都由R&D制造)。已經(jīng)報(bào)道，抗HB-EGF山羊多克隆抗體(由 R&D制造)與COS-7細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞表面膜型HB-EGF結(jié)合(非 專利文獻(xiàn)3)。眾所周知，當(dāng)膜蛋白呈遞在細(xì)胞例如癌癥細(xì)胞的表面上 時(shí)，與該蛋白結(jié)合的單克隆抗體可以變成抑制該細(xì)胞生長(zhǎng)的治療劑(非 專利文獻(xiàn)36)。但是，到目前為止，還沒有關(guān)于結(jié)合分泌型HB-EGF、 細(xì)胞膜結(jié)合的HB-EGF和膜型HB-EGF的單克隆抗體的報(bào)道。
非專利文獻(xiàn)h 非專利文獻(xiàn)2: 非專利文獻(xiàn)3: 非專利文獻(xiàn)4:
非專利文獻(xiàn)5: 非專利文獻(xiàn)6: 非專利文獻(xiàn)7: 非專利文獻(xiàn)8: 非專利文獻(xiàn)9: 非專利文獻(xiàn)10: 非專利文獻(xiàn)ll: 非專利文獻(xiàn)12 1524-1531
非專利文獻(xiàn)13 非專利文獻(xiàn)14 非專利文獻(xiàn)15 非專利文獻(xiàn)16 非專利文獻(xiàn)17 非專利文獻(xiàn)18 非專利文獻(xiàn)19 非專利文獻(xiàn)20 非專利文獻(xiàn)21
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非專利文獻(xiàn)22 非專利文獻(xiàn)23 非專利文獻(xiàn)24 非專利文獻(xiàn)25 非專利文獻(xiàn)26 非專利文獻(xiàn)27
H 、 ' I 一 IW 、 一 w
非專利文獻(xiàn)29 非專利文獻(xiàn)30
非專利文獻(xiàn)31 非專利文獻(xiàn)32 非專利文獻(xiàn)33 非專利文獻(xiàn)34 非專利文獻(xiàn)35 非專利文獻(xiàn)36
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發(fā)明的公開內(nèi)容
本發(fā)明擬解決的問題
治療與HB-EGF相關(guān)的疾病的藥物是有需求的。
解決問題的方法 本發(fā)明涉及下面(1)到(24):
(1) 與細(xì)胞膜結(jié)合的肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子(后文稱
為"HB-EGF ")、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF結(jié)合的單克隆抗 體或其抗體片段。
(2) (1)的單克隆抗體或其抗體片段，其與細(xì)胞膜結(jié)合的HB-EGF、 膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF的表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF樣結(jié) 構(gòu)域)結(jié)合。
(3X1)或(2)的單克隆抗體或其抗體片段，其抑制分泌型HB-EGF與
9HB-EGF受體的結(jié)合。
(4) (1)到(3)任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其對(duì)分泌型 HB-EGF具有中和活性。
(5) (1)到(4)任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其與分泌型 HB-EGF與HB-EGF受體或白喉毒素的結(jié)合區(qū)結(jié)合。
(6) (1)到(5)任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其與包含SEQ ID NO:2所顯示的氨基酸序列中第133、 135和147位氨基酸的至少一個(gè) 的表位結(jié)合。
(7) (6)的單克隆抗體或其抗體片段，其與包含SEQ ID NO:2所顯
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(8) (1)到(5)任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其與包含SEQ ID NO:2所顯示的氨基酸序列中第141位氨基酸的表位結(jié)合。
(9) (1)到(3)、 (5)和(8)任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其與表 位結(jié)合，所述表位被雜交瘤KM3579 (FERMBP-10491)產(chǎn)生的單克隆抗
體結(jié)合。
(10) (1)到(7)任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其與結(jié)合于雜交 瘤KM3567 (FERM BP-10573)產(chǎn)生的單克隆抗體的表位相結(jié)合。
(11) (1)到(7)任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其與結(jié)合于雜交 瘤KM3566 (FERM BP-10490)產(chǎn)生的單克隆抗體的表位相結(jié)合。
(12) (1)到(7)和(11)任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其中抗體 的重鏈可變區(qū)(后文中稱為"VH")的CDR (互補(bǔ)性決定區(qū)，后文中 稱為"CDR" ) 1、 CDR2和CDR3分別含有SEQ ID NO:12、 13禾口 14 顯示的氨基酸序列，并且抗體的輕鏈可變區(qū)(后文中稱為"VL")的 CDR1、 CDR2和CDR3分別含有SEQIDNO:15、 16和17顯示的氨基 酸序列。
(13) (1)到(12)任一項(xiàng)的抗體或其抗體片段，其中單克隆抗體是重組 抗體。
(14) (13)的抗體或其抗體片段，其中重組抗體選自人類嵌合抗體、 人源化抗體和人類抗體。
(15) (14)的人類嵌合抗體或其抗體片段，其中人類嵌合抗體的VH含有SEQ ID NO:9顯示的氨基酸序列，和人類嵌合抗體的VL含有SEQ ID NO:ll顯示的氨基酸序列。
(16) (14)的人類嵌合抗體或其抗體片段，其中人源化抗體的VH含 有SEQ ID NO:22顯示的氨基酸序列或在SEQ ID NO:22顯示的氨基酸 序列中有至少一個(gè)修飾的氨基酸序列，所述修飾選自Thr取代9位Ala、 Leu取代20位纈氨酸Val、 Arg取代30位Thr、 Lys取代38位Arg、 Thr取代41位Pro、 Ile取代48位Met、 Lys取代67位Arg、 Ala取代 68位Val、 Leu取代70位Ile、 Phe取代95位Tyr和Leu取代118位 Val;并且其中人源化抗體的VL含有SEQ ID NO:23顯示的氨基酸序列
甘rh廿rh 25T ,1、_■cb 、 7—1 Wn /Ji 1 /^r t — 、 r—i Tfn /Ji 1 n A a ，—
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Met取代21位Ile、 Ser取代49位Pro和Val取代84位Leu的氨基酸 序列。
(17) (1)到(16)任一項(xiàng)的抗體片段，其選自Fab、 Fab'、 F(ab')2、單鏈 抗體(scFv) 、 二聚體化V區(qū)(雙抗體)、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)(dsFv) 和含有CDRs的肽。
(18) DNA，其編碼(1)到(17)任一項(xiàng)的抗體或其抗體片段。
(19) 重組載體，其含有(18)的DNA。
(20) 轉(zhuǎn)化體，其可以通過將(19)的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中而獲得。
(21) 生產(chǎn)(1)到(17)任一項(xiàng)的抗體或其抗體片段的方法，其包括將 (20)的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以在培養(yǎng)物中形成和積累(1)到(17)任一 項(xiàng)的抗體或抗體片段，并從培養(yǎng)物中回收抗體或抗體片段。
(22) 藥物組合物，其含有(1)到(17)任一項(xiàng)的抗體或其抗體片段作為 活性成分。
(23) 治療與HB-EGF相關(guān)的疾病的藥劑，其含有(1)到(17)任一項(xiàng)的 抗體或其抗體片段作為活性成分。
(24) (23)中的藥劑，其中與HB-EGF相關(guān)的疾病是癌癥。
發(fā)明的效果
本發(fā)明提供了與細(xì)胞膜結(jié)合的肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子(后文稱為"HB-EGF ")、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF結(jié)合 的單克隆抗體或其抗體片段。
附圖簡(jiǎn)述


圖1A通過結(jié)合ELISA顯示各種不同的抗HB-EGF單克隆抗體的 反應(yīng)性。橫坐標(biāo)顯示每種抗體的濃度，縱坐標(biāo)顯示每種抗體的結(jié)合活 性。^顯示單克隆抗體KM511， ■顯示單克隆抗體KM3566， △顯示 單克隆抗體KM3567， ▲顯示單克隆抗體KM3579, o顯示了單克隆 抗體MAB259。
圖IB顯示抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、 KM3567、 KM3579 和MAB259的HB-EGF-EGFR結(jié)合抑制活性。橫坐標(biāo)顯示每種抗體的 濃度，縱坐標(biāo)通過熒光強(qiáng)度顯示生物素標(biāo)記的HB-EGF的結(jié)合。橫的 實(shí)線顯示當(dāng)加入生物素標(biāo)記的HB-EGF時(shí)和沒有加入抗體時(shí)的熒光強(qiáng) 度，橫的虛線顯示當(dāng)沒有加入生物素標(biāo)記的HB-EGF時(shí)和沒有加入抗 體時(shí)的熒光強(qiáng)度?！黠@示單克隆抗體KM3566, x顯示單克隆抗體 KM3567, 顯示單克隆抗體KM3579, 和■顯示單克隆抗體 MAB259。
圖2A顯示各種不同的抗HB-EGF單克隆抗體的HB-EGF中和活 性。橫坐標(biāo)顯示每種抗體的濃度，縱坐標(biāo)顯示生長(zhǎng)抑制率(％)。分別是， 顯示單克隆抗體KM511, a顯示了單克隆抗體KM3566, A顯示了 單克隆抗體KM3579,和o顯示單克隆抗體MAB259。
圖2B顯示各種不同的抗HB-EGF單克隆抗體的HB-EGF中和活 性。橫坐標(biāo)顯示每種抗體的濃度，縱坐標(biāo)顯示細(xì)胞生長(zhǎng)。HB-EGF(+) 顯示當(dāng)加入HB-EGF并且不加入抗體時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)，HB-EGF(-)顯示當(dāng) 不加入HB-EGF并且不加入抗體時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)。n顯示單克隆抗體 MAB259,園顯示單克隆抗體KM3567，和A顯示單克隆抗體KM3566。
圖3通過FCM分析顯示各種不同的抗HB-EGF單克隆抗體的反應(yīng) 性。橫坐標(biāo)顯示每種抗體的濃度，縱坐標(biāo)顯示平均熒光強(qiáng)度。x顯示單 克隆抗體KM511， A顯示單克隆抗體KM3566, □顯示單克隆抗體 KM3579，和o顯示單克隆抗體MAB259。圖4通過FCM分析顯示各種不同的抗HB-EGF單克隆抗體對(duì) MDA-MB-231細(xì)胞的反應(yīng)性。在每個(gè)方圖中，實(shí)線顯示陰性對(duì)照抗體 KM511，虛線顯示每種抗HB-EGF抗體。(a)、 (b)、 (e)和(d)分別顯示 MAB529、 KM3566、 KM3567和KM3579。
圖5顯示抗HB-EGF嵌合抗體表達(dá)載體pKANTEX3566的構(gòu)建步驟。
圖6顯示純化的抗HB-EGF嵌合抗體KM3966的SDS-PAGE (使 用5到20°/。的梯度凝膠)電泳圖形。1道顯示分子量標(biāo)志，2道和3 道分別顯示還原條件下和非還原條件下的抗HB-EGF嵌合抗體 KM3966。
圖7通過流式細(xì)胞術(shù)顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966對(duì)人類實(shí) 體癌細(xì)胞系的反應(yīng)性。在圖中，縱坐標(biāo)顯示細(xì)胞的數(shù)量，橫坐標(biāo)顯示 熒光強(qiáng)度。
圖8通過流式細(xì)胞術(shù)顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966對(duì)重組 HB-EGF處理過的人類實(shí)體癌細(xì)胞系的反應(yīng)性。在圖中，縱坐標(biāo)顯示細(xì) 胞的數(shù)量，橫坐標(biāo)顯示熒光強(qiáng)度。
圖9顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966對(duì)人類HB-EGF的中和活 性。在圖中，縱坐標(biāo)顯示代表活細(xì)胞數(shù)量的OD 450 nm處的吸光度值， 橫坐標(biāo)顯示抗體的濃度?！鲲@示陰性對(duì)照抗體人類IgG，和□顯示 KM3966。 HB-EGF(-)表示未添加HB-EGF， HB-EGF (+)表示添加了 HB-EGF。
圖10顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966對(duì)人類實(shí)體癌細(xì)胞系的抗 體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC活性)。在圖中，縱坐標(biāo)顯示細(xì)胞 毒性率(°/。)，橫坐標(biāo)顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966的抗體濃度。橫 的直線顯示在沒有加入抗體時(shí)的細(xì)胞毒性。
圖11顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966在早期癌癥模型中的抗腫 瘤活性。在圖中，縱坐標(biāo)顯示腫瘤體積，橫坐標(biāo)顯示癌細(xì)胞移植后的 天數(shù)。 顯示PBS施用組，和o顯示10 mg/kg KM3966施用組。 柱線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖12顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966在晚期癌癥模型中的抗腫
13瘤活性。在圖中，縱坐標(biāo)顯示腫瘤體積，橫坐標(biāo)顯示癌細(xì)胞移植后的
天數(shù)。 顯示PBS施用組，和o顯示10 mg/kg KM3966施用組。柱
線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖13通過流式細(xì)胞術(shù)顯示了抗HB-EGF小鼠抗體KM3566對(duì)人類 血癌細(xì)胞系的反應(yīng)性。在圖中，縱坐標(biāo)顯示細(xì)胞的數(shù)量，橫坐標(biāo)顯示 熒光強(qiáng)度。"A"表示急性骨髓性白血病細(xì)胞系，"B"表示T細(xì)胞白 血病細(xì)胞系。
圖14顯示了抗HB-EGF嵌合抗體KM3966對(duì)人類血癌細(xì)胞系的抗 體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC活性)。在圖中，縱坐標(biāo)顯示細(xì)胞 毒性比率(％)，橫坐標(biāo)顯示抗HB-EGF嵌合抗體KM3966的抗體濃度。 橫的直線顯示在沒有加入抗體時(shí)的細(xì)胞毒性。
圖15顯示抗HB-EGF單克隆抗體KM3566和KM3579以及嵌合抗 體KM3966對(duì)突變體HB-EGF表達(dá)細(xì)胞的反應(yīng)性。在圖'中，縱坐標(biāo)顯 示每種抗體的反應(yīng)性(％)，橫坐標(biāo)顯示突變體HB-EGF的種類。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式
在本發(fā)明中，膜型HB-EGF是通過跨細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜結(jié)合 的HB-EGF，并由信號(hào)序列、前區(qū)、肝素結(jié)合區(qū)、EGF樣結(jié)構(gòu)域、近 膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。具體來說，它包括含有SEQ ID N0:2 顯示的氨基酸序列的多肽。此外，在本發(fā)明中，分泌型HB-EGF是含 有EGF樣結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，其中膜型HB-EGF的膜結(jié)合區(qū)被蛋 白酶等裂解。具體來說，它包括含有SEQ IDNO:3顯示的氨基酸序列 的多肽。細(xì)胞膜結(jié)合的HB-EGF是其中分泌型HB-EGF通過其肝素結(jié) 合活性、靜電結(jié)合活性等與細(xì)胞膜的表面結(jié)合的HB-EGF。
與細(xì)胞膜上的分泌型HB-EGF結(jié)合的物質(zhì)可以是任何物質(zhì)，只要 它能夠結(jié)合細(xì)胞膜上的分泌型HB-EGF即可。具體來說，它包括多糖， 優(yōu)選為糖胺聚糖，更優(yōu)選為硫酸肝素。
HB-EGF具有與白喉毒素或EGF受體ErbB 1或ErbB4結(jié)合的活性。膜型HB-EGF包括下面(a)、 (b)和(c)等的蛋白
(a) 含有SEQ ID NO:2顯示的氨基酸序列的蛋白；
(b) 由其中SEQIDNO:2顯示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和 /或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、并具有與白喉毒素結(jié)合 的活性的蛋白；
(c) 由與SEQ ID NO:2顯示的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨 基酸序列構(gòu)成、并具有與白喉毒素結(jié)合的活性的蛋白。
此外，分泌型HB-EGF包括下面(a)、 (b)和(c)等的蛋白
(a) 含有SEQIDNO:3、 4或5顯示的氨基酸序列的蛋白；
(b) 由其中在SEQ ID NO:3、 4或5顯示的氨基酸序列中缺失、取 代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、并具有與EGF 受體ErbBl或ErbB4結(jié)合的活性的蛋白；
(c) 由與SEQ ID NO: 3、 4或5顯示的氨基酸序列具有80%以上的 同源性的氨基酸序列構(gòu)成、并具有與EGF受體ErbBl或ErbB4結(jié)合的 活性的蛋白。
在本發(fā)明中，由其中在SEQIDNO:2、 3、 4或5任何一個(gè)顯示的 氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸 序列構(gòu)成、并具有與白喉毒素或EGF受體ErbBl或ErbB4結(jié)合的活性 的蛋白，是通過例如將位點(diǎn)定向突變引入具有SEQIDNO:2、 3、 4或5 任何一個(gè)顯示的氨基酸序列的蛋白的編碼DNA中來產(chǎn)生的，其中位點(diǎn) 定向突變描述在《分子克隆》(第二版)(Mo/ecw/w C/om' g, Second Edition)、《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(Cwrew/7VoMco/s Mo/ecw/ar 丑/o/ogy (1987-1997)) 、 Wwc/w'c Jc/A及ejean^， 6487 (1982)、 /Voc. iVfl". Jcaaf. 2￡, 6409 (1982)、 Ge"e， M， 315 (1985)、 Wwc/e/c
爿"'a^ 7 e化arc/ ， Jl， 4431 (1985)、尸roc. A^a".爿cad Sc/ C/SJ, 488 (1985)等中。被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸殘基的數(shù)量是一 個(gè)或多個(gè)，并且沒有具體的限制，但是它在通過已知的方法例如上面
15描述的位點(diǎn)定向突變有可能進(jìn)行缺失、取代、插入或添加的范圍內(nèi)。 適合的數(shù)量是1到幾十個(gè)，優(yōu)選為1到20，更優(yōu)選1到10，最優(yōu)選1到5。
此外，與SEQIDNO:2、 3、 4或5顯示的氨基酸序列具有80%以 上同源性、并具有與白喉毒素或EGF受體ErbBl或ErbB4結(jié)合活性的 蛋白，是與SEQIDNO:2、 3、 4或5任何一個(gè)顯示的氨基酸序列具有 至少80%以上的同源性、優(yōu)選85%以上的同源性、更優(yōu)選90%以上的 同源性、更優(yōu)選95%以上的同源性、特別優(yōu)選97%以上的同源性、并 最優(yōu)選99%以上的同源性、并具有與白喉毒素或EGF受體ErbBl或 ErbB4結(jié)合的活性的蛋白。
除非另有指明，在本發(fā)明中描述的同源性數(shù)量可以是通過使用已 知的同源性搜索程序計(jì)算的已知數(shù)量。對(duì)于核苷酸序列來說，該數(shù)量 可以通過在BLAST [ / Mo/. 5/o/.， 211, 403 (1990)]等中使用缺省參數(shù) 來計(jì)算，對(duì)于氨基酸序列來說，該數(shù)量可以通過在BLAST2 [iV"c/e/c 爿c/A 21, 3389 (1997)] 、 Ge"owe i e&， 2, 649 (1997)或
http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html 中 使用缺省參數(shù)來計(jì)算。作為缺省參數(shù)，G (開放式間隙的價(jià)值，costto opengap)對(duì)于核苷酸序列來說是5，對(duì)于氨基酸序列來說G是11; -E
(擴(kuò)展間隙的價(jià)值，cost to extend gap)對(duì)于核苷酸序列來說是2，對(duì) 于氨基酸序列來說是l; -q (核苷酸錯(cuò)配的罰分，penalty for nucleotide mismatch)是-3; -r (核苷酸匹配的獎(jiǎng)勵(lì)，reward for nucleotide match) 是1; -e (預(yù)期值，expect value)是10; -W (字長(zhǎng)，wordsize)對(duì)于核 苷酸序列來說是ll個(gè)殘基，對(duì)于氨基酸序列是3個(gè)殘基；-y(blast延 伸的減少(X)的位數(shù)，dropoff(X) for blast extensions in bits)對(duì)于blastn 來說是 20 ，對(duì)于 blastn 之外的程序來說是 25
(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihel.p.html)。此夕卜，用 于氨基酸序列的分析軟件包括FASTA [MeAo^y & ￡wz_ymo/ogy, JH, 63 (1990)]等。本發(fā)明的抗體包括與細(xì)胞膜結(jié)合的HB-EGF、膜型HB-EGF和分 泌型HB-EGF結(jié)合、并能夠與細(xì)胞膜結(jié)合的HB-EGF、膜型HB-EGF 和分泌型HB-EGF的表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF樣結(jié)構(gòu)域)結(jié)合的 單克隆抗體。
EGF樣結(jié)構(gòu)域包括例如含有SEQ ID NO:4或5等顯示的氨基酸序 列的多肽。
與EGF樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體包括抑制分泌型HB-EGF與 HB-EGF受體結(jié)合的單克隆抗體。
抑制分泌型HB-EGF與HB-EGF受體結(jié)合的單克隆抗體包括與分 泌型HB-EGF和HB-EGF受體或白喉毒素等的結(jié)合區(qū)域結(jié)合的單克隆 抗體。
本發(fā)明的抗體包括對(duì)分泌型HB-EGF具有中和活性的抗體。在本 發(fā)明中，中和活性是抑制分泌型HB-EGF的生物學(xué)活性的活性，包括 例如抑制表達(dá)HB-EGF受體的細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，等等。
本發(fā)明的抗體的例子包括與含有第115位到147位氨基酸中的至 少一個(gè)氨基酸的表位結(jié)合的單克隆抗體，優(yōu)選與含有第133位到147 位氨基酸中的至少一個(gè)氨基酸的表位結(jié)合的單克隆抗體，更優(yōu)選與含 有第115、 122、 124、 125、 127、 129、 133、 135、 141和147位氨基 酸中的至少一個(gè)氨基酸的表位結(jié)合的單克隆抗體，更加優(yōu)選與含有第 133、 135和147位氨基酸中的至少第133和135位氨基酸的表位結(jié)合 的單克隆抗體，最優(yōu)選與含有第133、 135和147位氨基酸的表位結(jié)合 的單克隆抗體，等等，其中所述氨基酸位置是在具有SEQ ID NO:2顯 示的氨基酸序列的多肽中。此外，本發(fā)明的抗體的例子包括與雜交瘤KM3566 (FERM BP-10490)產(chǎn)生的單克隆抗體、雜交瘤KM3567 (FERM BP-10573)產(chǎn)生 的單克隆抗體或雜交瘤KM3579 (FERM BP-10491)產(chǎn)生的單克隆抗體
所結(jié)合的表位結(jié)合的單克隆抗體。
具有中和活性的抗體的例子包括所結(jié)合的表位含有具有SEQ ID N0:2顯示的氨基酸序列的多肽中第133、 135和147位氨基酸的單克 隆抗體。
本發(fā)明的單克隆抗體包括由雜交瘤產(chǎn)生的抗體、重組抗體等。
雜交瘤是產(chǎn)生具有所需免疫特異性的單克隆抗體的細(xì)胞，通過將 用抗原免疫非人類哺乳動(dòng)物所獲得的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融 合而得到。
重組抗體包括通過基因重組生產(chǎn)的抗體，例如人類嵌合抗體、人 源化抗體、人類抗體及其抗體片段。在重組抗體中，優(yōu)選具有單克隆 抗體、低免疫原性和延長(zhǎng)的血液半衰期特征的重組抗體作為治療劑。
本發(fā)明的重組抗體的例子包括的重組抗體中，抗體的VH的 CDR1、 CDR2和CDR3分別含有SEQ ID NO:12、 13和14顯示的氨基 酸序列，以及抗體的VL的CDR1、 CDR2和CDR3分別含有SEQ ID NO:15、 16和17顯示的氨基酸序列。
本發(fā)明的重組抗體，通過基因重組生產(chǎn)的抗體，例如人類嵌合抗 體、人源化抗體、人類抗體及其抗體片段。
人類嵌合抗體是含有非人類動(dòng)物的抗體的VH和VL以及人類抗體 的重鏈恒定區(qū)(在后文中稱為"CH")和輕鏈恒定區(qū)(在后文中稱為 "CL")的抗體。本發(fā)明的人類嵌合抗體可以如下產(chǎn)生。首先，從產(chǎn)生與細(xì)胞膜結(jié)
合的HB-EGF、分泌型HB-EGF和膜型HB-EGF結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤獲得編碼VH和VL的cDNA。將得到的cDNA插入到用于動(dòng)物細(xì)胞的、含有編碼人類抗體的CH和CL的基因的表達(dá)載體中，從而構(gòu)建人類嵌合抗體表達(dá)載體，將人類嵌合抗體表達(dá)載體導(dǎo)入到動(dòng)物細(xì)胞中從而表達(dá)人類嵌合抗體，這樣就可以生產(chǎn)人類嵌合抗體。
對(duì)于人類嵌合抗體的CH來說，可以使用任何CH，只要它屬于人類免疫球蛋白(在后文中稱為"hlg")即可，優(yōu)選屬于hlgG類別的，可以使用屬于hlgG類別的任何一個(gè)亞類，例如hlgGl、 hlgG2、 hlgG3和hlgG4。對(duì)于人類嵌合抗體的CL來說，可以使用任何CL，只要它屬于hlg類別即可，并可以使用屬于K類別或X類別的。
本發(fā)明的人類嵌合抗體包括例如其中抗體的VH含有SEQ IDNO:9顯示的氨基酸序列、抗體的VL含有SEQ ID NO:ll顯示的氨基酸序列的人類嵌合抗體，等等。此外，其中抗體的VH含有SEQIDNO:9顯示的氨基酸序列、抗體的VL含有SEQ ID NO:IO顯示的氨基酸序列的人類嵌合抗體，包括例如人類嵌合抗體KM3966等。
人源化抗體是其中源自非人類動(dòng)物的抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列被移植到人類抗體的VH和VL的適當(dāng)?shù)奈恢弥械目贵w，也被稱為CDR移植抗體、重構(gòu)抗體等。
本發(fā)明的人源化抗體可以如下產(chǎn)生。首先，構(gòu)建編碼V區(qū)的cDNA，V區(qū)中源自于非人類動(dòng)物的、與細(xì)胞膜結(jié)合的HB-EGF、分泌型的HB-EGF和膜型HB-EGF結(jié)合的單克隆抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列被移植到任何人類抗體的VH和VL的構(gòu)架中(在后文中稱為"FR")。將構(gòu)建的cDNA分別插入到用于動(dòng)物細(xì)胞的、含有人類抗體的CH和CL的編碼基因的表達(dá)載體中，從而構(gòu)建人源化抗體表達(dá)載
19體。接下來，將構(gòu)建的人源化抗體表達(dá)載體導(dǎo)入到動(dòng)物細(xì)胞中以表達(dá)人源化抗體，并可以生產(chǎn)人源化抗體。
對(duì)于人類抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列來說，可以使用任何氨基酸序列，只要它們分別是源自人類抗體的VH和VL的氨基酸序列即可。例子包括在數(shù)據(jù)庫(kù)例如蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank)中登記的人類抗體的VH和VL的氨基酸序列、在例如美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部(Dept. Health and Human Services) (1991)的《免疫學(xué)重要的蛋白序歹ll》 (5"e《"e"ces o//Vo&z>w o//m/ww"o/og,ca//wfereW)中描述的人類抗體的VH和VL的每個(gè)亞組FR的共有氨基酸序列，等等。
對(duì)于人源化抗體的CH來說，可以使用任何CH，只要它屬于hlg即可，優(yōu)選的是hlgG類別，并可以使用屬于hIgG類別的任何一個(gè)亞類，例如hlgGl、 hlgG2、 hlgG3和hlgG4。對(duì)于人類CDR移植抗體的CL來說，可以使用任何CL，只要它屬于hlg類別即可，并可以使用屬
于K類別或入類別的。
本發(fā)明的人源化抗體包括例如這樣的人源化抗體，其中抗體的VH含有SEQ ID NO:22顯示的氨基酸序列或其中選自SEQ ID NO:22顯示的氨基酸序列中的9位Ala、 20位Val、 30位Thr、 38位Arg、 41位Pro、 48位Met、 67位Arg、 68位Val、 70位Ile、 95位Tyr和118位Val的至少一個(gè)氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列，和/或抗體的VL含有SEQ ID NO:23顯示的氨基酸序列或其中選自SEQ IDNO:23顯示的氨基酸序列中15位Leu、 19位Ala、 21位Ile、 49位Pro和84位Leu的至少一個(gè)氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列，等等。這些被導(dǎo)入的修飾的數(shù)量沒有具體的限制。
例如，對(duì)于抗體的VH的氨基酸序列來說，例子包括人源化抗體，其中抗體的VH含有其中在SEQ ID NO:22顯示的氨基酸序列中20位Val、 30位Thr、 38位Arg、 48位Met、 67位Arg、68位Val、 70位Ile、 95位Tyr和118位Val被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列，優(yōu)選抗體的VH含有其中20位Val、 30位Thr、48位Met、68位Val、 70位Ile、 95位Tyr和118位Val被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列；
優(yōu)選的人源化抗體，其中抗體的VH含有其中30位Thr、 48位Met、 68位Val、 70位lie和95位Tyr、更優(yōu)選30位Thr、 48位Met、68位Val和70位lie被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列
優(yōu)選的人源化抗體，其中抗體的VH含有其中30位Thr、 68位Val、 70位Ile和95位Tyr被其它的氨基酸殘基取代的氨基酸序列；
優(yōu)選的人源化抗體，其中抗體的VH含有其中30位Thr、 68位Val和70位lie被其它的氨基酸殘基取代的氨基酸序列；
優(yōu)選的人源化抗體，其中抗體的VH含有其中30位Thr和70位Ile被其它的氨基酸殘基取代的氨基酸序列；等等。
通過上面的氨基酸修飾獲得的抗體的VH的氨基酸系列，其包括的氨基酸序列中導(dǎo)入的至少一個(gè)修飾選自在SEQ ID NO:22顯示的氨基酸序列中Thr取代9位Ala、 Leu取代20位的Val、 Arg取代30位Thr、Lys取代38位的Arg、 Thr取代41位脯氨酸、lie取代48位Met、 Lys取代67位Arg、 Ala取代68位Val、 Leu取代70位Ile、 Phe取代95位Tyr和Leu取代118位Val。
其中導(dǎo)入11個(gè)修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ IDNO:22顯示的氨基酸序列中進(jìn)行下面修飾的氨基酸序列Thr取代9位Ala、 Leu取代20位Val、 Arg取代30位Thr、 Lys取代38位Arg、 Thr取代41位脯氨酸、Ile取代48位Met、 Lys取代67位Arg、 Ala取代68位Val、 Leu取代70位Ile、 Phe取代95位Tyr和Leu取代118位Val。
其中導(dǎo)入了 IO個(gè)修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ IDNO:22顯示的氨基酸序列中進(jìn)行下面修飾的氨基酸序列Thr取代9位Ala、 Leu取代20位Val、 Arg取代30位Thr、 Lys取代38位Arg、 Thr取代41位Pro、 Ile取代48位Met、 Lys取代67位Arg、 Ala取代68位Val、 Leu取代70位Ile和Phe取代95位Tyr，等等。
其中導(dǎo)入9個(gè)修飾的VH的氨基酸序列，包括例如，在SEQ IDNO:22顯示的氨基酸序列中
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位Ala、 Leu取代20位Val、 Arg取代30位Thr、 Thr取代41位Pro、 Ile取代48位Met、Lys取代67位Arg、 Ala取代68位Val、 Leu取代70位Ile和Phe取代95位Tyr，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位Val、 Arg取代30位Thr、 Lys取代38位Arg、 Ile取代48位Met、 Lys取代67位Arg、Ala取代68位Val、 Leu取代70位Ile、 Phe取代95位Tyr和Leu取代118位Val，等等。
其中導(dǎo)入8個(gè)修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ IDNO:22顯示的氨基酸序列中
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位Ala、 Leu取代20位Val、 Arg取代30位Thr、 Thr取代41位Pro、 Ile取代48位Met、Ala取代68位Val、 Leu取代70位Ile和Phe取代95位Tyr，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位Val、 Arg取代30位Thr、 11e取代48位Met、 Lys取代67位Arg、 Ala取代68位Val、Leu取代70位Ile、 Phe取代95位Tyr和Leu取代118位Val，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位Val、 Arg取代30位Thr、 Lys取代38位Arg、 Ile取代48位Met、 Ala取代68位Val、Leu取代70位Ile、 Phe取代95位Tyr和Leu取代118位Val，等等。
其中導(dǎo)入7個(gè)修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ IDNO:22顯示的氨基酸序列中
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位Ala、 Arg取代30位Thr、 Thr取代41位Pro、 Ile取代48位Met、 Ala取代68位Val、Leu取代70位Ile和Phe取代95位Tyr，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位Val、 Arg取代30位Thr、 Ile取代48位Met、 Ala取代68位Val、 Leu取代70位Ile、 Phe取代95位Tyr和Leu取代118位Val，等等。
其中導(dǎo)入6個(gè)修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在氨基酸序列SEQ ID NO:22中
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位Ala、 Arg取代30位Thr、 Ile取代48位Met、 Ala取代68位Val、 Leu取代70位Ile和Phe取代95位Tyr，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位Val、 Arg取代30位Thr、 Ile取代48位Met、 Ala取代68位Val、 Leu取代70位Ile和Phe取代95位Tyr,等等。
其中導(dǎo)入5個(gè)修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在氨基酸序列SEQ ID NO:22中
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位Ala、 Arg取代30位Thr、 Ile取代48位Met、 Ala取代68位Val和Leu取代70位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Ile取代48位Met、 Ala取代68位Val、 Leu取代70位Ile和Phe取代95位Tyr，
其中導(dǎo)入4個(gè)修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ IDNO:22顯示的氨基酸序列中
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位Ala、 Arg取代30位Thr、 Ala取代68位Val和Leu取代70位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Ile取代48位Met、 Ala取代68位Val和Leu取代70位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位Val、 Arg取代30
23位Thr、 Ala取代68位Val和Leu取代70位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Lys取代38位Arg、 Ala取代68位Val和Leu取代70位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Thr取代41位Pro、 Ala取代68位Val和Leu取代70位Ile,
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Lys取代67位Arg、 Ala取代68位Val和Leu取代70位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Ala取代68位Val、 Leu取代70位Ile和Phe取代95位Tyr，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Ala取代68位Val、 Leu取代70位Ile和Leu取代118位Val，等等。
其中導(dǎo)入3個(gè)修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ IDNO:22顯示的氨基酸序列中
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Ala取代68位Val和Leu取代70位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Thr取代9位Ala、 Arg取代30位Thr和Leu取代70位的lie,
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Leu取代20位Val、 Arg取代30位Thr和Leu取代70位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Lys取代38位Arg和Leu取代70位的Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Thr取代41位Pro和Leu取代70位的Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Ile取代48位Met和Leu取代70位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Lys取代67位Arg和Leu取代70位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Leu取代70位Ile和Phe取代95位Tyr，
24進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr、 Leu取代70 位lie和Leu取代118位Val，等等。
其中導(dǎo)入2個(gè)修飾的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO:22顯示的氨基酸序列中
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序歹i 位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序歹l 位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序歹l 位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序歹l 位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序歹i 位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序歹l 位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序歹！ 位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序歹i 位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序歹i 位Tyr，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序歹l 位Val，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列 位Thr，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序歹i 位Thr，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序歹i
Arg取代30位Thr和Leu取代70 Thr取代9位Ala和Leu取代70 Leu取代20位Val和Leu取代70 Lys取代38位Arg和Leu取代70 Thr取代41位Pro和Leu取代70 Ile取代48位Met和Leu取代70 Lys取代67位Arg和Leu取代70 Ala取代68位Val和Leu取代70 Leu取代70位Ile和Phe取代95 Leu取代70位Ile和Leu取代118 Thr取代9位Ala和Arg取代30 Leu取代20位Val和Arg取代30 Arg取代30位Thr和Lys取代38位Arg，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr和Thr取代41 位Pro,
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr和lie取代48 位Met,
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr和Lys取代67 位Arg，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr和Ala取代68 位Val，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr和Phe取代95 位Tyr，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Arg取代30位Thr和Leu取代118 位Val，等等。
其中導(dǎo)入了 1個(gè)修飾的VH的氨基酸序列包括，例如在SEQ ID NO:22顯示的氨基酸序列中
用Thr取代9位Ala的氨基酸序列， 用Leu取代20位Val的氨基酸序列， 用Arg取代30位Thr的氨基酸序列， 用Lys取代38位Arg的氨基酸序列， 用Thr取代41位Pro的氨基酸序列， 用lie取代48位Met的氨基酸序列， 用Lys取代67位Arg的氨基酸序列， 用Ala取代68位Val的氨基酸序列， 用Leu取代70位lie的氨基酸序列， 用Phe取代95位Tyr的氨基酸序列，以及 用Leu取代118位Val的氨基酸序列。
抗體的VL包括，例如，在SEQIDNO:23顯示的氨基酸序列中15 位Leu、 19位Ala、 21位He和84位Leu被取代的氨基酸序列。其中19位Ala、21位Ile和84位Leu被取代的氨基酸序列是優(yōu)選的。
通過上面的氨基酸修飾獲得的氨基酸系列包括的氨基酸序列中， 導(dǎo)入的至少一個(gè)修飾選自在SEQ ID NO:23顯示的氨基酸序列中Val取 代15位Leu、 Val取代19位Ala、 Met取代21位Ile、 Ser取代49位 Pro和Val取代84位的Leu。
其中導(dǎo)入5個(gè)修飾的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO:23顯示的氨基酸序列中進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15 位Leu、 Val取代19位Ala、 Met取代21位Ile、 Ser取代49位Pro和 Val取代84位Leu，等等。
其中導(dǎo)入4個(gè)修飾的VL的氨基酸序列包括，例如，
在SEQ ID NO:23顯示的氨基酸序列中
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位Leu、 位Ala、 Met取代21位Ile和Ser取代49位Pro,
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位Leu、 位Ala、 Met取代21位Ile和Val取代84位Leu，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位Leu、 位Ala、 Ser取代49位Pro和Val取代84位Leu，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位Leu、 位Ile、 Ser取代49位Pro和Val取代84位Leu，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代19位Ala、 位Ile、 Ser取代49位Pro和Val取代84位Leu，等等。
其中導(dǎo)入3個(gè)修飾的VL的氨基酸序列包括，例如 NO:23顯示的氨基酸序列中
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位Leu、 Val取代19
Val取代19 Val取代19 ,Val取代19 Met取代21 Met取代21
，在SEQ ID
27位Ala和Met取代21位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列 位Ala和Ser取代49位Pro,
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列 位Ala和Val取代84位Leu，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列 位Ile禾卩Ser取代49位Pro，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列 位Ile和Val取代84位Leu，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列 位Pro和Val取代84位Leu，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列 位Ile和Ser取代49位Pro，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列
位Ile和Val取代84位Leu，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列
位Pro和Val取代84位Leu，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列: 位Pro和Val取代84位Leu，等等。
Val取代15位Leu、 Val取代19 Val取代15位Leu、 Val取代19 Val取代15位Leu、 Met取代21 Val取代15位Leu、 Met取代21 Val取代15位Leu、 Ser取代49 Val取代19位Ala、 Met取代21 Val取代19位Ala、 Met取代21 Val取代19位Ala、 Ser取代49 Met取代21位Ile、 Ser取代49
其中導(dǎo)入2個(gè)修飾的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO:23顯示的氨基酸序列中
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位Leu和Val取代19 位Ala，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位Leu和Met取代21 位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位Leu和Ser取代49 位Pro,
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代15位Leu和Val取代84 位Leu，
28進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代19位Ala和Met取代21 位Ile，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代19位Ala和Ser取代49 位Pro,
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Val取代19位Ala和Val取代84 位匕eu，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Met取代21位Ile和Ser取代49 位Pro，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Met取代21位Ile和Val取代84 位Leu，
進(jìn)行下面的修飾的氨基酸序列Ser取代49位Pro和Val取代84 位Leu，等等。
其中導(dǎo)入1個(gè)修飾的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO:23顯示的氨基酸序列中
用Val取代15位Leu的氨基酸序列，
用Val取代19位Ala的氨基酸序列，
用Met取代21位Ile的氨基酸序列，
用Ser取代49位Pro的氨基酸序列，
用Val取代84位Leu的氨基酸序列，等等。
本發(fā)明的人源化抗體的例子包括其中的可變區(qū)含有SEQ ID NO:22和23顯示的氨基酸序列的人源化抗體。
人類抗體原先是人體中天然存在的抗體，但是它也包括基于遺傳 工程、細(xì)胞工程和發(fā)育工程技術(shù)的最新進(jìn)展制備的人類抗體噬菌體文 庫(kù)或產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得的抗體。人體中存在的抗體的制 備可以例如如下分離人類外周血淋巴細(xì)胞，通過用EB病毒等感染使 其永生化，然后對(duì)它進(jìn)行克隆，從而獲得能夠生產(chǎn)抗體的淋巴細(xì)胞， 對(duì)這樣獲得的淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并從培養(yǎng)上清液中純化抗體。人類抗體噬菌體文庫(kù)，是其中通過將從人類B細(xì)胞制備的編碼抗體的基因
插入到噬菌體基因中，而在噬菌體表面上表達(dá)抗體片段例如Fab和scFv 的文庫(kù)。表達(dá)具有所需的抗原結(jié)合活性的抗體片段的噬菌體，可以利 用它與固定有抗原的基體的結(jié)合活性作為指標(biāo)，從文庫(kù)中回收?？贵w 片段可以通過遺傳工程技術(shù)進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楹袃蓷l完整的H鏈和兩條 完整的L鏈的人類抗體分子。產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是其中人類 抗體基因被整合到細(xì)胞中的動(dòng)物。具體來說，產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物可以通過下述來制備將編碼人類抗體的基因?qū)氲叫∈驟S細(xì)胞 中，將ES細(xì)胞移植到另一只小鼠的早期胚胎中，然后使其發(fā)育。從產(chǎn) 生人類抗體的轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物制備人類抗體可以通過通過通常在
非人類哺乳動(dòng)物中進(jìn)行的雜交瘤制備方法獲得產(chǎn)生人類抗體的雜交 瘤，將獲得的雜交瘤進(jìn)行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)上清液中形成和積累人類抗 體。
在構(gòu)成上述抗體或抗體片段的氨基酸序列中，其中一個(gè)或多個(gè)氨 基酸被缺失、取代、插入或添加、但仍與上述的抗體或其抗體片段具 有相似活性的抗體或其抗體片段，也包括在本發(fā)明的抗體或其抗體片 段中。
被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸數(shù)量是一個(gè)或多個(gè)，沒有 具體的限制，但是它在通過已知方法例如位點(diǎn)定向突變有可能缺失、 取代、或添加的范圍內(nèi)，位點(diǎn)定向突變描述在《分子克隆》(第二版)
(Mo/ecw/ar C/o"/"g, Second Edition)、《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》
6487 (1982)、 iVoc. A^/.」ok/. Sc/. t/SX, 2￡， 6409 (1982)、 315 (1985)、齒c/e/c爿c/出i e織n^， U, 4431 (1985)、 P亂淑/.爿cad t/A4，M,488 (1985)等中。例如，數(shù)量為1到幾十個(gè)，優(yōu)選為1到20， 更優(yōu)選為1到10，最優(yōu)選為1到5。
上述抗體的氨基酸序列中"一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、取代、插入或添加"的表述意義如下。S卩，它意味著在該相同序列和一個(gè)或多 個(gè)氨基酸序列中的任選位置上，存在著一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取 代、插入或添加。此外，缺失、取代、插入或添加可以同時(shí)發(fā)生，被 取代、插入或添加的氨基酸可以是天然類型或非天然類型的。天然類
型的氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、 L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、 L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-半胱氨酸等。
可互相取代的氨基酸的優(yōu)選例子顯示在下面。同樣組中的氨基酸 可以互相取代。
A組亮氨酸，異亮氨酸，正亮氨酸，纈氨酸，正纈氨酸，丙氨 酸，，2-氨基丁酸，甲硫氨酸，O-甲基絲氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基 丙氨酸，環(huán)己基丙氨酸
B組天冬氨酸，谷氨酸，異天冬氨酸，異谷氨酸，2-氨基己二酸， 2-氨基辛二酸
C組天冬酰胺，谷氨酰胺
D組賴氨酸，精氨酸，鳥氨酸，2，4-二氨基丁酸，2,3-二氨基丙
酸
E組脯氨酸，3-羥基脯氨酸，4-羥基脯氨酸
F組絲氨酸，蘇氨酸，高絲氨酸 G組苯丙氨酸，酪氨酸
本發(fā)明的抗體片段包括Fab、 Fab'、 F(ab')2、 scFv、雙抗體、dsFv等。
Fab是通過用蛋白酶木瓜蛋白酶處理IgG抗體分子獲得的。這是 具有大約50,000的分子量并具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，其中在通 過木瓜蛋白酶(在H鏈的224位切開氨基酸殘基)獲得的片段中，H 鏈的大約一半N-端側(cè)和整個(gè)L鏈通過二硫鍵結(jié)合在一起。白酶處理抗體來生產(chǎn)。此 外，本發(fā)明的Fab也可以通過將編碼抗體的Fab的DNA插入到原核生 物表達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中，將載體導(dǎo)入到原核生物或真核生 物中以表達(dá)Fab來生產(chǎn)。
F(ab')2是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，分子量為大約100,000， 其中在用蛋白酶胃蛋白酶(在第234個(gè)氨基酸殘基處切開H鏈)處理 IgG抗體而獲得的片段中，其比其中Fab通過鉸鏈區(qū)中的二硫鍵連接在 一起的抗體片段略大。
本發(fā)明的F(ab')2可以通過用蛋白酶胃蛋白酶處理抗體來生產(chǎn)。此 外，本發(fā)明的F(ab')2也可以通過用硫醚鍵或二硫鍵連接下面描述的Fab' 來生產(chǎn)。
Fab'是具有抗體結(jié)合活性的抗體片段，分子量為大約50,000，其中 上述F(ab')2的鉸鏈區(qū)中二硫鍵被切開了 。
本發(fā)明的Fab'可以使用還原劑二硫蘇糖醇，由F(ab')2產(chǎn)生。此外， 本發(fā)明的Fab'也可以通過將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生 物表達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中、并將載體導(dǎo)入到原核生物或真核 生物中以表達(dá)Fab'來生產(chǎn)。
scFv是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，是VH-P-VL或VL-P-VH 多肽，其中使用適當(dāng)?shù)碾慕宇^(在后文中稱為"P")將一條鏈VH和 一條鏈VL連接在一起。本發(fā)明的scFv的生產(chǎn)可以通過獲得編碼抗體 的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA，將編碼抗體的scFv的 DNA插入到原核生物表達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載 體導(dǎo)入到原核生物或真核生物中表達(dá)scFv。
32雙抗體是具有二價(jià)抗原結(jié)合活性的抗體片段，其中scFvs被二聚 體化。二價(jià)抗原結(jié)合活性可以是彼此相同或不同的。本發(fā)明的雙抗體
的生產(chǎn)可以通過獲得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv 的DNA使得P的氨基酸序列長(zhǎng)度是8個(gè)以下殘基，將DNA插入到原 核生物表達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入到原核 生物或真核生物中表達(dá)雙抗體。
dsFv'是通過將其中每個(gè)VH和VL中的一個(gè)氨基酸殘基被半胱氨 鴯就其K7仵的念吐誦計(jì)坐日脊氯鵬就其今問的—絡(luò)鍵法故龍一敘而坊;M
<t:i 、 hj /j"、 i w/" v "Cicr , i "j h j-* 。'u a^s i i ig v八，、j
的。用半胱氨酸殘基取代的氨基酸殘基，可以在Reiter等(/VWe/w 五wg/"een'"g, 2， 697-704 (1994))顯示的方法進(jìn)行的抗體的三維結(jié)構(gòu)評(píng)估 的基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇。本發(fā)明的dsFv的生產(chǎn)可以通過獲得編碼抗體的VH 和VL的cDNA，構(gòu)建編碼dsFv的DNA，將DNA插入到原核生物表 達(dá)載體或真核生物表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體導(dǎo)入到原核生物或真 核生物中表達(dá)dsFv。
在本發(fā)明中，可以使用其中放射性同位素、蛋白或藥劑被結(jié)合到 上述抗體或其抗體片段上的抗體衍生物。
本發(fā)明的抗體衍生物可以通過將藥劑化學(xué)連接到與細(xì)胞膜結(jié)合的 ni3-i^jr、欣生rir>-CAjr ,刀，生口、j no-r^xr 殆-口 口、j"ij評(píng)孰兵饑1^斤 段的H鏈或L鏈的N-端側(cè)或C-端側(cè)、抗體的適合的取代基或側(cè)鏈上、 或抗體中的糖鏈上來生產(chǎn)[《抗體工程手冊(cè)》，爿""力o辦五"g/"eeWwg f/am/Z)ooA:， Osamu Kanemitsu主編,Chijin Shokan出版(1994)]。
此外，抗體衍生物也可以如下遺傳生產(chǎn)將與細(xì)胞膜結(jié)合的 HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型的HB-EGF結(jié)合的抗體或其抗體片 段的編碼DNA與編碼待結(jié)合的藥劑例如蛋白的其它DNA連接在一起， 將DNA插入到表達(dá)載體中，并將表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。藥劑包括化療劑、治療性抗體、免疫刺激劑例如細(xì)胞因子、放射 性同位素、免疫佐劑等。
此外，待連接到抗體或其抗體片段上的藥劑可以是藥物前體的形 式。本發(fā)明中的藥物前體是受到腫瘤環(huán)境中存在的酶的化學(xué)修飾、并 被轉(zhuǎn)化成具有傷害腫瘤細(xì)胞的活性的物質(zhì)的藥劑。
化療劑包括任何化療劑，例如垸基化劑、亞硝基脲劑、代謝拮抗 劑、抗癌性抗生素物質(zhì)、來源于植物的生物堿、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、 激素療法的藥劑、激素拮抗劑、芳香化酶抑制劑、P糖蛋白抑制劑、鉑 復(fù)合物衍生物、M期抑制劑和激酶抑制劑?；焺┑睦影ò绷淄?br> (Ethyol)、順鉬，達(dá)卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、氮芥(氮芥子氣)、 鏈脲佐菌素、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀
(CCNU)、阿霉素(亞德里亞霉素)、阿霉素脂質(zhì)體(Doxyl)、表 柔比星、吉西他濱(Gemsal)、柔紅霉素、柔紅霉素脂質(zhì)體(Daunozome)、 丙卡巴肼、絲裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、 氟尿啼啶、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、博來霉素、道諾霉素、培洛霉素、 雌氮芥、紫杉醇(Taxol)、多烯紫衫醇(Taxotea)、阿地白介素、天 冬酰胺酶、白消安、卡鉑、奧沙利鉑、奈達(dá)鉑、克拉曲濱、喜樹堿、 CPT-ll、 10-羥基-7-乙基喜樹堿(SN38) 、 5-氟尿苷、氟達(dá)拉濱、羥基 脲、異環(huán)磷酰胺、伊達(dá)比星、美司那、伊立替康、nogitecan、米托蒽醌、 拓?fù)涮婵?、亮?nèi)瑞林、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、羥基脲、普卡 霉素、米托坦、培門冬酶、戊制菌素、哌泊溴烷、鏈脲霉素、他莫昔 芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睪內(nèi)酯、硫鳥嘌呤、 硫替哌、尿嘧啶氮芥、長(zhǎng)春瑞賓、苯丁酸氦芥、氫化可的松、潑尼松 龍、甲基潑尼松龍、長(zhǎng)春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他濱、雷 替曲塞、氮胞苷、UFT、奧沙利鉑、吉非替尼(Iressa)、伊馬替尼(STI 571)、埃羅替尼、Flt3抑制劑、VEGFR抑制劑、FGFR抑制劑、根赤 殼菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素、雷帕霉素、安丫啶、 全反式視黃酸、沙利度胺、阿那曲唑、法曲唑、來曲唑、依西美坦、
34硫代蘋果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立賓、環(huán)孢霉
素、雷帕霉素、氫化可的松、蓓薩羅丁 (Targretin)、他莫昔芬、地塞 米松、孕激素物質(zhì)、雌激素物質(zhì)、阿那曲唑(Arimidex)、來普隆、阿 司匹林、吲哚美辛、塞來考昔、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代蘋果酸金、 馬來酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯馬斯汀、維A酸、蓓薩羅丁、砷、 voltezomib、別嘌呤醇、吉妥單抗、伊莫單抗、131托西莫單抗、塔革 雷汀、ONTAK、奧唑米星、克拉霉素、甲酰四氫葉酸、異環(huán)磷酰胺、 酮康唑、氨基苯乙哌啶酮、蘇拉明和氨甲蝶呤。
將化療劑與抗體結(jié)合的方法包括其中化療劑與抗體的氨基基團(tuán)通 過戊二醛連接的方法，其中化療劑的氨基基團(tuán)與抗體的羧基基團(tuán)通過 水溶性碳二亞胺連接的方法，等等。
治療性抗體包括針對(duì)其中抗體的結(jié)合誘導(dǎo)凋亡的抗原的抗體，針 對(duì)參與腫瘤的病態(tài)形成例如腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的抗原的抗體，調(diào) 節(jié)免疫功能的抗體，以及抑制病態(tài)部位中血管形成的抗體。
其中抗體結(jié)合誘導(dǎo)凋亡的抗原包括分化簇(在后文中稱為"CD") 19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD24、 CD37、 CD53、 CD72、 CD73、 CD74、 CDw75、 CDw76、 CD77、 CDw78、 CD79a、 CD79b、 CD80 (B7.1)、 CD81、 CD82、 CD83、 CDw84、 CD85、 CD86 (B7.2) 、 II類人類白細(xì) 胞抗原(HLA) 、 EGFR，等等。
調(diào)節(jié)免疫功能的抗體的抗原包括CD4、 CD40、 CD40配體、B7家 族分子(CD80、 CD86、 CD274、 B7-DC、 B7誦H2、 B7誦H3、 B7-H4)、 B7家族分子的配體(CD28、 CTLA-4、 ICOS、 PD-1、 BTLA) 、 OX-40、 OX-40配體、CD137、腫瘤壞死因子(TNF)受體家族分子(DR4、 DR5、 TNFR1、 TNFR2)、誘導(dǎo)TNF相關(guān)的凋亡的配體受體(TRAIL)家族 分子、TRAIL家族分子的受體家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、 TRAIL-R4)、核因子kB配體(RANK)的受體激活劑、RANK配體、
35CD25、葉酸受體4、細(xì)胞因子[白介素-la (后文中白介素稱為IL ")、 IL-1卩、IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-IO、 IL-13、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF) (3、 TNFot， 等等]、這些細(xì)胞因子的受體、趨化因子(SLC、 ELC、 1-309、 TARC、 MDC、 CTACK等)以及這些趨化因子的受體。
在病態(tài)部位抑制血管形成的抗體的抗原包括內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF) 、 EGF、血小板衍生的生長(zhǎng) 因子(PDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、 TGF卩、IL-8、 ephilin、 SDF-1等。
免疫刺激劑可以是任何細(xì)胞因子，只要它增強(qiáng)了細(xì)胞例如NK細(xì) 胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞即可。例子包括干擾素(在后文中稱為
"INF")陽(yáng)a、 INF-p、 INF-y、 IL國(guó)2、 IL-12、 IL-15、 IL-18、 IL-21、 IL國(guó)23、 粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子
(GM-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)等。此外，還包括已 知為免疫刺激劑的天然產(chǎn)物，增強(qiáng)免疫原的藥劑的例子包括(5(1">3)葡 聚糖(香菇多糖，裂裥菌素)、a-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(KRN7000)、 真菌粉末(picibanil， BCG)和真菌提取物(云芝多糖(krestin))。 放射性同位素包括1311、 125I、 9QY、 64Cu、 "Tc、 77Lu、川At等。放射性 同位素可以通過氯胺-T方法直接與抗體相連。此外，也能夠?qū)Ⅱ戏?射性同位素的物質(zhì)與抗體相連。螯合劑包括甲基苯甲基二亞乙基-三胺 五乙酸(MX-DTPA)等。
在本發(fā)明中，用于本發(fā)明的抗體可以與一種或多種其它藥劑組合 施用，并也能組合使用放射性輻照。其它藥劑包括上面描述的化療劑、 治療性抗體、免疫刺激劑例如細(xì)胞因子，等等。
治療性抗體包括針對(duì)可以變成靶的抗原的抗體，例子包括EGFR 抗體(西妥昔單抗、帕尼單抗、Matuzumab等)，等等。放射性輻照包括光子(電磁)輻照例如X-射線或Y-射線、微粒輻 照例如電子束、質(zhì)子束或重粒子束，等等。
在組合給藥的方法中，藥劑可以與本發(fā)明中使用的抗體同時(shí)給藥， 或者藥劑可以在本發(fā)明中使用用的抗體施用之前或之后給藥。
下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
l.生產(chǎn)重組抗體組合物的方法 (1)抗原的制備
含有分泌型HB-EGF或分泌型HB-EGF的部分長(zhǎng)度(后文中簡(jiǎn)稱 為分泌型HB-EGF )的編碼cDNA的表達(dá)載體，被導(dǎo)入到大腸桿菌 (￡sc/ien'c/z!'a co/z')、酵母、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等中進(jìn)行表達(dá)，以獲 得分泌型HB-EGF或分泌型HB-EGF的部分片段。此外，能夠通過蛋 白酶處理從表達(dá)HB-EGF的細(xì)胞純化細(xì)胞外區(qū)域中的HB-EGF。能夠從 表達(dá)大量分泌型HB-EGF的各種不同的人類腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞、人類組織 等中純化分泌型HB-EGF。此外，可以制備具有分泌型HB-EGF的部分 序列的合成肽并用作抗原。
具體來說，在本發(fā)明中使用的分泌型HB-EGF能通過例如將編碼 它的DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)而生產(chǎn)，使用在《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》
(第二版)(Mo/ecw/ar C7om'"g'爿Z^60raf07 Mzwwa/, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))、《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》
(Cw/re"f 尸rofoco/s Mo/ecw/or fiz'o/ogy， John Wiley & Sons (1987-1997))等中描述的方法如下進(jìn)行。
首先，通過將全長(zhǎng)cDNA插入到適合的表達(dá)載體的啟動(dòng)子下游而 產(chǎn)生重組載體。這時(shí)，如果需要，可以制備具有適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度、含有基 于全長(zhǎng)cDNA的多肽的編碼區(qū)域的DNA片段，該DNA片段可以代替 上述全長(zhǎng)cDNA使用。接下來，通過將重組載體導(dǎo)入適合表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，可以獲得產(chǎn)生HB-EGF的轉(zhuǎn)化體。
宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)目的基因即可，包括 大腸桿菌、動(dòng)物細(xì)胞等。
表達(dá)載體包括能夠在供使用的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的載體，或者 能夠整合到含有適當(dāng)啟動(dòng)子的染色體中編碼分泌型HB-EGF的DNA能 夠被轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)位置的載體。
當(dāng)使用原核生物例如大腸桿菌作為宿主細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選含有編碼本 發(fā)明中使用的HB-EGF的DNA的重組載體在原核生物中可以自主復(fù) 制，并含有啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、在本發(fā)明中使用的DNA以及轉(zhuǎn) 錄終止序列。重組載體還可以含有調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的基因。
表達(dá)載體包括，例如，pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (都由Roche Diagnostics制造)、pKK233-2 (Pharmacia制造)、pSE280 (Invitrogen 制造)、pGEMEX-l (Promega制造)、pQE-8(QIAGEN制造)、pKYP10 (日本未經(jīng)審查的公布專利申請(qǐng)No. 110600/83 ) 、 pKYP200 [y4gr/cw/fwra/CAew&fr^y,化，669 (1984)]、 pLSAl [Xgn'c. CA亂，^i, 277 (1989)]、 pGELl [/Voc.淑/.爿cd Sc/.園，M， 4306 (1985)]、 pBluescript II SK(-) (Stratagene制造)、pTrs30 [從大腸桿菌 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)制備]、pTrs32 [從大腸桿菌 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)制備]、pGHA2 [從大腸桿菌IGHA2 (FERMBP-400)中制備，日本未經(jīng)審查的公布專利申請(qǐng)No. 221091/85]、 pGKA2 [從大腸桿菌IGKA2 (FERM BP-6798)制備，日本未經(jīng)審查的公 布專利申請(qǐng)No. 221091/85]、 pTerm2 (US4686191 、 US4939094、 US5160735) 、 pSupex、 pUB110、 pTP5、 pC194、 pEG400 [ /. jBoc^7'o/" 172, 2392 (1990)]、 pGEX (Pharmacia制造)、pET系統(tǒng)(Novagen制 造)、pME18SFL3，等等。任何啟動(dòng)子都可以使用，只要它能夠在要使用的宿主細(xì)胞中起作
用即可。例子包括源自于大腸桿菌、噬菌體等的啟動(dòng)子，例如trp啟動(dòng) 子(Ptrp) 、 lac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子。此夕卜， 人工設(shè)計(jì)和修飾的啟動(dòng)子也可以使用，例如其中兩個(gè)Ptrp串聯(lián)連接的 串聯(lián)啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、lacT7啟動(dòng)子和letl啟動(dòng)子。
此外，上述的重組載體優(yōu)選為質(zhì)粒，其中作為核糖體結(jié)合序列的 Shine-Dalgarno序列與起始密碼子之間的間距被調(diào)整到適當(dāng)?shù)木嚯x(例 如6到18個(gè)核苷酸)。在本發(fā)明所用的分泌型HB-EGF的編碼DNA 的核苷酸序列中，核苷酸能夠地安排，以獲得適合在宿主中表達(dá)的密 碼子，使得目的分泌型HB-EGF的生產(chǎn)率提高。此外，上述重組載體 中的轉(zhuǎn)錄終止序列對(duì)于表達(dá)基因來說不是必需的。但是，優(yōu)選將轉(zhuǎn)錄 終止序列安排在緊鄰結(jié)構(gòu)基因的下游。
用作宿主細(xì)胞的原核生物包括屬于大腸桿菌屬(&c/^Wc/u'a)的 原核生物，例子包括大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿 菌DH1、大腸桿菌DH5ot、大腸桿菌BL21 (DE3)、大腸桿菌MC1000、 大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌 HBIOI、大腸桿菌No. 49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49，等等。
任何導(dǎo)入重組載體的方法都可以使用，只要它是用于將DNA導(dǎo)入 到上述宿主細(xì)胞中的方法即可，例子包括在A^f/. ^c^/. Sc/. 旺2110 (1972)、 H， 107 (1982)、 Mo/,/ar c6: Ge鮮a/ G，"cs,
1M， 111 (1979)中描述的使用鈣離子的方法，等等。
當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞被用作宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體包括，例如，pcDNAI、 pcDM8 (從Funakoshi獲得)、pAGE107 [日本未經(jīng)審査的公布專利申 請(qǐng)No. 22979/91; C聲ec/mo/ogy, L 133 (1990)]、 pAS3誦3 (日本未經(jīng)審 查的公布專利申請(qǐng)No. 227075/90) 、 pCDM8 [AWwre， 122, 840,(1987)]、 pcDNAI/Amp (Invitrogen制造)、pREP4 (Invitrogen制造)、pAGE103AWz麵-自，101, 1307 (1987)1、 pAGE210、 pME18SFL3，等等。
任何啟動(dòng)子都可以使用，只要它能夠在動(dòng)物細(xì)胞中起作用即可。 例子包巨細(xì)胞病毒(CMV)的IE (立即早期)基因的啟動(dòng)子、SV40 早期啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng) 子、SRa啟動(dòng)子等。此外，人類CMV的IE基因的增強(qiáng)子可以與啟動(dòng) 子一起使用。
宿主細(xì)胞包括人類Namalwa細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中華倉(cāng)鼠卵巢 (CHO)細(xì)胞、HST5637 (日本未經(jīng)審查的公布專利申請(qǐng)No. 299/88)， 等等。
任何導(dǎo)入重組載體的方法都可以使用，只要它是用于將DNA導(dǎo)入 到動(dòng)物細(xì)胞中的方法即可，例子包括電穿孑L[Qy加ec/mo/ogy, 1, 133 (1990)]、磷酸鈣方法(日本未經(jīng)審査的公布專利申請(qǐng)No. 227075/90)、 脂轉(zhuǎn)染方法[ZVoc. A^/. Jcad Sc/.M, 7413 (1987)]，等等。
作為基因的表達(dá)方法，除了直接表達(dá)之外，還可以按照《分子克 隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第二版)(Mo/ec"/a7- C7om'"g, j丄a60raf07Ma肌a/, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))中描述的方 法進(jìn)行分泌生產(chǎn)、融合蛋白表達(dá)等。當(dāng)在真核生物來源的細(xì)胞中進(jìn)行 表達(dá)時(shí)，可以獲得添加有糖或糖鏈的分泌型HB-EGF。
在本發(fā)明中使用的分泌型HB-EGF可以通過將如此獲得的轉(zhuǎn)化體 在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)以在培養(yǎng)基中形成和積累分泌型HB-EGF、并從培 養(yǎng)物中回收它來生產(chǎn)。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的方法按照在宿主培養(yǎng) 中使用的有效方法來進(jìn)行。
當(dāng)用含有可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子作為啟動(dòng)子的重組載體轉(zhuǎn)化的微生物被 培養(yǎng)時(shí)，如果必要，可以在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑。例如，當(dāng)以使用/ac
40啟動(dòng)子的重組載體轉(zhuǎn)化的微生物被培養(yǎng)時(shí)，可以在培養(yǎng)基中加入異丙
基-P-D-硫代半乳糖苷等，或者當(dāng)以使用trp啟動(dòng)子的重組載體轉(zhuǎn)化的微 生物被培養(yǎng)時(shí)，可以在其中加入吲哚丙烯酸等。
當(dāng)使用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化體被培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基包 括常用的RPMI 1640培養(yǎng)基[77 e /owrwa/ o/ 爿meWcaw A/e力'ca/ J^oc/a"ow,塑，519 (1967)]、 Eagle's MEM培養(yǎng)基[S"'e"ce, 122， 501 (1952)]、 Dulbecco，s修飾的MEM培養(yǎng)基[J^o/ogy， & 396 (1959)]以及 199 培養(yǎng)基[/Voceed/wg o/ f/je SocZety /or ￡xpeWme to/ 5fo/ogy朋^ 71^AW"e,Ii, 1 (1950)]、加入了胎牛血清等的培養(yǎng)基，等等。培養(yǎng)一般 在5°/。 C02的存在下于pH 6到8和30到40°C下進(jìn)行1到7天。如果 必要，在培養(yǎng)過程中可以在培養(yǎng)基中加入抗生素例如卡那霉素或青霉 素。
因此，在本發(fā)明中使用的分泌型HB-EGF的生產(chǎn)，可以通過按照 通用的培養(yǎng)方法，對(duì)源自微生物、動(dòng)物細(xì)胞等的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，所 述轉(zhuǎn)化體包含其中插入了本發(fā)明使用的分泌型HB-EGF的編碼DNA的 重組載體，從而形成和積累多肽，然后從培養(yǎng)物中回收分泌型HB-EGF。
對(duì)于基因的表達(dá)方法來說，除了直接表達(dá)之外，還可以按照《分 子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第二版)(Mo/ecw/flT C7om'"g'」丄a6om^y Mawwa/, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) 中
描述的方法進(jìn)行分泌生產(chǎn)、融合蛋白表達(dá)等。
生產(chǎn)分泌型HB-EGF的方法包括在宿主細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的 方法、從宿主細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞外分泌的方法、在宿主細(xì)胞膜外膜上生產(chǎn) 的方法，等等。適合的方法可以通過改變使用的宿主細(xì)胞和產(chǎn)生的分 泌型HB-EGF的結(jié)構(gòu)來選擇。
當(dāng)在宿主細(xì)胞中或宿主細(xì)胞膜外包被上生產(chǎn)分泌型HB-EGF時(shí)，按照Paulson等的方法[/. B/o/. C/zem., 2M, 17619 (1989)]、 Lowe等的方 法[/Voc. iW^/. ^cad L^4, M， 8227 (1989), Deve/印.，4, 1288
(1990)]、日本未經(jīng)審查的公布專利申請(qǐng)No. 336963/93和WO94/23021 中描述的方法等，基因產(chǎn)物可以被主動(dòng)分泌到細(xì)胞外。
此外，按照日本未經(jīng)審查的公布專利申請(qǐng)No. 227075/90中描述的 方法，利用使用二氫葉酸還原酶基因的基因擴(kuò)增系統(tǒng)，能夠增加產(chǎn)量。 分泌型HB-EGF可以例如如下所述從上述培養(yǎng)物中分離和純化。當(dāng)分 泌型HB-EGF以溶解狀態(tài)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)后通過離心回 收，懸浮在水性緩沖液中，然后使用超聲發(fā)生器、French壓力器、Manton vjauun vj水研、環(huán)照肌、aynomuu守J2T1J似肝，fcA3大付A^胞提耿柳。 將無(wú)細(xì)胞提取物進(jìn)行離心以獲得上清液，并通過對(duì)上清液進(jìn)行一般的 酶分離和純化技術(shù)來獲得純化的制備物，這些技術(shù)例如溶劑抽提，使 用硫酸銨等進(jìn)行鹽析，脫鹽，用有機(jī)溶劑沉淀，使用樹脂例如二乙氨 基乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠、DIAIONHPA-75 (Mitsubishi Chemical 制造)進(jìn)行陰離子交換層析，使用樹脂例如S-瓊脂糖凝膠FF(Pharmacia 制造)進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，使用樹脂例如丁基-瓊脂糖凝膠或苯基-瓊脂糖凝膠進(jìn)行疏水層析，使用分子篩進(jìn)行凝膠過濾，親和層析，層 析聚焦，電泳例如等點(diǎn)聚焦，等等，它們可以單獨(dú)或組合使用。
當(dāng)分泌型HB-EGF通過形成包合體被細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，細(xì)胞以同樣 的方式回收、破碎和離心，分泌型HB-EGF的包合體作為沉淀級(jí)份被 回收。將回收的蛋白包合體用蛋白變性劑進(jìn)行溶解。通過對(duì)增溶的溶 液進(jìn)行稀釋或透析，使蛋白成為正常的三維結(jié)構(gòu)，然后通過與上述相 同的分離純化方法獲得分泌型HB-EGF的純化產(chǎn)品。
當(dāng)分泌型HB-EGF或衍生物例如糖基化產(chǎn)物被分泌到細(xì)胞外時(shí)， 能夠從培養(yǎng)上清液中回收分泌型HB-EGF或衍生物例如糖基化產(chǎn)物。 即，通過例如離心的方法、以與上述相同的方式來處理培養(yǎng)物，獲得 除去固形物的培養(yǎng)上清液，從培養(yǎng)上清液中通過與上述相同的分離純化方法獲得的多肽的純化產(chǎn)品。此外，在本發(fā)明中使用的分泌型
HB-EGF可以通過化學(xué)合成方法來生產(chǎn)，例如Fmoc (芴甲氧羰基)方 法或tBoc(叔丁氧羰基)方法。此外，可以使用由Advanced ChemTech、 Perkin-Elmer 、Pharmacia 、Protein Technology Instrument 、 Synthecell-Vega、 PerSeptive、 Shimadzu Co卬oration等制造的肽合成儀 來化學(xué)合成它。
(2)動(dòng)物的免疫和抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備
使用上面制備的抗原免疫3到20周齡的小鼠、大鼠或倉(cāng)鼠，然后 從動(dòng)物的脾臟、淋巴結(jié)或外周血收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞。此外，當(dāng)在上述 動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)由于低免疫原性而導(dǎo)致的足夠的滴度增加時(shí)，可以使用 HB-EGF敲除的小鼠作為供免疫的動(dòng)物。
免疫通過給動(dòng)物皮下、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射抗原連同適合的佐劑 (例如完全弗氏佐劑，氫氧化鋁凝膠與百日咳菌苗的組合等)來施用 抗原進(jìn)行。當(dāng)抗原是部分肽時(shí)，用載體蛋白例如BSA(牛血清白蛋白)、 KLH (匙孔血藍(lán)蛋白)等產(chǎn)生結(jié)合物，將其用作抗原。
抗原的施用在第一次施用后，每一周或每?jī)芍軆?nèi)進(jìn)行5到10次。 在每次施用后的第三天到第七天，從眼底收集血液樣品，通過例如酶 免疫分析[《抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，爿""力0&^-jMa""a/(Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等測(cè)試血清與抗原的反應(yīng)性。在其血清
中顯示出針對(duì)用于免疫抗原的足夠抗體滴度的小鼠、大鼠或倉(cāng)鼠，被 用作抗體產(chǎn)生細(xì)胞的供應(yīng)源。
在抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合中，在最后施用抗原后的第 三天到第七天，切除含有抗體產(chǎn)生細(xì)胞的組織例如來自被免疫的小鼠、 大鼠或倉(cāng)鼠的脾臟，以收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞。當(dāng)使用脾臟細(xì)胞時(shí)，切除 的脾臟放到MEM培養(yǎng)基中(Nissui Pharmaceutical)，用鑷子打散，并 離心(1200rpm， 5分鐘)。然后，丟棄上清液，加入Tris-氯化銨緩沖液(pH7.65) l到2分鐘以除去紅細(xì)胞。在用MEM培養(yǎng)基洗3次后， 提供了用于融合的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
(3) 骨髓瘤細(xì)胞的制備
從小鼠獲得的已建立的細(xì)胞系被用作骨髓瘤細(xì)胞。例子包括8-氮 雜鳥嘌呤抗性小鼠(源自BALB/c小鼠)骨髓瘤細(xì)胞系P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) [Cw/rew rop/cs M'croWo/ogy "m/ //wmtmo/ogy, 1-7 (1978)]、 P3-NSl/l-Ag41 (NS-1)[五wo; eaw /mmw"o/ogv, & 511-519 (1976)] 、 SP2/0-Ag14 (SP-2)[腺?gòu)d，269-270 (1978)]、 P3-X63-Ag8653 (653) [ /■ /mmw"o/ogy, 121, 1548-1550 (1979)]、 P3-X63-Ag8 (X63) [7W^ww， 2M， 495-497 (1975)]，等等。這些細(xì)胞系在 8-氮雜鳥嘌呤培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)[該培養(yǎng)基是將谷氨酰胺(1.5 mM)、 2-巰基乙醇(5x10-5 M)、慶大霉素(10嗎/ml)和胎牛血清(FCS) 加入到RPMI-1640培養(yǎng)基(在后文中稱為"正常培養(yǎng)基")中，并再 加入8-氮雜鳥嘌呤(15嗎/ml)]，并且在細(xì)胞融合之前將它們?cè)谡?培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)3或4天，以確保在進(jìn)行融合的當(dāng)天細(xì)胞數(shù)量達(dá)到 2xl07個(gè)以上。
(4) 細(xì)胞融合
將上述抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基或PBS (1.83 g 磷酸氫二鈉，0.21g磷酸二氫鉀，7.65g氯化鈉，l升蒸餾水，pH7.2) 進(jìn)行充分清洗和混合，使抗體產(chǎn)生細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞的比率=5-10:1，然 后離心(1200rpm， 5分鐘)。然后丟棄上清液，使沉淀的細(xì)胞群足夠 松散。在108個(gè)抗體產(chǎn)生細(xì)胞中，在37。C下在攪拌下加入0.2到lmL 2g聚乙二醇-1000 (PEG-1000) 、 2mLMEM和0.7mL二甲亞砜的混 合物溶液，每1或2分鐘加入1到2mLMEM培養(yǎng)基數(shù)次，并加入MEM 培養(yǎng)基使得總量為50mL。離心(900rpm, 5分鐘)后，將上清液丟棄， 輕輕地將細(xì)胞打散，通過使用刻度吸管吹吸，將細(xì)胞輕柔地懸浮在100 mLHAT培養(yǎng)基中[該培養(yǎng)基是次黃嘌呤(10—4M)、胸腺嘧啶(1.5"0'5 M)和氨基蝶呤(4xl0'7 M)加入到正常培養(yǎng)基中]。將懸浮液以100 ^L/
44孔分配到96孔培養(yǎng)板上，在5%(:02的培養(yǎng)箱中37。C培養(yǎng)7到14天。
培養(yǎng)后，將部分培養(yǎng)上清液作為樣品，通過下面描述的結(jié)合分析 方法篩選生產(chǎn)對(duì)所有細(xì)胞膜結(jié)合的HB-EGF、分泌型HB-EGF和膜型 HB-EGF具有反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤或純化的抗體。
然后，通過有限稀釋方法進(jìn)行兩次克隆[第一次使用HT培養(yǎng)基(其 中氨基蝶呤被除去的HAT培養(yǎng)基)，第二次使用正常培養(yǎng)基]，顯示出 穩(wěn)定的高抗體滴度的雜交瘤被選為生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤。
(5) 單克隆抗體的制備
將在(4)中獲得的產(chǎn)生抗HB-EGF單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，以 2"06到5><107個(gè)細(xì)胞/動(dòng)物的劑量通過腹膜內(nèi)注射施用于8到10周齡 的降植垸(pristane)處理過的小鼠或裸鼠中(0.5 ml 2,6,10，14-四甲基 十五垸(降植垸)腹膜內(nèi)注射，然后飼養(yǎng)2周)。雜交瘤在10到21 天內(nèi)發(fā)展成腹水腫瘤。從小鼠收集腹水液，離心(3,000 rpm， 5分鐘) 除去固形物，用40到50%飽和的硫酸銨進(jìn)行鹽析，然后用辛酸沉淀， 通過DEAE-Sepharose柱、蛋白A柱或凝膠過濾柱，收集IgG或IgM 級(jí)份作為純化的單克隆抗體。
抗體的亞類可以使用亞類分型試劑盒通過酶免疫分析來確定。蛋 白的量可以通過Lowry方法或從280 nm處的吸光度來測(cè)定。
(6) 結(jié)合分析
導(dǎo)入了基因的細(xì)胞或通過(l)中的方法將含有本發(fā)明使用的 HB-EGF的編碼cDNA的表達(dá)載體導(dǎo)入到大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、 動(dòng)物細(xì)胞等中而獲得的重組蛋白、或從人類組織獲得的純化的HB-EGF 或部分肽，被用作抗原。當(dāng)抗原是部分肽時(shí)，制備與載體蛋白例如BSA (牛血清白蛋白)或KLH (匙孔血藍(lán)蛋白)的結(jié)合物，并使用。在這些抗原中，其中分泌型HB-EGF和HB-EGF與細(xì)胞相連的細(xì) 胞系被分配到96孔板中并固相化，然后分配免疫動(dòng)物的血清、產(chǎn)生單 克隆抗體的雜交瘤的培養(yǎng)上清液或純化的抗體作為第一抗體并進(jìn)行反 應(yīng)。在用PBS或PBS-0.05% Tween充分清洗后，分配用酶、化學(xué)發(fā)光 物質(zhì)、放射性物質(zhì)等標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體作為第二抗體并進(jìn)行反 應(yīng)。在用PBS-Tween充分清洗后，進(jìn)行第二抗體中的標(biāo)記物質(zhì)的反應(yīng)。
按照上面描述的方法，可以篩選出能夠生產(chǎn)對(duì)所有細(xì)胞膜結(jié)合的 HB-EGF、分泌型HB-EGF和膜型HB-EGF具有反應(yīng)性的單克隆抗體的 雜交瘤或者純化的抗體。
在獲得的單克隆抗體中，具有分泌型HB-EGF對(duì)HB-EGF受體的 結(jié)合抑制活性的抗體，包括雜交瘤細(xì)胞系KM3566產(chǎn)生的單克隆抗體 KM3566、雜交瘤細(xì)胞系KM3567產(chǎn)生的單克隆抗體KM3567、以及由 雜交瘤KM3579產(chǎn)生的單克隆抗體。雜交瘤KM3579已經(jīng)于2006年1 月24日作為FERM BP-10491保藏于國(guó)立高等工業(yè)科學(xué)與技術(shù)研究所 國(guó)際專禾U生物保藏部[International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi， Ibaraki， Japan)]。
此外，獲得的單克隆抗體對(duì)分泌型HB-EGF是否具有中和活性， 可以通過使用HB-EGF依賴性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)抑制分析來證實(shí)。
用于細(xì)胞生長(zhǎng)抑制分析的細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，只要它是能夠與 分泌型HB-EGF結(jié)合的細(xì)胞。例子包括通過將EGF受體基因?qū)氲叫?鼠骨髓衍生的細(xì)胞系32Dclone3 (ATCC No. CRL-11346)等中獲得的 細(xì)胞系。
在使獲得的單克隆抗體與分泌型HB-EGF在板上反應(yīng)后，向其中 加入上述細(xì)胞系，然后進(jìn)行培養(yǎng)。作為對(duì)照，將上述的細(xì)胞系同樣加入到加入了分泌型HB-EGF但是沒有加入單克隆抗體的板以及既沒有 加入分泌型HB-EGF也沒有加入單克隆抗體的板中，然后進(jìn)行培養(yǎng)。 通過測(cè)量每個(gè)板上的細(xì)胞數(shù)量，可以測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制比率。可以將 具有高細(xì)胞生長(zhǎng)抑制比率的單克隆抗體選作具有中和活性的單克隆抗 體。
本發(fā)明的具有中和活性的單克隆抗體的例子包括由雜交瘤細(xì)胞系 KM3566產(chǎn)生的單克隆抗體KM3566和由雜交瘤細(xì)胞系KM3567產(chǎn)生 的單克隆抗體KM3567。雜交瘤細(xì)胞系KM3566和3567已經(jīng)分別于2006 年1月24日和2006年3月23日作為FERM BP-10490禾B FERM BP-10573保藏于國(guó)立高等工業(yè)科學(xué)與技術(shù)研究所國(guó)際專利生物保藏部 [International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1， Higashi l-chome， Tsukuba-shi, Ibaraki墨ken， Japan)]。
2.人類嵌合抗體和人源化抗體的制備 (l)表達(dá)人源化抗體的載體的構(gòu)建
表達(dá)人源化抗體的載體可以是任何用于動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體，只 要是插入了編碼人類抗體的CH和/或CL的基因。表達(dá)人源化抗體的載 體可以通過將每個(gè)編碼人類抗體的CH和CL的基因克隆到動(dòng)物細(xì)胞的 表達(dá)載體中來構(gòu)建。
人類抗體的C區(qū)可以是任何人類抗體的CH和CL。例子包括人類 抗體中H鏈的IgGl亞類的C區(qū)(在后文中稱為"he"")、人類抗 體中L鏈的K類的C區(qū)(在后文中稱為"hCic")，等等。對(duì)于編碼人 類抗體的CH和CL的基因來說，可以使用含有外顯子和內(nèi)含子或cDNA 的染色體DNA，也可以使用cDNA。
對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體來說，可以使用任何表達(dá)載體，只要是 其中插入并能表達(dá)編碼人類抗體的C區(qū)的基因。例子包括pAGE107
47[qyto&c/wo/" 2, 133-140 (1990)]、pAGE103 [ /. 5z'oc/zem.，巡，1307-1310 (1987)]、 pHSG274 [Ge"e， 2， 223-232 (1984)]、 pKCR [尸roceed/"gj o/Ae
1527-1531 (1981)]、 pSGipd2-4 [Q^ofec/z"o/"丄173-180 (19卯)]，等等。 用于動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的例子包括SV40早期啟 動(dòng)子和增強(qiáng)子[乂 S/oc/zem.， 1Qi， 1307-1310 (1987)]、莫洛尼小鼠白血病 病毒LTR啟動(dòng)子和增強(qiáng)子[石!'oc/zem.所op/z". Commww., 149,
960-968 (1987)]、免疫球蛋白H鏈啟動(dòng)子[Ce//, 4i， 479-487 (1985)]和增 強(qiáng)子[Ce〃，ii， 717-728 (1983)]，等等。
用于人類嵌合抗體和人源化抗體的表達(dá)的載體可以是其中抗體的 H鏈和L鏈存在于分開的載體上的類型，或是其中它們存在于同一個(gè) 載體上的類型(在后文中稱為"串聯(lián)類型")。對(duì)于構(gòu)建人類嵌合抗 體和人源化抗體的表達(dá)載體的容易性、導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的容易性、以及
動(dòng)物細(xì)胞中抗體H鏈和L鏈的表達(dá)量之間的平衡來說，串聯(lián)類型的表 達(dá)人源化抗體的載體是優(yōu)選的[Joz^"fl/ o/Vmmw"o/ogfca/ Me"o&, 1^2, 271-278 (1994)]。串聯(lián)類型的用于表達(dá)人源化抗體的載體的例子包括 pKANTEX93 ( WO 97/10354) 、 pEE18 [外諸oma, U， 559-567 (1998)]，
(2)非人類動(dòng)物抗體V區(qū)的編碼cDNA的獲得及氨基酸序列分析 編碼非人類動(dòng)物抗體例如小鼠抗體的VH和VL的cDNA可以按 照下面的方式獲得。
從雜交瘤提取mRNA用于合成cDNA。將合成的cDNA克隆到載 體例如噬菌體或質(zhì)粒中以獲得cDNA文庫(kù)。通過使用編碼小鼠抗體的C 區(qū)和V區(qū)的cDNA作為探針，從文庫(kù)中分離了每個(gè)含有編碼VH的 cDNA的重組噬菌體或重組質(zhì)粒和含有編碼VL的cDNA的重組噬菌體 或重組質(zhì)粒。重組噬菌體或重組質(zhì)粒上目的小鼠抗體的VH和VL的全 長(zhǎng)核苷酸序列被測(cè)定，并從核苷酸序列推導(dǎo)出VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列。
對(duì)于非人類動(dòng)物來說，可以使用任何動(dòng)物，只要可以從該動(dòng)物制 備雜交瘤細(xì)胞即可，例如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和兔子。從雜交瘤制備總
RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟乙酸銫方法[M"/ o^ /" ^矽mo/ogy， 154， 3-28 (1987)]，從總RNA制備mRNA的方法包括固定了寡聚(dT) 的纖維素柱的方法[《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Mo/ecw/ar C7om'"g, ^ 丄a6om^y Ma"wa/, Cold Spring Harbor Lab. Press New York (1989)]，等 等。用于從雜交瘤制備mRNA的試劑盒的例子包括Fast Track mRNA 分離試劑盒(Invitrogen制造)和Quick Prep mRNA純化試劑盒 (Pharmacia制造)，等等。
用于合成cDNA和制備cDNA文庫(kù)的方法包括常規(guī)的方法[《分子 克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》Mo/ecw/ar C7om'ng, Z^oraf"她wwa/, Cold Spring Harbor Lab. Press New York (1989)，《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》CwreW iVWoco/"" Mo/ecw/w 附錄1-34],使用可商購(gòu)試劑盒的方法，
例如用于cDNA合成和質(zhì)?？寺〉腟uperscript 質(zhì)粒系統(tǒng)(GIBCO BRL制造)和ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene制造)，等等。
在制備cDNA文庫(kù)中，對(duì)使用從雜交瘤提取的mRNA作為模板合 成的cDNA進(jìn)行整合的載體可以是任何載體，只要cDNA可以整合即 可。適合的載體的例子包括ZAP Express [S歸eg&， i, 58-61 (1992)]、 pBluescript II SK(+) ,c/e/cito臟/z， U, 9494 (1989)]、 XZAP II (Stratagene制造)、XgtlO、人gtll [《DNA克隆實(shí)用方法》DA^4 C/om'"g: 爿尸ra"/ca/JpproacA, I, 49 (1985)]、 Lambda BlueMid (Clontech制造)、 入ExCell、 pT7T3 18U (Pharmacia制造)、pcD2 [Afo/ecw/or <feCe〃w/w 5fo/ogV，l, 280-289 (1983)]、 pUC18 [Ge"e， H, 103-119 (1985)]，等等。
對(duì)于導(dǎo)入用噬菌體或質(zhì)粒載體構(gòu)建的cDNA文庫(kù)的大腸桿菌來 說，可以使用任何大腸桿菌，只要cDNA文庫(kù)可以被導(dǎo)入、表達(dá)和維持即可。例子包括XL1-Blue MRF [Jow"a/ o/5/o^c/z"o/ogy, 21， 271-289 (1992)]、 C600 [Gewe"a,旦，177-190 (1968)]、 Y1088、 Y1090 [Sc/ewce, 222, 778-782 (1983)]、 NM522 [Jbw簡(jiǎn)/ 。/她/織/w脂ogy,巡，1-19 (1983)]、K802 [Jowma/o/Mo/ecw/w M， 118-133 (1966)]、 JM105，等等。
從cDNA文庫(kù)篩選編碼非人類動(dòng)物來源的抗體的VH和VL的 cDNA克隆的方法包括使用同位素或熒光標(biāo)記的探針進(jìn)行菌落雜交或 噬斑雜交[《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Mo/ecw/ar C/om'"g， ^ LWom^j Mawwa/, Cold Spring Harbor Laboratory Press New York (1989)]。通過制 備引物并使用cDNA或cDNA文庫(kù)作為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(在后 文中稱為"PCR")，來制備編碼VH和VL的cDNA也是可能的[《分 子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Mo/ecw/ar C7om'wg, 丄a6ora/ory Mawwa/, Cold Spring Harbor Laboratory Press New York (1989)，《分子生物學(xué)現(xiàn)代方 法》，Cwn-eW/Vofoco/sMo/ecw/ar 5zWogy， 附錄1-34]。
通過上述方法篩選的cDNA的核苷酸序列可以如下確定用適合 的限制性酶裂解cDNA，將片段克隆到質(zhì)粒例如pBluescript SK(-) (Stratagene制造)中，然后通過通用的核苷酸序列分析方法例如雙脫 氧方法[尸roceed/wgj o/ j/Va"'owa/ /icacfe， o/ S"'e"ces o/ C/""ed 5V"^y o/^we〃'c", 24, 5463-5467 (1977)]或通過使用核苷酸序列分析儀 例如ABI PRISM 377 DNA測(cè)序儀(ABI制造)來分析序列。
從測(cè)定的核苷酸序列推導(dǎo)出VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列，并與已 知抗體的VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行比較[《免疫重要的蛋白序 歹U》，Se《we"ce51 o/iVofe/m1 o/7mmw2o/og/ca//",ereit,美國(guó)衛(wèi)生與人類 服務(wù)部(US Dept. Health and Human Services) ， (1991)]，由此可以i正 實(shí)獲得的cDNA編碼完整含有包括分泌信號(hào)序列的抗體的VH和VL的 氨基酸序列。將含有信號(hào)序列的抗體的VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列與 己知抗體的VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列[《免疫重要的蛋白序列》，iS"e《wewce51 o/ /Vo&z7w o/ /wmwwo/og/ca/ 7wfereW,美國(guó)衛(wèi)生與人類月艮務(wù) 部，(1991)]進(jìn)行比較，由此推導(dǎo)出信號(hào)序列的長(zhǎng)度和N-末端氨基酸序 列，并且可以知道它們所屬的亞類。此外，每個(gè)VH和VL的CDR的 氨基酸序列可以通過將其與已知抗體的VH和VL的每個(gè)CDR的氨基 酸序列[《免疫重要的蛋白的序列》，S^wewcw o/ i^We/似o/ /附mw"o/og/cfl/ /WereW,美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部，(1991)]進(jìn)行比較來發(fā) 現(xiàn)。
通過使用VH和VL的全長(zhǎng)氨基酸序列，用任何數(shù)據(jù)庫(kù)例如 SWISS-PROT或PIR-Protein進(jìn)行序列的同源性搜索、例如BLAST方 法[Joz^wa/ o/Mo/ecw/ar HI, 403-410 (1990)]，可以研究序列的
新穎性。
(3)人類嵌合抗體表達(dá)載體的構(gòu)建
將編碼非人類動(dòng)物的抗體的VH和VL的cDNA，克隆到表達(dá)人源 化抗體的載體中編碼人類抗體的CH和CL的基因上游，表達(dá)人源化抗 體的載體中按照本部分(2)-l中所述插入編碼人類抗體的CH和CL的 DNA，從而構(gòu)建了人類嵌合抗體表達(dá)載體。例如，將每個(gè)編碼非人類 動(dòng)物的抗體的VH和VL的cDNA，與合成的DNA進(jìn)行連接并克隆， 所述合成DNA含有非人類動(dòng)物的抗體的VH或VL的3'-末端的核苷酸 序列和人類抗體的CH和CL的5'-末端的核苷酸序列、并在兩端具有適 當(dāng)?shù)南拗菩悦傅淖R(shí)別序列，以便每個(gè)cDNA都以適當(dāng)?shù)男问皆诒磉_(dá)抗 體的載體中編碼人類抗體的CH和CL的基因上游進(jìn)行表達(dá)，其中表達(dá) 抗體的載體中按照本部分(2)-l中所述插入編碼人類抗體的CH和CL 的DNA，從而構(gòu)建了人類嵌合抗體表達(dá)載體。此外，使用含有編碼非 人類動(dòng)物的抗體的VH和VL的cDNA的質(zhì)粒作為探針，使用在5'-末 端具有適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅淖R(shí)別序列的引物，通過PCR擴(kuò)增VH和VL 的編碼cDNA，并將它們每個(gè)都克隆到本部分(2)-l中描述的表達(dá)人源 化抗體的載體中編碼CH和CL的基因上游，以便它可以以適當(dāng)?shù)男问?表達(dá)，從而構(gòu)建人類嵌合抗體表達(dá)載體。(4)人源化抗體(CDR移植抗體)的V區(qū)的編碼cDNA的構(gòu)建 編碼人源化抗體的VH或VL的cDNA可以如下獲得。首先，選 擇人類抗體的VH或VL中FR的氨基酸序列，在該序列中移植非人類 動(dòng)物的耙抗體的VH或VL中CDR的氨基酸序列?？梢允褂萌祟惪贵w 的VH或VL中FR的任何氨基酸序列，只要它們?cè)醋杂谌祟惪贵w即可。 例子包括在數(shù)據(jù)庫(kù)例如蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank)中登記的人類 抗體的VH或VL中FR的氨基酸序列，在人類抗體的VH或VL中FR 的亞類共有的氨基酸序列[《免疫重要的蛋白的序列》，^《"e"c^ o/ iVo&z7w 0//附mw"0/0g/ca//WereW,美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部，(1991)]， 等等。其中，為了生產(chǎn)具有強(qiáng)活性的人源化抗體，優(yōu)選選擇與非人類 動(dòng)物的靶抗體的VH或VL中FR的氨基酸序列具有高度同源性(至少 60%以上)的氨基酸序列。然后，將非人類動(dòng)物的靶抗體的VH或VL 中CDR的氨基酸序列分別移植到人類抗體的VH或VL中FR的選定 氨基酸序列中，以設(shè)計(jì)每個(gè)人源化抗體的VH或VL的氨基酸序列。通 過考慮在抗體的基因的核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)的密碼子使用頻率[《免疫重 要的蛋白的序歹(J》，5^gwe"ces o//Vofe/zw 0///w/nwwo/og7'ca/ /"fe/^sf，美 國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部，(1991)]，將設(shè)計(jì)的氨基酸序列轉(zhuǎn)化成DNA序列， 并設(shè)計(jì)編碼人源化抗體的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。根據(jù) 設(shè)計(jì)的DNA序列，合成幾個(gè)長(zhǎng)度大約150個(gè)核苷酸的合成DNA，使 用它們進(jìn)行PCR。在這種情況下，鑒于反應(yīng)的效率和可以合成的DNA 長(zhǎng)度，優(yōu)選對(duì)于每個(gè)VH和VL設(shè)計(jì)4個(gè)合成的DNA。
此外，通過在存在于兩端上的合成的DNA的5'-末端引入適當(dāng)?shù)?限制性酶的識(shí)別序列，可以將它容易地克隆到在本部分(2)-l中構(gòu)建的 人源化抗體的表達(dá)載體中。在PCR后，將每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒例 如pBluescript SK (-) (Stratagene制造)中，按照在本部分2(2)中描述 的方法測(cè)定核苷酸序列，從而獲得具有所需人源化抗體的VH或VL的 氨基酸序列的質(zhì)粒。(5) 人源化抗體的V區(qū)的氨基酸序列的修飾
已經(jīng)知道，當(dāng)通過僅僅將非人類動(dòng)物的靶抗體的VH和VL中的 CDR簡(jiǎn)單移植到人類抗體的VH和VL的FR中來生產(chǎn)人源化抗體時(shí)， 它的抗原結(jié)合活性比來自非人類動(dòng)物的原始抗體要低 [5/0/TSC7/M9丄(9G:r, & 266-271 (1991)]。因此，據(jù)認(rèn)為，不僅在CDR 而且在FR中的幾個(gè)氨基酸殘基，與非人類動(dòng)物的原始抗體的VH和 VL中的抗原結(jié)合活性直接或間接相關(guān)，并且作為CDR移植的結(jié)果， 這些氨基酸殘基被改變成人類抗體的VH和VL中FR的不同的氨基酸 殘基。為了在人源化抗體中解決這個(gè)問題，在人類抗體的VH和VL的 FR的氨基酸序列中，鑒定了直接與結(jié)合抗原相關(guān)的氨基酸殘基、或通 過與CDR中的氨基酸殘基相互作用或通過維持抗體的三維結(jié)構(gòu)間接地 與結(jié)合抗原相關(guān)的氨基酸殘基，并將其修改成在非人類動(dòng)物的原始抗 體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基，從而使已經(jīng)降低的抗原結(jié)合活性增加 [萬(wàn)/0/7^C/M^丄OGy， 2, 266-271 (1991)]。在人源化抗體的生產(chǎn)中，最重 要的是如何有效地鑒定FR中與抗原結(jié)合活性有關(guān)的氨基酸殘基，因此 通過X-射線晶體學(xué)IVom""a/ o/Mo/ecw/ar Ao/ogy,, JJl, 535-542 (1977)]、 計(jì)算機(jī)模擬[iVo^'"五"gZ"een'"g， Z, 1501-1507 (1994)]等構(gòu)建并分析抗 體的三維結(jié)構(gòu)。盡管抗體三維結(jié)構(gòu)的信息在人源化抗體的生產(chǎn)中是有 用的，但還沒有建立起能夠適用于任何抗體的生產(chǎn)人類CDR移植抗體 的方法。因此，現(xiàn)在必須需要進(jìn)行各種不同的嘗試，例如，生產(chǎn)每個(gè) 抗體的幾種修飾的抗體，并檢驗(yàn)每種修飾的抗體與其抗體結(jié)合活性之 間的相關(guān)性。
人類抗體的VH和VL中FR的氨基酸序列的修飾可以使用各種不 同的用于修飾的合成DNA按照本部分2(4)中描述的PCR來進(jìn)行。對(duì)于 通過PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物來說，核苷酸序列按照本部分2(2)中描述的 方法來測(cè)定，以便證實(shí)目的修飾是否已經(jīng)發(fā)生。
(6) 人源化抗體表達(dá)載體的構(gòu)建
人源化抗體表達(dá)載體的構(gòu)建可以通過將在本部分2(4)和2(5)中描述的被構(gòu)建的人源化抗體的VH或VL的每個(gè)編碼cDNA，克隆到在本 部分2(1)中描述的表達(dá)抗體的載體中人類抗體的CH或CL的每個(gè)編碼 基因的上游中。例如，當(dāng)適合的限制性酶的識(shí)別序列被引入到在本部 分2(4)和2(5)中構(gòu)建人源化抗體的VH或VL中使用的合成DNA中位 于兩端的合成DNA的5'-末端中時(shí)，克隆能夠進(jìn)行，以便它們?cè)诒静?分2(1)中描述的表達(dá)抗體的載體中，在每個(gè)編碼人類抗體的CH或CL 的基因的上游中以適當(dāng)?shù)男问奖磉_(dá)。
(7) 人源化抗體的瞬時(shí)表達(dá)
為了有效評(píng)估所產(chǎn)生的各種不同的人源化抗體的抗原結(jié)合活性， 能夠使用在本部分2(3)和2(6)中描述的人源化抗體表達(dá)載體或通過修 改它而獲得的表達(dá)載體來瞬時(shí)表達(dá)人源化抗體。任何細(xì)胞都可以用作 導(dǎo)入表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，只要宿主細(xì)胞能夠表達(dá)人源化抗體即可。 一般來說使用C0S-7細(xì)胞(ATCC CRL1651)，因?yàn)樗谋磉_(dá)量高 [M"/zoa^ /" Wwc/e/c ^c/(iy i wean^， CRC Press, 283 (1991)]。將表達(dá)載體 導(dǎo)入COS-7細(xì)胞的方法的例子包括DEAE-葡聚糖方法[7^eAo^ iVwc/efc爿czA i ^ewc/ , CRC Press, 283 (1991)]、月旨轉(zhuǎn)染方法
^me〃-ca,M, 7413-7417 (1987)]，等等。
導(dǎo)入表達(dá)載體之后，在培養(yǎng)上清液中人源化抗體的表達(dá)量和抗原 結(jié)合活性可以通過ELISA[《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，爿油'6oAw.'爿 丄a6orato7她"Ma/, Cold Spring Harbor Laboratory,第14章(1988);
《單克隆抗體原理禾口實(shí)踐》Mo"oc/o"a/ ^4油'6od/w尸r/wc^ /es a"d Pmc"ce, Academic Press Limited (1996)]等來測(cè)定。
(8) 人源化抗體的穩(wěn)定表達(dá)
穩(wěn)定表達(dá)人源化抗體的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞可以通過將本部分2(3)和2(6) 中描述的人源化抗體表達(dá)載體導(dǎo)入到適合的宿主細(xì)胞中來獲得。將表 達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法的例子包括電穿孔[C^ofec/mo/ogv， 2,133-140 (1990)]等。對(duì)于其中導(dǎo)入人源化抗體表達(dá)載體的宿主細(xì)胞來 說，可以使用任何細(xì)胞，只要它是能夠表達(dá)人源化抗體的宿主細(xì)胞即 可。例子包括小鼠SP2/0-Ag14細(xì)胞(ATCC CRL1581 )、小鼠 P3X63-Ag8.653細(xì)胞(ATCC CRL1580)、其中二氫葉酸還原酶基因(在 后文中稱為'W/ /F')缺陷的CHO細(xì)胞[iVocee&wgj o/ Ae A^"o"a/ ^cac/emy o/ 5We"cej o/ Ae t/""ed S加e51 o/ Jmer/ca, 22, 4216-4220 (1980)]、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細(xì)胞(ATCC CRL1662，在后 文中稱為"YB2/0細(xì)胞")，等等。
在導(dǎo)入了表達(dá)載體之后，按照在日本未經(jīng)審查的公布專利申請(qǐng)No. 257891/90中公開的方法，通過在含有藥劑例如硫酸G418 (在后文中 稱為"G418")等的培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來篩選穩(wěn)定地 表達(dá)人源化抗體的轉(zhuǎn)化體。培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的例子包括 RPMI1640培養(yǎng)基(Nissui Pharmaceutical制造)、GIT培養(yǎng)基(Nihon Pharmaceutical制造)、EX-CELL301培養(yǎng)基(JRH制造)、IMDM培 養(yǎng)基(GIBCOBRL)制造、雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(GIBCOBRL制造)、 通過在這些培養(yǎng)基中加入各種不同的添加物例如FBS而獲得的培養(yǎng) 基，等等。通過將選出的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，人源化抗 體可以表達(dá)并積累在培養(yǎng)上清液中。培養(yǎng)上清液中人源化抗體的表達(dá) 量和抗原結(jié)合活性可以通過ELISA測(cè)定。此外，在轉(zhuǎn)化體細(xì)胞中，可 以按照日本未經(jīng)審查的公布專利申請(qǐng)No. 257891/90中公開的方法，通 過使用DHFR擴(kuò)增系統(tǒng)等來增加人源化抗體的表達(dá)量。
可以通過使用蛋白A柱，從轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中純化人源 化抗體[《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，爿"^o力'm:爿丄a6oraMo; Mawwa/, Cold Sp;ing Harbor Laboratory,第8章(1988);《單克隆抗體原理和實(shí)踐》， A/o"oc/owa/ y4w"6od/es: /V/wc^7/es /Vac"ce, Academic Press Limited (1996)]。除此之外，也可以使用任何用于蛋白純化的其它常規(guī)方法。 例如，人源化抗體可以通過凝膠過濾、離子交換層析、超濾等的組合 來純化。人源化抗體的H鏈或L鏈或完整抗體分子的分子量可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(在后文中稱為"PAGE") [A^mM, 222, 680-685 (1970)]、 Western印跡[《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，^w"6od/w j丄a6ora^j M 麗/, Cold Spring Harbor Laboratory,第12章(1988);《單克隆抗 體原理禾卩實(shí)踐》，Mowoc/owa/ /4w"6o力'es: /Wwc^ /es cmd /Vac"ce, Academic Press Limited (1996)]等來測(cè)定。
(9)人源化抗體與抗原的結(jié)合活性的評(píng)估
人源化抗體與抗原的結(jié)合活性可以按照上面的描述通過ELISA來 評(píng)估。
3.抗體片段的制備
抗體片段可以在上面的第1部分和第2部分中描述的抗體的基礎(chǔ) 上、按照遺傳工程方法或蛋白質(zhì)化學(xué)方法來制備。
遺傳工程方法包括這樣的方法，其中構(gòu)建編碼目的抗體片段的基 因，并使用適當(dāng)?shù)乃拗骼鐒?dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、大腸桿 菌等進(jìn)行表達(dá)并純化。
蛋白質(zhì)化學(xué)方法包括這樣的方法，其中使用蛋白酶例如胃蛋白酶 或木瓜蛋白酶進(jìn)行部分特異性裂解、純化等。
下面具體描述抗體片段的生產(chǎn)方法，包括Fab、 F(ab')2、 Fab'、 scFv、 雙抗體和dsFv。
(l)Fab的制備
Fab可以使用蛋白質(zhì)化學(xué)方法通過用蛋白酶木瓜蛋白酶處理IgG 來制備。在用木瓜蛋白酶處理后，如果原始抗體是對(duì)蛋白A具有結(jié)合 性質(zhì)的IgG亞類，則可以通過過蛋白A柱將IgG分子與Fc片段分離開， 收集到均勻一致的Fab [《單克隆抗體原理和實(shí)踐》，Mo"oc/o朋/ J""力o^^:/Wwc^/es am/尸rac"ce，第三版(1995)]。在對(duì)蛋白A沒有結(jié)合活性的IgG亞類的抗體的情況下，可以通過離子交換層析在低鹽濃
度下洗脫的級(jí)份中收集Fab[《單克隆抗體原理和實(shí)踐》， J""6oWer尸nVz";p/ej am/尸rac"ce,第三版(1995)]。此夕卜，F(xiàn)ab通常也 可以通過遺傳工程方法使用大腸桿菌來制備，并可以使用昆蟲細(xì)胞、 動(dòng)物細(xì)胞等來制備。例如，將本部分的2(2)、 2(4)和(5)中提到的抗體的 V區(qū)的編碼DNA克隆到表達(dá)Fab的載體中，從而制備Fab表達(dá)載體。 任何表達(dá)Fab的載體都可以使用，只要Fab的DNA可以被插入和表達(dá) 即可。例子包括pIT 106 [Sc/e"ce, ，， 1041-1043 (1988)]等。Fab表達(dá) 載體被導(dǎo)入到適合的大腸桿菌中，從而在包合體或周質(zhì)空間中生產(chǎn)和 積累Fab。從包合體中，可以通過通常用于蛋白的重新折疊方法獲得具 有活性的Fab，而當(dāng)表達(dá)在周質(zhì)空間中時(shí)，具有活性的Fab泄漏到培養(yǎng) 上清液中。在重新折疊后或從培養(yǎng)上清液中，可以使用結(jié)合抗原的柱 子來純化均勻的Fab[《抗體工程實(shí)用指南》，」w油o辦五"g/"em'"g, ^ PraWcfl/ GWcfe, W. H. Freeman and Company (1992)]。
(2) F(ab')2的制備
F(ab')2可以使用蛋白質(zhì)化學(xué)方法通過用蛋白酶胃蛋白酶處理IgG 來制備。在用胃蛋白酶處理后，按照與Fab相同的方式，通過純化操 作回收到均勻的F(ab')2[《單克隆抗體原理和實(shí)踐》，Afo"oc/o"a/ 爿w^7)0(iz-es.. /V/wc^ /es 尸rac"ce，第三版,Academic Press (1995)]。它 也可以通過下面3(3)中提到的Fab'用馬來酰亞胺例如o-PDM或雙馬來 酰亞胺處理以形成硫醚鍵的方法、或用DTNB [5，5'-二巰基雙(2-硝基苯 甲酸)]處理以形成S-S鍵[《抗體工程實(shí)用方法》， j iVac"ca/々;^oac/i, IRL Press (1996)]的方法來制備。
(3) Fab'的制備
Fab'可以通過將上面3(2)中描述的F(ab')2用還原劑例如二硫蘇糖 醇進(jìn)行處理來制備。此外，F(xiàn)ab'也可以通過遺傳工程的大腸桿菌來制備。 此外，它也可以使用昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等來制備。例如，將本部分 的2(2)、 2(4)和(5)中提到的抗體V區(qū)的編碼DNA克隆到表達(dá)Fab'的載體中，從而制備Fab'表達(dá)載體。對(duì)于表達(dá)Fab'的載體來說，可以使用任 何載體，只要Fab'的DNA可以被插入和表達(dá)即可。例子包括pAK19 [Ao/recA"o/ogy, J^， 163-167 (1992)]等。Fab'表達(dá)載體被導(dǎo)入到適合的 大腸桿菌中，在包合體或周質(zhì)空間中生產(chǎn)和積累Fab'。從包合體中，可 以通過通常用于蛋白的重新折疊方法獲得具有活性的Fab'，當(dāng)Fab'表達(dá) 在周質(zhì)空間中時(shí)，可以通過用例如溶菌酶部分消化、滲透壓沖擊和超 聲進(jìn)行處理來破碎細(xì)胞，從而進(jìn)行細(xì)胞外回收。在重新折疊后或從破 碎的細(xì)胞的溶液中，可以使用蛋白G柱子等來純化均勻的Fab'[《抗體 工程實(shí)用方 去》，i4w^6oi/y五wg/ween.wg' j /Vacf/ca/J/ /7roac/z, IRL Press (1996)]。
(4) scFv的制備
scFv可以使用噬菌體、大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等通過遺 傳工程方法來制備。例如，將2(2)、 2(4)和2(5)中提到的抗體V區(qū)的編 碼DNA克隆到表達(dá)scFv的載體中，從而制備scFv表達(dá)載體。表達(dá)scFv 的任何載體都可以使用，只要scFv的DNA可以被插入和表達(dá)即可。 例子包括pCANTAB5E (Pharmacia制造)、pHFA [7fwmaw ^""力o&^ & ^;6nWomw， 48-56 (1994)]等。當(dāng)scFv表達(dá)載體被導(dǎo)入到適合的大腸 桿菌中并用輔助噬菌體進(jìn)行感染時(shí)，可以獲得在噬菌體表面上以與噬 菌體的表面蛋白融合的形式表達(dá)scFv的噬菌體。此外，scFv也可以 在其中導(dǎo)入了 scFv表達(dá)載體的大腸桿菌的周質(zhì)空間或包合體中生產(chǎn)并
積累。從包合體中，可以通過通常用于蛋白的重新折疊方法獲得具有 活性的scFv，當(dāng)scFv在周質(zhì)空間中表達(dá)時(shí)，可以通過用例如溶菌酶部 分消化、滲透壓沖擊和超聲等進(jìn)行處理來破碎細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞外回收。 在重新折疊后或從破碎的細(xì)胞的溶液中，可以使用陽(yáng)離子交換層析等 來純化均勻的scFv [《抗體工程實(shí)用方法》，爿油7)o辦五"g/"een'"g,爿 尸rac"cfl"; /woacA， IRL Press (1996)]。
(5) 雙抗體的制備
雙抗體通?？梢允褂么竽c桿菌或昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等通過遺傳工程方法來制備。例如，制備其中連接了本部分的2(2)、 2(4)和2(5)中 描述的抗體的VH和VL、以便由其接頭編碼的氨基酸殘基是8個(gè)以下 殘基的DNA,并將其克隆到表達(dá)雙抗體的載體中，從而制備雙抗體表 達(dá)載體。表達(dá)雙抗體的任何載體都可以使用，只要雙抗體的DNA可以 被插入和表達(dá)即可。例子包括pCANTAB5E (Pharmacia制造)、pHFA [T/wma" ^w幼o(hù)^m T7;^^omas, i, 48 (1994)]等。雙抗體可以在其中導(dǎo)入
了雙抗體表達(dá)載體的大腸桿菌的周質(zhì)空間或包合體中生產(chǎn)并積累。從 包合體中，可以通過通常用于蛋白的重新折疊方法獲得具有活性的雙
抗體，當(dāng)雙抗體在周質(zhì)空間中表達(dá)時(shí)，可以通過用例如溶菌酶部分消 化、滲透壓沖擊和超聲等進(jìn)行處理來破碎細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞外回收。在 重新折疊后或從破碎的細(xì)胞的溶液中，可以使用陽(yáng)離子交換層析等來 純化均勻的雙抗體[《抗體工程實(shí)用方法》，^""6o辦五"g/"eer/"g,」 /Vac"ca/々; roac/i, IRL Press (1996)]。
(6) dsFv的制備
dsFv通?？梢允褂么竽c桿菌或昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等通過遺傳工 程方法來制備。首先，將突變導(dǎo)入到本部分的2(2)、 2(4)和2(5)中提到 的抗體的VH和VL的編碼DNA的適當(dāng)位置中，以制備其中被編碼的 氨基酸殘基被半胱氨酸代替的DNA。制備的每個(gè)DNA被克隆到表達(dá) dsFv的載體中，從而制備VH和VL的表達(dá)載體。任何用作表達(dá)dsFv 的載體都可以使用，只要dsFv的DNA可以被插入和表達(dá)即可。例子 包括pULI 9 [尸ro化!'"五"g/"eeW"g， 2, 697-704 (1994)]等。VH和VL的表 達(dá)載體被導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌中，dsFv在包合體或周質(zhì)空間中形成 并積累。從包合體或周質(zhì)空間獲得VH和VL，混合并進(jìn)行通常用于蛋 白的重新折疊方法，從而獲得具有活性的dsFv。在重新折疊后，可以 通過離子交換層析、凝膠過濾等來進(jìn)一步純化[iVWe/" ￡"g/"een'"g, 2, 697-704 (1994)]。
4.本發(fā)明中的藥物和治療劑
含有本發(fā)明的單克隆抗體作為活性成分的藥劑可用于治療與HB-EGF有關(guān)的各種疾病。
與HB-EGF有關(guān)的疾病包括癌癥、心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化等。癌 癥包括實(shí)體癌例如乳腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌和卵巢生 殖細(xì)胞腫瘤。此外，它包括伴隨任何實(shí)體癌的連續(xù)、血原性或淋巴細(xì) 胞性轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的轉(zhuǎn)移癌、腹膜彌散等。此外，它包括了其它癌癥，例 如源自造血細(xì)胞的癌癥(血液癌或血癌)包括白血病(急性髓細(xì)胞性 白血病、T細(xì)胞白血病等)、淋巴瘤、骨髓瘤等。
含有本發(fā)明的抗體或抗體片段作為活性成分的藥劑，優(yōu)選被供應(yīng) 成通過在制藥技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的適合方法、將其與一種或多種可 藥用載體混合而生產(chǎn)的藥物制劑。
優(yōu)選選擇在治療中最有效的給藥途徑。例子包括口服給藥和腸胃 外給藥，例如頰、氣管、直腸、皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。在抗體或 肽制劑的情況下，靜脈內(nèi)給藥是優(yōu)選的。劑型包括噴劑、膠囊、片劑、 顆粒、糖漿、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、膠帶等。
適合于口服給藥的藥物制劑包括乳劑、糖漿、膠囊、片劑、粉末、 顆粒等。液體制劑例如乳劑和糖槳可以使用水，糖如蔗糖、山梨糖醇 和果糖，二醇例如聚乙二醇和丙二醇，油例如芝麻油、橄欖油和大豆 油，防腐劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯，香料例如草莓香料和胡椒薄荷等作 為添加劑來生產(chǎn)。膠囊、片劑、粉末、顆粒等可以使用賦形劑例如乳 糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇，崩解劑例如淀粉和藻酸鈉，潤(rùn)滑劑例 如硬脂酸鎂和滑石，粘合劑例如聚乙烯醇、羥丙基纖維素和明膠，表 面活性劑例如脂肪酸酯，塑化劑例如甘油等作為添加劑來生產(chǎn)。
適合腸胃外給藥的藥物制劑包括注射劑、栓劑、噴劑等。注射劑 可以使用載體例如鹽溶液、葡萄糖溶液或其二者的混合物來制備。栓 劑可以使用載體例如可可脂、氫化脂肪或羧酸來制備。噴劑可以使用抗體或抗體片段本身或?qū)⑵渑c不刺激患者的頰或氣道粘膜并能通過將
化合物分散成細(xì)小顆粒促進(jìn)其吸收的載體一起使用來制備。載體包括 乳糖、甘油等。根據(jù)抗體和載體的性質(zhì)，生產(chǎn)藥物制劑例如氣溶膠或 干粉是可能的。此外，作為口服制劑的添加劑示例的組分也可以添加 到腸胃外制劑中。
盡管給藥的劑量或頻率根據(jù)目標(biāo)療效、給藥方法、治療時(shí)間、年
齡、體重等而變化，但通常為每個(gè)成年人每天10 pg/kg到8 mg/kg。
下面將在實(shí)施例的基礎(chǔ)上對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的解釋；但是，實(shí)施 例是對(duì)本發(fā)明的說明，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1
抗HB-EGF單克隆抗體的制備
(1) 免疫原的制備
將R & D System制造的重組分泌型人類HB-EGF的凍干制劑(目 錄號(hào)259-HE/CF)溶解在Dulbecco's磷酸鹽緩沖液中(磷酸鹽緩沖的鹽 水PBS)，并用作免疫原。
(2) 動(dòng)物的免疫和抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備
對(duì)HB-EGF缺陷小鼠[從大阪大學(xué)微生物疾病研究所細(xì)胞生物部 (Department of Cell Biology, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University)獲得，Vol. 100, No. 100， 3221-3226 (2003)]， 施用實(shí)施例1(1)中制備的25 ng重組分泌型人類HB-EGF、以及2 mg 氫氧化鋁佐劑(《抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，^油'6o&"" LaZw^oo; Afo"wa/， ColdSpringHarborLaboratory,p. 99, 1988)和lx109個(gè)細(xì)胞的百日咳疫 苗(千葉血清研究所(Chiba Serum Institute))。給藥2周后，每周施 用一次單獨(dú)的25嗎HB-EGF，總共4次。從眼底的靜脈叢部分收集血 液，通過下面顯示的酶免疫分析檢測(cè)其血清抗體滴度，在最后一次免 疫后3天，從顯示出足夠抗體滴度的小鼠取出脾臟。將脾臟在MEM(最小必需培養(yǎng)基)培養(yǎng)基(Nissui Pharmaceutical制造)中切成片，使用 一副鑷子將細(xì)胞分開并離心(1,200 rpm， 5分鐘)。將這樣獲得的沉淀 級(jí)份用Tris-氯化銨緩沖液(pH7.6)處理1到2分鐘以除去紅細(xì)胞。這 樣獲得的沉淀級(jí)份(細(xì)胞級(jí)份)用MEM清洗3次，并用于細(xì)胞融合。
(3) 酶免疫分析(結(jié)合ELISA)
將實(shí)施例l(l)中的重組人類HB-EGF以0.5嗎/ml和50^1/孔分配 在用于ELISA的96孔板中(Greiner制造)，在4°C放置過夜進(jìn)行吸 附，并用于分析中。在洗板后，向其中加入50)Lil/孔的1%牛血清白蛋 白(BSA)-PBS，在室溫放置1小時(shí)以阻斷剩余的活性基團(tuán)。在將板放置 之后，棄去1%BSA-PBS，將作為第一抗體的待免疫小鼠的抗血清或雜 交瘤培養(yǎng)上清液以50pl/孔分配到板中，放置2小時(shí)。在用0.05%聚氧 乙烯(20)失水山梨糖醇單月桂酸酯[(相當(dāng)于ICI的商標(biāo)Tween20，由 Wako Pure Chemical Industries制造)]/PBS (在后文中稱為 "Tween-PBS")洗板后，加入50|_11/孔的過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠 IgG y鏈(Kirkegarrd & Perry Laboratories制造)作為第二抗體，在室 溫放置1小時(shí)。在用Tween-PBS洗板后，加入ABTS [2,2-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)銨]底物溶液[1 mmol/1 ABTS/0.1 mol/1檸檬酸緩 沖液(pH 4.2)， 0.1% 11202]進(jìn)行顯色，使用讀板器(Emax; molecular Devices公司制造)測(cè)定OD 415 nm處的吸光度。
(4) 小鼠骨髓瘤細(xì)胞的制備
將8-氮雜鳥嘌呤抗性的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8U.1 (P3-U1， 從ATCC購(gòu)買)培養(yǎng)在添加了 10%胎牛血清的RPMI 1640中(Invitrogen 制造)，確保在細(xì)胞融合的當(dāng)天有2 x 107個(gè)以上的細(xì)胞，作為親本細(xì) 胞系用于細(xì)胞融合。
(5) 雜交瘤的制備
將實(shí)施例1(2)中獲得的小鼠脾細(xì)胞和實(shí)施例1(4)中獲得的骨髓瘤 細(xì)胞以10:1的比率混合，然后離心(1,200 rpm， 5分鐘)。將這樣獲
62得的沉淀級(jí)份的細(xì)胞群完全打散，然后在37。C下一邊攪拌一邊以每108 個(gè)小鼠脾細(xì)胞0.5 ml的量加入1 g聚乙二醇-1000 (PEG-IOOO)、 1 ml MEM培養(yǎng)基和0.35 ml二甲基亞楓的混合溶液，以1到2分鐘的時(shí)間 間隔在懸浮液中數(shù)次加入1 ml MEM培養(yǎng)基，然后通過加入MEM培養(yǎng) 基將總體積調(diào)整到50ml。將懸浮液離心(900rpm， 5分鐘)，將如此 獲得的沉淀級(jí)份的細(xì)胞輕輕打散，然后通過用吸管輕柔地吹吸，將細(xì) 胞懸浮在100mlHAT培養(yǎng)基中[通過將HAT培養(yǎng)基添加物(Invitrogen 制造)加入到添加了 10。/。胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中制備的培養(yǎng) 基]。將懸浮液以200 pl/孔分配到96孔培養(yǎng)板中，然后在5%(^02培養(yǎng) 箱中37。C培養(yǎng)IO到14天。培養(yǎng)后，通過用實(shí)施例1(3)中描述的酶免 疫吸附檢查培養(yǎng)濾液，篩選出對(duì)重組人類HB-EGF有反應(yīng)的孔，從中 獲得的細(xì)胞通過有限稀釋方法重復(fù)克隆兩次，從而建立產(chǎn)生抗HB-EGF 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系KM3566、 KM3567和KM3579。
(6)單克隆抗體的純化
將每個(gè)在實(shí)施例1(5)中獲得的雜交瘤細(xì)胞系以5到20"06個(gè)細(xì)胞/ 動(dòng)物的劑量腹膜內(nèi)注射到降植垸(pristine)處理的8周齡雌性裸鼠中。 在此后的10到21天，從每只由于雜交瘤的腹水腫瘤而引起腹水液積 累的小鼠中收集腹水液(l到8ml/動(dòng)物)。將腹水液離心(3,000 rpm， 5分鐘)以除去固形物。按照辛酸沉淀方法(《抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》， y4油7)o&es-y4丄aZ ora^y Ma肌a/, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 迸行純化以獲得純化的IgG單克隆抗體。每個(gè)單克隆抗體的亞類通過 ELISA使用亞類分型試劑盒來確定。單克隆抗體KM3566的亞類是IgG 1，單克隆抗體KM3567的亞類是IgGl，單克隆抗體KM3579的亞類 是IgG2b。
實(shí)施例2
抗HB-EGF單克隆抗體對(duì)HB-EGF的反應(yīng)性 (1)通過結(jié)合ELISA分析與HB-EGF的反應(yīng)性 本實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例1(3)中表明的方法進(jìn)行。抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、 KM3567、 KM3579、可商購(gòu)的抗HB-EGF單克隆抗體MAB259 (R&D制造)與陰性對(duì)照抗體KM511 (抗G-CSF衍生物的單克隆抗體)的每種純化抗體，從IO嗎/ml開始通過5倍連續(xù)稀釋進(jìn)行逐級(jí)稀釋，并用作第一抗體。結(jié)果顯示在圖1A中。
抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、 KM3567、 KM3579和MAB259的每一種都與重組人類HB-EGF反應(yīng)，但是不與BSA反應(yīng)。
(2) 通過Western印跡分析與HB-EGF的反應(yīng)性
每道20ng重組人類HB-EGF (R & D制造)通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分級(jí)，電泳后將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在用10%BSA-PBS阻斷膜后，使用10% BSA-PBS將每種抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、 KM3567、 KM3579、 MAB259和陰性對(duì)照抗體KM511的純化抗體稀釋到1 |Lig/ml，將它們?cè)谑覝胤磻?yīng)2小時(shí)。在用Tween-PBS徹底清洗膜之后，將過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白抗體(ZymedLaboratory制造)稀釋，并在室溫反應(yīng)1小時(shí)。將膜用Tween-PBS徹底清洗，使用ECI/m Western印跡檢測(cè)試劑(Amersham Pharmacia制造)來檢測(cè)條帶。
從每種抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、 KM3567、 KM3579和MAB259中檢測(cè)到了對(duì)應(yīng)于重組分泌型人類HB-EGF的分子量的大約15到30千道爾頓(在后文中稱為"kDa")的條帶。
(3) 抗HB-EGF單克隆抗體的HB-EGF-EGFR結(jié)合抑制活性的評(píng)估使用32D/EGFR細(xì)胞和生物素標(biāo)記的HB-EGF檢測(cè)抗HB-EGF單
克隆抗體KM3566、 KM3567、 KM3579和MAB259的HB-EGF-EGFR
結(jié)合抑制活性。
重組分泌型人類HB-EGF以通常的方式使用EZ-Link Sulfo-NHS-生物素(Pierce制造)進(jìn)行生物素標(biāo)記。每種KM3566、 KM3567、 KM3579和MAB259從10 pg/ml開始通過5倍連續(xù)稀釋進(jìn)行逐級(jí)稀釋，以50 pl/孔分配到96孔板中。然后，以lx104細(xì)胞/50 pl/孔分配32D/EGFR細(xì)胞。此外，生物素標(biāo)記的HB-EGF和Alexa 647標(biāo)記的鏈親和素被稀釋到最適濃度，分別以10 |^1/孔和50fil/孔分配，在混合后，令混合物在暗處室溫下反應(yīng)3小時(shí)。使用8200細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems制造)，測(cè)定由633 nm He/Ne激光輻照激發(fā)的650 nm到685 nm的波長(zhǎng)。
結(jié)果顯示在圖1B中，所有的KM3566、 KM3567、 KM3579和MAB259抗體都濃度依賴性地抑制生物素化的HB-EGF與EGFR的結(jié)合。因此，發(fā)現(xiàn)所有的抗HB-EGF單克隆抗體都抑制HB-EGF與EGFR
的結(jié)合。
實(shí)施例3
抗HB-EGF單克隆抗體對(duì)HB-EGF的中和活性的檢測(cè)通過使用HB-EGF依賴性細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制分析，檢測(cè)抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、 KM3567、 KM3579禾卩MAB259的中和活性。通過將EGFR基因轉(zhuǎn)入小鼠骨髓衍生細(xì)胞系32D clone 3 (ATCCCRL-11345)中而構(gòu)建的細(xì)胞系(在后文中稱為"32D/EGFR")被用作HB-EGF依賴性細(xì)胞。每種抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、KM3567、 KM3579和MAB259和陰性對(duì)照抗體KM511的純化抗體從20 ng/ml開始以3到4倍稀釋進(jìn)行連續(xù)稀釋，并以50 pl/孔分配到96孔板中。接下來，以10 pl/孔分配0.1 jiig/ml的重組人類HB-EGF (R&D制造)，在混合后，將混合物在冰上反應(yīng)2小時(shí)。然后，將32D/EGFR細(xì)胞以lx104細(xì)胞/40nl/孔的細(xì)胞數(shù)量接種，然后培養(yǎng)36小時(shí)。以10n1/孔加入活細(xì)胞測(cè)量試劑(Nacalai Tesque制造)，2小時(shí)后，使用讀板器(Emax; Molecular Devices制造)測(cè)量OD 450 nm處的吸光度。
通過把只加入HB-EGF的孔的吸光度作為0%抑制率，沒有加入
65HB-EGF和抗體的孔的吸光度作為100%抑制率，計(jì)算每個(gè)孔的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，結(jié)果顯示在圖2A中。結(jié)果，KM3566顯示出對(duì)細(xì)胞系32D/EGFR的HB-EGF依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性，與MAB259的水平相似。因此，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)抗體具有相似的HB-EGF中和活性水平。另一方面，因?yàn)镵M3579不抑制細(xì)胞系32D/EGFR的生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)它不具有HB-EGF中和活性。
此外，以同樣的方式進(jìn)行的KM3567的中和活性的檢測(cè)結(jié)果顯示在圖2B中。結(jié)果，盡管它的活性與KM3566相比較弱，但KM3567仍具有抑制HB-EGF依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。
實(shí)施例4
抗HB-EGF單克隆抗體對(duì)膜型HB-EGF的反應(yīng)性的檢測(cè)將每種抗HB-EGF單克隆抗體KM3566、 KM3567、 KM3579、MAB259和陰性對(duì)照抗體KM511用0.1% BSA-PBS稀釋到相應(yīng)的濃度，加入到1至!j 5 x 105個(gè)細(xì)胞的人類胃癌細(xì)胞系MKN-28 (HSRRBJCRB 0253)、人類卵巢癌細(xì)胞系ES-2 (ATCC CRL-1978)或人類乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 (ATCCHTB-26)中，在混合后，將總體積調(diào)整到5(Hd。使這些細(xì)胞懸浮液每一種都在冰上反應(yīng)40分鐘，然后用0.1%BSA-PBS洗3次。在細(xì)胞中加入通過用0.1% BSA-PBS稀釋制備的50pl FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG + IgM (H + L)多克隆抗體(Kirkegaard & Perry Laboratories制造)，使混合物在冰上反應(yīng)40分鐘。細(xì)胞用0.1% BSA-PBS清洗，然后懸浮在0.1% BSA-PBS中，并使用流式細(xì)胞儀(Coulter制造)測(cè)量熒光強(qiáng)度。
圖3顯示了平均熒光強(qiáng)度(MFI值)，其中每種上面提到的單克隆抗體從20]Lig/ml開始被稀釋2倍，并與MKN-28和ES-2反應(yīng)。圖4顯示了每種抗體反應(yīng)性的方圖，其中使得20)ig/ml的每種上述的單克隆抗體與人類乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231反應(yīng)。結(jié)果，對(duì)于MKN-28來說，發(fā)現(xiàn)了KM3566和KM3579的結(jié)合活性。此外，在ES-2的情況下，發(fā)現(xiàn)結(jié)合活性的次序是KM3566 > KM3579。此外，在MDA-MB-231的情況下，發(fā)現(xiàn)結(jié)合活性的次序是KM3566 > KM3567 KM3579。此外，在所有細(xì)胞中，MAB259的MFI值與陰性對(duì)照抗體KM511和未加入抗體的陰性對(duì)照相似，并且MAB259基本上不與細(xì)胞結(jié)合。從上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)單克隆抗體KM3566、 KM3567和KM3579與癌細(xì)胞系的膜型和細(xì)胞膜結(jié)合的HB-EGF結(jié)合。
實(shí)施例5
抗HB-EGF單克隆抗體可變區(qū)的編碼cDNA的分離和分析
(1) 從產(chǎn)生抗HB-EGF單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞制備mRNA從實(shí)施例1中描述的雜交瘤KM3566的5xl(^個(gè)雜交瘤細(xì)胞中，
使用RNAeasy Maxi試劑盒(QIAGEN制造)和OligotexTM-dt30<super>mRNA純化試劑盒(Takara制造)，并按照其隨附的說明書，制備大約4.8嗎mRNA。
(2) 抗HB-EGF單克隆抗體KM3566的H鏈和L鏈可變區(qū)的DNA
克隆
使用BD SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(BD Biosciences制造)，按照其隨附的說明書，從實(shí)施例5(1)中獲得的抗HB-EGF單克隆抗體KM3566的l嗎mRNA，獲得了在5'末端具有試劑盒隨附的BDSMARTIlTMA寡核苷酸序列的cDNA。使用該cDNA作為模板，并使用試劑盒隨附的通用引物Amix以及具有SEQ ID NO:6顯示的核苷酸序列的小鼠Ig(力特異性引物，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增VH的cDNA片段。此夕卜，通過使用具有SEQ ID NO:7顯示的核苷酸序列的小鼠Ig(K)特異性引物代替Ig(y)特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增了 VL的cDNA片段。在94°C加熱5分鐘后，通過由94。C30秒和72°C3分鐘組成的反應(yīng)的5個(gè)循環(huán)，由94°C 30秒、70。C 30秒和72°C 3分鐘組成的反應(yīng)的5個(gè)循環(huán)，由94°C30秒、68°C 30秒和72°C 3分鐘組成的反應(yīng)的30個(gè)循環(huán)，然后在72°C反應(yīng)10秒來進(jìn)行PCR。PCR使用PTC-200 DNA Engine(Bio-Rad制造)來進(jìn)行。為了克隆這樣獲得的PCR產(chǎn)物并確定它們的核苷酸序列，通過瓊
脂糖凝膠電泳將它們分離，并使用凝膠提取試劑盒(QIAGEN制造) 提取每個(gè)大約為600bp的H鏈和L鏈的PCR產(chǎn)物。使用Ligation High (TOYOBO制造)，將每個(gè)這樣獲得的提取片段連接到Sm"I-消化的 pBluescript II SK(-)載體中，然后通過Cohen等的方法[ZVoc. AW/, Sc/. tAS^4， @, 2110 (1972)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5a。使用自動(dòng)質(zhì)粒提取 裝置(KURABO制造)，從獲得的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并使用BigDye 終止物循環(huán)測(cè)序FS簡(jiǎn)便反應(yīng)試劑盒(BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit ， PE Biosystems制造)、按照隨附 的說明書進(jìn)行反應(yīng)，然后通過同一公司的測(cè)序儀ABI PRISM 3700分析 克隆到的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列。結(jié)果，獲得了含有完整長(zhǎng)度的H鏈 cDNA的質(zhì)粒KM3566VH10G2和含有L鏈cDNA的質(zhì)粒 KM3566VL10K2，其中被認(rèn)為是起始密碼子的ATG序列存在于cDNA 的5'末端中。
(3)抗HB-EGF單克隆抗體V區(qū)的氨基酸序列的分析 質(zhì)粒KM3566VH10G2中包含的VH的完整核苷酸序列顯示在SEQ IDNO:8中，從該序列推導(dǎo)的含有信號(hào)序列的VH的完整氨基酸序列顯 示在SEQIDNO:9中，質(zhì)粒KM3566VL10K2中包含的VL的完整核苷 酸序列顯示在SEQ ID NO:10中，從該序列推導(dǎo)的含有信號(hào)序列的VL 的氨基酸序列顯示在SEQ IDNO:ll中。根據(jù)與小鼠抗體的已知序列數(shù) 據(jù)[《免疫重要的蛋白的序列》，S五^t/^VCES o/ /Vo^7w o/ /mmw"o/og/ca/ /" ereW,美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部(1991)]的比較，和與使 用蛋白測(cè)序儀(ShimadzuCorp.制造，PPSQ-10)分析純化的抗HB-EGF 單克隆抗體KM3566的H鏈和L鏈的N-末端氨基酸序列的結(jié)果比較， 發(fā)現(xiàn)分離到的相應(yīng)cDNA是編碼含有分泌信號(hào)序列的抗HB-EGF單克 隆抗體KM3566的全長(zhǎng)cDNA，并且在SEQ ID NO:9顯示的氨基酸序 列中第1到19位的氨基酸序列是H鏈的分泌信號(hào)序列，而在SEQ ID NO:ll顯示的氨基酸序列中第1到20位的氨基酸序列是L鏈的分泌信
68號(hào)序列。
接下來，檢測(cè)了抗HB-EGF單克隆抗體KM3566的VH和VL的 新穎性。使用GCG程序包(9.1版，Genetic Computer Group制造)作 為序列分析系統(tǒng)，通過BLASTP方法IWwc/e/c ^c!Wsi^s., 2i， 3389 (1997)] 檢索了現(xiàn)有的蛋白氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果，對(duì)于VH和VL沒有發(fā)現(xiàn) 完全一致的氨基酸序列，因此證實(shí)了抗HB-EGF單克隆抗體KM3566 的VH和VL具有新的氨基酸序列。
此外，通過與已知抗體的氨基酸序列進(jìn)行比較，鑒定了抗HB-EGF 單克隆抗體KM3566的VH和VL的CDR。抗HB-EGF單克隆抗體 KM3566的VH的CDR1 、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NO: 12、 13和14中，VL的CDR1、 CDR2和CDR3的氨基酸序列分 別顯示在SEQ ID NO:15、 16和17中。
實(shí)施例6
抗HB-EGF嵌合抗體的制備
(1)抗HB-EGF嵌合抗體表達(dá)載體pKANTEX3566的構(gòu)建 使用在WO 97/10354中描述的人源化抗體表達(dá)載體pKANTEX93 和實(shí)施例5(2)中獲得的質(zhì)粒KM3566VH10G2和KM3566VL10K2，通 過下述的方法構(gòu)建了抗HB-EGF嵌合抗體表達(dá)載體pKANTEX3566。
使用100 ng質(zhì)粒KM3566VH10G2作為模板，將總體積100 pl的 溶液，其由10 [il 10xKOD緩沖液、10 |al 2 mmo1/1 dNTP、 2 pl 25 mmo1/1 氯化鎂、1 |il 10 pmol/1的每種具有SEQ ID NO:18和19中描述的核苷 酸序列的引物以及1 )nlKOD聚合酶(TOYOBO制造)，在96°C加熱 3分鐘，然后進(jìn)行由94°C 1分鐘、55°C 1分鐘和72°C 1分鐘組成的25 個(gè)循環(huán)，然后在72。C反應(yīng)8分鐘。通過該反應(yīng)，合成了編碼KM3566 的VH的cDNA，其含有用于插入到pKANTEX93中的限制性酶識(shí)別序 列。通過同樣的方式，將總體積為100pl的溶液，其由100ng作為模板的質(zhì)粒KM3566VL10K2、 10 pl 10xKOD緩沖液、10 pi 2 mmol/1 dNTP、 2 pl 25 mmol/1氯化鎂、1 pl 10 pmol/l的每種具有SEQ ID NO:20 和21顯示的核苷酸序列的引物以及1 plKOD聚合酶(TOYOBO制造) 組成，在96。C加熱3分鐘，然后進(jìn)行由94。C l分鐘、55°C 1分鐘和 72°C l分鐘組成的25個(gè)循環(huán)，然后再在72。C反應(yīng)8分鐘。通過該反 應(yīng)，合成了編碼KM3566的VL的cDNA ，其含有用于插入到 pKANTEX93中的限制性酶識(shí)別序列。通過用乙醇沉淀純化和濃縮每種 PCR產(chǎn)物，并將其克隆到SmaI消化的pBluescript II SK(-)中，獲得了 含有編碼KM3566的VH的核苷酸序列的質(zhì)粒pKM3566VH和含有編 碼KM3566的VL的核苷酸序列的質(zhì)粒pKM3566VL。接下來，在上面 獲得的每種載體pKANTEX93和pKM3566VL中加入限制性酶BsiWI
(New England Biolabs制造)，在55。C反應(yīng)1小時(shí)，然后向其中加入 限制性酶EcoRI (Takara制造)，之后在37°C反應(yīng)1小時(shí)。將該反應(yīng) 溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后使用QIAquick凝膠提取試劑盒
(QIAGEN制造)回收每種大約12.8 kb的pKANTEX93 EcoRI-BsiWI 片段和大約0.43 kb的VL EcoRI-BsiWI片段。使用Ligation High
(TOYOBO制造)，按照隨附的說明書將這樣獲得的兩個(gè)片段連接， 使用這樣獲得的重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (TOYOBO制 造)。通過從轉(zhuǎn)化體的克隆制備每種質(zhì)粒DNA并通過限制性酶處理進(jìn) 行證實(shí)，獲得了含有大約0.43 kb的目的EcoRI-BsiWI片段的質(zhì)粒 pKANTEX3566VL。接下來，在上面獲得的每個(gè)pKANTEX3566VL和 pKM3566VH中加入限制性酶Apal (Takara制造)，在37°C反應(yīng)1小 時(shí)，然后向其中再加入限制性酶NotI (New England Biolabs制造)， 之后在37°C反應(yīng)1小時(shí)。該反應(yīng)溶液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級(jí)以 回收Apal-Notl片段，分別回收到了大約13.2 kb的pKANTEX3566VL 和大約0.47kb的VH。使用Ligation High (TOYOBO制造)，按照隨 附的說明書將這樣獲得的兩個(gè)片段連接，使用這樣獲得的重組質(zhì)粒 DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5(x (TOYOBO制造)。通過從轉(zhuǎn)化體的克 隆制備每種質(zhì)粒DNA并通過限制性酶處理進(jìn)行證實(shí)，獲得了含有大約 0.47 kb的目的Apal-Notl片段的質(zhì)粒pKANTEX3566。對(duì)于質(zhì)粒來說，使用BigDye終止物循環(huán)測(cè)序FS簡(jiǎn)便反應(yīng)試劑盒(PEBiosystems制造)， 按照隨附的說明書進(jìn)行反應(yīng)后，通過同一公司的測(cè)序儀ABI PRISM 3700分析核苷酸序列。結(jié)果，獲得了克隆有編碼KM3566的VH的目 的cDNA和編碼其VL的cDNA的抗HB-EGF嵌合抗體表達(dá)載體 pKANTEX3566。載體結(jié)構(gòu)的示意圖顯示在圖5中。
(2) 抗HB-EGF嵌合抗體在動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá) 使用在上面提到的(l)中獲得的抗HB-EGF嵌合抗體表達(dá)載體
pKANTEX3566，通過常用的方法[《抗體工程實(shí)用指南》，^"油o辦 五w^7'wee〃'"g, ^ 7Vac"ca/ GwWe， W.H. Freeman and Company (1992)]4每抗 HB-EGF嵌合抗體在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，獲得產(chǎn)生抗HB-EGF嵌合抗體的 轉(zhuǎn)化體KM3966。
(3) 純化的嵌合抗體的制備
在通過普通的培養(yǎng)方法將上面提到的(2)中獲得的轉(zhuǎn)化體KM3966 進(jìn)行培養(yǎng)后，將細(xì)胞懸浮液回收并在3,000 rpm和4°C下離心10分鐘， 然后將如此回收的上清液通過孔徑為0.22 pm的Millex GV濾器 (Millipore制造)進(jìn)行過濾除菌。使用蛋白A高容量樹脂(Millipore 制造)柱，按照隨附的說明書，從如此獲得的培養(yǎng)上清液中純化抗 HB-EGF嵌合抗體KM3966。使用梯度凝膠(ATTO制造，E-T520L)， 按照隨附的說明書，通過SDS-PAGE證實(shí)了純度和分子量。
結(jié)果顯示在圖6中。對(duì)于純化的抗HB-EGF嵌合抗體KM3966的 分子量來說，在非還原條件下發(fā)現(xiàn)了大約150到200 kDa的單一條帶， 在還原條件下發(fā)現(xiàn)了大約50 kDa和大約25kDa的兩條條帶。這些分子 量與報(bào)道一致，在報(bào)道中指出，IgG類抗體在非還原條件下具有大約 150kDa的分子量，但是由于切開了分子內(nèi)S-S鍵，被降解成具有大約 50 kDa的分子量的H鏈和具有大約25 kDa的分子量的L鏈[《抗體-實(shí) 驗(yàn)室手冊(cè)》，爿油'6o^ies-J Z^60raf07 Ma"wa/， Cold Spring Harbor Laboratory,第14部分(1988)，《單克隆抗體原理與應(yīng)用》，Mo"ocZowa/爿/^ibcx^es-iViwc^3a^ iVac^ce, Academic Press Limited (1996)]。因此，證實(shí)了抗HB-EGF嵌合抗體KM3966被表達(dá)為具有正 確結(jié)構(gòu)的抗體分子。
實(shí)施例7
抗HB-EGF嵌合抗體的活性評(píng)估
(1) 對(duì)人類實(shí)體癌細(xì)胞系的結(jié)合活性
為了評(píng)估在實(shí)施例6中獲得的抗HB-EGF嵌合抗體KM3966的結(jié) 合活性，以下面的方式通過熒光抗體技術(shù)對(duì)它進(jìn)行了檢測(cè)。
人類卵巢癌細(xì)胞系MCAS(JCRB 0240)、RMG-I(JCRB IF 050315) 和ES-2 (CRL 1978)、人類乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) 、 T47D (HTB-133) 、 SK-BR-3 (ATCCHTB-30)禾卩ZR-75-1
(ATCC CRL-1500)以及人類胃癌細(xì)胞系MKN-28 (HSRRB JCRB 0253)的每個(gè)細(xì)胞系用0.02。/。-EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剝離 并用PBS清洗，然后以2xl05細(xì)胞/50 pl/孔分配到96孔U型底的板中
(FALCON制造)。用1% BSA-PBS制備到20 pig/ml的抗HB-EGF嵌 合抗體KM3966溶液分配50)il/孔，然后使用板混合器攪拌，將板在冰 上放置30分鐘。在用PBS清洗兩次后，將稀釋100倍的第二抗體FITC 結(jié)合的AffmityPure F(ab')2片段兔抗人IgG (H + L) (Jackson Laboratories制造)向其中加入50 nl/孔，然后使用板混合器攪拌，將 板在暗處冰上放置30分鐘。在用PBS清洗兩次后，使用流式細(xì)胞儀 EPICS XL系統(tǒng)II v. 3.0 (BECKMAN COULTER制造)測(cè)量熒光強(qiáng)度。 使用抗FGF-8嵌合抗體KM3034 (US 2004-0253234)作為陰性對(duì)照抗 體。
結(jié)果顯示在圖7中?？笻B-EGF嵌合抗體KM3966與所有人類實(shí) 體癌細(xì)胞系的膜型和細(xì)胞膜結(jié)合的HB-EGF結(jié)合。
(2) 測(cè)量抗HB-EGF嵌合抗體KM3966對(duì)人類HB-EGF的結(jié)合活
72性
為了分析小鼠抗體KM3566和嵌合抗體KM3966對(duì)人類HB-EGF 在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)上的結(jié)合活性，使用Biacore進(jìn)行結(jié)合活性測(cè)量。所有下 面的操作都使用BiacoreT-100 (Biacore制造)來進(jìn)行。通過胺偶聯(lián)方 法，將使用HBS-EP緩沖液(Biacore制造)制備成5嗎/ml的人類HB-EGF (R&D制造)固定在CM5傳感器芯片上(Biacore制造)，水平為 80 RU (共振單位)。然后，使每種從9nmol/l稀釋5倍的抗體以10^1/ 分鐘的速度在芯片上流動(dòng)，通過分析每種濃度下的傳感器圖，計(jì)算每 種抗體對(duì)人類HB-EGF的結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩種抗體的情況下，在抗體濃度范圍內(nèi)，抗體與人 類HB-EGF結(jié)合后幾乎不能發(fā)現(xiàn)解離反應(yīng)，使得解離速率常數(shù)不能計(jì) 算。另一方面，結(jié)合速度常數(shù)可以被計(jì)算，結(jié)果顯示在表1中。根據(jù) 結(jié)果，證實(shí)了這兩種抗體對(duì)人類HB-EGF具有幾乎相同的結(jié)合活性。
表1
抗體_Ka(l/Ms)
KM3566 2.7x105 KM3966 2.4x105
(3)抗HB-EGF單克隆抗體對(duì)細(xì)胞膜結(jié)合的HB-EGF的反應(yīng)性 每個(gè)細(xì)胞系用0,02。/。-EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剝離并用 PBS清洗，然后與RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制造)混合，并以 300g離心5分鐘，丟棄上清液。在細(xì)胞中加入1 ]Lig/ml用0.1%BSA-PBS 稀釋的重組人類HB-EGF (R&D制造)，并允許在37°C反應(yīng)10分 鐘。當(dāng)不加入重組人類HB-EGF時(shí)，僅加入0.1。/。BSA-PBS，并以同樣 的方式允許在37。C反應(yīng)IO分鐘。在用1% BSA-PBS清洗兩次后，將 用1% BSA-PBS制備成10 ng/ml的抗HB-EGF嵌合抗體KM3966溶液 分配50 pl/孔，然后使用板混合器攪拌，將板在冰上放置30分鐘。在 用PBS清洗兩次后，向其中加入50 pl/孔稀釋100倍的第二抗體FITC結(jié)合的AffinityPure F(ab')2片段兔抗人IgG (H + L) (Jackson Laboratories制造)，然后使用板混合器攪拌，將板在暗處冰上放置30 分鐘。在用PBS清洗兩次后，使用流式細(xì)胞儀EPICSXL系統(tǒng)IIv. 3.0 (BECKMAN COULTER制造)測(cè)量熒光強(qiáng)度。使用抗FGF-8嵌合抗 體KM3034 (US 2004-0253234)作為陰性對(duì)照抗體。
結(jié)果，在所有的細(xì)胞系中，用重組HB-EGF處理的細(xì)胞與未處理 的細(xì)胞相比，抗HB-EGF嵌合抗體KM3966的反應(yīng)性增加(圖8)。因 此，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的抗HB-EGF嵌合抗體KM3966與膜型和細(xì)胞膜結(jié) 合的HB-EGF都結(jié)合。
(4)對(duì)人類實(shí)體癌細(xì)胞系的中和活性
為了評(píng)估在實(shí)施例6中獲得的抗HB-EGF嵌合抗體KM3966的 HB-EGF中和活性，測(cè)量了 HB-EGF依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性。對(duì)于 HB-EGF依賴性細(xì)胞來說，使用了 HB-EGF陽(yáng)性的人類卵巢癌細(xì)胞系 RMG-I(JCRB IF 050315)和人類胃癌細(xì)胞系MKN-28(HSRRB〗CRB)。
每種細(xì)胞系用0.02。/。-EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剝離并用 PBS清洗，然后與RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制造)(無(wú)血清) 混合，并以300g離心5分鐘，丟棄上清液。在將細(xì)胞懸浮在同樣的培 養(yǎng)基中之后，將RMG-I和MKN-28分別以2.5 x 103細(xì)胞/50nl/孔和1 x 104細(xì)胞/50|11/孔接種到96孔板中。加入用0.1。/。BSA-PBS稀釋的重組 人類HB-EGF (R&D制造)，在RMG-I的情況下濃度為3 ng/ml 50^1/ 孔，或在MKN-28的情況下濃度為30 ng/ml 50pl/孔的份額，然后將抗 HB-EGF嵌合抗體KM3966從30|Lig/ml開始通過4個(gè)連續(xù)的步驟稀釋 10倍，以50^1/孔的份額加入，然后混合。使用人類IgG (Mitsubishi PharmaCorp.制造)作為陰性對(duì)照抗體。在37°C培養(yǎng)72小時(shí)后，以15|il/ 孔加入活細(xì)胞測(cè)量試劑WST-1 (Nacalai Tesque制造)，在2小時(shí)后， 使用讀板器(Emax; Molecular Devices制造)測(cè)量在OD 450 nm的吸 光度。結(jié)果顯示在圖9中。RMG-I和MKN-28 二者都顯示出由于加入 HB-EGF引起的細(xì)胞生長(zhǎng)，并顯示出HB-EGF依賴性的細(xì)胞生長(zhǎng)?？?HB-EGF嵌合抗體KM3966以抗體濃度依賴性方式抑制HB-EGF依賴 性細(xì)胞生長(zhǎng)，因此顯示出中和活性。
(5)抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC活性) 按照下面顯示的方法測(cè)定了在實(shí)施例6中獲得的抗HB-EGF嵌合 抗體KM3966的ADCC活性。
(5)-l靶細(xì)胞溶液的制備
每種人類卵巢癌細(xì)胞系MCAS、 RMG-I和ES-2，人類乳腺癌細(xì)胞 系MDA-MB-231、 T47D、 SK-BR-3和ZR-75-1以及人類胃癌細(xì)胞系 MKN-28用0.02%-EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剝離，并用含有 1% FCS (JRH制造)且不含酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen制 造)(在后文中稱為ADCC培養(yǎng)基)清洗，然后使用同樣的培養(yǎng)基調(diào) 整到最適濃度，用作耙細(xì)胞溶液。
(5)-2效應(yīng)細(xì)胞溶液的制備
通過下面顯示的方法從健康人的外周血制備外周血單核細(xì)胞 (PBMC)。使用含有少量肝素鈉注射液N "Shimizu" ( Shimizu Pharmaceutical制造)的注射器，從健康人收集50 ml外周血。加入同 樣體積的生理鹽水(制造商的名稱)將所收集到的外周血稀釋，然后 徹底攪拌。15 ml容量的試管(Greiner制造)中分配大約6.5 ml Polymorphprep (NYCOMED制造)，并將同樣體積的稀釋外周血輕輕 置于其上，在室溫下以800 G離心30分鐘，分離單核細(xì)胞層。在用ADCC 培養(yǎng)基清洗兩次后，使用同樣的培養(yǎng)基將其制備成最適的濃度，并用 作效應(yīng)細(xì)胞溶液。
(5)-3 ADCC活性的測(cè)定將抗體稀釋溶液以5(Hil的份額加入96孔U型底的板的孔中，在 其中加入50nl在(4)-l中制備的靶細(xì)胞溶液和50nl在(4)-2中制備的效 應(yīng)細(xì)胞溶液(效應(yīng)細(xì)胞(E)與靶細(xì)胞(T)的比率設(shè)置為25)，將總 體積調(diào)整到150^1，反應(yīng)在37。C進(jìn)行4小時(shí)。通過加入50pl靶細(xì)胞溶 液和lOO)iil培養(yǎng)基，獲得了靶細(xì)胞自發(fā)釋放的值，通過加入5(Hil靶細(xì) 胞溶液、50nl效應(yīng)細(xì)胞溶液和50inl培養(yǎng)基，獲得了耙細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞 自發(fā)釋放的值。通過加入5(Hil靶細(xì)胞溶液和80nl培養(yǎng)基、并在反應(yīng)完 成前45分鐘加入20|il 9% Triton X-100溶液，獲得了靶細(xì)胞總體釋放 的值。在反應(yīng)后，將板離心，通過使用LDH-細(xì)胞毒性測(cè)試 (LDH-CytotoxicTest ， Wako制造)，按照隨附的說明書測(cè)量吸光度 檢測(cè)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)的活性。ADCC活性通過下式計(jì)算。
(公式)
ADCC活性(％)=([樣品的吸光度]-[靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放的 吸光度])/([靶細(xì)胞總釋放的吸光度]-[靶細(xì)胞自發(fā)釋放的吸光度]x 100
結(jié)果顯示在圖10中。抗HB-EGF嵌合抗體KM3966顯示出了對(duì) HB-EGF陽(yáng)性的人類實(shí)體癌細(xì)胞系的抗體依賴性細(xì)胞毒性。
(6)使用小鼠異種移植物評(píng)估抗腫瘤活性
為了評(píng)估在實(shí)施例6中獲得的抗HB-EGF嵌合抗體KM3966的抗 腫瘤活性，使用人類卵巢癌和人類乳腺癌的小鼠異種移植物早期癌癥 模型和晚期癌癥模型進(jìn)行評(píng)估。
(6)-1通過早期癌癥模型評(píng)估
將人類卵巢癌細(xì)胞系MCAS和ES-2每種用0.02%-EDTA溶液 (Nacalai Tesque制造)剝離，并用PBS清洗，在其中加入RPMI 1640 培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制造)，然后以300 G離心5分鐘，棄去上清液。 加入同樣的培養(yǎng)基通過離心操作清洗細(xì)胞并制備成最適的濃度，將 10(Hd這樣制備的細(xì)胞懸浮液皮下移植到各8周齡雌性SCID小鼠 (CLEA Japan制造)的右胸肋。從當(dāng)天開始，對(duì)于抗體施用組來說從尾靜脈施用lOOnl用PBS稀釋的抗體溶液，或者在對(duì)照組的情況下只 用PBS (每組5到7只動(dòng)物)。給藥每周進(jìn)行2次，總共8次，從發(fā) 現(xiàn)腫瘤的時(shí)間開始，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的直徑。腫瘤的體積通過 下式計(jì)算。
(公式)
腫瘤體積(mm3)=長(zhǎng)度x 寬度2x0.5
結(jié)果顯示在圖11中?？笻B-EGF嵌合抗體KM3966顯著抑制卵巢 癌細(xì)胞系MCAS和ES-2的腫瘤生長(zhǎng)。因此，發(fā)現(xiàn)了抗HB-EGF嵌合抗 體KM3966在早期癌癥模型中具有抗腫瘤效應(yīng)。
(6)-2通過晚期癌癥模型評(píng)估
將人類卵巢癌細(xì)胞系MCAS和ES-2以及人類乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231的每一種用0.02%-EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剝 離，并用PBS清洗，然后在其中加入RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO-BRL 制造)，然后以300 G離心5分鐘，棄去上清液。加入同樣的培養(yǎng)基 后，通過離心清洗細(xì)胞，然后制備成最適的密度，將10(Hil這樣制備的 細(xì)胞懸浮液皮下移植到各6-8周齡雌性SCID小鼠(CLEA Japan制造) 的右腋窩。通過觀察腫瘤的發(fā)展，選擇出腫瘤體積變?yōu)榇蠹s100 mm3 的小鼠，對(duì)它們進(jìn)行分組，使得各組中的平均腫瘤體積變成相似的水 平。從當(dāng)天開始，對(duì)于抗體施用組來說從尾靜脈施用lO(Hd用PBS稀 釋的抗體溶液，或者在對(duì)照組的情況下只用PBS(每組6或7只動(dòng)物)。 給藥每周進(jìn)行2次，總共8次，從抗體施用時(shí)間開始使用游標(biāo)卡尺測(cè) 量腫瘤直徑。腫瘤的體積通過下式計(jì)算。
(公式)
腫瘤體積(mm3)=長(zhǎng)度x 寬度2x0.5
結(jié)果顯示在圖12中。結(jié)果是，抗HB-EGF嵌合抗體KM3966顯著抑制了卵巢癌細(xì)胞系MCAS和ES-2以及乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB 231 的腫瘤生長(zhǎng)。因此，發(fā)現(xiàn)了抗HB-EGF嵌合抗體KM3966在晚期癌癥
模型中具有抗腫瘤活性。
實(shí)施例8
抗HB-EGF抗體對(duì)人類血液癌細(xì)胞系的反應(yīng)性和抗體依賴性細(xì)胞 性細(xì)胞毒性(ADCC活性)的評(píng)估
(1) 人類血液癌細(xì)胞系中的HB-EGF表達(dá)分析
為了評(píng)估HB-EGF在人類血液癌細(xì)胞系中的表達(dá)，通過熒光抗體 技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)。將每種人類急性骨髓性白血病細(xì)胞系ML-1 (DSMZ ACC 464)、 MOLM-13 (DSMZ ACC 554)、 MV畫4-11 (ATCC CRL 9591)、 HL-60 CATCC CRL隱240)、 NB-4 (DSMZ ACC 207)和KG-la (ATCC CCL-246.1)以及人類T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Karpas 299 (DSMZ ACC 31)和Jurkat (RCB RCB 0806)用PBS清洗，制備成最適密度， 然后以50 pl/孔(大約2xl05個(gè)細(xì)胞)分配到96孔U型底的板中 (FALCON制造)。將用1% BSA-TPBS制備成20 pg/ml的抗HB-EGF 小鼠抗體KM3566溶液分配50pl/孔，然后使用板混合器進(jìn)行攪拌，并 將板在冰上放置30分鐘。在用PBS清洗兩次后，向其中加入50pl/孔 稀釋50倍的第二抗體抗小鼠Igs/FITC山羊F(ab')2 (DAKO制造)，然 后使用板混合器進(jìn)行攪拌，并將板在暗處在冰上放置30分鐘。在用PBS 清洗兩次后，使用流式細(xì)胞儀EPICS XL系統(tǒng)II v. 3.0 (BECKMAN COULTER制造)測(cè)量熒光強(qiáng)度。使用小鼠IgGl (DAKO制造)作為 陰性對(duì)照抗體。
結(jié)果顯示在圖13中。KM3566與T細(xì)胞白血病和急性骨髓性白血 病細(xì)胞系特異性結(jié)合。因此，證實(shí)了 HB-EGF在人類血液癌細(xì)胞系中 表達(dá)。
(2) 抗HB-EGF嵌合抗體對(duì)人類血液癌細(xì)胞系的抗體依賴性細(xì)胞 性細(xì)胞毒性(ADCC活性)通過下面顯示的方法測(cè)定了抗HB-EGF嵌合抗體KM3966對(duì)其中 證實(shí)了 HB-EGF表達(dá)的急性骨髓性白血病細(xì)胞系的ADCC活性。
(2)-1靶細(xì)胞溶液的制備
每種人類急性骨髓性白血病細(xì)胞系ML-1、 MOLM-13、 MV-4-ll、 HL-60、 NB-4和KG-la用PBS清洗，用ADCC培養(yǎng)基清洗，然后使用 同樣的培養(yǎng)基制備成最適的密度，用作耙細(xì)胞溶液。
(2)-2效應(yīng)細(xì)胞溶液的制備
通過下面顯示的方法，從健康人的外周血分離外周血單核細(xì)胞 (PBMC)。使用含有少量肝素鈉注射液N "Shimizu" ( Shimizu Pharmaceutical制造)的注射器，從健康人收集50 ml外周血。通過加 入同樣體積的生理鹽水(Otsuka Pharmaceutical制造)將所收集到的外 周血稀釋，然后徹底攪拌。在15 ml容量的試管(Greiner制造)中分 配大約6.5 ml Polymorphprep (NYCOMED制造)，將同樣體積的稀釋 外周血輕輕置于其上，然后在室溫下以800 G離心30分鐘，分離單核 細(xì)胞層。在用ADCC培養(yǎng)基清洗兩次后，使用同樣的培養(yǎng)基將其調(diào)整 到最適濃度，并用作效應(yīng)細(xì)胞溶液。
(2)-3 ADCC活性的測(cè)定
將抗體稀釋溶液分配到96孔U型底的板(FALCON制造)的孔 中50|il，在其中加入50^1在(2)-l中制備的靶細(xì)胞溶液和50|il在(2)-2 中制備的效應(yīng)細(xì)胞溶液(效應(yīng)細(xì)胞(E)與靶細(xì)胞(T)的比率設(shè)置為 25)，將總體積調(diào)整到150^1，反應(yīng)在37。C進(jìn)行4小時(shí)。通過加入5(Hd 靶細(xì)胞溶液和lO(Hil培養(yǎng)基，獲得靶細(xì)胞自發(fā)釋放的值，并通過加入 50fil耙細(xì)胞溶液、50nl效應(yīng)細(xì)胞溶液和培養(yǎng)基獲得耙細(xì)胞和效應(yīng) 細(xì)胞自發(fā)釋放的值。通過加入5(Hil靶細(xì)胞溶液和8(Hil培養(yǎng)基、并在反 應(yīng)完成前45分鐘加入20^1 9% Triton X-100溶液，獲得靶細(xì)胞總釋放 的值。在反應(yīng)后，將板離心，通過使用LDH-細(xì)胞毒性測(cè)試(Wako制 造)，按照隨附的說明書測(cè)量吸光度，檢測(cè)上清液中的乳酸脫氫酶(LDH)活性。ADCC活性通過下式計(jì)算。 (公式)
ADCC活性(％)=([樣品的吸光度]-[靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放的 吸光度])/([靶細(xì)胞總釋放的吸光度]-[靶細(xì)胞自發(fā)釋放的吸光度]x 100
結(jié)果顯示在圖14中。抗HB-EGF嵌合抗體KM3966顯示出了對(duì) HB-EGF陽(yáng)性的人類血液癌細(xì)胞系的抗體依賴性細(xì)胞毒性。因此表明， 有可能本發(fā)明的抗HB-EGF單克隆抗體和重組抗體不僅對(duì)實(shí)體癌例如 表達(dá)HB-EGF的卵巢癌、而且對(duì)血液癌例如急性骨髓性白血病和T細(xì) 胞白血病都有效。
實(shí)施例9
抗HB-EGF人源化抗體的制備
(1)設(shè)計(jì)抗HB-EGF人源化抗體的VH和VL的氨基酸序列 首先，如下設(shè)計(jì)抗HB-EGF人源化抗體的VH的氨基酸序列。
為了移植SEQ IDNO:12至lJ 14中分別顯示的抗體VH的CDR 1到 3的氨基酸序列，選擇人類抗體的VH的FR氨基酸序列。Kabat等已 經(jīng)根據(jù)氨基酸序列的同源性將各種不同的已知人類抗體的VH分成三 個(gè)亞類(HSG I到III),并進(jìn)一步報(bào)道了相應(yīng)亞類間的共有序列(《免 疫學(xué)重要的蛋白序列》，SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest,美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部，1991)。因?yàn)檫@些共有序列有可能在 人類中免疫原性降低，因此決定在這些共有序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)抗 HB-EGF人源化抗體的VH氨基酸序列。為了在設(shè)計(jì)中制備具有更高結(jié) 合活性的抗HB-EGF人源化抗體，決定在三個(gè)亞類人類抗體的VH的 共有序列的FR氨基酸序列中，選擇與抗HB-EGF小鼠抗體KM3566 的VH的FR氨基酸序列具有最高同源性的FR氨基酸序列。
作為同源性檢索的結(jié)果，HSGI、 HSGII和HSGIII的同源性分別為73.6%、 50.6%和56.3%。因此，KM3566的VH區(qū)的FR的氨基酸序 列與亞類I具有最高的同源性。
基于上面的結(jié)果，將抗HB-EGF小鼠抗體KM3566的VH的CDR 氨基酸序列移植到人類抗體的I亞類VH共有序列的FR氨基酸序列的 適當(dāng)位置中。但是，盡管在SEQ ID NO:9中描述的KM3566的VH氨 基酸序列中，74位Lys在人類抗體FR氨基酸序列的相應(yīng)區(qū)中不是Kabat 等引用的具有最高使用頻率的氨基酸殘基，但其也是相對(duì)高頻率使用 的氨基酸殘基，因此決定使用在KM3566的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)的上面 描述的氨基酸殘基。因而設(shè)計(jì)了 SEQ IDNO:22顯示的抗HB-EGF人源 化抗體的VH的氨基酸序列HV0。
接下來，如下設(shè)計(jì)了抗HB-EGF人源化抗體的VL的氨基酸序列。
為了移植SEQ ID NO:15到17分別顯示的抗體VL的CDR 1到3 的氨基酸序列，選擇了人類抗體的VL的FR氨基酸序列。Kabat等已 經(jīng)根據(jù)氨基酸序列的同源性將各種不同的已知人類抗體的VL分成四 個(gè)亞類(HSG I至ljIV)，然后報(bào)道了相應(yīng)亞類間的共有序列(《免疫學(xué) 重要的蛋白序列》，SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, 美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部，1991)。因此，與VH的情況類似，從人類抗 體的四個(gè)亞類VL的共有序列的FR氨基酸序列中，選擇與抗HB-EGF 小鼠抗體KM3566的VL的FR氨基酸序列具有最高同源性的FR氨基 酸序列。
作為同源性搜索的結(jié)果，HSG I、 HSG II、 HSG III和HSG IV的 同源性分別為75.0%、 75.9%、 71.3%和81.3%。因此，KM3566的VL
區(qū)的FR氨基酸序列與亞類IV具有最高的同源性。
基于上面的結(jié)果，將抗HB-EGF小鼠抗體KM3566的VL的CDR
氨基酸序列移植到人類抗體的IV亞類VL的共有序列的FR氨基酸序列的適當(dāng)位置中。但是，盡管在SEQ ID NO:ll中描述的KM3566的 VL氨基酸序列中，110位Leu在人類抗體FR氨基酸序列的相應(yīng)區(qū)中 不是Kabat等引用的具有最高使用頻率的氨基酸殘基，但它是相對(duì)高 頻率使用的氨基酸殘基，因此決定使用在KM3566的氨基酸序列中發(fā) 現(xiàn)的上面描述的氨基酸殘基。因而設(shè)計(jì)了 SEQ ID NO:23顯示的抗 HB-EGF人源化抗體的VL的氨基酸序列LVO。
這樣設(shè)計(jì)的抗HB-EGF人源化抗體的VH的氨基酸序列HVO和 VL的氨基酸序列LVO，是其中只有抗HB-EGF小鼠抗體KM3566的 CDR氨基酸序列被移植到選定的人類抗體的FR氨基酸序列中的序列。 但是， 一般來說，當(dāng)制備人源化抗體時(shí)，在許多情況下，通過只移植 小鼠抗體CDR氨基酸序列下，結(jié)合活性降低了。因此，為了避免結(jié)合 活性的這種降低，在人類抗體與小鼠抗體之間不同的FR氨基酸殘基 中，進(jìn)行了被認(rèn)為對(duì)結(jié)合活性有影響的氨基酸殘基的修飾，并與移植 CDR氨基酸序列一起進(jìn)行移植。因此，在本實(shí)施例中，如下鑒定了被 認(rèn)為對(duì)結(jié)合活性有影響的FR氨基酸殘基。
首先，通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，構(gòu)建了由上面設(shè)計(jì)的抗HB-EGF人 源化抗體的VH的氨基酸序列HVO和VL的氨基酸序列LVO構(gòu)成的抗 體V區(qū)(HVOLVO)的三維結(jié)構(gòu)。這種構(gòu)建是使用用于制備三維結(jié)構(gòu)坐 標(biāo)的軟件AbM (Oxford Molecular制造)和用于顯示三維結(jié)構(gòu)的軟件 Pro-Explore (Oxford Molecular帝隨)或ViewerLite (Accelrys制造)， 按照隨附的相應(yīng)說明書來進(jìn)行的。此外，也以同樣的方式構(gòu)建了抗 HB-EGF小鼠單克隆抗體KM3566的V區(qū)的三維結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模型。 此夕卜，還通過制備其中選擇在HVOLVO的VH和VL的FR氨基酸序列 中與抗HB-EGF小鼠抗體KM3566不同的氨基酸殘基并將其修改成抗 HB-EGF小鼠抗體KM3566的氨基酸殘基的氨基酸序列，而以同樣的方 式構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)模型。通過對(duì)這些制備的抗HB-EGF小鼠抗體 KM3566、 HVOLVO和修改的產(chǎn)物的V區(qū)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，鑒定了 被認(rèn)為對(duì)抗體的結(jié)合活性有影響的氨基酸殘基。氨基酸殘基中，被認(rèn)為通過改變抗原 結(jié)合區(qū)的三維結(jié)構(gòu)而對(duì)抗體活性具有影響的氨基酸殘基，分別是，對(duì) 于HV0來說選出9位的Ala、 20位的Val、 30位的Thr、 38位的Arg、 41位的Pro、 48位的Met、 67位的Arg、 68位的Val、 70位的Ile、 95 位的Tyr和118位的Val，對(duì)于LVO來說選出15位的Leu、 19位的 Ala、 21位的Ile、 49位的Pro和84位的Leu。通過將至少一個(gè)或多個(gè) 這些選出的氨基酸殘基修改成在小鼠抗體KM3566的同樣區(qū)域中存在 的氨基酸殘基，設(shè)計(jì)了具有各種不同修飾的人源化抗體的VH和VL。 具體來說，對(duì)于抗體VH來說，導(dǎo)入下述氨基酸修飾中的至少一個(gè)修飾， 其中在SEQ ID NO:22顯示的氨基酸序列中，9位的Ala被Thr取代， 20位的Val被Leu取代，30位的Thr被Arg取代，38位的Arg被Lys 取代，41位的Pro被Thr取代，48位的Met被lie取代，67位的Arg 被Lys取代，68位的Val被Ala取代，70位的lie被Leu取代，95位 的Tyr被Phe取代，和118位的Val被Leu取代。此外，對(duì)于VL來說， 導(dǎo)入了下述氨基酸修飾中的至少一個(gè)修飾，其中在SEQIDNO:23顯示 的氨基酸序列中，15位的Leu被Val取代，19位的Ala被Val取代， 21位的lie被Met取代，49位的Pro被Ser取代，和84位的Leu被Val 取代。
(2)抗HB-EGF人源化抗體的VH的編碼cDNA的構(gòu)建 按照下面的方式使用PCR構(gòu)建在本實(shí)施例(1)中設(shè)計(jì)的抗HB-EGF 人源化抗體VH氨基酸序列HV0的編碼cDNA。
首先，通過與SEQ IDNO:9的1到19位中描述的抗HB-EGF小鼠 抗體KM3566的H鏈的分泌信號(hào)序列連接，將設(shè)計(jì)的氨基酸序列制備 成完整的抗體氨基酸序列。接下來，將氨基酸序列轉(zhuǎn)變成遺傳密碼子。 當(dāng)對(duì)于1個(gè)氨基酸殘基存在兩個(gè)或多個(gè)遺傳密碼子時(shí)，通過將抗體基 因的核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)的密碼子使用頻度[《免疫學(xué)重要的蛋白的序 列》，SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest,美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部，1991]考慮在內(nèi)，來確定相應(yīng)的遺傳密碼子。通過將這樣確
定的遺傳密碼子相連，設(shè)計(jì)了完整的抗體V區(qū)氨基酸序列的編碼cDNA 的核苷酸序列，并將用于PCR擴(kuò)增的引物的結(jié)合性核苷酸序列(包括 用于克隆到人源化抗體表達(dá)載體中的限制性酶識(shí)別序列)加到5'-末端 和3'-末端。這樣設(shè)計(jì)的核苷酸序列被分成總共4個(gè)核苷酸序列，從5'-末端側(cè)(設(shè)計(jì)鄰近的核苷酸序列，使得末端具有大約20個(gè)核苷酸的交 疊序列)開始，每個(gè)具有大約IOO個(gè)核苷酸，并且合成的DNA片段(SEQ ID NO:24到27)通過以正義鏈和反義鏈交替的次序排列它們來合成。
將每個(gè)合成的DNA片段(SEQ ID NO:24到27)加入到50 pl反 應(yīng)溶液中，使終濃度為0.1 ]Limo1/1，并使用0.5 nmol/1 T3引物(Takara Shuzo制造)、0.5 pmol/1 T7弓l物(Takara Shuzo制造)和1單位KOD 聚合酶(TOYOBO制造)，按照KOD聚合酶隨附的說明書，進(jìn)行PCR。 對(duì)于這種情況下的反應(yīng)條件來說，PCR按照說明書中描述的條件進(jìn)行 (由94°C 30秒、50°C 30秒和74°C 60秒構(gòu)成的30個(gè)循環(huán))。將反應(yīng) 溶液進(jìn)行乙醇沉淀，將沉淀溶解在無(wú)菌水中，用適當(dāng)?shù)南拗菩悦柑幚恚?然后與質(zhì)粒pBluescript II SK(-)連接。使用這樣獲得的重組質(zhì)粒DNA 溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，從各轉(zhuǎn)化體制備各質(zhì)粒DNA，然后使用Big Dye終止物循環(huán)測(cè)序試劑盒(Applied Biosystems制造)分析其核苷酸 序列。結(jié)果，獲得了具有目的核苷酸序列的質(zhì)粒。
接下來，通過制備具有突變的合成DNA并進(jìn)行上面描述的PCR， 或者通過使用含有上面制備的HV0的編碼cDNA的質(zhì)粒DNA作為模 板、合成的DNA片段作為引物進(jìn)行PCR、并分離擴(kuò)增到的基因片段， 來修改本實(shí)施例(1)中設(shè)計(jì)的FR氨基酸殘基。修改后氨基酸殘基的基因 密碼子的制備方式使得它們變成在抗HB-EGF小鼠抗體KM3566中發(fā) 現(xiàn)的基因密碼子。此外，除非下面另外指明，反應(yīng)通過35個(gè)循環(huán)的PCR 進(jìn)行，每個(gè)循環(huán)由94°C 30秒、55°C 30秒和72°C 60秒的反應(yīng)構(gòu)成。 PCR使用KOD曙plus聚合酶(TOYOBO審ij造)來進(jìn)行。此外，在本文 中使用的合成DNA是FASMAC Co., Ltd的產(chǎn)品。
84(3)抗HB-EGF人源化抗體的VL的編碼cDNA的構(gòu)建 使用下面描述的PCR，構(gòu)建了在本實(shí)施例(l)中設(shè)計(jì)的抗HB-EGF 人源化抗體VL氨基酸序列的編碼cDNA。
首先，通過與SEQ ID NO:ll的1到20位顯示的抗HB-EGF小鼠 抗體KM3566的L鏈的分泌信號(hào)序列連接，將設(shè)計(jì)的氨基酸序列制備 成完整的抗體氨基酸序列。接下來，將氨基酸序列轉(zhuǎn)變成遺傳密碼子。 當(dāng)對(duì)于1個(gè)氨基酸殘基存在兩個(gè)或多個(gè)遺傳密碼子時(shí)，通過將在抗體 基因的核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)的密碼子使用頻度[《免疫學(xué)重要的蛋白的序 列》，SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest,美國(guó)衛(wèi)生與人 類服務(wù)部，1991]考慮在內(nèi)，來確定相應(yīng)的遺傳密碼子。通過將這樣確 定的遺傳密碼子相連，設(shè)計(jì)了完整的抗體V區(qū)氨基酸序列的編碼cDNA 的核苷酸序列，并將用于PCR擴(kuò)增的引物的結(jié)合性核苷酸序列(包括 用于克隆到人源化抗體表達(dá)載體中的限制性酶識(shí)別序列)加到5'-末端 和3'-末端。這樣設(shè)計(jì)的核苷酸序列被分成總共4個(gè)核苷酸序列，從5'-末端一側(cè)(設(shè)計(jì)鄰近的核苷酸序列，使得末端具有大約20個(gè)核苷酸的 交疊序列)開始，每個(gè)具有大約100個(gè)核苷酸，合成的DNA片段(SEQ IDNO:28到31)通過以正義鏈和反義鏈交替的次序排列它們來合成。
將每個(gè)合成的DNA片段(SEQ IDNO:28到31)加入到50 pl反 應(yīng)溶液中，使終濃度為0.1 pmo1/1，按照與上述(2)中同樣的方式，使用 0.5 nmol/1 T3弓|物(Takara Shuzo制造)、0.5 pmol/l T7弓l物(Takara Shuzo制造)和l單位KOD聚合酶(TOYOBO制造)，按照KOD聚 合酶隨附的說明書，進(jìn)行PCR。將反應(yīng)溶液進(jìn)行乙醇沉淀，將沉淀溶 解在無(wú)菌水中，進(jìn)行適當(dāng)?shù)南拗菩悦柑幚?，然后與質(zhì)粒pBluescript II SK(-)連接。使用這樣獲得的重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a， 從各轉(zhuǎn)化體制備各質(zhì)粒DNA，然后使用Big Dye終止物循環(huán)測(cè)序試劑 盒(Applied Biosystems制造)分析其核苷酸序列。結(jié)果，獲得了具有 目的核苷酸序列的質(zhì)粒pBS/LV0。接下來，通過制備具有突變的合成DNA并進(jìn)行上面描述的PCR， 或者通過使用含有上面制備的LV0的編碼cDNA的質(zhì)粒DNA作為模 板、合成的DNA片段作為引物進(jìn)行PCR、并分離擴(kuò)增到的基因片段， 來修改在本實(shí)施例(1)中設(shè)計(jì)的FR氨基酸殘基。修改后氨基酸殘基的基 因密碼的制備方式使得它們變成在抗HB-EGF小鼠抗體KM3566中發(fā) 現(xiàn)的基因密碼子。
在下面，除非另有指明，PCR進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由94°C30 秒、55°C 30秒和72°C 60秒的反應(yīng)構(gòu)成，使用KOD-plus聚合酶 (TOYOBO制造)。此夕卜，在本文中使用的合成DNA是FASMAC Co., Ltd的產(chǎn)品。
(4) 抗HB-EGF人源化抗體表達(dá)載體的構(gòu)建
通過將在本實(shí)施例(2)或(3)中獲得的HV0或LV0的編碼cDNA、 或編碼其修改產(chǎn)物的cDNA插入到WO 97/10354中描述的人源化抗體 表達(dá)載體pKANTEX93的適當(dāng)位置中，構(gòu)建了各種不同的抗HB-EGF 人源化抗體表達(dá)載體。
(5) 抗HB-EGF人源化抗體的穩(wěn)定表達(dá)和使用動(dòng)物細(xì)胞制備純化 的抗體
抗HB-EGF人源化抗體的穩(wěn)定表達(dá)，和使用動(dòng)物細(xì)胞從培養(yǎng)上清 液中純化抗體，按照與實(shí)施例6(2)和(3)中描述的方法相同的方式來進(jìn) 行。
實(shí)施例10
抗HB-EGF抗體的結(jié)合表位的分析
在抗HB-EGF抗體KM3566、KM3579和KM3966對(duì)人類HB-EGF
的結(jié)合表位上進(jìn)行了下面的分析。(1)突變型人類HB-EGF全長(zhǎng)基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞的構(gòu)建 所有的抗HB-EGF抗體KM3566、 KM3579和KM3966都與人類 HB-EGF反應(yīng)，但不顯示出與小鼠HB-EGF的交叉反應(yīng)。因此，構(gòu)建了 表達(dá)10種突變型人類HB-EGF全長(zhǎng)蛋白(后文中稱為突變HB-EGF) 的基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中在人類HB-EGF的EGF樣結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列 中，與小鼠HB-EGF不同的IO個(gè)氨基酸中的每一個(gè)都被源自小鼠的氨 基酸所取代，并通過測(cè)量抗HB-EGF抗體對(duì)它們的結(jié)合活性，分析了 結(jié)合表位。制備的10種突變HB-EGF顯示如下。
(1) 從N-末端開始第115位苯丙氨酸被酪氨酸取代的突變HB-EGF (后文中稱為"F115Y")
(2) 從N-末端開始第122位賴氨酸被精氨酸取代的突變HB-EGF (后文中稱為"K122R")
(3) 從N-末端開始第124位纈氨酸被亮氨酸取代的突變HB-EGF (后文中稱為"V124L")
(4) 從N-末端開始的第125位賴氨酸被谷氨酰胺取代的突變 HB-EGF (后文中稱為"K125Q")
(5) 從N-末端開始第127位亮氨酸被苯丙氨酸取代的突變HB-EGF (后文中稱為"L127F")
(6) 從N-末端開始第129位丙氨酸被蘇氨酸取代的突變HB-EGF (后文中稱為"A129T")
(7) 從N-末端開始第133位異亮氨酸被賴氨酸取代的突變HB-EGF (后文中稱為"I133K")
(8) 從N-末端開始第135位組氨酸被亮氨酸取代的突變HB-EGF (后文中稱為"H135L")
(9) 從N-末端開始第141位谷氨酸被組氨酸取代的突變HB-EGF (后文中稱為"E141H")
(10) 從N-末端開始第147位絲氨酸被蘇氨酸取代的突變HB-EGF (后文中稱為"S147T")。
87此外，構(gòu)建了下面的人類/小鼠嵌合HB-EGF全長(zhǎng)基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞作 為陽(yáng)性對(duì)照。
(11)制備了人類/小鼠嵌合HB-EGF，其中從N-末端開始1到49 位的序列由源自小鼠HB-EGF的序列構(gòu)成，從N-末端開始50到208 位的序列由源自人類HB-EGF的序列構(gòu)成。因?yàn)樗蠩GF樣結(jié)構(gòu)域都 是源自于人類HB-EGF的序列，因此該HB-EGF被用作陽(yáng)性對(duì)照。
使用Mekada等的方法(J. Bio. Chem., 272, 27084-270卯(1997))， 制備了用于瞬時(shí)表達(dá)上面提到的突變體HB-EGF和人類/小鼠嵌合 HB-EGF的質(zhì)粒。將小鼠LMTK細(xì)胞(ATCC CCL-1.3)用添加了 100 單位/ml青霉素G、 100嗎/ml鏈霉素和10%牛血清白蛋白的Dulbecco's 修改的Eagle's培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。通過磷酸鈣方法將每種上面提到的表 達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入小鼠LMTK細(xì)胞，然后將細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)并用于下面的試
驗(yàn)o
通過僅將載體轉(zhuǎn)入小鼠LMTK細(xì)胞而制備的細(xì)胞(后文中稱為 "模擬體(mock)")被用作陰性對(duì)照。
(2)使用突變體HB-EGF基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行的抗HB-EGF抗體結(jié) 合活性分析
首先，將用結(jié)合緩沖液(通過將非必需氨基酸、20 mM HEPES-NaOH (pH 7.2)和10%胎牛血清添加到Ham's F12中而制備)稀 釋到2ng/ml的生物素標(biāo)記的抗HB-EGF抗體(KM3566、 KM3579或 KM3966)，與1 x 105個(gè)細(xì)胞的突變體HB-EGF基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞、人類/ 小鼠嵌合HB-EGF基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或模擬體在4°C反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng) 后，用冰冷的清洗緩沖液(通過向PBS中加入0.5 mMCaCl2、 0.5 mM MgCl2和0.1%胎牛血清而制備)清洗細(xì)胞兩次，然后用PBS(+)(通過 向PBS中加入0.5 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2而制備)清洗一次。將 用PBS(+)稀釋到1.8%的甲醛溶液加入到洗過的細(xì)胞中，將細(xì)胞在4°C固定20分鐘。接下來，將細(xì)胞用PBS(+)清洗一次，然后用甘氨酸溶液 (0.2M甘氨酸，100mMTris， pH8.1)在4。C處理20分鐘，然后在 清洗緩沖液中在4。C下溫育20分鐘。接下來，將細(xì)胞與用結(jié)合緩沖液 稀釋到0.1ng/ml的HRP結(jié)合的鏈親和素在4°C下反應(yīng)20分鐘，并用 清洗緩沖液洗兩次，用PBS(+)洗兩次。通過使用過氧化物酶檢測(cè)試劑 盒(ELISAPOD底物OPD試劑盒，NacalaiTesque制造)進(jìn)行顯色， 測(cè)定492 nm處的吸光度，并測(cè)量細(xì)胞結(jié)合的HRP的活性。
通過從抗HB-EGF抗體的各個(gè)不同的突變體HB-EGF基因轉(zhuǎn)化細(xì) 胞或人類/小鼠嵌合HB-EGF基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞的吸光度中減去模擬體的吸 光度而獲得的值，被用作值A(chǔ)。
接下來，為了分析突變體HB-EGF蛋白在小鼠LMTK細(xì)胞的細(xì)胞 膜上的表達(dá)，通過與上面描述的相同方法，測(cè)量了平均結(jié)合所有突變 體HB-EGF的抗HB-EGF兔多克隆抗體(抗體名稱H-6，通過用合成 的肽免疫兔而制備的抗體，該合成的肽是人類HB-EGF從N-末端開始 的54到73位，并與Sepharose CL-6B交聯(lián))對(duì)突變體HB-EGF基因轉(zhuǎn) 化細(xì)胞、人類/小鼠嵌合HB-EGF基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及模擬體的吸光度。 但是，生物素標(biāo)記的H-6抗體以10嗎/ml的抗體濃度使用。通過從H-6 抗體的各個(gè)突變體HB-EGF基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞或人類/小鼠嵌合HB-EGF基 因轉(zhuǎn)化細(xì)胞的每一個(gè)的吸光度中減去對(duì)模擬體的吸光度而獲得的值， 被用作值B。
為了校正基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞之間表達(dá)量的差別，通過用值A(chǔ)除以值B 計(jì)算A/B值。當(dāng)將抗HB-EGF抗體對(duì)陽(yáng)性對(duì)照pRTHGC-6的A/B值當(dāng) 作100%時(shí)，計(jì)算對(duì)每個(gè)突變體HB-EGF的A/B值的比率，該比率被用 作每個(gè)突變體HB-EGF的相對(duì)結(jié)合活性。
結(jié)果顯示在圖15中。與pRTHGC-6相比，抗HB-EGF單克隆抗 體KM3566幾乎不結(jié)合I133K、H135L和S147T。因此，發(fā)現(xiàn)了抗HB-EGF
89單克隆抗體KM3566識(shí)別含有133位I、 135位H和147位S的氨基酸 的表位。此外，此外，與抗HB-EGF單克隆抗體KM3566的情況類似， 具有同樣抗體可變區(qū)的抗HB-EGF單克隆抗體KM3966，與pRTHGC-6 相比，也幾乎不結(jié)合1133K和H135L，并且對(duì)S147T的結(jié)合活性被降 低到大約1/3。因此，發(fā)現(xiàn)了抗HB-EGF單克隆抗體KM3966與抗 HB-EGF單克隆抗體KM3566的情況類似，識(shí)別含有133位I、 135位 H和147位S的氨基酸的表位。
與pRTHGC-6相比，抗HB-EGF單克隆抗體KM3579僅僅不與 E141H結(jié)合，對(duì)所有其它的突變體HB-EGF都顯示出與pRTHGC-6相 當(dāng)?shù)慕Y(jié)合活性。因此，發(fā)現(xiàn)了抗HB-EGF單克隆抗體KM3579識(shí)別含 有141位E的氨基酸的表位。
基于上面的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)抗HB-EGF單克隆抗體KM3566和抗 HB-EGF單克隆抗體KM3966以及抗HB-EGF單克隆抗體KM3579識(shí) 別HB-EGF的不同表位。
工業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明提供了與細(xì)胞膜結(jié)合的HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型 HB-EGF結(jié)合的單克隆抗體或其抗體片段。
序列表的自由文本
SEQIDNO:18-描述了人工序列合成的DNA SEQIDNO:19-描述了人工序列合成的DNA SEQ IDNO:20-描述了人工序列合成的DNA SEQIDNO:21-描述了人工序列合成的DNA SEQIDNO:22-描述了人工序列人源化抗體的氨基酸序列 SEQIDNO:23-描述了人工序列人源化抗體的氨基酸序列 SEQIDNO:24-描述了人工序列合成的DNA SEQIDNO:25-描述了人工序列合成的DNA
90SEQ ID NO::26—描述了人工序列合成的DNA
SEQ ID NO::27—描述了人工序列合成的DNA
SEQ ID NO::28-描述了人工序列合成的DNA
SEQ ID NO::29-描述了人工序列-合成的DNA
SEQ ID NO::30 —描述了人工序列:合成的DNA
SEQ ID NO::31—描述了人工序列合成的DNA
權(quán)利要求
1. 單克隆抗體或其抗體片段，其與細(xì)胞膜結(jié)合的肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子(后面稱為“HB-EGF”)、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF相結(jié)合。
2. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或其抗體片段，其與細(xì)胞膜結(jié)合的 HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF的表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF樣結(jié)構(gòu)域)相結(jié)合。
3. 權(quán)利要求1或2的單克隆抗體或其抗體片段，其抑制分泌型 HB-EGF與HB-EGF受體的結(jié)合。
4. 權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其對(duì)分泌 型HB-EGF具有中和活性。
5. 權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其與分泌 型HB-EGF與HB-EGF受體或白喉毒素的結(jié)合區(qū)相結(jié)合。
6. 權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其與包含 SEQ ID NO:2所顯示的氨基酸序列中第133、 135和147位氨基酸的至 少一個(gè)的表位相結(jié)合。
7. 權(quán)利要求6的單克隆抗體或其抗體片段，其與包含SEQ ID NO:2所顯示的氨基酸序列中第133、 135和147位氨基酸的表位結(jié)合。
8. 權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其與包含 SEQ IDNO:2所顯示的氨基酸序列中第141位氨基酸的表位相結(jié)合。
9. 權(quán)利要求1到3、 5和8任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其結(jié)合的表位與雜交瘤KM3579 (FERM BP-10491)產(chǎn)生的單克隆抗體相妙a :口 n o
10. 權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其結(jié)合 的表位與雜交瘤KM3567 (FERMBP-10573)產(chǎn)生的單克隆抗體相結(jié)合。
11. 權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其結(jié)合的 表位與雜交瘤KM3566 (FERM BP-10490)產(chǎn)生的單克隆抗體相結(jié)合。
12. 權(quán)利要求1到7和11任一項(xiàng)的單克隆抗體或其抗體片段，其 中抗體的重鏈可變區(qū)(后面稱為"VH")的CDR (互補(bǔ)性決定區(qū)，后 面稱為"CDR" ) 1、 CDR2和CDR3分別含有SEQIDNO:12、 13和14 顯示的氨基酸序列，而抗體的輕鏈可變區(qū)(后面稱為"VL")的CDR1、 CDR2和CDR3分別含有SEQIDNO:15、 16和17顯示的氨基酸序列。
13. 權(quán)利要求1到12任一項(xiàng)的抗體或其抗體片段，其中單克隆抗 體是重組抗體。
14. 權(quán)利要求13的抗體或其抗體片段，其中重組抗體選自人類嵌 合抗體、人源化抗體和人類抗體。
15. 權(quán)利要求14的人類嵌合抗體或其抗體片段，其中人類嵌合抗 體的VH含有SEQ ID NO:9顯示的氨基酸序列，而人類嵌合抗體的VL 含有SEQ ID NO:ll顯示的氨基酸序列。
16. 權(quán)利要求14的人類嵌合抗體或其抗體片段， 其中人源化抗體的VH含有SEQ ID NO:22顯示的氨基酸序列或在SEQ ID NO:22顯示的氨基酸序列中有至少一個(gè)修飾選自下列取代的氨 基酸序列Thr取代9位Ala、 Leu取代20位Val、 Arg取代30位Thr、 Lys取代38位Arg、 Thr取代41位Pro、 lie取代48位Met、 Lys取代67位Arg、 Ala取代68位Val、 Leu取代70位Ile、 Phe取代95位Tyr 和Leu取代118位Val;并且其中人源化抗體的VL含有SEQ ID NO:23顯示的氨基酸序列或其 中至少一個(gè)修飾選自下列取代的氨基酸序列Val取代15位Leu、 Val 取代19位Ala、 Met取代21位Ile、 Ser取代49位Pro和Val取代84 位Leu。
17. 權(quán)利要求1到16任一項(xiàng)的抗體片段，其選自Fab、Fab'、F(ab')2、 單鏈抗體(scFv) 、 二聚體化V區(qū)(雙抗體)、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)(dsFv) 和含有CDRs的肽。
18. DNA，其編碼權(quán)利要求1到17任一項(xiàng)的抗體或抗體片段。
19. 重組載體，其含有權(quán)利要求18的DNA。
20. 轉(zhuǎn)化體，其可以通過將權(quán)利要求19的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 中而獲得。
21. 生產(chǎn)權(quán)利要求1到17任一項(xiàng)的抗體或其抗體片段的方法，其 包括將權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)以在培養(yǎng)物中形成和積累 權(quán)利要求1到17任一項(xiàng)的抗體或抗體片段，并從培養(yǎng)物中回收抗體或 抗體片段。
22. 藥物組合物，其含有權(quán)利要求1到17任一項(xiàng)的抗體或其抗體 片段作為活性成分。
23. 治療與HB-EGF相關(guān)疾病的藥劑，其含有權(quán)利要求1到17任 一項(xiàng)的抗體或其抗體片段作為活性成分。
24. 權(quán)利要求23的藥劑，其中與HB-EGF相關(guān)的疾病是癌癥。
全文摘要
對(duì)于治療以HB-EGF增加為特征的疾病的藥物一直有需求。本發(fā)明公開了能夠與細(xì)胞膜結(jié)合的HB-EGF、膜錨定的HB-EGF和分泌型HB-EGF結(jié)合的單克隆抗體或其抗體片段。
文檔編號(hào)C12N15/02GK101511870SQ20078002894
公開日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2007年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月6日
發(fā)明者中村和靖, 佐佐木由香, 古谷安希子, 安藤博司, 宮本新吾, 巖本亮, 桝田和宏, 目加田英輔, 設(shè)樂研也, 高橋久美子 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社