專利名稱：：具有二苯亞胂酸降解能力的新微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及屬于中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬、且具有二苯亞胂酸降解能力的微生物。另外，本發(fā)明涉及屬于劍菌(Ensifer)屬、且具有二苯亞胂酸降解能力的微生物。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及使用至少1種上述微生物降解二苯亞胂酸的方法。
背景技術(shù)：
：2003年3月，從茨城縣神棲市的飲用井水中檢測到相當(dāng)于水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)450倍的高濃度的砷。之后通過調(diào)查表明此砷為有機(jī)砷化合物的一種，是以二苯亞胂酸((C6H5)2AsO(OH);結(jié)構(gòu)式如式I所示)為主要成分的苯基化砷化合物。0式I:由于該苯基化砷化合物引起的污染使附近居民遭受直接的健康損害，此外還發(fā)現(xiàn)附近水田產(chǎn)出的大米中也混入砷。該地域的土壤和地下水的二苯亞胂酸引起的砷污染在廣泛進(jìn)行著，環(huán)境省目前也在繼續(xù)進(jìn)行監(jiān)測調(diào)查。另外，二苯亞胂酸是作為化學(xué)武器之一的嘔吐劑(噴嚏劑)使用的二苯胂基氰和二苯胂基氯的合成原料或水解生成物。如果將二苯胂基氰和二苯胂基氯棄于土壤中，則經(jīng)二苯胂氫氧化物(diphenylarsinehydroxide)及氧聯(lián)雙二苯胂(bis-(diphenylarsine)oxide)變成二苯亞胂酸。日本國在存在60年以上的前軍隊(duì)相關(guān)設(shè)施的場所及其附近，發(fā)現(xiàn)由于含有這些有機(jī)砷化學(xué)武器的遺棄引起的土壤污染。另外，確認(rèn)國外也發(fā)生由于化學(xué)武器的棄置引起的土壤和地下水的有機(jī)砷污染。有待建立這些有機(jī)砷污染土壤的修復(fù)技術(shù)。作為已有的有機(jī)砷化合物污染土壤的凈化方法，提出了通過洗滌處理從污染土壤中提取除去有機(jī)砷化合物的方法(專利文獻(xiàn)1)。這時(shí)，作為洗滌劑，使用含有氫氧化鈉的水溶液、含有磷酸或其鹽的水溶液、含有硫酸的水溶液、含有鹽酸的水溶液、含有酒石酸或其鹽的水溶液、含有檸檬酸或其鹽的水溶液、或者含有草酸或其鹽的水溶液的任一種。另外，作為含有有機(jī)砷化合物的水的凈化方法，提出了在選自鐵離子、銅離子、鈷離子及錳離子構(gòu)成的組中的至少1種金屬離子的存在下，使過氧化氫反應(yīng)，將有機(jī)砷化合物氧化降解成無機(jī)砷的有機(jī)砷化合物的處理方法(專利文獻(xiàn)2)?；蛘?，還提出了添加氯化鐵等無機(jī)絮凝劑和有機(jī)高分子絮凝劑，使形成絮狀物，將此絮狀物沉淀分離后，用砂濾器過濾處理沉淀處理水，該處理水再進(jìn)行活性炭吸附處理，從而降低有機(jī)砷化合物的方法(專利文獻(xiàn)3)。進(jìn)一步，提出了下述方法，其特征在于對含有有機(jī)砷化合物的水照射紫外線，同時(shí)通入臭氧氣體，將有機(jī)砷化合物降解成無機(jī)砷化合物(專利文獻(xiàn)4)。進(jìn)一步，提出了一種水處理方法，其特征在于在含有有機(jī)砷的水中加入絮凝劑，沉淀除去含有的有機(jī)砷的沉淀工序后，再進(jìn)行用反滲透膜除去水中殘留的有機(jī)砷的反滲透膜工序。并且，提出了一種水處理裝置，其特征在于所述水處理裝置具有處理含有有機(jī)砷的水的反滲透膜裝置，在上述反滲透膜裝置的上游一側(cè)，具有在上述水中混合絮凝劑使上述有機(jī)砷沉淀的沉淀槽(專利文獻(xiàn)5)。但是，將上述列舉的有機(jī)砷化合物的凈化方法應(yīng)用于污染土壤時(shí)，需要進(jìn)行挖掘污染土壤、汲水、提取有機(jī)砷等，需要大量的勞動(dòng)力和成本。因此，希望一種更簡便、在原位就能夠凈化的方法，作為適合這種條件的新的環(huán)境凈化技術(shù)之一的生物修復(fù)引人注目。能夠有效降解、除去作為對象的污染物質(zhì)的微生物是實(shí)施生物修復(fù)必不可少的，對有機(jī)砷化合物引起的環(huán)境污染應(yīng)用此方法時(shí)，尚未分離出有用的微生物成為課題。據(jù)報(bào)道，到目前為止，作為降解有機(jī)砷化合物的微生物，有能夠降解二甲亞胂酸的微生物K8株、12M17株及7M5株，能夠降解單甲基胂酸的微生物K-r株及IV-1株(專利文獻(xiàn)6)。據(jù)報(bào)道K-1'株及IV-1株也能夠降解少量苯胂酸(專利文獻(xiàn)6)。但是到目前為止，尚不知道在上述神棲市的砷污染等中作為以最高濃度檢測到的有機(jī)砷化合物二苯亞5胂酸的降解菌。專利文獻(xiàn)1(特開2005-169162號(hào)公報(bào))、專利文獻(xiàn)2(特開2001-158622號(hào)公報(bào))、專利文獻(xiàn)3(特開2005-238184號(hào)公報(bào))、專利文獻(xiàn)4(特開2005-334761號(hào)公報(bào))、專利文獻(xiàn)5(特開2006-43616號(hào)公報(bào))以及專利文獻(xiàn)6(特開2005-229945號(hào)公報(bào))中記載的內(nèi)容作為本說明書記載的一部分引入。專利文獻(xiàn)l:特開2005-169162號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:特開2001-158622號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3:特開2005-238184號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4:特開2005-334761號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5:特開2006-43616號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6:特開2005-229945號(hào)公報(bào)
發(fā)明內(nèi)容二苯亞胂酸為有機(jī)砷化合物的一種，二苯亞胂酸本身的棄置或土壤中遺棄的化學(xué)武器(二苯胂基氰和二苯胂基氯)水解引起土壤和地下水污染。作為改善這種狀況的方法，希望得到有效降解二苯亞胂酸的方法。因此，本發(fā)明的目的是提供具有降解二苯亞胂酸能力的微生物、用于通過該微生物降解二苯亞胂酸的方法、使用該微生物凈化污染土壤及/或地下水的方法、含有該微生物的二苯亞胂酸的降解劑、含有該微生物的污染土壤及/或污染地下水的凈化劑。本發(fā)明人等為了解決上述問題，進(jìn)行了富集培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)二苯亞胂酸污染的水田土壤中存在有效的微生物，從這些微生物中分離出的新的劍菌(Ensifer)屬細(xì)菌及新的中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬細(xì)菌具有高的二苯亞胂酸降解能力。另外，還發(fā)現(xiàn)通過添加硫酸亞鐵等鐵成分可促進(jìn)該微生物對二苯亞胂酸的降解，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明在于下述[1][13]。具有二苯亞胂酸降解能力的屬于中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬的微生物。具有二苯亞胂酸降解能力的屬于中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬的微生物，具有含有下列(A)或(B)的16S核糖體RNA基因(A)由序列編號(hào)1中記載的堿基序列組成的DNA;(B)與序列編號(hào)1中記載的堿基序列具有95%以上同一性的DNA。具有二苯亞胂酸降解能力的屬于中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬的L2406株(FERMBP-10658)。具有二苯亞胂酸降解能力的屬于劍菌(Ensifer)屬的微生物。具有二苯亞胂酸降解能力的屬于劍菌(Ensifer)屬的微生物，具有含有下列(A)或(B)的16S核糖體RNA基因(A)由序列編號(hào)2中記載的堿基序列組成的DNA;(B)與序列編號(hào)2中記載的堿基序列具有95%以上同一性的DNA。具有二苯亞胂酸降解能力的屬于劍菌(Ensifer)屬的L2413株(FERMBP-10659)。—種降解二苯亞胂酸的方法，使用[1][6]中任一項(xiàng)所述的微生物?！N凈化土壤及/或污染地下水的方法，使用[1][6]中任一項(xiàng)所述的微生物。如[7]或[8]所述的方法，其中，在鐵成分存在下使用微生物?！N二苯亞胂酸的降解劑，其中，含有[1][6]中任一項(xiàng)所述的微生物。如[10]所述的降解劑，其中，含有鐵成分?！N污染土壤及/或污染地下水的凈化劑，其中，含有[1][6]中任一項(xiàng)所述的微生物。如[12]所述的凈化劑，其中，含有鐵成分。另外，本發(fā)明還在于下述[14][18]。一種降解二苯亞胂酸制備苯胂酸的方法，其中，使用[1][6]中任一項(xiàng)所述的微生物。7[15]—種從污染土壤制備凈化土壤的方法，其中，使用[1][6]中任一項(xiàng)所述的微生物。—種從污染地下水制備凈化地下水的方法，其中，使用[1][6]中任一項(xiàng)所述的微生物。如[14][16]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在鐵成分存在下使用微生物?！N挑選具有二苯亞胂酸降解能力的菌株的方法，其中，包括在濕潤土的狀態(tài)下采取砷污染土壤的工序；在二苯亞胂酸存在下培養(yǎng)該砷污染土壤，得到培養(yǎng)液的工序；稀釋得到的培養(yǎng)液、制作稀釋系列的工序；在二苯亞胂酸存在下，培養(yǎng)作為稀釋系列的培養(yǎng)液的工序；以及從稀釋系列中選擇伴隨培養(yǎng)產(chǎn)生二苯亞胂酸濃度降低或消失的培養(yǎng)液的工序。艮卩，本發(fā)明首先在于具有二苯亞胂酸降解能力的屬于中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬的微生物。作為這種微生物，優(yōu)選具有含有下列(A)或(B)的16S核糖體RNA基因的具有二苯亞胂酸降解能力的屬于中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬的微生物，所述(A)和(B)為(A)由序列編號(hào)1中記載的堿基序列組成的DNA;(B)與序列編號(hào)1中記載的堿基序列具有95%以上同一性的DNA。上述同一性優(yōu)選95%以上，更加優(yōu)選96°/。以上，進(jìn)一步優(yōu)選97%以上，進(jìn)一步優(yōu)選98%以上，進(jìn)一步優(yōu)選99%以上，特別優(yōu)選99.5%以上，特別優(yōu)選99.8%以上，特別優(yōu)選99.9%以上的同一性。作為這種微生物，非常優(yōu)選屬于中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬的L2406株(FERMBP-10658)。另外，本發(fā)明在于具有二苯亞胂酸降解能力的屬于劍菌(Ensifer)屬的微生物。作為這種微生物，優(yōu)選具有含有下列(A)或(B)的16S核糖體RNA基因的具有二苯亞胂酸降解能力的屬于劍菌(Ensifer)屬的微生物，所述(A)和(B)為(A)由序列編號(hào)2中記載的堿基序列組成的DNA;(B)與序列編號(hào)2中記載的堿基序列具有95%以上同一性的DNA。上述同一性優(yōu)選95%以上，更加優(yōu)選96%以上，進(jìn)一步優(yōu)選97%以上，進(jìn)一步優(yōu)選98%以上，進(jìn)一步優(yōu)選99%以上，特別優(yōu)選99.5%以上，特別優(yōu)選99.8%以上，特別優(yōu)選99.9。/。以上的同一性。作為這種微生物，非常優(yōu)選屬于劍菌(Ensifer)屬的L2413株(FERMBP-10659)。另外，本發(fā)明還在于使用上述微生物的至少1種以上降解二苯亞胂酸的方法、降解二苯亞胂酸制備苯胂酸的方法、凈化污染土壤及/或污染地下水的方法、從污染土壤制備凈化土壤的方法以及從污染的污染地下水制備凈化的污染地下水的方法，還在于在這些方法中上述微生物的使用。進(jìn)一步，在這些方法及使用的優(yōu)選方式中，可以在鐵成分存在下進(jìn)行。用于與微生物一起使用而存在的鐵成分的量，作為鐵濃度[mg-Fe/1](每1升體積的鐵的質(zhì)量mg)通常為0.01[mg-Fe/l]以上，優(yōu)選0.04[mg-Fe/l]以上，更加優(yōu)選0.1[mg-Fe/l]以上，特別優(yōu)選0.2[mg-Fe/l]以上，特別優(yōu)選0.3[mg-Fe/l]以上，特別優(yōu)選0.4[mg-Fe/l]以上，特別優(yōu)選1[mg-Fe/l]以上，特別優(yōu)選2[mg-Fe/l]以上，特別優(yōu)選4[mg-Fe/l]以上，優(yōu)選鐵濃度高。對鐵濃度的上限沒有特別限制，可以是根據(jù)離子積確定的飽和濃度，通常為1000[mg-Fe/l]以下。例如可以通過添加硫酸亞鐵等鐵成分達(dá)到這些鐵濃度。污染土壤或地下水是指主要含有二苯亞胂酸、被砷污染的土壤或地下水。被砷污染的土壤或地下水一般是指由于以有機(jī)化合物及無機(jī)化合物的形態(tài)含有砷元素而被污染的土壤或地下水，本發(fā)明中是指主要含有二苯亞胂酸、被砷污染的土壤或地下水。污染土壤或污染地下水的凈化是指除去了主要含有的二苯亞胂酸的土壤或地下水。但是，這種污染土壤的凈化或污染地下水的凈化也包括適當(dāng)除去二苯亞胂酸，結(jié)果從土壤或地下水中迅速除去成為二苯亞胂酸生成源的有機(jī)砷化合物；另外，也包括組合使用促進(jìn)苯胂酸降解的已知的組合物及方法，從土壤或地下水中迅速除去全部有機(jī)砷化合物。另外，本發(fā)明還在于含有上述微生物的二苯亞胂酸的降解劑、污染土壤或污染地下水的凈化劑，還在于使用上述微生物制備它們的方法。這些降解劑、土壤凈化劑及地下水凈化劑含有作為有效成分的上述微生物，而且，可以含有在其目的方面容許的已知的輔助成分。另外，這些降解劑、土壤凈化劑及地下水凈化劑的優(yōu)選方式中，可以含有硫酸亞鐵等鐵成分。適當(dāng)?shù)蔫F成分的含量，優(yōu)選在降解或凈化時(shí)，將在土壤、地下水等中與微生物一起使用時(shí)存在的鐵成分的量設(shè)定為鐵濃度[mg-Fe/1](每1升體積的鐵的質(zhì)量mg)達(dá)到上述范圍的值。另外，本發(fā)明還在于挑選具有二苯亞胂酸降解能力的菌株的方法，其中，用于挑選(篩選)具有二苯亞胂酸降解能力的微生物菌株的下述方法包括在濕潤土的狀態(tài)下采取砷污染土壤的工序；在二苯亞胂酸存在下培養(yǎng)該砷污染土壤，得到培養(yǎng)液的工序；稀釋得到的培養(yǎng)液，制作稀釋系列的工序；在二苯亞胂酸存在下，培養(yǎng)作為稀釋系列的培養(yǎng)液的工序；以及從稀釋系列中選擇伴隨培養(yǎng)產(chǎn)生二苯亞胂酸濃度降低或消失的培養(yǎng)液的工序。根據(jù)要求，可以將稀釋得到的培養(yǎng)液制作稀釋系列的工序、在二苯亞胂酸存在下培養(yǎng)作為稀釋系列的培養(yǎng)液的工序、以及從稀釋系列中選擇伴隨培養(yǎng)產(chǎn)生二苯亞胂酸濃度降低或消失的培養(yǎng)液的工序反復(fù)進(jìn)行多次。另外，為了有效地挑選，在優(yōu)選的方式中，在二苯亞胂酸存在下的培養(yǎng)，可以進(jìn)一步添加硫酸亞鐵等鐵成分。從砷污染土壤中采取濕潤土，可以通過從砷污染水田土壤中適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行采取。通過這種挑選具有二苯亞胂酸降解能力的菌株的方法，可以挑選(篩選)得到上述有用的微生物。進(jìn)一步，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，上述微生物菌株可以降解二苯亞胂酸的代謝產(chǎn)物苯胂酸，生成無機(jī)砷化合物。苯胂酸為有機(jī)砷化合物的一種，上述微生物菌株降解二苯亞胂酸一10次生成苯胂酸[(C6Hs)AsO(OH)2;結(jié)構(gòu)式如式II所示]。但是，為了凈化土壤和地下水，希望進(jìn)一步降解除去該苯胂酸。如果能夠?qū)⒃摫诫纤峤到獬蔁o機(jī)砷化合物，則土壤和地下水的凈化會(huì)變得更徹底。因此，本發(fā)明人等進(jìn)行了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)上述微生物菌株可以降解二苯亞胂酸的代謝產(chǎn)物苯胂酸，生成無機(jī)砷化合物。艮P，本發(fā)明還在于下述[19][22]。一種降解苯胂酸的方法，其中，使用[1][6]中任一項(xiàng)所述的微生物。如[19]所述的方法，其中，在鐵成分存在下使用微生物。[21]—種苯胂酸的降解劑，其中，含有[1][6]中任一項(xiàng)所述的微生物。如[21]所述的降解劑，其中，含有鐵成分。進(jìn)一步，本發(fā)明還在于下述[23][24]?！N降解苯胂酸以制備無機(jī)砷化合物的方法，其中，使用[1][6]中任一項(xiàng)所述的微生物。如[23]所述的方法，其中在鐵成分存在下使用微生物。進(jìn)一步，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)上述微生物菌株可以降解作為家禽促生長劑使用的洛克沙胂(Roxarsone),生成無機(jī)砷化合物。洛克沙胂[(C6H3(N02)(OH"AsO(OH)2;結(jié)構(gòu)式如式III所示]為作為促生長劑而給予家禽的苯基化有機(jī)砷化合物。在美國，83億只肉雞的約7成給予本品(2000年)，所出的廄肥中含有卯0t洛克沙胂，換算成砷相當(dāng)于250t。近年來，擔(dān)心因?qū)⒋藥适┯迷谵r(nóng)地等中造成發(fā)生有機(jī)砷污染土壤，正在尋求其對策。11因此，本發(fā)明人等為了弄清這次分離的降解菌對洛克沙胂的效果，在含有洛克沙胂作為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中移植L2406株，研究培養(yǎng)基中的洛克沙胂是否能夠得到降解。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述微生物菌株可以降解洛克沙胂，生成無機(jī)砷化合物。艮P，本發(fā)明還在于下述[25][28]。—種降解洛克沙胂的方法，其中，使用[1][6]中任一項(xiàng)所述的微生物。如[25]所述的方法，其中，在鐵成分存在下使用微生物?！N洛克沙胂的降解劑，其中，含有[1][6]中任一項(xiàng)所述的微生物。如[27]所述的降解劑，其中，含有鐵成分。進(jìn)一步，本發(fā)明還在于下述[29][30]?！N降解洛克沙胂以制備無機(jī)砷化合物的方法，其中，使用[1][6]中任一項(xiàng)所述的微生物。如[29]所述的方法，其中，在鐵成分存在下使用微生物。根據(jù)本發(fā)明的具有降解二苯亞胂酸能力的微生物，能夠降解在某種砷污染等中以最高濃度檢測到的有機(jī)砷化合物二苯亞胂酸。含有該微生物的二苯亞胂酸降解劑可以提供用于降解二苯亞胂酸的合適方法。而且，如果將這種二苯亞胂酸的降解劑作為污染土壤或污染地下水的凈化劑使用，對由有機(jī)砷化合物引起的污染土壤或污染地下水實(shí)施凈化的方法，則不需要挖掘污染土壤、汲水、提取有機(jī)砷等，不需要大量的勞動(dòng)力和成本，能夠更簡便、在原位就能夠凈化。S卩，本發(fā)明首次使作為新的環(huán)境凈化技術(shù)之一的生物修復(fù)在除去二苯亞胂酸方面成為可能。oo-——ooPoII式1圖1表示回流液中二苯亞胂酸濃度變化的圖。圖2表示L型管的培養(yǎng)基中二苯亞胂酸濃度變化的圖。圖3表示三角燒瓶的培養(yǎng)基中二苯亞胂酸濃度變化的圖。圖4表示培養(yǎng)液中苯胂酸濃度變化的圖。圖5表示培養(yǎng)液中砷的形態(tài)分析結(jié)果(色譜圖)圖。圖6表示培養(yǎng)液中洛克沙胂濃度變化的圖。具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)說明本發(fā)明。成為本申請優(yōu)先權(quán)主張的基礎(chǔ)的日本專利申請?zhí)卦?006-238350及日本專利申請?zhí)卦?007-115920說明書等中記載的內(nèi)容，作為本說明書記載的一部分引入。本發(fā)明的具有二苯亞胂酸降解能力的微生物為如下述那樣從土壤中分離的細(xì)菌。二苯亞胂酸降解菌的富集培養(yǎng)采用土壤'木炭回流法進(jìn)行。首先準(zhǔn)備具有表1所示組成的、高壓釜滅菌(120°C、20分鐘)后的回流液。但是，將硫酸鎂七水合物單獨(dú)調(diào)制成適當(dāng)濃度的溶液，另外進(jìn)行高壓釜滅菌后加入。表1.回流液組成培養(yǎng)基組成含量硝酸銨0.5g磷酸二氫鉀0.5g硫酸鎂七水合物0.2g硫酸亞鐵七水合物5mg(相當(dāng)于鐵lmg)二苯亞胂酸5mg或20mg水1000ml作為微生物源，供試土壤為采自茨城縣神棲市的砷污染水田土壤I及n。在濕潤土的狀態(tài)下稱取這些土壤，其量相當(dāng)于30g干土量，與少量的木炭(CharcoalA、東洋電化工業(yè)株式會(huì)社制造)混合，置于回流裝13置內(nèi)的規(guī)定位置。將該裝置置于25。C恒溫室，一邊使200ml回流液進(jìn)行回流，一邊進(jìn)行降解微生物的富集。每兩周取出全部回流液，更換成相同組成的新鮮回流液。該次運(yùn)轉(zhuǎn)的回流裝置中的供試土壤與回流液中二苯亞胂酸濃度的組合歸納于表2。表2.供試土壤與回流液中二苯亞胂酸濃度的組合回流裝置~~供試土壤二苯亞胂酸濃度1I20mg/l2I20mg/l3I5mg/l4I5mg/l5_^_20mg/l_富集培養(yǎng)中，采取微量回流液，用設(shè)定為表3所示測定條件的高效液相色譜法(HPLC)測定二苯亞胂酸的濃度。結(jié)果如圖l所示。表3.二苯亞胂酸濃度的測定條件￥1S#圖1中，15表示各回流裝置的編號(hào)(參照表2)，縱軸表示相對于初期二苯亞胂酸濃度的相對值，箭頭符號(hào)表示回流液的更換時(shí)間?；亓鏖_始19天后，該次運(yùn)轉(zhuǎn)的回流裝置中，回流液中的二苯亞胂酸的濃度顯著降低，從認(rèn)為二苯亞胂酸降解菌充分富集的回流裝置3及4中，濕潤狀態(tài)下采取土壤各2g，分別分散到滅菌的生理鹽水20ml中，調(diào)制土壤混懸液。將這些土壤混懸液0.1ml接種到6ml液體培養(yǎng)基中，所述液體培養(yǎng)基為分注入L型管的、與回流液具有相同組成的滅菌后的液體培養(yǎng)基，于25。C進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。這時(shí)二苯亞胂酸的濃度設(shè)定為5mg/1，關(guān)于各土壤混懸液，分別使用4個(gè)、共計(jì)8個(gè)L型管實(shí)施本實(shí)驗(yàn)。用HPLC經(jīng)時(shí)測定各L型管的培養(yǎng)基中二苯亞胂酸的濃度，結(jié)果9天后二苯亞胂ODS柱、內(nèi)徑3mmx長度250mm水-乙腈(i:i)混合液lmg/分鐘40。C10^1UV(220nm)絕對校準(zhǔn)曲線法相且里動(dòng)速溫樣測旦柱流流柱進(jìn)檢定14酸均大致消失(參照圖2)。因此，將任意選擇的L型管的培養(yǎng)液用滅菌后的生理鹽水稀釋，制作稀釋系列，將104及1()S倍的稀釋液0.1ml接種到6ml液體培養(yǎng)基中，所述液體培養(yǎng)基為分注入另外的L型管的、與回流液具有相同組成的滅菌后的液體培養(yǎng)基，于25'C進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。每個(gè)稀釋系列各培養(yǎng)2個(gè)。用HPLC經(jīng)時(shí)測定各個(gè)L型管的培養(yǎng)基中的二苯亞胂酸的濃度，結(jié)果培養(yǎng)開始17天后，任一L型管中的二苯亞胂酸均大致消失(參照圖3)。同樣，以接種105倍稀釋液的L型管的培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，反復(fù)稀釋和傳代，使培養(yǎng)液中含有的微生物種穩(wěn)定后，在表4所示組成的DPAA20VTE培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂制作平板，在該平板上，接種一部分上述培養(yǎng)液，于3(TC靜置培養(yǎng)。l周后，釣取出現(xiàn)的菌落，在R2A瓊脂培養(yǎng)基(Difco)上劃線，再于30'C靜置培養(yǎng)，得到多個(gè)純分離株。關(guān)于這些純分離株，在預(yù)先分注有DPAA5VTE培養(yǎng)基20ml的100ml容量三角燒瓶中，分別移植l白金耳，于25'C、120rpm進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。通過用HPLC經(jīng)時(shí)測定培養(yǎng)基中二苯亞胂酸的濃度，挑選具有二苯亞胂酸降解能力的菌株。表4.DPAA5VTE培養(yǎng)基的組成及DPAA20VTE培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基組成含量DPAA5VTE培養(yǎng)基DPAA20VTE培養(yǎng)基硝酸銨0.5g0.5g磷酸二氫鉀0.5g0.5g硫酸鎂七水合物0.2g0.2g硫酸亞鐵七水合物5mg(相當(dāng)于鐵lmg)5mg(相當(dāng)于鐵lmg)二苯亞胂酸5mg20mg維生素溶液+110ml10ml微量元素溶液A210ml10ml水1000ml1000ml15供試株菌落編號(hào)二苯亞胂酸降解率(％)苯胂酸生成量(mg/1)L2楊株139.40.52238.90.4837.10.44434.40.46536.40.43L2413株122.60.27212.20.17314.80.20413.40.19517.20.22表5.女1維生素溶液的組成組成成分含量—10mg素20mg"mg50mg100mg250mg苯甲酸500mg_1000ml表6.女2微量元素溶液的組成組成成分含量EDTA.2Na500mgZnS04.7H2010mgMnS04.H205mgH3B0330mgCoS04.7H2024mgCuS045H205mgNa2Mo04.2H205mgCa(OH)250mg水1000ml通過上述操作，挑選對二苯亞胂酸具有降解能力的菌株，發(fā)現(xiàn)L2406株及L2413株具有降解二苯亞胂酸的能力。各株用R2A瓊脂培養(yǎng)基(Difco)再次進(jìn)行單菌落分離，將每種菌株各5株接種到分注有6mlDPAA5VTE培養(yǎng)基的L型管中。于25'C振蕩培養(yǎng)14天，用HPLC測定二苯亞胂酸的殘存量，用LC-MS測定代謝物苯胂酸的生成量，結(jié)果如表7所示。另外，LC-MS的分析條件如表8所示。表7.L2406株及L2413株對二苯亞胂酸的降解和代謝物的生成素胺轉(zhuǎn)素醇基物鈷酸胺酸哆氨生氰泛硫煙吡對水16表8.LC-MS條件項(xiàng)目條件分離條件與表2相同離子化方法電噴霧法模式正離子增益1.0干燥氣體氮?dú)?12ml/分鐘、350°C)霧化器壓力45psig毛細(xì)管電壓3.5kV裂解器電壓80eV定量絕對校準(zhǔn)曲線法對于按上述步驟發(fā)現(xiàn)的L2406株及L2413株，實(shí)施了基于16S核糖體RNA基因(16S核蛋白體RNA基因)的堿基序列的基因分類學(xué)研究。首先，將各菌株移植于R2A瓊脂培養(yǎng)基(Difco)，于3(TC、暗處進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。取1白金耳產(chǎn)生的菌落，分散到滅菌后的生理鹽水lml中，從其中用DNeasyTissueKit(Qiagen)提取DNA。使用得到的DNA為模板，將已知的Dlf和Dlr作為引物進(jìn)行PCR，將16S核糖體RNA基因擴(kuò)增。此PCR產(chǎn)物用QIA快速PCR純化試劑盒(QIAquickPCRPurificationKit)(Qiagen)精制后，供循環(huán)測序反應(yīng)，其反應(yīng)物用DNA測序儀(日立制SQ-5500E)進(jìn)行解析，確定堿基序列。結(jié)果L2406株確定了1,101個(gè)堿基對(序列編號(hào)1:SEQIDNo.1)，L2413株確定了1,276個(gè)堿基對(序列編號(hào)2:SEQIDNo.2)。基于確定的堿基序列，用GENETYXPDB對DNA堿基序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)進(jìn)行FASTA檢索，結(jié)果L2406株與莫雷蘭中華根瘤菌(Sinorhizobiummorelense)有99.5%的同源性，L2413株與黏著劍菌(Ensiferadhaerens)有99.5%的同源性。然后研究了L2406株及L2413株的形態(tài)學(xué)及生理學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如表9所示。表9中的"+"表示有或陽性，"-"表示無或陰性。17表9.L2406株及L2413株的形態(tài)學(xué)及生理學(xué)性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(+:有或陽性，-無或陰性)另外，根據(jù)API系統(tǒng)(生物梅里埃公司(BioMerieuxCorporation))的API20NE的測定方法研究了兩種菌株的生化性狀，結(jié)果如表10所示。表10.L2406株及L2413株的生化性狀<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>上述結(jié)果與"Brenner,D.J.,Krieg，N.R.,Staley,J.T.,Garrity，G.M.共著，伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(Bergey'sManualofSystematicBacteriology)，第2版，變形細(xì)菌(TheProteobacteria)"中記載的中華根瘤菌屬細(xì)菌及劍菌屬細(xì)菌的特征沒有矛盾。根據(jù)上述結(jié)果，發(fā)明人等將L2406株鑒定為中華根瘤菌屬L2406(Sinorhizobiumsp.L2406)，在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為FERMBP-10658;另外，將L2413株鑒定為劍菌屬L2413(Ensifersp.L2413)，在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為FERMBP-10659。分離L2406株及L2413株使用的DPAA5VTE培養(yǎng)基中，作為微量元素含有鐵、鋅、錳、硼、鈷、銅、鉬及鈣。試驗(yàn)了這些元素對兩菌株降解二苯亞胂酸的必要性，表明鐵的添加非常重要。因此，通過改變添加的硫酸亞鐵七水合物的量，準(zhǔn)備培養(yǎng)基中的鐵濃度為0、0.04、0.2、0.4、1、2及4mg-Fe/l的DPAA5VTE培養(yǎng)基，研究了培養(yǎng)基中的鐵濃度如何影響二苯亞胂酸降解菌的降解能力。將各種培養(yǎng)基各6ml分注入L型管，移植L2406株或L2413株。于25'C振蕩培養(yǎng)7天后，用HPLC測定培養(yǎng)液中的二苯亞胂酸的濃度，求出其降解率。結(jié)果培養(yǎng)基中高的鐵濃度會(huì)促進(jìn)L2406株及L2413株對二苯亞胂酸的降解(表11)。表11.二苯亞胂酸降解的鐵濃度依賴性<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)施例下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，但是本發(fā)明的范圍并不局限于這些實(shí)施例。富集培養(yǎng)中，采取微量回流液，用設(shè)定為表3所示測定條件的高效液相色譜法(HPLC)測定二苯亞胂酸的濃度。結(jié)果如圖l所示?；亓鏖_始19天后，這次運(yùn)轉(zhuǎn)的回流裝置中，回流液中的二苯亞胂酸的濃度顯著降低，從認(rèn)為二苯亞胂酸降解菌充分富集的回流裝置3及4中，在濕潤狀態(tài)下采取土壤各2g，分別分散到滅菌的生理鹽水20ml中，調(diào)制土壤混懸液。將這些土壤混懸液O.lml接種到6ml液體培養(yǎng)基中，所述液體培養(yǎng)基為分注入L型管的、與回流液具有相同組成的滅菌后的液體培養(yǎng)基，于25。C進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。這時(shí)的二苯亞胂酸的濃度設(shè)定為5mg/1，關(guān)于各土壤混懸液，分別使用4個(gè)、共計(jì)8個(gè)L型管實(shí)施本實(shí)驗(yàn)。用HPLC經(jīng)時(shí)測定各個(gè)L型管的培養(yǎng)基中的二苯亞胂酸的濃度，結(jié)果9天后二苯亞胂酸均大致消失(參照圖2)。將任意選擇的L型管的培養(yǎng)液用滅菌后的生理鹽水稀釋，制作稀釋系列，將104及1()S倍的稀釋液0.1ml接種到6ml液體培養(yǎng)基中，所述液體培養(yǎng)基為分注入另外的L型管的、與回流液具有相同組成的滅菌后的液體培養(yǎng)基，于25'C進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。各個(gè)稀釋系列各培養(yǎng)2個(gè)。用HPLC經(jīng)時(shí)測定各個(gè)L型管的培養(yǎng)基中的二苯亞胂酸的濃度，結(jié)果培養(yǎng)開始17天后，任一L型管中的二苯亞胂酸均大致消失(參照圖3)。同樣，以接種105倍稀釋液的L型管的培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，反復(fù)稀釋和傳代，使培養(yǎng)液中含有的微生物種穩(wěn)定后，在表4所示組成的DPAA20VTE培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂制作平板，在該平板上，接種一部分上述培養(yǎng)液，于30'C靜置培養(yǎng)。l周后，釣取出現(xiàn)的菌落，在R2A瓊脂培養(yǎng)基(Difco)上劃線，再于3(TC靜置培養(yǎng)，得到多個(gè)純分離株。關(guān)于這些純分離株，在預(yù)先分注DPAA5VTE培養(yǎng)基20ml的100ml容量三21角燒瓶中，分別移植l白金耳，于25r、120rpm進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。通過用HPLC經(jīng)時(shí)測定培養(yǎng)基中的二苯亞胂酸的濃度，挑選具有二苯亞胂酸降解能力的菌株。通過上述操作，挑選對二苯亞胂酸具有降解能力的菌株，發(fā)現(xiàn)L2406株及L2413株具有降解二苯亞胂酸的能力。各菌株用R2A瓊脂培養(yǎng)基(Difco)再次進(jìn)行單菌落分離，將每種菌株各5株接種到分注有6mlDPAA5VTE培養(yǎng)基的L型管中。于25'C振蕩培養(yǎng)14天，用HPLC測定二苯亞胂酸的殘存量，用LC-MS測定代謝物苯胂酸的生成量，結(jié)果如表7所示。另外，LC-MS的分析條件如表8所示。對于按上述步驟發(fā)現(xiàn)的L2406株及L2413株，實(shí)施了基于16S核糖體RNA基因的堿基序列的基因分類學(xué)研究。首先，將各菌株移植于R2A瓊脂培養(yǎng)基(Difco)，于30。C、暗處進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。取1白金耳產(chǎn)生的菌落，分散到滅菌后的生理鹽水lml中，從其中用DNeasyTissueKit(Qiagen)提取DNA。使用得到的DNA為模板，將已知的Dlf和Dlr作為引物進(jìn)行PCR，將16S核糖體RNA基因擴(kuò)增。此PCR產(chǎn)物用QIA快速PCR純化試劑盒(QIAquickPCRPurificationKit)(Qiagen)精制后，供循環(huán)測序反應(yīng)，其反應(yīng)物用DNA測序儀(日立制SQ-5500E)進(jìn)行解析，確定堿基序列。結(jié)果L2406株確定了1,101個(gè)堿基對(序列編號(hào)l:SEQIDNo.1)，L2413株確定了1,276個(gè)堿基對(序列編號(hào)2:SEQIDNo.2)。基于確定的堿基序列，用GENETYXPDB對DNA堿基序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)進(jìn)行FASTA檢索，結(jié)果L2406株與莫雷蘭中華根瘤菌(Sinorhizobiummorelense)有99.5%的同源性，L2413株與黏著劍菌(Ensiferadhaerens)有99.5%的同源性。然后研究了L2406株及L2413株的形態(tài)學(xué)及生理學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如表9所示。表9中的"+"表示有或陽性，"-"表示無或陰性。另外，根據(jù)API系統(tǒng)(生物梅里埃公司)的API20NE的測定方法研22究了兩種菌株的生化性狀，結(jié)果如表10所示。上述結(jié)果與"Brenner,D.J"Krieg,N.R.,Staley,J.T"Garrity，G.M.共著，伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(Bergey'sManualofSystematicBacteriology)，第2版，變形細(xì)菌(TheProteobacteria)"中記載的中華根瘤菌屬細(xì)菌及劍菌屬細(xì)菌的特征沒有矛盾。根據(jù)上述結(jié)果，發(fā)明人等將L2406株鑒定為中華根瘤菌屬L2406(Sinorhizobiumsp.L2406)，在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為FERMBP-10658;另外，將L2413株鑒定為劍菌屬L2413(Ensifersp.L2413)，在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為FERMBP-10659。分離L2406株及L2413株使用的DPAA5VTE培養(yǎng)基中，作為微量元素含有鐵、鋅、錳、硼、鈷、銅、鉬及鈣。試驗(yàn)了這些元素對兩菌株降解二苯亞胂酸的必要性，表明鐵的添加非常重要。因此，通過改變添加的硫酸亞鐵七水合物的量，準(zhǔn)備培養(yǎng)基中的鐵濃度為0、0.04、0.2、0.4、1、2及4mg-Fe/1的DPAA5VTE培養(yǎng)基，研究了培養(yǎng)基中的鐵濃度如何影響二苯亞胂酸降解菌的降解能力。將各種培養(yǎng)基各6ml分注入L型管，移植L2406株或L2413株。于25。C振蕩培養(yǎng)7天后，用HPLC測定培養(yǎng)液中的二苯亞胂酸的濃度，求出其降解率。結(jié)果培養(yǎng)基中髙的鐵濃度會(huì)促進(jìn)L2406株及L2413株對二苯亞胂酸的降解(表11)。如表7所示，L2406株及L2413株降解二苯亞胂酸，生成苯胂酸[(C6H5)AsO(OH)2;結(jié)構(gòu)式如式II所示]。但是，任一菌株中，檢測到的苯胂酸的量以砷計(jì)只不過是被降解的二苯亞胂酸的1/3左右，由此認(rèn)為這些菌株有進(jìn)一步降解苯胂酸的可能性。因此，接著在含有苯胂酸作為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中移植二苯亞胂酸降解菌，經(jīng)時(shí)測定培養(yǎng)基中的苯胂酸的量。首先，將L2406株利用R2A瓊脂培養(yǎng)基(Difco)(組成如表12所23示)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，刮取產(chǎn)生的菌落，混懸于滅菌后的生理鹽水中。然后，從表4的DPAA5VTE培養(yǎng)基中除去二苯亞胂酸，添加苯胂酸lmg代替之，命名為PAA1VTE培養(yǎng)基，將PAA1VTE培養(yǎng)基20ml放入100ml容量三角燒瓶中。在各三角燒瓶中移植預(yù)先調(diào)制的L2406株的菌體混懸液各O.lml，于30°C、暗處進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(120rpm)。再準(zhǔn)備未實(shí)施移植菌的三角燒瓶作為對照。本實(shí)驗(yàn)以11=2進(jìn)行。培養(yǎng)基中的苯胂酸的定量使用LC-MS，應(yīng)用表8的分析條件。其結(jié)果如圖4所示。圖4的白圓圈(0)表示移植L2406株時(shí)培養(yǎng)液中苯胂酸濃度經(jīng)時(shí)變化的平均值。圖4的縱軸表示培養(yǎng)液中的苯胂酸濃度與對照的苯胂酸濃度的相對值，橫軸表示培養(yǎng)天數(shù)。如圖4所表明的那樣，L2406株在含有苯胂酸作為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，具有降低苯胂酸濃度的能力。另外，關(guān)于14天后的培養(yǎng)液，使用LC-ICP/MS進(jìn)行砷的形態(tài)分析。使用LC-ICP/MS分析時(shí)的分離條件如表13所示。表12.R2A瓊脂培養(yǎng)基組成(最終pH:7.2±0.2)培養(yǎng)基組成含量酵母提取物0.5g月示蛋白胨(DifcoNo.3)0.5g酪蛋白氨基酸0.5g葡萄糖0.5g可溶性淀粉0.5g磷酸氫二鉀0.3g硫酸鎂七水合物0.05g丙酮酸鈉0.3g瓊脂15.0g水畫Oml表13項(xiàng)目條件柱ODS柱、內(nèi)徑2mmx長度150mm流動(dòng)相A液0.1%甲酸B液含有0.1%甲酸的甲醇梯度條件注入后1.5分鐘后，B液的混合比例保持在1%。1.5分鐘后4分鐘后期間，B液的混合比例直線增加至25%。4分鐘后11分鐘后，B液的混合比例保持在25%。11分鐘后15分鐘后期間，B液的混合比例直線增加至75%。15分鐘后20分鐘后，B液的混合比例保持在75%。流速0.15ml/分鐘柱溫40°CLC-ICP/MS得到的色譜圖如圖5所示。縱軸表示峰強(qiáng)度，橫軸表示流出時(shí)間。上段為標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖，AsIII表示亞砷酸，DMAA+MAA表示二甲亞胂酸和單甲基胂酸，AsV表示砷酸，DMPAO表示二甲苯胂化氧(dimethylphenylarsineoxide)，MPAA表示甲苯基亞月申酸(methylphenylarsinicacid)，PAA表示苯胂酸，MDPAO表示甲基二苯基胂化氧(methyldiphenylarsineoxide)，DPAA表示二苯亞胂酸的洗脫峰位置(各20mg/1)。下段表示培養(yǎng)28天得到的L2406株的培養(yǎng)液的色譜圖，檢測到相當(dāng)于亞砷酸(圖5下段(1)的峰)和砷酸(圖5下段(2)的峰)的峰。進(jìn)一步，還檢測到未知的3種砷化合物(圖5下段(3)的峰)。另外，在圖5下段(4)的位置檢測到?jīng)]有被降解的殘存的苯胂酸。另一方面，對照(沒有移植菌)中只出現(xiàn)苯胂酸的峰。由此得出結(jié)論，L2406株具有降解苯胂酸、生成無機(jī)砷的能力。作為降解苯胂酸、生成無機(jī)砷的微生物，據(jù)報(bào)道有K-1'株及IV-1株(專利文獻(xiàn)6)。但是它們的苯胂酸降解率(％)非常慢，培養(yǎng)2周時(shí)，對于K-1'株，降解率為0.63%;對于IV-1株，降解率為2.20%。而與此相反，對于L2406株，2周時(shí)的降解率達(dá)10%左右，4周時(shí)達(dá)40%，推測其生物修復(fù)的可利用性更高。洛克沙胂[(C6H3(N02)(OH"AsO(OH)2;結(jié)構(gòu)式如式III所示]為作為促生長劑而給予家禽的苯基化有機(jī)砷化合物。在美國，83億只肉雞的約257成給予本品(2000年)，所出的廄肥中含有卯Ot洛克沙胂，換算成砷相當(dāng)于250t。近年來，擔(dān)心因?qū)⒋藥适┯玫睫r(nóng)地等中發(fā)生有機(jī)砷污染土壤，正在尋求其對策。因此本研究中，為了弄清這次分離的降解菌對洛克沙胂的效果，在含有洛克沙胂作為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中移植L2406株，研究培養(yǎng)基中的洛克沙胂是否能夠得到降解。首先，將L2406株利用R2A瓊脂培養(yǎng)基(Difco)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，刮取產(chǎn)生的菌落，混懸于滅菌后的生理鹽水中。然后，從表4的DPAA5VTE培養(yǎng)基中除去二苯亞胂酸，添加洛克沙胂6mg代替之，命名為ROX6VTE培養(yǎng)基，將ROX6VTE培養(yǎng)基20ml放入100ml容量三角燒瓶中。在各三角燒瓶中移植預(yù)先調(diào)制的L2406株的菌體混懸液各O.lml，于30°C、暗處進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(120rpm)。再準(zhǔn)備未實(shí)施移植菌的三角燒瓶，作為對照。本實(shí)驗(yàn)以n=2進(jìn)行。培養(yǎng)基中洛克沙胂的定量使用HPLC，應(yīng)用表13的分析條件。其結(jié)果如圖6所示。圖6的黑菱形()表示移植L2406株時(shí)的培養(yǎng)液中，洛克沙胂濃度經(jīng)時(shí)變化的平均值。圖6的縱軸表示培養(yǎng)液中洛克沙胂濃度與對照的洛克沙胂濃度的相對值，橫軸表示培養(yǎng)天數(shù)。如圖6所表明的那樣，在含有洛克沙胂作為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，L2406株具有降低洛克沙胂濃度的能力。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明的具有降解二苯亞胂酸能力的微生物，能夠降解某種砷污染等中作為以最高濃度檢測到的有機(jī)砷化合物二苯亞胂酸。含有該微生物的二苯亞胂酸降解劑可以提供用于降解二苯亞胂酸的適宜方法。而且，如果將這種二苯亞胂酸降解劑作為污染土壤或污染地下水的凈化劑使用，實(shí)施凈化有機(jī)砷化合物引起的污染土壤或污染地下水的方法，則不需要挖掘污染土壤、汲水、提取有機(jī)砷等大量的勞動(dòng)力和成本，能夠更簡便、在原位就能夠凈化。即，本發(fā)明在除去二苯亞胂酸方面，首次使作為新的環(huán)境凈化技術(shù)之一的生物修復(fù)成為可能。因此，本發(fā)明新提供一種優(yōu)良的環(huán)境凈化技術(shù)，是在產(chǎn)業(yè)上可以有效利用的發(fā)明。26序列表的自由文字序列編號(hào)1:本發(fā)明的降解菌L2406株的16S核糖體RNA基因的1101個(gè)堿基。序列編號(hào)2:本發(fā)明的降解菌L2413株的16S核糖體RNA基因的1276個(gè)堿基。權(quán)利要求1.具有二苯亞胂酸降解能力的屬于中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬的微生物。2.具有二苯亞胂酸降解能力的屬于中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬的微生物，具有含有下列(A)或(B)的16S核糖體RNA基因(A)由序列編號(hào)1中記載的堿基序列組成的DNA;(B)與序列編號(hào)1中記載的堿基序列具有95。/。以上同一性的DNA。3.具有二苯亞胂酸降解能力的屬于中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬的L2406株(FERMBP-10658)。4.具有二苯亞胂酸降解能力的屬于劍菌(Ensifer)屬的微生物。5.具有二苯亞胂酸降解能力的屬于劍菌(Ensifer)屬的微生物，具有含有下列(A)或(B)的16S核糖體RNA基因(A)由序列編號(hào)2中記載的堿基序列組成的DNA;(B)與序列編號(hào)2中記載的堿基序列具有95。/。以上同一性的DNA。6.具有二苯亞胂酸降解能力的屬于劍菌(Ensifer)屬的L2413株(FERMBP-10659)。7.—種降解二苯亞胂酸的方法，其中，使用權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的微生物。8.—種凈化土壤及/或污染地下水的方法，其中，使用權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的微生物。9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，在鐵成分存在下使用微生物。10.—種二苯亞胂酸降解劑，其中，含有權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的微生物。11.如權(quán)利要求io所述的降解劑，其中，含有鐵成分。12.—種污染土壤及/或污染地下水的凈化劑，其中，含有權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的微生物。13.如權(quán)利要求12所述的凈化劑，其中，含有鐵成分。14.一種降解苯胂酸的方法，其中，使用權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的微生物。15.—種降解洛克沙胂的方法，其中，使用權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的微生物。16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其中，在鐵成分存在下使用微生物。17.—種苯胂酸降解劑，其中，含有權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的微生物。18.—種洛克沙胂降解劑，其中，含有權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的微生物。19.如權(quán)利要求17或18所述的降解劑，其中，含有鐵成分。全文摘要本發(fā)明提供具有降解二苯亞胂酸能力的微生物、利用該微生物降解二苯亞胂酸的方法、利用該微生物凈化污染土壤的方法、含有該微生物的二苯亞胂酸降解劑以及含有該微生物的污染土壤或污染地下水的凈化劑。本發(fā)明提供具有二苯亞胂酸降解能力的屬于中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬的微生物、具有二苯亞胂酸降解能力的屬于劍菌(Ensifer)屬的微生物、使用該微生物凈化污染土壤的方法、含有該微生物的二苯亞胂酸降解劑以及含有該微生物的污染土壤或污染地下水的凈化劑。文檔編號(hào)C12N1/20GK101501181SQ20078002988公開日2009年8月5日申請日期2007年8月24日優(yōu)先權(quán)日2006年9月1日發(fā)明者原田直樹,高木和廣申請人:興和株式會(huì)社