專利名稱：：新型犬流感病毒及用于它的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新型流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)和A/Canine/Korea/03/07(H3N2)，還涉及包含至少一種所述病毒作為活性成分的疫苗組合物、用于預(yù)防或治療由流感病毒感染引起的疾病的方法以及用于檢測(cè)所述病毒的分析試劑盒。
背景技術(shù)：
：由正黏液病毒科(CW/wm丌oW^Wae)家族的流感病毒A引起的流感，是人、豬、馬和家禽最具有經(jīng)濟(jì)學(xué)重要性的疾病?；谝阎募t血球凝集素(H)和神經(jīng)氨酸苷酶(N)這兩種表面蛋白的特性，將流感病毒A進(jìn)一步分類。將流感病毒A表示為H(紅血球凝集素)亞型和一種類型N(神經(jīng)氨酸苷酶)的組合(例如，H9N2)。有16種不同的H亞型和9種N亞型，導(dǎo)致流感病毒A的H和N亞型總計(jì)有144種不同的可能組合。流感是一種人畜共患病。在3種流感類型中，A型病毒是最惡性的人病原體，引發(fā)最嚴(yán)重的疾病。此外，它們非常易于變異并且易于從一個(gè)物種傳播到另一物種，引發(fā)流行病。因此，流行性流感的爆發(fā)已成為亟待解決的重大問(wèn)題。此外，有幾個(gè)報(bào)道認(rèn)為流感病毒正在感染迄今已知能抵抗病毒感染的新物種。犬流感指的是引起犬科動(dòng)物流感的流感病毒A的新品種。因?yàn)橹皼](méi)有暴露于這種病毒，所以犬類對(duì)這種病毒沒(méi)有天然免疫力。因此，所有種類和各種年齡均易感染這種病毒。帶有犬流感的犬類可能患有急性肺炎，表現(xiàn)出劇烈咳嗽、高燒和流鼻涕的癥狀。高度傳染性流感病毒經(jīng)發(fā)現(xiàn)是造成2004年Florida賽犬跑道上Greyhound賽犬因呼吸性疾病死亡的原因。當(dāng)時(shí)，因?yàn)樵诿绹?guó)的Texas、Alabama、Arkansas和其他州均報(bào)導(dǎo)了犬流感的爆發(fā)，所以犬流感被視為犬類的新流行病。流行病學(xué)的調(diào)査顯示出從帶有犬流感的犬分離出來(lái)的病毒幾乎與馬流感病毒H3N8相同，表明犬流感的產(chǎn)生是由馬傳播到犬的結(jié)果。有報(bào)道說(shuō)馬流感病毒H3N8引起賽犬出血性肺炎，并從犬類分離出人流感病毒H3N8。然而，必須找到犬流感的足夠的血清學(xué)和病毒學(xué)證據(jù)。此外，已有犬科動(dòng)物爆發(fā)禽流感的報(bào)導(dǎo)病例。據(jù)推測(cè)，流感由禽類傳播到犬類的流行病學(xué)機(jī)理有兩種途徑一種途徑是通過(guò)向犬類喂食未煮過(guò)的攜帶流感的禽類，如鴨、雞等；流感病毒蔓延的另一種主要途徑是以咳嗽和噴嚏的呼吸小滴從感染的犬類傳播到正常犬類。另外，據(jù)推測(cè)，犬流感在感染的犬類暴露于新環(huán)境并與正常犬類接觸后形成。重要的是預(yù)防犬流感，因?yàn)槿鞲胁《究梢鹁哂胁煌劳雎实睦^發(fā)性感染。這時(shí)沒(méi)有可用于犬類的疫苗。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，本發(fā)明者在上述背景下對(duì)犬科動(dòng)物流感病毒的產(chǎn)生進(jìn)行了深入徹底的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)自韓國(guó)某些犬類的流感病毒是A血清型變體，與以前的流感病毒不同，并且，盡管屬于禽群，但是通過(guò)病毒學(xué)、血清學(xué)、病理學(xué)和進(jìn)化分析卻顯示出禽類和犬類之間的種間傳播。此外，已經(jīng)成功開發(fā)了抵抗這些病毒的高度穩(wěn)定的疫苗。技術(shù)方案本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供一種新型的H3N2血清型犬流感病毒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一種編碼流感病毒蛋白組分的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一種抵抗上述新型病毒的疫苗組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一種用于檢測(cè)H3N2血清型流感病毒的分析試劑盒，所述分析試劑盒包括本發(fā)明的病毒或其抗原決定簇。圖1顯示與流感病毒A/Dove/Korea/S11/03(H3N2)、A/Duck/Korea/S7/03(H3N2)和A/Chicken/Korea/S6/03(H3N2)的那些相比較，用流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)的NA基因編碼的完全氨基酸序列。圖2顯示與流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Dove/Korea/S11/03(H3N2)、A/Duck/Korea/S7/03(H3N2)和A/Chicken/Korea/S6/03(H3N2)的另，些相比較，用流感病毒A/Equine/Jilin/1/1989(H3N8)的HA基因編碼的完全氨基酸序列。圖3顯示與流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)、A/Canine/Korea/03/07(H3N2)、A/Dove/Korea/S11/03(H3N2)、A/Duck/Korea/S7/03(H3N2)和A/Chicken/Korea/S6/03(H3N2)的那些相比較，用流感病毒A/Equine/Jilin/1/1989(H3N8)的HA基因編碼的部分氨基酸序列。圖4顯示HA基因的進(jìn)化樹，根自流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)。圖5顯示NA基因的進(jìn)化樹，根自流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)。圖6是顯示用流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)進(jìn)行免疫的動(dòng)物和沒(méi)有用其進(jìn)行免疫的動(dòng)物一周內(nèi)體溫、抗體滴度和病毒后代產(chǎn)生的變化的圖。圖7顯示用流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)進(jìn)行免疫的動(dòng)物(免疫組B、D和F)和沒(méi)有用其進(jìn)行免疫的動(dòng)物(對(duì)照組，A和C)的器官和肺的組織病理?yè)p傷(A)侵襲性接種9天后對(duì)照組正常器官內(nèi)的偽復(fù)層柱狀上皮層(400倍放大)；(B)侵襲性接種9天后免疫組內(nèi)的壞死器官(n)、鱗狀上皮化(s)和結(jié)締組織上的上皮增生和慢性炎癥(c)(400倍放大);(C)侵襲性接種3天后對(duì)照組的正常肺泡(200倍放大)；(D)侵襲性接種3天后免疫組的支氣管腔內(nèi)嚴(yán)重?cái)U(kuò)散壞死性支氣管炎和膿性細(xì)支氣管炎(100倍放大)；(E)侵襲性接種6天后免疫組內(nèi)嚴(yán)重壞死性細(xì)支氣管炎(充滿分離的壞死性細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，并在細(xì)支氣管周圍觀察到輕度或中度慢性炎癥)(200倍放大)；(F)侵襲性接種9天后免疫組內(nèi)嚴(yán)重壞死性肺泡炎(H&E染色的肺泡管(ad)和肺泡(a)內(nèi)的壞死性細(xì)胞浸潤(rùn)(200倍放大))。具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明是關(guān)于新型的H3N2血清型犬流感病毒o根據(jù)本發(fā)明的新型H3N2血清型犬流感病毒，它具有由SEQIDNO.9的氨基酸序列或與其共有95%以上同源性的氨基酸序列表示的紅血球凝集素(HA)蛋白。當(dāng)與以前已知的馬流感病毒H3N8相比較時(shí)，根據(jù)對(duì)完全神經(jīng)氨酸苷酶(NA)氨基酸序列(圖l)和完全紅血球凝集素(HA)氨基酸序列(圖2)的分析，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的犬流感病毒的氨基酸序列具有極為特征性的變化。具體而言，A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)和A/Canine/Korea/03/07(H3N2)的HA氨基酸序列特征性地改變?yōu)樵谖恢?7具有N(天冬酰胺)、在位置127具有I(異亮氨酸)、在位置142具有T(蘇氨酸)、在位置176具有T(蘇氨酸)、在位置188具有N(天冬酰胺)、在位置209具有S(絲氨酸)、在位置212具有I(異亮氨酸)和在位置252具有I(異亮氨酸)(圖3)。與SEQIDNO.9的氨基酸序列共有至少95%同源性的氨基酸序列在位置97、127、142、176、188、209、212和252中的至少一個(gè)位置含有與SEQIDNO.9的氨基酸序列相同的氨基酸殘基。此外，根據(jù)本發(fā)明的新型H3N2血清型犬流感病毒，它具有由SEQIDNO.11的氨基酸序列或與其共有95%以上同源性的氨基酸序列表示的神經(jīng)氨酸苷酶(NA)蛋白。此外，根據(jù)本發(fā)明的新型犬流感病毒，其還可包含選自以下的蛋白由SEQIDNO.3的核苷酸序列編碼的非結(jié)構(gòu)性蛋白(NS)、由SEQIDNO.4的核苷酸序列編碼的基質(zhì)蛋白(M)、由SEQIDNO.5的核苷酸序列編碼的核蛋白(NP)、由SEQIDN0.6的核苷酸序列編碼的聚合酶(PA)、由SEQIDNO.7的核苷酸序列編碼的聚合酶蛋白2(PB2)、由SEQIDNO.8的核苷酸序列編碼的聚合酶蛋白1(PBl)及其組合。對(duì)于本文的紅血球凝集素或神經(jīng)氨酸苷酶，術(shù)語(yǔ)"同源性"用于指與野生型氨基酸序列的相似性。在本發(fā)明的流感病毒中表達(dá)的紅血球凝集素和神經(jīng)氨酸苷酶分別與SEQIDNO.9和SEQIDNO.11的氨基酸序列共有卯％以上、優(yōu)選95%以上、更優(yōu)選98%以上和最優(yōu)選99%以上的同源性。通常，蛋白同源物具有與其原型相同的活性位點(diǎn)。使用裸眼或使用軟件可進(jìn)行氨基酸序列之間的同源性比較。使用市售軟件可計(jì)算兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列之間的同源性并表示成百分?jǐn)?shù)。本發(fā)明的犬流感病毒包含A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)和A/Canine/Korea/03/07(H3N2)。流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)的蛋白顯示出與禽流感病毒的蛋白95.5-98.9%的同源性。例如，本發(fā)明的流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)與A/Dove/Korea/S11/03(H3N2)對(duì)于HA(紅血球凝集素)和NA(神經(jīng)氨酸苷酶)基因以及與A/Chicken/Nanchang/7-010/2000(H3N6)對(duì)于NS(非結(jié)構(gòu)性)基因共有最高的同源性。關(guān)于PB1(聚合酶堿性蛋白1)、PB2、PA(聚合酶)、NP(核蛋白)和M(基質(zhì))的基因，它們顯示出與香港、日本和中國(guó)發(fā)現(xiàn)的禽流感病毒較高的同源性。流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)于2007年9月19日保藏在位于Eoeun-dong，YusungGu,DaejeonCity,SouthKorea的KoreanResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(韓國(guó)生物禾斗學(xué)與生物技術(shù)研究所)，保藏編號(hào)為KCTC11205BP。流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)具有包含SEQIDNO.1的核苷酸序列的紅血球凝集素(HA)基因和包含SEQIDNO.2的核苷酸序列的神經(jīng)氨酸苷酶(NA)基因。SEQIDNO.9中給出了HA的完全核苷酸序列和其完全氨基酸序列，而SEQIDNO.11中給出了NA的完全核苷酸序列和其完全氨基酸序列。此外，NS基因含有SEQIDNO.3的核苷酸序列、M基因含有SEQIDN0.4的核苷酸序列、NP基因含有SEQIDNO.5的核苷酸序列、PA基因含有SEQIDN0.6的核苷酸序列、PB2基因含有SEQIDNO.7的核苷酸序列以及PB1基因含有SEQIDNO.8的核苷酸序列。本發(fā)明的流感病毒A/Canine/Korea/02/07(H3N2)具有包含SEQIDNO.13的核苷酸序列的HA基因和包含SEQIDNO.14的核苷酸序列的NA基因。發(fā)現(xiàn)這種病毒與流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)基本相同，因?yàn)閮煞N病毒之間的HA和NA核苷酸序列以及氨基酸序列經(jīng)分析共有98%的同源性。流感病毒A/Canine/Korea/02/07(H3N2)于2007年9月19日保藏在位于Eoeun-dong,YusungGu,DaejeonCity,SouthKorea的KoreanCollectionforTypeCultures(KCTC)ofKoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(韓國(guó)生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所的韓國(guó)典型菌種保藏中心)，保藏編號(hào)為KCTCU206BP。流感病毒A/Canine/Korea/03/07(H3N2)具有包含SEQIDNO.1的核苷酸序列的HA基因和包含SEQIDNO.16的核苷酸序列的NA基因。這種病毒經(jīng)鑒定與流感病毒A/Canine/Korea/02/07(H3N2)和流感病毒A/Canine/Korea/03/07(H3N2)基本相同，因?yàn)榱鞲胁《続/Canine/Korea/03/07(H3N2)和流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)之間的HA和NA核苷酸序列和氨基酸序列經(jīng)分析共有99%的同源性，并之間的HA和NA核苷酸序列和氨基酸序列經(jīng)分析共有98%的同源性。流感病毒A/Canine/Korea/03/07(H3N2)于2007年9月19日保藏在位于Eoeun-dong,YusungGu,DaejeonCity,SouthKorea的KoreanCollectionforTypeCultures(KCTC)ofKoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(韓國(guó)生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所的韓國(guó)典型菌種保藏中心)，保藏編號(hào)為KCTCU207BP。從韓國(guó)犬類鼻腔分離出來(lái)的根據(jù)本發(fā)明的犬流感病毒具有圖4和圖5中的進(jìn)化圖表顯示的進(jìn)化關(guān)系?；诹鞲胁《続/Canine/Korea/01/07(H3N2)，構(gòu)建HA基因和NA基因的圖4和圖5的進(jìn)化樹。如在HA和NA基因的這些進(jìn)化樹中所看到的，本發(fā)明的流感病毒和禽流感病毒形成了與從馬類和犬類分離出來(lái)的H3N8病毒所屬群不同的群。當(dāng)用于感染犬類時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的犬流感病毒顯示出致病性，引起發(fā)燒和肺炎，因此是韓國(guó)犬類的流行性病毒。當(dāng)給予抵抗本發(fā)明的犬流感病毒的疫苗時(shí)，發(fā)現(xiàn)犬類在極大程度上對(duì)病毒具有免疫性并由此抑制病毒的傳播和產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明是關(guān)于一種基因，所述基因編碼具有SEQIDNO.9的氨基酸序列或與其共有95%以上同源性的氨基酸序列的紅血球凝集素(HA)蛋白。優(yōu)選地，所述基因具有SEQIDN0.9的核苷酸序列。此外，本發(fā)明是關(guān)于一種基因，所述基因編碼具有SEQIDNO.11的氨基酸序列或與其共有95%以上同源性的氨基酸序列的神經(jīng)氨酸苷酶(NA)蛋白。優(yōu)選地，所述基因具有SEQIDNO.IO的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明關(guān)于一種疫苗組合物，其可提供對(duì)犬流感病毒的免疫力。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物包含犬流感病毒或其抗原作為活性成分。用于疫苗組合物的犬流感病毒選自A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)、A/Canine/Korea/03/07(H3N2)及其組合。用于本發(fā)明的抗原指的是病毒組分的抗原部分，它引起免疫應(yīng)答，并可包含具有與SEQIDNO.9的氨基酸序列或其片段共有90%以上同源性、優(yōu)選95。/。以上同源性的氨基酸序列的紅血球凝集素(HA)蛋白。與SEQIDNO.9的氨基酸序列共有至少95%同源性的氨基酸序列在位置97、127、142、176、188、209、212和252中的至少一個(gè)位置含有與SEQIDNO.9的氨基酸序列相同的氨基酸殘基。可選擇地，抗原可包含具有與SEQIDNO.11的氨基酸序列或其片段共有95n/。以上同源性的氨基酸序列的神經(jīng)氨酸苷酶(NA)蛋白。根據(jù)本發(fā)明的疫苗可包括減毒活疫苗或滅活疫苗、亞單位疫苗、合成疫苗和基因工程疫苗，優(yōu)選活疫苗，因?yàn)槠淠苷T發(fā)有效的免疫應(yīng)答。本文所用的術(shù)語(yǔ)"活疫苗"指的是從已經(jīng)減毒但仍可復(fù)制宿主生物體的細(xì)胞的病毒制備的疫苗。本文所用的術(shù)語(yǔ)"減毒"用于指以使基因喪失致病性、但保持抗原性的方式對(duì)涉及病原體基本代謝的基因進(jìn)行突變來(lái)人工降低病原體毒性。通常，通過(guò)UV輻射、化學(xué)處理或體外連續(xù)11高階繼代培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)減毒。外顯的基因改變，如使已知序列中的特定核苷酸缺失以提供毒性或?qū)⒑塑账岵迦氩《净蚪M中，也可能導(dǎo)致減毒。本文所用的術(shù)語(yǔ)"滅活疫苗"，也稱作失活疫苗，指的是用作抗原以產(chǎn)生免疫力的滅活病毒的混懸液。滅活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易地產(chǎn)生滅活疫苗。例如，通過(guò)用福爾馬林處理病毒可獲得全病毒疫苗。裂解型疫苗可在用醚處理后由病毒包膜制備得到。術(shù)語(yǔ)"亞單位疫苗"指的是包含通過(guò)提取從病毒性生物體分離出來(lái)的純化的抗原決定簇的疫苗。它比全病毒疫苗引起副反應(yīng)的可能性小。例如，從犬流感病毒提取的HA蛋白和/或NA蛋白可用于制備亞單位疫苗。術(shù)語(yǔ)"合成疫苗"指的是主要由化學(xué)合成抗原或基因工程抗原、抗原決定簇或肽組成的疫苗。例如，犬流感病毒的HA蛋白和/或NA蛋白可被合成用作疫苗?；蚬こ桃呙缈蓻](méi)有造成致病性的特定基因或可含有修飾的基因。此外，本發(fā)明的流感疫苗可與其他失活生物體或抗原組合使用以制備抵抗包括流感的各種疾病的混合疫苗或復(fù)合疫苗。本文所用的術(shù)語(yǔ)"混合疫苗"用于指從本發(fā)明的犬流感病毒與至少一種不同病毒的病毒混合物制備的疫苗。術(shù)語(yǔ)"復(fù)合疫苗"指的是從病毒和細(xì)菌制備的疫苗。例如，本發(fā)明的犬流感病毒可與犬仙臺(tái)病毒、犬瘟熱病毒、犬腺病毒和/或支氣管炎博德特菌(50^/￡^//06rawc/z/w/^ca)混合或組合。根據(jù)本發(fā)明的犬流感病毒疫苗可使用以下方法制備，該方法包括(a)將本發(fā)明的犬流感病毒注射到胚胎卵中并使病毒在其中增殖；(b)用福爾馬林、BPL(P-丙內(nèi)酉旨)或BEI(二乙烯亞胺)處理來(lái)自胚胎卵的尿囊液；以及收集來(lái)自化學(xué)處理的尿囊液的失活病毒。在步驟(a)中，將犬流感病毒注射到9-11天大的胚胎卵中并在30~40°C下孵育24~72小時(shí)。在步驟(b)中，使用常規(guī)方法從孵育的卵獲得尿囊液，用0.005~0.2(v/w)。/。的福爾馬林、BEI或BPL處理并在低溫下孵育以使病毒失活。在步驟(c)中，通過(guò)離心或過(guò)濾收集來(lái)自用福爾馬林、BEI或BPL處理的尿囊液的失活病母。然后，病母被吸附到氧氧化鉛/紐膠上。這種方法可包括眾所周知的技術(shù)或可改變?yōu)楦子趯?shí)施的形式。此外，本發(fā)明的疫苗組合物還可包含介質(zhì)、佐劑和/或賦形劑。生理鹽水或蒸餾水可用作介質(zhì)。用于疫苗組合物的佐劑的例子包括Freund的不完全佐劑或完全佐劑、氫氧化鋁凝膠、植物油或礦物油等。賦形劑的例子包括磷酸鋁、氫氧化鋁和硫酸鋁鉀，但不限于此。在實(shí)踐中，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于疫苗制備的所有物質(zhì)均可適用于本發(fā)明的疫苗組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物可包含25HAU(血凝(反應(yīng))單位)量的犬流感病毒。當(dāng)犬流感病毒以少于2SHAU的量使用時(shí)，疫苗不能有效誘發(fā)抗體產(chǎn)生。另一方面，超過(guò)2SHAU的量可能是不經(jīng)濟(jì)的。可將根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物制備成口服劑型或非口服劑型。優(yōu)選的是可通過(guò)皮內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或硬腦膜外途徑給予的非口服劑型。根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物適用于易感染A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)或A/Canine/Korea/03/07(H3N2)并作為宿主的所有受試者，包括人類、寵物、家禽和禽類，如狗、豬、雞、鴨、火雞等。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明是關(guān)于一種用于預(yù)防和治療流感病毒相關(guān)疾病的方法，所述方法包括將疫苗組合物給予有危險(xiǎn)的個(gè)體。本文所用的術(shù)語(yǔ)"流感病毒相關(guān)疾病"用于指由流感病毒感染引起的疾病。它的例子包括鼻竇炎、痙攣性孝喘、中耳炎、囊腫性纖維化、支氣管炎、肺炎、痢疾等(PitkarantaandHayden,1998.Ann.Med.)，但不限于此。本文所用的術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"用于指已經(jīng)感染或可能感染流感病毒的所有脊椎動(dòng)物(包括人類)。通過(guò)給予本發(fā)明的疫苗組合物，可有效地預(yù)防和治療疾病。例如，可用本發(fā)明的疫苗組合物來(lái)治療感染各種亞型或變型流感病毒的人。此外，為了預(yù)防流感，可用疫苗組合物使雞或豬免疫?？蓪⒈景l(fā)明的疫苗組合物與流感病毒相關(guān)疾病的常規(guī)治療組合給予。本文所用的術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"指通過(guò)給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物抑制流感病毒感染或推遲流感發(fā)作的所有行為。術(shù)語(yǔ)"治療"指通過(guò)給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物使流感病毒感染引起的癥狀減輕或轉(zhuǎn)好的所有行為。以藥物有效量給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物。本文所用的術(shù)語(yǔ)"藥物有效量"用于指以藥物治療的益處對(duì)危險(xiǎn)的合理比率來(lái)用于治療流感病毒相關(guān)疾病的量。本發(fā)明化合物的劑量取決于疾病的種類和嚴(yán)重性、藥物活性、藥物敏感性、給予次數(shù)和時(shí)間間隔、給予途徑、排泄率和本領(lǐng)域熟知的因素(包括例如同時(shí)使用的藥物等)。本發(fā)明的疫苗組合物可用作單一藥物或與其他藥物同時(shí)或順序組合使用，可以單劑量或多劑量給予。考慮到上面提到的因素，重要的是確定能引起最大治療作用而沒(méi)有不需要的副作用的劑量，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很容易。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明是關(guān)于一種用于檢測(cè)H3N2血清型流感病毒的分析試劑盒，所述分析試劑盒包括本發(fā)明的流感病毒或其抗原決定簇。通過(guò)抗原-抗體復(fù)合反應(yīng)，本發(fā)明的流感病毒或其抗原決定簇用于流感病毒的特定檢測(cè)，同時(shí)消滅被感染的細(xì)胞內(nèi)的流感病毒。這種分析試劑盒包括通常用于免疫學(xué)領(lǐng)域的工具/試劑和本發(fā)明的流感病毒。工具/試劑的例子包括適合的載體、產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物、增溶劑、洗滌劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑等，但不限于此。當(dāng)標(biāo)記物是酶時(shí)，所述試劑盒還可包括用于分析酶活和反應(yīng)終止物的底物。適合的載體例子包括但不限于可溶性的載體，如本領(lǐng)域熟知的生理上可接受的緩沖液(例如，PBS),不溶性的載體，如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟樹脂、交聯(lián)葡聚糖、多糖等，磁性微粒，如金屬被覆乳膠、紙、玻璃、金屬、瓊脂糖，以及它們的組合。關(guān)于抗原-抗體復(fù)合物形成的分析，其例子包括免疫組織化學(xué)染色、放射免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、Western免疫印跡、免疫沉淀分析、免疫擴(kuò)散分析、補(bǔ)體結(jié)合分析、FACS和蛋白芯片，但不限于此。定性或定量分析抗原-抗體復(fù)合物的標(biāo)記物的例子是酶、熒光劑、配體、發(fā)光劑、微粒、氧化還原分子和放射性同位素，但不受此限制。用作可檢測(cè)的標(biāo)記物的酶的例子包括P-葡萄糖苷酸酶、(3-D-葡萄糖苷酶、卩-D-半乳糖苷酶、脲酶、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDP酶的組合、核糖核酸酶、葡萄糖氧化酶和熒光素酶的組合、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸烯醇式丙酮酸脫羧酶和(3-內(nèi)酰胺酶，但不限于此。用于本發(fā)明的熒光劑的示例性的、非限制性的例子包括熒光素、異硫氰酸鹽、若丹明、phycoerytherin、藻青蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二甲醛和熒光胺。生物素衍生物可用作配體，但不限制本發(fā)明范圍。吖啶酯、蟲熒光素和熒光素酶用作發(fā)光劑，但所列舉的這些不用于限制本發(fā)明范圍。示例性的、非限制性的微粒包括膠體金、被覆的乳膠等。作為用于本發(fā)明的氧化還原分子，有二茂鐵、釕復(fù)合物、紫精、醌、鈦離子、銫離子、二酰亞胺、1,4-苯醌、氫醌、K4W(CN)8、[Os(bpy)3]2+、)3]2+和[MO(CN)8]4—，給出這些只用于示例性目的，但不用于限制本發(fā)明范圍。用于本發(fā)明的放射性同位素的例子包括311、14C、32P、35S、36C1、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131，186Re，但不限于此。實(shí)施例通過(guò)以下實(shí)施例可更好地理解本發(fā)明，所舉的實(shí)施例用于說(shuō)明、而不用于限制本發(fā)明。實(shí)施例l:樣本采集和病毒分離從在位于Kyeonggi-Do,Korea的獸醫(yī)院治療的犬類采集樣本一只是遭受3天流鼻涕和2天打噴嚏然后從流感恢復(fù)的5歲小型髯狗(MiniatureSchnauzer);—只是遭受發(fā)燒、咳嗽、流鼻涕和食欲不振并最終死亡的3歲英國(guó)可卡犬(CockerSpaniel);遭受嚴(yán)重咳嗽、發(fā)燒和流鼻涕并住院治療2天后死亡的一只約克郡犬(Yorkshireterrier)和兩只金刀犬(Jindo)。根據(jù)利用購(gòu)自Anigen的快速試劑盒和RT-PCR的分析，所有這些動(dòng)物被鑒定為均感染了A型流感病毒。未對(duì)這些犬類檢測(cè)其他病原體。將來(lái)自動(dòng)物的樣本(鼻分泌物)接種到ll天大的卵中，之后從其采集尿囊液。發(fā)現(xiàn)尿囊液使雞紅血球聚集。從動(dòng)物分離出來(lái)的病毒經(jīng)血清鑒定為H3N2型血清。這些病毒被命名為A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)和A/Canine/Korea/03/07(H3N2)，并于2007年9月19日保藏在位于Eoeun-dong,YusungGu,DaejeonCity,SouthKorea的KoreanCollectionforTypeCultures(KCTC)ofKoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(韓國(guó)生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所的韓國(guó)典型菌種保藏中心)，保藏編號(hào)分別為KCTCU205BP、KCTC11206BP和KCTCU207BP。實(shí)施例2:分離的病毒的遺傳特性通過(guò)基因分析來(lái)確定在實(shí)施例1中分離的病毒的遺傳特性。將使用TrizolLS從尿囊液分離的流感病毒總RNA用作使用隨機(jī)六聚體引物的RT-PCR的模板，接下來(lái)使用表1所示的引物進(jìn)行PCR。使用改進(jìn)的Primer3程序(WhiteheadInstitute/MTCenterforGenomeResearch)來(lái)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增H3、N2、PB1、PB2、PA、NP、M和NS基因的引物序列。將cDNA(2^1)與試劑混合物{2.5^11，10xTaqDNA聚合酶緩沖液、MgCl21.5mM、dNTPs(2.5mM/pl)2.0^il、每種引物(10pmol)1^1、TaqDNA聚合酶(Promega,USA)lnl"混合，并用蒸餾水將終體積調(diào)節(jié)到25|il以制備PCR混合物。在94°C下變性lOmin開始PCR，進(jìn)行在96°C下變性30sec、在53。C下退火30sec和在72。C下延伸2min的32個(gè)循環(huán)，接下來(lái)在72°C下延伸10min。在4°C下終止PCR。通過(guò)在含有溴化乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析所得的PCR產(chǎn)物。用Bioedit軟件分析所得的序列數(shù)據(jù)。表1PCR引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>將來(lái)自A/Canine/Korea/01/07(H3N2)的8個(gè)基因片段進(jìn)行堿基排序并與基因庫(kù)的基因(SEQIDNO.1~12)相比較。發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的病毒與以前已知的禽流感病毒具有95.598.9%同源性(表2)。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的病毒對(duì)于HA和NA基因與韓國(guó)分離的Sll共有最高的同源性，而對(duì)于NS基因與從中國(guó)雞類分離的菌株共有最高的同源性。關(guān)于PB1、PB2、PA、NP和M基因，在本發(fā)明的病毒與香港、日本和中國(guó)分離的禽流感病毒之間檢測(cè)出較高的同源性。在本發(fā)明的病毒A/Canine/Korea/01/07、A/Canine/Korea/02/07和A/Canine/Korea/03/07中，發(fā)現(xiàn)HA和NA基因具有98%~99%的同源性，這表明它們基本相同。表2犬流感病毒的基因同源性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例3:分離病毒的進(jìn)化使用群對(duì)齊算法和MEGALIGN軟件(DNASTAR,Madison,WI)確定A/Canine/Korea/01/07在進(jìn)化樹中的位置。從HA和NA基因的觀點(diǎn)來(lái)看，本發(fā)明的病毒經(jīng)鑒定屬于與以前從馬類和犬類分離出來(lái)的H3N8病毒群不同的群，并且顯示出與韓國(guó)分離的H3N2病毒非常近的遺傳關(guān)系(圖4和圖5)。實(shí)施例4:分離的病毒的致病性分析為了檢驗(yàn)其致病性，將A/Canine/Korea/01/07(H3N2)接種到犬類體內(nèi)。將10只10周齡的比格犬(beagle)分成7只的試驗(yàn)組和3只的對(duì)照組。將HA滴度為1:64(1()69EID5o/0.1ml)的分離病毒(2ml)鼻內(nèi)和口服給予試驗(yàn)組的7只比格犬，而將沒(méi)有病原體的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水，2ml)鼻內(nèi)和口服給予對(duì)照組的3只比格犬，接下來(lái)監(jiān)控臨床癥狀7天。從接種當(dāng)天起，使用RT-PCR對(duì)通過(guò)排泄和流鼻涕進(jìn)行的病毒排出監(jiān)控10天。使用以重組NP(核蛋白)為抗原的競(jìng)爭(zhēng)型ELISA(AnimalGeneticsInc.Korea)進(jìn)行血清研究。按照OIE的建議，為了檢測(cè)重組NP的抗體，對(duì)血清樣品也進(jìn)行分析。為了觀察病理?yè)p傷，在接種3、6和9天后各用lml甲苯噻嗪使試驗(yàn)組的兩只比格犬和對(duì)照組的1只比格犬經(jīng)受安樂(lè)死并驗(yàn)尸。在接種后的27天，觀察比格犬遭受包括打噴嚏和流鼻涕的臨床癥狀。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照組比格犬的直腸溫度保持在39°C，但接種24小時(shí)后，試驗(yàn)組比格犬平均上升到40.14°C(圖6)。接種前所有實(shí)驗(yàn)犬中病毒的血清試驗(yàn)均為陰性，試驗(yàn)組的比格犬在實(shí)驗(yàn)中仍保持陰性。ELISA顯示接種6天后試驗(yàn)組比對(duì)照組的抑制百分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出，表明產(chǎn)生了抗體。有趣的是，接種8天后，發(fā)現(xiàn)接種的比格犬HI滴度為1:80。在接種后6天內(nèi)于接種的比格犬的鼻分泌物中均發(fā)現(xiàn)病毒，但在排泄物中沒(méi)有檢測(cè)到。通常，感染1天后，犬流感病毒開始從犬體內(nèi)排出并且在感染4天后達(dá)到滴度為10"EID5o/0.1ml的峰值。發(fā)現(xiàn)組織病理?yè)p傷限于肺部。大組織學(xué)上，在上呼吸道(支氣管)和下呼吸道(細(xì)支氣管和肺泡)發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的壞死損傷。盡管在程度上略有不同，但是在所有接種的比格犬中均發(fā)生細(xì)支氣管炎和支氣管炎(圖7)。因此，分離的病毒經(jīng)鑒定在犬體內(nèi)為致病性的，引起體溫升高和肺炎。此外，發(fā)現(xiàn)病毒在6天內(nèi)排出。實(shí)施例5:疫苗制備將新分離的犬流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)接種到10天的胚胎卵的尿囊膜中。3天后，采集尿囊液作為病毒堆。向該病毒堆加入0.2%福爾馬林，接下來(lái)在室溫下孵育24小時(shí)使其失活。將病毒堆重新接種到胚胎卵中后，當(dāng)沒(méi)有檢測(cè)到病毒后代時(shí)，確定病毒堆失活。將失活的病毒堆濃縮到25HAU以上。通過(guò)在10，000rpm下攪拌10min，使該病毒堆與氫氧化鋁凝膠以7:3的比率混合。病毒陰性試驗(yàn)之后，將混合物用作疫苗。實(shí)施例6:預(yù)防接種后的侵襲性接種以0.5ml的劑量將制備的疫苗皮下注射到10周齡的10只比格犬體內(nèi)，3周后以相同方式另外注射。第二次注射兩周后，以2ml的劑量通過(guò)口服或鼻內(nèi)途徑將HA滴度為h64(10"EID5o/0.1ml)的分離的病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)侵襲性接種到比格犬體內(nèi)。作為對(duì)照，在侵襲性接種前，將PBS接種到3只比格犬體內(nèi)。在實(shí)驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行體溫、病毒產(chǎn)生、臨床癥狀和抗體滴度的監(jiān)控。即使在接種后，預(yù)防接種的比格犬仍沒(méi)有表現(xiàn)出體溫變化、沒(méi)有排出病毒后代并且沒(méi)有顯示出臨床癥狀。相反，對(duì)照組在接種一周內(nèi)體溫升高(表3)。PCR顯示病毒后代從對(duì)照組的全部3只比格犬體內(nèi)排出，但沒(méi)有從接種6天后的任何一只體內(nèi)排出(表4)。此外，觀察到對(duì)照組遭受包括流鼻涕和咳嗽(如犬窩咳(ke皿elcough)或濕排痰性咳(wetproductivecough))的臨床癥狀。關(guān)于抗體滴度，在以對(duì)預(yù)防接種的比格犬進(jìn)行侵襲性接種7天后為開始的實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)于核蛋白的ELISA抗體和紅血球凝集素的HI抗體，抗體滴度開始增加(表5)。然而，對(duì)照組從侵襲性接種7天后開始，則是核蛋白和紅血球凝集素的抗體的滴度開始增加。因此，發(fā)現(xiàn)預(yù)防接種的比格犬能抵制侵襲性接種，表明本發(fā)明的疫苗組合物可用作抵抗流感病毒的疫苗。表3侵襲性接種后預(yù)防接種和未預(yù)防接種的動(dòng)物的體溫(在第21天進(jìn)行加強(qiáng)接種，在第35天進(jìn)行侵襲性接種)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*PCR陽(yáng)性數(shù)/PCR試驗(yàn)數(shù)表4侵襲性接種后病毒從預(yù)防接種和未預(yù)防接種的動(dòng)物的排出(在第21天進(jìn)行加強(qiáng)接種，在第35天進(jìn)行侵襲性接種)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*1值為正表5侵襲性接種后預(yù)防接種和未預(yù)防接種的動(dòng)物的抗體滴度(在第21天進(jìn)行加強(qiáng)接種，在第35天進(jìn)行侵襲性接種)200780029971.7<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>工業(yè)實(shí)用性如本文所述，本發(fā)明提供新型的犬流感病毒和抵抗它們的疫苗。因?yàn)槟苷T發(fā)對(duì)犬流感病毒的有效免疫，因此所述疫苗用于預(yù)防和治療犬類和由犬類繼發(fā)性感染的個(gè)體的流感病毒相關(guān)疾病。盡管為了說(shuō)明已經(jīng)公開了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解在沒(méi)有偏離所附權(quán)利要求公開的本發(fā)明范圍和精神的條件下，可作出各種修改、添加和替代。權(quán)利要求1.一種H3N2血清型流感病毒，它具有由SEQIDNO.9的氨基酸序列或與其共有95％以上同源性的氨基酸序列表示的紅血球凝集素(HA)蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H3N2血清型流感病毒，其中與SEQIDNO.9的氨基酸序列共有至少95%同源性的氨基酸序列在位置97、127、142、176、188、209、212和252中的至少一個(gè)位置含有與SEQIDNO.9的氨基酸序列相同的氨基酸殘基。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H3N2血清型流感病毒，它具有由SEQIDNO.11的氨基酸序列或與其共有95%以上同源性的氨基酸序列表示的神經(jīng)氨酸苷酶(NA)蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的H3N2血清型流感病毒，其還包含選自以下的蛋白由SEQIDNO.3的核苷酸序列編碼的非結(jié)構(gòu)性蛋白(NS)、由SEQIDNO.4的核苷酸序列編碼的基質(zhì)蛋白(M)、由SEQIDNO.5的核苷酸序列編碼的核蛋白(NP)、由SEQIDNO.6的核苷酸序列編碼的聚合酶(PA)、由SEQIDNO.7的核苷酸序列編碼的聚合酶堿性蛋白2(PB2)、由SEQIDNO.8的核苷酸序列編碼的聚合酶堿性蛋白1(PBl)及其組合。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H3N2血清型流感病毒，其保藏編號(hào)為KCTC11205BP。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H3N2血清型流感病毒，其保藏編號(hào)為KCTC11206BP。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H3N2血清型流感病毒，其保藏編號(hào)為KCTC11207BP。8.—種核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求1所述的紅血球凝集素(HA)的氨基酸序列。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核苷酸序列，其由SEQIDNO.9的核苷酸序列表示。10.—種核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求3所述的神經(jīng)氨酸苷酶(NA)的氨基酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的核苷酸序列，其由SEQIDNO.11的核苷酸序列表示。12.—種流感病毒疫苗組合物，其包含權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的病毒或其抗原決定簇作為活性成分。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的流感病毒疫苗組合物，其適用于犬類。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的流感病毒疫苗組合物，其還包含氫氧化鋁凝膠或油作為佐劑。15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的流感病毒疫苗組合物，其還包含不同于所述活性成分的至少一種病原體。16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的流感病毒疫苗組合物，其中所述疫苗組合物是一種減毒活疫苗。17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的流感病毒疫苗組合物，其包含25HAU以上量的所述流感病毒。18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的流感病毒疫苗組合物，其中所述抗原決定簇為權(quán)利要求1或2所述的紅血球凝集素(HA)或其抗原片段，并且含量為卯％以上。19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的流感病毒疫苗組合物，其中所述抗原決定簇為權(quán)利要求3所述的神經(jīng)氨酸苷酶(NA)或其抗原片段，并且含量為90%以上。20.—種用于預(yù)防或治療由流感病毒感染引起的疾病的方法，所述方法包括將權(quán)利要求12所述的流感病毒疫苗組合物給予感染流感病毒的個(gè)體。21.—種用于檢測(cè)H3N2血清型流感病毒的分析試劑盒，所述分析試劑盒包括權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的病毒或其抗原決定簇。全文摘要本文公開了新型流感病毒A/Canine/Korea/01/07(H3N2)、A/Canine/Korea/02/07(H3N2)和A/Canine/Korea/03/07(H3N2)。還公開了一種包含至少一種所述病毒的疫苗組合物、一種通過(guò)給予所述疫苗組合物來(lái)預(yù)防或治療由流感病毒感染引起的疾病的方法以及一種用于檢測(cè)所述病毒的分析試劑盒。文檔編號(hào)C12N15/33GK101605898SQ200780029971公開日2009年12月16日申請(qǐng)日期2007年11月16日優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日發(fā)明者吳鎮(zhèn)植,姜東奭,姜普圭,宋錞燮,李澈承,河健雨,趙榮植申請(qǐng)人:韓國(guó)安捷公司