專利名稱：與y染色體相關的精細胞表面抗原結構的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及存在于精細胞(精子)上并且與Y染色體相關的抗原 結構，以及針對該抗原結構的分子，特別是抗體或抗體的部分。
本發(fā)明還涉及使得能夠表征在細胞特別是精細胞(精子)中Y染 色體的存在的方法。
本發(fā)明還涉及一種方法，所述方法通過分離出已確定為雄性并攜 帶Y染色體的精細胞來表征哺乳動物(包括人)的后代的性別，并且 基于利用該抗原結構與針對該抗原結構的優(yōu)選地經(jīng)標記的分子(特別 是經(jīng)標記的抗體)之間的相互作用。
作為本發(fā)明基礎的技術背景和現(xiàn)有技術
在雜交育種和人工授精(AI)的自然條件下，后代的性別比例大 約為50°/。的雄性(XY)和50°/。的雌性(XX)。
長期以來，農(nóng)民和其他動物育種者就表達了他們的愿望提高產(chǎn) 生具有所選擇的性別的后代的概率(優(yōu)選通過在哺乳動物授精之前選 擇攜帶Y染色體或攜帶X染色體的精細胞)。
除了顯而易見的生理學方面的考慮外，按照性別來選擇后代還具 有重要的經(jīng)濟意義，當在生產(chǎn)動物性食品(羊的、牛的和豬的)方面 考慮這些應用時，以及當在動物(特別是馬和狗)竟賽的范圍內(nèi)考慮 這些應用時。
已采取了各種不同的技術方向以在哺乳動物中實現(xiàn)性別選擇，這 既是為了在物種的動物技術方面的意義，也是為了那些瀕臨滅絕的物 種，以及還為了家畜和為了人類的輔助生殖。為此存在有兩種備選方案將攜帶X染色體的精細胞與攜帶Y染色體的精細胞分開；或者在 再植入之前確定胚胎的性別。
在人類中，選擇胚胎的性別牽涉強烈的倫理學約束，這一約束可 通過性別鑒定而被消除。精細胞的性別鑒定還可以具有臨床應用，以 在人類中預防與X染色體連鎖的疾病，例如迪謝納肌營養(yǎng)不良、血友 病A或B、視網(wǎng)膜脫色素、萊-尼綜合征或脆性X綜合征(其導致精神 發(fā)育遲緩)(ZARUTSKIE等人，1989 )。存在大約6000種遺傳異常， 而其中超過370種與X染色體連鎖(C0TIN0T等人，1993; JOHNSON 等人，1993 )。
已進行了各種嘗試以實現(xiàn)根據(jù)性別來選擇后代。那些在獲得所需 結果方面顯得最令人感興趣的嘗試已被導向進行X或Y精細胞的獲取 和選擇。
為了能夠有效，任何分離技術應當利用X精細胞和Y精細胞之間 的表型差異。將攜帶X染色體的精子與攜帶Y染色體的精子相分開， 有賴于檢測這些表型之間的至少一種差異。在這種背景下，已基于X 精細胞和Y精細胞之間各種明顯的差異(化學的或物理的)(例如熒 光、大小、質(zhì)量、密度、游動速度、對pH的敏感性、對Sephadex的 附著等的差異)進行了分離試驗。
還已提出了攜帶Y染色體的精子與攜帶X染色體的精子的免疫學 分離方法。
專利US 4448767描述了一種方法，該方法需要形成針對能夠區(qū)分 X細胞與Y細胞的特異性細胞表面標記物的抗體。
已經(jīng)使用H-Y抗原作為標記物來分開攜帶X染色體或Y染色體的 精細胞(Ali等人，1990; Peter等人，1993 )。然而，其他研究者報 導，他們使用H-Y抗原標記物不能分離X型或Y型細胞(Hendriksen 等人，1993; Sins等人，1998 )。目前的共識是，H-Y抗原不能夠允 許分開攜帶X染色體或Y染色體的細胞。
專利US 5660997描述了性連鎖的膜蛋白(SAM蛋白)的用途。這 些SAM蛋白的特征在于具有在SDS聚丙烯酰胺凝膠(PAGE )上測定的
5特定分子量，和通過在pH梯度凝膠上停止移動(IPG)而測定的等電 點(PI )。在Chinchilla狗中，SAM-X蛋白具有分別為19 kDa、 25 kDa、 29 kDa、 32 kDa、 39 kDa、 72 kDa和120 kDa的分子量，而Y染色體 的SAM蛋白具有15 kDa、 45 kDa、 55 kDa、 64 kDa和125 kDa的分 子量。
然而，該專利申請沒有給出該方法有效性的數(shù)據(jù)，而且沒有給出 證據(jù)證明這些特征性的蛋白質(zhì)確實與細胞的X或Y染色體連鎖，以及 因而所述連鎖在哺乳動物物種中具有顯著的性比偏離。
專利US 5021244描述了特異性地結合在攜帶X染色體(X-SAM) 的細胞的膜上的抗體。所述抗體(優(yōu)選單克隆抗體)基本上沒有能夠 與這樣的膜蛋白相結合的抗體，所述膜蛋白與Y染色體相關或與H-Y 抗原相關，或與存在于細胞質(zhì)膜上的性別非特異性組分相關。
專利申請CA 1341328描述了與性別相關的膜蛋白，其中包括一種 分子量為9. 6 kDa和等電點為6. 58的蛋白質(zhì)。
發(fā)明目標
本發(fā)明旨在提供新型精細胞表面抗原結構，其與Y染色體相關， 并且使得能夠區(qū)分攜帶Y染色體的精細胞(精子)與攜帶X染色體的 細胞。
本發(fā)明還旨在提供特異性地針對該抗原結構的優(yōu)選地經(jīng)標記的分 子，特別是經(jīng)標記的抗體，例如單克隆抗體或其部分，以便利用該抗 原結構和這些分子之間的相互作用來特異性地標記這些細胞，并且還 為了能夠區(qū)分和任選地分開僅攜帶Y染色體的細胞與其他細胞(攜帶 X染色體和/或任選地攜帶Y染色體)。本發(fā)明還涉及通過所述經(jīng)區(qū)分的細胞來進行哺乳動物授 精的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及特異于Y染色體的精細胞(精子)表面抗原結構，其 具有小于15 kDa，優(yōu)選小于10 kDa的分子質(zhì)量，更特別地具有5至 10kDa的分子質(zhì)量，以及大于9，優(yōu)選約9至約11，更特別地約9至 約10的等電點。優(yōu)選地，該抗原結構具有分別約5 kDa的分子質(zhì)量和 約9. 35的PI，約7 kDa的分子質(zhì)量和約9. 07的PI，或者約10 kDa
的分子質(zhì)量和大于或等于10的PI。
該抗原結構的特異性可以通過Western印跡法來測定，所述 Western印跡法特異性地和唯一地標記僅存在于Y染色體上的該目的 抗原結構。
因此，本發(fā)明的首要目標涉及使用本發(fā)明的目的抗原結構來相對 于不表達Y染色體的細胞(僅包含X染色體的細胞)而言特異性地標 記表達Y染色體的細胞。
該分析可以通過對細胞的表面進行標記而在活細胞上進行，或者 例如通過Western印跡法在細胞提取物上進行。
本發(fā)明的另一個方面涉及優(yōu)選地經(jīng)標記且針對(和特異于)該抗 原結構的分子。
優(yōu)選地，這些分子為(特異性地)針對該抗原結構的經(jīng)標記的抗 體或者這些抗體的高變且特異的部分。這些分子還可以是 nanobodies ,其是一類新型類別的源自抗體的治療性蛋白質(zhì)。這些分 子的實例為來自駱駝科(Camelidae)的抗體的衍生物，其沒有抗體的 特異性輕鏈但保留了 (特異性地)結合抗原的完整能力。因此，有可 能獲得僅由抗體末端的可變結構域部分構成的nanobodies (www, ablynx. com) e
優(yōu)選地，所述抗體為單克隆抗體。
本發(fā)明的另一個方面涉及能夠產(chǎn)生這些抗體或這些抗體的高變且 特異的部分的(雜交瘤)細胞。
本發(fā)明還涉及(性別鑒定)診斷試劑盒，其包含特異性地針對該 抗原結構的所述分子(任選地經(jīng)標記的)，特別是所述抗體或所述抗體的高變部分，以及用于表征這些抗原結構和(特異性地)針對這些 抗原結構的所述分子之間的相互作用的所有介質(zhì)和試劑。
這些介質(zhì)和試劑例如為洗滌溶液和針對(特異于)該抗原結構的 所述分子的標記成分(例如比色的、發(fā)光的、化學發(fā)光的、生物發(fā)光 的、熒光的或放射性的標記物)。這些介質(zhì)和試劑還可以包括能夠與 針對(特異于)該抗原結構的所述分子相互作用的固體支持物。能夠 與這些分子相互作用的固體支持物為珠粒、瓊脂糖珠或金屬珠(特別
是磁珠)，其具有適當?shù)拇笮?約50nm至約4或9jum)從而可以有 效地結合和標記活細胞，并隨后從精細胞混合物中分離出特異地攜帶 Y染色體的精細胞。
本發(fā)明的試劑盒還可以包含用于證明由所述經(jīng)區(qū)分的精子所攜帶 的染色體的性別特征的工具。這些工具由X染色體或者Y染色體的特 異基因的基因擴增試劑盒構成。這些工具優(yōu)選地由使得能夠進行基因 擴增的引物、酶和反應介質(zhì)構成，所述基因擴增通過選自PCR、 LCR 或NASBA的方法來進行。
本發(fā)明的試劑盒還可以用于確認其他的細胞分離手段(通過物理 的、化學的或生物技術的方法)是否有效。因此，本發(fā)明的試劑盒可 以用作用于證明在細胞上或在細胞提取物中存在Y染色體的工具。
本發(fā)明的另一個方面涉及包含特異性地針對本發(fā)明的抗原結構的 所述分子的固體支持物，所述分子以直接或間接的方式(通過一對分 子(結合對)例如生物素和鏈霉抗生物素蛋白/ (或)抗生物素蛋白的 相互作用)固定在固體支持物的表面上，并且能夠通過所述抗原結構 和所述分子之間的相互作用而特異性地結合包含Y染色體的精細胞。
所述固體支持物可以例如由色鐠柱、多孔板、珠粒(其大小優(yōu)選 為約50nm至約4Mm或約9pm，優(yōu)選約100至約400或約500納米) (特別是磁珠)的固體支持物構成，其允許細胞的該抗原結構和針對 (特異于)該抗原結構的分子之間的相互作用，這使得能夠區(qū)分和有 利地使得能夠分開各種不同類別的細胞(分開僅攜帶Y染色體的細胞 與其他細胞(攜帶X染色體的細胞，和任選地，攜帶Y染色體的其他
8細胞))。
本發(fā)明還涉及用于通過利用該抗原結構和針對(特異于)該抗原 結構的這些分子(特別是這些抗體或其部分)之間的相互作用來區(qū)分
(非治療性的)和任選地分開攜帶Y染色體或X染色體的細胞的方法。 本發(fā)明的方法包括下列步驟
-在適合于獲得所述抗原結構和所述分子之間的特異性相互作用 (結合或標記)的條件下，使精細胞與(特異性地)針對本發(fā)明抗原 結構的分子或本發(fā)明的固體支持物(包含所述分子)接觸，所述抗原 結構是Y染色體所特異性的并且存在于所述細胞的表面上；
-通過所述分子和所述抗原結構之間的相互作用而結合或標記攜 帶Y染色體的細胞，所述標記過程通過由于存在于細胞表面上的所述
^:得; ，丄'、 、 曰
-任選地，分開被所述分子結合或標記的細胞與未被所述分子結 合和/或標記的細胞；
-任選地，收集被結合或標記的細胞，或者其他細胞(未被結合 和未被標記且主要攜帶X染色體)；和
-任選地，用所述細胞對哺乳動物進行一次或幾次授精(非治療 性的)(用經(jīng)收集的且僅攜帶Y染色體的所述細胞對哺乳動物進行授 精)，以及任選地，用經(jīng)收集的且主要攜帶X染色體的其他細胞對哺 乳動物進行一次或幾次授精(非治療性的)。
根據(jù)本發(fā)明，針對(特異于)所述抗原結構的分子為抗體(優(yōu)選 單克隆抗體)或者抗體的高變部分。這些抗體可以通過比色的、發(fā)光 的、化學發(fā)光的、熒光的或放射性的標記成分直接或間接地進行標記。 該標記過程可以是直接或間接的標記。
直接標記是指標記物(比色的、發(fā)光的、熒光的、放射性的)在 所述分子上，優(yōu)選在所述抗體上共價結合。
間接標記是指第一分子與已結合至該標記物的第二分子結合。例 如可以使第一分子(為抗體)與(特異性地)針對一抗的恒定部分的第二分子(二抗)發(fā)生反應，所述二抗優(yōu)選與比色的、發(fā)光的、化學 發(fā)光的、熒光的或放射性的標記物，能夠產(chǎn)生該標記物的酶，或者固 體支持物(珠粒)共價結合。
在本發(fā)明的方法中，細胞的表征是通過使本發(fā)明的分子與細胞進 行接觸來獲得的。該操作在這樣的介質(zhì)中進行，所述介質(zhì)允許所述細 胞存活且還使得能夠消除任何的組分干擾，所述組分可能干擾所述細 胞和針對(特異于)細胞的該抗原結構的所述分子之間的相互作用。
分開和收集僅攜帶Y染色體的細胞和其他細胞的步驟借助于用與 該抗原結構相互作用的分子對細胞進行標記來施行。優(yōu)選地，該分開 步驟可以固體支持物(優(yōu)選地，磁珠)上進行，在所述固體支持物上 固定有所述細胞可能與之相互作用的所述分子。
允許洗脫未被結合或未被標記的其他細胞的介質(zhì)使得能夠獲得有 效的分開。分開和任選地收集被結合或標記的細胞這一步驟是本領域 技術人員已知的。
還通過本領域技術人員熟知的方法來進行下述步驟用僅包含Y 染色體的細胞對哺乳動物進行授精，和/或任選地，用主要包含僅攜帶 X染色體的細胞(和任選地，更低比例的攜帶Y染色體的細胞)的精 液對哺乳動物進行授精。
術語"主要包含僅攜帶X染色體的細胞的精液"是指這樣的事實 大于約50%，優(yōu)選大于約75%,更特別地大于約90%或約95%的比例的 細胞僅攜帶X染色體。
通過這些授精步驟，可能獲得僅為雄性的后代，或者基本上為雌 性，優(yōu)選地僅為雌性的后代。
可授精的哺乳動物優(yōu)選為對于生產(chǎn)動物性食品而言重要的哺乳動 物，例如羊、牛和豬(優(yōu)選牛)，但也可以是諸如馬、兔、狗或貓的 家畜或者屬于瀕臨滅絕的物種的哺乳動物。所述哺乳動物還可以是靈 長類，包括人，尤其是其雙親為X染色體連鎖遺傳疾病攜帶者的受試 者，所述X染色體連鎖遺傳疾病例如為迪謝納肌營養(yǎng)不良、血友病A 或B、視網(wǎng)膜脫色素、萊-尼綜合征或脆性X綜合征(其導致精神發(fā)育遲緩)。
本發(fā)明的方法可以任選地與將攜帶Y染色體或X染色體的細胞分 開的其他方法相結合，例如基于與攜帶X染色體的細胞或攜帶Y染色 體的細胞相關的化學或物理差異的分離方法，所述化學或物理差異例 如為熒光、大小、質(zhì)量、密度、游動速度、對pH的敏感性、對Sephadex 的附著等的差異。
本發(fā)明方法的各個不同步驟可以任選地與在全體所選擇的細胞上 或在其樣品上進行的細胞性別的特異表征步驟相組合，以確保這些細
胞表征步驟以最佳方式進行。
該表征步驟可以例如由下列構成 一個或多個基因擴增步驟(通 過PCR、 LCR、 NASBA ...)，或者一個或多個給細胞添加一種或多種 特異于X染色體或Y染色體的標記物的步驟。
根據(jù)本發(fā)明，針對該抗原結構(特異于該抗原結構)的分子還可 以是能夠破壞所述細胞的分子，例如裂解性抗體或者這樣的分子，所 述分子包含能夠被特異性地識別的標記物并且使得能夠通過適當?shù)氖?段(激光)來破壞攜帶所述表面抗原結構(即與Y染色體相關的精細 胞表面抗原結構)的經(jīng)標記的細胞。
因此，該方法可如此進行修改，即借助于經(jīng)由特異性地針對本發(fā) 明的所述抗原結構的分子或者經(jīng)由使得能夠只特異性地消除經(jīng)標記的 細胞的手段(激光)破壞經(jīng)標記的細胞，來分開被所述分子結合或標 記的細胞與未被所述分子結合或標記的其他細胞。隨后，該方法將包 括收集未被結合和未被標記的且主要攜帶X染色體的細胞；和任選地， 僅用這些未被結合和未被標記的細胞來對哺乳動物進行授精。
通過參考附圖，在以本發(fā)明方法的非限制性舉例說明方式給出的 下面的實施方案中將更詳細地描述本發(fā)明。
附圖簡述
3_1_顯示了細胞的總蛋白質(zhì)組分析，其使得能夠分離出特異于Y型細胞的蛋白質(zhì)級分(級分F)。
圖2顯示了該蛋白質(zhì)級分的三種同種型，其特征為它們在電泳凝 膠上的分子量.
圖3顯示了用本發(fā)明的抗體來進行的精細胞體內(nèi)免疫定位的標記 過程。圖3中顯示了經(jīng)標記的和未標記的細胞。
發(fā)明詳述
1. 獲得特異的蛋白質(zhì)級分
對借助于人工陰道例如從牛中獲取以便隨后進行稀釋并在PUC麥 管(paillettes enPUC)中冷藏處理的精子進行總蛋白質(zhì)組分析，這 使得能夠分離出特異于Y型細胞的蛋白質(zhì)級分(級分F)(

圖1)。
該蛋白質(zhì)級分包含三種同種型
-分子質(zhì)量分別為5、 7和10 kDa。
2. 獲得抗體
將經(jīng)鑒定的級分注射給兩只兔子以獲得抗體。
3. 驗證抗體的特異性
已就其特異性測試了包含多克隆抗體的兔血清所進行的 Western印跡法清楚地表明，該多克隆抗體特異于攜帶Y染色體的精 細胞，因為只有以50/50從雄性和雌性細胞中提取的蛋白質(zhì)級分與血 清發(fā)生反應。
按照"堿性磷酸酶綴合底物試劑盒"17016432 (BI0-RAD)的供應 商的指示，通過1: 500比例的一抗稀釋物來實施該實驗方案。
將無性別以及性別為X的細胞的蛋白質(zhì)提取物置于12. 5%的丙烯 酰胺電泳凝膠上；將此細胞提取物轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，在4X:下將膜 用TBST溶液(含有0. 15%Tween-20的Tris緩沖鹽水)飽和過夜。在 用TBST洗滌三次后，將膜與以用TBST稀釋至的適當稀釋度(即1/500 )
12進行測試的兔血清(通過注射目的色譜級分而獲得的)反應1小時30 分鐘。在用TBST再次洗滌三次后，在根據(jù)供應商的方案在TBST緩沖 液中進行稀釋后，添加用堿性磷酸酶標記的山羊"抗兔免疫球蛋白" 抗體(例如Biorad的產(chǎn)品170-6460 )并保持2小時，再次進行三次 洗滌，接著在沒有Tween-20的TBS中進行最后一次洗滌，并根據(jù)供應 商的指示(Biorad的170-6432 )添加5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽和 氮藍四唑，直至獲得結果。陽性結果相應于在膜上在目的蛋白質(zhì)的位 置處出現(xiàn)底物沉淀。
在圖2上觀察到3條蛋白質(zhì)條帶，它們只在包含攜帶混合的X和 Y染色體的細胞的提取物中出現(xiàn)，而在包含僅攜帶X染色體的細胞的 蛋白質(zhì)提取物中不出現(xiàn)條帶。
4,驗證該蛋白質(zhì)的細胞定位精細胞上的免疫定位實驗方案 生物材料由以存活狀態(tài)獲取和使用的細胞構成。將500 pi新鮮
精液在4ml處于37TC的稀釋劑中進行稀釋。在帶至4X:之前，讓精液
慢慢恢復至環(huán)境溫度。
5.在活細胞上的免疫定位(在Eppendorf管中)
-抽取300 ju 1經(jīng)稀釋的精液并置于無菌Eppendorf管中;
—以1: 50的最終稀釋度添加一抗；
-在4TC下溫育4小時至過夜，不時進行搖動；
一以600 g離心2分鐘；
-除去上清液；
-加1 ml稀釋劑以漂洗和懸浮細胞； -以600 g離心2分鐘； -除去上清液；
-在500ju 1稀釋劑中重懸浮細胞； —以1: 50的最終稀釋度添加二抗； -在環(huán)境溫度下溫育1至2小時或者在4'C下溫育過夜；-以600 g離心2分鐘； —除去上清液；
-添加1 ml稀釋劑以進行漂洗； -以600 g離心2分鐘； -除去上清液；
-在300 ml中重懸浮粒狀沉淀； -取20ju 1置于栽玻片上； -放置載玻片； —在熒光顯微鏡下觀察。
并非所有以5 0/5 0的比例包含X型和Y型細胞的精液樣品的細胞 都被標記。看起來標記分布按35至50°/。的被抗體標記的細胞這樣的比 率來進行。
在進行允許抗體附著的處理后，細胞仍是活的，不論是否被抗體 結合、標記。
因此，本發(fā)明的抗體特異于Y型細胞的表面(圖3)。在圖3中， 標記出現(xiàn)在圖的灰色部分，白色部分表示細胞。
6. 細胞亞群的獲得
純化血清的抗體以便去除兔血清蛋白質(zhì)，特別是白蛋白。 實驗方案按照"蛋白A抗體純化試劑盒"PURE-1A試劑盒 (SIGMA-ALDRICH)的供應商的指示來進行。
使純化的抗體固定在磁珠上?；谒隹贵w對于攜帶Y染色體的 精子的表面蛋白質(zhì)的特異性，將這些固定在珠粒上的抗體用于制備精 細胞的亞群。按照DYNAL， dynabeads M450 epoxy試劑盒的供應商的 指示來施行該實驗方案。
7. 產(chǎn)生兩個亞群的操作程序
在獲取后盡可能快地使用細胞。將細胞在允許保持細胞的完整性 并同時允許抗體附著的稀釋劑中進行稀釋(以2xlQ7個細胞/ml)。使細胞與抗體接觸30分鐘，所述抗體或者直接偶聯(lián)(接枝)到磁珠(大 小為約50至約500 mn或約9jam，優(yōu)選約100至約400或500 nm)上， 或者借助于結合包含在血清中的所述抗體的二抗(山羊抗兔抗體)而 間接偶聯(lián)到這些珠粒上，該接觸于約41C至約25X:的溫度在輕輕搖動 下和于約41C至約25E的溫度進行12。然后，將與配備有磁珠的抗體 相附著的細胞置于磁場中以便保留下Y型細胞。回收含有X細胞的上 清液。這樣，上清液的精細胞可供人工授精使用。
8. 驗證兩個經(jīng)表征的細胞亞群的性別
在所述兩個細胞群體(結合和未結合在珠粒上的)中進行每種性
別的細胞比例的驗證測試。這包括擴增X染色體或Y染色體所特異的
基因。對這兩個群體的構成所進行的該驗證測試使得能夠比較在所述 兩個群體中每種細胞類型的比例。
理論上認為，從所進行的觀測來看，被保留的群體，即所謂的Y 型細胞，只包含攜帶Y染色體的細胞。然而，包含在上清液中的細胞 群體，即所謂的X型細胞，主要表現(xiàn)為X型細胞，但還包含一定比例 的攜帶Y染色體的細胞。這是因為，根據(jù)原位免疫定位的觀測，看來 并非所有Y型精子都在其表面上攜帶所述抗原。這些觀測表明，所述 目的結構存在于精子的頭部區(qū)域和鞭毛的第二部分區(qū)域內(nèi)。
將包含在上清液中的細胞群體用于人工授精。所獲得的胚胎的性 別鑒定給出了下面的在性比方面的結果(在進行中)。
9. 在牛中用精子進行授精的方法
在-196t:的液氮中，將根據(jù)本發(fā)明的方法選擇出的細胞保存在薄 壁PUC麥管中。
將所述麥管引入輸精槍(pistolet)(—次性的覆蓋有塑料的金 屬管)中，所述輸精槍包含能夠?qū)Ⅺ湽苤兴囊后w推出的活塞。 該輸精槍使得能夠通過手工操作將細胞注射進位于兩個子宮角底部處 的子宮頸中。
權利要求
1. 精細胞表面抗原結構，其與Y染色體相關，并且具有5kDa至12kDa的分子量和大于9的等電點。
2. 根據(jù)權利要求1的抗原結構，其特征在于，所述抗原結構的等 電點在9和11之間。
3. 根據(jù)權利要求1的抗原結構，其特征在于，所述抗原結構具有 5 kDa的分子量和9. 35的等電點，7 kDa的分子量和9. 7的等電點， 或者10 kDa的分子量和大于或等于10的等電點。
4. 特異性地針對根據(jù)權利要求1至3的抗原結構的分子。
5. 根據(jù)權利要求4的分子，其特征在于，所述分子是抗體或抗體 的高變部分。
6. 根據(jù)權利要求5的分子，其特征在于，所述分子是單克隆抗體。
7. 性別鑒定試劑盒，其包含根據(jù)前述權利要求4至6中任一項的 分子，和任選地，根據(jù)權利要求1至3的抗原結構。
8. 固體支持物，其包含根據(jù)前述權利要求4至6中任一項的分子， 所述分子固定在所述固體支持物的表面上。
9. 根據(jù)權利要求8的固體支持物，其特征在于，所述固體支持物 包括珠粒，優(yōu)選》茲珠。
10. 根據(jù)權利要求8的固體支持物，其特征在于，所述固體支持 物包括直徑為50 nm至9jum,優(yōu)選100 nm至400 nm的珠粒。
11. 用于區(qū)分攜帶Y染色體的精細胞與攜帶X染色體的精細胞的 方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟-使所述細胞與根據(jù)前述權利要求4至6中任一項的分子或者根據(jù) 權利要求8至10中任一項的固體支持物接觸，在適合于獲得所述分子 或所述固體支持物和權利要求1至3的抗原結構之間的結合的條件下；-通過所述分子和所述抗原結構之間的相互作用而結合或標記攜 帶Y染色體的細胞；-任選地，分開被所述分子標記或結合的分子與未被所述分子標記或結合的細胞；-任選地，收集被標記或結合的細胞，或者未被標記和未被結合的 細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及與Y染色體相關的精細胞表面抗原結構；針對該抗原結構的分子，特別是抗體；以及使得能夠通過該抗原結構與針對該結構的分子之間的相互作用來表征僅攜帶Y染色體的細胞的方法。
文檔編號C12N5/00GK101501074SQ200780029988
公開日2009年8月5日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權日2006年6月22日
發(fā)明者L·列格奧伊斯, S·杜邦-德威爾 申請人:基因擴散公司