專利名稱：：檢測血液樣品中egfr突變的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及個體血液(血清/血漿)樣品中EGFR突變的檢測。
背景技術：
：在男性和女性中，肺癌均是癌相關死亡的主要原因。肺癌的患病率僅次于男性的前列腺癌和女性的乳腺癌。最近肺癌超過心臟病成為吸煙相關死亡的主要原因。此外，患有肺癌的大部分患者吸煙，并且其心臟和肺受到吸煙相關的損害，使選擇積極手術或者綜合治療不太可行。大部分肺癌是在晚期被診斷的，造成預后較差。非小細胞肺癌(NSCLC)占全部肺癌的大約75%。NSCLC是組織的異質聚集。最常見的組織結構是表皮樣癌或者鱗狀癌、腺癌和大細胞癌。已經(jīng)進行了數(shù)項研究來鑒定臨床、實驗室和分子標志物，以幫助臨床醫(yī)生和研究人員區(qū)分NSCLC患者的亞組。按照這個線索，已經(jīng)證明40-80%的非小細胞肺癌和許多其他上皮癌中表皮生長因子受體(EGFR)過表達。異常的表皮生長因子受體(EGFR)信號轉導對于限制針對抗癌劑的敏感性非常重要，而不依賴于配體的EGFR酪氨酸激酶激活常常是由胞外結構域的EGFR突變引起的，在各種腫瘤類型諸如多形性膠質母細胞瘤中已經(jīng)觀察到所述突變。EGFR信號轉導是由生長因子諸如表皮生長因子(EGF)的結合引發(fā)的。受體通過其酪氨酸激酶結構域的自體磷酸化和轉磷酸作用導致下游效應物的募集，以及增殖信號和細胞存活信號的激活。兩種突變占據(jù)了迄今為止報道的肺腺癌EGFR突變的約90%。在白種人中，最常見的突變類型是外顯子19中9、12、15、18或者24個核苷酸的短的框內缺失，這在大約65。/。的EGFR突變病例中可以觀察到。第二種最常見的突變(可以在大約35。/。的EGFR突變病例中觀察到)是外顯子21中核苷酸2573的點突變(CTG到CGG),導致密碼子858(L858R)的亮氨酸被精氨酸取代，所述密碼子858接近于激酶活化環(huán)中羧基端小葉的DFG基序。這些EGFR突變純粹是NSCLC的體細胞突變，并沒有在其他原發(fā)腫瘤類型中鑒定出。此外，EGFR突變是非小細胞肺癌(NSCLC)中對吉非替尼(gefitinib)的腫瘤反應的主要決定因素。關于外顯子18、20和21中其他不太常見的突變也有描述。到目前為止，對這些突變的篩選基于直接測序或者單鏈構象多態(tài)性分析。核酸擴增方法(例如，聚合酶鏈式反應)允許在正常分子的背景下檢測少量突變分子。盡管檢測少量腫瘤細胞的替代方法(諸如流式細胞術)通常限于血液惡性腫瘤，但在惡性細胞鑒定和化療后的預后預測方面，核酸擴增分析法被證明具有靈敏性和特異性。已經(jīng)開發(fā)出各種檢測實體瘤組織中少量突變分子的核酸擴增策略。例如，一種鑒定突變ras原癌基因DNA的靈敏和特異性方法基于無法切割關鍵的第12密碼子的限制性位點(Kahn"a/.RapidandsensitivenonradioactivedetectionofmutantK-rasgenesvia'enriched'PCRamplifkation(通過"富集"PCR擴增對突變K-ras基因的快速和靈敏的非放射性檢測).Oncogene.1991Jun;6(6):1079-83)。類似的實驗步驟可被用于檢測腫瘤中DNA的任意突變區(qū)，允許檢測其他原癌基因DNA或者肺瘤相關的DNA。因為不僅可以在原發(fā)癌，而且可以在前體病灶和轉移部位中檢測到突變的DNA，所以核酸擴增分析法提供了在疾病早期及晚期檢測和監(jiān)測癌癥的方法。其他研究利用核酸擴增試驗分析癌癥患者的外周血，以檢測從患者的循環(huán)癌細胞中提取的胞內DNA。但是，必須強調這些研究嘗試用基于核酸的擴增試驗來檢測從循環(huán)癌細胞內提取的胞內DNA。所述分析利用全血內的細4包沉淀或者細胞對癌癥患者血液的細胞部分進行，而血清或者血漿部分在分析前通常被忽視或者丟棄。因為這類方法需要轉移性循環(huán)癌細胞的存在(對于非血液腫瘤來說)，所以它在癌癥早期患者中的臨床使用受到限制，而且它不能用于檢測非血液、非侵襲性的腫瘤或者癌前狀態(tài)。在現(xiàn)有技術中已知小的但數(shù)量顯著的正常DNA在健康人的血液中循環(huán)，但在癌癥狀態(tài)發(fā)現(xiàn)所述數(shù)量增加?，F(xiàn)有技術公開了可以在癌癥患者的外周血血漿或者血清中檢測到突變的原癌基因DNA。但是，這些報道通常也只限于患有晚期癌癥或者已知腫瘤性或者增殖性疾病的患者。一些作者(Kimura"a/"2006.EGFRMutationofTumorandSeruminGefitinib-TreatedPatientswithChemotherapy-NaiveNon-smallCellLungCancer(用吉非替尼治療的患有初次接受化療的非小細胞肺癌的患者的腫瘤和血清中的EGFR突變))描述了在NSCLC患者的血清樣品中能夠檢測到EGFR基因的突變。所述文獻描述了利用位于所述突變側翼的引物，通過PCR和測序>^測這類突變。發(fā)明概述本發(fā)明涉及在個體血液樣品中檢測EGFR基因突變的方法，所述方法包括(i)從所述樣品獲得DNA;(ii)利用蛋白-核酸探針，通過PCR擴增對應于EGFR基因特異區(qū)域的核酸序列；和(iii);險測所述突變。本文中，發(fā)明人開發(fā)和證實了用于檢測血漿/血清樣品中最常見EGFR突變的基于聚合酶鏈式反應(PCR)的分析法。利用蛋白-核酸(PNA)探針，通過增強待分析樣品中突變等位基因的擴增，該分析法提供比標準方法更高的分析靈敏度，其中使用所述突變側翼的引物進行PCR擴增以及進一步的測序分析。因此，本文提供有效和可獲得的方法來快速鑒定大部分肺癌患者，所述患者有可能對特異性EGFR抑制劑產(chǎn)生應答。此外，盡管肺瘤組織的直接分析常常是困難或者不可能的(諸如潛伏的、未被認定的疾病)，如上所述的方法在利用血液諸如外周血4企測所述突變方面具有優(yōu)勢。外周血可以輕易獲得，并適于基于核酸的分5析。發(fā)明詳述為了便于理解本說明書，將在下面解釋本發(fā)明范圍內一些術語和表達的含義術語"個體"表示任意年齡或者種族的男性或者女性人類。優(yōu)選地，它包括患有或者被懷疑患有非小細胞肺癌(NSCLC)的人。對于醫(yī)學領域的普通技術人員來說，NSCLC的診斷方法和NSCLC診斷的臨床描述是公知的。例如，鑒定被懷疑患有NSCLC的個體的方法可以包括身體檢查、個體的家族病史，個體的病史，肺活檢，或者大量成像技術諸如超聲檢查。術語"核酸"涉及包括核苷或者核苷類似物的多體化合物，所述核苷或者核芬類似物具有含氮雜環(huán)堿基或者堿基類似物，它們通過磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸。術語"DNA"是指脫氧核糖核酸。DNA序列是脫氧核糖核苷酸序列。DNA是核苷酸的長聚合物，利用遺傳密碼編碼蛋白的氨基酸殘基序列。術語"蛋白-核酸探針"是指合成的DNA類似物，其中磷酸二酯骨架被N-(2-氨基乙基)甘氨酸的重復單元取代，嘌呤和嘧啶堿基通過曱基羰基連接子與其連接。一方面，本發(fā)明涉及方法，在本文中被稱為"本發(fā)明的方法"，用于在個體的血液樣品中;f企測EGFR基因的突變，所述方法包括(i)從所述樣品獲得DNA;(ii)利用蛋白-核酸探針，通過PCR擴增對應于EGFR基因特異區(qū)域的核酸序列；和Ciii)4企測所述突變。本發(fā)明的方法可用于檢測EGFR基因的任意突變。在本發(fā)明的特定實施方式中，待檢測的EGFR基因突變選自外顯子19的ELREA缺失，外顯子21的L858R突變和外顯子21的T7^)M突變。6岸品說明但非限制性的樣品(從中可以提取核酸并利用本發(fā)明的方法進行分析)實例包括，但不限于，正常和癌性血液(血清或者血漿)以及其他包含可一全測核酸的體液。為了實施本發(fā)明的方法，從被研究的個體處獲得樣品。在特定實施例中，所述樣品是血液樣品?？梢詮南惹霸\斷患有或者不患有NSCLC的個體，或者從正在接受或者先前已經(jīng)接受抗NSCLC治療的個體處獲得樣品。在一個實施方式中，所述樣品是來自具有正常肺功能組織的個體的樣品，即，沒有NSCLC證據(jù)的個體。在實施本發(fā)明時，通過標準方法將血液采集到收集管，其優(yōu)選地包括硅化玻璃，不含用于血清制備的抗凝劑，或者包含用于血漿制備的EDTA、肝素或者類似的抗凝劑，最優(yōu)選的是EDTA。任選地，隨后可以讓抗凝血漿與等體積的氯化釣在37。C孵育較短時間(最優(yōu)選的1-3分鐘)直到出現(xiàn)凝血，從而將血漿轉化為血清。然后通過短暫離心沉淀凝塊，將脫去蛋白質的血漿轉移到另一個管?？蛇x擇地，離心可以被省略。還可以利用促凝劑管(clotactivatortubes)獲得血清。DAC4f增在本發(fā)明的特定實施方式中，血清或者血漿可以直接用于突變DNA的鑒定。在另一個特定實施方式中，從血漿或者血清提取核酸作為本發(fā)明的起始步驟。在這種情況下，從所述樣品提取的總DNA將代表適于后續(xù)擴增的工作材料。一旦獲得樣品后，就可以進行核酸的擴增。在特定實施方式中，通過PCR實現(xiàn)DNA的擴增。核酸擴增和;險測(諸如利用PCR)的一般原理和條件是本領域技術人員公知的。特別地，通過本發(fā)明方法實施的聚合酶鏈式反應(PCR)使用合適并且特異性的寡核苷酸引物或者擴增寡核苷酸來特異性擴增EGFR靶序列。說明但非限制性的，這類擴增寡核苷酸的實例包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的序列。術語"寡核苷酸引物，，或者"擴增寡核苷酸"在本文中的使用沒有差別，是指通常低于1,000個殘基的聚合核酸，包括大小范圍的下限為大約2到5個殘基和上限為大約500到900個殘基的聚合核酸。在優(yōu)選的實施方式中，寡核芬酸引物大小范圍的下限為大約5到大約15個殘基，上限為大約100到200個殘基。更優(yōu)選的，本發(fā)明寡核苷酸引物大小范圍的下限為大約IO到大約15個殘基，上限為大約17到100個殘基。盡管可以從天然存在的核酸純化寡核苷酸引物，但它們通常是利用各種公知的酶法或者化學法中的任意一種合成的。在本發(fā)明的特定實施方式中，這類寡核苷酸引物能夠特異性擴增DNA片^殳，所述DNA片段對應于EGFR基因外顯子19的特定核苷酸缺失。因此，在特定實施方式中，本發(fā)明的方法可以用于^f企測外顯子19的ELREA缺失。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及檢測EGFR基因外顯子19中9、12、15、18或者24個核苷酸的缺失。在另一個特定實施方式中，本發(fā)明的方法可以用于才企測EGFR基因外顯子21的L858R突變。在另一個特定實施方式中，本發(fā)明的方法可以用于檢測EGFR基因外顯子21的T790M突變。術語"擴增寡核苷酸"是指與靶核酸或者其互補序列雜交并且參與核酸擴增反應的寡核苷酸。擴增寡核苷酸包括引物和啟動子-引物，其中利用另一核酸鏈作為模板，酶延伸所述寡核苷酸的3'端。在一些實施方式中，擴增寡核苷酸包含至少大約IO個連續(xù)堿基，和優(yōu)選的大約12個連續(xù)堿基，所述堿基與靶序列(或者其互補鏈)區(qū)互補。靶結合堿基與其結合的序列優(yōu)選的至少大約80%互補，和更優(yōu)選的大約90%到100%互補。擴增寡核芬酸優(yōu)選的長大約IO到大約60個石咸基，可以包括修飾的核苷酸或者石威基類似物。術語"擴增(amplify)"或者"擴增(amplification)"是指產(chǎn)生靶核酸序列或者其互補序列或者其片段(即，擴增產(chǎn)物可以包含不完整的靶序列)多拷貝的步驟。例如，利用與靶核酸的內部位置雜交并從此起始聚合的擴增寡核苷酸，通過擴增所述靶核酸的一部分來產(chǎn)生片段。已知的擴增方法包括，例如，聚合酶鏈式反應(PCR),復制酶介導的擴增，連接酶鏈式反應(LCR)擴增，鏈置換擴增(SDA)以及轉錄相關或者轉錄介導的擴增(TMA)。PCR擴增使用DNA聚合酶、相反鏈的引物和熱循環(huán)來合成DNA或者cDNA的多拷貝。復制酶介導的擴增使用QB-復制酶來擴增RNA序列。LCR擴增通過利用雜交、連接和變性的循環(huán)，使用至少4種不同的寡核苷酸來擴增靶的互補鏈。SDA使用引物(包含限制性核酸內切酶的識別位點)和核酸內切酶(在包含靶序列的半修飾DNA雙鏈體的一條鏈上產(chǎn)生切口)，繼之以一系列引物延伸和鏈置換步驟。不依賴于核酸內切酶切口的等溫鏈置換擴增方法也是已知的。轉錄相關或者轉錄介導的擴增使用包含啟動子序列的引物和對所述啟動子特異的RNA聚合酶以從靶序列產(chǎn)生多轉錄本，從而擴增靶序列。本發(fā)明優(yōu)選的實施方式在聚合酶鏈式反應(PCR)擴增中利用所述擴增寡核苷酸來擴增EGFR靶序列。本領域技術人員將理解這些擴增寡核苷酸可以非常方便的用于其他核酸擴增方法，所述擴增方法使用聚合酶介導的引物延伸。在本發(fā)明方法的擴增步驟中，利用蛋白-核酸(PNA^笨針通過PCR擴增對應于EGFR基因特異區(qū)的核酸序列。PNA探針是核酸類似物，其中天然核酸的糖磷酸骨架被合成肽骨架(通常由N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單位形成)取代，產(chǎn)生非手性和不帶電荷的模擬物。這種新分子是化學穩(wěn)定的，并且抗水解(酶)切割，因此預期不會在活細胞內降解。盡管這些都不同于天然核酸，但PNA仍然能夠遵從Watson-Crick氫鍵鍵合規(guī)則，序列特異性的結合DNA以及RNA。其雜交復合物顯示極高的熱穩(wěn)定性，并展示獨特的離子強度性質。在許多應用中，相對于核酸探針更優(yōu)選PNA探針，因為與在低鹽條件下不穩(wěn)定的核酸/核酸雙鏈不同，PNA/核酸雙體在非常低的鹽條件下形成并且保持穩(wěn)定。核酸雜交領域的普通技術人員都知道通常用于施加或控制雜交嚴謹性的因素包括甲酰胺濃度(或者其他化學變性試劑)，鹽濃度(即，離子強度)，雜交溫度，去污劑濃度，pH以及離液劑的存在與否。通常用公知的設定上述幾種嚴謹性因素，然后確定改變單個嚴謹性因素的影響的技術，來發(fā)現(xiàn)探針/靶序列組合的最適嚴謹性。除了PNA的雜交基本不依賴于離子強度之外，可以調節(jié)相同嚴謹性因素從而控制PNA和核酸雜交的嚴謹性。通過檢查各種嚴謹性因素直到實現(xiàn)所需鑒別度，就可以用實驗方法確定分析的最適嚴謹性。利用例如(曱基-二苯曱基)胺聚苯乙烯樹脂作為固相支持物，按照肽的標準固相合成步驟(Merrifield，B.1986.Solid-phasesynthesis(固相合成).Science232,341-347)可以制備PNA寡聚物。PNAs可以包含嵌合結構，諸如PNA/DNA嵌合體，其中PNA寡聚物與DNA寡聚物融合。除了具有突變等位基因的DNA分子外，臨床樣品還包含具有野生型等位基因的DNA分子。所以，在正常情況下，在野生型EGFR基因(野生型等位基因)的大背景下，很難檢測到EGFR突變(突變等位基因)。在特定情況下，本發(fā)明人使用的PNA探針能夠特異性識別并雜交野生型EGFR序列。作為說明但非限制性的實例，用于實施本發(fā)明方法的PNA探針包括在本發(fā)明所附實施例中SEQIDNO:3所示的PNA探針。將這類探針添加到PCR反應混合物中，從而抑制野生型等位基因的擴增，促進樣品中存在的突變等位基因即EGFR突變體的擴增，有利于其之后的檢測。本領域普通技術人員將理解合適的PNA探針不是必須具有完全一樣的所述探針核酸序列才能有效，而是可以根據(jù)特定的分析條件進行改變。例如，如果需要改變雜交的穩(wěn)定性從而降低Tm和/或調整嚴謹性，則可以通過核酸序列的截短來制備更短的PNA探針。類似地，只要區(qū)別核酸序列仍位于PNA探針序列內，則核酸序列可以在一端被截短，而在另一端延伸。本文所述參數(shù)內探針核酸序列的這類變化被認為是本發(fā)明的實施方式。如本發(fā)明的實施例1中可以觀察到，在本發(fā)明方法中應用的利用這類PNA探針的聚合酶鏈式反應條件使得只要40個擴增循環(huán)就足以荻得包括120bp基因組片段的精確PCR擴增產(chǎn)物，所述基因組片段包括EGFR基因外顯子19的目標突變。本發(fā)明方法中PCR的常規(guī)條件顯示于本發(fā)明的實施例1。在該實施例中，用于PCR擴增反應的DNA來自于血漿/血清樣品。先前已經(jīng)公開了用于檢測和分析PCR擴增產(chǎn)物的許多方法。特別地，可以采用本領域:技術人員已知的大量方法中的任意一種進行DNA10序列突變的岸全測(Kilgerefa/.,1997,NucleicAcidsRes.25:2032-4)。在本發(fā)明的特定實施方式中，通過核酸測序進行本發(fā)明方法的檢測步驟。說明但非限制性的核酸測序方法的實例是循環(huán)測序(Sarkar"a/.,1995，NucleicAcidsRes.23:1269-70)或者直接雙脫氧核苦酸測序，其中從樣品收集的部分或者完整目標DNA被用作測序反應的模板。對目標基因或者DNA特異的寡核苷酸引物或者引物組被用于標準測序反應?？梢允褂闷渌鸇NA測序的方法，諸如雜交測序，利用包含許多用于雜交的寡核苷酸的"芯片"進行測序(諸如由AffymetrixCorp.制造的^^、片；Ramsaya/.,1998,NatureBiotechnology16:40-44;Marshalla/,,1998，NatureBiotechnology16:27-31)，HPLC測序(DeDionisio""/.,1996，JChromatogrA735:191-208)，和DNA測序策略的變化諸如多重等位基因特異性診斷分析(MASDA;ShuberWa/.，1997，Hum.Molec.Genet.6:337-47),雙脫氧指紋法(Sarkar"a/.，1992，Genomics13:441-3;Martincic1996，Oncogene13:2039-44),和基于熒光4罙針的PCR方法(i者力口Taqman;Perkin隱ElmerCorp.;HeidWa/.,1996，GenomeRes.6:986-94)以及基于裂解酶的方法?？蛇x擇地，可以利用被適當標記的引物進行擴增，而擴增的引物延伸產(chǎn)物可以利用檢測所述標記的步驟和裝置來檢測。優(yōu)選的本發(fā)明的探針用至少一種可檢測的部分標記，其中所述可4企測的一個或多個部分選自偶聯(lián)物，分枝檢測系統(tǒng)，生色團，熒光團，自旋標記物，放射性同位素，酶，半抗原，吖啶酯和發(fā)光化合物。作為說明但非限制性的實例，在本發(fā)明方法中使用的引物可以用熒光團標記。更特別的，本發(fā)明方法的反向引物在其5'端用6-FAM熒光團標記。該熒光團發(fā)射峰值波長為522nm的熒光。可以通過用例如FAM、HEX、VIC或者NED染料標記的引物之一來進行PCR。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式中，如本發(fā)明所附實施例所示，隨后對本發(fā)明方法擴增的DNA的檢測和分析是通過GeneScan技術進行將PCR反應物等分試樣(通常是1pl)添加到9pl曱酰胺HI-DI和0.25|ilGeneScan標志物-500LIZ大小標準品。變性后，將樣品置于ABI3130遺傳分析儀中，進行毛細管電泳。利用GeneScan軟件分析原始數(shù)據(jù)。這種分析是非常重要的，因為將根據(jù)樣品中的大小標準品外推出PCR產(chǎn)物的大小。利用該技術，本發(fā)明人能夠以非常精確和準確的方式檢測到目標突變。本發(fā)明還通過下列實施例進行說明，所述實施例用于顯示本發(fā)明的某些實施方式，但不應被理解為限制本發(fā)明。實施例1遞過Ge/iMc朋確定五OF及差厲/A^"f"時^Xi^v4^關材泮+和方法將每位個體的靜脈血(IOml)放入包含50mmolEDTA(乙二胺四乙酸)每升的管中，然后按照制造商的說明書，利用QIAmpDNA血液小量試劑盒(Qiagen，Germany)分離基因組DNA。2-Ge"^Sca"A,雀備1.1-材料-AbiPrism3130DNA分析儀(Perkin-Elmer，AppliedBiosystems)畫96孔光反應板(AppliedBiosystems，產(chǎn)品目錄號4306737)1.2-包含PNA探針的PCR反應混合物如下制備PCR反應混合物-2.5pl緩沖液1Ox(Ecogen)-0.5|il50mMMgCl2(Ecogen)-0.625(il10mMdNTPs(P醒ega)-1.25|ul10(iM各種引物-0.1|ulTAQ聚合酶(Ecogen)-12.5pi5mMPNA探針(AppliedBiosystems)-來自血清或者血漿的5iliIDNA12-添加無菌蒸餾水至終體積25nl。1.3-不含PNA探針的PCR反應混合物如下制備PCR反應混合物畫2.5|ul緩沖液1Ox(Ecogen)-0.5pi50mMMgCl2(Ecogen)-0.625)al10mMdNTPs(Promega)-1.25pi10iuM各種引物-0.1piTAQ聚合酶(Ecogen)-來自血清或者血漿的5|LilDNA-添加無菌蒸餾水至終體積25|iil。反向引物用6-FAM熒光團(6-FAM發(fā)射峰值波長為522nm的熒光)標記。正向引物ACTCTGGATCCCAGAAGGTGAG(SEQIDNO:1)反向引物6-FAM-CCACACAGCAAAGCAGAAACTC(SEQIDNO:2)PNA探針序列Ac-AGATGTTGCTTCTCTTA(SEQIDNO:3)1.3-PCR程序如下進行PCR:95。C5分鐘，然后是40個循環(huán)95。C30秒，58。C30秒和72°C1分鐘，最后在72。C延伸5分鐘。3-G^"eSca"涼備-9fil曱酰胺HI畫DI(AppliedBiosystems)畫0.25piGeneScan標志物-500LIZ大小標準品(AppliedBiosystems)畫lpl稀釋的PCR終產(chǎn)物樣品在93。C變性3分鐘，在冰上冷卻10分鐘。然后將樣品進行毛細管電泳，隨后接受494nm的激發(fā)波長，在ABI3130DNA分析儀上檢測522nm的發(fā)射波長。結果通過GeneScan總共分析了41份血清/血漿樣品，以;險測外顯子19的缺失。所有被分析的樣品都來自腫瘤組織具有陽性突變的患者。GeneScan分析結果顯示，55%的樣品(腫瘤組織具有陽性突變)經(jīng)Genescan分析也是陽性的(表1)。肺瘤的EGFR突變S/P陽性S/P陰性N-41N=22(55%)N=19(45%)男性88女性1411埃洛替尼(Erlotinib)一線1211二線108從不吸煙者1512曾吸煙者76吸煙者01血液提取物治療前169治療后58未知12CR+PR1+121+6SD+PD0+12+0表1.患者(其腫瘤組織具有陽性突變)的血清/血漿中EGFR外顯子19突變分析。實施例2遞過確定五GF/差厲#^"f2/時丄S5Si才才沖+和方法7-脊品僅桌將每位個體的靜脈血(IOml)放入包含50mmolEDTA(乙二胺四乙酸)每升的管中，然后按照制造商的說明書，利用QIAmpDNA血液小量試劑盒(Qiagen，Ge腿ny)分離基因組DNA。142-^:^Y5vi^爽活'/4為N^1.1-材料-AB7000或者7900HT(AppliedBiosystems)1.2-包含PNA探針的PCR反應(5'核酸酶活性分析)混合物如下(表2)制備PCR反應混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表2如下進行PCR:60。C變性2分鐘，繼之50個循環(huán)95。C10分鐘，然后是50個循環(huán)95°C15秒和60°C1分30秒。3-//氛探《伸授j檢測野生型序列的探針用焚光染料VIC標記，而檢測突變等位基因的探針用熒光染料FAM標記正向引物AACACCGCAGCATGTCAAGA(SEQIDN0:4)反向引物TTCTCTTCCGCACCCAGC(SEQIDNO:5)用熒光染料VIC標記的檢測野生型等位基因的探針VIC-TCACAGATTTTGGGCTGGCCAAAC-TAMRA(SEQIDNO:6)用熒光染料FAM標記的檢測突變等位基因的探針6-FAM-CAGATTTTGGGCGGGCCAAAC-TAMRA(SEQIDNO:7)PNA探針AGTTTGGCCAGCCCA(SEQIDNO:8)結果通過GeneScan總共分析了41份血清/血漿樣品，以檢測L858R的突變。所有被分析的樣品都來自腫瘤組織具有陽性突變的患者。5'核酸酶活性分析結果顯示，55。/。(L858R)的樣品(腫瘤組織具有陽性突變)經(jīng)這種分析也是陽性的(表3)。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例3遞過r^附朋及^"確定五C7F/f差西#崖f27^T7卯M材津牛和方法7-斧品炎桌將每位個體的靜脈血(IOml)放入包含50mmolEDTA(乙二胺四乙酸)每升的管中，然后按照制造商的說明書，利用QIAmp⑧DNA血液小量試劑盒(Qiagen,Germany)分離基因組DNA。2隱ra《ma"^;^Y5'凝^錄活'/i為、^^1.1-材料-AB7000或者7900HT(AppliedBiosystems)1.2-包含PNA探針的PCR反應(5'核酸酶活性分析)混合物按照實施例2所述(參見表2)制備PCR反應混合物。如下進行PCR:60。C2分鐘，繼之50個循環(huán)95。C10分鐘，然后是50個循環(huán)95°C15秒和60°C1分30秒。3-〃參，一泉^^^尸7V^檢測野生型序列的探針用熒光染料VIC標記，而檢測突變等位基因的探針用熒光染料FAM標記。正向引物AGGCAGCCGAAGGGC(SEQIDN0:9)反向引物CCTCACCTCCACCGTGCA(SEQIDNO:10)用熒光染料VIC標記的檢測野生型等位基因的探針VIC-TGAGCTGCGTGATGA-MGB(SEQIDNO:11)用熒光染料FAM標記的檢測突變等位基因的探針6-FAM-TGAGCTGCATGATGA-MGB(SEQIDNO:12)PNA探針TCATCACGCAGCTC(SEQIDNO:13)結果總共分析了4份血清/血漿樣品。所有被分析的樣品都來自腫瘤組織具有陽性突變的患者。5'核酸酶活性分析結果顯示，75%(T7卯M)的樣品(腫瘤組織具有陽性突變)經(jīng)這種分析也是陽性的(針對T790M的表4)。腫瘤的EGFR突變S/P陽性S/P陰性N=4N=3(75%)N=l(25%)表41權利要求1.檢測個體血液樣品中EGFR基因突變的方法，所述方法包括(i)從所述樣品獲得DNA；(ii)利用蛋白-核酸探針，通過PCR擴增對應于所述EGFR基因的特異區(qū)域的核酸序列；和(iii)檢測所述突變。2.如權利要求1所述的方法，選自外顯子19的ELREA缺失，21的T790M突變。3.如權利要求1所述的方法，樣品。4.如^k利要求1所述的方法，驟。其中待^r測的所述EGFR基因突變外顯子21的L858R突變和外顯子其中所述血液樣品是血清或者血漿其中通過核酸測序進行所述檢測步5.如權利要求1所述的方法，其中通過GeneScan技術進行所述檢測步驟。6.如權利要求5所述的方法，其中所述GeneScan技術包括利用寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物的5'端用熒光染料進行熒光標記。7.如權利要求6所述的方法，其中所述熒光染料選自6-FAM、HEX或者NED染料。全文摘要本發(fā)明涉及個體血液(血清/血漿)樣品中EGFR突變的檢測。所述方法包括(i)從所述樣品獲得DNA；(ii)利用蛋白-核酸探針，通過PCR擴增對應于EGFR基因特異區(qū)域的核酸序列；和(iii)檢測所述突變。文檔編號C12Q1/68GK101506385SQ200780031604公開日2009年8月12日申請日期2007年7月20日優(yōu)先權日2006年7月20日發(fā)明者拉斐爾·羅賽爾克斯塔,米格爾·達榮洛卡申請人:潘蓋伊生物技術有限公司