專利名稱：：用于診斷和治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的基于微小rna的方法和組合物的制作方法用于診斷和治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的基于微小RNA的方法和組合物相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2006年7月13日提交的美國臨時(shí)申請No.60/807，304和2007年6月1日提交的美國臨時(shí)申請No.60/932，736的權(quán)益，所述臨時(shí)申請的公開內(nèi)容以引用方式并入本文。關(guān)于聯(lián)邦贊助研究的說明本發(fā)明在政府資助下進(jìn)行，且政府在國立衛(wèi)生研究院授權(quán)No.xxx和國立癌癥研究所授權(quán)下對所述發(fā)明具有權(quán)力。
背景技術(shù)：
：結(jié)腸腺癌是世界上主要的癌癥死亡原因\結(jié)直腸癌是美國第三最常見和第二主要的癌癥死亡原因2。散發(fā)性結(jié)腸腺癌最初為腺瘤并通過分子進(jìn)展、細(xì)胞和組織的變化來演化3。雖然5-年死亡率在最近30年內(nèi)適當(dāng)降低4，仍需要鑒定所述疾病的新預(yù)后生物標(biāo)記物和治療靶。目前，化療法具有重要的治療價(jià)值但手術(shù)是治療的唯一治愈形式5。理想的治療靶應(yīng)該與疾病原因上相關(guān)，且經(jīng)可設(shè)計(jì)治療干預(yù)進(jìn)行修正；而理想的生物標(biāo)記應(yīng)該易于測量并與臨床結(jié)果具有強(qiáng)相關(guān)性。微小RNA符合這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)h。微小RNA為18-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，其調(diào)節(jié)許多基因的翻譯9。從發(fā)現(xiàn)它們開始1Q，u，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞凋亡12—14，分化"'u'"和細(xì)胞增殖16。微小RNA在癌變中起因果作用16'17。微小RNA的表達(dá)水平在大多數(shù)肺瘤類型18'19，包括結(jié)腸癌19"中被改變。在大多數(shù)慢性淋巴細(xì)胞白血病中微小RNAmiR-15ii和miR-16a被刪除或下調(diào)23。特異性微小RM的實(shí)驗(yàn)操作調(diào)節(jié)小鼠模型系統(tǒng)中胂瘤發(fā)育"'"—"。還證實(shí)了微小RNA對慢性淋巴細(xì)胞白血病7、肺癌8、和神經(jīng)母細(xì)胞瘤"的預(yù)后潛力。微小RNA的異常表達(dá)可能引起癌變，抑制特異性微小RNA可能具有治療意義。可以設(shè)計(jì)修飾的反義寡核苷酸來特異性抑制微小RNA的功能28。Antagomirs為一種被證明在抑制小鼠體內(nèi)微小RNA功能中是有效的反義寡核苷酸"。由于微小RNA功能的特異性抑制劑易于設(shè)計(jì)，使得其成為治療靶的候選。發(fā)明概述在一個(gè)廣義的方面，本文提供一種診斷受試者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病、處于發(fā)展出結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中、或具有降低的結(jié)腸癌相關(guān)疾病存活預(yù)后的方法。所述方法包括測量來自受試者的測試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中相對于對照樣品中對應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平，測試樣品中所述miR基因產(chǎn)物水平的改變指示所述受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或處于發(fā)展結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)具體方面，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。在另一廣義的方面，本文提供一種測試至少結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的開始、對結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的傾向或降低的存活預(yù)后的方法，其包括(1)測定來自受試者的樣品中至少一種標(biāo)記物的表達(dá)水平；所述至少一種標(biāo)記物包括至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR—21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其纟且合組成的組；(2)比較步驟(1)中測定的表達(dá)水平與來自健康受試者的樣品中所述標(biāo)記物的對照表達(dá)水平；和(3)當(dāng)步驟(2)中的比較結(jié)果顯示i)受試者中的至少一個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)水平比對照中的高，或ii)受試者中的至少一個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)水平比對照中的低時(shí)，判斷受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病。樣品可包括組織、血液、血漿、血清、尿和糞便中的一種或多種。此外，所有的方法步驟可以在體外進(jìn)行。在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種診斷受試者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病、處于發(fā)展出結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中、或是否具有降低的結(jié)腸癌相關(guān)疾病存活預(yù)后的方法，包括(1)逆轉(zhuǎn)錄來自獲自受試者的測試樣品的RNA以提供一組靶寡聚脫氧核普酸；(2)使所述耙寡聚脫氧核苷酸與微陣列雜交以提供測試樣品的雜交譜，所述微陣列包括miRNA特異性探針寡核苷酸；和(3)比較測試樣品的雜交鐠與對照樣品產(chǎn)生的雜交鐠，其中至少一個(gè)miRNA信號(hào)的改變指示所述受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病，處于發(fā)展結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中，或具有降低的結(jié)腸癌相關(guān)疾病存活預(yù)后。在一個(gè)具體的方面，相對于對照樣品產(chǎn)生的信號(hào)，至少一個(gè)miRNA信號(hào)是被上調(diào)或下調(diào)的。此外，所述微陣列可包括一個(gè)或多個(gè)miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸，所述miRNA選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種抑制受試者中胂瘤形成的方法，所述受試者患有或懷疑患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病，其中相對于對照細(xì)胞，在受試者的癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物是被上調(diào)或下調(diào)的，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組，包括(1)當(dāng)癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物被下調(diào)時(shí)，給受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其纟且合纟且成的組，從而抑制受試者中腫瘤形成；或(2)當(dāng)癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物被上調(diào)時(shí)，給受試13者施用有效量的至少一種抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組，從而抑制受試者中肺瘤形成。在一個(gè)具體的方面，在步驟(1)和/或步驟(2)中至少一個(gè)分離的miR基因產(chǎn)物是miR-21、或其分離的變體、或其生物活性片段或功能等價(jià)物，或與其結(jié)合的抗體。在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種抑制患有結(jié)腸癌的受試者中肺瘤形成的方法，包括(l)相對于對照細(xì)胞，測定受試者的癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的量；和(2)改變在癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，通過(i)給受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物，如果在癌細(xì)胞中表達(dá)的所述miR基因產(chǎn)物的量少于對照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、邁iR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組；或(ii)給受試者施用有效量的至少一種用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物的化合物，如果在癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量大于對照細(xì)胞中表達(dá)的所述miR基因產(chǎn)物的量；從而抑制受試者中腫瘤形成。在一個(gè)具體的方面，步驟(i)中的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物是miR-21或其分離的變體或生物活性片段。此外，在某些實(shí)施方案中，在步驟(ii)中的至少一種miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、raiR-181b、miR-203及其組合組成的組，或其分離的變體或生物活性片段。在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種腫瘤形成抑制劑的鑒定方法，包括給細(xì)胞提供一種測試試劑，并測量與結(jié)腸癌相關(guān)疾病中變化的表達(dá)水平相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中相對于合適的對照細(xì)胞，所述細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物水平的升高或降低指示所述測試試劑為腫瘤形成的抑制劑。在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種腫瘤形成抑制劑的鑒定方法，包括給細(xì)胞提供一種測試試劑，并測量與結(jié)腸癌相關(guān)疾病中改變的表達(dá)水平相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中相對于合適的對照細(xì)胞，所述細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物水平的降低指示所迷測試試劑為腫瘤形成的抑制劑。在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種用于評(píng)估一種或多種代謝途徑的標(biāo)記物，所述代謝途徑對至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的引發(fā)、進(jìn)展、嚴(yán)重性、病理、惡性(aggressiveness)、分期、活性、殘疾、死亡率、發(fā)病率、疾病亞分類或其他潛在致病或病理特征的至少一種有貢獻(xiàn)，其中所述標(biāo)記物包括一種或多種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在另一個(gè)廣義的方面，本文提供包含一個(gè)或多個(gè)本文所述標(biāo)i己物的纟且合物。在另一個(gè)廣義的方面，本文提供鑒定引發(fā)或發(fā)展受試者中至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的潛力的方法，所述方法提供對一種或多種本文所述標(biāo)記物的測量。在某些實(shí)施方案，在分離的樣品中存在一種或多種標(biāo)記物，且所有的方法步驟在體外進(jìn)行。在另一個(gè)廣義的方面，本文提供測試結(jié)腸癌相關(guān)疾病的試劑，其中所述試劑包含多核苷酸，所述多核普酸包括至少一種本文所述標(biāo)記物的核苷酸序列或與所述標(biāo)記物的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在另一個(gè)廣義的方面，本文提供測試結(jié)腸癌相關(guān)疾病的試劑，其中所迷試劑包含抗體，所述抗體識(shí)別由至少一種本文所述的標(biāo)記物編碼的蛋白。在另一個(gè)廣義的方面，本文提供測試結(jié)腸癌相關(guān)疾病的DNA芯片，探針固定在所述芯片上以測試至少一種本文所述的標(biāo)記物。在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種評(píng)估療法預(yù)防、診斷和/或治療至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的效力的方法，包括15l)給動(dòng)物施用一種療法，評(píng)估所迷療法的效力，和2)通過評(píng)價(jià)至少一個(gè)本文所述的標(biāo)記物測定在治療或預(yù)防結(jié)腸癌相關(guān)疾病中待測試的治療的效力水平。在某些實(shí)施方案中，候選治療劑包括藥物組合物、保健組合物和順勢療法組合物的一種或多種。此外，待評(píng)估的療法可用于人受試者。在某些實(shí)施方案中，所迷方法不是通過手術(shù)或療法來治療人體或動(dòng)物體的方法。在另一廣義的方面，本文提供一種評(píng)估至少一種材料引發(fā)動(dòng)物模型中結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的能力的方法，所述方法包括1)在使動(dòng)物與足以引發(fā)動(dòng)物中結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的量的一種或多種材料接觸后，測量一種或多種本文所述的被上調(diào)或下調(diào)的標(biāo)i己物；和2)測定上調(diào)或下調(diào)標(biāo)記物的至少一種是否具有引發(fā)結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的能力。在另一廣義的方面，本文提供一種治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的藥物組合物，包括至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由niiR20a、niiR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組；和藥學(xué)可接受的栽體。在另一廣義的方面，本文提供治療結(jié)腸癌的藥物組合物，其包括至少一種miR表達(dá)抑制化合物和藥學(xué)可接受的載體，其中所述的至少一種ffliR表達(dá)抑制化合物對miR基因產(chǎn)物具有特異性，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在另一廣義的方面，本文提供一種產(chǎn)品，包括至少一種與結(jié)腸癌相關(guān)疾的標(biāo)記物結(jié)合的捕獲試劑，所述標(biāo)記物選自本文所述標(biāo)記物的至少一種。在另一廣義的方面，本文提供篩選用于治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療劑的候選化合物的試劑盒，其中所述試劑盒包括至少一種本文所述的標(biāo)記物的一種或多種試劑，和表達(dá)至少一種標(biāo)記物的細(xì)胞。16在某些實(shí)施方案中，使用包含抗體或抗體片段的試劑檢測所述標(biāo)記物的存在，所述抗體或抗體片段與至少一種標(biāo)記物特異性結(jié)合。同樣，在某些實(shí)施方案中，所述試劑是標(biāo)記的、放射標(biāo)記的、或生物素標(biāo)記的，和/或所述抗體或抗體片段是放射標(biāo)記的、生色團(tuán)標(biāo)記的、熒光團(tuán)標(biāo)記的或酶標(biāo)記的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括包含至少一種標(biāo)記物的容器。同樣，所述試劑可包括下述的一種或多種抗體、附帶或可附帶的探針、和固定的金屬螯合物。在另一廣義的方面，本文提供結(jié)腸癌相關(guān)疾病的篩選測試，包括使一種或多種權(quán)利要求20的標(biāo)記物與所述標(biāo)記物的底物和與測試試劑接觸，和測定所述測試試劑是否調(diào)節(jié)所述標(biāo)記物的活性。在某些實(shí)施方案中，所有的方法步驟可以在體外進(jìn)行。在另一廣義的方面，本文提供預(yù)測受試者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病存在的微陣列，包含針對至少一種權(quán)利要求20的標(biāo)記物的抗體。在另一廣義的方面，本文提供方法、組合物等，其中通過檢測轉(zhuǎn)錄多核苷酸或其部分的存在來評(píng)估標(biāo)記物的表達(dá)水平，其中所述轉(zhuǎn)錄的多核苷酸包括所述標(biāo)記物的編碼區(qū)。同時(shí)，所述樣品可以是結(jié)腸癌相關(guān)體液或組織。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述樣品包括來自患者的細(xì)胞。在另一廣義的方面，本文提供治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制在需要其的個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性的方法，包括給個(gè)體施用干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答信號(hào)傳導(dǎo)途徑的試劑，以足以千擾所述信號(hào)傳導(dǎo)的量，其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在另一廣義的方面，本文提供干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答信號(hào)傳導(dǎo)途徑的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性，其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在另一廣義的方面，本文提供治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制在需要其的個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性的方法，包括給所述個(gè)體施用千擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑，其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b，miR-203及其組合組成的組。在另一廣義的方面，本文提供干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性，其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在另一廣義的方面，本文提供包括一種包含數(shù)據(jù)庫的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，所述數(shù)據(jù)庫具有多種數(shù)據(jù)編碼的參考鐠，其中至少第一參考譜代表來自一個(gè)或多個(gè)受試者的一個(gè)或多個(gè)樣品中至少第一標(biāo)記物的水平，所述受試者展示結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的標(biāo)記(indicia)，其中所述標(biāo)記物包括一種或多種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在某些實(shí)施方案中，所述計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包含至少第二參考譜，其代表來自一個(gè)或多個(gè)受試者的一個(gè)或多個(gè)樣品中至少第二標(biāo)記物的水平，所述受試者展示結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的標(biāo)記，或受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病。在另一廣義的方面，本文提供一種測定患者是否患有，或傾向于患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病，或具有差的結(jié)腸癌相關(guān)疾病存活預(yù)后的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，包括本文所述的數(shù)據(jù)庫，和包括計(jì)算機(jī)可執(zhí)行代碼的服務(wù)器，其使計(jì)算機(jī)接收受試者的鐠，從數(shù)據(jù)庫識(shí)別匹配的在診斷上與受試者的譜相關(guān)的參考譜，并產(chǎn)生所述受試者是否患有或傾向于患結(jié)腸癌相關(guān)疾病的指示。18在另一廣義的方面，本文提供一種評(píng)價(jià)受試者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的存在、不存在、性質(zhì)或程度的計(jì)算機(jī)輔助方法，包括1)提供包括對來自獲自受試者的樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類的模型或運(yùn)算法則，其中，所述分類包括就至少一種標(biāo)記物的存在、不存在或量分析所述數(shù)據(jù)，其中所述標(biāo)記物包括一種或多種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。2)輸入獲自受試者的生物樣品的數(shù)據(jù)；和3)分類生物樣品以指示結(jié)腸癌相關(guān)疾病的存在、不存在、性質(zhì)或程度。在另一廣義的方面，至少一種miR基因產(chǎn)物及其組合包括分離的變體、或其生物活性片段或功能等價(jià)物、或與其結(jié)合的抗體。在另一廣義的方面，本文提供結(jié)腸癌的動(dòng)物模型，其中下述生物或化學(xué)過程的至少一個(gè)(上調(diào)或下調(diào)一種或多種miR基因產(chǎn)物)在所述動(dòng)物模型中發(fā)生，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在某些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物模型是非人脊推動(dòng)物。在具體的實(shí)施方案中，所述動(dòng)物模型是小鼠、大鼠、兔或靈長類動(dòng)物。在附圖的啟發(fā)下閱讀時(shí)，從下述優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的各種目的和優(yōu)點(diǎn)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的。專利或申請文件包括至少一副以彩色繪制的附圖。在提出要求和支付必須的費(fèi)用后辦事處(Office)可以提供帶有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埑霭嫖锏母北?。圖la-lg:miR-21在結(jié)腸腺癌中以較高水平表達(dá)，在更晚期胂瘤中表達(dá)逐步增加。(圖la)對miR-21的原位雜交進(jìn)行最優(yōu)化以區(qū)分miR-21的高表達(dá)和低表達(dá)。人腫瘤(T)中的結(jié)腸上皮細(xì)胞與臨近的非胖瘤組織(N)相比表達(dá)較高水平的miR-21。(圖lc)在高的放大倍率下，胂瘤組織中結(jié)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)在腫瘤組織中表達(dá)顯著量的miR-21。(圖le)非腫瘤組織在相同的放大倍率下不顯示miR-21的顯著表達(dá)。(圖lb，圖ld，圖lf)如所預(yù)料的，在低或高的放大倍率下，在腫瘤組織和非腫瘤組織的連續(xù)切片中爭奪對照探針(thescramblecontrolprobe)沒有顯示顯著染色。標(biāo)尺線(scalebars)(圖lc-f)顯示在晚期腫瘤中500(g)miR-n以較高水平表達(dá)。點(diǎn)圖表示腺瘤和肺瘤表達(dá)水平的miR-21相對Ct值(來自定量RT-PCR),其已分別針對配對非腺瘤或非腫瘤組織進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。組織類型從腺瘤到I-IV期的腫瘤進(jìn)行排序。線條顯示中間值。存在越晚期的腫瘤具有越高的miR-21表達(dá)的明顯趨勢(在排列的組中趨勢的非參數(shù)測試)。圖2:miR-21在較晚期的腫瘤中以較高水平表達(dá)。使用微小RNA微陣列來測量miR-21的表達(dá)水平。點(diǎn)圖代表miR-21Ioga(腫瘤/非腫瘤比例)，如根據(jù)來自原來的群(cohort)的微小RNA微陣列所計(jì)算的。使用來自微陣列的探針hsa-miR-21-prec17No1來測量miR-21表達(dá)。排除基于微陣列數(shù)據(jù)具有不可測的miR-21表達(dá)的組織。組織類型從TNM的I期至IV期腫瘤進(jìn)行排列。線條表示中間值。存在越晚期的腫瘤具有越高的miR-21表達(dá)的明顯趨勢(p-0.04;在排列的組中趨勢的非參數(shù)測試)。圖3a和3b:腫瘤中高的miR-21表達(dá)預(yù)測在兩個(gè)獨(dú)立群中具有典型腺癌組織結(jié)構(gòu)的患者中差的存活。所述分析排除具有粘液腺癌或腺鱗狀癌組織結(jié)構(gòu)的受試者。(圖3a)在馬里蘭測試群中使用微小RNA微陣列來測量腫瘤和非腫瘤組織的微小RNA表達(dá)水平。排除基于微陣列數(shù)據(jù)具有不可測的miR-21表達(dá)的組織。基于最高三分位組(tertile)對高的miR-21表達(dá)進(jìn)行分類。紅線表示具有高表達(dá)的個(gè)體，而綠線對應(yīng)低表達(dá)。對于非腫瘤組織，24/69組織被分類為高的，而26/72腫瘤被分類為高20的。腫瘤中高的miR-21表達(dá)(右)與差的存活相關(guān)，而其在非腫瘤組織中沒有關(guān)聯(lián)。(圖3b)驗(yàn)證獨(dú)立群中腫瘤高的miR-21表達(dá)與差的預(yù)后的相關(guān)性。通過定量RT-PCR測量miR-21的表達(dá)水平。高的表達(dá)基于最高三分位組。35/103非腫瘤組織被分類為高的，且34/103腫瘤組織被分類為高的。P-值為根據(jù)Kaplan-Meier分析的log秩p-值。在所有線上的X's表示檢查個(gè)體的時(shí)間。圖4a和4b:腫瘤中高miR-21表達(dá)預(yù)測兩個(gè)獨(dú)立群中的差的存活。所述分析包括所有受試者，不考慮腺癌組織結(jié)構(gòu)。(圖4a)在馬里蘭測試群中使用微小RNA微陣列來測量腫瘤和非腫瘤組織的微小RNA表達(dá)水平。排除基于微陣列數(shù)據(jù)檢測不到niiR-21表達(dá)的組織。基于最高三分位組對高niiR21表達(dá)進(jìn)行分類。紅線表示具有高表達(dá)的個(gè)體，而綠線對應(yīng)低表達(dá)。對于非胂瘤組織，26/74組織被分類為高的，而28/79腫瘤被分離為高的。腫瘤中高的miR-21表達(dá)(右)與差的存活相關(guān)，而其在非肺瘤組織中沒有關(guān)聯(lián)。(圖4b)對獨(dú)立群中腫瘤中高的miR-21表達(dá)與差的預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證。通過定量RT-PCR測量miR-21的表達(dá)水平。高表達(dá)基于最高三分位組。37/111非腫瘤組織被分類為高的，且37/111腫瘤組織被分類為高的。所有p-值為根據(jù)Kaplan-Meier分析的log秩p-值。在所有線上的X's表示檢查個(gè)體的時(shí)間。圖5a、5b和5c:在常規(guī)腺癌組織結(jié)構(gòu)情況下，高的miR-21表達(dá)與對輔助化療低的應(yīng)答有關(guān)。所述分析包括來自驗(yàn)證群的受試者，排除具有粘液腺癌組織結(jié)構(gòu)或腺鱗狀癌組織結(jié)構(gòu)的受試者。(圖5a)通過miR-21表達(dá)水平比較具有常規(guī)腺癌組織結(jié)構(gòu)的TNMII/III期受試者和接受輔助化療的受試者的存活率。對于77個(gè)II/III期的受試者，25個(gè)被分類為低的miR-21并接受治療，28個(gè)為低miR-21且不接受治療，11個(gè)為高的miR-21并接受治療，和13個(gè)為高的miR-21且不接受治療。對于接受輔助化療的II/III期受試者，腫瘤中高的miR-21表達(dá)與差的存活相關(guān)(p=0.03)。(圖5b)比較具有常規(guī)腺癌組織結(jié)構(gòu)的TNMII期受試者。對于33個(gè)II期受試者，8個(gè)被分類為低的miR-21并接受治療，15個(gè)為低miR-21且不接受治療，3為高miR-21的接受治療，和7個(gè)為高miR-21的且不接受治療。對于所有接受輔助化療的II期的受試者，在研究期間存活。(圖5c)比較具有常規(guī)腺癌組織結(jié)構(gòu)的TNMIII期受試者。對于44個(gè)III期受試者，17個(gè)被分類為低的miR-21并接受治療，13個(gè)為低的miR-21且不接受治療，8為高的miR-21并接受治療，和6個(gè)為高的miR-21且不接受治療。對于接受輔助化療的III期受試者，腫瘤中高的miR-21表達(dá)與差的存活相關(guān)(p=0.02)。在所有線上的X's表示檢查個(gè)體的時(shí)間。圖6a、6b和6c:馬里蘭測試群和香港驗(yàn)證群的聯(lián)合分析，檢測腫瘤和接受輔助化療之間iniR-21的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。所述分析包括來自兩個(gè)群的所有TNM的II/III期受試者。排除具有粘液腺癌組織結(jié)構(gòu)或腺鱗狀癌組織結(jié)構(gòu)的個(gè)體。左邊的柱包括分析接受輔助療法與預(yù)后之間的相關(guān)性的Kaplan-Meier圖。中間的柱包括對腫瘤中高的miR-21表達(dá)與預(yù)后相關(guān)性的分析，且右邊的柱基于化療和miR-21表達(dá)情況對個(gè)體進(jìn)行細(xì)分。(圖6b)所有TNM的II期受試者。對于52個(gè)II/III期受試者，10個(gè)被分類為低的niiR-21并接受治療，25個(gè)為低miR-21但不接受治療，4為高的miR-21并接受治療，和13個(gè)為高的miR-21但不接受治療。高的miR-21表達(dá)與預(yù)后之間的相關(guān)性在接受化療的個(gè)體(p==0.11)或不接受化療的個(gè)體(p-0.06)中不是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。22(圖6c)所有TNM的III期受試者。對于67個(gè)III期的受試者，30個(gè)被分類為低的miR-21并接受治療，16個(gè)為低miR-21但不接受治療，12為高的miR-21并接受治療，和9個(gè)為高的miR-21但不接受治療。高的miR-21表達(dá)與在接受化療的III期受試者中差的存活顯著相關(guān)(p-0.007)，但在不接受化療的受試者中不顯著相關(guān)(p=0.30)。在所有線上的X's表示檢查個(gè)體的時(shí)間。圖8a-8i.個(gè)體miRNA的TIN比例預(yù)測存活預(yù)后。此處展示的圖通過對9個(gè)miRNA的每一個(gè)進(jìn)行TNM分期(左)和Kaplan-Meier分析(右)顯示TIN比例。Y軸(TNM分期圖顯示的TIN比例)顯示每一個(gè)個(gè)體的經(jīng)log(2)轉(zhuǎn)化的TIN比例，而TNM分期(I、II、III或IV)顯示Y軸組個(gè)體。顯示的權(quán)值為通過分期進(jìn)行分組的個(gè)體的平均TIN比值的趨勢的非參數(shù)測試的結(jié)果。Kaplan-Meier圖包括對于那個(gè)具體的miRNA具有TIN比例數(shù)據(jù)的所有個(gè)體。發(fā)現(xiàn)TIN比例與臨床分期和存活預(yù)后均有關(guān)。圖9a和9b.9個(gè)miRNA的miRM信號(hào)預(yù)測死于結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。各個(gè)miR-21、HiiR-106a、miR181b、miR-16b、miR-203、let-7g、miR-29a、miR-103-2和miR-10a的TIN比例顯示對結(jié)腸癌預(yù)后的預(yù)測。這9個(gè)miRNA的TIN比例的分級(jí)聚類將個(gè)體分成具有顯著不同存活預(yù)后兩組(1A)(1B)。B組個(gè)體死于結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)比A組高得多。如果個(gè)體缺少大于組成miRM信號(hào)的9個(gè)TIN比例中的2個(gè)，從所述分析中排除它們。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述在一個(gè)廣義的方面，本文提供對具體微小MA的鑒定，相對于正常對照細(xì)胞，所述微小RNA的表達(dá)在與不同結(jié)腸癌相關(guān)的癌細(xì)胞中改變。所述具有19-25個(gè)核香酸的活性RNA分子可以通過天然加工途徑(例如，使用完整細(xì)胞或細(xì)胞裂解物)或通過合成加工途徑(例如，使用分離的加工酶，諸如分離的Dicer、Argonaut或RNAseIII)獲自miR前體。應(yīng)理解所述具有19-25個(gè)核苷酸的活性RM分子還可以通過生物或化學(xué)合成直接產(chǎn)生，無需從miR前體進(jìn)行加工。當(dāng)在本文中以名字提及微小RNA時(shí)，所述名字對應(yīng)于前體和成熟形式，除非另外指出。在一個(gè)方面，本文提供診斷受試者是否患有結(jié)腸或處于發(fā)展結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括測量來自受試者的測試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，并比較測試樣品中所述miR基因產(chǎn)物的水平與對照樣品中對應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平。如本文所使用的，"受試者"可以是任何患有或懷疑患有實(shí)體癌的哺乳動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述受試者是患有或懷疑患有結(jié)腸癌的人。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述測試樣品中測量的至少一種miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物是24miR-21。所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病可以是任何由結(jié)腸組織引起的障礙或癌癥。所述癌癥典型地與腫瘤塊的形成和/或存在相關(guān)，例如腺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)腸是腺癌和在所述測試樣品中測量的至少一種miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在測試樣品中測量的至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。可以測量獲自受試者的生物樣品(例如，細(xì)胞、組織)中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，可以通過常規(guī)的活檢技術(shù)從懷疑患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病的受試者提取組織樣品(例如，來自腫瘤)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以從受試者提取血液樣品，并通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對血細(xì)胞(例如，白血細(xì)胞)進(jìn)行分離以獲得DNA提取物。所述血液或組織樣品優(yōu)選獲自開始放射治療、化學(xué)療法或其他治療性治療之前的受試者。對應(yīng)的對照組織樣品或血液樣品可荻自所述受試者未受影響的組織、正常人個(gè)體或正常個(gè)體群、或?qū)?yīng)于所述受試者樣品中大多數(shù)細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞。然后將對照組織樣品或血液樣品與來自受試者的樣品一起處理，從而比較由來自受試者樣品的細(xì)胞中給定miR基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的水平與來自對照樣品的細(xì)胞的對應(yīng)miR基因產(chǎn)物水平。所述生物樣品的參考miR表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)也可用作對照。相對于對照樣品中對應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平，獲自受試者的樣品中miR基因產(chǎn)物水平的改變(例如，增加或降低)指示受試者中存在結(jié)腸癌相關(guān)疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，測試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對照樣品中對應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平(即，所述miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被"上調(diào)")。如本文所使用的，當(dāng)來自受試者的細(xì)胞或組織中的基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的量大于對照細(xì)胞或組織樣品中相同基因產(chǎn)物的量時(shí)，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被"上調(diào)"。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)25物的水平小于對照樣品中對應(yīng)iniR基因產(chǎn)物的水平(即，HiiR基因產(chǎn)物的表達(dá)被"下調(diào)")。如本文所使用的，當(dāng)來自受試者的細(xì)胞或組織中miR基因產(chǎn)物的量小于對照細(xì)胞或組織樣品中相同基因產(chǎn)生的量時(shí)，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被"下調(diào)"。對照和正常樣品中相對的miR基因表達(dá)可以相對于一種或多種RNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定。所述標(biāo)準(zhǔn)例如可以包括零raiR基因表達(dá)水平、在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中所述miR基因的表達(dá)水平，受試者未受影響的組織中所述miR基因的表達(dá)水平、或之前獲自正常人對照群的miR基因表達(dá)的平均水平?？梢允褂萌魏芜m合檢測生物樣品中RNA表達(dá)水平的技術(shù)測定樣品中miR基因產(chǎn)物的水平。測定生物樣品(例如，細(xì)胞、組織)中RNA表達(dá)水平的合適技術(shù)(例如，Northern印跡分析、RT-PCR、原位雜交)為本領(lǐng)域所述技術(shù)人員所熟知的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用Northern印跡分析測定至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，可以在核酸提取緩沖溶液存在下通過勻漿化作用，然后通過離心從細(xì)胞分離出總的細(xì)胞RNA。沉淀核酸，通過用DNase處理和沉淀除去DNA。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過瓊脂糖凝膠上的凝膠電泳分離所述RNA分子，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜。然后通過加熱將所述RM固定在濾膜上。使用與可疑RNA互補(bǔ)的合適標(biāo)記的DNA或RNA探針來完成特異性RNA的檢測和定量。例如參見,MolecularCloning:ALaboratoryManual，J.Sambrook等,eds.，2ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989，Chapter7，其/>開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。可以由所述核酸序列產(chǎn)生用于給定邁iR基因產(chǎn)物Northern印跡雜交的合適探針，其包括但不限于與目的miR基因產(chǎn)物至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或完全互補(bǔ)的探針。標(biāo)記的DNA和RNA探針的制備方法，以及其與耙核苷酸序歹'J的雜交條件描述于MolecularCloning:ALaboratoryManual,J.Sambrook等編輯，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989，第10和11章，其公開內(nèi)容以引用方式并入本文。在一個(gè)非限制性的實(shí)施例中，所述核酸探針例如可以用放射性核素(諸如3H、32P、"P、14C或35S);重金屬；能用作經(jīng)標(biāo)記配體的特異性結(jié)合對成員的配體(例如，生物素、親和素或抗體)；熒光分子；化學(xué)發(fā)光分子；酶等進(jìn)行標(biāo)記。，通過Rigby等(1977)，J'Mol.Biol.113:237-251的缺口翻譯方法，或通過Fienberg等(1983)，Anal.Biochem.132:6-13的隨機(jī)引物法，探針可以被標(biāo)記為具有高的特異性活性，其全部公開的內(nèi)容以引用方式并入本文。后者是從單鏈DNA或從RNA模板選擇合成高特異性活性的"P-標(biāo)記探針的選擇方法。例如，根據(jù)缺口翻譯方法通過用高放射性的核苷酸替代先前存在的核苷酸，有可能制備超過108cpffl/mg的"P標(biāo)記具有特異性活性的核酸探針。然后通過將雜交的濾膜曝光于膠片來進(jìn)行雜交的放射自顯影檢測。由雜交濾膜曝光的膠片的光密度掃描提供miR基因轉(zhuǎn)錄水平的準(zhǔn)確測量。使用另一種方法，miR基因轉(zhuǎn)錄水平可以通過計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)(諸如購自AmershamBiosciences,Piscataway，NJ的MolecularDynamics400-B2DPhosphorimager)進(jìn)行定量。在DNA或RNA探針的放射性核標(biāo)記是不可行的情況下，可以使用隨機(jī)引物方法將類似物，例如，dTTP類似物5-(N-(N-生物素酰-s-氨基己?；?-3-氨基烯丙基)脫氧尿苷三磷酸整合到探針分子中。所述生物素探針寡核苷酸可以通過與生物素-結(jié)合蛋白反應(yīng)來檢測，諸如親和素、鏈霉親和素與熒光染料或產(chǎn)生顏色反應(yīng)的酶偶合的抗體(例如，抗生物素抗體)。除了Northern和其他RNA雜交技術(shù)外，可以使用原位雜交技術(shù)來完成RNA轉(zhuǎn)錄水平的測定。所述技術(shù)與Northern印跡技術(shù)相比需要更少的細(xì)胞，且包括將全細(xì)胞沉積到顯微鏡蓋玻片上，并用含放射性或經(jīng)其他方式標(biāo)記的核酸(例如，cDNA或RNA)探針的溶液探測所述細(xì)胞的核酸含量。所述技術(shù)特別適合對來自受試者的組織活檢樣品進(jìn)行分析。原位雜交技術(shù)的實(shí)踐更詳細(xì)描述于美國專利No.5,427,916，其公開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。在一個(gè)非限制性的實(shí)施例中，可以由所述核酸序列產(chǎn)生給定miR基因產(chǎn)物原位雜交的合適探針，其包括但不限于與目的miR基因產(chǎn)物至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或完全互補(bǔ)的探針，如上述所。細(xì)胞中miR基因轉(zhuǎn)錄物的相對數(shù)量還可以通過miR基因轉(zhuǎn)錄物的逆轉(zhuǎn)錄，接下來通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增來確定。與內(nèi)標(biāo)(例如，來自存在于同一樣品的"管家"基因的mRNA水平)進(jìn)行比較來對miR基因轉(zhuǎn)錄物的水平進(jìn)行定量。用作內(nèi)標(biāo)的合適"管家"基因例如包括，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)。進(jìn)行定量和半定量RT-PCR的方法，及其變化形式是本領(lǐng)域所屬的技術(shù)人員所熟知的。在一些情況下，可能需要同時(shí)測定樣品中多種不同miR基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。在其他情況下，可能需要測定與癌癥相關(guān)的所有已知miR基因轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平。評(píng)估數(shù)百個(gè)miR基因或基因產(chǎn)物的癌癥特異性表達(dá)水平是耗時(shí)的，且需要大量的總RNA(例如，對于每個(gè)Northern印跡至少20jug)和需要放射性同位素的放射自顯影技術(shù)。為了克服這些限制，可以構(gòu)建微芯片形式的寡核苷酸文庫(即，微陣列)，其含有一組寡核苷酸(例如，寡脫氧核苷酸)探針，所迷探針對一組miR基因具有特異性。使用所述微陣列，通過逆轉(zhuǎn)錄RNA以產(chǎn)生一組靶寡脫氧核苷酸并對它們進(jìn)行雜交來探測微陣列上的寡核苷酸以產(chǎn)生雜交譜或表達(dá)譜，可以測定生物樣品中多個(gè)微小RNA的表達(dá)水平。然后比較測試樣品和對照樣品的雜交譜以測定實(shí)體癌細(xì)胞中哪個(gè)微小RNA具有改變的表達(dá)水平。如本文所使用的，"探針寡核苷酸"或"探針寡脫氧核苷酸，，指能與靶寡核苷酸雜交的寡核苷酸。"靶寡核苷酸"或"靶寡脫氧核苷酸"指待檢測(例如，經(jīng)由雜交)的分子。"miR-特異性探針寡核苷酸"或"對miR特異性的探針寡核苷酸"指一種探針寡核苷酸，其具有經(jīng)選擇與特異性miR基因產(chǎn)物或與所述特異性miR基因產(chǎn)28物的逆轉(zhuǎn)錄物雜交的序列。具體樣品的"表達(dá)鐠"或"雜交鐠"本質(zhì)上為樣品狀態(tài)的指紋傳；而兩個(gè)狀態(tài)可能使任何具體基因被類似地表達(dá)，對許多基因同時(shí)進(jìn)行評(píng)價(jià)允許產(chǎn)生獨(dú)特于細(xì)胞狀態(tài)的基因表達(dá)譜。即，正常組織可能與癌(例如，肺瘤)組織不同，且可以測定癌組織中不同的預(yù)后狀態(tài)(例如，好的或差的長期存活前景)。通過比較不同狀態(tài)中結(jié)腸癌組織的表達(dá)鐠，獲得關(guān)于在這些狀態(tài)的每一個(gè)中哪些基因是重要的(包括基因的上調(diào)和下調(diào))的信息。在結(jié)腸癌組織中差異表達(dá)的序列的鑒定，以及導(dǎo)致不同預(yù)后結(jié)果的差異表達(dá)，允許以多種方式使用所迷信息。在一個(gè)非限制性的實(shí)施例中，可以評(píng)價(jià)具體的治療方案(例如，確定化療藥物是否起到改善具體患者中長期預(yù)后的作用)。類似地，可以進(jìn)行診斷或通過比較患者樣品與已知表達(dá)譜來證實(shí)。此外，這些基因表達(dá)鐠(或個(gè)別基因)允許篩選抑制結(jié)腸癌表達(dá)譜或?qū)⒉畹念A(yù)后傳轉(zhuǎn)變成較好的預(yù)后鐠的候選藥物。因此，本文還提供診斷受試者是否患有結(jié)腸癌或處于發(fā)展出結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括對來自獲自受試者的測試樣品的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以提供一組靶寡聚脫氧核苷酸，使所述靶寡聚脫氧核苷酸與微陣列雜交以提供測試樣品的雜交譜，所述微陣列包括miRNA特異性探針寡核苷酸，和比較測試樣品的雜交語與對照樣品或參考標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生的雜交譜，其中至少一種miRNA信號(hào)的改變指示所述受試者患有實(shí)體癌，處于發(fā)展實(shí)體癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微陣列包括大部分的所有已知人miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述微陣列包括針對一種或多種miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸，所述miRNA選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。所述微陣列可以由產(chǎn)生自已知miRNA序列的基因特異性寡核苷酸探針制備。所述陣列針對每種miRM可以包含兩種不同的寡核苷酸探針，一種包含活性、成熟的序列和另一種對所述miRNA前體具有特異性。所述陣列還可以包含對照、諸如與人直系同源物的區(qū)別僅在于幾個(gè)堿基的一種或多種小鼠序列，其可用作嚴(yán)格雜交條件的對照。還可以在微芯片上印刷來自這兩個(gè)物種的tRNA或其他RNA(例如rRNAs、mRNAs)，以提供特異性雜交的內(nèi)在的、相對穩(wěn)定的陽性對照。還可以在所述微芯片上包括非特異性雜交的一種或多種合適對照。出于這個(gè)目的，基于不存在任何已知miRNA的任何同源來選擇序列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)來制備微陣列。例如，合適長度的探針寡核苷酸(例如，40個(gè)核苷酸)，在C6位置為5'-胺修飾的并用商購可得的微陣列系統(tǒng)(例如，GeneMachineOmniGrid100microarrayer和AmershamCodeLinkactivatedslides)進(jìn)行印刷。通過用經(jīng)標(biāo)記的引物逆轉(zhuǎn)錄靼RNA來制備對應(yīng)于靼RNA的經(jīng)標(biāo)記的cDNA低聚物。在第一鏈合成后，使RNA/DNA雜交體變性以降解RNA模板。然后，將由此制備的標(biāo)記靶cDNA在雜交條件下(例如，在25C下6XSSPE/30%甲酰胺持續(xù)18小時(shí)，然后在37。C下在0.75XTNT(TrisHCl/NaCl/Tween20)中洗滌40分鐘)與微陣列芯片雜交。在陣列上固定的探針DNA識(shí)別樣品中互補(bǔ)的靶cDNA的位置上發(fā)生雜交。經(jīng)標(biāo)記的耙cDNA標(biāo)記所述陣列上結(jié)合發(fā)生的準(zhǔn)確位置，允許自動(dòng)檢測和定量。輸出信號(hào)由一系列雜交事件組成，指示患者樣品中特異性cDNA序列的相對豐度，從而對應(yīng)的互補(bǔ)miR的相對豐度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述經(jīng)標(biāo)記的cDNA低聚物是由生物素標(biāo)記的引物制備的生物素標(biāo)記的cDNA。然后通過使用，例如，鏈親和素-Alexa647綴合物，直接檢測含生物素的轉(zhuǎn)錄物，對所述微陣列進(jìn)行操作，并利用常規(guī)掃描方法進(jìn)行掃描。陣列上每一個(gè)點(diǎn)的圖像強(qiáng)度與患者樣品中對應(yīng)miR的豐度成正比。微陣列的使用對于miRNA表達(dá)檢測來說具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。第一，可以同時(shí)鑒定同一樣品中幾百個(gè)基因的總表達(dá)。第二，通過仔細(xì)設(shè)計(jì)寡核苷酸探針可以鑒定成熟和前體分子的表達(dá)。第三，與Northern印跡分析相比，所述芯片需要少量的RNA，并通過使用2.530總RNA提供可重復(fù)的結(jié)果。相對有限數(shù)量的miRNA(幾百個(gè)/物種)允許構(gòu)建幾個(gè)物種的共同微陣列，針對每個(gè)物種具有不同的寡核苷酸探針。所述工具允許在不同條件下分析每個(gè)已知miR的跨物種(trans-species)表達(dá)。除了用于特異性miR的定量表達(dá)水平測試外，含有對應(yīng)于大部分miRNome(優(yōu)選全部miRNome)的miRNA特異性探針寡核苷酸的微芯片，可用來實(shí)現(xiàn)miR基因表達(dá)分析，以分析miR表達(dá)模式。不同的miR信號(hào)可以與已確定的疾病標(biāo)記物，或直接與疾病狀態(tài)相關(guān)。根據(jù)本文所述的表達(dá)分析方法，來自懷疑患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病的受試者的樣品的總RNA被定量逆轉(zhuǎn)錄以提供一組與樣品中所述RNA互補(bǔ)的經(jīng)標(biāo)記的耙寡脫氧核苷酸。然后，所述靼寡脫氧核苷酸與包括miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供樣品的雜交鐠。所述結(jié)果是代表樣品中miRM表達(dá)模式的樣品雜交譜。所述雜交譜包括來自樣品的所述靶寡脫氧核苷酸與微陣列中所述miRNA特異性探針寡核苷酸結(jié)合的信號(hào)。所述鐠可被記錄為存在或不存在結(jié)合(信號(hào)相對零信號(hào))。更優(yōu)選地，所記錄的鐠包括每個(gè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度。比較所述鐠與正常(即，非癌)對照樣品產(chǎn)生的雜交譜。信號(hào)的改變指示受試者中存在或傾向于發(fā)展癌癥。測量ffliR基因表達(dá)的其他技術(shù)也在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)，包括測量RNA轉(zhuǎn)錄和降解速率的各種技術(shù)。本文還提供確定患有結(jié)腸癌的受試者預(yù)后的方法，包括測量來自所述受試者的測試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其與結(jié)腸癌相關(guān)疾病中的具體預(yù)后(例如，好的或良性預(yù)后，差的或不良預(yù)后)相關(guān)。根據(jù)這些方法，與對照樣品中對應(yīng)miR基因產(chǎn)物水平相比，與測試樣品中具體預(yù)后相關(guān)的miR基因產(chǎn)物水平的改變指示所述受試者患有具有具體預(yù)后的實(shí)體癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物與不良(即，差的)預(yù)后相關(guān)。不良預(yù)后的實(shí)例包括，但不限31于低存活率和快速疾病進(jìn)展。在某些實(shí)施方案中，通過對來自獲自受試者的測試樣品的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以提供一組靶寡聚脫氧核苷酸，使所述靶寡聚脫氧核苷酸與微陣列雜交以提供所述測試樣品的雜交鐠，所述微陣列包括miRNA特異性探針寡核苷酸，并比較測試樣品的雜交鐠與對照樣品產(chǎn)生的雜交譜來測量所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。不希望受任何理論限制，認(rèn)為細(xì)胞中一種或多種miR基因產(chǎn)物水平的改變能導(dǎo)致這些miR的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)靶的失調(diào)，其能導(dǎo)致實(shí)體癌的形成。因此，改變所述miR基因產(chǎn)物的水平(例如，通過降低在實(shí)體癌細(xì)胞中被上調(diào)的miR基因產(chǎn)物的水平，或增加在實(shí)體癌細(xì)胞中被下調(diào)的miR基因產(chǎn)物的水平)可以成功地治療所述實(shí)體癌。因此，本文進(jìn)一步提供抑制患有或懷疑患有實(shí)體癌的受試者中腫瘤形成的方法，其中在所述受試者的癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物失調(diào)(例如，下調(diào)、上調(diào))。如果在所述癌細(xì)胞中所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物(例如，iniR-21)是被下調(diào)的，所述方法包括施用有效量的所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，從而抑制所述受試者中癌細(xì)胞增殖。例如，如果miR基因產(chǎn)物在受試者的癌細(xì)胞中是被下調(diào)的，給所述受試者施用有效量的分離的miR基因產(chǎn)物可以抑制所述癌細(xì)胞增殖。給所述受試者施用的分離的miR基因產(chǎn)物與在癌細(xì)胞中被下調(diào)的內(nèi)源性野生型miR基因產(chǎn)物(例如，miR基因產(chǎn)物)一致，或可以是其變體或生物活性片段。如本文所定義的，miR基因產(chǎn)物的"變體"指與對應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物具有低于100%同一性的miRNA并具有對應(yīng)野生型miR基因產(chǎn)物的一種或多種生物活性。所述生物活性的實(shí)例包括，但不限于，抑制靶RNA分子的表達(dá)(例如，抑制靶RNA分子的翻譯、調(diào)節(jié)耙RNA分子的穩(wěn)定性、抑制乾RNA分子的加工)和抑制與實(shí)體癌相關(guān)的細(xì)胞過程(例如，細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、細(xì)胞死亡)。這些變體包括物種變體和由miR基因中一個(gè)或多個(gè)突變(例如，置換、刪除、插入)導(dǎo)致的變體。在某些實(shí)施方案中，所述變體與對應(yīng)野生型miR基因產(chǎn)物至少具有約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%的同一性。如本文所定義的，miR基因產(chǎn)物的"生物活性片段"指miR基因產(chǎn)物的RNA片段，其具有對應(yīng)野生型miR基因產(chǎn)物的一種或多種生物活性。如上所述，所述生物活性的實(shí)例包括，但不限于，抑制靶RNA分子的表達(dá)和抑制與結(jié)腸癌相關(guān)的細(xì)胞過程。在某些實(shí)施方案中，所述生物活性片段的長度至少為約5、7、10、12、15或17個(gè)核苷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，分離的miR基因產(chǎn)物可以與一種或多種其他抗癌治療聯(lián)合施用于受試者。合適的抗癌治療包括，但不限于，化學(xué)療法、放射療法及其組合(例如，化放療(chemoradiation))。如果所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在所述癌細(xì)胞中是被上調(diào)的，所述方法包括給受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物，本文稱為miR基因表達(dá)抑制化合物，從而抑制實(shí)體癌細(xì)胞增殖。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述至少一種miR表達(dá)抑制化合物對miR基因產(chǎn)物具有特異性，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。miR基因表達(dá)抑制性化合物可以與一種或多種其他抗癌治療聯(lián)合施用于受試者。合適的抗癌治療包括，但不限于，化學(xué)療法、放射療法及其組合(例如，化放療)。術(shù)語"治療(treat)"，"治療(treating)"和"治療(treatment)"，如本文所使用的，指緩解與疾病或病癥(例如，實(shí)體癌)相關(guān)的癥狀，包括預(yù)防或延遲疾病癥狀的發(fā)作，和/或減輕疾病或病癥癥狀的嚴(yán)重性或頻率。本文定義術(shù)語"受試者(subject)"、"患者(patient)"和"個(gè)體(individual)"包括動(dòng)物，諸如哺乳動(dòng)物，包括，但不限于靈長類動(dòng)物、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他?？?、羊科、馬科、犬科、貓科、嚙齒動(dòng)物或鼠科類。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述動(dòng)物是人。如本文所使用的，分離的miR基因產(chǎn)物的"有效量"是指足以抑制遭受實(shí)體癌的受試者中癌細(xì)胞增殖的量。通過考慮因素，諸如受試者的尺寸和體重、疾病入侵的程度、受試者的年齡、健康和性別、給藥途徑以及給藥是局部的或全身的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地確定給給定受試者施用的miR基因產(chǎn)物的有效量。例如，分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可以基于待治療的瘤塊的近似重量。瘤塊的近似重量可以通過計(jì)算所述瘤塊的近似體積確定，其中一立方厘米體積大約相當(dāng)于lg。基于瘤塊重量，分離的ffliR基因產(chǎn)物的有效量可以在約10-500ng/g瘤塊的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，所述瘤塊至少可以是約10pg/g瘤塊、至少大約60pg/g瘤塊或至少大約100ng/g瘤塊。分離的miR基因產(chǎn)物的有效量還可以基于待治療的受試者的近似或估算體重。優(yōu)選地，如本文所述，所述有效量可以腸胃外或腸內(nèi)給藥。例如，給受試者施用的分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可以在約5-3000ng/kg體重、約700-lOOO^ig/kg體重、或大于約100(Vg/kg體重的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以容易地確定給給定受試者施用分離的miR基因產(chǎn)物的合適給藥方案。例如，可以一次給所述受試者施用miR基因產(chǎn)物(例如，以單一注射或沉積(deposition))。或者，可以給受試者施用miR基因產(chǎn)物一天一次或兩次，持續(xù)約3_28天，更具體地約7-10天的周期。在一個(gè)具體的給藥方案中，施用miR基因產(chǎn)物一天一次，持續(xù)7天。在給藥方案包括多次施用的情況下，應(yīng)理解給受試者施用的分離的ffliR基因產(chǎn)物的有效量可以包括整個(gè)給藥方案中施用的基因產(chǎn)物的總量。如本文所使用的，"分離的"miR基因產(chǎn)物是指合成的、或從天然狀態(tài)通過人千預(yù)改變或提取的基因產(chǎn)物。例如，認(rèn)為合成的miR基因產(chǎn)物、或部分或完全分離自其天然狀態(tài)的共存材料的miR基因產(chǎn)物是"分離的"。分離的miR基因產(chǎn)物可以以基本上純的形式存在，或可以存在于所述miR基因產(chǎn)物被遞送到的細(xì)胞中。因此，有意34地被遞送到細(xì)胞或在細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是"分離的"miR基因產(chǎn)物。在細(xì)胞內(nèi)從miR前體分子產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物也被認(rèn)為是"分離的"分子。根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方案，本文所描述的分離的miR基因產(chǎn)物可用于制備藥物，所述藥物用于治療受試者(例如，人)的實(shí)體癌。使用許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以獲得分離的miR基因產(chǎn)物。例如，使用本領(lǐng)域中已知的方法可以化學(xué)合成或重組產(chǎn)生miR基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用適當(dāng)保護(hù)的核糖核苷酸亞磷酰胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀化學(xué)合成miR基因產(chǎn)物。合成的RNA分子或合成試劑的商品供應(yīng)商例如包括，Proligo(Hamburg,Germany)、DharmaconResearch(Lafayette,C0，U,S,A.)、PierceChemical(partofPerbioScience,Rockford，IL，U.S.A.)、GlenResearch(Sterling，VA，U.S.A.)、ChemGenes(Ashland,MA,U.S.A.)和Cruachem(Glasgow,UK)?；蛘撸梢允褂萌魏魏线m的啟動(dòng)子從重組的環(huán)狀或線性DNA質(zhì)粒表達(dá)所述miR基因產(chǎn)物。用于從質(zhì)粒表達(dá)RNA的合適啟動(dòng)子例如包括，U6或HIRNApolIII啟動(dòng)子序列，或細(xì)胞巨化病毒啟動(dòng)子。其他合適啟動(dòng)子的選擇是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。本發(fā)明的重組質(zhì)粒還可以包括用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子。可由重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物可以通過標(biāo)準(zhǔn)^支術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中分離出來。由重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物還可以被遞送至癌細(xì)胞中，并直接在癌細(xì)胞中表達(dá)。在下面將更詳細(xì)討論使用重組質(zhì)粒將miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞中。所述miR基因產(chǎn)物可以由分開的重組質(zhì)粒表達(dá)，或它們可以由相同的重組質(zhì)粒表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物在單一質(zhì)粒中被表達(dá)為RNA前體分子，并且所述前體分子被合適的加工系統(tǒng)加工成功能性miR基因產(chǎn)物，所述加工系統(tǒng)包括但不限于癌細(xì)胞中現(xiàn)存(extant)的加工系統(tǒng)。其他合適的加工系統(tǒng)例如包括，體外果蠅細(xì)胞裂解系統(tǒng)(例如，如在Tuschl等人的美國公開的專利申請No.2002/0086356中所述的，其公開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文)和大腸桿菌RNAseIII系統(tǒng)(例如，如在Yang等人的美國公開的專利申請No.2004/0014113中所述的，其公開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文)。適合表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒的選擇，將核酸序列插入到質(zhì)粒中以表達(dá)所述基因產(chǎn)物的方法，和將重組質(zhì)粒遞送到目的細(xì)胞中的方法是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。例如參見，Zeng等(2002)，MolecularCell9:1327-1333;Tuschl(2002)，Nat.Biotechnol，20:446-448;Br翻elkamp等(2謹(jǐn))，Science296:550-553;Miyagishi等(2002)，Nat.Biotechnol.20:497-500;Paddison等(2002)，GenesDev.16:948-958;Lee等(2002)，Nat，Biotechnol.20:500-505;和Paul等(2002)，Nat.Biotechnol.20:505-508，其公開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)所述miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒包含在CMV中間體早期啟動(dòng)子(CMVintermediate-earlypromoter)的控制下編碼miR前體RNA的序列。如本文所使用的，啟動(dòng)子的"控制下"指編碼所述miR基因產(chǎn)物的核酸序列被定位在啟動(dòng)子的3、使得所述啟動(dòng)子能引發(fā)miR基因產(chǎn)物編碼序列的轉(zhuǎn)錄。還可以由重組病毒載體表達(dá)所述miR基因產(chǎn)物。預(yù)期所述miR基因產(chǎn)物可以由兩個(gè)分開的重組病毒載體表達(dá)，或由相同的病毒載體表達(dá)。由重組病毒載體表達(dá)的RNA可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離自培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，或可以在癌細(xì)胞中被直接表達(dá)。在下面將更詳細(xì)討論重組病毒載體將所述miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞中的使用。本發(fā)明的重組病毒載體包括編碼所述miR基因產(chǎn)物的序列和任何用于表達(dá)所述RNA序列的合適啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子包括，但不限于U6或H1RNApolIII啟動(dòng)子序列或細(xì)胞巨化病毒啟動(dòng)子。其他合適啟動(dòng)子的選擇是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。本發(fā)明的重組病毒載體還可以包括用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或調(diào)節(jié)型36啟動(dòng)子?？梢允褂媚芙邮芩鰉iR基因產(chǎn)物的編碼序列的任何病毒載體；例如，衍生自腺病毒(AV)、腺相關(guān)病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(例如，慢病毒(LV)、棒狀病毒、鼠白血病病毒)、皰滲病毒等的載體?？梢酝ㄟ^用來自其他病毒的衣殼蛋白或其他表面抗原假型包裝栽體，或通過置換不同的病毒殼體蛋白(如果合適的話)來改變所迷病毒載體的向性(tropism)。例如，本發(fā)明的慢病毒栽體用來自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病、埃博拉病毒(Ebola)、Mokola等的表面蛋白進(jìn)行假型包裝。通過改造栽體以表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型，可以使本發(fā)明的AAV載體靶向不同的細(xì)胞。例如，在血清2型基因組上表達(dá)血清2型衣殼的AAV載體被稱為AAV2/2。在AAV2/2載體中這種血清2型衣殼基因能被血清5型衣殼基因替代以產(chǎn)生AAV2/5載體。構(gòu)建表達(dá)不同衣殼蛋白血清型的AAV載體的技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍內(nèi)；例如參見，Rabinowitz，J,E.，等(2002)，J.Virol.76:791-801，其公開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。適用于本發(fā)明的重組病毒載體的選擇，將表達(dá)RNA的核酸序列插入到所述載體中的方法，將病毒載體遞送至目的細(xì)胞的方法，和所表達(dá)的RNA產(chǎn)物的回收是在本領(lǐng)域^支術(shù)范圍內(nèi)的。例如參見，Dornburg(1995)，GeneTherapy2:301-310;Eglitis(1988),Biotechniques6:608-614;Miller(1990)，Hum.GeneTherapy1:5-14;andAnderson(1998)，Nature392:25-30,其/〉開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。特別適合的病毒載體是衍生自AV和AAV的那些。表達(dá)所述miR基因產(chǎn)物的合適AV載體，構(gòu)建所述重組AV載體的方法，和將所述栽體遞送至靶細(xì)胞的方法描述于Xia等(2002)，Nat.Biotech.20:1006-1010，其公開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。表達(dá)miR基因產(chǎn)物的合適AAV栽體，構(gòu)建所述重組AAV栽體的方法，和將所述載體遞送至靶細(xì)胞的方法描述于Samulski等(1987)，LVirol.61:373096-3101;Fisher等(1996)，J.Virol.，70:520-532;Samulski等(1989)，J.Virol.63:3822-3826;美國專利No.5252479;美國專利No.5,139,941;國際專利申請No.WO94/13788;和國際專利申請No.W093/24641，其公開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物表達(dá)自包含CMV中間體早期啟動(dòng)子的單一重組AAV載體。在某一實(shí)施方案，本發(fā)明重組AAV病毒載體包含在人U6RNA啟動(dòng)子的控制下，與polyT終止序列可操作連接的、編碼miR前體RNA的核酸序列。如本文所使用的，"與polyT終止序列可操作連接"指編碼正義或反義鏈的核酸序列與5'方向的polyT終止信號(hào)直接相鄰。在從栽體轉(zhuǎn)錄miR序列期間，polyT終止信號(hào)起終止轉(zhuǎn)錄的作用。在本發(fā)明治療方法的其他實(shí)施方案中，可以給所述受試者施用有效量的至少一種抑制miR表達(dá)的化合物。如本文所使用的，"抑制miR表達(dá)"指治療后miR基因產(chǎn)物的前體和/或活性、成熟形式的產(chǎn)生低于治療前產(chǎn)生的量。例如使用上面關(guān)于診斷方法所討論的測定miR轉(zhuǎn)錄水平的技術(shù)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地確定癌細(xì)胞中miR的表達(dá)是否受到抑制。抑制在基因表達(dá)水平上(即，通過抑制編碼miR基因產(chǎn)物的miR基因的轉(zhuǎn)錄)或在加工水平上(例如，通過抑制將miR前體加工成成熟、活性的miR)發(fā)生。如本文所使用的，抑制miR表達(dá)的化合物的"有效量"是指足以抑制遭受癌癥(例如，結(jié)腸癌)的受試者中癌細(xì)胞增殖的量。通過考慮因素，諸如受試者的尺寸和體重、疾病入侵的程度、受試者的年齡、健康和性別、給藥途徑以及給藥是局部的或全身的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地確定給給定受試者施用的miR表達(dá)抑制化合物的有效量。例如，如本文所述，所述表達(dá)抑制化合物的有效量可以基于待治療瘤塊的近似重量。如本文所述，抑制miR表達(dá)的化合物的有效量還可以基于待治療受試者的近似或估算體重。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以容易地確定給給定受試者施用抑制miR表達(dá)的化合物的合適給藥方案。抑制miR基因表達(dá)的合適化合物包括雙鏈RNA(諸如短或小的干擾RNA或"siRNA")，反義核酸和酶促RNA分子(諸如核酶)。這些化合物的每一個(gè)可以靶向給定miR基因產(chǎn)物并干擾靼miR基因產(chǎn)物的表達(dá)(例如，抑制靶miR基因產(chǎn)物翻譯、誘導(dǎo)乾miR基因產(chǎn)物的切割或破壞)。例如，通過用分離的雙鏈RNA("dsRM")分子i秀導(dǎo)對miR基因的RNA干擾，可以抑制給定miR基因的表達(dá)，所述雙鏈RNA分子與所述ffliR基因產(chǎn)物的至少一部分具有至少90%，例如至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述dsRNA分子是"短或小的干擾RNA"或"siRNA，，。本發(fā)明方法中有用的siRNA包括長度為約17個(gè)核苷酸至約29個(gè)核苷酸的短雙鏈RNA，優(yōu)選長度為約19至約25個(gè)核苷酸。所述siRNA包括一個(gè)正義RNA鏈和一個(gè)互補(bǔ)的反義RNA鏈，通過標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基配對相互作用(以下稱為，，堿基配對，，)退火在一起。正義鏈包括與包含在所述靶miR基因產(chǎn)物內(nèi)的核酸序列基本一致的核酸序列。如本文所使用的，在siRNA中與包含在所述靶mRNA基因產(chǎn)物內(nèi)的核酸序列"基本一致"的核酸序列是與所述靶序列一致或與所述靶序列區(qū)別在于一個(gè)或兩個(gè)核苷酸的核酸序列。siRNA的正義鏈和反義鏈可包括兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈RNA分子，或可包括其中兩個(gè)互補(bǔ)部分通過單鏈"發(fā)夾，，區(qū)堿基配對和共價(jià)連接的單一分子。所述siRNA還可以是改變的RNA，其通過添加、刪除、置換和/或改變一個(gè)或多個(gè)核苷酸而不同于天然存在的RNA。所述改變可包括諸如將非核苷酸材料添加到所迷siRNA的端上或所述siRNA的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核苷酸上，或使siRNA對核酸酶消化具有抗性的修飾，或用脫氧核糖核苷酸置換所述siRNA中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。所述siRNA的一條或兩條鏈還可以包含一個(gè)3'突出端。39如本文所使用的，"3'突出端"指延伸自雙重RM鏈的3'-端的至少一個(gè)未配對的核苷酸。因此，在某些實(shí)施方案中，所述siRNA包括至少一個(gè)長度為1至約6個(gè)核苷酸(其包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)，長度為1至約5個(gè)核苷酸，長度為1至約4個(gè)核苷酸，或長度為約2至約4個(gè)核苷酸的3'突出端。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所迷3'突出端存在于所述siRNA的兩條鏈，且長度為2個(gè)核苷酸。例如，所述siRNA的每一條鏈可包括二胸苷酸("TT")或二尿苷酸("uu")的3'突出端。如上面關(guān)于所述分離的miR基因產(chǎn)物的描述，所述siRNA可以化學(xué)或生物制備，或可以由重組質(zhì)粒或病毒載體表達(dá)。制備和測試dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Gewirtz的美國公開的專利申請No.2002/0173478和Reich等人的美國公開的專利申請No.2004/0018176，兩者公開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。給定miR基因的表達(dá)還可以被反義核酸抑制。如本文所使用的，"反義核酸，，指通過RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用的方式與靶RNA結(jié)合的核酸分子，其改變所述靶RNA的活性。適用于本發(fā)明方法的反義核酸是單鏈核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合體、肽核酸(PNA))，其通常包含與miR基因產(chǎn)物中連續(xù)核酸序列互補(bǔ)的核酸序列。所述反義核酸可包含與miR基因產(chǎn)物中連續(xù)核酸序列50-100%互補(bǔ)、75-100%互補(bǔ)、或95-100%互補(bǔ)的核酸序列。不希望受任何理論限制，認(rèn)為所述反義核酸激活RNaseH或另一個(gè)消化所述miR基因產(chǎn)物/反義合適雙鏈體的細(xì)胞核酸酶。反義核酸還可含有對所述核酸骨架或?qū)μ呛蛪A基部分(或其等價(jià)物)的修飾以增強(qiáng)靶特異性、核酸酶抗性、與分子功效相關(guān)的遞送或其他性質(zhì)。所述修飾包括膽固醇部分、雙鏈嵌入劑(諸如，吖啶)，或一種或多種抗核酸酶基團(tuán)。如上面關(guān)于所述分離的miR基因產(chǎn)物的描述，反義核酸可以化學(xué)或生物制備，或可以由重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)。示例性的制備和測試方法是在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)的；例如參見，SteinandCheng(1993),Science261:1004和Woolf等的美國專利No.5，849，902,其公開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。給定miR基因的表達(dá)還可以被酶促核酸抑制。如本文所使用的，"酶促核酸"指包含與miR基因產(chǎn)物的連續(xù)核酸序列互補(bǔ)的底物結(jié)合區(qū)的核酸，且其能特異性切割miR基因產(chǎn)物。所述酶促核酸底物結(jié)合區(qū)例如可以與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列50-100%互補(bǔ)、75-100%互補(bǔ)、或95-100%互補(bǔ)。所述酶促核酸還可在堿基、糖和/或磷酸基團(tuán)處包含修飾。用于本發(fā)明方法的示例性酶促核酸是核酶。如上面關(guān)于分離的miR基因產(chǎn)物的描述，所述酶促核酸可以化學(xué)或生物制備，或可以由重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)。制備和測試dsMA或siRNA分子的示例性方法描述于Werner和Uhlenbeck(1995),Nucl.AcidsRes.23:2092-96;Hammann等人(1999),AntisenseandNucleicAcidDrugDev.9:25-31;和Cech等的美國專利No.4,987,071，其^^開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。施用至少一種miR基因產(chǎn)物或至少一個(gè)抑制miR表達(dá)的化合物將抑制在患有實(shí)體癌的受試者中癌細(xì)胞增殖。如本文所使用的，"抑制癌細(xì)胞增殖"指殺死所述細(xì)胞、或長期或臨時(shí)妨礙或減慢所述細(xì)胞的生長。如果在施用所迷miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物后，受試者中所述細(xì)胞的數(shù)量維持不變或降低，可以推定癌細(xì)胞增殖的抑制。如果所述細(xì)胞的絕對數(shù)量增加但腫瘤的生長速率降低，也可以推定癌細(xì)胞增殖的抑制。受試者體內(nèi)的癌細(xì)胞數(shù)量可以通過直接測量，或通過根據(jù)原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性瘤塊的大小估計(jì)測定。例如，受試者中癌細(xì)胞的數(shù)量可以通過免疫組織學(xué)方法，流式細(xì)胞儀，或其他設(shè)計(jì)用于檢測癌細(xì)胞特征表面標(biāo)記物的技術(shù)進(jìn)行測量。瘤塊的大小可以通過直接目測法、或通過診斷顯像方法(諸如，X-射線、核磁共振成像、超聲波和閃爍掃描法)確定。如本領(lǐng)域已知的，用于確定瘤塊大小的診斷顯像方法-可以與或不與造影劑41一起使用。瘤塊的大小還可以通過物理手段(諸如組織塊的觸診或用測量儀器(如卡鉗)測量組織塊)確定。可以通過任何適合給受試者的癌細(xì)胞遞送這些化合物的方式給受試者施用所述miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物。例如，可以通過適合用這些化合物或用包括編碼這些化合物的序列的核酸轉(zhuǎn)染受試者細(xì)胞的方法施用所述ffliR基因產(chǎn)物或miR表達(dá)抑制化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，用包含編碼至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物的序列的質(zhì)?；虿《驹泽w轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域所熟知的，例如包括，將所述核酸直接注入細(xì)胞的核或原核中；電穿孔；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移或親脂性材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移；受體介導(dǎo)的核酸遞送、生物彈道(bioballistic)或粒子加速；磷酸鉀沉淀，和病毒栽體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。例如，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移化合物例如，D0TAP(N-[l-(2,3-二油?；趸?丙基]-N，N，N-三甲基-甲基硫酸銨，Boehringer-Mannheim)或等價(jià)物(諸如LIPOFECTIN)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。所使用的核酸的量對本發(fā)明實(shí)踐來說不是關(guān)鍵的；用O.l-lOO]Lig核酸/105細(xì)胞可獲得可接受的結(jié)果。例如，可以使用在3pgDOTAP/10S細(xì)胞中約0.5pg質(zhì)粒載體的比例。還可以通過任何合適的腸內(nèi)或腸胃外施用途徑給受試者施用miR基因產(chǎn)物或ffliR基因表達(dá)抑制化合物。本發(fā)明方法的合適腸內(nèi)施用途徑例如包括，口服、直腸或鼻內(nèi)遞送。合適的腸胃外施用途徑例如包括，血管內(nèi)施用(例如，靜脈內(nèi)推注、靜樂K內(nèi)輸注、動(dòng)脈內(nèi)推注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和導(dǎo)管灌注到脈管系統(tǒng)中)；組織周圍和組織內(nèi)注射(例如，腫瘤周圍和腫瘤內(nèi)注射、視網(wǎng)膜內(nèi)注射、或視網(wǎng)膜下注射)；皮下注射或沉積，包括皮下輸注(諸如通過滲透泵)；直接施用到目的組織；例如通過導(dǎo)管或其他敷設(shè)裝置(例如，視網(wǎng)膜丸?；蛩▌┗虬ǘ嗫?、無孔或凝膠材料的植入物)；和吸入。特別合適的施用途徑是注射、輸注和直接注射到腫瘤中。在本發(fā)明的方法中，miR基因產(chǎn)物或miR基因產(chǎn)物表達(dá)抑制化合物可以以棵RNA，或與遞送劑組合，或以包含表達(dá)所述miR基因產(chǎn)物或ffiiR基因產(chǎn)物表達(dá)抑制化合物的序列的核酸(例如，重組質(zhì)?；虿《据d體)給受試者施用。合適的遞送劑例如包括，MirusTransitTK0親脂試劑；脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(lipofectin);脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine);cellfectin;聚陽離子(例如，聚賴氨酸)和脂質(zhì)體。包含表達(dá)所述miR基因產(chǎn)物或miR基因產(chǎn)物表達(dá)抑制化合物的序列的重組質(zhì)粒和病毒載體，和將所述質(zhì)粒和載體遞送至癌細(xì)胞的技術(shù)如本文所討論的和/或在本領(lǐng)域中是熟知的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用脂質(zhì)體將miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或包括編碼它們的序列的核酸)遞送到受試者中。脂質(zhì)體還可以增加所述基因產(chǎn)物或核酸的血液半衰期。用于本發(fā)明的合適脂質(zhì)體可以由標(biāo)準(zhǔn)微泡形成脂形成，其通過包括中性或帶負(fù)電的磷酸脂和固醇，諸如膽固醇。脂質(zhì)的選擇通常通過考慮因素，諸如所需脂質(zhì)體的大小和血液中所述脂質(zhì)體的半衰期來進(jìn)行指導(dǎo)。已知許多制備脂質(zhì)體的方法例如，如Szoka等(1980)，Ann.Rev.Biophys.Bioeng,9:467;和美國專利Nos.4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所描述的，其公開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。用于本發(fā)明方法的脂質(zhì)體可包括使脂質(zhì)體靶向癌細(xì)胞的配體分子。優(yōu)選與癌細(xì)胞中普遍存在的受體結(jié)合的配體，諸如與腫瘤細(xì)胞抗原結(jié)合的單克隆抗體。還可以修飾用于本發(fā)明方法的脂質(zhì)體以避免被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)("MMS，，)和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)("RES")清除。如此修飾的脂質(zhì)體在表面上具有調(diào)理抑制(opsonization-inhibition)部分或使調(diào)理抑制部分整合到所述脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中。在一個(gè)特別優(yōu)選的,實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可包括調(diào)理抑制部分和配體。用于制備本發(fā)明脂質(zhì)體的調(diào)理抑制部分典型地為與脂質(zhì)43體膜結(jié)合的大的親水聚合物。如本文所使用的，當(dāng)調(diào)理抑制部分與膜化學(xué)或物理連接時(shí)(例如，通過將脂溶性錨插入膜自身中，或通過直接與膜脂的活性基團(tuán)結(jié)合)，調(diào)理抑制部分與脂質(zhì)體膜"結(jié)合，，。這些調(diào)理抑制親水聚合物形成保護(hù)的表面層，其通過MMS和RES顯著降低所述脂質(zhì)體的攝??；例如，如在美國專利No.4，920，016中所描述的，其公開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。適合修飾脂質(zhì)體的調(diào)理抑制部分優(yōu)選是數(shù)均分子量優(yōu)選為約500-40000道爾頓，和更優(yōu)選為約2000-20000道爾頓的水溶性聚合物。所述聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸脂；合成聚合物，諸如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯吡咯烷酮；直鏈、支鏈或樹枝狀聚酰氨基胺；聚丙烯酸；多元醇，例如，與羧基或氨基化學(xué)連接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂(諸如神經(jīng)節(jié)苷脂GM1)。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG的共聚物、或其衍生物也是合適的。此外，所述調(diào)理抑制聚合物可以是PEG與聚氨基酸、多糖、聚酰氨基胺、聚乙烯胺或聚核苷酸之一的嵌段共聚物。所述調(diào)理抑制聚合物還可以是含氨基酸或羧酸的天然多糖，例如，半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、褐藻酸、角叉菜膠、胺化多糖或寡糖(直鏈或支鏈)；或羧化多糖或寡糖，例如，與具有羧酸基團(tuán)所得連接的碳酸衍生物反應(yīng)。優(yōu)選地，所述調(diào)理抑制部分是PEG、PPG、或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物改性的脂質(zhì)體有時(shí)稱為"PEG化脂質(zhì)體"。可以通過眾多熟知技術(shù)中之一，將所述調(diào)理抑制部分與脂質(zhì)體膜連接。例如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯可以與磷脂酰乙醇胺的脂溶性錨結(jié)合，然后與膜結(jié)合。類似地，葡聚糖聚合物可以在60。C下經(jīng)由使用Na(CN)BH3和溶劑混合物(諸如30:12的四氫呋喃和水)的還原性胺化(ainination)用硬脂酰氨脂溶性錨衍生。經(jīng)調(diào)理抑制部分改性的脂質(zhì)體比未改性的脂質(zhì)體在循環(huán)中維持更長時(shí)間。因此，所述脂質(zhì)體有時(shí)稱為"隱形，，脂質(zhì)體。已知隱形脂質(zhì)體在由多孔或"滲透，，微血管系統(tǒng)供養(yǎng)的組織中聚集。因此，44這種微血管系統(tǒng)缺陷表征的組織，例如，實(shí)體瘤將有效聚集這些脂質(zhì)體，參見Gabizon，等(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.,18:6949-53。此外，RES攝取的降低通過防止肝和脾內(nèi)脂質(zhì)體顯著的積累來降低隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理抑制部分改性的脂質(zhì)體特別適合于將miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或包括編碼它們的序列的核酸)遞送至腫瘤細(xì)胞。根據(jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，所述miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物可配制成藥物組合物，在給受試者施用它們之前，有時(shí)稱為"藥物"。因此，本發(fā)明包括治療實(shí)體癌的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含至少一個(gè)分離的miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物活性片段，和藥學(xué)可接受的載體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物對應(yīng)于一種raiR基因產(chǎn)物，其相對于合適的對照細(xì)胞，在實(shí)體癌細(xì)胞中具有降低的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，所述分離的ffliR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種miR表達(dá)抑制化合物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因表達(dá)抑制化合物對miR基因具有特異性，所述miR基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)高于在對照細(xì)胞中的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述miR基因表達(dá)抑制化合物對一種或多種miR基因產(chǎn)物具有特異性，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。本發(fā)明的藥物組合物特征在于至少是無菌和無致熱原的。如本文所使用的，"藥物組合物，，包括用于人和獸醫(yī)用途的制劑。本發(fā)明藥物組合物的制備方法是在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)的，例如，如在Remington'sPharmaceuticalScience,第17版,MackPublishingCompany,Eastern,Pa.(1985)中所述的，其公開的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種miR基因產(chǎn)物或miR45基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)(例如，0.1-90重量％)或其生理學(xué)可接受的鹽，與藥學(xué)可接受的栽體混合。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物還包含一種或多種抗癌試劑(例如，化療試劑)。本發(fā)明的藥物制劑還包含至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)，其被脂質(zhì)體和藥學(xué)可接受的栽體封裝成膠嚢。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含為miR-21的miR基因或基因產(chǎn)物。尤其適合的藥學(xué)可接受的載體是水、緩沖水溶液、正常鹽水、0.4%鹽水、0.3%甘氨酸、透明質(zhì)酸等。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含對核酸酶降解具有抗性的至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地合成核酸酶抗性的核酸，例如，通過將一種或多種在2'-位置修飾的核糖核苷酸整合到所述miR基因產(chǎn)物中。合適的2'-修飾的核糖核苷酸包括在2'-位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和0-烯丙基修飾的那些。本發(fā)明的藥物組合物還包含常規(guī)的藥物賦形劑和/或添加劑。合適的藥物賦形劑包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、等滲調(diào)節(jié)劑、緩沖劑和pH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑例如包括，生理學(xué)上生物相容的緩沖溶液(例如，鹽酸氨丁三醇)，加入螯合劑(諸如，例如，DTPA或DTPA-雙酰胺)或鈣螯合復(fù)合物(諸如，例如，鈣DTPA、CaNaDTPA-雙酰胺)、或任選地加入鉀或鈉鹽(例如，氯化鈞、抗壞血酸鈣、葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)?？砂b本發(fā)明的藥物組合物以液體形式使用或可將其凍千。對于本發(fā)明的固體藥物組合物，可以使用常規(guī)無毒的固體藥學(xué)可接受載體；例如，醫(yī)藥級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。例如，口服施用的固體藥物組合物可包含上面所列的任何載體和賦形劑，且包含10-95%、優(yōu)選25%-75%的所述至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)。用于氣溶膠(吸入)施用的藥物組合物可包含如上所述封裝在脂質(zhì)體中的0.01-20重量％、優(yōu)選1重量％-10重量％的所述至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)，和推進(jìn)劑。還可以根據(jù)需要包含載體，例如，用于鼻內(nèi)遞送的卵磷脂。本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包含一種或多種抗癌試劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述組合物包含至少一種miR基因產(chǎn)物或iniR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)和至少一種化療試劑。適用于本發(fā)明方法的化療試劑包括，但不限于，DNA-烷基化試劑、抗腫瘤抗生素試劑、抗代謝試劑、微管蛋白穩(wěn)定劑、微管蛋白去穩(wěn)定劑、荷爾蒙拮抗劑、拓樸異構(gòu)酶抑制劑、蛋白激酶抑制劑、HMG-CoA抑制劑、CDK抑制劑、細(xì)胞周期蛋白抑制劑、胱天蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、反義核酸、三螺旋DNA、核酸適配體(nucleicacidsaptamers)，以及分子改良的病毒、細(xì)菌和外毒素試劑。適合本發(fā)明組合物的試劑的實(shí)例包括，但不限于胞苷阿拉伯糖苷、甲氨蝶呤、長春新堿、依托泊甙(VP-16)、阿審素(亞德里亞霉素)、順鉑(CDDP)、地塞米松、arglabin、環(huán)磷酰胺、沙可來新、甲基亞硝基脲、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶(5FU)、長春花堿、喜樹堿、放線菌素-D、絲裂霉素C、過氧化氫、奧沙利鉑、依立替康、拓樸替康、醛氫葉酸、卡氮芥、鏈脲佐菌素、CPT-ll、紫杉醇、他莫昔芬、達(dá)卡巴嗪、利妥昔單抗、柔紅霉素、l-P-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、伊馬替尼、氟達(dá)拉濱、多西他塞、FOLFOX4。本發(fā)明還4^供腫瘤形成抑制劑的鑒定方法，包括給細(xì)胞提供測試試劑并測量所述細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括給細(xì)胞提供一種測試試劑并測量癌細(xì)胞中與表達(dá)水平降低相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在提供所述試劑后，相對于合適的對照細(xì)胞(例如，沒有提供試劑)，所述細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物水平的增加指示所述測試試劑為肺瘤形成的抑制劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在癌細(xì)胞中與表達(dá)水平降低相關(guān)的至少一47種miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在其他實(shí)施方案中，所述方法包括給細(xì)胞提供一種測試試劑并測量癌細(xì)胞中與表達(dá)水平增加相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在提供試劑后，相對于合適的對照細(xì)胞(例如，沒有提供試劑)，所述細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物水平的降低指示所述測試試劑為腫瘤形成的抑制劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在癌細(xì)胞中與表達(dá)水平增加相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自由ffliR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。合適的試劑包括，但不限于藥物(例如，小分子、多肽)，和生物大分子(例如，蛋白、核酸)。所述試劑可以重組、合成產(chǎn)生，或其可以由天然來源分離(即，純化)。給細(xì)胞提供所述試劑的各種方法(例如，轉(zhuǎn)染)是本領(lǐng)域中熟知的，所述方法中的幾個(gè)描述于上文中。檢測至少一種miR基因產(chǎn)物表達(dá)的方法(例如，Northern印跡、原位雜交、RT-PCR、表達(dá)分析)也是本領(lǐng)域中熟知的。這些方法中的幾個(gè)也描述于上文中。本發(fā)明現(xiàn)在將通過下述非限制性實(shí)施例進(jìn)行描述。實(shí)施例實(shí)施例1結(jié)腸腫瘤中微小RNA表達(dá)模式的改變使用微小RNA微陣列比較84對結(jié)腸腫瘤和臨近非腫瘤組織的微小RNAi普3°。這84個(gè)受試者是招募自馬里蘭巴爾的摩地區(qū)的患者，所述患者患有易發(fā)性結(jié)腸腺癌(incidentcolonadenocarcinoma)，并稱為馬里蘭觀'J試群(cohort)(表l)。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>'遠(yuǎn)端的包括位于或遠(yuǎn)離降結(jié)腸的腫瘤。近端的腫瘤包括位于或臨近脾曲的胂瘤。最初群中82個(gè)受試者和驗(yàn)證群中所有受試者的腫瘤部位是可利用。2測試群中59個(gè)受試者和驗(yàn)證群中所有受試者的與接受化學(xué)治療相關(guān)的詳細(xì)信息是可利用?；瘜W(xué)治療主要是基于氟尿嘧啶(以靜脈內(nèi)5-氟尿嘧啶或包括替加氟與尿嘧啶[UFT]的口服藥物形式)，伴有或無左旋咪唑或醛氫葉酸。腫瘤微小RNA鐠明顯不同與非腫瘤鐠。發(fā)現(xiàn)37個(gè)獨(dú)立的微小RNA在腫瘤中差異表達(dá)(p<0.001，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率<0.5%;表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>hsa-miR-324-5pNo2miR-324-5p1.00E-040.000960.917pl3.1hsa-mir-030a-precNo2miR-30a-3p0.00019330.0017J_fc~96ql3hsa-mir-l-lNo2raiR-l0.00029060.002160.920ql3,33hsa-mir-34cNo2miR-34c0.00073340.003920,9llq23.1hsa-mir-331No2toiR-3310.00085550.004460.912q22hsa-mir-148bNo2miR-l楊0.00087260.004460.912ql3.13^艮導(dǎo)的P-值是來自84對結(jié)腸腺癌和非腫瘤組織的微小RNA表達(dá)模式的成對分類比較分析結(jié)果。2FDR-錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率26個(gè)微小RNA在腫瘤中以較高水平表達(dá)，其中miR-21富集最高為1.8倍。通過使用3-最近鄰或最近質(zhì)心算法類預(yù)測算法，總微小RNA鐠在腫瘤和配對非腫瘤組織之間的區(qū)別具有89%的準(zhǔn)確度，(10倍交叉驗(yàn)證，重復(fù)100次)，顯示在腫瘤形成中微小RNA表達(dá)模式的系統(tǒng)變化?；谒鼈冊谀[瘤和成對非胂瘤組織之間的表達(dá)差異結(jié)合它們與差的存活的相關(guān)性，選擇miR-20a、miR-21、miR-106a、mtR-181b和miR-203用于驗(yàn)證。關(guān)于驗(yàn)證，用qRT-PCR測量這些微小RNA在來自獨(dú)立群的腫瘤和配對非腫瘤組織中的表達(dá)水平。驗(yàn)證群由113個(gè)招募自中國香港的患者組成，所述患者患有易發(fā)性結(jié)腸癌(表l)。MiR-20a(2.3倍)、miR-21(2.8倍)、miR106a(2.4倍)、miR-181bU.4倍)和miR-203U.8倍)在腫瘤中均以較高水平表達(dá)(p〈0.001，Wilcoxon配對測試)(表3a)。表3-胂瘤相對配對非腫瘤組織中微小RNA的表達(dá)表3a—香港驗(yàn)證群變化倍數(shù)微小RNAAACt'SD(△△Ct)月中瘤2P-值3miR-20a1.180.972.3倍p<0.001miR-211.471.202.8倍p<0.001miR-106a1.250.942.4倍p<0.001miR-mb0.471.031.4倍p<0.001miR-2030.831.401.8倍p<0.00151表3b腺瘤相對配對非腺瘤組織中微小RNA的表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>'來自qRT-PCR的平均(腫瘤ACt-配對非腫瘤ACt)或平均(腺瘤厶Ct-配對非腺瘤ACt)。2根據(jù)2AA3Wilcoxon配對測試計(jì)算。SD-標(biāo)準(zhǔn)偏差。加黑數(shù)字是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。對于腫瘤/非腫瘤比較，針對miR-20a和miR-203l吏用113對組織，而針對miR-21、miR-106a、和miR-181b使用lll對組織。對于所有的腺瘤/非腺瘤比較，使用18對組織。大多數(shù)腫瘤(miR-20a為89%、miR-21為87%、miR-106a為90%、miR-181b為71%和miR-203為74%)中這些微小RNA的表達(dá)比配對非腫瘤組織高。分別基于3-最近鄰或最近質(zhì)心算法，這5種微小RNA的表達(dá)模式在肺瘤相對配對非腫瘤之間的區(qū)別具有96%或98%的準(zhǔn)確度(IO倍交叉驗(yàn)證，重復(fù)100次)。使用原位雜交來顯現(xiàn)肺瘤和鄰近非腫瘤組織中miR-n的表達(dá)(參見圖la-f)。與鄰近的非腫瘤組織相比，MiR-21在人腫瘤組織的結(jié)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均以高水平表達(dá)。這些結(jié)果與qRT-PCR和微陣列數(shù)據(jù)一致，并支持微小RM在癌發(fā)生中的地位。MiR-21在結(jié)腸腺瘤中以較高水平表達(dá)腺瘤代表結(jié)腸腺癌的前體階段3。通過qRT-PCR測試18對腺瘤和鄰近非腺瘤組織中miR-20a、邁iR21、miR-106a、miR-181b和miR-203的表達(dá)水平。雖然5個(gè)微小RNA中的4個(gè)在腺瘤組織中顯示出增加的水平，但只有miR-21顯著富集，為1.6-倍高(p-O.006，Wilcoxon配對測試)(參見表Sb)。腺瘤組織在15/18配對中表達(dá)較高水平的miR-21。較晚期階段的腫瘤表達(dá)較高水平的miR-21。根據(jù)腺瘤的診斷和TNM分期對受試者進(jìn)行分類，而認(rèn)為腺瘤為最早期和TNMIV期為最晚期。與來自驗(yàn)證群的腫瘤相比，腺瘤表達(dá)較低水平的miR-21表達(dá)(p〈0.001，Mann-Whitney測試)。較晚期的腫瘤表達(dá)較高水平的miR-21表達(dá)(測試趨勢，P<0.001)(參見圖lg)。使用來自馬里蘭測試群的微小RNA微陣列數(shù)據(jù)也觀察到這個(gè)趨勢(p-O.04)(參見圖2)。高miR-21表達(dá)預(yù)測在兩個(gè)獨(dú)立群中差的預(yù)后分析個(gè)別微小RNA肺瘤/非腫瘤(T/N)表達(dá)比以確定是否與差的預(yù)后有關(guān)。基于最高的三分位組，將T/N微小RNA表達(dá)比分類為高的。搜索任何高TIN比與癌癥存活相關(guān)的微小RNA(p<0.05)。根據(jù)這些，選擇在腫瘤中差異表達(dá)的微小RM(p<0.001)。5個(gè)微小RNA滿足這些標(biāo)準(zhǔn)。Kaplan-Meier分析表示miR-20a(p-O.02)、miR-21(p-0.004)、miR-106a(p-0.01)、miR-181b(p=0.04)和miR-203(p-O.004)的高T/N比各自與差的存活相關(guān)。選擇這5個(gè)微小RNA用于進(jìn)一步分析。在該研究中，來自89-93%的受試者的結(jié)腸腺癌具有典型的組織結(jié)構(gòu)。少數(shù)腫瘤具有粘液腺癌、腺鱗狀癌或印戒細(xì)胞癌組織結(jié)構(gòu)(參見表1)。不同亞型的腺癌與不同的臨床結(jié)果相關(guān)，包括存活預(yù)后31。為了除去與組織結(jié)構(gòu)相關(guān)的潛在混淆，從最初分析中排除所有患有粘液腺癌、腺鱗狀癌和印戒細(xì)胞癌的受試者。T/N比與差的存活的相關(guān)性歸因于腫瘤組織、周圍非腫瘤組織、或兩者的組合中微小RNA的表達(dá)水平。為了區(qū)分這些可能性，分別分析了微小RNA表達(dá)在腫瘤和配對非腫瘤中的相關(guān)性。腫瘤中miR-20a、miR-21、miR106a、miR-181b和miR-203的高表達(dá)水平(基于最高的三分位組)各自與馬里蘭測試群中的差的存活相關(guān)(參見圖3a，還來自未顯示的數(shù)據(jù))。沒有觀察到這5個(gè)微小RNA中的任何一個(gè)與非腫瘤組織中微小RNA表達(dá)顯著相關(guān)。使用單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析評(píng)價(jià)患有典型腺癌的個(gè)體中腫瘤表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性(表4a)。表4-患有結(jié)腸腺癌的受試者中miR-21表達(dá)水平和總癌癥存活率的單變量和多變量Cox回歸分析1<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><50》501.5(0.9-2.6)0.14性別女性1.0男性1.4(0.8-2.3)0.29腫瘤部位遠(yuǎn)端的1.0近端的0.7(0.3-1.4)0.27用馬里蘭群的miRNA微陣列和用香港群的qRT-PCR測量微小RNA表達(dá)。i在分析中排除粘液腺癌、腺鱗狀癌或印戒細(xì)胞癌的病例。2多變量分析使用逐步加入和除去發(fā)現(xiàn)與單變量模型中的存活相關(guān)的臨床協(xié)變量(p<0.10)，且最終模型僅包括與存活顯著相關(guān)的那些協(xié)變量(Wald統(tǒng)計(jì)p<0.05)。3基于最高的三分位組，定義腫瘤中所有miRNA的高表達(dá)。在單變量(HR=2.5[1.2-5.2]，p=0.01)和多變量(HR-2.9[1.4-6.1]，p=0.004)分析中，具有表達(dá)高水平miR-21的腫瘤的個(gè)體處在顯著較高的死于結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)中。為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，使用qRT-PCR來測量香港驗(yàn)證群中這五個(gè)微小RNA的腫瘤和非腫瘤表達(dá)水平，并分析與預(yù)后的相關(guān)性。高的miR-21腫瘤表達(dá)預(yù)測香港驗(yàn)證群中差的預(yù)后(p-0.001，Kaplan-Meierlog秩測試)，而在非肺瘤組織中的表達(dá)沒有這種情況(參見圖3b)。沒有發(fā)現(xiàn)在所述群中預(yù)后與miR-20a、miR-106a、181b或miR-203的表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)。在香港驗(yàn)證群中，腫瘤中高的miR-21表達(dá)與年齡、性別、腫瘤組織結(jié)構(gòu)或腫瘤部位不是顯著相關(guān)的(Fisher'sexacttest)。通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析檢查所有的協(xié)變量(表4b)。，p-0.002)和TNM分期(HR-4.7[2.4-9.5],p<0.001)與單變量模型中的存活率顯著相關(guān)。多變量Cox回歸分析證實(shí)腫瘤中高的miR-21表達(dá)預(yù)測差的存活預(yù)后(HR-2.4[1.4-4.1]，p-0.002)，獨(dú)立于其他臨床協(xié)變量，與馬里蘭測試群中的結(jié)果一致。重復(fù)包括所有受試者的分析，不考慮腫瘤組織結(jié)構(gòu)。在兩個(gè)群中，高miR-21表達(dá)與預(yù)后之間存在相關(guān)性(參見圖4，參見表5)。表5_對于所有受試者，受試者中miR-21表達(dá)水平和總癌癥存活的單變量和多變量Cox回歸分析表5a馬里蘭測試群<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>用馬里蘭群的miRNA微陣列和用香港群的qRT-PCR測量微小RNA的表達(dá)。1在所述分析中包括所有的個(gè)體，不考慮腫瘤組織結(jié)構(gòu)。2多變量分析使用逐步加入和除去發(fā)現(xiàn)與單變量模型中的存活相關(guān)的臨床協(xié)變量(P<0.10),且最終的模型僅包括與存活顯著相關(guān)的那些協(xié)變量(Wald統(tǒng)計(jì)p<0.05)。3基于最高的三分位組，定義腫瘤中所有miRNA的高表達(dá)。MiR-21的表達(dá)水平和對治療的應(yīng)答對與對輔助化學(xué)治療的應(yīng)答相關(guān)的生物標(biāo)記的鑒定允許醫(yī)師更好地預(yù)測治療的益處。為此，分析了II和III期癌癥患者中miR-21表達(dá)與對輔助化學(xué)治療的應(yīng)答的相關(guān)性。關(guān)于施用輔助化學(xué)治療的信息在馬里蘭測試群的65個(gè)II和III期受試者中的W個(gè)以及香港驗(yàn)證群的所有受試者中是可利用的。在這兩個(gè)群中，化學(xué)治療方案主要是基于氟尿嘧啶(以靜脈內(nèi)5-氟尿嘧啶的形式或以包括替加氟與尿嘧啶[UFT]的口服藥物形式)，伴有或無左旋咪唑或醛氫葉酸。在所述分析中僅使用患有典型腺癌組織結(jié)構(gòu)受試者，使剩下馬里蘭群中42個(gè)II/III期的個(gè)體中的20個(gè)接受化學(xué)治療。對接受化學(xué)治療的那些，腫瘤中高的miR-21表達(dá)預(yù)測較差的總存活(p=0.01，Kaplan-Meierlog秩測試)，初步支持高的miR-21與對輔助化學(xué)治療的差應(yīng)答相關(guān)。對于香港驗(yàn)證群，所述分析使用患有n/in期癌癥的具有典型腺癌組織結(jié)構(gòu)的77個(gè)個(gè)體。接受輔助化學(xué)治療的n/in期受試者比沒有接受輔助化學(xué)治療的那些具有更好的存活預(yù)后(P=0.02,Kaplan-Meierlog秩測試)。在接受輔助化學(xué)治療的那些受試者中(n=36)，腫瘤中高的miR-21表達(dá)與對治療的差應(yīng)答相關(guān)(p=0.03，Kaplan-Meierlog秩測試)，與馬里蘭群中的觀察一致(參見圖5a)。在所述群中，接受輔助化學(xué)治療的所有II期受試者(n-11)均存活(參見圖5b)，但對接受輔助化學(xué)治療的III期受試者(n=25)，高的miR-21表達(dá)與差的存活相關(guān)(p=0.02，Kaplan-Meierlog秩測試)(參見圖5c)。使用多變量Cox回歸分析對這些觀察進(jìn)行分析顯示高的raiR-21表達(dá)預(yù)測差的預(yù)后(HR=3.1[1.5-6.1];p=0.001)并且接受化學(xué)治療預(yù)測改善的存活結(jié)果(HR=0.3;p<0.001),獨(dú)立于其他臨床協(xié)變量(表6a)。表6-單變量和多變量cox回歸分析患有腺癌的i/nr期受試者中miR-21表達(dá)、輔助化學(xué)治療的接收和癌癥的存活<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>p-0.004)，獨(dú)立于其他臨床些變量(表6b)。討論使用兩個(gè)獨(dú)立的群分析結(jié)腸癌組織中微小RNA鐠。根據(jù)微小RNA微陣列分析，37個(gè)微小RNA在腫瘤組織中差異表達(dá)。被測試的所有5個(gè)微小RNA的表達(dá)模式都在香港群中進(jìn)行驗(yàn)證。5個(gè)微小RM在腫瘤和非腫瘤組織之間不同的鑒別力表示在腫瘤形成期間微小RNA表達(dá)模式發(fā)生可預(yù)測和系統(tǒng)的變化且可能代表大多數(shù)散發(fā)性結(jié)腸腺癌。發(fā)現(xiàn)miR-20a、miR-21、miR-106a、miR-181b和miR-203都在結(jié)腸腫瘤中以較高水平表達(dá)。微小RNA表達(dá)模式的這些變化可能僅僅與結(jié)腸癌相關(guān)或引起癌癥的組織結(jié)構(gòu)的進(jìn)展。存在有力證據(jù)表示微小RNA表達(dá)模式的變化促進(jìn)肺瘤形成，特別是miR-20a和miR-21。miR-20a是miR-17-92多順反子微小RNA蔟的一部分32。所述簇的過表達(dá)增強(qiáng)體外細(xì)胞增殖"并加速動(dòng)物模型中的腫瘤形成16。niiR-17-92簇的強(qiáng)制表達(dá)通過負(fù)調(diào)節(jié)抗血管生成Tspl蛋白引起小鼠中增加的腫瘤大小和腫瘤血管形成"。實(shí)驗(yàn)證據(jù)還顯示miR-21表達(dá)的提高促進(jìn)腫瘤發(fā)育。在大多數(shù)實(shí)體瘤中miR-21以高水平表達(dá)19'34。miR-21的過表達(dá)在人惡性膠質(zhì)瘤中用作抗細(xì)胞凋亡因子13。miR-21的抑制通過間接下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2來抑制體外細(xì)胞生長并抑制異種移植小鼠模型中腫瘤生長35。人細(xì)胞系的研究顯示miR-21還能靶向腫瘤抑制基因PTEN"和TPM137。所有這些數(shù)據(jù)一起支持腫瘤形成期間微小RNA表達(dá)的變化具有因果作用。腺瘤代表腺癌的前體時(shí)期。腺瘤表達(dá)高水平的miR-21。如果miR-21表達(dá)的增加促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展，腺瘤中增加的表達(dá)可能是向癌癥發(fā)展的一個(gè)早期細(xì)胞事件。抑制miR-21活性可能幫助防止處于結(jié)腸癌高風(fēng)險(xiǎn)的群(如患有家族性腺瘤性息肉病的個(gè)體)中腫瘤的促進(jìn)38。因此，本文呈現(xiàn)的證據(jù)證實(shí)了微小RNA表達(dá)模式與結(jié)腸癌預(yù)后和對輔助化學(xué)療法的應(yīng)答之間的相關(guān)性。較晚期的腫瘤表達(dá)較高水平的miR-21。分別在馬里蘭測試群和香港驗(yàn)證群中觀察到腫瘤中高miR-21表達(dá)與差的存活之間的穩(wěn)固相關(guān)性。在每個(gè)群中，這些相關(guān)性獨(dú)立于所有其他臨床協(xié)變量，表示除了TNM分期和其他臨床參數(shù)外miR-21表達(dá)可能是一個(gè)有用的預(yù)后指示，以幫助鑒定處于較高末期癌癥風(fēng)險(xiǎn)中的患者。這些觀察在具有不同種族和地理組成的兩個(gè)獨(dú)立的群中進(jìn)行。因此，所述觀察廣泛適用于其他群體是可能的。在這兩個(gè)群中，肺瘤中高的miR-21表達(dá)與對輔助化學(xué)療法的差應(yīng)答相關(guān)。這些結(jié)果有助于預(yù)測個(gè)體中治療的益處，所述個(gè)體的miR-21表達(dá)情況是已知的。此外，如果高的miR-21表達(dá)引起結(jié)腸癌患者的差的存活，antagomirs"'"或其他靶向miR-21的反義治療劑在具有高miR-21表達(dá)的腫瘤的受試者中可具有治療益處。除了目前的治療外，這些可用于改善存活結(jié)果。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌和配對非結(jié)腸癌組織之間微小RNA表達(dá)模式的系統(tǒng)差異。腫瘤中高的miR-21表達(dá)預(yù)測在兩個(gè)獨(dú)立群中差的存活結(jié)果和對輔助化學(xué)治療的差應(yīng)答，獨(dú)立于分期和其他臨床協(xié)變量，表示其可能是有用的結(jié)腸腺癌診斷和存活預(yù)后(包括對治療的應(yīng)答)的生物標(biāo)記。方法組織的收集和RNA分離來自84個(gè)招募自1993至2002年期間馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的患者的原發(fā)性結(jié)腸肺瘤和鄰近的非腫瘤組織對，以及來自113個(gè)招募自1991至2000年期間香港瑪麗醫(yī)院的患者的原發(fā)性結(jié)腸腫瘤和鄰近的非肺瘤組織對。收集了每個(gè)組織捐贈(zèng)者的詳細(xì)背景，包括年齡、性別、臨床分期、腫瘤部位、從診斷到接受輔助化學(xué)治療的存活時(shí)間。才艮據(jù)腫瘤體系的世界衛(wèi)生組織分類1(WorldHealthOrganizationClassificationofTumorsystem)對腫瘤組織病理學(xué)進(jìn)行分類。腺瘤組織獲自CooperativeHumanTissueNetwork。所述研究得到美國國家衛(wèi)生院的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(InstitutionalReviewBoardoftheNationalInstitutesofHealth)、香港f緣/HospitalAuthorityHongKongWestCluster的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)和馬里蘭大學(xué)關(guān)于人受試者研究的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(InstitutionalReviewBoardforHumanSubjectResearchattheUniversityofMaryland)的批準(zhǔn)。RNA分離和微小RNA鐠使用標(biāo)準(zhǔn)的TRIZ0L(Invitrogen，Carlsbad)方法從組織中提取RNA。如之前所描述，進(jìn)行微小RNA微陣列分析3。。簡而言之，標(biāo)記5lag的總RNA并與每一包含約400個(gè)人微小RNA探針(一式四份)的微小RNA微陣列雜交。使用PerkinElmerScanArrayLX5K掃描儀掃描載片(slide)。根據(jù)制造商關(guān)于7500實(shí)時(shí)RT-PCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity)的說明，使用Taqman微小RNA測試(AppliedBiosystems,FosterCity)進(jìn)行微小RNA的qRT-PCR。U6B是所有qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化對照。所有試驗(yàn)按一式兩份(miR-20a、miR-203)或一式三份(miR-21、miR-106a、miR-181b)進(jìn)行。AJS對miR-21、miR-106a和miR-181b進(jìn)行qRT-PCR,AJS看不見那時(shí)驗(yàn)證群成員的存活結(jié)果和臨床數(shù)據(jù)。微陣列分析在所述出版物中討論的數(shù)據(jù)已經(jīng)存放在NCBIsGeneExpressionOmnibus(GEO,http:〃w而.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)并通過GE0系列登記號(hào)GSE7828可獲得。將LOESS標(biāo)準(zhǔn)化的微陣列數(shù)據(jù)輸入到BRBarraytools3.5.0(http:〃linus.nci.nih.gov/.BRB-ArrayTools.html)并用所述軟件進(jìn)行所有的后續(xù)微陣列分析。進(jìn)行微陣列分析。從分析中除去其值損失大于20%的陣列的探針，留下230個(gè)探針。成對的、分類比較分析識(shí)別在腫瘤中差異表達(dá)的微小RNA(p<0.G01)。62為了最初搜索與差的存活相關(guān)的微小RNA，使用微陣列數(shù)據(jù)分析馬里蘭群中的腫瘤/非腫瘤(T/N)微小RNA的表達(dá)比。通過從1og2腫瘤表達(dá)值減去1og2非腫瘤表達(dá)值產(chǎn)生微小RNA的TN表達(dá)比。過濾掉損失大于25%的T/N比的微小RNA，留下208個(gè)。將T/N表達(dá)比分成兩部分，最高的三分位組分類為高的和較低的2個(gè)三分位組被分類為低的(參見補(bǔ)充方法)。所述高/低分界在整個(gè)研究中普遍使用。基于所有存活相關(guān)性的分析的微陣列實(shí)驗(yàn)的日期，對腫瘤和非腫瘤微小RNA表達(dá)水平進(jìn)行分批標(biāo)準(zhǔn)化。原位雜交用人miR-21探4十、scramble和U6(Exiqon,Woburn)進(jìn)行原位雜交(ISH),帶有由W.Kloosterman所著的關(guān)于人結(jié)腸組織的甲醛固定石蠟包埋(FFPE)組織的制造商方案的改進(jìn)版本(liil2L//www,exiqon.com/uploads/.LNA52-FFPEmiRNAinsituj.rotocol.pdf)。改進(jìn)包括使用多克隆兔抗-DIG/HRP-綴合抗體和DakoCytomationGenPointTyramideSignalAmplicationSystem(DakoCytomation，Carpinteria)、以及VECT0RNovaRed底物(VectorLaboratories,Burlingame)。在使用OlympusDP70數(shù)碼相機(jī)和DPcontroller軟件(Olympus,Champaign)的OlympusBX40顯微鏡上獲得圖像。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用Wilcoxon配對測試來分析所有qRT-PCR數(shù)據(jù)中腫瘤和配對非腫瘤組織之間微小RNA表達(dá)的差異，以及腺瘤和配對非腺瘤組織之間的差異。所報(bào)道的所有趨勢測試是關(guān)于有序組趨勢的非參數(shù)測試。用WINSTAT2001(R.FitchSoftware)進(jìn)行所有Kaplan-Meier分析。使用IntercooledStata9.2(StataCorpLP，CollegeStation)進(jìn)行多變量Cox回歸分析。最終的多變量模型基于逐步加入和除去發(fā)現(xiàn)與單變量模型中差的存活相關(guān)的臨床協(xié)變量63(p<0.10)。采用p<0.05的Wald統(tǒng)計(jì)量作為最終多變量模型中內(nèi)含物的標(biāo)準(zhǔn)。所報(bào)導(dǎo)的所有p-值是雙邊的。所報(bào)導(dǎo)的風(fēng)險(xiǎn)落在95%的置信區(qū)間內(nèi)。使用GraphpadPrism4.0(GraphpadSoftwareInc.,SanDiego)繪制表達(dá)圖。其他微陣列分析用于該分析的微陣列是針尖打點(diǎn)的(pin-spotted)微小RNA孩丈陣歹寸(來自O(shè)hioStateUniversityComprehensiveCancerCenter,version2.0)。每一個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度是前景的中間強(qiáng)度。用于所述研究的170個(gè)微陣列的每一個(gè)包含11520個(gè)點(diǎn)。前景強(qiáng)度低于背景的所有點(diǎn)被再指定為NA(NA標(biāo)記缺失的數(shù)據(jù)點(diǎn))。掃描儀標(biāo)記為不足的所有點(diǎn)也被再指定為NA。所有具有高前景強(qiáng)度的空白(nooligo)點(diǎn)被再指定為NA。每一個(gè)微小RNAoligo由這些陣列上的點(diǎn)(一式四份)表示為兩個(gè)鄰近點(diǎn)的遠(yuǎn)對(distantpair)。3口果一個(gè)oligoquadruple存在0或1個(gè)NA，和遠(yuǎn)的oligo對的平均值在log2量度上的區(qū)別大于l，所有一式四份的點(diǎn)被再指定為M。如果一個(gè)oligoquadruple存在2個(gè)NA，和2個(gè)非NA點(diǎn)強(qiáng)度在log2量度上的區(qū)別大于1,所有一式四份的點(diǎn)被再指定為NA。如果一個(gè)quadruple存在3個(gè)NA點(diǎn)，最終的點(diǎn)被再指定為NA。使用這些方法，總共在1，958，400個(gè)點(diǎn)中有1，082，689個(gè)被再指定為NA。使用R軟件包進(jìn)行LOESS(LocallyWeightedScatterplotSmoothing)標(biāo)準(zhǔn)化。然后將所有數(shù)據(jù)輸入BRBarraytoolsversion3，5.0以進(jìn)4亍分才斤并對所有重復(fù)點(diǎn)進(jìn)行平均。使用最初存在85對(腫瘤和配對非腫瘤組織)的陣列。一個(gè)最初被鑒定為易發(fā)性結(jié)腸腺癌的患者的病例后來發(fā)現(xiàn)被診斷為原位癌，并從所述分析中除去，留下84個(gè)受試者的研究群。過濾微小RNA的列表使其僅包括389個(gè)人hsa-miRprobesets。對其進(jìn)一步過濾以除去任何在超過25%的陣列中缺少的探針組，留下230個(gè)人微小RNA探針組。使用成對的分類比較分析來鑒定在肺瘤和配對非腫瘤組織中差異表達(dá)的微小RNA。對于兩個(gè)微小RNA(miR-181b和miR-338),兩個(gè)測量彼此的獨(dú)立探針給出了矛盾的結(jié)果，其中對于每一個(gè)微小RNA,一個(gè)探針在肺瘤中顯示較高的表達(dá)，而一個(gè)探針在腫瘤中顯示較低的表達(dá)。對于每一個(gè)，放棄指示miR-181b和miR-388在腫瘤中富集較不顯著的結(jié)果。此外，qRT-PCR證實(shí)miR-181b在腫瘤中富集。最初使用每一個(gè)微小RNA的腫瘤/非腫瘤(T/N)表達(dá)傳來搜索與差的存活率相關(guān)的微小RNA。對于所述分析，決定用普遍高和低的分界將所有表達(dá)數(shù)據(jù)分為兩個(gè)部分，以尋找與差的存活的相關(guān)性。為了確定所使用的普遍高/低的分界，以三種獨(dú)立的方式，將T/N表達(dá)數(shù)據(jù)分成兩個(gè)部分，并確定哪個(gè)方法在測試群中給出最多數(shù)量的顯著結(jié)果。高的表達(dá)基于高于中間、最高三分位組或最高四分位組(Quartile)進(jìn)行分類，并使用單變量Cox回歸分析測試了這些分界與差的存活的相關(guān)性。在37個(gè)在腫瘤中表達(dá)不同的微小RNA中，基于高于中值，4個(gè)高的表達(dá)與差的存活相關(guān)，基于最高三分位組，5個(gè)高的表達(dá)與差的存活相關(guān)，基于最高四分位組，2個(gè)高的表達(dá)與差的存活相關(guān)(p<0.05，數(shù)據(jù)未顯示)?；谧罡呷治唤M的二分化，基于馬里蘭測試群中的標(biāo)準(zhǔn)給出與差的存活最相關(guān)的微小RNA;因此，在整個(gè)研究中一致使用基于最高三分位組的分類來分析馬里蘭測試群和香港驗(yàn)證群中微小RNA的表達(dá)水平與差的預(yù)后之間的相關(guān)性。使用微小RNA微陣列比較腫瘤中miR-21的表達(dá)水平與預(yù)后。用于所述分析的微陣列探針是hsa-miR-21-precl7No1。該分析要求根據(jù)微陣列實(shí)驗(yàn)的日期對數(shù)據(jù)進(jìn)行批標(biāo)準(zhǔn)化。為了根據(jù)日期進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，每天分別將表達(dá)給定微小RNA的最高的1/3的陣列歸類為高的。在任意給定的一天，對至多12對組織進(jìn)行分析。對進(jìn)行少于10對微陣列的任意一天，放棄在那些天進(jìn)行的陣列，導(dǎo)致?lián)p失5對陣列。然后合并這些數(shù)據(jù)以分析與存活結(jié)果的相關(guān)性。檢查并發(fā)現(xiàn)在基于微陣列實(shí)驗(yàn)(Fisher"exacttest)的時(shí)間進(jìn)行分類的組之間，在年齡、性別、種族、腫瘤部位、TNM期、或癌癥存活的頻率分布上沒有顯著差異。65統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析mir-21表達(dá)水平和其他臨床變量對患者存活的影響。包括的臨床變量是年齡、性別、種族、腫瘤部位、腫瘤組織結(jié)構(gòu)、輔助化學(xué)療法的接收和TNM分期。對于這些模型，選擇對年齡進(jìn)行二分，為年齡>50相對年齡<50,因?yàn)榻Y(jié)腸癌的推薦篩選年齡是50;如果腫瘤位于脾曲內(nèi)或附近，腫瘤部位被定義為近端的(proximal)，如果肺瘤位于降結(jié)腸內(nèi)或遠(yuǎn)離降結(jié)腸，腫瘤部位被定義為遠(yuǎn)端的(distal);基于轉(zhuǎn)移相對非轉(zhuǎn)移疾病將TNM分期二分，導(dǎo)致I-II期相對ni-iv期。馬里蘭群中的一個(gè)患者在手術(shù)當(dāng)天死亡，導(dǎo)致O個(gè)月的存活時(shí)間。所述病例包括在Kaplan-Meier分析中并從Cox回歸分析中除去，引起圖2(n-72)的腫瘤中miR-21表達(dá)的案例與表4的Cox回歸分析(n-71)中的案例數(shù)有差別。對每一個(gè)臨床協(xié)變量進(jìn)行單變量Cox回歸以檢查每一個(gè)對患者存活的影響。最終的多變量模型基于逐步加入和除去發(fā)現(xiàn)與單變量模型中差的存活相關(guān)的臨床協(xié)變量(p<0.10)。采用p<0.05的Wald統(tǒng)計(jì)量作為最終多變量模型中內(nèi)含物的標(biāo)準(zhǔn)。將最節(jié)儉Cox回歸模型用于最終的多變量模型。.實(shí)施例2—最初的結(jié)果MiRNA在結(jié)腸腫瘤中差異表達(dá)使用miRNA微陣列分析85對癌和鄰近的非癌結(jié)腸組織的miRNA語。發(fā)現(xiàn)腫瘤的miRNA表達(dá)譜與正常組織非常不同，表示miRNA在結(jié)腸癌變中起顯著作用。成對的分類比較分析鑒定了27個(gè)在這些腫瘤中差異表達(dá)的獨(dú)立miRNA(表7)。表7-與配對的正常組織相比，27個(gè)miRNA在結(jié)腸腫瘤中差異表達(dá)不同。在BRBarraytools3.4中使用成對的分類比較分析發(fā)現(xiàn)27個(gè)miRNA在胂瘤中差異表達(dá)。使用p<0.001的權(quán)值作為差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)，其導(dǎo)致0.08%的估計(jì)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。上調(diào)(Up)指在腫<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>總miRNA表達(dá)鐠預(yù)測結(jié)腸癌的存活預(yù)后確定miRM表達(dá)鐠是否預(yù)測患者的存活。對于所述分析，計(jì)算每一個(gè)個(gè)體的每一個(gè)miRNA的腫瘤相對正常的miRNA表達(dá)比(TIN比)。所有miRNATIN比的無監(jiān)督分層聚類將個(gè)體分成兩組，隨機(jī)被標(biāo)記為A組和B組(圖7)。這兩個(gè)組在臨床分期(p=0.009;圖lb)和存活預(yù)后(p-0.026;圖7c)上顯著不同。這表示總miRNA鐠預(yù)測臨床分期，且更重要地，預(yù)測存活預(yù)后。使用單變量和多變量Cox回歸分析更詳細(xì)研究所述關(guān)系(表8)。表8總miRNA傳的Cox回歸分析進(jìn)行單變量(上)和多變量(下)Cox回歸分析顯示歸類在miRNAB組的個(gè)體處于較高的死于結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)中。年齡、性別或種族均不是存活風(fēng)險(xiǎn)的顯著貢獻(xiàn)者。出于這些分析的目的，將年齡二分為大于或小于50，并將種族二分為美國黑人(AA)和白種人(Caucasian)。單變量分析變量HR(95%C1)P-值群B/A2.6(1.0-6.3)0.042年齡>50/年齡<500.62(0.14—-2.7)0.53男性/女性1.4(0.48-4.0)0.54AA/白人(白人)1.1(0.83-2.3)0.83多變量，根據(jù)年齡、性別和種族校準(zhǔn)群B/A2.7(1.1-6.8)0.034年齡>50/年齡<500.49(0.11—-2.2)0.35男性/女性1.5(0.52-4.4)0.45AA/白人1.0(0.45-2.2)0.99B組個(gè)體具有顯著較高的死于結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)(風(fēng)險(xiǎn)比[HR]-2.6(p==0.04)。在根據(jù)年齡、種族和性別進(jìn)行校準(zhǔn)后，這風(fēng)險(xiǎn)仍維持顯著高(HR-2.7;p-0.03)。這些結(jié)果證實(shí)了使用結(jié)腸癌的68miRNA譜預(yù)測預(yù)后的潛力。這些結(jié)果顯示miRNA還可能在結(jié)腸癌變中起作用。miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-16h、miR-203、let-7tg、miR-29a、miR-103-2和miR-10a的鐠預(yù)測結(jié)腸癌預(yù)后識(shí)別其表達(dá)水平預(yù)測結(jié)腸癌預(yù)后的個(gè)別miRNA。對TIN比使用KaplanMeier存活圖和多變量Cox回歸分析以鑒定與差的存活預(yù)后相關(guān)的miRNA表達(dá)模式。使用BRB陣列工具鑒定與差的存活相關(guān)的TIN比(數(shù)據(jù)未顯示)。選擇更詳細(xì)地分析這些miRM。還分析任何在腫瘤中差異表達(dá)的miRNA(p<0.01)。根據(jù)中間或最高四分位組TIN比，對每個(gè)個(gè)體的TIN比進(jìn)行二分。還從分析中除去任何在大于18個(gè)個(gè)體中TIN比缺失的miRNA。鑒定至少9個(gè)miRNA，包括miR-21、nriR-106a、miR-181b、miR-16h、miR-203、let-7g、miR-29a、miR-103-2和miR-10a，其TIN比預(yù)測結(jié)腸癌預(yù)后(圖8，表9)。進(jìn)行單變量和多變量Cox回歸分析顯示可以使用各個(gè)miRNA的TIN比來分類處于較高的死于結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體。這9個(gè)miRNA的TIN比是存活預(yù)后的重要預(yù)測因子，獨(dú)立于TNM分期、年齡、性別和種族。注意根據(jù)中間TIN比值對miR-16b、miR-21、miR-29a、miR-103-2、miR-I06a和miR-203的高/低區(qū)別進(jìn)行分類，而根據(jù)最高四分位組TIN比對Iet-7g，miR-10a和miR-1815進(jìn)行分類。69表9:各個(gè)miRNA的TIN比的Cox回歸分析<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>評(píng)價(jià)腫瘤中MiR-21表達(dá)(表7)。還將miR-21TIN比與結(jié)腸癌患者的臨床分期和存活預(yù)后相關(guān)聯(lián)(表9，圖8a)。存在一個(gè)趨勢較晚期TNM分期的個(gè)體具有較高的TIN比(p=0.034)。根據(jù)80個(gè)個(gè)體的每一個(gè)的中值對TIN比進(jìn)行二分?；贙aplanMeier分析，具有高的miR-21TIN表達(dá)比的個(gè)體具有較差的存活預(yù)后(p=0.004)，表示表達(dá)高水平miR-21的腫瘤預(yù)測差的預(yù)后。用Cox回歸分析進(jìn)一步分析這些結(jié)果。根據(jù)對年齡、性別、種族和TNM分期進(jìn)行校準(zhǔn)的單變量(HR-3.0;p-0.01)和多變量(HR=2,8;p-0.02)分析，具有高的miR-21TIN比的個(gè)體處于較高風(fēng)險(xiǎn)中(表9)。該結(jié)果表示miR-21表達(dá)水平可用作預(yù)后預(yù)測方法并能提供比單獨(dú)的TNM分期更具有預(yù)測性的存活預(yù)后值。已經(jīng)在許多肺瘤類型中發(fā)現(xiàn)miR-21的差異表達(dá)12一18。研究還證實(shí)miR-21的高水平可能導(dǎo)致惡性膠質(zhì)瘤中細(xì)胞凋亡的抑制5，而miR-21的抑制能導(dǎo)致HeLa細(xì)胞中細(xì)胞增殖增加19。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)目前認(rèn)為miR-21以類似方式貢獻(xiàn)于結(jié)腸癌變。發(fā)現(xiàn)腫瘤中miR-106a的升高(表7)和miR-106aTIN比與存活預(yù)后相關(guān)(表9,圖8b)。MiR-106a是旁系同源miRNA類的成員，所迷旁系同源miRNA包括miR-17、miR-20、miR-106a和miR-106h2。。這些miRNA非常類似于另一個(gè)，區(qū)別僅在于1-2個(gè)核苷酸。由于它們的相似性，它們可能都具有類似的靶。有趣地是，這四個(gè)miRNA都顯示類似的表達(dá)模式和與預(yù)后的相關(guān)性(數(shù)據(jù)未顯示)。本文提供miR-106a的相關(guān)性，但形式上沒有排除任何或所有其他miRNA平行基因?qū)λ鱿嚓P(guān)性有貢獻(xiàn)的可能性?；?2個(gè)個(gè)體的每一個(gè)的中值對MiR-106aTIN比進(jìn)行二分?；贙aplanMeier分析，具有高miR-106aTIN表達(dá)比的個(gè)體具有較差的存活預(yù)后(p=0.013;圖8b)。這表示高水平表達(dá)miR-106a的腫瘤預(yù)測差的存活預(yù)后。根據(jù)對年齡、性別、種族和TNM分期進(jìn)行校準(zhǔn)的單變量(FIR=2.6，p=0.01)和多變量(HR=2.4;p-0.05)分析，具有高的miR-106aTIN比的個(gè)體處于較高風(fēng)險(xiǎn)中(表7)。因此，miR-106a可以成為有用的結(jié)腸癌預(yù)后的預(yù)后預(yù)測因子，獨(dú)立于TNM分期。有趣地是，視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤抑制基因已顯示是miR-106a的功能靶12,支持miR-106a在機(jī)理上貢獻(xiàn)于結(jié)腸癌變的機(jī)制。包含miR-106a平行基因的miR-17-92簇的過表達(dá)導(dǎo)致小鼠腫瘤發(fā)育加速"。這在實(shí)驗(yàn)上顯示所述miR-106a家族的miRNA能影響癌變，進(jìn)一步支持了miR-106a可能對癌變和腫瘤進(jìn)展有貢獻(xiàn)的假說。7個(gè)其他raiRNA的表達(dá)模式與臨床分期和差的存活預(yù)后相關(guān)(表9，圖8c-8i)。存在一個(gè)趨勢診斷患有較晚期TNM分期的個(gè)體，對/et-7a(p=0.010)、miR-10a(p-0，008)、miR-16h(p-0.048)、miR-29a(p-0，005)、miR-103-2(p-0.033)、miR-181h(p=0.016)和miR-203(p=0.016)而言，具有較高的TIN比(圖8)?；谥虚g值(miR-16h、miR-29a、miR-103-2、miR-203)或最高四分位組(let-7g、miR-10a、miR-181h)將TIN比分成兩部分，KaplanMeier分析揭示發(fā)現(xiàn)每一個(gè)高的TIN比是差的存活預(yù)后的預(yù)測因子(圖8c-8i)。單變量和多變量Cox回歸分析證實(shí)這些miRNA的任一個(gè)的高TIN比預(yù)測差的結(jié)腸癌預(yù)后，獨(dú)立于TNM分期(表9)。對年齡、性別、種族和TNM分期進(jìn)行校準(zhǔn)的多變量Cox回歸模型顯示對miR-16b(HR=5.1;p=0.003)、Jet-7g(HR=2.5;p-0.03)、miR-lOa(HR=3.4;p-0.003)、miR-29a(HR=3.2;p-0.01)、miR-103-2(HR=3.1;p-0.01)、miR-181h(HR=3.2;p-0，01)和miR-203(HR=3.2;p=0.03)而言，高的TIN比各自預(yù)測差的存活預(yù)后。這些結(jié)果顯示具有表達(dá)高水平的這些miRNA中任一個(gè)的腫瘤的患者，處于增加的死于結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)中。因此，任何這些miRNA的表達(dá)水平可能成為有用的生物標(biāo)記，所述生物標(biāo)記能幫助預(yù)測結(jié)腸癌患者的存活風(fēng)險(xiǎn)，獨(dú)立于分期。9個(gè)miRNA的MiRNA表達(dá)特征預(yù)測存活預(yù)后使用所有9個(gè)之前提到的miRNA的TIN比來產(chǎn)生可用于預(yù)測結(jié)腸癌預(yù)后的miRNA特征。從所述分析中排除在9個(gè)這些值中缺失超過2個(gè)的個(gè)體。所述9個(gè)miRNA的TIN比的分層聚類將剩下78個(gè)患者分成兩組(圖9a)。這些組具有顯著不同的存活預(yù)后(圖9b，p-0.004)。單變量(HR-3.2，p=0.008)和多變量(HR=2.8，p-0.04)。Cox回歸分析證實(shí)所述miRNA特征與差的存活預(yù)后相關(guān)，獨(dú)立于TNM分期(表10)。表10-微小RNA特征的Cox回歸分析單變量分析變量HR(95%CI)P值9miR群B/A3.2(1.4-7.8)0.008多變量分析，根據(jù)年齡、性別和種族校準(zhǔn)變量HR(95%CI)P值9miR群B/A2.8(1.0-7.4)0.043年齡>50/年齡<500.4(0.08--1.8)0.23男性/女性1.9(0.6-6.6)0.29AA/白人0.9(1.4-10.7)0.82III-IV期/I-II期3.9(1.4-10.7)0.007進(jìn)行單變量(上)和多變量(對年齡、性別、種族和分期進(jìn)行校準(zhǔn)；下)Cox回歸分析顯示使用所述9個(gè)miRNA特征被分類為B組的個(gè)體處于死于較高的結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)中。年齡、性別或種族均對存活風(fēng)險(xiǎn)沒有顯著貢獻(xiàn)。與聚類指定(clusterassignment)有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立于分期。這些結(jié)果證實(shí)miRNA特征可用作生物標(biāo)記來預(yù)測結(jié)腸癌患者的存活預(yù)后。討論個(gè)別miRNA在結(jié)腸腫瘤中差異表達(dá)12'"顯示這些miRNA改變的表達(dá)可能是造成結(jié)腸癌變的細(xì)胞變化的一部分。除了這些發(fā)現(xiàn)外，本文顯示miRNA表達(dá)鐠與結(jié)腸癌分期和預(yù)后相關(guān)。因此miRNA(單獨(dú)分析或作為miRNA特征的一部分)可用作生物標(biāo)記，所述生物標(biāo)記將能讓醫(yī)師更準(zhǔn)確地預(yù)測患者的存活風(fēng)險(xiǎn)。miRNATIN比與存活預(yù)后的強(qiáng)相關(guān)性顯示改變的miRNA表達(dá)可能是結(jié)腸癌變和進(jìn)展中因果途徑的一部分。如果這些miRNA中的任一個(gè)的改變的表達(dá)引起癌變，也許能夠設(shè)計(jì)能用于治療癌癥的類antagomir的醫(yī)藥品。使用miRNA分析和基于miRNA的治療劑，根據(jù)這9個(gè)miRNA中的哪一些被改變，也許能夠設(shè)計(jì)針對性的藥物治療方案。此外，這些方案可用于預(yù)防人的結(jié)腸癌，所述人處于歸因于基因?qū)W上遺傳的風(fēng)險(xiǎn)或以前的癌癥史的高風(fēng)險(xiǎn)中。實(shí)施例3診斷、分期、預(yù)測、監(jiān)測和治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的方法、試劑和試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供評(píng)估患者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或是否具有高于正常發(fā)展結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的診斷方法，包括比較患者樣品中標(biāo)記物的表達(dá)水平與對照(例如，來自不患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病的患者的樣品)中所述標(biāo)記物的正常表達(dá)水平的步驟。與正常水平相比，患者樣品中所述標(biāo)記物顯著較高的表達(dá)水平指示患者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或具有高于正常發(fā)展結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。選擇所述標(biāo)記物，使得所述方法的正預(yù)測值至少約為10%，且在某些非限制性實(shí)施方案中，約為25%、約為50%或約為90%。與正常細(xì)胞相比，還優(yōu)選用于所述方法的標(biāo)記物，其中至少約20%，且在某些非限制性實(shí)施方式中約50%或約75%,被差異表達(dá)至少2倍。在評(píng)估患者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病的一種診斷方法中(例如，新的檢測("篩選")，復(fù)發(fā)的檢測，反射測試(reflextesting))，所述方法包括比較a)患者樣品中標(biāo)記物的表達(dá)水平，和b)對照非結(jié)腸癌相關(guān)疾病樣品中所述標(biāo)記物的正常表達(dá)水平。與正常水平相比，患者樣品中所述標(biāo)記物顯著較高的表達(dá)水平指示患者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病。還提供評(píng)估抑制患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療功效的診斷方法。所述方法包括比較a)獲自患者的第一樣品中標(biāo)記物的表達(dá)，所述患者為對其提供至少一部分治療之前的患者，和b)獲自患者的第二樣品中所述標(biāo)記物的表達(dá)，所述患者為對其提供部分治療后的患者。相對于第一樣品中所述標(biāo)記物的表達(dá)水平，第二樣品中所述標(biāo)記物顯著低的表達(dá)水平指示所述治療對于抑制所述患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病是有效的。將理解在這些方法中，所述"治療(therapy)，，可以是任何用于治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的任何治療，包括但不限于藥物組合物，基因治療和生物治療，諸如施用抗體和趨化因子。因此，本文所述的方法可用于評(píng)價(jià)治療前、治療中和治療后的患者，例如，評(píng)價(jià)病情的緩解。在某些方面，所述診斷方法涉及使用化學(xué)或生物試劑的治療。這些方法包括比較a)獲自患者的第一樣品中標(biāo)記物的表達(dá)，并在化學(xué)或生物試劑存在下維持，和b)獲自患者的第二樣品中所述標(biāo)記物的表達(dá)，并在不存所述試劑下維持。相對于第一樣品中所述標(biāo)記物的表達(dá)水平，第二樣品中所述標(biāo)記物顯著較低的表達(dá)水平指示所述試劑對于抑制所述患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病是有效的。在一個(gè)實(shí)施方76案中，所述第一和第二樣品可以是獲自所述患者的單一樣品的部分或獲自所述患者的樣品庫的部分。還提供評(píng)估患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病進(jìn)展的監(jiān)測方法，所述方法包括a)在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測患者樣品中標(biāo)記物的表達(dá)；b)及時(shí)在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)步驟a);和c)比較步驟a)和b)中檢測到的表達(dá)水平，由此監(jiān)測患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的進(jìn)展。與在第一時(shí)間點(diǎn)時(shí)樣品中所述標(biāo)記物的表達(dá)水平相比，在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)時(shí)樣品中所述標(biāo)記物顯著較高的表達(dá)水平指示所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病在惡化，而顯著較低的表達(dá)水平指示結(jié)腸癌相關(guān)疾病在退化。進(jìn)一步提供確定結(jié)腸癌相關(guān)疾病是否惡化或?qū)硎欠窨赡軔夯脑\斷方法，所述方法包括比較a)患者樣品中標(biāo)記物的表達(dá)水平，和b)對照樣品中所述標(biāo)記物的正常表達(dá)水平。與正常水平相比，患者樣品中顯著較高的表達(dá)水平指示結(jié)腸癌相關(guān)疾病會(huì)惡化或?qū)砜赡軔夯?。還提供選擇抑制患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的組合物的測試方法。所述方法包括下述步驟a)獲得包含來自患者的細(xì)胞的樣品；b)在多種測試組合物存在下，分別維持等分試樣的樣品；c)比較每一個(gè)等分試樣中標(biāo)記物的表達(dá)；和d)選擇測試組合物中的一個(gè)，其相對于在其他測試組合物存在下所述標(biāo)記物的表達(dá)水平，顯著降低含有該組合物的等分試樣中所述標(biāo)記物的表達(dá)水平。還提供評(píng)估引起結(jié)腸癌相關(guān)疾病的化合物的危害潛力。所述方法包括下述步驟a)在化合物存在和不存在下維持分開的細(xì)胞等分試樣；和b)比較每一個(gè)等分試樣中標(biāo)記物的表達(dá)。相對于不存在所述化合物而維持的等分試樣，在所述化合物存在下維持的等分試樣中所述標(biāo)記物顯著較高的表達(dá)水平指示所述化合物具有所述危害潛力。此外，進(jìn)一步提供一種抑制患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的方法。所述方法包括下述步驟a)獲得包含來自患者的細(xì)胞的樣品；b)在多種測試組合物存在下，分別維持等分試樣的樣品；c)比較每一個(gè)等分試樣中標(biāo)記物的表達(dá)；和d)給所述患者施用所述組合物中的至少一種，其相對于在其他組合物存在下所述標(biāo)記物的表達(dá)水平，顯著降低含有所述組合物的等分試樣中所述標(biāo)記物的表達(dá)水平。例如，通過檢測樣品中下述物質(zhì)的存在可以評(píng)估樣品中標(biāo)記物的表達(dá)水平相應(yīng)標(biāo)記蛋白或所述蛋白的片段(例如，通過使用試劑，諸如與所述蛋白或蛋白片段特異性結(jié)合的抗體衍生物、抗體片段或單鏈抗體)、相應(yīng)標(biāo)記核酸(例如，核苷酸轉(zhuǎn)錄物、或其補(bǔ)體)、或所述核酸的片段(例如，通過使獲自樣品的經(jīng)轉(zhuǎn)錄的多核苷酸與底物接觸，所述底物在其上固定有一個(gè)或多個(gè)具有完整或部分核酸序列或其補(bǔ)體的核酸)、由相應(yīng)標(biāo)記蛋白直接(即，催化)或間接產(chǎn)生的代謝物?？梢允褂媒Y(jié)腸癌相關(guān)疾病標(biāo)記物的至少一個(gè)或多個(gè)(例如，2、3、5或10或更多)，包括結(jié)腸癌相關(guān)疾病標(biāo)記物來進(jìn)行前述方法的任—可一個(gè)。在所述方法中，比較樣品中多個(gè)標(biāo)記物(至少一個(gè)是標(biāo)記物)中每一個(gè)的表達(dá)水平與相同類型的獲自不患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病的對照人的樣品中多個(gè)標(biāo)記物中每一個(gè)的正常表達(dá)水平。相對于標(biāo)記物相應(yīng)的正?；?qū)φ账?，樣品中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物，或其一些組合的顯著改變(即，如使用單一標(biāo)記物的上述方法中所指出的，升高或降低)的表達(dá)水平指示所迷患者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病。對于所有前述的方法，選擇所述標(biāo)記物使得所述方法的正預(yù)測值至少約為10%。在另一方面，提供各種診斷和測試試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒用于評(píng)估患者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病。所述試劑盒包括評(píng)估標(biāo)記物表達(dá)的試劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒用于評(píng)估用于抑制患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的化學(xué)或生物試劑的適宜性。所述試劑盒包括評(píng)估標(biāo)記物表達(dá)的試劑，且還可以包括一種或多種所述試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒用于評(píng)估結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞的存在或用于治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病。所述試劑盒包括與標(biāo)記蛋白或所述蛋白的片段特異性結(jié)合的抗體、抗體衍生物或抗體片段。所述試劑盒還可以包括多種抗體、抗體衍生物或抗體片段，其中多種所述抗體試劑與標(biāo)記蛋白或所述蛋白的片段特異性結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒用于評(píng)估結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞的存在，其中所述試劑盒包括與標(biāo)記核酸或所述核酸的片段特異性結(jié)合的核酸探針。所述試劑盒還可以包括多種探針，其中每一種探針與標(biāo)記核酸或所述核酸的片段特異性結(jié)合。在另一方面，提供治療患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或處于發(fā)展出腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中的患者的方法。所述方法包括降低標(biāo)記物的表達(dá)和/或干擾標(biāo)記物的生物功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括給患者提供與標(biāo)記核酸或其片段互補(bǔ)的反義寡核苷酸或多核苷酸。例如，通過遞送表達(dá)標(biāo)記核酸或其片段的反義多核苷酸的載體，可以給患者提供反義多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括給患者提供與標(biāo)記蛋白或所述蛋白的片段特異性結(jié)合的抗體、抗體衍生物或抗體片段。在一個(gè)廣義的方面，提供產(chǎn)生用于評(píng)估至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的非人動(dòng)物模型的方法。所述方法包括使動(dòng)物接觸重復(fù)劑量的至少一種認(rèn)為引起結(jié)腸癌的化學(xué)試劑。在某些方面，所述方法進(jìn)一步包括收集一種或多種來自所述動(dòng)物的選擇樣品；并比較所收集的樣品與一種或多種潛在結(jié)腸癌引發(fā)或發(fā)展的標(biāo)記。在廣義方面，提供產(chǎn)生動(dòng)物模型的方法，包括將動(dòng)物維持在無特別化學(xué)試劑的環(huán)境下，并用至少一種認(rèn)為引起結(jié)腸癌的化學(xué)試劑使所述動(dòng)物過敏。在某些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物結(jié)腸的至少一部分通過多次連續(xù)接觸被敏化。在另一方面，提供篩選有效對抗至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的試劑的方法。所述方法通常包括給動(dòng)物施用至少一種試劑，測定所述試劑是否減輕或加重結(jié)腸癌相關(guān)疾病癥狀的一種或多種；使一種或多種癥狀的減輕與對抗所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病的試劑的有效性相關(guān)79聯(lián)；使沒有一種或多種癥狀的減輕與對抗所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病的試劑的無效性相關(guān)聯(lián)。所述動(dòng)物模型用于評(píng)估一種或多種代謝途徑，所述代謝途徑對至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的引發(fā)、進(jìn)展、嚴(yán)重性、病理、惡化、分級(jí)、活性、殘疾、死亡率、發(fā)病率、疾病亞分類或其他潛在致病或病理特征的至少一種有貢獻(xiàn)。所述分析可以是下述的一種或多種分層聚類(hierarchicalclustering)、信號(hào)網(wǎng)構(gòu)建(signaturenetworkconstruction)、質(zhì)語蛋白組學(xué)分析(massspectroscopyproteomicanalysis)、表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance)、線性統(tǒng)計(jì)建模(linearstatisticalmodeling)、偏最小二乘法判另'J分析(partialleastsquaresdiscriminantanalysis)、和多線性回歸分析(multiplelinearregressionanalysis)。在一個(gè)具體方面，所述動(dòng)物模型通過檢查一種或多種標(biāo)記物或其功能等價(jià)物的表達(dá)水平來對至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病進(jìn)行評(píng)估。除非另有說明，所有本文所使用的術(shù)語的意義與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同(例如，在細(xì)胞培養(yǎng)、分子基因?qū)W、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué)中)。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)用于分子、基因和生物化學(xué)的方法。所述技術(shù)在文獻(xiàn)中得到詳細(xì)解釋。例如參見，MolecularCloningALaboratoryManual,2ndEd，，ed.byS咖brook，F(xiàn)ritschandManiatis(ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989);DNACloning,VolumesIandII(Glovered.，1985》OligonucleotideSynthesis(Gaited.,1984);Mu出setal.U.S,Pat.No:4,683,195;NucleicAcidHybridization(Hames&Higginseds"1984);TranscriptionAndTranslation(Hames&Higginseds.,1984);CultureOfAnim,alCells(R.I,Freshney,AlanR.Liss,In",1987);ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress,1986);Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning(1984);thetreatise,MethodsInEnzymology(AcadfemicPress,Inc,，N.Y.);GeneTransferVectorsForMammalianCells(MillerandCalos'eds.,1987,ColdSpringHarborLaboratory);MethodsnEnzymology,Vols.154and155(Wuetal.eds.)，ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer抑dWalker,eds,，AcademicPress,London,1987);HandbookOfExperimentalImmunology,VolumesI-IV(WeirandBlackwell,eds.,1986);TheLaboratoiyRat,editorinchief:MarkA.Suckow;authors:SharpandLaRegina.CRCPress,Boston,1988,其以引用方式并入本文)和化學(xué)方法。本文所描述的是最近發(fā)現(xiàn)的與各種細(xì)胞的結(jié)腸癌誘導(dǎo)狀態(tài)相關(guān)的標(biāo)記物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記物中的任何一個(gè)或這些標(biāo)記物的組合高于正常的表達(dá)水平與患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的存在相關(guān)。提供檢測樣品中結(jié)腸癌相關(guān)疾病存在、樣品中結(jié)腸癌相關(guān)疾病不存在、結(jié)腸癌相關(guān)疾病的分期和其他結(jié)腸癌相關(guān)疾病特征的方法，所述特征與患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的評(píng)估、預(yù)防、診斷、表征和治療相關(guān)。還提供治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的方法。i&如本文所使用的，下述每一個(gè)術(shù)語在所述部分中具有與其相關(guān)的意義。本文使用的冠詞"一個(gè)"指一個(gè)或多于一個(gè)(即，至少一個(gè))語法對象的物品。例如，"一個(gè)要素，，指一個(gè)要素或多個(gè)要素。"標(biāo)記物(marker)"是基因或蛋白，其相對于正?；蛳嚓P(guān)。"正常"的標(biāo)記物表達(dá)水平是在不患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病的人受試者或患者的結(jié)腸系統(tǒng)細(xì)胞中所述標(biāo)記物的表達(dá)水平。標(biāo)記物的"過表達(dá)，，或，，顯著高水平的表達(dá)"指測試樣品中的表達(dá)水平高于用于評(píng)估表達(dá)的試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差，且在某些實(shí)施方案中，至少兩倍，在其他實(shí)施方案中，3、4、5、或10倍高于對照樣品中所述標(biāo)記物的表達(dá)水平(例如，來自不患有與所述標(biāo)記物相關(guān)疾病的健康受試者的樣品)，和在某些實(shí)施方案中，高于幾個(gè)對照樣品中所述標(biāo)記物的平均表達(dá)水平。標(biāo)記物的"顯著較低水平的表達(dá)"指測試樣品中的表達(dá)水平是至少2倍，和在某些實(shí)施方案中，3、4、5、或10倍低于對照樣品中所迷標(biāo)記物的表達(dá)水平(例如，來自不患有與所述標(biāo)記物相關(guān)疾病的健康受試者的樣品)和在某些實(shí)施方案中，低于幾個(gè)對照樣品中所述標(biāo)記物的平均表達(dá)水平。試劑盒是任何制品(例如，包裝或容器)，其包括至少一種試劑，例如，特異性檢測標(biāo)記物表達(dá)的探針。所述試劑盒可以作為執(zhí)行本發(fā)明方法的一個(gè)單元被推廣、配銷或銷售。"蛋白"包括標(biāo)記蛋白及其片段；變體標(biāo)記蛋白及其片段；肽和多肽，其包括標(biāo)記物或變體標(biāo)記蛋白的至少15個(gè)氨基酸片段；和融合蛋白，所述融合蛋白包含標(biāo)記物或變體標(biāo)記蛋白、或標(biāo)記物或變體標(biāo)記蛋白的至少15個(gè)氨基酸的片段。本文所述的組合物、試劑盒和方法尤其具有下述用途1)評(píng)估患者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾??；2)評(píng)估人患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的階段；3)評(píng)估患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的等級(jí)；4)評(píng)估患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的性質(zhì)；5)評(píng)估患者中發(fā)展出結(jié)腸癌相關(guān)疾病的潛在可能；6)評(píng)估患者中與結(jié)腸癌相關(guān)疾病相關(guān)的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)類型；7)制備抗體、抗體片段或抗體衍生物，所述抗體、抗體片段或抗體衍生物可用于治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病和/或評(píng)估患者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾??；8)評(píng)估結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞的存在；9)評(píng)估用于抑制患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的一種或多種測試化合物的功效；10)評(píng)估用于抑制患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療的功效；11)監(jiān)測患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的進(jìn)展；12)選擇用于抑制患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的組合物或療法；13)治療患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病的患者；14)抑制患者的結(jié)腸癌相關(guān)疾??；l5)評(píng)估測試化合物的危害潛力；和16)預(yù)防處于發(fā)展出結(jié)腸癌相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)的患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的發(fā)作。篩選方法通過本文所述的方法構(gòu)建的動(dòng)物模型將實(shí)現(xiàn)對用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療試劑的篩選。因此，所述方法用于鑒定用于治療或預(yù)防結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療試劑。所述方法包括給動(dòng)物模型施用候選試劑，所述動(dòng)物模型由本文所述的方法構(gòu)建；相對于沒有施用所述候選試劑的對照動(dòng)物模型，評(píng)估所述動(dòng)物模型中至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的應(yīng)答。如果癥狀中至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答減輕或延遲發(fā)作，則所述候選試劑是治療或預(yù)防結(jié)腸癌相關(guān)疾病的試劑。所述候選試劑可以是本領(lǐng)域已知的藥學(xué)試劑或可以是之前不知道具有藥學(xué)活性的試劑。所述試劑可是天然來源的或?qū)嶒?yàn)室設(shè)計(jì)的。它們可以分離自微生物、動(dòng)物或植物，或可以重組產(chǎn)生或通過任何合適的化學(xué)方法合成。它們可以是小分子、核酸、蛋白、肽或肽模擬物。在某些實(shí)施方案中，候選試劑可以是分子量大于50并小于約2500道爾頓的小有機(jī)化合物。候選試劑包含與蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)相互作用所必需的官能團(tuán)。還在大分子中發(fā)現(xiàn)候選試劑，包括但不限于肽、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、其結(jié)構(gòu)類似物或組合。候選試劑獲自各種來源，包括合成或天然化合物文庫。存有例如眾多可用于隨機(jī)和定向合成多種有機(jī)化合物和生物分子的方法，包括隨機(jī)寡核苷酸和寡肽的表達(dá)?；蛘?，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物文庫是可用的或容易產(chǎn)生的。此外，天然或合成產(chǎn)生的文庫和化合物可通過常規(guī)的化學(xué)、物理和生物化學(xué)方法容易地進(jìn)行改性，并可用于產(chǎn)生組合文庫。在某些實(shí)施方案中，所述候選試劑可使用組合文庫方法技術(shù)中任一種方法獲得，包括，但不限于生物文庫、空間可尋的平行固相或液相文庫(spatiallyaddressableparallelsolidphaseorsolutionphaselibraries);需要去巻積的合成文庫法、，，一珠一物，，文庫法、和使用親和色鐠選擇的合成文庫法。在某些其他實(shí)施方案中，可以對某些藥物試劑進(jìn)行定向或隨機(jī)的化學(xué)改性(諸如，?；?、烷基化、酯化、酰胺化(amidification)等)以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。鑒定用于治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療劑的相同方法也可用于驗(yàn)證體外研究產(chǎn)生的前導(dǎo)化合物/試劑。所述候選試劑可以是上調(diào)或下調(diào)一種或多種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答途徑的試劑。在某些實(shí)施方案中，所述候選試劑可以是影響所述途徑的拮抗劑。治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的方法本文提供治療、抑制、減輕或逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的方法。在本文所述的方法中，給需要其的個(gè)體(諸如，但不限于所述并發(fā)癥還不明顯的結(jié)腸癌相關(guān)疾病患者以及已經(jīng)具有至少一個(gè)結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的那些)，施用干擾信號(hào)級(jí)聯(lián)的試劑。在前面的情況中，所述治療用于預(yù)防所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的發(fā)生和/或降低它們發(fā)生的程度。在后面的情況中，所述治療用于降低所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答發(fā)生的程度，預(yù)防其進(jìn)一步發(fā)展或逆轉(zhuǎn)所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，干擾結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑可以是對所述應(yīng)答具有特異性的抗體。標(biāo)記物的表達(dá)可以以多種方式抑制標(biāo)記物的表達(dá)，以非限制性舉例的方式包括，可以給結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞提供反義寡核苷酸以抑制所述標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄、翻譯或兩者?；蛘?，可以給所述細(xì)胞提供與合適啟動(dòng)子/調(diào)控區(qū)可操作連接的多核苷酸以產(chǎn)生抑制所述蛋白功能或活性的細(xì)胞內(nèi)抗體，所述多核苷酸編碼特異性結(jié)合標(biāo)記蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段。還可以通過用特異性結(jié)合標(biāo)記蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞來抑制標(biāo)記物的表達(dá)和/或功能。使用本文所述的方法，對多種分子，特別包括能穿過細(xì)胞膜的足夠小的分子進(jìn)行篩選以鑒定抑制標(biāo)記物表達(dá)或抑制標(biāo)記蛋白功能的分子?？梢越o患者提供如此鑒定的化合物以抑制患者的結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞?？梢栽诒疚乃龅慕M合物、試劑盒和方法中使用任何標(biāo)記物或標(biāo)記物的組合以及任何某些標(biāo)記物與所述標(biāo)記物的組合。通常，希望使用這樣的標(biāo)記物，所述標(biāo)記物在結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞中的表達(dá)水平與相同標(biāo)記物在正常結(jié)腸系統(tǒng)細(xì)胞中的表達(dá)水平之間的差異盡可能大。雖然所述差異可以小到所述標(biāo)記物表達(dá)的評(píng)估方法的檢出限，希望所述差異至少大于評(píng)估方法的標(biāo)準(zhǔn)誤差，且在某些實(shí)施方案中，至少2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、15-、20-、100-、500-、1000-倍或大于正常組織中相同標(biāo)記的表達(dá)水平。認(rèn)識(shí)到某些標(biāo)記蛋白被分泌到細(xì)胞周圍的細(xì)胞間隙。由于可在結(jié)腸癌相關(guān)體液樣品(其可能比組織活檢樣品更容易從人患者中收集)中檢測到所述標(biāo)記蛋白這一事實(shí)，在所述組合物、試劑盒和方法的某些實(shí)施方案中使用這些標(biāo)記物。此外，標(biāo)記蛋白的體內(nèi)檢測技術(shù)包括向受試者中引入針對所述蛋白的經(jīng)標(biāo)記的抗體。例如，所述抗體可以用放射性標(biāo)記物標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，受試者中所述放射性標(biāo)記物的存在和位置可以通過標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)檢測。為了確定任何具體的標(biāo)記蛋白是否是分泌蛋白，例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(諸如，人結(jié)腸系)中表達(dá)所述標(biāo)記蛋白，收集細(xì)胞外液，并評(píng)估細(xì)胞外液中所述蛋白存在與否(例如，使用與所述蛋白特異性結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的抗體)。將理解可以在本文所述的方法中使用包含結(jié)腸細(xì)胞的患者樣品。在這些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記物的表達(dá)水平可以通過評(píng)估樣品中所述標(biāo)記物的量(例如，絕對量或濃度)來評(píng)估。當(dāng)然在評(píng)估樣品中所述標(biāo)記物的量之前，可以對所述細(xì)胞樣品進(jìn)行各種收集后制備和貯藏技術(shù)(例如，核酸和/或蛋白提取、固定、貯藏、冷凍、超濾、濃縮、蒸發(fā)、離心等)。還將理解所述標(biāo)記物可能從細(xì)胞流到消化系統(tǒng)、血流和/或胞間隙中。例如可以通過檢查血清或血漿可以檢測所述流出的標(biāo)記物0所述組合物、試劑盒和方法可用于檢測標(biāo)記蛋白的表達(dá)，所述標(biāo)記蛋白具有至少一部分呈現(xiàn)在表達(dá)其的細(xì)胞的表面上。例如，免疫學(xué)方法可用于檢測全細(xì)胞上的所述蛋白，或基于計(jì)算機(jī)的序列分析方法可用于預(yù)測至少一種胞外結(jié)構(gòu)域(即，包括兩種分泌蛋白和具有至少一個(gè)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域的蛋白)的存在?？梢詸z測標(biāo)記蛋白的表達(dá)，無需裂解所述細(xì)胞，其中所述標(biāo)記蛋白具有至少一部分呈現(xiàn)在表達(dá)其的細(xì)胞的表面上(例如，使用與蛋白的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)85合的標(biāo)記抗體)?？梢酝ㄟ^檢測轉(zhuǎn)錄核酸或蛋白表達(dá)的多種方法中的任一種評(píng)估標(biāo)記物的表達(dá)。所述方法的非限制性實(shí)例包括檢測分泌、細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)或核蛋白的免疫學(xué)方法、蛋白純化方法、蛋白功能或活性檢測、核酸雜交方法、核酸逆轉(zhuǎn)錄方法和核酸擴(kuò)增方法。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用抗體(例如，放射標(biāo)記的、生色團(tuán)標(biāo)記的、熒光團(tuán)標(biāo)記的或酶標(biāo)記的)，抗體衍生物(例如，與底物或蛋白或蛋白質(zhì)配體對的配體綴合的抗體)，或與標(biāo)記蛋白或其片段(包括已經(jīng)進(jìn)行全部或部分正常的翻譯后修飾的標(biāo)記蛋白)特異性結(jié)合的抗體片段(例如，單鏈抗體、分離的抗體高變區(qū)等)來評(píng)估標(biāo)"i己物的表達(dá)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，通過從患者樣品的細(xì)胞中制備mRNA/cDNA(即，轉(zhuǎn)錄多核苷酸)，和通過使mRNA/cDNA與參考多核苷酸雜交，所述參考多核苷酸與標(biāo)記核酸或其片段的補(bǔ)體)，來評(píng)估標(biāo)記物的表達(dá)。任選地，在與參考多核苷酸雜交之前，可以使用多種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法中的任一種對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增；優(yōu)選地，其沒有被擴(kuò)增。同樣地使用定量PCR檢測一種或多種標(biāo)記物的表達(dá)以評(píng)估所述標(biāo)記物的表達(dá)水平?；蛘?，可以使用多種檢測標(biāo)記物的突變或變體(例如，單個(gè)核苷酸多型現(xiàn)象、刪除等)的方法中的任一種來檢測患者中標(biāo)記物的出現(xiàn)。在相關(guān)的實(shí)施方案中，獲自樣品的轉(zhuǎn)錄多核苷酸的混合物與底物接觸，在所述底物上固定有與標(biāo)記核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或多個(gè)核苷酸殘基)互補(bǔ)或同源的多核苷酸。如果與標(biāo)記核酸互補(bǔ)或同源的多核苷酸在底物上是差異可檢測的，(例如，使用不同的生色團(tuán)或熒光團(tuán)是可檢測，或固定到不同所選的位置上)，那么多個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)水平可以使用單個(gè)底物(例如，固定在所選位置上的多核苷酸的"基因芯片"微陣列)同時(shí)進(jìn)行評(píng)估。當(dāng)使用涉及一個(gè)核酸與另一個(gè)雜交的標(biāo)記物表達(dá)的評(píng)估方法時(shí)，希望所述雜交可以在嚴(yán)格雜交條件下進(jìn)行。86在某些實(shí)施方案中，可使用質(zhì)鐠或表面等離子體共振進(jìn)行生物標(biāo)記測試。在各種實(shí)施方案中，鑒定對結(jié)腸癌相關(guān)疾病具有活性的試劑的方法，包括a)提供含有一種或多種標(biāo)記物或其衍生物的細(xì)胞樣品；b)制備來自所述細(xì)胞的提取物；c)混合物所述提取物與含有標(biāo)記物結(jié)合位點(diǎn)的經(jīng)標(biāo)記的核酸探針；和d)測定在所述測試試劑存在或不存在下，所述標(biāo)記物與所述核酸探針之間復(fù)合物的形成。測定步驟可以包括給所述提取物/核酸探針混合物進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)分析。在某些實(shí)施方案中，所述測定步驟包括選自下述的試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、基于萸光的試驗(yàn)和超高通量試驗(yàn)，例如表面等離子體共振(SPR)或熒光關(guān)聯(lián)i瞽(FCS)試驗(yàn)。在所述實(shí)施方案中，由于SPR對金屬絕緣表面上的微小折射率變化敏感，所述SPR傳感器用于直接實(shí)時(shí)觀察生物分子的相互作用。SPR是一種表面技術(shù)，其對約200nm的SPR傳感器/樣品界面內(nèi)105至10—6折射率(RI)單位的變化敏感。因此，SPR光譜用于監(jiān)測沉積在傳感層上的有機(jī)薄膜的生長。因?yàn)樗鼋M合物、試劑盒和方法取決于檢測一種或多種標(biāo)記物表達(dá)水平的差異，希望所述標(biāo)記物的表達(dá)水平顯著大于所述方法的最小檢出限，所述方法用于評(píng)估在至少一種正常細(xì)胞和結(jié)腸癌感染細(xì)胞中的表達(dá)。應(yīng)該理解通過使用一種或多種標(biāo)記物對其他患者樣品進(jìn)行常規(guī)掃描，將認(rèn)識(shí)到某些標(biāo)記物在各種類型(包括特異性結(jié)腸癌相關(guān)疾病)的細(xì)胞中是過表達(dá)的。此外，因?yàn)樵u(píng)估較大數(shù)量患者樣品中所述標(biāo)記物的表達(dá)并關(guān)聯(lián)樣品獲自其的個(gè)體患者的結(jié)果，還證實(shí)某些標(biāo)記物改變的表達(dá)與結(jié)腸癌相關(guān)疾病強(qiáng)相關(guān)聯(lián)且其他標(biāo)記物改變的表達(dá)與其他疾病強(qiáng)相關(guān)聯(lián)。因此所述組合物、試劑盒和方法用于表征患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的分期、分級(jí)、組織結(jié)構(gòu)類型和性質(zhì)的一種或多種。當(dāng)所述組合物、試劑盒和方法用于表征患者中結(jié)腸癌相87關(guān)疾病的分期、階段、組織結(jié)構(gòu)類型和性質(zhì)的一種或多種，希望選擇所述標(biāo)記物或標(biāo)記物庫，使得在至少約20%，和在某些實(shí)施方案中，至少約40%、60%、或80%和基本上全部受對應(yīng)期、階段、組織結(jié)構(gòu)類型或性質(zhì)的結(jié)腸癌相關(guān)疾病折磨的患者中獲得陽性結(jié)果?？梢赃x擇本發(fā)明的所述標(biāo)記物或標(biāo)記物庫，使得對于普通人口獲得大于約10%的正預(yù)測值(在非限制性實(shí)例中，與試驗(yàn)偶合，特異性大于80%)。當(dāng)在所述組合物、試劑盒和方法中使用多種標(biāo)記物時(shí)，可以在單一反應(yīng)混合物中(即，使用試刑，諸如對于每個(gè)標(biāo)記物使用不同的熒光探針)或在對應(yīng)一種或多種標(biāo)記物的單獨(dú)的反應(yīng)混合物中，比較患者樣品中每個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)水平與同一類的非結(jié)腸癌樣品中多種標(biāo)記物的每一種的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對于對應(yīng)的正常水平，樣品中多個(gè)標(biāo)記物中一種以上表達(dá)水平顯著增加指示所述患者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病。當(dāng)使用多種標(biāo)記物時(shí)，可以使用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30、或50或更多個(gè)體標(biāo)記物；在某些實(shí)施方案中，可能希望使用更少的標(biāo)記物。為了最大化所述組合物、試劑盒和方法的靈敏度(即，由于歸因于源自患者樣品中的非結(jié)腸癌系統(tǒng)細(xì)胞的干擾)，希望本文所用的標(biāo)記物是具有限制組織分布的標(biāo)記物，例如，正常下不在非結(jié)腸癌系統(tǒng)組織中表達(dá)。承認(rèn)所述組合物、試劑盒和方法對具有增強(qiáng)的發(fā)展出結(jié)腸癌相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)的患者和其醫(yī)學(xué)顧問是特別有用的。公認(rèn)具有增強(qiáng)的發(fā)展出結(jié)腸癌相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)的患者例如包括，具有結(jié)腸癌相關(guān)疾病家族史的患者。可以用各種方式評(píng)估正常人結(jié)腸系統(tǒng)組織中標(biāo)記物的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過評(píng)估一部分似乎正常的結(jié)腸系統(tǒng)細(xì)胞中所迷標(biāo)記物的表達(dá)水平，并通過比較所述正常表達(dá)水平與懷疑異常的一部分結(jié)腸系統(tǒng)細(xì)胞中的表達(dá)水平，來評(píng)估所述正常的表達(dá)水平。或者，且特別因?yàn)檫M(jìn)一步信息可作為常規(guī)執(zhí)行本文所述方法的結(jié)果，可以使用所述標(biāo)記物正常表達(dá)的群體平均值。在其他實(shí)施方案中，可以通過評(píng)估獲自非結(jié)腸癌折磨患者的患者樣品中，獲自懷疑患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病發(fā)作之前的患者樣品中，獲自存檔患者樣品等中標(biāo)記物的表達(dá)來測定所述標(biāo)記物的"正常"表達(dá)水平。本文還提供評(píng)估樣品中結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞存在的組合物、試劑盒和方法(例如，歸檔的組織樣品或獲自患者的樣品)。這些組合物、試劑盒和方法基本上與上述的相同，只是，當(dāng)需要時(shí)，可以改變所述組合物、試劑盒和方法以用于除了患者樣品外的樣品。例如，當(dāng)待使用的樣品是石蠟化的，存檔人組織樣品時(shí)，可能需要調(diào)整組合物中、試劑盒中化合物的比例，或調(diào)整用于評(píng)估所述樣品中標(biāo)記物表達(dá)水平的方法。試劑盒和試劑所述試劑盒用于評(píng)估結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞的存在(例如，在諸如患者樣品的樣品中)。所述試劑盒包括多種試劑，每一種試劑能特異性結(jié)合標(biāo)記核酸或標(biāo)記蛋白。結(jié)合標(biāo)記蛋白的合適試劑包括抗體、抗體衍生物、抗體片段等。結(jié)合標(biāo)記核酸的合適試劑(例如，基因組DNA、MRNA、剪切MRNA、cDNA等)包括互補(bǔ)核酸。例如，所述核酸試劑可以包括固定到底物的寡核苷酸(標(biāo)記或未標(biāo)記的)，不與底物結(jié)合的標(biāo)記寡核苷酸，PCR引物對，分子信標(biāo)探針等。所述試劑盒任選可包括用于進(jìn)行本文所述方法的其他成分。例如，所述試劑盒可以包括流體(例如，SSC緩沖溶液)，所述流體適合于退火互補(bǔ)核酸或使抗體與與其特異性結(jié)合的蛋白結(jié)合，一種或多種樣品室，描述執(zhí)行所述方法的說明材料，正常結(jié)腸系統(tǒng)細(xì)胞的樣品，結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞的樣品等。抗體的制備方法還提供分離的雜交瘤的制備方法，所述雜交瘤產(chǎn)生用于評(píng)估患者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病的抗體。在所述方法中，合成或分離(例如，通過從表達(dá)其的細(xì)胞中純化，或通過體外轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼所述蛋白或肽的核酸)包含標(biāo)記蛋白的全部或部分的蛋白或肽。使用所述蛋白或肽免疫脊稚動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物諸如小鼠、大鼠、兔或羊。任選可以用所述蛋白或肽至少再次免疫所述脊推動(dòng)物使所述脊推動(dòng)物對所述蛋白或肽展現(xiàn)強(qiáng)的免疫應(yīng)答。通過使用多種方法中的任一種，脾細(xì)胞分離自免疫脊推動(dòng)物并用永生細(xì)胞系融合以形成雜交瘤。這種方式形成的雜交瘤然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行篩選以鑒定一種或多種雜交瘤，所述雜交瘤產(chǎn)生與所述標(biāo)記蛋白或其片段特異性結(jié)合的抗體。本文還提供這種方法制備的雜交瘤和使用所述雜交瘤制備的抗體。評(píng)估功效的方法本文還提供評(píng)估測試化合物功效的方法，所述測試化合物抑制結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞。如上所述，所述標(biāo)記物表達(dá)水平的差異與結(jié)腸系統(tǒng)細(xì)胞的異常狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。雖然承認(rèn)某些標(biāo)記物表達(dá)水平的變化可能由結(jié)腸系統(tǒng)細(xì)胞的異常狀態(tài)引起，同樣承認(rèn)其他標(biāo)記物表達(dá)水平的變化誘導(dǎo)、維持和促進(jìn)這些細(xì)胞的異常狀態(tài)。因此，抑制患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的化合物將使一個(gè)或多個(gè)所述標(biāo)記物的表達(dá)水平變化到更接近那個(gè)標(biāo)記物的正常表達(dá)水平(即，正常結(jié)腸系統(tǒng)細(xì)胞中所述標(biāo)記物的表達(dá)水平)。因此，所述方法包括比較第一結(jié)腸細(xì)胞樣品中以及在測試化合物存在下維持的標(biāo)記物表達(dá)和第二結(jié)腸細(xì)胞樣品中以及在測試化合物不存在下維持的標(biāo)記物表達(dá)。在所述測試樣品存在下，標(biāo)記物表達(dá)的顯著降低指示測試化合物抑制結(jié)腸癌相關(guān)疾病。所述結(jié)腸細(xì)胞樣品例如可以是獲自患者的正常結(jié)腸細(xì)胞的等分試樣，獲自患者的正常結(jié)腸細(xì)胞、正常結(jié)腸細(xì)胞系的細(xì)胞的合并樣品的等分試樣，獲自患者的結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞的單個(gè)樣品的等分試樣，獲自患者的結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞、結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞的合并樣品的等分試樣等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品是獲自患者的結(jié)腸癌相關(guān)疾病細(xì)胞，并對多個(gè)認(rèn)為對于抑制各種結(jié)腸癌相關(guān)疾病是有效的化合物進(jìn)行測試以鑒定可能最好抑制患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的化合物。所述方法同樣可用于評(píng)估用于抑制患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療的功效。在所述方法中，評(píng)估在一對樣品中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)水平(一個(gè)接受所述治療，另一個(gè)不接受所述治療)。與評(píng)估測試化合物功效的方法一樣，如果所述治療誘導(dǎo)顯著較低的標(biāo)記物表達(dá)水平，那么所述治療對于抑制結(jié)腸癌相關(guān)疾病是有效的。如上所述，如果在所述方法中使用來自所選患者的樣品，那么可以體外評(píng)估備選治療以選擇最可能有效抑制患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療。如本文所述，將人結(jié)腸細(xì)胞的異常狀態(tài)與所述標(biāo)記物的表達(dá)水平的變化相關(guān)聯(lián)。還提供評(píng)估測試化合物危害潛力的方法。所述方法包括在所述測試化合物存在和不存在下維持分開的人結(jié)腸細(xì)胞的等分試樣。比較每一個(gè)等分試樣中標(biāo)記物的表達(dá)。在所述測試化合物存在下維持的等分試樣中顯著較高的標(biāo)記物表達(dá)水平指示(相對于在不存在所述測試化合物下維持的等分試樣)指示所述測試化合物具有危害潛力?？梢酝ㄟ^比較相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)水平增強(qiáng)或抑制的程度，通過比較表達(dá)水平被增強(qiáng)或抑制的標(biāo)記物的數(shù)，或通過比較兩者來評(píng)估各種測試化合物的相對危害潛力。在下述小節(jié)中進(jìn)一步詳細(xì)描述各個(gè)方面。分離的蛋白和抗體—個(gè)方面涉及分離的標(biāo)記蛋白及其生物學(xué)活性部分，以及多核苷酸片段，所述多核苷酸片段適合用作免疫原以產(chǎn)生針對標(biāo)記蛋白或其片段的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化技術(shù)的合適純化方案可以從細(xì)胞或組織分離所述天然標(biāo)記蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方式中，包含整個(gè)標(biāo)記蛋白或其片段的蛋白或肽可以通過重組DNA技術(shù)來制備。重組表達(dá)的備選方案，使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成所述蛋白或肽。"分離"或"純化"蛋白或其生物學(xué)活性部分是基本上白，或基本上不含化學(xué)合成時(shí)的化學(xué)前體或其他化學(xué)產(chǎn)品。表述"基本上不含細(xì)胞材料，，包括蛋白制品，其中所述蛋白分離自細(xì)胞的細(xì)胞成分，所述細(xì)胞指從其分離或重組產(chǎn)生所述蛋白的細(xì)胞。因此，基本上不含細(xì)胞材料的蛋白包括含有低于約30%、20%、10%或5%(基于干重)異源蛋白的蛋白制品(本文也稱為"污染蛋白")。當(dāng)重組產(chǎn)生所述蛋白或其生物學(xué)活性部分時(shí)，還優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基代表低于約20%、10%或5%的蛋白制品體積。當(dāng)所述蛋白通過化學(xué)合成制備，優(yōu)選基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)產(chǎn)品，即，將其與參與所述蛋白合成的化學(xué)前體或其他化學(xué)產(chǎn)品分離。因此，所述蛋白制品含有低于約30%、20%、10%、5%(基于干重)的除目的多肽外的化學(xué)前體或化合物。標(biāo)記蛋白的生物學(xué)活性部分包括多肽，所述多肽包括與所述標(biāo)記蛋白的氨基酸序列充分一致或衍生自所述標(biāo)記蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列，其包括比全長蛋白少的氨基酸，但展示對應(yīng)全長蛋白至少一種活性。典型地，生物活性部分包括具有對應(yīng)全長蛋白的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。標(biāo)記蛋白的生物活性部分可以是例如，長度為10、25、50、100或更多氨基酸的多肽。此外，可以通過重組技術(shù)制備其他生物學(xué)活性部分(其中所述標(biāo)記蛋白被刪除)，并就所述標(biāo)記蛋白天然形式的一種或多種功能活性對其進(jìn)行評(píng)價(jià)。在某些實(shí)施方案中，有用的蛋白與這些序列之一基本上是一致的(例如，至少約40%，且在某些實(shí)施方案中，50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%)，并維持對應(yīng)天然標(biāo)記蛋白的功能活性，然而由于天然變異或突變在氨基酸序列上不同。此外，標(biāo)記蛋白片段的文庫可用于產(chǎn)生各種多肽群以用于篩選和隨后對變體標(biāo)記蛋白或其片段的選擇。預(yù)測藥物本文還提供動(dòng)物模型和標(biāo)記物在預(yù)測醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的用途，其中出于預(yù)后(預(yù)測)目的采用診斷測試、預(yù)后測試、藥物基因組學(xué)和檢測臨床試驗(yàn)，從而預(yù)防性地治療個(gè)體。因此，本文還提供確定一種或多種標(biāo)記蛋白或核酸的表達(dá)水平的診斷測試，以確定個(gè)體是否處于發(fā)展結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。所述測試可用于診斷或預(yù)測目的，從而在所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病發(fā)作之前預(yù)防性治療個(gè)體。在另一方面，所述方法用于至少周期性篩選同一個(gè)體以了解所述個(gè)體是否與改變其表達(dá)模式的化學(xué)產(chǎn)品或毒素接觸。然而另一個(gè)方面涉及監(jiān)測試劑對臨床測試中標(biāo)記物表達(dá)或活性的影響(例如，施用藥物或其他化合物以抑制結(jié)腸癌相關(guān)疾病或治療或預(yù)防任何其他障礙(例如，為了了解所述治療可能具有的任何系統(tǒng)效應(yīng)))。藥物基因組學(xué)所述標(biāo)記物還用作藥物基因組學(xué)標(biāo)記物。如本文所使用的，"藥物基因組學(xué)標(biāo)記物"是客觀的生物化學(xué)標(biāo)記物，其表達(dá)水平與患者中一種具體的臨床藥物應(yīng)答或易感性有關(guān)。藥物基因組學(xué)標(biāo)記物表達(dá)的存在或定量與患者的預(yù)測應(yīng)答相關(guān)，更具體地患者腫瘤對于一種具體的藥物或一類具體的藥物的治療相關(guān)。通過評(píng)估患者中一種或多種藥物基因組學(xué)標(biāo)記物表達(dá)的存在或定量，可以選擇最適合患者的藥物治療或預(yù)測具有最大成功度的藥物治療。監(jiān)測臨床測試監(jiān)測試劑(例如，藥物化合物)對標(biāo)記物表達(dá)水平的影響不僅可以在基礎(chǔ)藥物篩選中進(jìn)行，也可以在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行。例如，可以在受試者的臨床試驗(yàn)中監(jiān)測試劑影響標(biāo)記物表達(dá)的效力，所迷受試者接受結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療。在非限制實(shí)施方案中，本發(fā)明提供監(jiān)測用試劑(例如，激動(dòng)劑、拮抗劑、擬肽、蛋白、肽、核酸、小分子、或其他藥物候選)治療受試者的效力的方法，包括下述步驟U)在施用所述試劑之前，獲得來自受試者的施用前樣品；(ii)檢測所述施用前樣品中一種或多種所選標(biāo)記物的表達(dá)水平；(iii)從所述受試者中獲得一種或多種93施用后樣品；(iv)檢測所述施用后樣品中所述標(biāo)記物的表達(dá)水平；(V)比較施用前樣品中所述標(biāo)記物的表達(dá)水平與施用后樣品中所述標(biāo)記物的表達(dá)水平；和(vi)相應(yīng)地改變給所述受試者施用的試劑。例如，在治療過程中，所述標(biāo)記基因增加的表達(dá)可能指示無效劑量或增加劑量的需要。相反，所述標(biāo)記基因降低的表達(dá)可能指示有效治療并且不需要改變劑量。電子設(shè)備可讀介質(zhì)、系統(tǒng)、陣列和使用其的方法如本文所使用的，"電子設(shè)備可讀介質(zhì)"指任何適合存儲(chǔ)、保留或包含數(shù)據(jù)或信息的介質(zhì)，所述數(shù)據(jù)或信息可通過電子設(shè)備直接讀取或獲取。所述介質(zhì)可包括，但不限于磁存儲(chǔ)介質(zhì)，諸如軟磁盤，硬磁盤存儲(chǔ)介質(zhì)和磁帶；光存儲(chǔ)介質(zhì)，諸如，光盤；電子存儲(chǔ)介質(zhì)，諸如RAM、R0M、EPR0M、EEPR0M等；和普通硬盤以及這些種類的混合，諸如磁/光存儲(chǔ)介質(zhì)。調(diào)整或設(shè)定所述介質(zhì)以在其上記錄本文所述標(biāo)記物。如本文所使用的，術(shù)語"電子設(shè)備"意圖包括任何合適的計(jì)算或加工設(shè)備，或構(gòu)建或改變其他設(shè)備以儲(chǔ)存數(shù)據(jù)或信息。適用于本發(fā)明的電子設(shè)備的實(shí)例包括單機(jī)計(jì)算機(jī)設(shè)備；網(wǎng)絡(luò)，包括局域網(wǎng)(LAN)、廣域網(wǎng)(WAN)、因特網(wǎng)、內(nèi)部網(wǎng)和外聯(lián)網(wǎng)；電子器件，諸如個(gè)人數(shù)字助理(PDAs)、移動(dòng)電話、尋呼機(jī)等；和局部和分布式處理系統(tǒng)。如本文所使用的，"記錄"指在電子設(shè)備可讀介質(zhì)上儲(chǔ)存和編碼信息的過程。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易釆用任何在介質(zhì)上記錄信息的方法以產(chǎn)生包括本文所述標(biāo)記物的材料。多種軟件程序和格式可用于在電子設(shè)備可讀介質(zhì)上儲(chǔ)存本發(fā)明的標(biāo)記物信息。可以釆用任何數(shù)量的數(shù)據(jù)處理結(jié)構(gòu)格式(structuringformat)(例如，文本文件或數(shù)據(jù)庫)以獲得或產(chǎn)生在其上記錄有所述標(biāo)記物的介質(zhì)。通過提供可讀形式的標(biāo)記物，可以常規(guī)地獲得用于各種目的的標(biāo)記物序列信息。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人94與儲(chǔ)存于數(shù)據(jù)儲(chǔ)存工具中的序列信息。使用搜索方法來鑒定與具體靶序列或靶基序匹配的序列的片段或區(qū)域。因此，本文還提供保留說明書的介質(zhì)，所述說明書關(guān)于實(shí)行確定受試者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或具有結(jié)腸癌相關(guān)疾病誘因的方法，其中所述方法包括下述步驟確定標(biāo)記物的存在與否，并基于標(biāo)記物的存在與否確定受試者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或具有結(jié)腸癌相關(guān)疾病誘因，和/或?yàn)榻Y(jié)腸癌相關(guān)疾病和預(yù)結(jié)腸癌相關(guān)疾病病癥推薦具體治療。本文還提供電子系統(tǒng)和/或在網(wǎng)絡(luò)中，一種確定受試者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或具有與標(biāo)記物相關(guān)的結(jié)腸癌相關(guān)疾病誘因的方法，其中所述方法包括下述步驟確定所述標(biāo)記物的存在與否，并基于標(biāo)記物的存在與否確定受試者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或是否具有結(jié)腸癌相關(guān)疾病誘因，和/或?yàn)榻Y(jié)腸癌相關(guān)疾病和預(yù)結(jié)腸癌相關(guān)疾病情況推薦具體治療。所述方法還進(jìn)一步包括接受與受試者相關(guān)的表型信息和/或從網(wǎng)絡(luò)獲得與受試者相關(guān)的表型信息的步驟。本文還提供了一種網(wǎng)絡(luò)，一種確定受試者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或具有與標(biāo)記物相關(guān)的結(jié)腸癌相關(guān)疾病誘因的方法，所述方法包括下述步驟接受與標(biāo)記物相關(guān)的信息，接受與受試者相關(guān)的表型信息，從網(wǎng)絡(luò)獲得對應(yīng)于所述標(biāo)記物和/或結(jié)腸癌相關(guān)疾病的信息，并基于表型信息、所述標(biāo)記物和獲得的信息中的一種或多種確定患者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或具有結(jié)腸癌相關(guān)疾病的誘因。所述方法還進(jìn)一步包括為結(jié)腸癌相關(guān)疾病和預(yù)結(jié)腸癌相關(guān)疾病病癥推薦具體治療的步驟。本文還提供確定受試者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或具有結(jié)腸癌相關(guān)疾病誘因的商業(yè)方法，所述方法包括下述步驟接受與標(biāo)記物相關(guān)的信息，接受與受試者相關(guān)的表型信息，從網(wǎng)絡(luò)獲得對應(yīng)于所述標(biāo)記物和/或結(jié)腸癌相關(guān)疾病的信息，并基于表型信息、所述標(biāo)記物和獲得的信息中的一種或多種確定患者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或具有結(jié)腸癌相關(guān)疾病的誘因。所述方法還進(jìn)一步包括為結(jié)腸癌相關(guān)疾病和預(yù)結(jié)腸癌相關(guān)疾病病癥推薦具體治療的步驟。本文還提供一種陣列，其能用于分析在所述陣列中一種和多種基因的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述陣列可用于分析組織中基因的表達(dá)以確定在所述陣列中基因的組織特異性。以這種方式，可以同時(shí)分析直至約7000或更多種基因的表達(dá)。這允許形成一個(gè)語，顯示在一種或多種組織中特異性表達(dá)的一串基因。除了所述定性測定外，本文提供基因表達(dá)的定量。因此，不僅組織特異性，而且所述組織中一串基因的表達(dá)水平是可確定的。因此，基因可以基于其自身的組織表達(dá)和在該組織的表達(dá)水平來分組。例如，這可用于確定組織之間的基因表達(dá)關(guān)系。因此，可以干擾一個(gè)組織并可以確定在第二個(gè)組織中對基因表達(dá)的影響。在所述上下文中，可以確定一種細(xì)胞類型對另一種細(xì)胞類型在應(yīng)答生物刺激中的影響。所述測定例如對于在基因表達(dá)水平上了解細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的影響是有用的。如果治療性施用一種試劑以治療一種細(xì)胞類型但對另一種細(xì)胞類型具有不希望的影響，所述方法提供一種確定不希望的效果的分子基礎(chǔ)的測試，并由此提供共同施用抵消試劑，或者治療該不希望的效果的機(jī)會(huì)。類似地，甚至在單一細(xì)胞類型中，可以在分子水平上確定不需要的生物影響。因此，可以確定和抵消所述試劑對靶基因以外的其他基因表達(dá)的影響。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述陣列可用于監(jiān)測所述陣列中一種或多種基因表達(dá)的時(shí)間過程。這可以在各種生物環(huán)境中發(fā)生，如本文所公開的，例如結(jié)腸癌相關(guān)疾病的發(fā)展，結(jié)腸癌相關(guān)疾病的進(jìn)展，和過程，諸如與結(jié)腸癌相關(guān)疾病相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化。所述陣列還用于確定在相同細(xì)胞或不同細(xì)胞中基因表達(dá)或其他基因表達(dá)的影響。這例如提供，如果最終靶或下游靶不能被調(diào)控，治療干預(yù)的替代分子靶的選擇。所述陣列還用于確定在正常和異常細(xì)胞中一種或多種基因的差異表達(dá)模式。這提供一串基因，其可用作診斷或治療干預(yù)的分子靶。替代標(biāo)記物所述標(biāo)記物可用作一種或多種障礙或疾病狀態(tài)，或作為導(dǎo)致結(jié)腸癌相關(guān)疾病狀態(tài)的病癥的替代標(biāo)記物。如本文所使用的，"替代標(biāo)記物"是客觀的生物化學(xué)標(biāo)記物，其與疾病或障礙的存在與否，或與疾病或障礙的進(jìn)展相關(guān)。所述標(biāo)記物的存在或數(shù)量獨(dú)立于所述疾病。因此，這些標(biāo)記物可用于指示治療的具體過程在減輕疾病狀態(tài)或障礙中是否是有效的。當(dāng)疾病狀態(tài)或障礙的存在或程度通過標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)難于評(píng)估時(shí)，或當(dāng)在到達(dá)潛在危險(xiǎn)臨床終點(diǎn)之前需要評(píng)估疾病進(jìn)展時(shí)，替代標(biāo)記物是特別有用的。所述標(biāo)記物還用做藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物。如本文所使用的，"藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物"是一種客觀的生化標(biāo)記物，其與藥效特別地相關(guān)。藥學(xué)標(biāo)記物的存在或數(shù)量與施用所述藥物的疾病狀態(tài)或障礙無關(guān)；因此所述標(biāo)記物的存在或數(shù)量指示受試者中所述藥物的存在或活性。例如，藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物可以指示生物組織中藥物的濃度，其中根據(jù)所述藥物水平，所述標(biāo)記物在所述組織中被表達(dá)或轉(zhuǎn)錄或不被表達(dá)或轉(zhuǎn)錄。以這種方式，所述藥物的分配和攝取可以通過藥學(xué)標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。類似地，所述藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物的存在或數(shù)量可能與藥物的代謝產(chǎn)物的存在或數(shù)量相關(guān)，使得所述標(biāo)記物的存在或數(shù)量指示體內(nèi)所述藥物的相對分解速率。藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物特別用于增加藥物效果的檢測靈敏度，特別是當(dāng)所述藥物以低劑量施用時(shí)。因?yàn)樯踔列×康乃幬锟赡茏阋约せ疃噍喌臉?biāo)記物轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，所述擴(kuò)增的標(biāo)記物的量可以是比藥物本身更容易被檢測的量。此外，由于標(biāo)記物本身的性質(zhì)，所迷標(biāo)記物可能更容易被檢測；例如，使用本文所述的方法，可以在基于免疫的蛋白標(biāo)記物檢測系統(tǒng)中采用抗體，或可以使用標(biāo)記物特異性的同位素標(biāo)記探針來檢測mRNA標(biāo)記物。此外，由于在可能直接觀察的范圍外的藥物治療，藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物的使用可以提供基于機(jī)理的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測。97測試方案結(jié)腸癌相關(guān)疾病的測試方法例如包括，測量來自受試者的生物樣品中每個(gè)標(biāo)記基因隨時(shí)間的表達(dá)水平，并比較所述水平與對照生物樣品中所述標(biāo)記基因的水平。當(dāng)所述標(biāo)記基因是本文所述的基因之一，并且所述表達(dá)水平是差異性表達(dá)的(例如，高于或低于對照水平)，判斷所述受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病。當(dāng)所述標(biāo)記基因的表達(dá)水平落入允許范圍內(nèi)，所述受試者不太可能患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病。對照的標(biāo)準(zhǔn)值可以通過測量對照中所述標(biāo)記基因的表達(dá)水平來預(yù)先確定，以比較所述表達(dá)水平。例如，可以基于對照中上述標(biāo)記基因的表達(dá)水平確定標(biāo)準(zhǔn)值。例如，在某些實(shí)施方案中，基于所述標(biāo)準(zhǔn)值允許范圍為土2S.D.。一旦標(biāo)準(zhǔn)值被確定，所迷測試方法可以通過僅測量來自受試者的生物樣品中的表達(dá)水平并比較所述值與確定的對照標(biāo)準(zhǔn)值來進(jìn)行。標(biāo)記基因的表達(dá)水平包括將標(biāo)記基因轉(zhuǎn)錄成mRNA，并翻譯成蛋白。因此，一種測試結(jié)腸癌相關(guān)疾病的方法基于比較對應(yīng)于所述標(biāo)記基因的mRNA的表達(dá)強(qiáng)度，或所述標(biāo)記基因編碼的蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行。在結(jié)腸癌相關(guān)疾病的測試中標(biāo)記基因表達(dá)水平的測量可以根據(jù)各種基因分析方法進(jìn)行。具體地，例如可以使用雜交技術(shù)或基因擴(kuò)增技術(shù)，所述雜交技術(shù)采用與作為探針的那些基因雜交的核酸，所述基因擴(kuò)增技術(shù)使用與作為引物的所述標(biāo)記基因雜交的DNA。用于所述測試的探針或引物可以根據(jù)所述標(biāo)記基因的核苷酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。各個(gè)標(biāo)記基因的核苷酸的識(shí)別數(shù)(identificationnumber)如本文所迷。此外，應(yīng)理解較高級(jí)動(dòng)物的基因通常伴隨高頻率的多型現(xiàn)象。還存在許多在剪切過程中產(chǎn)生亞型的分子，所述亞型包含突變上不同的氨基酸序列。與標(biāo)記基因具有類似活性的結(jié)腸癌相關(guān)疾病相98關(guān)的任何基因包括在所述標(biāo)記基因內(nèi)，即使其由于多型現(xiàn)象或成為亞型而具有核苷酸序列差異。還應(yīng)理解所述標(biāo)記基因可以包括除人以外的其他物種的同源物。因此，除非另有說明，表述"標(biāo)記基因"指物種獨(dú)有的標(biāo)記基因的同源物或被引入到個(gè)體中的外源標(biāo)記基因。此外，還應(yīng)理解"標(biāo)記基因的同源物"指衍生自人以外的物種的基因，其在嚴(yán)格條件下能作為探針與人標(biāo)記基因雜交。所述嚴(yán)格條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，所述本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇適當(dāng)條件來產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)或經(jīng)驗(yàn)上的嚴(yán)格性。多核苷酸可用作引物或探針，所述多核苷酸包括標(biāo)記基因的核苷酸序列或與標(biāo)記基因核苷酸序列的互補(bǔ)鏈互補(bǔ)并具有至少15個(gè)核苷酸的核苷酸序列。因此"互補(bǔ)鏈"指雙鏈DNA相對于另一條鏈的一條鏈，并且其由A:T(RNA為U)和G:C堿基對組成。此外，"互補(bǔ)的"不僅指與至少15個(gè)連續(xù)核苷酸區(qū)完全互補(bǔ)的那些，還指在某些情況下具有至少40%、在某些情況下具有至少50%、在某些情況下具有至少60°/。、在某些情況下具有至少70%、在某些情況下具有至少80%、90%和95%或更高的核苷酸序列同源性的那些。核苷酸序列之間的同源性程度可以通過算法BLAST等測定。所述多核苷酸用作檢測標(biāo)記基因的探針，或用作擴(kuò)增標(biāo)記基因的引物。當(dāng)用作引物時(shí)，所述多核苷酸通常包含15bp-100bp，和在某些實(shí)施方案中15bp-35bp的核苷酸。當(dāng)用作探針時(shí)，DM包含所述標(biāo)記基因的整個(gè)核苷酸序列(或其互補(bǔ)鏈)，或其具有至少15bp核苷酸的部分序列。當(dāng)用作引物時(shí)，3'區(qū)必須與所迷標(biāo)記基因互補(bǔ)，而5'區(qū)可以與限制性酶識(shí)別序列或tag連接。"多核苷酸"可以是DNA或RNA。這些多核苷酸可以是合成或天然存在的。此外，用作雜交探針的DNA通常是經(jīng)標(biāo)記的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解所述標(biāo)記方法。本文中，術(shù)語"寡核苷酸"指具有相對低聚集度的多核苷酸。寡核苷酸包括在多核苷酸中。使用雜交技術(shù)的結(jié)腸癌相關(guān)疾病的測試?yán)缈梢允褂肗orthern雜交、斑點(diǎn)雜交或DNA微陣列技術(shù)來進(jìn)行。此外，可以使用基因擴(kuò)增技術(shù)，諸如，RT-PCR方法。通過在RT-PCR的基因擴(kuò)增步驟期間使用PCR擴(kuò)增監(jiān)測方法，可以獲得標(biāo)記基因表達(dá)的更定量的分析。在PCR基因擴(kuò)增監(jiān)測方法，檢測靶(DNA或RNA的逆轉(zhuǎn)錄物)與探針雜交，所述探針用熒光染料和吸收熒光的淬滅劑進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)PCR進(jìn)行且Taq聚合酶降解具有其-3'核酸外切酶活性的探針，所述熒光染料和淬滅劑彼此被分開，并檢測到熒光。實(shí)時(shí)檢測所述熒光。通過同時(shí)測量其中靶的副本數(shù)是已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品，用PCR擴(kuò)增是線性的情況下的循環(huán)數(shù)來確定受試者樣品中所述靶的副本數(shù)是可能的。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員承認(rèn)PCR擴(kuò)增監(jiān)測方法能使用任何合適方法進(jìn)行。用于結(jié)腸癌相關(guān)疾病的測試方法還可以通過檢測標(biāo)記基因編碼的蛋白來進(jìn)行。在下文中，標(biāo)記基因編碼的蛋白被描述為"標(biāo)記蛋白"。對于這些測試方法，例如通過使用與每個(gè)標(biāo)記蛋白結(jié)合的抗體，可以采用蛋白印跡法，免疫沉淀發(fā)，和ELISA法。在檢測中使用的與標(biāo)記蛋白結(jié)合的抗體，可以通過任何合適的技術(shù)制備。此外，為了檢測標(biāo)記蛋白，所述抗體可以被適當(dāng)?shù)貥?biāo)記?；蛘?，除了標(biāo)記所述抗體外，可以標(biāo)記特異性結(jié)合抗體的底物，例如，蛋白A或蛋白G，以間接檢測所述標(biāo)記蛋白。更具體地，所述檢測方法可以包括ELISA方法。例如通過在表達(dá)載體中插入標(biāo)記基因或其部分，在合適寄主細(xì)胞中引入構(gòu)建體以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化林，培育所述轉(zhuǎn)化林以表達(dá)重組蛋白，并從所述培養(yǎng)物或培養(yǎng)物上清液純化所述表達(dá)的重組蛋白，可以獲得用作抗原的蛋白或其部分肽?；蛘?，化學(xué)合成基因編碼的氨基酸序列，或包括由全長cDNA編碼的氨基酸序列的一部分的寡肽以用作免疫原。此外，結(jié)腸癌相關(guān)疾病的測試不僅可以使用標(biāo)記基因的表達(dá)水平作為指標(biāo)還可以使用生物樣品中標(biāo)記物活性作為指標(biāo)來進(jìn)行。標(biāo)記蛋白的活性指所述蛋白固有的生物活性。各種方法可用于測量每種蛋白的活性。即使在常規(guī)測試中患者沒有被診斷為患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病，盡管癥狀暗示這些疾病，所述患者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病通過根據(jù)本文所述的方法進(jìn)行測試可以容易地測定。更具體地，在某些實(shí)施方案中，當(dāng)所述標(biāo)記基因是本文所述基因之一時(shí)，在患者中所述標(biāo)記基因的表達(dá)水平的增加或降低指示所述癥狀主要由結(jié)腸癌相關(guān)疾病引起，所述患者的癥狀顯示至少對結(jié)腸癌相關(guān)疾病具有易感性。此外，所述測試用于測定患者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病是否改善。本文所述的方法可用于判斷結(jié)腸癌相關(guān)疾病治療的治療效果。此外，當(dāng)所述標(biāo)記基因是本文所述基因之一時(shí)，被診斷為患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病的患者中，所述標(biāo)記基因表達(dá)水平的增加或降低暗示所述疾病已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)展。結(jié)腸癌相關(guān)疾病的嚴(yán)重性和/或易感性還可以基于表達(dá)水平的差異確定。例如，當(dāng)所述標(biāo)記基因是本文所述基因之一時(shí)，所述標(biāo)記基因表達(dá)水平的增加程度與結(jié)腸癌相關(guān)疾病的嚴(yán)重性和/或易感性相關(guān)。動(dòng)物模型在另一個(gè)方面，本文提供用于結(jié)腸癌相關(guān)疾病的動(dòng)物模型，其中一種或多種標(biāo)記基因的表達(dá)水平或與標(biāo)記基因功能上等價(jià)的基因的表達(dá)水平在所述動(dòng)物模型中被提高。本文所使用的"功能上等價(jià)的基因"通常是一種基因，其編碼具有與所述標(biāo)記基因編碼的蛋白的已知活性類似的活性的蛋白。功能上等價(jià)的基因的代表性實(shí)例包括，受試者動(dòng)物的標(biāo)記基因的類似物，其內(nèi)源于所述動(dòng)物。所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病的動(dòng)物模型用于檢測由于結(jié)腸癌相關(guān)疾病引起的生理變化。在某些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物模型用于顯示標(biāo)記基因的其他功能，并評(píng)價(jià)其靶為所述標(biāo)記基因的藥物。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)腸癌相關(guān)疾病的動(dòng)物模型可以通101過控制同源基因(counterpartgene)的表達(dá)水平或施用同源基因來創(chuàng)建。所述方法可以包括通過控制選自本文所述基因的基因的表達(dá)水平創(chuàng)建用于結(jié)腸癌相關(guān)疾病的動(dòng)物模型。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法可以包括通過施用本文所述基因編碼的蛋白，或施用針對所述蛋白的抗體創(chuàng)建結(jié)腸癌相關(guān)疾病的動(dòng)物模型。還應(yīng)理解，在某些實(shí)施方案中，可以過表達(dá)所述標(biāo)記物，然后使用合適方法測量所述標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)腸癌相關(guān)疾病的動(dòng)物模型可以通過引入選自所述基因的組的基因，或通過施用所述基因編碼的蛋白來創(chuàng)建。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過抑制選自所述基因的組的基因的表達(dá)，或抑制所述基因編碼的蛋白活性可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌相關(guān)疾病。反義核酸、核酶或RNAi可用于抑制表達(dá)?？梢酝ㄟ^施用抑制活性的物質(zhì)(諸如，抗體)有效控制蛋白活性。動(dòng)物模型用于闡明結(jié)腸癌相關(guān)疾病的潛在機(jī)理，并還可用于測試通過篩選獲得的化合物的安全性。例如，當(dāng)動(dòng)物模型發(fā)展出結(jié)腸癌相關(guān)疾病的癥狀時(shí)，或當(dāng)動(dòng)物中涉及某些結(jié)腸癌相關(guān)疾病的測量值變化時(shí)，可以構(gòu)建篩選系統(tǒng)來探測具有減輕疾病活性的化合物。如本文所使用的，表述"表達(dá)水平增加，，指下述任何一種作為外來基因引入的標(biāo)記基因被人工表達(dá)；受試動(dòng)物的內(nèi)源標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄及其翻譯成蛋白被增強(qiáng)；或所述蛋白水解受到抑制，所述蛋白為翻譯產(chǎn)物。如本文所使用的，表述"表達(dá)水平降低"指其中受試動(dòng)物的標(biāo)記蛋白轉(zhuǎn)錄及其翻譯成蛋白受到抑制的狀態(tài)，或其中蛋白水解增強(qiáng)的狀態(tài)，所述蛋白為翻譯產(chǎn)物。例如，通過DM芯片上信號(hào)強(qiáng)度的差異可以測定基因的表達(dá)水平。此外，翻譯產(chǎn)物(所述蛋白)的活性可以通過與正常狀態(tài)的活性比較來測定。動(dòng)物模型可以包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如包括標(biāo)記基因被人工引入和表達(dá)的動(dòng)物，標(biāo)記基因被敲除的動(dòng)物，和其中另一個(gè)基因被標(biāo)記基因替代的敲入動(dòng)物)也在預(yù)期的范圍內(nèi)。在其中引入標(biāo)記基因的反義核酸、核酶、具有RNAi效應(yīng)的多核苷酸、或用作誘騙核酸的DNA等的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可以被用作所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還包括，例如，其中標(biāo)記蛋白活性通過在基因編碼區(qū)引入突變被增強(qiáng)或抑制，或已對氨基酸序列進(jìn)行修飾以對水解具有抗性或易于水解的動(dòng)物。氨基酸序列中的突變包括置換、刪除、插入和添加。此外，通過在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)引入突變可以控制標(biāo)記基因自身的表達(dá)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解這些氨基酸置換。而且，不特別限制突變的氨基酸數(shù)，只要活性得到保留。正常地，其在50個(gè)氨基酸內(nèi)，在某些非限制性實(shí)施方案中，在30個(gè)氨基酸內(nèi)，在10個(gè)氨基酸內(nèi)，或在3個(gè)氨基酸內(nèi)。突變位點(diǎn)可以是任何位點(diǎn)，只要活性得到保留。在另一個(gè)方面，本文提供篩選用作治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療試劑的候選化合物的方法。一種或多種標(biāo)記基因選自本文所述的基因。通過選擇能增加或降低所述標(biāo)記基因表達(dá)水平的化合物可以獲得結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療試劑。應(yīng)該理解，表述"增加基因表達(dá)水平的化合物"指促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄、基因翻譯或蛋白活性表達(dá)階段中任一個(gè)的化合物。另一方面，表述"降低基因表達(dá)水平的化合物"，如本文所使用的，指抑制這些步驟中任一個(gè)的化合物。在具體方面，篩選結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療劑的方法可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行。所述篩選方法例如可以通過下述方式進(jìn)行，通過(1)給動(dòng)物受試者施用候選化合物；(2)測量來自所述動(dòng)物受試者的生物樣品的標(biāo)記基因的表達(dá)水平；或(3)選擇與對照相比增加或降低標(biāo)記基因表達(dá)水平的化合物，所述對照沒有與候選化合物接觸。在另一個(gè)方面，本文提供評(píng)估藥物試劑的候選化合物對標(biāo)記基因表達(dá)水平的功效的方法，通過使動(dòng)物受試者接觸候選化合物并監(jiān)測所述化合物對源自所述動(dòng)物受試者的生物樣品中所述標(biāo)記基因表達(dá)水平的影響?？梢允褂萌缟鲜鰷y試方法中使用的相同方法監(jiān)測源自所述動(dòng)物受試者的生物樣品中所述標(biāo)記基因表達(dá)水平的變化。此外，基于所述評(píng)價(jià)，藥物試劑的候選化合物可以通過篩選進(jìn)行選擇。103本文引用所有專利、專利申請和參考文獻(xiàn)以引用方式整體并入本文。雖然本發(fā)明已經(jīng)充分詳細(xì)地描述和舉例以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能制備和使用它，但各種改變、修改和改進(jìn)在不背離本發(fā)明的精神和范圍下是顯而易見的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解可以很好的調(diào)整本發(fā)明以實(shí)現(xiàn)目的并獲得所提到的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，以及固有的那些。本文所述的方法和試劑代表優(yōu)選實(shí)施方案，是代表性的，并不意圖作為對本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能想到本文的修改和其他用途。這些修改被包括在本發(fā)明的精神內(nèi)，并通過權(quán)利要求的范圍進(jìn)行限定。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明的精神和范圍下可以進(jìn)行各種替代和修改也是顯而易見的。應(yīng)該理解通過優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征已經(jīng)詳細(xì)公開了本發(fā)明，本文所公開的概念的修改和變化取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員，且認(rèn)為所述修改和變化在本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍內(nèi)。實(shí)施例1的參考文獻(xiàn)1.HamiltonSR^VogelsteinB，KudoS,etal.Carcinomaofthecolonandrectum.In:HamiltonSRAaltonenLA,eds.WorldHealthOrganizationclassificationoftumours:PathologyandGeneticsofTumoursoftheDigestiveSystem.LyonOxford:IARCPress;2000:104-19.2.JemalA，SiegelR，WardE,MurrayT,XuJ，ThunMJ.Cancerstatistics,2007,CACancerJCHn2007;57(l):43-66.3.FearonE民VogelsteinB.Ageneticmodelforcolorectaltumorigenesis.Cell19卯;61(5):75967.4.GoldmanE,FisherJL.Discrepanciesncancermortalityestimates.ArchMedRes2006;37(4):548-51.5.Rodriguez-BigasMA，HoffP，Cr咖CH.CarcinomaoftheColonandRectum.In:KufeDW,BastRC，HaitWN,etal,，eds.Holland-FreiCancerMedicine7.7thed.Hamilton,Ont:BCDedcerInc;2006:1369-91.6.CalinGA,CroceCM".MicroRNAsignaturesinhumancancers.NatRevCancer2006;6(11):857-66.7.Calin<3A,FerracinM,CimminoA,etal.AMicroRNAsignatureassociatedwithprognosisandprogressioninchroniclymphocyticleukemia.NEnglJMed2005;353(17):1793-80.8.YanaiharaN，CaplenN,BowmanE'etal.UniquemicroRNAmolecularprofilesinlungcancerdiagnosisandprognosis.CancerCell2006;9(3):189-98.9.BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,助dfunction.Cell2004;116(2):281-97.10.LeeRC,FeinbaumRL,AmbrosV.TheC,elegansheterochronicgene，in-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14.Cell1993;75(5):843-54.11.WightmanB,HaI，RuvkunG.Posttranscript〖o(jì)nalregulationoftheheterochronicgenelin-14bylin-4mediatestemporalpatternformationinC.elegans.Cell1993;75(5):855-62,12.BrenneckeJ，HipfherDR,StarkA，RussellRB，CohenSM.bantamencodesadevelopmentallyregulatedmicroRNAthatcontrolscellproliferationandregulatestheproapoptoticgenehidinDrosophila.Cell2003;113(0:25-36,13.ChanJA，KrichevskyAM,KosikKS.MicroRNA-21isanantiapoptoticfactorinhumanglioblastomacells.CancerRes2005;65(14):6029-33，14.XuP，VernooySY，GuoM，HayBA,TheDrosophilamicroRNAMir-14suppressescelldeathandisrequiredfornormalfatmetabolism.CuirBiol2003;13(9):790-15.ChenCZLiL，LodishHF,BartelDP.MicroRNAsmodulatehematopoieticlineagedifferentiation.Science2004;303(5654):83-6.16.HeL,ThomsonJM,HemannMT,etal.AmicroRNApolycistronasapotentialhumanoncogene.Nature2005;435(7043):828-33.17.Esquela-KerscherA,SlackFJ.Oncomirs-microRNAswitharoleincancer.NatRevCancer2006;6(4):259-69.18.LuJ,GetzG,MiskaEA,etal.MicroRNAexpressionprofilesclassifyhumancancers.Nature2005;435(7043):834-8.19，VoliniaS,CalinGA，LiuCG，etal,AmicroRNAexpressionsignatureofhumansolidtumorsdefinesc旭cergenetargets.ProcNatlAcadSciUSA2006;103(7):2257-61,20.CumminsJMHeY,LearyRJ,etal.ThecolorectalmicroRNAome.ProcNatlAcadSciUSA2006;103(10):3687-92,21.BandresE，CubedoE，AgirreX，etal.IdentificationbyReal-timePCRof13maturemicroRNAsdifferentiallyexpressedincolorectalcancerandnon-tumoraltissues.MolCancer2006;5:29,10522.MichaelMZ，SMOC，vanHoistPellekaanNG，YoungGP，JamesRJ.ReducedaccumulationofspecificmicroRNAsincolorectalneoplasia.MolCancerRes2003;1(12):882-91.23.CaHnGA，DumitruCD,ShimizuM,etal.Frequentdeletionsanddown-regulationoftnicroRNAgenesmiR15andmiR16at13ql4inchroniclymphocyticleukemia.ProcNatlAcadSciUSA2002;99(24):15524-9,24.DewsM，Homayoun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27的方法，其中所述候選治療劑包括藥物組合物、保健組合物和順勢療法組合物的一種或多種。29.權(quán)利要求27的方法，其中所述被評(píng)估的療法可用于人受試者。30.權(quán)利要求27的方法，其中所述方法不是通過手術(shù)或療法來治療人體或動(dòng)物體的方法。31.—種評(píng)估至少一種材料在動(dòng)物模型中引發(fā)結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的潛力的方法，所述方法提供l)在使動(dòng)物與足以引發(fā)動(dòng)物中結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的量的一種或多種材料接觸后，測量一種或多種被上調(diào)或下調(diào)的權(quán)利要求20的標(biāo)記物j和2)測定所述被上調(diào)或下調(diào)標(biāo)記物的至少一種是否具有引發(fā)結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的能力。32.—種治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的藥物組合物，包括至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組；和藥學(xué)可接受的栽體。33.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物對應(yīng)于在癌細(xì)胞中相對于合適的對照細(xì)胞被上調(diào)或下調(diào)的miR基因產(chǎn)物。34.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中所述miR基因產(chǎn)物是miR-21。35.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病是腺癌。36.—種治療結(jié)腸癌的藥物組合物，包括至少一種miR表達(dá)抑制化合物，和藥學(xué)可接受的載體，其中所迷的至少一種miR表達(dá)抑制化合物對miR基因產(chǎn)物具有特異性，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。37.權(quán)利要求36的藥物組合物，其中所述至少一種miR表達(dá)抑制化合物對在癌細(xì)胞中相對于合適的對照細(xì)胞被上調(diào)或下調(diào)的miR基因產(chǎn)物具有特異性。38.—種產(chǎn)品包括至少一種與結(jié)腸癌相關(guān)疾病的標(biāo)記物結(jié)合的捕獲試劑，所述標(biāo)記物選自權(quán)利要求20的標(biāo)記物的至少一種。39.—種用于篩選用于治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療劑的候選化合物的試劑盒，其中所述試劑盒包括至少一種權(quán)利要求20的標(biāo)記物的一種或多種試劑，.和表達(dá)至少一種標(biāo)記物的細(xì)胞。40.權(quán)利要求39的試劑盒，其中使用包括抗體或抗體片段的試劑以檢測所述標(biāo)記物的存在，所述抗體或抗體片段與至少一種標(biāo)記物特異性結(jié)合。41.權(quán)利要求40的試劑盒，其中所述試劑是標(biāo)記的、放射標(biāo)記的、或生物素標(biāo)記的，和/或其中所述抗體或抗體片段是放射標(biāo)記的、生色團(tuán)標(biāo)記的、熒光團(tuán)標(biāo)i己的或酶標(biāo)^己的。42.權(quán)利要求39的試劑盒進(jìn)一步包括容器，其包含所述標(biāo)記物的至少一種。43.權(quán)利要求39的試劑盒，其中所述試劑包括抗體、與所述附帶或可附帶的探針、和固定金屬螯合物的一種或多種。44.一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的篩選測試包括使權(quán)利要求20的標(biāo)記物的一種或多種與所述標(biāo)記物的底物和與測試試劑接觸，并測定所述測試試劑是否調(diào)節(jié)所述標(biāo)記物的活性。45.權(quán)利要求44的篩選測試，其中所有的方法步驟在體外進(jìn)行。46.—種預(yù)測受試者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病存在的微陣列，包括抗體，其針對權(quán)利要求20的標(biāo)記物的至少一種。47.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中通過檢測經(jīng)轉(zhuǎn)錄的多核苷酸或其部分的存在以評(píng)估所述標(biāo)記物的表達(dá)水平，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)錄的多核苷酸包括所述標(biāo)記物的編碼區(qū)。48.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是結(jié)腸癌相關(guān)體液或組織。49.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品包括獲自患者的細(xì)胞。50.—種治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制在需要其的個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性的方法，包括給所述個(gè)體施用干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答信號(hào)傳導(dǎo)途徑的試劑，以足以干擾所述信號(hào)傳導(dǎo)的量，其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。52.—種干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答信號(hào)傳導(dǎo)途徑的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性，其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。53.權(quán)利要求52的用途，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。54.—種治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制在需要其的個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性的方法，包括給所述個(gè)體施用干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑，其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b，miR-203及其組合組成的組。55.權(quán)利要求55的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。56.—種干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性，其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。57.權(quán)利要求56的用途，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。58.—種包含數(shù)據(jù)庫的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，所述數(shù)據(jù)庫具有多種數(shù)字編碼的參考譜，其中至少第一參考譜代表來自一個(gè)或多個(gè)受試者的一個(gè)或多個(gè)樣品中至少第一標(biāo)記物的水平，所述受試者展示結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的;f示"i己，其中所述標(biāo)記物包括一種或多種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。59.權(quán)利要求58的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，包含至少第二參考鐠，其代表來自一個(gè)或多個(gè)受試者的一個(gè)或多個(gè)樣品中至少第二標(biāo)記物的水平，所述受試者展示結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的標(biāo)記，或受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病。60.—種測定患者是否患有，或傾向于患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病，或具有差的結(jié)腸癌相關(guān)疾病存活預(yù)后的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，包括權(quán)利要求58的數(shù)據(jù)庫，和包含計(jì)算機(jī)執(zhí)行代碼的服務(wù)器，所述代碼使計(jì)算機(jī)接收受試者的譜，從數(shù)據(jù)庫中識(shí)別在診斷上與受試者譜相關(guān)的匹配參考譜，并產(chǎn)生所述受試者是否患有或傾向于患結(jié)腸癌相關(guān)疾病的指示。61.—種評(píng)價(jià)受試者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的存在、不存在、性質(zhì)或程度的計(jì)算機(jī)輔助方法，包括1)提供一種計(jì)算機(jī)，其包括對獲自所述受試者的樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類的模型或運(yùn)算法則，其中，所述分類包括就至少一種標(biāo)記物的存在、不存在或量針對所迷數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，和其中所述標(biāo)記物包括一種或多種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。2)輸入獲自受試者的生物樣品的數(shù)據(jù)；和3)對生物樣品進(jìn)行分類以指示結(jié)腸癌相關(guān)疾病的存在、不存在、性質(zhì)或程度。62.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物及其組合包括其分離的變體、或生物活性片段或功能等價(jià)物、或與其結(jié)合的抗體。63.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病是腺癌。64.—種結(jié)腸癌的動(dòng)物模型，其中存在一種或多種miR基因產(chǎn)物中至少一種改變的表達(dá)，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。65.權(quán)利要求64的動(dòng)物模型，其中所述動(dòng)物模型是非人脊稚動(dòng)物。66.權(quán)利要求64的標(biāo)記物，其中所述動(dòng)物模型是小鼠、大鼠、兔或靈長類動(dòng)物o全文摘要本發(fā)明提供診斷和治療結(jié)腸癌的新方法和組合物。本發(fā)明還提供鑒定腫瘤形成抑制劑的方法。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101657547SQ200780033066公開日2010年2月24日申請日期2007年7月12日優(yōu)先權(quán)日2006年7月13日發(fā)明者A·J·斯徹特,C·C·哈里斯,C·M·克羅斯申請人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會(huì);由衛(wèi)生與公眾服務(wù)部代表的美利堅(jiān)合眾國政府