專利名稱：：糖蛋白的產生的制作方法糖蛋白的產生本發(fā)明涉及在包含錳的細胞培養(yǎng)基中產生糖蛋白的方法，和用于這種方法的細胞培養(yǎng)基。相關申請的參考本申請是2()06年7月13日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/830,658的共同待決申請，并且與其有至少一個共同發(fā)明人并且要求該美國臨時專利申請的優(yōu)先權，將該美國臨時專利申請的內容完整引入本文作為參考。
背景技術：
：蛋白質和多肽已經成為越來越重要的治療劑。在多數情況下，這些蛋白質和多肽在細胞培養(yǎng)物中從細胞產生，所述細胞已經被人工改造和/或選擇以產生不尋常的高水平的特定目的蛋白質或多肽。細胞培養(yǎng)條件的控制和優(yōu)化對于蛋白質和多肽的成功的商業(yè)化生產是尤其重要的。細胞培養(yǎng)物中產生的許多蛋白質和多肽是糖蛋白，其含有共價連接的糖類結構，包括寡糖鏈。這些寡糖鏈在內質網和高爾基體中通過N-連接或O-連接連接到蛋白質。寡糖鏈可以占糖蛋白質量的大部分。認為寡糖鏈在糖蛋白的功能中起重要作用，包括促進糖蛋白的正確折疊、介導蛋白質-蛋白質相互作用、賦予穩(wěn)定性、賦予有利的藥物動力學和/或藥物代謝動力學性質、抑制蛋白酶解消化、將糖蛋白靶向正確的分泌途徑和將糖蛋白靶向一個或多個特定器官。通常，在內質網腔中，N-連接的寡糖鏈加入新生的轉運蛋白(見Alberts等人，MolecularBiologyoftheCell,1994，引入本文作為參考)。寡糖被加入目標共有序列Asn-X-Ser/Thr內所含的天冬酰胺殘基側鏈上的氨基上，其5中x可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。最初的寡糖鏈通常在內質網中被特定糖苷酶修剪，得到由兩個N-乙酰葡糖胺和三個甘露糖殘基組成的短的分枝的核心寡糖。糖蛋白在內質網中的最初處理后，通過小泡穿梭到高爾基體中，在那里寡糖鏈經歷進一步的加工后被分泌到細胞表面。經修剪的N-連接的寡糖鏈可以通過加入幾個甘露糖殘基修飾，得到高甘露糖寡糖。備選地，N-乙酰葡糖胺的一個或多個單糖單位可以加入核心甘露糖亞基形成復雜的寡糖。半乳糖可被加入N-乙酰葡糖胺亞基，唾液酸亞基可被加入半乳糖亞基，得到以唾液酸、半乳糖或N-乙酰葡糖胺殘基的任一個結束的鏈。此外，巖藻糖殘基可以加入核心寡糖的N-乙酰葡糖胺殘基。這些加入的每一種通過特定糖基轉移酶催化。除了通過N-連接的糖基化途徑修飾外，糖蛋白也可通過向特定絲氨酸或蘇氨酸殘基加入O-連接的寡糖鏈被修飾，如它們在高爾基體中被處理那樣。()-連接的寡糖的殘基每次加入一個并且每個殘基的加入通過特定酶催化。()-連接的糖基化的共有氨基酸序列不如N-連接的糖基化意義明確。蛋白質糖基化的最終質量和程度受到細胞培養(yǎng)條件的顯著影響。例如，常規(guī)的分批和補料分批培養(yǎng)方法集中于所產生的肽的最終水平并且通常導致產生這樣的糖蛋白，所述糖蛋白具有較不廣泛的糖基化模式和/或這樣的糖基化模式，其寡糖鏈的糖殘基沒有足夠地反映存在于天然發(fā)生形式的糖蛋白中的糖殘基。增加糖基化程度和/或調節(jié)糖殘基的組成到更接近地反映存在于天然形式糖蛋白中的糖基化水平和組成可以潛在地導致這樣的治療性糖蛋白物質，其具有更高的功效、改進的藥物代謝動力學和/或藥物動力學性質和更少的副作用。盡管在提高細胞培養(yǎng)物中產生的糖蛋白的糖基化的質量和數量方面做出了一定的努力，但是仍然需要額外的進步。尤其需要開發(fā)通過在確定成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞產生具有改進的糖基化模式的糖蛋白的系統。發(fā)明概述本發(fā)明的方法和組合物提供了用于用細胞培養(yǎng)大規(guī)模產生具有改進的糖基化模式的糖蛋白的改進系統。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了商業(yè)規(guī)模(例如，500L或更多)培養(yǎng)方法，其利用含有約10到600nM之間的錳的摩爾累積濃度的培養(yǎng)基。在一些實施方案中，培養(yǎng)基中的摩爾累積谷氨酰胺濃度小于約8mM。在一些實施方案中，培養(yǎng)基中的摩爾累積谷氨酰胺濃度小于約4mM。將理解如上面使用的"累積，，指在細胞培養(yǎng)過程中加入的具體一種或多種組分的總量，包括培養(yǎng)開始時加入的組分和隨后加入的組分。在本發(fā)明的一些實施方案中，希望隨時間減小培養(yǎng)的"進料"，因此希望最初存在的量最大。當然，如果那些組分在不同時間加入(例如，最初存在的所有組分對通過進料加入的一些組分)，那么培養(yǎng)基組分在培養(yǎng)期間被代謝使得具有相同累積量的給定組分的培養(yǎng)物將具有不同的絕對水平。根據本發(fā)明，此類培養(yǎng)基的使用允許產生含有希望的糖基化模式的糖蛋白。在一些實施方案中，糖蛋白可以具有更廣泛的糖基化^t式和/或可以具有更類似于天然宿主細胞應用于該糖蛋白的寡糖鏈分布的寡糖鏈分布。在一些實施方案中，本發(fā)明系統的使用可以導致產生這樣的糖蛋白，其糖基化模式與該糖蛋白在內源人細胞中表達時將存在的糖基化模式相似或相同。本領域技術人員將理解本發(fā)明的培養(yǎng)基制劑包括確定成分培養(yǎng)基和復雜的培養(yǎng)基。在一些實施方案中，培養(yǎng)基是確定成分培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基的組成是已知的和受控的。在一些實施方案中，細胞在美國臨時專利申請序號60/605，097(《1入本文作為參考)中所述的一個或多種條件下生長。在一些實施方案中，細胞在美國臨時專利申請序號11/213，308(引入本文作為參考)中所述的一個或多種條件下生長。本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物可以任選補充營養(yǎng)物和/或其他培養(yǎng)基組分，包括激素和/或其他生長因子、特定離子(如鈉、氯化物、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低終濃度存在的無機化7合物)、氨基酸、脂類或葡萄糖或其他能源。在一些實施方案中，對培養(yǎng)基補充化學誘導物如六亞甲基二(乙酰胺)("HMBA，，)和丁酸鈉("NaB")可以是有益的。此類任選的補充物可以在培養(yǎng)開始時加入或者可以在以后的時間點加入以便補充耗盡的營養(yǎng)物或者為了另一原因。通常，希望選擇最初的培養(yǎng)基組成以便減'J、根據本發(fā)明的補充。附圖簡述圖1顯示了UF/DF存留物質中糖苷活性的研究。對于每個實驗，代表多種K4和K4，種類的條形從左到右為K4(Fuc-GleNAe-Gal-SA)、K4，(Fuc-GlcNAc-Gal)、K4,(Fuc-GlcNAc)和K4，(Fuc)。圖2顯示了在搖瓶培養(yǎng)中產生的rFIX中K4種類分布。對于每個實驗，代表多種K4和K4，種類的條形從左到右為K4(Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4，(Fuc畫GlcNAc-(;al)、K4，(Fuc-GlcNAc)和K4，(Fuc)。圖3顯示了來自使用多種培養(yǎng)基添加劑的搖瓶培養(yǎng)物的K4種類分布。對于每個實驗，代表多種K4和K4，種類的條形從左到右為K4(Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4，(Fuc-GlcNAc-Gal)、K4，(Fuc-GlcNAc)和K4，(Fuc)。圖4顯示了使用補充培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)物的K4種類分布。對于每個實驗，代表多種K4和K4，種類的條形從左到右為K4(Fuc-(;lcNAc-Gal-SA)、K4，(Fuc畫GlcNAc-Gal)、K4，(Fuc隱GlcNAc)和K4，(Fuc)。圖5顯示了來自使用多種培養(yǎng)基添加劑的搖瓶培養(yǎng)物的K4種類分布。對于每個實驗，代表多種K4和K4，種類的條形從左到右為K4(Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4，(Fuc-GlcNAc誦Gal)、K4，(Fuc-GlcNAc)和K4，(Fuc)。圖6顯示了來自不同錳水平下的搖瓶培養(yǎng)物的K4種類分布。對于每個實驗，代表多種K4和K4，種類的條形從左到右為K4(Fuc-GlcNAc國Gal-SA)、K4，(Fuc-GlcNAc-Gal)、K4，(Fuc-GlcNAc)和K4，(Fuc)。圖7顯示了(;0、Gl和G2HPAEC-PED峰的總峰面積百分數的圖形比較。對于每個實驗，代表復雜N-連接的雙觸角聚糖的條形從左到右為(;0、Gl和G2。圖8顯示了G0、Gl和G2HPAEC-PED峰的總峰面積百分數的圖形比較。對于每個實驗，代表復雜N-連接的雙觸角聚糖的條形從左到右為(;0、Gl和G2。定義"氨基酸"如本文所用的術語"氨基酸"指通常用于形成多肽的20種天然存在的氨基酸的任一種，或者那些氨基酸的類似物或衍生物或任一種非天然存在的氨基酸。本發(fā)明的氨基酸在培養(yǎng)基中提供給細胞培養(yǎng)物。培養(yǎng)基中提供的氨基酸可以作為鹽或者以水合物形式提供。"抗體"如本文所用的術語"抗體"指免疫球蛋白分子或者免疫球蛋白分子的免疫學活性部分，即，含有特異結合抗原的抗原結合部位的分子，如Fab或F(ab')2片段。在一些實施方案中，抗體是本領域技術人員已知的典型的天然抗體，如包含四條多肽鏈兩條重鏈和兩條輕鏈的糖蛋白。在一些實施方案中，抗體是單鏈抗體。例如，在一些實施方案中，單鏈抗體包含典型的天然抗體的變體，其中重鏈和/或輕鏈的兩個或多個成員已經例如通過肽鍵共價連接。在一些實施方案中，單鏈抗體是具有由重鏈和輕鏈組成的兩條多肽鏈結構的蛋白質，所述鏈例如通過鏈間肽接頭穩(wěn)定化，所述蛋白質具有特異結合抗原的能力。在一些實施方案中，抗體是僅由重鏈組成的抗體，例如，在駝科(Camelidae),包括羊駝和駱駝的成員中天然發(fā)現的那些(見例如，Casterman等人的美國專利號6,765,087，Casterman等人的美國專利號6,015,695和Casterman等人的美國專利號6，()05，079，將它們各自完整引入本文作為參考)。如本文所用的術語"單克隆抗體"和"單克隆抗體組合物"指含有僅僅一個種類的抗原結合部位并且因此通常僅與單個表位或特定抗原相互作用的一群抗體分子。單克隆抗體組合物從而通常顯示出它們與之免疫反應的特定表位的單一結合親和力。術語"多克隆抗體"和"多克隆抗體組合物"指含有與特定抗原相互作用的多個種類的抗原結合部位的抗體分子群體。"分批培養(yǎng)"如本文所用的術語"分批培養(yǎng)"指培養(yǎng)細胞的方法，其中在培養(yǎng)過程開始時提供將最終用于培養(yǎng)細胞的所有組分，包括培養(yǎng)基(見下面"培養(yǎng)基"的定義)以及細胞自身。分批培養(yǎng)通常在某個點停止并且收獲并任選純化培養(yǎng)基中的細胞和/或組分。"生物反應器"如本文所用的術語"生物反應器"指用于哺乳動物細胞培養(yǎng)物生長的任何容器。生物反應器可以為任何大小，只要它用于培養(yǎng)哺乳動物細胞。通常，此類生物反應器將為至少1升并且可以為10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或以上，或者之間的任何體積。在培養(yǎng)期間通常控制生物反應器的內部條件，包括但不限于，pH、溶解氧和溫度。生物反應器可以由適于在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下容納懸浮在培養(yǎng)基中的哺乳動物細胞培養(yǎng)物的任何材料(包括玻璃、塑料或金屬)組成。如本文所用的術語"生產生物反應器"指用于生產目的糖蛋白的最終生物反應器。生產生物反應器的體積通常為至少500升并且可以為1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或以上，或之間的任何體積。本領域技術人員將知道并且將能夠選擇用于實施本發(fā)明的合適的生物反應器。"細胞密度"如本文所用的術語"細胞密度"指在給定體積的培養(yǎng)基中存在的細胞數目。"細胞生存力，，如本文所用的術語"細胞生存力"指培養(yǎng)的細胞在給定的一組培養(yǎng)條件或者實驗變化下存活的能力。如本文所用的該術語也指特定時間存活的細胞相對于在該時間時培養(yǎng)物中活細胞和死細胞總數的部分。"復雜培養(yǎng)基"如本文所用的術語"復雜培養(yǎng)基"指含有身份或量未知或不受控制的至少一種組分的培養(yǎng)基。"培養(yǎng)物，，、"細胞培養(yǎng)物"如本文所用的這些術語指在適于細胞10群體存活和/或生長的條件下懸浮在培養(yǎng)基(見下面"培養(yǎng)基"的定義)中的該細胞群體。如本領域技術人員清楚的，在一些實施方案中，如本文所用的這些術語指包含細胞群體和其中懸浮該群體的培養(yǎng)基的組合。在一些實施方案中，細胞培養(yǎng)物的細胞包含哺乳動物細胞。"確定成分培養(yǎng)基"如本文所用的術語"確定成分培養(yǎng)基"指這樣的培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基的組成是已知的和受控的。"補料分批培養(yǎng)，，如本文所用的術語"補料分批培養(yǎng)"指培養(yǎng)細胞的方法，其中在培養(yǎng)過程開始后一次或多次向培養(yǎng)物提供額外的組分。如此提供的組分通常包含在培養(yǎng)過程期間被消耗的細胞的營養(yǎng)組分。額外或備選地，此類額外的組分可以包括補充組分(見下面"補充組分，，的定義)。在一些實施方案中，在補料培養(yǎng)基中提供額外的組分(見下面的"補料培養(yǎng)基")。補料分批培養(yǎng)通常在某點停止并且收獲并任選純化培養(yǎng)基中的細胞和/或組分。"補料培養(yǎng)基"如本文所用的術語"補料培養(yǎng)基"指在細胞培養(yǎng)開始后加入的溶液，其含有為哺乳動物細胞生長提供營養(yǎng)的營養(yǎng)物。補料培養(yǎng)基可以含有與最初的細胞培養(yǎng)基中提供的組分相同的組分。備選地，補料培養(yǎng)基可以含有除了最初的細胞培養(yǎng)基中提供的組分之外的一種或多種額外組分。額外或備選地，補料培養(yǎng)基可以缺少在最初的細胞培養(yǎng)基中提供的一種或多種組分。在一些實施方案中，補料培養(yǎng)基的一種或多種組分以與最初的細胞培養(yǎng)基中提供的那些組分的濃度或水平相同或相似的濃度或水平提供。在一些實施方案中，補料培養(yǎng)基的一種或多種組分以與最初例性補料培養(yǎng)基在表2顯示，盡管本發(fā)明不限于使用這些培養(yǎng)基。本領域技術人員將認識到可以使用備選的補料培養(yǎng)基和/或可以對表2中所列的示例性補料培養(yǎng)基的組分進行某些改變。在一些實施方案中，補料培養(yǎng)基含有補充組分(見下面"補充組分"的定義)。"片段"如本文所用的術語"片段"指被定義為給定多肽的任何離散部分的多肽，所述離散部分是所述給定多肽獨特或特征性的。例如，如本文所用的該術語指給定多肽的任一部分，其包括在全長多肽中發(fā)現的至少一個確定的序列元件。在一些片段中，序列元件跨越全長多肽的至少4-5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或以上的氨基酸。備選或額外地，如本文所用的該術語指給定多肽的保留全長多肽的至少一種活性的至少一部分的任何離散部分。在一些實施方案中，所保留的活性的部分為全長多肽活性的至少10%。在一些實施方案中，所保留的活性的部分為全長多肽活性的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或卯％。在一些實施方案中，所保留的活性的部分為全長多肽活性的至少95%、96%、97%、98%或99%。在一些實施方案中，所述片段保留全長多肽活性的100%或以上。在一些實施方案中，本發(fā)明的片段含有作為糖基化位點的肽序列。在一些實施方案中，本發(fā)明的片段含有糖基化位點的部分，使得當連接到含有糖基化位點的另一部分的另一片段時，重構了功能糖基化位點。"基因，，如本文所用的術語"基因"指任何核苷酸序列、DNA或RNA,其至少部分編碼離散的終產物，通常是但不限于多肽，其在細胞代謝或發(fā)育的某方面發(fā)揮功能。任選地，基因不僅包含編碼多肽或其他離散終產物的編碼序列，而且包含編碼區(qū)之前和/或之后的調節(jié)基礎表達水平的區(qū)域(見下面的"遺傳控制元件"的定義)，和/或各編碼區(qū)段("外顯子")之間的間插序列("內含子")。"遺傳控制元件"如本文所用的術語"遺傳控制元件"指任一序列元件，其調節(jié)它有效連接的基因的表達。遺傳控制元件可以通過提高或降低表達水平發(fā)揮功能并且可以位于編碼序列之前、之內或之后。遺傳控制元件可以在基因表達的任一階段通過調節(jié)例如轉錄的起始、延長或終止、mRNA剪接、mRNA編輯、mRNA穩(wěn)定性、mRNA在細胞內的定位、翻譯的起始、延長或終止或者基因表達的任一其他階段起作用。遺傳控制元件可以單獨或者相互組合發(fā)揮功能。"糖蛋白"如本文所用的術語"糖蛋白"指含有一個或多個共價連接的寡糖鏈的蛋白質或多肽。寡糖鏈可以由單一糖殘基、糖殘基的單一不分枝的鏈組成或者可以由分枝一次或多次的糖殘基鏈組成。在一些實施方案中，寡糖鏈是N-連接的。在一些實施方案中，寡糖鏈是O-連接的。"糖基化模式"術語"糖基化模式"指給定的一種或多種糖蛋白的所觀察到的糖基化。在寡糖鏈中具有較大數目的共價連接的糖殘基的糖蛋白被說成是具有增加的或者更廣泛的糖基化模式。相反地，在寡糖鏈中具有較少的共價連接的糖殘基的糖蛋白被說成是具有減少的或者較不廣泛的糖基化模式。如本文所有的術語"糖基化模式"也指根據本發(fā)明的教導表達的個體糖蛋白上的一些不同的糖基化^^莫式的特征性分布。在該意義上，增加的糖基化模式指所表達的糖蛋白的糖基化模式的特征性分布的增加。"宿主細胞"如本文所用的術語"宿主細胞"指根據本發(fā)明操作以產生如本文所述的具有希望的糖基化模式的糖蛋白的細胞。在一些實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞。"雜交瘤"如本文所用的術語"雜交瘤，，指永生化細胞和產生抗體的細胞融合得到的細胞或細胞后代。這種得到的雜交瘤是產生抗體的永生化細胞。用于產生雜交瘤的個體細胞可以來自任何哺乳動物來源，包括但不限于，大鼠、豬、兔、綿羊、豬、山羊和人。在一些實施方案中，雜交瘤是三瘤細胞系，當人細胞和小鼠雜交瘤細胞系融合產物一一異雜交骨髓瘤融合后代隨后與漿細胞融合時得到三瘤細胞系。在一些實施方案中，雜交瘤是產生抗體的任何永生化的雜交細胞系，如四瘤(quadromas)(見例如，畫stein等人，Nature,537:3053,1983)。"培養(yǎng)基"、"細胞培養(yǎng)基"、"培養(yǎng)基"如本文使用的這些術語指為生長的哺乳動物細胞提供營養(yǎng)的含有營養(yǎng)物的溶液。通常，此類溶液提供細胞的基本生長和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、維生素、能源、脂類和微量元素。此類溶液也可以含有在最小程度之上增強生長和/或存活的補充組分(見下面"補充組分"的定義)，包括但不限于，激素和/或其他生長因子、特定離子(如鈉、氯化物、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低終濃度存在的無機化合物)、氨基酸、脂類和/或葡萄糖或其他能源。在一些實施方案中，有利地將培養(yǎng)基配制成對于細胞存活和增殖最優(yōu)的pH和鹽濃度。示例性培養(yǎng)基在表l中顯示，13然而本發(fā)明不限于使用這些培養(yǎng)基。本領域技術人員將認識到可以使用備選培養(yǎng)基和/或可以對表l中所列的示例性培養(yǎng)基的組成進行某些改變。在一些實施方案中，培養(yǎng)基是在細胞培養(yǎng)開始后加入的補料培養(yǎng)基(見上面的"補料培養(yǎng)基，，的定義)。"多肽"如本文使用的術語"多肽"指通過肽鍵連接在一起的氨基酸的順序鏈。該術語用于指任何長度的氨基酸鏈，但是本領域技術人員將理解該術語不限于長鏈并且可以指包含通過肽鍵連接在一起的兩個氨基酸的最小鏈。如本領域技術人員所知，可以處理和/或修飾多肽。例如，可以糖基化多肽(見上面"糖蛋白"的定義)。"蛋白質"如本文使用的術語"蛋白質"指作為離散單位發(fā)揮功能的一種或多種多肽。如果單個多肽是離散的功能單位并且不需要與其他多肽永久或暫時物理結合以便形成離散的功能單位，那么術語"多肽，，和"蛋白質"可以互換使用。如果離散的功能單位由物理上相互結合的一種以上的多肽組成，那么術語"蛋白質"指物理上偶聯并且一起作為離散單位發(fā)揮功能的多個多肽。"重組表達的糖蛋白，，和"重組糖蛋白"如本文使用的這些術語指從宿主細胞表達的糖蛋白，所述宿主細胞已經通過人的手操作而表達該糖蛋白。在一些實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞。在一些實施方案中，此類操作包含一個或多個遺傳修飾。例如，通過導入一個或多個編碼待表達糖蛋白的異源基因可以遺傳修飾哺乳動物宿主細胞。異源重組表達的糖蛋白可以與在哺乳動物宿主細胞中正常表達的糖蛋白相同或相似。異源重組表達的糖蛋白也可以是宿主細胞外源的，即，與在哺乳動物宿主細胞中正常表達的糖蛋白是異源的。在一些實施方案中，異源重組表達的糖蛋白是嵌合的，因為該糖蛋白的部分含有與在哺乳動物宿主細胞中正常表達的糖蛋白相同或相似的氨基酸序列，而其他部分是宿主細胞外源的。備選地，通過活化或上調一種或多種內源基因可以遺傳修飾哺乳動物宿主細胞。"補充組分"如本文使用的術語"補充組分"指增強生長和/存活高于最小程度的組分，包括但不限于，激素和/或其他生長因子、特定離子(如鈉、氯化物、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低終濃度存在的無機化合物)、氨基酸、脂類和/或葡萄糖或其他能源。在一些實施方案中，可以將補充組分加入最初的細胞培養(yǎng)物中。在一些實施方案中，可以在細胞培養(yǎng)開始后加入補充組分。"效價"如本文使用的術語"效價，，指在給定量的培養(yǎng)基體積中哺乳動物細胞培養(yǎng)物產生的重組表達的糖蛋白的總量。效價通常以毫克糖蛋白/毫升培養(yǎng)基的單位表示。一些實施方案的詳細描述本發(fā)明提供了用于在細胞培養(yǎng)物中產生糖蛋白的改進系統。具體地，提供了導致產生含有希望的糖基化模式的糖蛋白的系統。例如，糖蛋白可以具有更廣泛的糖基化模式和/或可以具有更類似于天然宿主細胞應用于糖蛋白的寡糖鏈分布的寡糖鏈分布。在一些實施方案中，本發(fā)明系統的使用可以導致產生這樣的糖蛋白，其糖基化模式與該糖蛋白在內源人細胞中表達時將存在的糖基化模式相似或相同。在下面詳細討論本發(fā)明的一些實施方案。然而，本領域技術人員將理解這些實施方案的多種修飾在所附權利要求的范圍內。權利要求和其等同方案限定了本發(fā)明的范圍，其不會且不應該局限于某些實施方案的描述或受到某些實施方案的描述的限制。培養(yǎng)基組成多種哺乳動物生長培養(yǎng)基可以用于本發(fā)明。在一些實施方案中，細胞可以生長于多種化學上確定成分培養(yǎng)基的一種中，其中培養(yǎng)基的成分是已知和受控的。在一些實施方案中，細胞可以生長在復雜培養(yǎng)基中，其中不是培養(yǎng)基的所有組分都是已知和/或受控的。上確定成分培養(yǎng)基。確定成分培養(yǎng)基的所有組分被良好表征，并且該確定成分培養(yǎng)基不含有復雜的添加劑，如血清或水解物。開發(fā)了早期的培養(yǎng)基制劑以允許細胞生長和生存力的維持，而對于蛋白質產生關心很少或者不關心。最近，開發(fā)的培養(yǎng)基制劑具有維持產生高水平生產性重組蛋白和/或糖蛋白的細胞培養(yǎng)物的表達目的。確定成分培養(yǎng)基通常由水中的已知濃度的基本上50種化學實體組成。它們的多數也含有一種或多種良好表征的蛋白質，如胰島素、IGF-1、轉鐵蛋白或BSA,但是其他的不需要蛋白質組分并且因此被稱作無蛋白質的確定成分培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的化學組分落入五個大類氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素和難以良好歸類的雜類。微量元素由以微摩爾或更低水平被包括的多種無機鹽組成。存在于幾乎所有確定成分培養(yǎng)基中的四種最通常被包括的微量元素是鐵、鋅、硒和銅。鐵(二價或三價鹽)和鋅通常以微摩爾濃度加入，而其他的通常以納摩爾濃度加入。多數較不常見的微量元素通常以納摩爾濃度加入。錳通常作為二價陽離子(MnCl2或MnS04)被包括在微量元素中。在早期形式的確定成分培養(yǎng)基中，它被省略或者以1^M級的高濃度包括(見例如，Barnes和Sato，1980[培養(yǎng)基DMEM/F12]和Kitos等人，1962[培養(yǎng)基Ml)705/11)。在最近開發(fā)的確定成分培養(yǎng)基中，錳常常被包括在內，但是以低得多的濃度，如l-5nM范圍的濃度包括在內(見例如，Hamilton和Ham,1977[培養(yǎng)基MCDB301j和Cleveland和Erlanger,1988|未命名的培養(yǎng)基l)。本發(fā)明包括如下發(fā)現在含有這些極限濃度之間的錳濃度的確定成分培養(yǎng)基中生長的細胞的培養(yǎng)物產生的糖蛋白比在常規(guī)培養(yǎng)基(如上迷的那些培養(yǎng)基)中生長的細胞產生的糖蛋白含有更廣泛的糖基化模式。在一些實施方案中，錳以約10到600nM的濃度在培養(yǎng)基中提供。在一些實施方案中，錳以約20到100nM的濃度在培養(yǎng)基中提供。在一些實施方案中，錳以約IO、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、2卯、300、310、320、330、340、350、360、370、380、3卯、400、410、420、430、440、450、460、470、480、4卯、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600nM的濃度或者這些濃度內的任何范圍的濃度在培養(yǎng)基中提供。本發(fā)明也包括如下發(fā)現在含有相對低水平的谷氨酰胺的確定成分培養(yǎng)基中生長的細胞培養(yǎng)物產生的糖蛋白比在含有較高水平谷氨酰胺的常規(guī)培養(yǎng)基中生長的細胞產生的糖蛋白含有更廣泛的糖基化模式。在一些實施方案中，培養(yǎng)基中谷氨酰胺的最初水平小于或等于約8mM。在一些實施方案中，培養(yǎng)基中谷氨酰胺的最初水平小于或等于約4mM。本領域普通技術人員將能夠基于他或她的實驗設計的具體屬性選擇這些發(fā)明性范圍內的確切的錳濃度，所述屬性包括表達糖蛋白的細胞的特性、待產生的糖蛋白的特性，和用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中其他組分的存在或缺失。例如，每個這些大類中N-連接的和O-連接的結構之間的差異、或具體寡糖結構之間的差異可以需要生長培養(yǎng)基中不同的錳濃度以便產生更廣泛和/或更天然的寡糖鏈。糖蛋白根據本教導可以產生能夠在宿主細胞中表達的任何糖蛋白。糖蛋白可以從宿主細胞的內源基因表達，或者從導入宿主細胞的異源基因表達。糖蛋白可以是在自然界中存在的糖蛋白，或者可以備選地具有通過人的手改造或選擇的序列。待產生的糖蛋白可以從在自然界單獨發(fā)生的多肽片段裝配，至少一個片段含有作為糖基化位點的肽序列。備選地，每個多肽片段可以僅僅具有糖基化位點的一部分，當多肽片段裝配時重構該糖基化位點。額外或備選地，改造的糖蛋白可以包括非天然存在的一個或多個片段，只要該改造的糖蛋白含有作為糖基化位點的至少一個肽序列?？梢韵Ｍ鶕景l(fā)明表達的糖蛋白將通?；谟腥せ蛴杏玫纳锘蚧瘜W活性選擇。例如，本發(fā)明可以用于表達任一種藥學或商業(yè)上相關的酶、受體、抗體、激素、調節(jié)因子、抗原、結合劑等等。可以根據本發(fā)明產生的下面糖蛋白的列表僅僅是示例性的，并且不意在作為限制性引用。本領域技術人員將理解任何糖蛋白可以根據本發(fā)明表達并且將能夠基于他或她的具體需要選擇待產生的具體糖蛋白。凝血因子已經表明凝血因子作為藥學和/或商業(yè)活性劑是有效的?？紤]到重組凝血因子在治療諸如血友病的疾病中的重要性，根據本發(fā)明優(yōu)化重組產生的凝血因子的糖基化模式是尤其重要的。例如，凝血因子IX(因子IX或"FIX")是單鏈糖蛋白，其缺乏導致B型血友病，其是患者的血液不能凝固的一種疾病。從而，任何導致出血的小創(chuàng)傷都是潛在威脅生命的事件。FIX作為單鏈酶原合成，其通過活性肽的釋放而被活化成兩條鏈的絲氨酸蛋白酶(因子IXa)。因子IXa的催化結構域位于重鏈中(見Chang等人，丄Clin.Invest.,100:4，1997，引入本文作為參考)。FIX有多個糖基化位點，包括N-連接的和O-連接的糖類二者。曾經認為絲氨酸61處的一種具體的()-連接的結構Sia-a2，3-Gal-卩l(xiāng)，4-GlcNAc-pi,3-Fuc-al-0-Ser)是FIX特有的但是其后來在包括哺乳動物和果蠅中的Notch蛋白質的一些其他分子上被發(fā)現(Maloney等人，JournalofBiol.Chem.，275(13)，2000)。細胞培養(yǎng)中中國倉鼠卵巢("CHO")細胞產生的FIX在絲氨酸61寡糖鏈中顯示出一定的變異性。這些不同的糖形和其他潛在的糖形當施用于人或動物時可以具有不同的誘導凝血的能力和/或在血液中具有不同的穩(wěn)定性，導致效率較低的凝血。A型血友病在臨床上與B型血友病不能區(qū)分，由人類凝血因子VIII中的缺陷引起，人類凝血因子vm是另一種糖蛋白，其作為單鏈酶原合成然后被加工成兩條鏈的活性形式。本發(fā)明也可以用于控制或改變凝血因子vni的糖基化模式以便調節(jié)它的凝血活性。根據本發(fā)明可以產生并且可以控制或改變其糖基化模式的其他糖蛋白凝血因子包括例如，但不限于，組織因子和馮維勒布蘭德(vonWillebrands)因子?？贵w抗體是能夠特異結合特定抗原的蛋白質?？紤]到當前使用或研究中的許多抗體作為藥學或其他商業(yè)活性劑，根據本發(fā)明產生具有希望的糖基化18模式的抗體是尤其重要的。此外，具有不同的糖基化模式的抗體較不可能在施用它們的個體中引起免疫應答，導致更有效的治療方案。額外或備選地，在它們的恒定區(qū)中具有不同糖基化模式的抗體可以顯示出改進的藥物代謝動力學或藥物動力學效應功能。額外或備選地，具有不同糖基化模式的抗體可以在產生它們的細胞培養(yǎng)條件中更穩(wěn)定，例如，通過更抗細胞培養(yǎng)物中的蛋白酶或其他組分，使得產生更高最終效價的抗體。些實施方案中，待表達的抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體是嵌合抗體。嵌合抗體含有來自一種以上生物的氨基酸片段。嵌合抗體分子可以包括例如，來自小鼠、大鼠或其他物種的抗原結合結構域與人恒定區(qū)。已經描述了多種制備嵌合抗體的方法(見例如，Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，6851，1985;Takeda等人，Nature314，452，1985，Cabilly等人，美國專利號4,816,567;Boss等人，美國專利號4,816,397;Tanaguchi等人，歐洲專利公布EP171496;歐洲專利^>布0173494，英國專利GB2177096B，將它們各自引入本文作為參考)。在一些實施方案中，單克隆抗體是人源化抗體。人源化抗體是嵌合抗體，其中多數氨基酸殘基來自人抗體，從而使得遞送到人類受試者時減小任何潛在的免疫反應。在人源化抗體中，高變區(qū)中的氨基酸殘基被來自非人物種的賦予所希望的抗原特異性或親和性的殘基替換。在一些實施方案中，人源化抗體具有與人抗體有百分之80、85、卯、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，通過引入保守替代、共有序列替代、種系替代和/或回復突變優(yōu)化人源化抗體。此類改變的免疫球蛋白分子可以通過本領域已知的幾種技術的任一種制備(例如，Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80,7308-7312,1983;Kozbor等人，ImmunologyToday,4，7279，1983;Olsson等人，Meth.Enzymol.，92，3-16.1982，各自引入本文作為參考)。在一些實施方案中，根據PCT公布WO92/06193或EPt)239400(各自完整引入本文作為參考)的教導制備改變的免疫球蛋白分子。抗體可以含有顯示出改進的糖基化模式的免疫球蛋白恒定區(qū)或Fc區(qū)。例如，根據本文教導產生的抗體可以更強烈結合效應分子或對效應分子有更高特異性，所述效應分子如補體和/或Fc受體，可以控制抗體的幾種免疫功能，如效應細胞活性、裂解、補體介導的活性、抗體清除、和抗體半壽期。結合抗體(如IgG抗體)的Fc區(qū)的典型的Fc受體包括，^L不限于，FqrRI、FqRII和FcyRIII和FcRn亞類的受體，包括這些受體的等位變體和選擇性剪接的形式。Fc受體在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9:457-92，1991;Capel等人，Immunoinethods4:25-34,1994;和deHaas等人，丄Lab.Clin.Med.126:330-41,1995中回顧，將這些文獻各自完整引入本文作為參考。僅作為一個非限制性實例，可以根據本教導產生的抗體是抗ABeta抗體?？笰Beta抗體是阿爾茨海默氏病的治療中尤其有希望的潛在治療途徑。阿爾茨海默氏病(AD)是導致老年性癡呆的進行性疾病(一般見Selkoe，TINS16:403，1993;Hardy等人，WO92/13069;Sdkoe，丄Neuropathol.Exp.Neurol.53:438，1994;Duff等人，Nature373:476，1995;Games等人，Nature373:523，1995，各自引入本文作為參考)。一般地說，該疾病落入兩個類別遲發(fā)型，其發(fā)生在老年(65歲以上)，和早發(fā)型，其發(fā)生在老年期之前，即，35到60歲之間。在兩種類型的疾病中，病理是相同的但是在較早年齡開始的病例中，異常傾向于更嚴重和廣泛。該疾病的特征是腦中至少兩種類型的病變神經原纖維纏結和衰老斑。神經原纖維纏結是與tau蛋白相關的微管的細胞內沉積，由成對的相互纏繞的兩條絲組成。衰老斑(即，淀粉狀蛋白斑)是直徑長達150nm的紊亂的神經氈區(qū)域，在中心具有細胞外淀粉狀蛋白沉積物，通過腦組織切片的顯微鏡分析可以看到所述區(qū)域。腦中淀粉狀蛋白斑的積累也與唐氏綜合征和其他認知病癥有關。所述斑的主要成分是稱作ABeta或P-淀粉狀蛋白肽的肽。ABeta肽是稱作淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)的較大的跨膜糖蛋白的39-43個氨基酸的4-kDa內部片段。作為不同的分泌酶對APP的蛋白酶解加工的結果，ABeta主要以長40個氨基酸的短形式和長42-43個氨基酸的長形式被發(fā)現。APP的疏水跨膜結構域的部分被發(fā)現于ABeta的羧基末端，并且可以是ABeta聚集成斑塊的原因，尤其對于長形式的情況。腦中淀粉狀蛋白斑的積累最終導致神經元細胞死亡。與該類型的神經衰退相關的身體癥狀是阿爾茨海默氏病的特征。APP蛋白內的一些突變與阿爾茨海默氏病的存在相關(見例如，Goate等人，Nature349:704,1991(纈氨酸717突變成異亮氨酸)；ChartierHarlan等人Nature353:844，1991(纈氨酸717突變成甘氨酸)；Murrell等人，Science254:97,1991(纈氨酸717突變成苯丙氨酸)；Mullan等人，NatureGenet.1:345,1992(雙突變，將賴氨酸595-曱硫氨酸596改變成天冬酰胺595-亮氨酸596)，將這些文獻各自完整引入本文作為參考)。認為此類突變通過APP向ABeta的增加或改變的加工，尤其APP向增加量的長形式ABeta(即，ABetal-42和ABeta143)的加工而引起阿爾茨海默氏病。認為其他基因如衰老蛋白基因PS1和PS2中的突變間接影響APP的加工而產生增加量的長形式ABeta(見Hardy,TINS20:154，1997，將其完整引入本文作為參考)。已經成功地用小鼠^t型確定淀粉狀蛋白斑在阿爾茨海默氏病中的重要性(Games等人，同上；Johnson-Wood等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:1550，1997，將其完整引入本文作為參考)。具體地，當用長形式ABeta注射PDAPP轉基因小鼠(其表達突變形式的人APP并且在幼年發(fā)生阿爾茨海默氏病)時，它們顯示出阿爾茨海默氏病進展的減慢和抗ABeta肽的抗體效價的升高(Schenk等人，Nature400,173，1999,將其完整引入本文作為參考)。上面討論的觀察表明ABeta，尤其其長形式是阿爾茨海默氏病的成因。ABeta肽可以存在于溶液中并且可以在CNS(例如，CSF)和血漿中檢測到。在一些條件下，可溶性ABeta被轉化為在AD患者的神經突斑塊和腦血管中發(fā)現的纖絲狀毒性P折疊形式。已經研究了涉及用抗ABeta的單克隆抗體進行免疫的治療。已經在AD的小鼠模型中測試了主動和被動免疫。主動免疫導致腦中斑塊負荷的一定減少，但是僅僅通過經鼻施用進行了主動免疫。也已經研究了PDAPP轉基因小鼠的被動免疫(Bard，等人，Nat.21Mcd.6:916-19，2000，將其完整引入本文作為參考)。發(fā)現識別ABeta的氨基末端和中心結構域的抗體刺激ABeta沉積物的吞噬作用，而抗羧基末端結構域附近結構域的抗體不刺激ABeta沉積物的吞噬作用。被動或主動免疫后ABeta的清除機理正在持續(xù)的研究中。已經為有效清除提出了兩種機理，即中樞降解和外周降解。中樞降解機理依賴于能夠穿過血腦屏障、結合斑塊并誘導現有斑塊清除的抗體。已經表明通過Fc-受體介導的吞噬作用促進清除(Bard，等人，同上)。ABeta清除的外周降解機理依賴于施用抗體時腦、CSF和血漿之間ABeta的動態(tài)平衡的破壞，導致ABeta從一個隔室轉移到另一隔室。中樞來源的ABeta^皮轉運到CSF和血漿，在這里它被降解。最近的研究已經斷定可溶性和未結合的ABeta涉及與AI)相關的記憶缺陷，甚至腦中淀粉狀蛋白沉積沒有減少。需要進一步的研究來確定用于ABeta清除的這些途徑的作用和/或相互影響(Dodel，等人，TheLancetVol.2:215,2003,將其完整引入本文作為參考)?？笰Beta抗體是AD治療的潛在有希望的途徑，因為它們可以結合并清除ABeta或包含淀粉狀蛋白斑的其他組分。根據本公開的教導產生的抗ABeta可以用于更好地治療阿爾茨海默氏病或其他相關疾病，例如，通過更有效地結合并清除淀粉狀蛋白斑的組分，通過以更少或更低的嚴重副作用清除淀粉狀蛋白斑，或者通過防止淀粉狀蛋白斑的形成或積累實現所述治療。在一些實施方案中，根據本教導產生的抗ABeta抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，根據本教導產生的抗ABeta抗體特異結合ABeta的聚集形式而不結合可溶形式。在一些實施方案中，才艮據本教導產生的抗ABeta抗體在它們不結合聚集形式的條件下特異結合抗ABeta的可溶形式。在一些實施方案中，根據本教導產生的抗ABeta抗體結合聚集和可溶形式兩者。在一些實施方案中，根據本教導產生的抗ABeta抗體結合斑塊中的ABeta。在一些實施方案中，根據本教導產生的抗ABeta抗體穿過血腦屏障。在一些實施方案中，根據本教導產生的抗ABeta抗體減輕受試者中的淀粉狀蛋白負擔。在一些實施方案中，根據本教導產生的抗ABeta抗體減輕受試者中的神經突營養(yǎng)不良。在一些實施方案中，抗ABeta抗體可以保持突觸結構體系(例如，突觸泡蛋白)。根據一些實施方案，根據本教導產生的抗ABeta抗體結合ABeta的殘基13-28內的表位(天然ABeta的第一個N-末端殘基標為1)。在一些實施方案中，根據本教導產生的抗ABeta抗體結合ABeta的殘基19-22內的表位。在一些實施方案中，使用對不同的抗ABeta表位具有結合特異性的多種單克隆抗體。例如，在一些實施方案中，對ABeta的殘基19-22內的表位特異的抗體與對ABeta的殘基19-22外的表位特異的抗體共同施用。此類抗體可以順序或同時施用。也可以施用抗除了ABeta之外的淀粉狀蛋白組分的抗體(例如，施用或共同施用)。在一些實施方案中，根據本教導產生的抗ABeta抗體比其他方式產生的抗ABeta抗體更強烈或者以更高特異性結合到ABeta表位。通過已知的技術，例如，通過形成噬菌體展示文庫可以確定抗體的表位特異性，在噬菌體展示文庫中，不同的成員展示ABeta的不同的子序列。然后選擇噬菌體展示文庫中特異結合所測試抗體的成員。分離序列家族。典型地，此類家族含有共同的核心序列，和不同成員中不同長度的側翼序列。顯示出對抗體特異結合的最短的核心序列通常確定了抗體結合的表位。備選或額外地，可以在竟爭性測定法中用已經確定了表位特異性的抗體測試抗體的表位特異性。例如，認為與15C11抗體竟爭結合ABeta的抗體與15C11結合相同或相似的表位，即在殘基ABeta19-22內。在一些實施方案中，篩選抗體的表位特異性是治療功效的有用的預測子。例如，根據本發(fā)明的方法學，被確定結合ABeta的殘基13-28內的表位(例如，結合到A卩19-22)的抗體可能在預防和治療阿爾茨海默氏病中是有效的。特異結合ABeta的優(yōu)選區(qū)段而不結合ABeta的其他區(qū)域的抗體相對于結合其他區(qū)域的單克隆抗體或相對于結合完整ABeta的多克隆血清有許多優(yōu)點。其中，對于相等的質量劑量，特異結合優(yōu)選區(qū)段的抗體的劑量含有更高摩爾劑量的有效清除淀粉狀蛋白斑的抗體。而且，特異結合優(yōu)選區(qū)段的抗體可以誘導針對淀粉狀蛋白沉積物的清除應答而不誘導針對完整APP多肽的清除應答，從而降低潛在的副作用。在一些實施方案中，上述單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或人源化基。此類外源殘基可以用于例如賦予單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或人源化抗體新的或改良的特異性、親和力或效應子功能。酶已經表明有效作為藥學和/或商業(yè)活性劑的另一類糖蛋白包括酶。酶可以是糖蛋白，其糖基化模式影響酶活性。從而，根據本發(fā)明產生具有希望的糖基化模式的酶也是尤其重要的。僅僅作為非限制性實例，葡糖腦苷脂酶(GCR)的缺乏導致稱作戈謝病的狀況，其由某些細胞的溶酶體中葡糖腦苷脂酶的積累引起?；加懈曛x病的受試者顯示出一系列癥狀，包括脾腫大、肝腫大、骨骼病癥、血小板減少癥和貧血。Friedman和Hayes表明在一級氨基酸序列中含有單個替代的重組CR(rGCR)與天然存在的GCR相比顯示出改變的糖基化模式，特別是巖藻糖和N-乙酰葡糖胺殘基的增加(見美國專利號5，549，892)。Friedman和Hayes還表明該rGCR與天然存在的rGCR相比顯示出改善的藥物代謝動力學性質。例如，比天然存在的GCR高約兩倍的rGCR耙向肝臟肝巨噬細胞。盡管這兩種蛋白質的一級氨基酸序列僅在一個殘基處不同，但是Friedman和Hayes假定rGCR的改變的糖基化模式也影響向肝巨噬細胞的革巴向。本領域技術人員將知道由于糖基化模式的改變而顯示出改變的酶學、藥物代謝動力學和/或藥物動力學性質的酶的其他已知的實例。生長因子和其他信號分子已經表明有效作為藥學和/或商業(yè)活性劑的另一類糖蛋白包括生長因子和其他信號分子。從而，根據本發(fā)明產生具有希望的糖基化模式的受體也是尤其重要的。生長因子通常是糖蛋白，其被細胞分泌并結合和活化其他細胞上的受體，啟動受體細胞中的代謝或發(fā)育改變。哺乳動物生長因子和其他信號分子的非限制性實例包括細胞因子；表皮生長因子(EGF);血小板衍生生長因子(PDGF);成纖維細胞生長因子(FGFs)如FGF-5;胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II);des(l畫3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白，如CD-3，CD-4，CI)-8，和CD-19;紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs);干擾素，如oc、0和Y干擾素；集落刺激因子(CSFs)，例如，M-CSF，GM-CSF和G-CSF;多數白介素；胂瘤壞死因子(TNF)P;促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；抗凝血因子，如蛋白C;心房鈉尿肽；肺表面活性物質；纖溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA);造血生長因子；和腦啡肽酶。本領域技術人員將知道可以根據本發(fā)明表達的其他生長因子或信號分子。生長因子或其他信號分子的糖基化模式的特定改變已經表明對它們的治療性質具有顯著影響。僅作為非限制性實例，治療患有慢性貧血的患者的一種常見方法是為他們提供經常注射重組人紅細胞生成素(rHuEPO)以便加強他們的紅細胞產生。已經開發(fā)了rHuEPO的類似物促紅血球生成素(darbepoetin)a(Aranesp)，其在身體中比正常rHuEPO有更長的持續(xù)時間。促紅血球生成素oc和rHuEPO之間的主要差別是存在兩個額外的含有唾液酸的N-連接的寡糖鏈。使用體外糖工程已經完成了促紅血球生成素a的產生(見Elliott等人，NatureBiotechnology21(4):414國21，2003)。Elliott等人使用體外誘變向rHuEPO多肽主鏈中導入額外的糖基化位點，導致促紅血球生成素a類似物的表達。該額外的寡糖鏈位于EPO受體結合位點遠端并且表面上不干擾受體結合。然而，促紅血球生成素a的半壽期比rHuEPO高達3倍，導致更有效的治療劑。該實例闡明生長因子或其他信號分子的糖基化^^莫式的改變可以對治療性糖蛋白的體內穩(wěn)定性和/或活性具有顯著影響。從而，根據本發(fā)明的目的生長因子或其他信號分子的表達可以導致所表達的生長因子或信號分子具有改進的糖基化^=莫式和改進的治療性質。受體已經表明有效作為藥學和/或商業(yè)活性劑的另一類糖蛋白是受體。從而，根據本發(fā)明產生具有希望的糖基化模式的受體也是尤其重要的。受體通常是跨膜糖蛋白，其通過識別細胞外信號配體而發(fā)揮功能。除了識別配體的結構域之外，受體通常還具有蛋白激酶結構域，其通過結合配體時磷酸化目標細胞內分子而啟動信號途徑，導致細胞內發(fā)育或代謝改變。在一些實施方案中，將根據本發(fā)明產生的糖蛋白受體是受體酪氨酸激酶(RTK)。RTK家族包括對于多種細胞類型的多種功能關鍵的受體(見例如，Yarden和Ullrich,Ann.Rev.Biochem.57:433-478，1988;Ullrich和Schlessinger，Cell61:243-254，1990，引入本文作為參考)。RTK的非限制性實例包括成纖維細胞生長因子(FGF)受體家族成員、表皮生長因子(EGF)受體家族成員、血小板衍生生長因子(PDGF)受體、具有免疫球蛋白和EGF同源性結構域-1的酪氨酸激酶(TIE-1)和TIE-2受體(Sato等人，Nature376(6535):70-74，1995)和c-Met受體，其一些已經被提出直接或間接促進血管發(fā)生(Mustonen和Alitalo，J.CellBiol.129:895-898，1995)。RTK的其他非限制性實例包括胎兒肝臟激酶l(FLK-l)(有時稱作含有激酶插入結構域的受體(KI)R)(Terman等人，Oncogene6:1677-83，1991)或血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR-2))、fms樣酪氨酸激酶-l(Flt-l)(DeVries等人Science255;989-991，1992;Shibuya等人，Oncogene5:519-524，19卯)，有時被稱作血管內皮細胞生長因子受體1(VEGFR-1)、神經氈蛋白-1、內皮糖蛋白、內皮唾液酸蛋白和Axl。在一些實施方案中，根據本發(fā)明表達腫瘤壞死因子oc和P受體(TNFR-l;1991年3月20日公布的EP417,563;和TNFR-2，1991年3月20日公布的EP417,014)(回顧見Naismith和Sprang,,JInflamm.47(l-2):l-7，1995-96,引入本文作為參考)。在一些實施方案中，待根據本發(fā)明產生的糖蛋白受體是G-蛋白偶聯受體(GPCR)。GPCR是具有7跨膜結構域的糖蛋白。當配體結合到GPCR時，在細胞內轉導信號，其導致細胞的生物學或生理學性質改變。GPCR是藥物作用和開發(fā)的主要靶標。實際上，受體已經導致半數以上的當前已26知的藥物(Drews，NatureBiotechnology,14:1516，1996)并且GPCR代表治療千預的最重要的靶標，30%的臨床處方藥拮抗或者激動GPCR(Milligan，G.和Rees，S.,TIPS,20:118-124，1999)。因為此類受體具有作為治療靶標的確立的被證明的歷史，所以根據本發(fā)明產生具有希望的糖基化模式的GPCR也是尤其重要的。例如，根據本發(fā)明表達的具有希望的糖基化模式的GPCR的細胞外結構域可以通過滴定或者螯合配體而作為重要的治療劑，其中所述配體對內源GPCR的結合是有害的。GPCR，以及G蛋白和效應子(受G蛋白調節(jié)的細胞內酶和通道)是調節(jié)信號系統的組分，所述系統連接細胞內第二信使的狀態(tài)與細胞外輸入。此類基因和基因產物是疾病的潛在病因。GPCR蛋白質超家族現在含有250種以上類型的種內同源物，其代表基因復制(或其他加工)產生的變體，與直向同源物相反，其中直向同源物是來自不同物種的相同受體。該超家族可以分成5個家族家族I:以視紫紅質和e2-腎上腺素能受體為代表的受體并且當前通過200種以上的獨特成員代表；家族n:最近表征的曱狀旁腺激素/降鈣素/分泌素受體家族；家族Ill:哺乳動物中的代謝型谷氨酸受體家族；家族IV:cAMP受體家族，在盤基網柄菌(D.discoideum)的趨化性和發(fā)育中是重要的；和家族V:真菌交配信息素受體如STE2。GPCR包括生物胺類、炎癥的脂類介體、肽激素和感覺信號介體的受體。GPCR當結合到它的細胞外配體時被活化。配體-受體相互作用導致的GPCR的構象改變影響G蛋白與GPCR細胞內結構域的結合親和力。這使得GTP能夠以增強的親和力結合G蛋白。GTP對G蛋白的活化導致G蛋白a亞基與腺苷酸環(huán)化酶或者其他第二信使分子產生者的相互作用。該相互作用調節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性從而調節(jié)第二信使分子cAMP的產生。cAMP調節(jié)其他細胞內蛋白質的磷酸化和活化。備選地，GPCR的活性可以上調或者下調其他第二信使分子如cGMP或eicosinoids的細胞水平。G蛋白ot亞基通過GTP酶對GTP的水解失活，并且(*、.，￡1:(4和"/亞基再結合。異三聚體G蛋白然后與腺苷酸環(huán)化酶或其他第二信使分子產生者解離。GPCR的活性也可以通過細胞內和細胞外結構域或環(huán)的磷酸化調節(jié)。谷氨酸受體形成在神經傳遞中重要的一組GPCR。谷氨酸是CNS中的主要神經遞質并且被認為在神經元可塑性、認知、記憶、學習和一些神經性障礙如癲癇、中風和神經變性中起重要作用(Watson，S.和S.Arkinstall,1994)TheG-ProteinLinkedReceptorFactsBook,AcademicPress,SanDiegoCA，pp.130-132)。谷氨酸的這些效應通過稱作離子型和代謝型受體的兩個不同類別的受體介導。離子型受體含有內在的陽離子通道并且介導谷氨酸的快速興奮作用。代謝型受體是調節(jié)性的，通過抑制依賴鈣的鉀電導和抑制和加強離子型受體的興奮傳導而增加神經元的膜興奮性。代謝型受體基于激動劑藥理學和信號轉導途徑被分成5個亞類并且在腦組織中廣泛分布。已經表明N-連接的糖基化在人1型cc代謝型谷氨酸(mGlulot)受體的功能中是重要的(Mody等人，Neuropharmacology38(10):1485-92,1999)。mGlulcc通常至少部分作為由約145和160KDa的單體組成的二聚體表達。通過用N-連接的糖基化的有效抑制劑衣霉素處理mGlulcc，Mody等人闡明盡管細胞表面表達不受影響，但是僅僅表達一種肽，其通過其一級氨基酸序列預測具有約130kDa的質量。在功能上，用衣霉素處理與未處理的細胞群體相比，激動劑刺激的磷酸次黃苷酸水解降低了約50%。從而，根據本發(fā)明調節(jié)所表達的GPCR的糖基化模式可用于調節(jié)所表達的GPCR的信號功能并且潛在控制或影響所表達的GPCR的藥學或其他性質。血管活性腸肽(VIP)家族是一組相關的多肽，其作用也通過GPCR介導。該家族的關鍵成員是VIP自身、促胰液素和生長激素釋放因子(GRF)。VIP具有寬的生理作用譜，包括平滑肌的松弛、多種組織中分泌的刺激或抑制、多種免疫細胞活性的調節(jié)，和CNS中多種興奮性和抑制性活性。促胰液素刺激胰腺和腸中酶和離子的分泌并且也以少量存在于腦中。已經表明VIP受體的糖基化對其同族VIP的結合具有重要影響(Chochola等人，丄Biol.Chem.268:2312-2318,1993)。通過用麥胚凝集素處理VIP受體立體地阻斷寡糖鏈以依賴劑量的方式顯著抑制VIP結合并且減小了VIP刺激的cAMP應答。此外，VIP受體中特定N-連接的糖基化位點的突變導致內質網中受體的滯留，表明正確的糖基化對于向細胞表面的遞送是關鍵的(Couvineau等人，Biochemistry35(6):1745-52，1996)。從而，調節(jié)根據本發(fā)明表達的GPCR的糖基化模式可以用于調節(jié)(例如，增加或減少)所表達的GPCR與其同族配體的結合和潛在控制或影響所表達的GPCR的藥學性質或其他性質。通常，本發(fā)明的實踐者將選擇目的糖蛋白，并且將知道它的精確氨基酸序列。本發(fā)明的技術已經成功應用于O-連接的(實施例1和2)和N-連接的(實施例3和4)糖蛋白，表明本發(fā)明將可應用于一般的糖蛋白表達。將根據本發(fā)明表達的任何給定的糖蛋白可以具有其自身的具體特征并且可以影響所培養(yǎng)細胞的細胞密度和生存力，可以比在相同培養(yǎng)條件下生長的另一糖蛋白以更低水平表達，并且可以取決于確切的培養(yǎng)條件和進行的步驟在一個或多個位點被不同地糖基化。本領域技術人員將能夠適當修飾用于根據本發(fā)明教導產生具體糖蛋白的步驟和組合物以便優(yōu)化細胞生長和任何給定表達的糖蛋白產生和/或糖基化模式。在一些實施方案中，根據本發(fā)明的系統和方法表達腫瘤壞死因子ot和P受體形式的腫瘤壞死因子抑制劑(TNFR-1;1991年3月20日公布的EP417,563;和TNFR-2，1991年3月20日公布的EP417,014，各自完整引入本文作為參考)(回顧見Naismith和Sprang,JInflamm.47(1-2):1-7，1995-96.完整引入本文作為參考)。根據一些實施方案，腫瘤壞死因子抑制劑包含可溶性TNF受體。在一些實施方案中，腫瘤壞死因子抑制劑包含可溶性TNFR-Ig。在一些實施方案中，本發(fā)明的TNF抑制劑是可溶形式的TNFRI和TNFRII。在一些實施方案中，本發(fā)明的TNF抑制劑是可溶性TNF結合蛋白。在一些實施方案中，本發(fā)明的TNF抑制劑是TNFR-Ig融合蛋白，例如，TNFR-Fc或etanerc印t。如本文所用，"etanercept"指TNFR-Fc，其是p75TNF-a受體的細胞外部分的兩個分子的二聚體，每個分子由人1gGl的235個氨基酸的Fc部分組成。29向宿主細胞中導入用于表達糖蛋白的基因通常，導入細胞中的核酸分子編碼希望根據本發(fā)明表達的糖蛋白。備選地，核酸分子可以編碼基因產物，其誘導細胞表達希望的糖蛋白。例如，導入的遺傳物質可以編碼活化內源或異源糖蛋白轉錄的轉錄因子。備選或額外地，導入的核酸分子可以增加細胞表達的糖蛋白的翻譯或穩(wěn)定性。適于向哺乳動物細胞中導入足夠實現目的糖蛋白表達的核酸的方法是本領域已知的。見例如，Gething等人，Nature,293:620-625，1981;Mantei等人，Nature,281:40-46，1979;Levinson等人EP117,060;和EP117,058，將它們各自引入本文作為參考。對于哺乳動物細胞，將遺傳物質導入哺乳動物細胞的常規(guī)方法包括Graham和vanderErb(Virology,52:456-457，1978)的石岸酸釣沉淀方法或lipofectamineTM(GibcoBRL)MethodofHawley-Ndson(Focus15:73，1993)。哺乳動物宿主系統轉化的一般方面已經由Axel在1983年8月16日公布的美國專利號4,399,216描述。對于向哺乳動物細胞導入遺傳物質的多種技術，見Keown等人，MethodsinEnzymology,1989,Keown等人,MethodsinEnzymology,185:527-537,簡),和Mansour等人，Nature,336:348-352,1988。在一些實施方案中，待導入的核酸是棵核酸分子的形式。例如，待導入細胞的核酸分子可以僅由編碼糖蛋白的核酸和必要的遺傳控制元件組成。備選地，編碼糖蛋白的核酸(包括必要的調節(jié)元件)可以包含在質粒載體中。用于在哺乳動物細胞中表i^JI蛋白的合適載體的非限制性代表性實例包括pCDNAl;pCD，見Okayama，等人Mol.CellBiol.5:1136-1142,1985;pMClneoPoly-A，見Thomas，等人Cell51:503-512，1987;桿狀病毒載體，如pAC373或pAC610;CDM8，見Seed,B.Nature329:840，1987;和pMT2PC，見Kaufman，等人EMBOJ.6:187-195,1987,將它們各自完整引入本文作為參考。在一些實施方案中，待導入細胞的核酸分子包含在病毒載體中。例如，可以將編碼糖蛋白的核酸插入病毒基因組(或者部分病毒基因組)。指導糖蛋白表達的調節(jié)元件可以與插入病毒基因組的核酸一起被包括(即，連接到待插入病毒基因組的基因)或者可以由病毒基因組自身提供。提供形成舍有DNA和磷酸鉤的沉淀可以將棵DNA導入細胞中。備選地，也可以通過形成DNA與DEAE-葡聚糖的混合物并將該混合物與細胞溫育或者通過將細胞與DNA—起在合適的緩沖液中溫育并將細胞進行高電壓電脈沖(例如，通過電穿孔)將棵DNA導入細胞中。向細胞導入棵DNA的另一方法是通過將DNA與含有陽離子脂類的脂質體懸浮液混合。然后將DNA/脂質體復合物與細胞溫育。也可以通過例如顯微注射將棵DNA直接注射到細胞中。備選地，通過將棵DNA與偶聯到細胞表面受體配體的陽離子如聚賴氨酸絡合將棵DNA導入細胞(見例如，Wu，G.和Wu，C.H.J.Biol.Chem,263:14621，1988;Wilson等人J.Biol.Chem.267:963-967，1992;和美國專利號5,166,320，各自完整引入本文作為參考)。DNA-配體復合體與受體的結合通過受體介導的內吞作用促進了對DNA的攝入。使用含有具體核酸序列，如編碼糖蛋白的cDNA的病毒載體是將核酸序列導入細胞的常用方法。用病毒載體感染細胞具有大比例的細胞接受該核酸的優(yōu)點，其可以避免對已經接受該核酸的細胞進行選擇的需要。此外，病毒載體內編碼的分子(如通過病毒載體所含的cDNA編碼的分子)通常在已經攝入病毒載體核酸的細胞中有效表達。缺陷逆轉錄病毒已經被良好表征用于基因治療目的的基因轉移(回顧見Miller,A.I).Blood76:271，1990)?？梢詷嫿ㄖ亟M逆轉錄病毒，其具有插入到逆轉錄病毒基因組中的編碼目的糖蛋白的核酸。此外，可以除去逆轉錄病毒基因組的部分以使得逆轉錄病毒復制缺陷。這種復制缺陷逆轉錄病毒然后包裝成病毒體，其可以通過標準技術通過輔助病毒用于感染靶細胞?？梢圆僮飨俨《镜幕蚪M使得它編碼并表達目的糖蛋白但是在正常的裂解病毒生命周期中復制的能力被失活。見例如，Berkner等人BioTechniques6:616，1988;Rosenfeld等人Science252:431-434,1991;和Rosenfeld等人Cell68:143-155,1992。衍生自腺病毒毒抹Ad型5d1324或腺病毒的其他毒株(例如，Ad2，Ad3，Ad7等等)的合適的腺病毒載體是本領域技術人員已知的。重組腺病毒是有利的，因為它們不需要分裂細胞為有效的基因遞送載體并且可以用于感染多種細胞類型，包括呼吸道上皮(Rosenfeld等人，1992，如上引用)，內皮細胞(Lemarchand等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6482-6486，1992)，肝細胞(Herz和Gerard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA卯:2812-2816，1993)和肌細胞(Quantin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2581-2584,1992)。此外，所導入的腺病毒DNA(和其中含有的外源DNA)不整合到宿主細胞的基因組中而是保持附加型，從而避免了由于導入的DNA變得整合到宿主基因組中(例如，逆轉錄病毒DNA)的情況下發(fā)生插入誘變而引起的潛在問題。此外，腺病毒基因組對于外源DNA的攜帶能力相對于其他基因遞送載體是強的(高達8千堿基)(Berkner等人，上文引用；Haj-Ahmand和Graham,J.Virol.57:267，1986)。當前使用的多數復制缺陷腺病毒載體對于病毒El和E3基因的所有或者部分是缺失的但是保留高達80%的腺病毒遺傳物質。腺伴隨病毒(AAV)是天然存在的缺陷病毒，其需要另一病毒，如腺病毒或皰滲病毒，作為有效復制和生產性生命周期的輔助病毒(回顧見Muzyczka等人Curr.TopicsinMicro,andImmunol"158:97-129,1992)。它也是可以將其DNA整合到非分裂的細胞并顯示出高頻率的穩(wěn)定整合的少數幾種病毒之一(見例如，Flotte等人，Am.丄Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356,1992;Samulski等人，丄Virol.63:3822-3828，1989;和McLaughlin等人，,J.Virol.62:1963-1973，1989)。含有AAV的少至300堿基對的載體可以包裝并整合。外源DNA的空間局限于約4.5kb。諸如Tratschin等人(Mol.Cell.Biol.5:3251-3260，1985)中描述的AAV載體可以用于向細胞導入DNA。使用AAV載體已經向不同的細胞類型中導入了多種核酸(見例如，Hermonat等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6466-64701984;Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.4:2072-2081,1985;Wondis化rd等人，Mol.Endocrinol.2:32-39，1988;Tratschin等人，J.Virol.51:611-619,1984;和Flotte等人，丄Biol.Chem.268:3781-3790，1993)。有效表達糖蛋白時，可以使用修飾的細胞群體而不用進一步分離或亞克隆該群體內的個體細胞。即，通過細胞群體可以產生足夠的糖蛋白使得不需要進一步分離細胞并且該群體可以立即用于接種細胞培養(yǎng)物用于產生糖蛋白。備選地，可以希望從有效產生所述糖蛋白的一些細胞或單個細胞分離和擴增同質細胞群體。作為向細胞導入編碼目的糖蛋白的核酸分子的替代，所導入的核酸可以編碼另一多肽或蛋白，其誘導或提高細胞內源產生的糖蛋白的表達水平。例如，細胞可以能夠表達特定糖蛋白但是不進行細胞的額外處理時不能表達該糖蛋白。類似地，為了所希望的目的，細胞可以表達不足量的目的糖蛋白。從而，刺激目的糖蛋白表達的試劑可以用于誘導或增加細胞對該糖蛋白的表達。例如，所導入的核酸分子可以編碼轉錄因子，該轉錄因子活化或上調目的糖蛋白的轉錄。此類轉錄因子的表達又導致目的糖蛋白的表達或者更穩(wěn)健的表達。在一些實施方案中，指導糖蛋白表達的核酸穩(wěn)定整合到宿主細胞。在一些實施方案中，指導糖蛋白表達的核酸被暫時導入宿主細胞。本領域技術人員將能夠基于他或她的實驗需要選擇向細胞中穩(wěn)定還是暫時導入核酸。編碼目的糖蛋白的基因可以任選連接到一個或多個調節(jié)性遺傳控制元件。在一些實施方案中，遺傳控制元件指導糖蛋白的組成型表達。在一些實施方案中，可以使用提供編碼目的糖蛋白的基因的誘導型表達的遺傳控制元件。誘導型遺傳控制元件(例如，誘導型啟動子)的使用允許調節(jié)細胞中糖蛋白的產生。用于真核細胞的潛在有用的誘導型遺傳控制元件的非限制性實例包括激素調節(jié)的元件(例如見Mader,S.和White,丄H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5603-5607，1993)，合成的配體調節(jié)的元件(見例如,Spencer,D.M.等人，Science262:1019-1024,1993)和電離輻射調節(jié)的元件(例如見，Manome，Y.等人，Biochemistry32:10607-10613,1993;Datta，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10149-10153，1992)。根據本發(fā)明可以使用本領域已知的額外的細胞特異性或其他調節(jié)系統。本領域技術人員根據本發(fā)明的教導將能夠選擇和任選地，合適地修飾導入基因的方法，所述基因引起細胞表達目的糖蛋白。細胞根據本發(fā)明可以利用易于進行細胞培養(yǎng)和表達糖蛋白的任何宿主細胞。在一些實施方案中，宿主細胞是哺乳動物?？梢愿鶕景l(fā)明使用的哺乳動物細胞的非限制性實例包括BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/1，ECACCNo:85n0503);人成視網膜細胞(PER,C6(CruCell，Leiden，荷蘭))；用SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚腎系(經亞克隆用于懸浮培養(yǎng)生長的293或293細胞，Graham等人，J.GenVirol.，36:59,1977);倉鼠嬰腎細胞(BHK，ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細胞+/-DHFR(CH()，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:4216，1980);小鼠支持細胞(TM4，Mather,Biol.R印rod.，23:243-251,1980);猴腎細胞(CV1ATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HeLa，ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCK，ATCCCCL34);水牛鼠肝細胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺細胞(W138,ATCCCCL75);人肝細胞(HepG2，HB8065);小鼠乳腺腫瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI細胞(Mather等人，A扁lsN.Y.Acad.Sci"383:44-68，1982);MRC5細胞；FS4細胞；和人肝癌系(HepG2)。此外，根據本發(fā)明可以利用表達糖蛋白的任何數目的商業(yè)和非商業(yè)途徑可得到的雜交瘤細胞系。本領域技術人員將理解雜交瘤細胞系可以具有不同的營養(yǎng)需求和/或可能需要不同的培養(yǎng)條件以優(yōu)化生長和糖蛋白表達，并且如需要將能夠修改條件。如上指出，在許多情況下，將選擇或改造細胞以產生高水平糖蛋白。通常，通過人手操作細胞以產生高水平的糖蛋白，例如，通過導入編碼目的糖蛋白的基因和/或通過導入調節(jié)該基因表達的遺傳控制元件(無論內源的或導入的)。本領域技術人員將理解在不同細胞類型中產生的糖蛋白可以含有不同的所得的糖基化模式。例如，Przybylo等人闡明鈣黏著蛋白當在非惡性上皮輸尿管細胞、v-raf轉染的HCV29細胞和膀胱的移行細胞癌中表達時具有不同的糖基化模式(見Przybylo等人，CancerCellInternational,2(1):6,2002)。Lifely等人闡明人源化的IgG抗體當在CHO、Y0骨髓瘤和NS0骨髓瘤細胞系中表達時的糖基化模式和生物活性不同(見Lifely等人，Glycobiology.5(8):813-22，1995)。本領域普通技術人員將不用過度實驗就能夠選擇合適的細胞系用于產生具體的糖蛋白。不管最終選擇的細胞系如何，都可以根據本發(fā)明表達糖蛋白，得到更廣泛的糖基化模式。某些糖蛋白對細胞生長、細胞生存力或細胞的一些其他特征具有有害影響，其最終以某種方式限制了目的糖蛋白的產量。甚至在被改造為表達特定糖蛋白的一種具體類型的細胞群體中，在該細胞群體中也存在差異4吏得某些個體細胞將生長的更好，產生更多目的糖蛋白，產生具有更廣泛的糖基化模式的糖蛋白，或者產生這樣的糖蛋白，其糖基化模式更準確地反映了天然存在的糖蛋白的糖基化模式。在一些實施方案中，為培養(yǎng)細胞所選的具體條件下，由實踐者根據經驗選擇細胞系的穩(wěn)健生長。在一些實施方案中，基于細胞生長、最終細胞密度、細胞存活百分比、所表達的糖蛋白的效價、寡糖側鏈的程度和組成或者實踐者認為重要的這些或任何其他條件的任一組合選擇經改造以表達具體糖蛋白的個體細胞用于大規(guī)模生產。培養(yǎng)細胞本發(fā)明可以使用適于表達糖蛋白的任何細胞培養(yǎng)方法。例如，細胞可以分批或補料分批培養(yǎng)生長，其中在糖蛋白的足夠表達后終止培養(yǎng)，之后收獲所表達的糖蛋白。備選地，細胞可以灌注培養(yǎng)生長，其中培養(yǎng)不終止并且將新的營養(yǎng)物和其他組分周期性或連續(xù)加入培養(yǎng)物中，在此期間周期性或連續(xù)地收獲表達的糖蛋白。細胞可以以實踐者所選的任何方便的體積生長。例如，細胞可以在體35積為幾毫升到幾升的小規(guī)模反應容器中生長。備選地，細胞可以在約至少1升到10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或以上，或者之間的任何體積的大規(guī)模商業(yè)生物反應器中生長。將主要基于細胞培養(yǎng)物保持存活的溫度范圍、產生高水平糖蛋白的范圍和/或所表達的糖蛋白含有希望的糖基化模式的范圍選擇細胞培養(yǎng)的溫度。例如，在約37。C下，CHO細胞生長良好并且可以以商業(yè)上足夠的水平產生具有希望的糖基化模式的糖蛋白。通常，多數哺乳動物細胞在約25。C到42。C的范圍內生長良好并且可以以商業(yè)上足夠的水平產生具有希望的糖基化模式的糖蛋白，然而，本公開教導的方法不限于這些溫度。某些哺乳動物細胞在約35。C到40。C的范圍內生長良好并且可以以商業(yè)上足夠的水平產生具有希望的糖基化模式的糖蛋白。在一些實施方案中，在細胞培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)物在20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、450C的溫度下生長一次或多次。本領域技術人員將能夠選擇生長細胞的合適溫度，這取決于細胞的具體需要和實踐者的具體生產要求。此外，培養(yǎng)物可以在培養(yǎng)過程中進行一次或多次溫度轉變。當轉變培養(yǎng)溫度時，溫度轉變可以是相對逐漸的。例如，可以需要幾小時或幾天來完成溫度改變。備選地，溫度轉變可以是相對突然的。溫度可以在培養(yǎng)過程中穩(wěn)定升高或降低。備選地，溫度可以在培養(yǎng)過程中以離散量多次升高或降低。隨后的溫度或溫度范圍可以低于或高于最初或以前的溫度或溫度范圍。本領域技術人員將理解在該實施方案中包括多個離散的溫度轉變。例如，溫度可以轉變一次(到較高或較低溫度或溫度范圍)，細胞在該溫度或溫度范圍保持一段時間，之后溫度可以再次轉變到新的溫度或溫度范圍，其可以高于或低于以前的溫度或溫度范圍。每次離散轉變后培養(yǎng)的溫度可以是恒定的或者可以保持在一定的溫度范圍內。關于最初的溫度或溫度范圍，溫度轉變后細胞培養(yǎng)的溫度或溫度范圍通常主要基于細胞培養(yǎng)物保持存活的溫度、產生高水平糖蛋白的范圍和/或所表達的糖蛋白含有所希望的糖基化模式的范圍選擇。通常，多數哺乳動物細胞在約25。C到42。C的范圍內保持存活并且以商業(yè)上足夠的水平表達具有希望的糖基化模式的糖蛋白，盡管本公開教導的方法不限于這些溫度。在一些實施方案中，哺乳動物細胞在約25。C到35。C的范圍內保持存活并且以商業(yè)上足夠的水平表達具有希望的糖基化模式的糖蛋白。本領域技術人員將能夠選擇生長細胞的合適的溫度或溫度范圍，這取決于細胞的具體需要和實踐者的具體生產要求。取決于實踐者的需要和細胞自身的需要，細胞可以生長任一時間量。在一些實施方案中，一旦所表達的糖蛋白達到足夠高的效價和/或一旦所表達的糖蛋白顯示出希望的糖基化模式，就終止分批或補料分批反應，如通過實踐者的需要確定。額外或備選地，一旦細胞達到足夠高的密度就終止分批或補料分批反應，如通過實踐者的需要確定。例如，一旦細胞達到最大存活細胞密度的百分之l、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99就終止培養(yǎng)。額外或備選地，可以在代謝廢產物如乳酸或者銨過量積累之前終止分批和補料分批反應。在一些情況中，有益的是在隨后的生產期向細胞培養(yǎng)物補充被細胞耗盡或者代謝的營養(yǎng)物或者其他培養(yǎng)基組分。作為非限制性實例，有益的是為細胞培養(yǎng)物補充激素和/或其他生長因子、無機離子(如鈉、氯化物、4丐、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低終濃度存在的無機化合物)、氨基酸、脂類或者葡萄糖或其他能源。此類補充組分可以一次都加入細胞培養(yǎng)物中，或者它們可以在一系列的添加中提供給細胞培養(yǎng)物。在一些實施方案中，才艮據美國臨時專利申請序號60/605，097(引入本文作為參考)描述的任一種細胞培養(yǎng)方法生長細胞。在一些實施方案中，在美國臨時專利申請序號11/213，308(引入本文作為參考)中所述的一種或多種條件下生長細胞。本領域技術人員將能夠定制具體細胞生長條件以便優(yōu)化細胞培養(yǎng)的一些特征，包括但不限于生長速率、細胞活力、細胞培養(yǎng)物的最終細胞密度、有害的代謝副產物如乳酸和銨的終濃度、所表達的糖蛋白的最終效價、寡糖側鏈的程度和組成或者實踐者認為重要的這些條件或其他條件的任一組合。所表達糖蛋白的分離通常，典型的是希望分離和/或純化根據本發(fā)明表達的糖蛋白。在一些實施方案中，表達的糖蛋白分泌到培養(yǎng)基中從而可以如通過離心或過濾除去細胞和其他固體，作為純化方法中的第一步。備選地，所表達的糖蛋白可以結合到宿主細胞的表面。例如，可以除去培養(yǎng)基并裂解表達糖蛋白的宿主細胞作為純化過程中的第一步。可以通過本領域技術人員公知的任一種方法實現哺乳動物宿主細胞的裂解，所述方法包括通過玻璃珠物理破碎和暴露于高pH條件?？梢酝ㄟ^標準方法分離和純化表達的糖蛋白，所述方法包括但不限于，層析(例如，離子交換、親和、大小排阻和羥基磷灰石層析)、凝膠過濾、離心、或差別溶解度、乙醇沉淀和/或通過用于純化蛋白質的任何其他可用的4支術(見例i口，Scopes,ProteinPurificationPrinciplesandPractice2ndEdition,Springer-Verlag，NewYork,1987;Higgins，S.J.和Hames,B.D.(eds.)，ProteinExpression:APracticalApproach,OxfordUnivPress,1999;andI)eutscher，M.P.,Simon,M.I.,Abelson，，J.N.(eds.)，GuidetoProteinPurification:MethodsinEnzymology(MethodsinEnzymologySeries,Vol.182)，AcademicPress,1997，各自引入本文作為參考)。尤其對于免疫親和層析，可以分離糖蛋白將它結合到親和柱，該親和柱包含針對該糖蛋白產生并固定到固定支持體的抗體。備選地，可以通過標準重組技術將親和標記如流感外殼序列、聚組氨酸或者谷胱甘肽S-轉移酶連接到糖蛋白以允許通過穿過合適的親和柱容易地純化。蛋白質抑制劑，如苯曱基磺酰氟(PMSF)、抑酶醛肽、胃蛋白酶抑制劑或抑酶肽可以在任一或所有階段加入以便減小或者消除純化過程中糖蛋白的降解。當細胞必須被裂解以便分離和純化表達的糖蛋白時，蛋白酶抑制劑是尤其有利的。額外或備選地，糖苷酶抑制劑可以在任一或所有階段加入以便減小或者消除共價連接的寡糖鏈的酶促修整。根據本發(fā)明表達的糖蛋白可以比在常規(guī)細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)產生的糖蛋白具有更廣泛的或者改變的糖基化模式。從而，可以在純化步驟利用的本發(fā)明的一個實際益處是根據本發(fā)明的一些方法培養(yǎng)的糖蛋白上額外的和/或改變的糖殘基可以賦予其不同的生物化學性質，其與根據更常規(guī)的方法生長的糖蛋白相比可以被實踐者用于更容易地純化糖蛋白，或純化至更高的程度。本領域技術人員將理解確切的純化技術將取決于待純化的糖蛋白的特征、用于表達糖蛋白的細胞的特征，和/或用于生長細胞的培養(yǎng)基的組成而變。免疫原性組合物根據本公開的教導產生的糖蛋白也可以用于免疫原性組合物如疫苗中。在一些實施方案中，通過根據本發(fā)明的某些方法產生糖蛋白實現的改善的糖基化模式可以導致更有效的免疫原性組合物。例如，含有所產生的糖蛋白的免疫原性組合物可以引發(fā)更有效的免疫應答，其中受試者的免疫系統產生更多數目的抗該糖蛋白的抗體和/或產生顯示出對免疫原性糖蛋白的更高特異性的抗體。額外或備選地，此類糖蛋白可以引發(fā)具有更少和/或更小嚴重副作用的免疫應答。在一些實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含一種或多種糖蛋白。額外或備選地，發(fā)明性免疫原性組合物包括一種或多種生理學上可接受的載體。通常，發(fā)明性免疫原性組合物的組分的合適的"有效量"或劑量的選擇基于多種因素，包括但不限于，使用的免疫原性組合物中所選糖蛋白的身份、糖蛋白的糖基化模式，和受試者的身體狀況，最特別包括所免疫的受試者的一般健康、年齡和/或體重。如本領域已知的，具體施用方法和途徑和免疫原性組合物中額外組分的存在也可以影響DNA質粒組合物的劑量和量。有效劑量的此類選擇和向上或向下調節(jié)也在本領域技術范圍之內。39誘導免疫應答，包括但不限于保護性應答或者在患者中產生外源效應而無顯著的不利副作用所需的免疫原性組合物的量取決于這些因素而變。本領域技術人員可容易地確定合適劑量。本發(fā)明的某些免疫原性組合物可以含有佐劑。佐劑是當與免疫原或抗原一起施用時增強免疫應答的物質。已經表明許多細胞因子或淋巴因子具有免疫調節(jié)活性，從而可以用作佐劑，包括但不限于，白介素l-(x、l-p、2、4、5、6、7、8、10、12(見例如，美國專利號5,723,127，完整引入本文作為參考)、13、14、15、16、17和18(和其突變形式)，a，p和y干擾素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(見例如，美國專利號5，078，996，完整引入本文作為參考)、巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子、GSF和腫瘤壞死因子a和IJ?？捎糜诒景l(fā)明的其他佐劑包括趨化因子，包括但不限于，MCIM、MIP-la、MIP-ip和RANTES。翻著分子，如選擇蛋白，如L-選擇蛋白、P-選擇蛋白和E-選擇蛋白也可以用作佐劑。其他有用的佐劑包括，但不限于，黏蛋白樣分子，如C1)34、GlyCAM-l和MadCAM-l，整聯蛋白家族成員，如LFA-1、VLA-1、Mac-l和p150.95,免疫球蛋白超家族成員，如PECAM、ICAMs，例如，ICAM-1、ICAM-2和ICAM誦3、CD2和LFA-3，共刺激分子，如CD40和CD40L,生長因子，包括血管生長因子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、B7.2、P1)(;F、BL-1、和血管內皮生長因子、受體分子，包括Fas、TNF受體、Flt、Apo-l、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6。再一種佐劑分子包括胱天蛋白酶(ICE)。也見國際專利7>開號W098/17799和W()99/43839，將其各自完整引入本文作為參考。也可以用作佐劑的是霍亂毒素(CT)和其突變體，包括公開的國際專利申請?zhí)朩O00/18434中描述的那些(其中氨基酸位置29的谷氨酸被另一氨基酸(不同于天冬氨酸)代替，優(yōu)選被組氨酸代替)。類似的CT或突變體描述于公開的國際專利申請?zhí)朩O02/098368中(其中氨基酸位置16的異亮氨酸被另一氨基酸單獨代替或者與氨基酸位置68的絲氨酸被另一氨基酸代替相組合；和/或其中氨基酸位置72位的纈氨酸被另一氨基酸代替)。其他CT毒素描述于公開的國際專利申請?zhí)朩O02/098369(其中氨基酸位置25的精氨酸被另一氨基酸代替；和/或在氨基酸位置49插入氨基酸；和/或兩個氨基酸插入氨基酸位置35和36)。將這些參考文獻各自完整引入本文作為參考。在一些實施方案中，通過多種途徑對人或對非人脊推動物施用本發(fā)明的免疫原性組合物，所述途徑包括，但不限于，鼻內、經口、陰道、直腸、腸胃外、皮內、經皮(見例如，國際專利^^布號WO98/20734，將其完整引入本文作為參考)，肌內、腹膜內、皮下、靜脈內和動脈內途徑。可以根據使用的免疫原性組合物的性質、患者的年齡、體重、性別和一般健康的評估和免疫原性組合物中存在的抗原，和/或本領域技術人員已知的其他因素選擇合適的途徑。在一些實施方案中，多次施用免疫原性組合物。本領域技術人員基于本領域技術人員已知的相關因素選擇免疫原性組合物施用的順序和各施用之間的時間期限，所述因素包括但不限于，宿主的身體特征和對方法應用的準確應答。藥物制劑在一些實施方案中，產生的糖蛋白將具有藥理學活性并且將可用于制備藥物。上述發(fā)明組合物可以施用于受試者或者可以首先通過任何可利用的途徑配制用于遞送，所述途徑包括但不限于腸胃外(例如，靜脈內)、皮內、皮下、經口、經鼻、支氣管、眼、經皮(局部)、經粘膜、直腸和陰道途徑。本發(fā)明的藥物組合物通常包括從哺乳動物細胞系表達的純化的糖蛋白、遞送試劑(例如，如上述的陽離子聚合物、肽分子轉運蛋白、表面活性劑等等)與可藥用載體的組合。如本文所用，術語"可藥用栽體"包括與藥物施用相容的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑，等等。補充性活性化合物也可以摻入組合物中。例如，根據本發(fā)明產生的糖蛋白可以額外綴合到用于全身藥物療法的其他藥物，如毒素、低分子量細胞毒性藥物、生物學應答修飾劑，和放射性核素(見例如，Kunz等人,Calicheamicinderivative-carrierconjugates,US20040082764Al)。備選或額外地，根據本發(fā)明產生的蛋白質或多肽可以與一種或多種額外的藥學活性劑(同時或者順序)組合施用。這些藥學活性劑的示例性列表可以見醫(yī)師案頭參考(Physicians'DeskReference)第55版(MedicalEconomicsCo.,Inc.,Montvale，NJ，2001出版，引入本文作為參考)。對于許多這些列出的活性劑，藥物有效劑量和方案是本領域已知的；許多在醫(yī)師案頭參考中給出?？梢杂欣嘏渲扑幬锝M合物與其預期的施用途徑相容。用于腸胃外、皮內或皮下應用的溶液劑或混懸劑可以包括下面的組分無菌稀釋劑，如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或者其他合成的溶劑；抗細菌劑，如苯曱醇或者對幾基苯曱酸甲酯;抗氧化劑，如抗壞血酸或者亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖劑，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調節(jié)張力的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。可以用酸或堿，如鹽酸或者氫氧化鈉調節(jié)pH。可以將腸胃外制劑封裝在安瓿、一次性注射器或者由玻璃或者塑料制造的多劑量瓶中。適于注射使用的藥物組合物通常包括無菌水溶液(其中水可溶的)或者分散體和用于臨時制備無菌注射液或分散體的無菌粉劑。對于靜脈內施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物將是無菌的并且應該是流動的，達到容易注射的程度。本發(fā)明的某些藥物制劑在生產和保持條件下是穩(wěn)定的并且必須保存以抗微生物如細菌和真菌的污染作用。通常，相關載體可以是溶劑或分散介質，含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)，和其合適的混合物。例如，通過使用包衣如卵磷脂，對于分散體的情況通過保持所需的顆粒大小和通過使用表面活性劑可以保持適當的流動性。通過多種抗細菌和抗真菌劑可以實現防止微生物的作用，所述抗細菌和抗真菌劑為例如對羥基苯曱酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等。在許多情況下，將有利地在組合物中包括等滲劑，如糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇或者氯化鈉。通過在組合物中包括延遲吸收的物質如單硬脂酸鋁和明膠可以延長可注射組合物的吸收。通過在合適的溶劑中以所需量摻入純化的糖蛋白與(如果需要)上面列舉的成分之一或者組合，接著通過過濾除菌，可以制備無菌注射溶液。通常，通過在含有基本分散介質的無菌載體中摻入從哺乳動物細胞系表達的純化的糖蛋白和來自上面列舉的那些的所需的其他成分可以制備分散體。對于用于制備無菌注射溶液的無菌粉劑的情況，制備方法包括，例如，真空干燥和冷凍干燥，其產生活性成分的粉末加上來自其以前無菌過濾溶液的任何額外的所希望成分。經口組合物一般包括惰性稀釋劑或者可食用的載體。對于經口治療施用的目的，所純化的糖蛋白可以摻入賦形劑并以片劑、含片、或膠嚢劑，如明膠膠嚢劑的形式使用。使用液體載體也可以制備用作漱口水的經口組合物。可以包括藥學上相容的勦合劑和/或佐劑物質作為組合物的部分。片劑、丸劑、膠嚢劑、含片等等可以含有任一種下面的成分，或者類似性質的化合物黏合劑，如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；賦形劑，如淀粉或乳糖，崩解劑，如藻酸、Primogd或者玉米淀粉；潤滑劑，如硬脂酸鎂或Stcrotes;助流劑，如二氧化硅膠體；增甜劑，如蔗糖或糖精；或者調味劑，如薄荷油、水楊酸甲酯或者橙子調味劑。用于經口遞送的制劑可以有利地摻入試劑以提高在胃腸道內的穩(wěn)定性和/或增強吸收。對于通過吸入施用，包含從哺乳動物細胞系表達的純化的糖蛋白和遞送劑的本發(fā)明組合物有利地以氣霧劑噴霧的形式從加壓的容器或分配器或噴霧器遞送，所述容器或分配器含有合適的推進劑，例如，氣體，如二氧化碳。本發(fā)明尤其設想使用經鼻噴霧、吸入器遞送組合物或者直接遞送到上和/或下呼吸道。已經表明抗流感病毒的DNA疫苗的鼻內施用誘導CD8T細胞應答，表明當通過該途徑遞送時，呼吸道中的至少一些細胞才聶入DNA,并且本發(fā)明的遞送劑將增強細胞攝入。根據一些實施方案，將包含從哺乳動物細胞系表達的純化的糖蛋白和遞送劑的組合物配制為用于氣霧劑施用的大孔顆粒。也可以通過經粘膜或者經皮方式進行全身施用。對于經粘膜或經皮施用，適于待穿透的屏障的穿透劑可以用于制劑中。此類穿透劑是本領域公知的，并且對于經粘膜施用，包括例如，去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。通過使用經鼻噴霧或者栓劑也可以完成經粘膜施用。對于經皮施用，將純化的糖蛋白和遞送劑配制成如本領域公知的軟膏劑、油膏劑、凝膠劑或者霜劑。組合物也可以以栓劑(例如使用常規(guī)栓劑基質，如可可脂和其他甘油西旨)或者保留灌腸劑的形式制備用于直腸遞送。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物含有任選的賦形劑，如局部麻醉藥、肽、脂類，包括陽離子脂類、脂質體或者脂類顆粒，聚陽離子，如聚賴氨酸、分枝的三維聚陽離子，如樹狀聚體、糖類、陽離子兩親化合物、去污劑、千基銨表面活性劑，或者促進多核苷酸轉移到細胞的另一化合物。此類促進試劑包括局部麻醉藥布比卡因或丁卡因(見例如，美國專利號5,593,972;5,817,637;5,380,876;5,981,505和6,383,512和國際專利公開號W()98/17799，將其各種完整引入本文作為參考)。在一些實施方案中，用保護糖蛋白免于從身體快速清除的載體制備組合物，如控釋制劑，包括植入物和微嚢化的遞送系統?？梢允褂蒙锟山到獾纳锵嗳菪跃酆衔?，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯，和聚乳酸。制備此類制劑的方法將是本領域技術人員顯而易見的。也可以從AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals,Inc.通過商業(yè)途徑得到材料。脂質體懸浮液(包括用抗病毒抗原的單克隆單體耙向受感染細胞的脂質體)也可以用作可藥用載體。可以根據本領域技術人員已知的方法(如美國專利號4，522，811中所述，完整引入本文作為參考)制備此類懸浮液?？梢杂欣匾詥挝粍┬团渲平浛诨蚰c胃外組合物以容易施用和劑型的均一性。如本文所用的單位劑型指適合作為待治療受試者的單一劑量的物理上分散的單位，每一單位含有預定量的活性糖蛋白，所迷量經計算與所需的藥物載體結合產生希望的治療效果。根據本發(fā)明表達的糖蛋白可以以所需的不同間隔和在不同時間期限內施用，如每周一次持續(xù)約1到10周、2到8周、約3到7周、約4、5或6周等等。技術人員將理解某些因素可以影響有效治療受試者所需的劑量和時限，包括^旦不限于受試者的疾病或病癥的嚴重性、以前的治療、一般健康和/或年齡，和存在的其他疾病。通常，用如本文所述的糖蛋白對受試者的治療可以包括單一治療，或者在許多情況下，可以包括一系列治療。將理解合適的劑量可以取決于糖蛋白的效力并且可以任選為具體接受者定制，例如，通過施用增加的劑量直到實現預先選擇的所希望的應答。還將理解任一具體動物受試者的特定劑量水平可以取決于多種因素，包括使用的具體糖蛋白的活性、受試者的年齡、體重、一般健康、性別和飲食、施用時間、施用途徑、排泄速率、任何藥物組合，和/或被調節(jié)的表達或活性的程度。本發(fā)明包括使用本發(fā)明組合物治療非人動物。因此，可以根據獸醫(yī)藥理學和醫(yī)學的已知的原理選擇施用劑量和方法。教導可以見例如Adams,R.(ed.)，VeterinaryPharmacologyandTherapeutics,第八版，IowaStateUniversityPress;ISBN:0813817439;2001。本發(fā)明藥物組合物可以與施用說明書一起包括在容器、包裝或者分配器中。將理解前面的描述僅僅是代表性的并且不意在進行限制。用于實現本發(fā)明和額外的應用的備選方法和材料是本領域技術人員顯而易見的，并且意在包括在所附權利要求中。實施例實施例1:培養(yǎng)基制劑本發(fā)明包括如下發(fā)現通過在含有一種或多種本發(fā)明濃度的錳的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞產生的糖蛋白比所述細胞在常規(guī)培養(yǎng)基中生長產生的糖蛋白具有更廣泛的糖基化模式?？梢詫㈠i加入能夠支持細胞生長的任何培養(yǎng)基中?？梢约尤肴我槐景l(fā)明濃度內的錳的示例性培養(yǎng)基在表1中列出，然而45本發(fā)明不限于利用這些培養(yǎng)基。如本領域技術人員將理解的，其他培養(yǎng)基改變。表l.示例性培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>在一些實施方案中，在最初的培養(yǎng)后為細胞補充一次或多次補料培養(yǎng)基。示例性補料培養(yǎng)基在表2中列出，然而，本發(fā)明不限于利用這些補料培養(yǎng)基。如本領域普通技術人員將理解的，其他補料培養(yǎng)基可以用于生長細胞和/或可以對表2中列出的示例性補料培養(yǎng)基的組成做出一些改變。例如，此類補料培養(yǎng)基的一種或多種組分的濃度可以升高或降低以實現此類組分的希望的濃度。在一些實施方案中，每種補料培養(yǎng)基組分的濃度升高或降低相同的因數。例如，每種補料培養(yǎng)基組分的濃度可以升高或降低lx、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、llx、12x、13x、14x、15x、16x、17x、18x、19x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x或更高。表2.示例性補料培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>實施例2:rFIX肽作圖的小規(guī)模研究引言在重組人凝血因子IX("rFIX")原料藥物("BDS")的生產期間，在肽圖內K4肽的相對峰面積比("RPAR")中觀察到批與批的差異。通過用來自Achromobacterlyticus的賴氨酰內肽酶("AchroK"，Wako目錄號129-()2541)消化制備樣品，并隨后通過反相HPLC進行分辨。在某些批中K4肽的RPAR落入參考物質的對照樣品的820/。的下限以下并且達到對照樣品的78%的最小值。在K4，峰中發(fā)現物質的平衡。兩個峰之間的差異完全是由于Ser-61處糖基化的程度。K4種類具有連接到絲氨酸的Sia-a2，3-Gal-pi，4-GlcNAc-(31，3-Fuc-al-0四糖，而成比例增加的K4，種類僅僅具有巖藻糖。在當發(fā)生肽圖差異的期間內進行完全規(guī)^^莫細胞培養(yǎng)實驗。細胞生長在分別補充FeS()4，CuS04和氯化膽堿至2X，7X和2X的細胞培養(yǎng)基中。實驗批次的小規(guī)模純化產生的BDS表明提高的K4RPAR,但是以相同方式純化的對照物質則否。BDS批通過了肽圖要求(^82%的對照樣品)，盡管它們沒有達到參考物質中看到的水平。這表明在RPAR圖中觀察到的差異是細胞培養(yǎng)過程的結果并且可能與營養(yǎng)缺乏相關。過程中的樣品分析通過微量過濾("MF")和超濾/滲濾("UF/DF")步驟從細胞培養(yǎng)基除去細胞，從各自的生物反應器得到可用于分析的相當純的物質。為了研究K4種類在從細胞分泌后是否被降解回K4，(僅僅巖藻糖)，對來自UF/DF存留物的過程中樣品進行改進的分析。將存留物的大樣品分成三個相等的等分試樣。一個立即在小規(guī)模捕獲柱上純化；這用作陰性對照。另外兩個各自在37。C過夜溫育后以相似的方式純化。向一個過夜等分試樣加入唾液酸酶以從K4種類除去末端唾液酸以防唾液酸阻斷一些其他糖苷酶的活性。小規(guī)模純化后，如上分析所有三個樣品的K4種類。圖l表明除了唾液酸酶催化的降解外任一樣品中沒有降解。這強烈表明肽圖問題是合成代謝的問題，意味著在Ser-61處"丟失，，的糖殘基從來沒有加入新52生鏈。盡管非常不可能，但是仍然保持可能的是，負責除去這些糖殘基的糖苷活性通過MF和UF/DF步驟失活或者被去除。結果也闡明了利用小規(guī)^^莫純化步驟分析來自QSepharose步驟上游的樣品。小規(guī)模建模生長在搖瓶中的小規(guī)模rFIX培養(yǎng)物用作模型來評估多種培養(yǎng)基和添加劑對K4種類的影響。在每種情況下，來自搖瓶的條件培養(yǎng)基在小規(guī)模捕獲柱上直接(無UF/DF)使用基于體積的峰收集進行純化，并測定樣品中的K4分布。使用與完整規(guī)模實驗相同的添加劑闡明d、規(guī)模模型的效用。也分析了錳添加，因為文獻檢索發(fā)現麗11++是果蠅酶的類似的糖基化活性所需的(見Moloney等人，丄Biol.Chem.275(13):9604-9611，2000;Bruckner等人，Nature406:411-415,2000)。該比較在搖瓶中四個世代中進行，并且在圖2中顯示了結果。顯示了每個樣品的一式兩份注射。"PW，指示每個條件的傳代次數。對于Pl-2，Mn的濃度為lnM;對于P3-4，為10nM。對照和補充的培養(yǎng)基K4種類分布之間的差異與在生產生物反應器中看到的差異相當。單次傳代后表明了差異并且多次傳代沒有揭示任何傾向。因為添加劑包括三種組分(FeS04,CuS04和氯化膽堿)，所以接下來的實驗處理這些組分的哪一個負責改進的K4種類分布。向三個rFIX搖瓶培養(yǎng)物中加入三種組分。逐步加入這些組分以揭示任何協同作用。其他培養(yǎng)物包括陽性(所有三種組分)和陰性(無添加劑)對照。圖3表明FeS04是負責幫助改善K4種類分布的添加劑。顯示了每個樣品的一式兩份注射。在每個實驗濃度進行添加。似乎在缺少FeS04時，CuS04和氯化膽堿的添加甚至使得分布更差。注意到由于未知的原因，K4，脫唾液酸形式在試樣和測定參照中以更高的豐度顯現。該趨勢在圖3中是顯而易見的并且在隨后的實驗中持續(xù)存在。培養(yǎng)基粉劑的鐵含量的電感偶合等離子體光鐠("ICP")分析表明在該粉劑中存在合適量的鐵。這導致如下假說來自所加入的FeS04的益處實際上由該原料的微量污染物引起。通過ICP分析分析了最初培養(yǎng)基條件中使用的FeS04批次，并且?guī)追N微量雜質出現的水平高于檢測極限。通過去除已知的抑制劑和rFIX細胞培養(yǎng)基的組分，將列表限制為下面的九種潛在有益的元素Sb、Bi、B、Co、Ge、Mn、Mo、Ni和V。接著，進行小規(guī)模建模實驗來研究可能補充最初的培養(yǎng)基添加劑的一些其他可能的添加劑。測試了額外的CuS04、ZnS04和MnS04(至10nM)。包括了ZnS04,因為鋅可以竟爭性抑制其他二價陽離子的吸收。由于未知的原因，對照和實驗條件給出了非常相似的K4種類分布，其更像以前為對照條件觀察到的(見圖4，顯示了每個樣品的一式兩份注射)。然而，向該實驗條件加入MnS04明顯改善了K4種類分布。似乎所加入的ZnS04惡化了K4種類分布，但是該差異的顯著性不確定。在上面提到在圖3中觀察到脫唾液酸化的K4，峰水平的升高。該現象在所述的小規(guī)沖莫研究過程中持續(xù)并且傾向于增大。該趨勢沒有改變所給出的結果的解釋。結論過程中和小規(guī)模捕獲柱洗脫液的廣泛測試已經提供了強烈證據表明培養(yǎng)基粉劑中的差異引起K4RPAR的偏移，其又導致多種肽圖差異。因為向細胞培養(yǎng)基中加入某些組分部分逆轉了該偏移，所以培養(yǎng)基粉劑中的差異可能是一種或多種組分偏向低水平。因為所發(fā)現的最有效的添加劑是FeS04，并且ICP分析表明培養(yǎng)基粉劑含有合適量的Fe,所以假設FeS04中的微量雜質是Ser-61處的正確糖基化所必須的?；贔eS04的ICP分析，該微量雜質不是培養(yǎng)基粉劑的特定組分，而是以前一直存在于培養(yǎng)基中的偶然營養(yǎng)物。實施例3:培養(yǎng)基添加劑對rFIX肽圖影響的小規(guī)模研究引言實施例2闡明在多種rFIX批中觀察到Ser-61處糖基化程度的批與批的差異，其被看作K4肽群體分布中的偏移。所有rFIX批具有在該位點以全長四糖(Sia-a2，3-Gal-p1，4-GlcNAc-卩l(xiāng)，3-Fuc-al)占優(yōu)勢的鏈長分布，但是一些批具有不同尋常的高比例的僅巖藻糖形式。實施例2還表明在生物反應器中發(fā)生的K4分布的偏移與培養(yǎng)基粉劑的批改變緊密聯系。實施例2的結果導致對如下假設的強烈支持糖形分54布的改變是合成代謝功能，而不是分解代謝功能。此外，這些實驗表明補充的FeS04可以部分逆轉該偏移，但是ICP分析表明在培養(yǎng)基粉劑批次之間的FeS04濃度沒有顯著差異。從而，假設對于不同的培養(yǎng)基粉劑以不同水平存在的FeS04的另一種未鑒定的微量組分造成該偏移。添加劑影響如實施例2中討論，ICP分析表明用于實驗培養(yǎng)條件的FeS04批中存在可測量量的九種微量元素。這些微量元素與公開的培養(yǎng)基制劑中的那些元素的比較消除了加入Sb或Bi的需要。基于培養(yǎng)基制劑和FeS04的ICP分析，產生了加入rFIX培養(yǎng)物的五種化合物的混合物(給出了最終培養(yǎng)基濃度)1nM(NH4)6Mo7024，10nMCoCl2，5.5nMNH4V03，1.5nMNiS()4，和20nMH3BO3。MnS04單獨加入，因為以前的文獻綜述指出錳可能對于糖基轉移酶活性是重要的(見Breton和Imberty，Curr.OpinioninStructuralBiol.9:563-571，1999;Bruckner等人，Nature406:411-415,2000)。在相同的實驗中，測試了額外的FeSO"2X或4X)以確定它是否可以進一步增加四糖的相對量。在每種情況下，除了實施例2中所述的補充物外，還使用所述添加劑。該添加實驗的結果在圖5中顯示。測定種類分布并且所報告的值為四個K4峰的每一個與它們的總和的比例。該圖也顯示了參考材料、對照(無添加劑)和補充的(如實施例2中)培養(yǎng)物。顯示了每個樣品的一式兩份注射。在每組列中，最左邊的列對應于在Ser-61處具有四糖的分子級分，最右邊的列是具有僅僅巖藻糖的級分。所觀察到的在陽性和陰性對照培養(yǎng)物(分別補充和不補充)之間的差異比以前看到的更小。無論如何，圖5清楚地表明樣t量元素混合物對于K4種類分布沒有影響，而加入FeS04和MnS04改善了K4種類分布。當加入到補充物中時，15nMMnS04與額外的12pMFeS04對K4種類分布具有大約相同的效果。對錳的強烈應答導致設計了實驗來發(fā)現rFIX細胞培養(yǎng)基中錳的最優(yōu)濃度。圖6顯示該實驗給出了與圖5中顯示的結果相一致的結果，因為加入錳的所有培養(yǎng)物都比補充的或者對照培養(yǎng)物具有更少的僅巖藻糖K4。實際上，使用40nM或以上錳的培養(yǎng)物具有與測定參考物質相同量的僅巖藻糖K4。然而，100或500nM時比40nM錳時似乎出現更多的三糖。從而，確定了對于Ser-61處更廣泛的FIX糖基化，40nM是出乎意料的有益的錳濃度。小規(guī)模才莫型的效用這些小規(guī)模實驗和實施例2中給出的小規(guī)模實驗的一個不尋常的特征是來自實驗與實驗之間的不同水平的三糖或者脫唾液酸化的種類。因為該種類與測定參考物相似地改變，所以認為它是單點消化方法的假象。因為使用相同的原材料同時消化給定實驗的所有樣品，所以認為該差異不影響該實施例或者實施例2中給出的分析。結論這些實驗表明向rFIX細胞培養(yǎng)基中加入40nMMnSO4改善了K4種類分布。實施例4:抗-ABeta培養(yǎng)基樣品的N-連接的寡糖分析引言在四種培養(yǎng)基條件下研究了表達人源化的抗ABeta肽IgGl單克隆抗體的CHO細胞("抗-ABeta細胞")的N-連接的寡糖指紋。樣品鑒定和相關信息在表3中列出。表3.從多種培養(yǎng)條件收獲的抗-ABeta樣品品ID條件Gln微量元素體積(mL)天濃度1高否1143.06mg/mL2微量元素高是1144.61mg/mL3低Gln(4mM)微量元素低是1144.44mg/mL4低Gln(4mM)2g/LGlu低否1144.14mg/mL步驟培養(yǎng)抗ABeta培養(yǎng)物1并用補料培養(yǎng)基周期性喂飼。在抗ABeta培養(yǎng)物2中，在開始時加入微量元素E。表4列出了微量元素E的組成。在與培養(yǎng)物2相同的條件下培養(yǎng)抗ABeta培養(yǎng)物3，只是最初的谷氨酰胺水平為4mM。在與培養(yǎng)物3相同的條件下培養(yǎng)抗ABeta培養(yǎng)物4，只是不加入微量元素并且補料培養(yǎng)基補充谷氨酸至2g/L。56通過PNGaseF消化，接著通過高pH陰離子交換層析與脈沖電化學檢測(HPAEC-PED)分析測定每個樣品的糖形分布。簡言之，使用AmiconUltra30,000MWCO蛋白質濃縮器將樣品緩沖液交換到在pH7.3緩沖的50mM甲酸銨中?；厥蘸?，每個樣品用5i^LPNGaseF(無甘油)消化并在37。C過夜溫育。然后通過速度真空離心干燥樣品并用純化水重構。然后將樣品轉移到自動采樣瓶中用于HPAEC-PED分析。HPAEC-PED系統裝配I)ionexCarboPacPA100保衛(wèi)和分析柱(2x250mm)，和ED-40檢測器。使用乙酸鈉的線性梯度，其包括兩種洗脫劑由lOOmMNaOH組成的洗脫劑A和由100mMNaOH/500mM乙酸鈉組成的洗脫劑B。表4.纟效量元素E的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>數據分析與抗ABeta抗體結合的三種類型的復雜的N-連接的雙觸角聚糖在它們的外部N-連接的雙觸角臂上含有0個("G0")、一個("Gl")或兩個(G2")半乳糖殘基。所有樣品都顯示存在代表GO、G1和G2糖形的三個峰。圖7顯示了每個樣品的G0、Gl和G2HPAEC-PED峰的總峰面積百分數的圖形比較。在所有提交的樣品圖中觀察到存在額外的小峰。所觀察到的峰代表低水平的單和二唾液酸化的糖形。討論這些實驗測試了在多種實驗條件下補充補料培養(yǎng)基的抗ABeta培養(yǎng)物的G0:G1:G2峰的相對分布。相對于缺少微量元素E的培養(yǎng)條件，其中加入微量元素E的培養(yǎng)物表明GO水平的下降，和Gl和G2水平的對應升高(圖7)。含有低谷氨酰胺的培養(yǎng)條件具有類似的效果，并且效果是累加的。其中加入微量元素E的低谷氨酰胺(4mM)培養(yǎng)物表明N-連接的糖形分布的顯著偏移，具有幾乎相等比例的GO和G1，G2占總峰面積的約10%(圖7)。加入微量元素E的培養(yǎng)物含有濃度為156nM的錳。然而，應該注意到培養(yǎng)物也含有升高水平的其他金屬。從而，可能的是，除了錳之外，其他培養(yǎng)條件也促進所觀察到的改善的糖基化模式。結論:在抗ABeta樣品中觀察到的糖基化分布的差異最可能是由于培養(yǎng)條件的各自改變。我們的數據強烈提示低谷氨酰胺(4mM)的存在和/或含有100mMMnS04的微量元素E的加入導致抗ABeta中多種N-連接的糖形的百分比改變。這些效果似乎是獨立的和累加的。實施例5:抗ABeta錳研究樣品的N-連接的寡糖分析引言實施例4表明通過向培養(yǎng)條件加入微量元素E和通過保持低谷氨酰胺水平可以得到抗ABeta樣品的糖基化分布的改善。這里我們測試了在培養(yǎng)條件中僅僅加入錳是否可以實現糖基化分布的類似改善。步驟抗ABeta培養(yǎng)物生長于含有或缺少40mM錳的培養(yǎng)基中。用40%總體積的補料培養(yǎng)基喂銅培養(yǎng)物。收獲樣品并根據實施例4中描述的方法分析。數據分析按照峰存在和每個峰的總峰面積百分比比較所分析的樣品。圖8顯示了每個樣品的G0、Gl和G2HPAEC-PED峰的總峰面積百分比的圖形比較。討論與抗ABeta抗體結合的三種類型的復雜N-連接的雙觸角聚糖是G0、G1和G2結構，其在它們的外部N-連接的雙觸角臂上分別含有O、158或2個半乳糖殘基。從在缺少或含有40mM錳的培養(yǎng)基中生長的細胞收獲的樣品顯示存在代表G0、Gl和G2糖形的所有三個峰。G0峰從對照樣品中68%的總峰面積降低到從含有加入錳的培養(yǎng)基收獲的樣品中的53%(見圖8)。在從含有錳的培養(yǎng)基收獲的樣品中也看到總峰面積的Gl和G2百分比的增加?？偡迕娣e的Gl百分比在對照樣品中為26%,在加入錳的樣品中為39°/。?？偡迕娣e的G2百分比在對照樣品中為6%，在加入錳的樣品中為9%(圖8)。結論這些數據表明向培養(yǎng)基中僅僅加入錳導致更廣泛的糖基化模式，如通過這些樣品中G0:G1:G2的百分比分布的偏移所闡明。權利要求1.在細胞培養(yǎng)物中產生糖蛋白的方法，其包括將含有編碼目的糖蛋白的基因的哺乳動物細胞在包含約10nM到600nM錳的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)的條件和時間足夠允許表達所述糖蛋白，其中所表達的糖蛋白的糖基化模式比在缺少錳的其他方面相同的培養(yǎng)基中在其他方面相同條件下觀察到的糖基化模式更廣泛。2.權利要求1的方法，其包括步驟在包含約10nM到600nM錳的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有編碼目的糖蛋白的基因的哺乳動物細胞；在第一個溫度范圍保持培養(yǎng)物第一個時間期限，所述第一個時間期限足夠允許細胞再生至如果培養(yǎng)物保持在第一個溫度范圍時最大可能的活細胞密度的約20%-80%范圍內的活細胞密度；將培養(yǎng)物轉換到第二個溫度范圍，其中第二個溫度范圍的至少一個溫度低于第一個溫度范圍的最低溫度；在足夠允許所述糖蛋白表達的條件和時間內保持培養(yǎng)物第二個時間期限，其中所表達的糖蛋白的糖基化模式比在缺少錳的其他方面相同的培養(yǎng)基中在其他方面相同條件下觀察到的糖基化模式更廣泛。3.權利要求2的方法，其中第一個溫度范圍包含約30到42。C的溫度范圍。4.權利要求3的方法，其中第一個溫度范圍包含約37。C的溫度。5.根據權利要求2到4任一項的方法，其中所述第二個溫度范圍包含約25到4rc的溫度范圍。6.權利要求5的方法，其中所述第二個溫度范圍包含約3rc的溫度。7.根據權利要求2到6任一項的方法，其還包含第一個轉換步驟后的第二個轉換步驟，該第二個轉換步驟包括將培養(yǎng)物轉換到第三個溫度或溫度范圍，其中第三個溫度范圍的至少一個溫度低于第二個溫度范圍的最低溫度。8.權利要求7的方法，其中第三個溫度范圍包含約25到40。C的溫度范圍。9.根據權利要求1到8任一項的方法，其中所述細胞培養(yǎng)基包含約20到200nM錳。10.權利要求9的方法，其中所述細胞培養(yǎng)基包含約40nM錳。11.根據權利要求l到IO任一項的方法，其中細胞培養(yǎng)基包含最初濃度小于或等于約8mM的谷氨酰胺。12.權利要求ll的方法，其中所述細胞培養(yǎng)基的最初谷氨酰胺濃度小于或等于約4mM。13.根據權利要求1到12任一項的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物的體積為至少約500L。14.根據權利要求l到13任一項的方法，其中最初的細胞培養(yǎng)開始后進一步為細胞培養(yǎng)物提供補料培養(yǎng)基。15.根據權利要求l到14任一項的方法，其中進一步為細胞培養(yǎng)物提供補充組分。16.權利要求15的方法，其中所述補充組分選自激素和/或其他生長因子、無機離子、緩沖劑、維生素、核苷或核苷酸、微量元素、氨基酸、脂類、葡萄糖或其他能源，和其組合。17.權利要求16的方法，其中為所述細胞培養(yǎng)物補充約2克/升的葡萄糖。18.根據權利要求1到17任一項的方法，其中所述細胞培養(yǎng)基是確定成分培養(yǎng)基。19.根據權利要求1到18任一項的方法，其中目的糖蛋白包含凝血因子IX。20.權利要求19的方法，其中凝血因子IX是重組人凝血因子IX。21.根據權利要求l到18任一項的方法，其中目的糖蛋白包含抗ABeta抗體。22.權利要求21的方法，其中抗ABeta抗體是單克隆抗體。23.權利要求22的方法，其中抗ABeta抗體是人源化的抗ABeta肽IgGl單克隆抗體。24.包含約10到600nM猛的細胞培養(yǎng)基。25.權利要求24的細胞培養(yǎng)基，其包含約20到200nM錳。26.權利要求25的細胞培養(yǎng)基，其包含約40nM錳。27.根據權利要求24到26任一項的細胞培養(yǎng)基，其中細胞培養(yǎng)基包含最初濃度小于或等于約8mM的谷氨酰胺。28.權利要求27的細胞培養(yǎng)基，其中最初的谷氨酰胺濃度小于或等于約4mM。29.根據權利要求24到28任一項的細胞培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基是確定成分培養(yǎng)基。30.通過權利要求1到23任一項的方法得到的糖蛋白。全文摘要提供了用于在細胞培養(yǎng)物中大規(guī)模產生糖蛋白的改進系統。根據本發(fā)明，表達糖蛋白的細胞生長在含有約10到600nM濃度的錳的培養(yǎng)基中。此類系統的使用允許產生糖蛋白，該糖蛋白具有增加的糖基化模式和/或更準確反映了天然存在的糖蛋白的糖基化模式的糖基化模式。根據本發(fā)明表達的糖蛋白可以有利地用于制備藥物組合物。文檔編號C12N5/00GK101541950SQ200780033112公開日2009年9月23日申請日期2007年7月11日優(yōu)先權日2006年7月13日發(fā)明者D·R·拉斯科,S·M·科扎申請人:惠氏公司