專利名稱：：抗屈曲病毒感染的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及能夠在人和其他哺乳動物宿主中誘發(fā)對抗屈曲病毒(Chikungunyavirus,CHIKV)感染的保護性免疫反應的疫苗制劑。免疫原性制劑包括處于穩(wěn)定劑型的純化的滅活(inactivated)屈曲病毒。提供了在諸如Vero和MRC-5細胞等FDA/國家監(jiān)管局認可的疫苗品質(zhì)細胞系的連續(xù)細胞培養(yǎng)中進行體外病毒適應和增殖的方法。探討了病毒的純化和滅活方法。探討了包含附加的穩(wěn)定劑的病毒液體和凍干劑型的制備和服用方法。滅活病毒制劑是非感染性的，具有免疫原性，且能夠在哺乳動物宿主中誘導保護性免疫反應。配制免疫原性組合物以用于人體內(nèi)服。利用能夠在哺乳動物宿主中誘發(fā)對抗屈曲病毒的保護性免疫反應的重組病毒蛋白作為抗原來開發(fā)亞單位(subunit)疫苗的方案也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。重組抗原還有可能用于診斷病毒的存在。
背景技術(shù)：
：疾病和流行病學基孔肯雅癥(Chikungunya)是主要流行于非洲和亞洲的一種使人身體衰弱的疾病。癥狀包括突發(fā)高熱、皮滲或者出血，關(guān)節(jié)痛，和偶爾累及神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和肝臟。能持續(xù)數(shù)年的關(guān)節(jié)痛會導致失能(Sarkar等，1965;Rao等，1965;Nimmannitya等，1969;Schuffenecker等，2006)。這種疾病是屈曲病毒(CHIKV)引起的，并且通過伊蚊(Aedesspp.)經(jīng)由居住森林中的其他脊推動物宿主傳播(在非洲)或者經(jīng)由人-蚊-人循環(huán)傳播(在亞洲)(Powers等，2000)。這種疾病曾經(jīng)有過幾次大規(guī)模爆發(fā)，包括最近一次在印度洋、馬來西亞和印度的爆發(fā)的幾次就使得數(shù)以千計的人們受到疾病的折磨。在印度，主要的爆發(fā)發(fā)生在20世紀60年代和2005到2006年(Shah等，1964;Rao等，1965;Chaturvedi等，1970;Ravi，2006)。在最近一次爆發(fā)中，卡納塔克邦、安德拉邦、泰米爾納德邦、馬哈拉施特拉邦可能還有奧里薩邦的幾個地區(qū)都受到影響。多種血清學試驗能夠診斷這種疾病，但是由于多種緊密關(guān)聯(lián)的蟲媒病毒都會引起類似的疾病，因此最終的鑒定需要核實遺傳物質(zhì)，。治療只能起到緩和作用，目前還沒有商業(yè)化的疫苗。屈曲病毒包含一個單鏈的有義鏈RNA基因組，與辛德畢斯(Sindbis)和塞姆利基才絮才木(Semliki)疾病病毒(Forestdiseaseviruses)同屬披蓋病毒科(Togaviridae)a病毒屬A組蟲媒病毒(Fauquet等，2005)。病毒體大小為50-60nm,并且能夠被70%乙醇、1°/。次氯酸鈉、2%戊二醛、液體脂溶劑、高于58oC的濕熱或干熱以及干燥滅活?；蚍中徒沂敬嬖谌N進化枝西部非洲型、東部中部南部非洲型和亞洲型。亞洲和非洲抹形成序列、抗原性和病毒特性上彼此有區(qū)別的緊密聯(lián)系的進化枝。亞洲隔離群顯得比任何一種非洲進化枝更保守(Powers等，2000;Schuffenecker等，2006)。最近的印度洋爆發(fā)隔離群均顯示出在疾病的早期到晚期發(fā)展過程中包膜糖蛋白El的第226位從丙氨酸到纈氨酸的特有突變(Schuffenecker等，2006)。盡管還不清楚這種現(xiàn)象的重要性，但是可以推測其對于病毒有進化上的優(yōu)勢。對病毒蛋白及其功能或病原性的了解還不多。病毒基因組大約12kb,具有5，7mG帽結(jié)構(gòu)和3，poly(A)區(qū)，堿基組成為30%的A,25。/。的C和G,以及20y。的U?；蚪M序列為5，-nsPl-nsP2-nsP3-nsP4-(連接區(qū))-C-E3-E2-6K-El-polyA-3，。非結(jié)構(gòu)蛋白由基因組的5，端2/3部分直接翻譯，而結(jié)構(gòu)蛋白則由與基因組3，端1/3部分共線的26S亞基因組RNA產(chǎn)生。在基因組的3'非翻譯區(qū)包含保守重M列和一個內(nèi)部poly(A)束(Khan等，2002;Schuffenecker等，2006)。在序列信息的基礎(chǔ)上推知出nsPl、nsP2、nsP3、nsP4、C、E3、E2、6K和E1蛋白分別包含535、798、530、611、261、64、423和61個氨基酸殘基(Khan等，2002;Schuffenecker等，2006)。在SDS凝月交上能觀察到包膜蛋白為62kDE2/E3，在90分鐘內(nèi)分裂為E2和E3,以及45-50kD的緊密共同遷移的El和E2。El和E2迅速地彼此緊緊結(jié)合在一起。llkD的E3蛋白不與病毒體結(jié)合，而是釋放到培養(yǎng)基中(Simizu等，1984;Ranadive和Banerjee，1990)。為了診斷的目的，在鵝紅細胞上常規(guī)進行病毒El糖蛋白使紅細胞粘著，血凝反應試驗(HA)和血凝抑制反應試-瞼(HI)。病毒的HA活性對胰蛋白酶不敏感，而被tween-醚處理增強(Hannoun，1968)。HI效價大于40的血清通常顯示出中和能力(Bedekar和Pavri，1969b)?？梢詮男律覍倩蚶鲜?，或者動物或昆蟲細胞培養(yǎng)物中分離病毒。Vero、非洲綠猴腎細胞、BHK21、BSC-1、雞胚成纖維細胞和C6/36細胞被用來在體外分離和擴增病毒。病毒在細胞培養(yǎng)物中復制相當快。根據(jù)劑量和細胞系，細胞病變效應在12-48小時內(nèi)能夠被觀察到。感染復數(shù)為1-5時，在一個5-6小時的隱蔽期之后，細胞內(nèi)病毒效價急劇地升高并在12小時達到峰值。細胞外病毒在感染后8小時能夠觀察到，在12-24小時達到峰值，這取決于細胞體系和接種物劑量(Chain等，1966;Higashi等，1967;Hahon和Hankins，1970;Eckels等，1970)。在單細胞層中感染的擴散方式根據(jù)細胞種類的不同而不同，在BHK21細胞中包括細胞外以及細胞至細胞的傳播，而在L929細胞和豚鼠肺細胞中僅僅只有前者(Hahon和Zimmerman,1970)。上清液的效價可以達到小鼠腦標本觀察到的那么高(Shah等，1964;Paul和Singh,1968;Umrigar和Kadam，1974)。病毒能通過超速離心從細胞培養(yǎng)上清液中濃縮，或者利用硫酸銨、明夙或者聚乙二醇沉淀(Eckels等，1970;Klein等，1970;Banerjee和Ranadive,1988;Killington等，1996)。病毒還能通過速度區(qū)帶離心、平衡密度梯度或凝月交過濾進一步純化(Eckels等，1970;Simizu等，1984;Banerjee和Ranadive，1988)。病毒的滴定可以利用免疫熒光、ELISA、補體結(jié)合、瓊脂凝膠免疫擴散、血凝反應和血凝抑制反應、噬菌斑測定或中和作用進行?，F(xiàn)在還不清楚CHIKV或其它a病毒如何引起關(guān)節(jié)炎。提出的可能機制包括病毒復制導致細胞死亡和組織損傷，關(guān)節(jié)處產(chǎn)生免疫介導的攻擊，或者免疫復合物介導的炎癥。塞姆利基森林病毒(Semlikiforestvirus)和羅斯河病毒(RossRivervirus)凈皮發(fā)現(xiàn)在新生兒的骨關(guān)聯(lián)結(jié)締組織和成體小鼠的皮膚和肌肉中復制(Heise等，2000),但是對于CHIKV還沒有類似的研究。與需要適應才能感染動物的登革熱病毒(Denguevirus)相反，CHIKV在臨床樣本的初次接種中顯示出快而高的死亡率(Myers等，1965)。但是，新生家鼠和老.鼠是僅有的顯示出疾病的物種(ChakravarthyandSarkar，1969)。在大腦內(nèi)、腹月莫內(nèi)或皮下4妄種3-10天的病人血清后，新生家鼠/老鼠以一種劑量依賴性的方式顯示出疾病和高死亡率，小鼠的半數(shù)致死劑量為105.5-107.0病毒/mL血清(Shah等，1964)。動物迅速出現(xiàn)呆滯，嚴重食欲不振，發(fā)紺，皮膚溫度降低，和死亡。從病理學上看，它們顯示出心臟肥大，胃腸道、肺泡、膀胱、關(guān)節(jié)和皮膚出血，骨骼肌和脂肪墊壞死，以及彌散的腸內(nèi)機能障礙(Nimmannitya等，1969;Weiss等，1965)。存活者(注入較少劑量的)顯示出發(fā)育障礙，但產(chǎn)生了HI抗體，并且在大腦內(nèi)或腹膜內(nèi)攻擊之后得到保護使免受攻擊(Shah等，1964;Giovarelli等，1977)。新生兔和豚鼠對某些病毒復蘇有適度的敏感性，而一天的小貓敏感性較低。成體家鼠、老鼠、豚鼠、倉鼠、野兔和家兔顯示出病毒血癥，但沒有發(fā)生疾病，而且產(chǎn)生了HI抗體和中和抗體，反之成體貓和家禽則不會產(chǎn)生抗體。在奶牛、綿羊、山羊和馬中能觀察到低效價的HI抗體，而沒有病毒血癥或中和抗體(Mcintosh等，1963;Bedekar和Pavri，1969a;Chakravarthy和Sarkar，1969)。鳥類的4文感性還有爭論。在一項研究中，白來杭雞死于病毒接種，而康復的鳥類產(chǎn)生了中和抗體(Bedekar和Pavri，1969a)。這項研究以及其它包括對雞、麻雀、鵒子和蝙蝠的研究中觀察到不伴隨病毒血癥的血清轉(zhuǎn)化或者什么都沒觀察到(Shah等，1964;Bedekar和Pavri，1969a)。屬于各種種類的成體猴表現(xiàn)出病毒血癥，能將病毒傳播給蚊子，并且長時間持續(xù)產(chǎn)生中和抗體(Paul和Singh,1968)。非洲的野生猴和狒狒在病毒感染后傳播高效價的病毒卻不顯現(xiàn)出任何明顯的疾病，并能將病毒傳播給蚊子(Mcintosh等，1963)。但是，印度并沒有猴子自然感染的血清學證據(jù)(Bedekar和Pavri，1969b)。CHIKV感染(臨床的或者隱在的)被認為給予終身免疫。因為接近的抗原關(guān)系，可以假定存在不同毒抹之間的交叉保護(Casals,1957;Porterfield，1961;Shah等，1964)以及與其它oc病毒之間的相互交叉保護(Parks和Price,1958;Hearn和Rainey，1963)，這在動物模型中得到了證實。盡管如此，有證據(jù)表明活的減弱ot病毒疫苗可以干擾以后的相關(guān)疫苗(McClain等，1998)。作為疫苗的前奏，原始CHIKV制劑經(jīng)過福爾馬林滅活(Harrison等，1967)或從體外培養(yǎng)的病毒中用tween-醚萃取(Eckels等，1970)。盡管兩者都徹底喪失感染性，然而福爾馬林破壞HA活性，而后者則完全保留HA活性。但是它們都引起相似的HA、補體結(jié)合和中和抗體，還在致死性攻擊研究中顯示出相似的保護水平(Eckels等，1970)。馬里蘭州弗雷德里克的美軍傳染性疾病醫(yī)學研究所制成了CHIKV的一種候選疫苗。使用來自于泰國(1962年爆發(fā))的CHIKV毒抹15561來生產(chǎn)經(jīng)過多次綠猴中傳代以及福爾馬林滅活的制劑，服用至16個志愿者，他們顯示出高的免疫反應并且沒有不良反應(Harrison等，1971)。GMK傳代的病毒進一步通過噬斑試驗在MRC-5細胞中進行18次連續(xù)傳代(Levitt等，1986)，在15名首次遭遇a病毒的個體進行的I期試驗中是安全的，并有免疫原性，接種后2-4天出現(xiàn)病毒血癥(McClain等，1988)。在一項隨4幾的、雙盲的、安慰劑對照的II期試驗中，73名首次遭遇a病毒的18-40歲志愿者被皮下接種了0.5mL劑量，其中含有一105PFU的病毒(59人)或安慰劑(14人)。血清學評價包括嗟斑減少中和效價(plaquereductionneutralizationtiterPRNT)和50%減少效價>20被視為陽性。局部和全身反應僅限于疫苗組，8%的CHIKV疫苗組成員(安慰劑組中沒有)出現(xiàn)關(guān)節(jié)痛。到第28天為止98.3%的接種疫苗者發(fā)生血清轉(zhuǎn)化，28-42天達到PRNT50效價的峰值1:10240。盡管抗體水平隨時間稍微下降，一年以后85°/。的接種疫苗者仍然是血清陽性的，在180-360天維持效價l:1280(Edelman等，2000)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的范圍包括從受感染的病人的血清樣本中分離屈曲(CHIK)病毒的程序，在諸如Vero和MRC-5等FDA/國家監(jiān)管局認可的細胞系的連續(xù)培養(yǎng)中適應和增殖病毒到一個高的效價以及從培養(yǎng)的被感染細胞中收獲病毒的方法。本發(fā)明描述的方法適用于所有屈曲病毒的基因型/毒抹/遺傳性變型，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明的范圍包括基本不含有細胞和血清組分的受感染細胞中純化病毒的方法。本發(fā)明中使用的一種方法包括使用所有人HimaxTM的4支術(shù)來純化病毒。純化的病毒通過熱滅活或使用包括但不限于福爾馬林、丙內(nèi)酯、戊二醛、非離子洗滌劑、抗壞血酸等的滅活試劑中的一種化學滅活。疫苗制劑包括藥學上可接受的緩沖劑，例如pH范圍6.4-7.5的磷酸鹽或磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液，其中添加了穩(wěn)定劑，包括但不限于AA清清蛋白、明膠、還原和非還原糖、氨基酸、例如山梨醇和甘露醇的多元醇、甘油有機和無機鹽、聚乙烯吡咯烷酮等中的一種或幾種。液體形式的穩(wěn)定制劑適合于人類宿主的肌肉內(nèi)/皮內(nèi)/皮下/靜脈內(nèi)服用。凍干形式的穩(wěn)定制劑在服用前可以通過合適的溶劑再生。制劑適合人類口服和鼻內(nèi)服用。疫苗制劑的功效通過多種方法例如病毒中和試驗和血凝抑制測定確定出?？乖鞍椎脑u價通過^f吏用標準蛋白評價方法和ELISA進行。疫苗的效能在動物模型中進行測試。疫苗制劑的效能在抗原劑量從ljug到200iag的范圍內(nèi)進行測試，制劑中的活性成分為滅活的病毒。在使用制劑服用的家兔中觀察到了高比率的血清轉(zhuǎn)化和對抗病毒的保護性抗體。在諸如Vero/MRC-5等FDA/國家監(jiān)管局認可的細月包系的連續(xù)細胞培養(yǎng)中病毒的適應和生長提供了一種能負擔的，可再生的和容易被驗證的方法來在適合于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)能夠用作為疫苗的穩(wěn)定病毒制劑的連續(xù)細胞培養(yǎng)中增殖屈曲病毒。添加了穩(wěn)定劑的滅活屈曲病毒穩(wěn)定制劑具有免疫原性，能夠誘發(fā)對抗屈曲病毒株的保護性免疫反應。本發(fā)明還描述了利用重組病毒蛋白作為抗原的亞單位疫苗的方案。病毒蛋白能夠在原核或真核宿主細胞中表達為重組蛋白。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，這里描述的克隆和表達的方法適用于病毒蛋白的所有遺傳性變型/突變體。圖1:A-未感染的對照Vero細胞B-CHIK感染的Vero細胞C-對照MRC-5細胞D-CHIKV感染的MRC-5細胞E-對照BHK21細胞F-CHIKV感染的BHK21細胞圖2:純化的CHKV制劑的SDS-PAGE，示出了比病毒抗原更突出的El和E2蛋白。病毒樣本在12%的變性SDS-PAGE凝膠中電泳，通過銀染使結(jié)果可視化。兩種蛋白的大小約為46-50kD。圖3:純化的屈曲病毒隔離群CHK/03/06在老鼠大腦內(nèi)注射后的體內(nèi)毒力。2天齡的老鼠大腦內(nèi)注純化的射屈曲病毒隔離群CHK/03/06，對照動物注射等體積的PBS。圖A-注射PBS7天后的對照小鼠圖B-注射純化病毒的老鼠在大腦內(nèi)注射純化病毒制劑后第6天死亡圖C-給2天齡的老鼠大腦內(nèi)注射后第9天，注射PBS的對照動物顯示正常生長(左)，而注射l:64稀釋的純化病毒制劑的小鼠嚴重生長遲緩。圖4:CHK/03/06隔離群200K放大倍率的透射電子顯微照片(TEM)。圖5CHK/01/06和CHK/03/06病毒隔離群使用CHIK病毒基因特異性引物擴增的RT-PCR產(chǎn)物的溴化乙錠染色照片。泳道1--使用CHKSPFP1和CHKSPRP5擴增的CHK/01/06;~550bp泳道2-使用CHKSPFPl和CHKSPRP5擴增的CHK/03/06;~550bpM-分子大小標記;1kbladder;(N3232S;NewEnglandBiolabs)泳道4-J吏用CHKSPFP3和CHKSPRP4擴增的CHK/01/06;~686泳道5-使用CHKSPFP3和CHKSPRP4擴增的CHK/03/06;~686bp泳道6-使用CHKSPFP1和CHKSPRP5擴增的CHK/01/06;~637bp泳道7-使用CHKSPFP1和CHKSPRP5擴增的CHK/03/06;637bp圖6使用新鮮鵝紅細胞的CHK/03/06病毒血凝反應(HA)。前兩列是連續(xù)稀釋的從Vero細胞中收獲的病毒的HA效價。后兩列是連續(xù)稀釋的純化CHIK病毒制劑的HA效價，表現(xiàn)出HA效價的增加。圖7.病毒結(jié)構(gòu)蛋白的RT-PCR。格A-泳道l-衣殼的PCR產(chǎn)物；泳道2-100bpladder;泳道3-E2的PCR產(chǎn)物格B-泳道l-E1的PCR產(chǎn)物；泳道2-1Kbladder才各C-泳道1-100bpladder;泳道2-E3的PCR產(chǎn)物圖8在大腸桿菌(E.coli)表達細胞中誘導的克隆El蛋白的SDS-PAGE。泳道l-未誘導細胞；泳道2-蛋白質(zhì)分子大小標記；泳道3-IPTG誘導4小時后的大腸桿菌細胞，顯示出約47kD的El蛋白的誘導。圖9在巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)中誘導的約30kD的衣殼蛋白的SDS-PAGE;泳道1-曱醇誘導后0小時的蛋白表達；泳道2-曱醇誘導后72小時；泳道3-蛋白質(zhì)分子大小標記。具體實施例方式-沈明了屈曲病毒顆粒的免疫原特性，病毒在宿主細胞系中適應和增殖以達到更高的效價(ahightiter),用RT-PCR、電子顯微鏡識別病毒的檢測方法；還說明了一種純化和滅活病毒的方法，在適合人類服用的藥學可接受的載體上制備穩(wěn)定液體和凍千疫苗制劑，在動物模型中研究疫苗功效的病毒方法和試驗。本發(fā)明中描述的疫苗的活性成分或免疫原是滅活的屈曲病毒顆粒。本發(fā)明描述的方法適合于屈曲病毒的任何基因型/毒林。從患者血清中的臨床隔離群得到的病毒顆粒在體外單細胞層中適應和增殖了許多代。在可選擇的操作規(guī)程中，在2天大小的乳鼠中進行病毒顆粒的傳代，重新分離病毒并在體外單細胞層中傳代。根據(jù)本發(fā)明的屈曲(CHIK)病毒疫苗指滅活屈曲病毒的活性成分(免疫原)，其通過在cGMP條件下在細胞被用作培養(yǎng)屈曲病毒的宿主細胞的連續(xù)培養(yǎng)物中感染Vero細胞或MRC-5細胞的單細胞層來生產(chǎn)。細胞系在各種質(zhì)量控制測試中表現(xiàn)合格，并被FDA/國家監(jiān)管局認可作為疫苗品質(zhì)細胞系。病毒通過在細胞培養(yǎng)物中生長到高效價(~109)和從感染的細胞中純化來大量繁殖。病毒通過熱滅活或滅活試劑滅活。使用穩(wěn)定劑型中的上述顆粒免疫得到的抗血清的中和抗體效^f介通過體外中和試驗測定，它提供了動物中的保護性免疫。屈曲病毒疫苗的免疫原是對抗各種毒抹或基因型變體的屈曲病毒引起的傳染性疾病的疫苗的免疫原的代表性實例。本發(fā)明的疫苗以液體或凍千形式在密封的小瓶或安瓿中提供。在液體劑型的情況下，以大約每人0.05ml到5ml的量通過皮下/肌肉內(nèi)/皮內(nèi)/靜脈內(nèi)注射或口/鼻內(nèi)服用至要接種疫苗的個體。在凍干劑型的情況下，在使用合適的溶劑重新溶解后再注射。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中使用的適合屈曲病毒林的方法適用于具有廣泛抗原譜的任何屈曲病毒抹。廣譜抗原反應對除制造疫苗使用的毒林之外的多種CHIK病毒抹提供了滿意的免疫保護。如本領(lǐng)域:f支術(shù)人員所知，二價或多價疫苗可以通過將兩種或多種在遺傳上確證為CHIK病毒的CHIK病毒抹制造的疫苗混合，并根據(jù)抗原蛋白含量以合適的比率混合來配制。這樣的混合提供具有更廣的對抗感染的保護抗原語的疫苗制劑。才艮據(jù)本發(fā)明，用病毒4秦種合適的宿主細胞系，例如Vero細胞/MRC-5細胞，在連續(xù)培養(yǎng)中維持感染的細胞。培養(yǎng)方法包括用病毒感染宿主單細胞層和從感染的宿主細胞中收獲足夠數(shù)量的病毒。在細胞層中生長的病毒包括能夠通過離心收獲的從感染的細胞培養(yǎng)物上清液中收獲得到的細胞外病毒群落，并且通過超聲降解和離心收獲細胞關(guān)聯(lián)的病毒。能夠在體外培養(yǎng)中增殖的細胞系可以用來作為病毒培養(yǎng)的宿主。例如，二倍體細胞系(如MRC-5和WI-38)以及連續(xù)傳代細胞系(如Vero、BHK-21、CHO等)都能被使用。為了繁殖屈曲病毒^K,優(yōu)選地選擇讓病毒良好地生長的許可細胞(permissivecell)。例如Vero(ATCCNo.CCL曙81)、BHK-21(ATCCNo.CCL-IO)、C6/C3(ATCCNo.CRL-1660)等是優(yōu)選使用的。本發(fā)明中使用的一種這樣的細胞系是Vero細胞，它已經(jīng)被確認為疫苗生產(chǎn)使用的宿主細胞。確認的Vero細胞系符合第50號生物制品要求，其關(guān)于世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的生產(chǎn)生物制品的細胞的使用要求，因而證實這些細胞系具有生產(chǎn)疫苗的資格(WHOTechnicalreportSeries,No.878,pp1&52,1998)。此夕卜，按照慣例用于生產(chǎn)病毒疫苗的CV-1、BSC-l、MA104、MDCK、CaCO-2etch和DBS-FLC-l、DBS-FLC國2、DBS-FRhl-2、ESK畫4、HEL、IMR陽90、WRL68等同樣能夠使用("ATCCMicrobesandCellatWork",第二版.，ppl44,AmericanTypeCultureCollection(ATCC)1991，USA)。為了在細胞培養(yǎng)中維持上述細胞系，能應用單細胞層固定培養(yǎng)，灌流系統(tǒng)培養(yǎng)，搖瓶，滾管/瓶培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)，細胞工廠和細胞堆集室以及類似的方法。例如商業(yè)上可以獲得的多種Cytodex(PharmaciaBiotech,瑞典)被用作為微載體，也能使用其它商業(yè)上可以獲得的動物細胞培養(yǎng)裝置。將滅活試劑諸如福爾馬林、P-丙內(nèi)酯，和戊二醛加入病毒懸浮液來滅活病毒。例如，使用福爾馬林和P-丙內(nèi)酯時，加入的量大約是0.001%到0.4%(v/v),滅活溫度為約2-8。C到約40°C,滅活持續(xù)時間主要取決于滅活溫度。例如，37。C時在2-72小時范圍之間，2-8°C時大約12-250小時。在22。C左右的中間溫度滅活2-120小時也是有效的。病毒滅活也可以通過非離子型洗滌劑和抗壞血酸進行。56-58。C左右溫度下熱滅活屈曲病毒1小時也是有效的。純化病毒是利用物理方法或者化學方法或者更好地兩者的組合來進行。物理方法利用病毒的物理性質(zhì)諸如密度、大小、質(zhì)量、沉降系數(shù)等和包括但不限于下列任何技術(shù)區(qū)帶超速離心、密度梯度離心、大小截斷范圍50-1000kDa的膜超濾來去除血清和細胞組分。通過化學方法的純化應用諸如通過化學或生理化學反應吸附/解吸附的方法，并且包括例如超離心、密度梯度離心、離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、凝膠過濾層析、以硫酸氨為例的無機鹽成鹽和使用所有者HimaxTM的技術(shù)、有機鹽、有機溶劑、石克酸鋁、氫氧化鋁以及諸如聚乙二醇的有機化合物。病毒的純化通過上述一種方法或者兩種及兩種以上方法的聯(lián)合而實現(xiàn)。病毒的濃縮通過超濾膜低速離心、鹽沉淀或使用HimaxTM技術(shù)純化而實現(xiàn)。病毒顆粒的滅活可以在病毒純化之前或之后實現(xiàn)。通過使用2%(w/v)的乙酸雙氧鈾負染色方法在約20,000到約200,000放大倍率的電子顯樣吏鏡中能觀察到病毒。CHIK病毒的遺傳一致性通過對互補于毒抹基因組RNA的cDNA測序來確認。更具體地說，通過超離心?；驈拿芏忍荻戎蟹蛛x后，從病毒感染的細胞或純化的CHIKV中抽提基因組RNA。此后，使用一對引物和通過雙脫氧鏈終止法確定的產(chǎn)物cDNA的堿基序列使用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)進一步擴增編碼包膜蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的區(qū)域。堿基序列編碼的氨基酸序列使用通用密碼譯解并通過病毒的遺傳一致性確認為屈曲病毒。本發(fā)明的滅活病毒顆粒通過合適的藥學上可接受的的稀釋劑稀釋以得到需要的效價。制劑中使用的緩沖液可以是磷酸鹽或磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液。疫苗可以任選地含有防腐劑、穩(wěn)定劑等。將還原和非還原糖、糖醇(如山梨醇和甘露醇)、甘油、氨基酸、人血清清蛋白以0.01%到10%的范圍添加到液體劑型中或以不多于總固體量的60%添加到凍干劑型中。這樣的液體或凍干形式的和在藥學上可接受的緩沖液或水中重建之后的免疫原的穩(wěn)定制劑適合于對人類宿主皮內(nèi)/皮下/肌肉內(nèi)/靜脈內(nèi)服用，也同樣適合于口和鼻內(nèi)服用?？蛇x地，屈曲病毒疫苗可以是亞單位疫苗，其用結(jié)構(gòu)蛋白(如屈曲病毒林的衣殼蛋白、El和E2和E3糖蛋白)配制，所述毒抹可以是分別克隆和表示，并純化來組成疫苗制劑，或通過表達由衣殼蛋白、E3、E2、6K多肽和E1蛋白構(gòu)成的整個結(jié)構(gòu)多聚蛋白，其作為一個單一的多肽克隆，并具有在例如酵母、經(jīng)由桿狀病毒介導表達的昆蟲細胞，和宿主信號肽酶加工后的哺乳動物細胞的真核宿主細胞中組裝為病毒樣顆粒(VLP)的潛能。因為它們被宿主信號肽酶正確加工組裝后在結(jié)構(gòu)上模擬了天然病毒顆粒，因此VLPs具有高度免疫原性。它們的組裝結(jié)構(gòu)中包含了多拷貝的抗原蛋白。原核或真核宿主細胞中表達的病毒蛋白都經(jīng)純化去除了宿主細胞蛋白。純化的結(jié)構(gòu)蛋白可以以制劑且通過上述方法服用?？寺r在重組蛋白的任一端添加的組氨酸殘基有利于重組蛋白的純化。在本發(fā)明的另一方面中，才艮據(jù)本發(fā)明獲得的病毒顆粒和重組病毒蛋白在診斷試驗中能被用作試劑(作為抗原)，例如在免疫沉淀方法、血凝抑制反應(HI)試驗、補體結(jié)合(CF)反應、ELISA、放射免疫測定、免疫熒光沖企驗、WesternBlot和其它類似的試驗中作為抗原。更具體地說，提供了使用本發(fā)明的滅活病毒顆粒整體或其部分的4企測屈曲病毒各種毒抹感染的高靈敏度和特異性的診斷試驗。這里使用的術(shù)語滅活病毒顆粒的"部分"指保持需要的免疫原性并衍生自病毒顆粒的病毒部分，包括例如在提供的實施例中描述的在純化步驟中溶解的或在重組表達系統(tǒng)中表達的結(jié)構(gòu)蛋白。具體用于病毒的多克隆抗體或單克隆抗體能夠用于屈曲病毒感染的診斷測定。在Balb/c老鼠和家兔中測-瞼疫苗制劑以測定疫苗的效能。對每組動物腹膜內(nèi)注射大約0.2-0.5ml/老鼠的連續(xù)稀釋疫苗制劑，不同測-瞼組的劑量范圍從ljig到大約500jug。首次服用抗原7-14天之后再給予一個加強劑量。在氬氧化鋁和寡核苷酸中配制的滅活病毒制劑帶來了更高的免疫反應。產(chǎn)物血清通過體外中和試驗測定，抗體效價利用ELISA測定。-使用疫苗制劑免疫的動物觀察到血清轉(zhuǎn)化。下面包含的實施例僅僅是為了更全面地理解這里描述和要求保護的發(fā)明。這些實施例不以任何方式限制要求保護的發(fā)明的范圍，它不能解釋權(quán)利要求的保護范圍。但是，應該理解的是，在不違背如前的權(quán)利要求給出的本發(fā)明的范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠作出修飾和改變。益處、優(yōu)點、問題的解決方法和任何能夠帶來益處、優(yōu)點或出現(xiàn)或變得更顯著的解決方法的要素都不應理解為任何或所有權(quán)利要求的關(guān)鍵的、必需的或本質(zhì)的特征或要素。本發(fā)明僅僅通過附加的權(quán)利要求書來定義，包括在本申請審查期間的任何修改和那些權(quán)利要求的所有等效物。實施例1:在病毒培養(yǎng)細胞系中增殖Vero細胞系(ATCCNo.CCL-81)、BHK-21細胞和MRC-5細胞被用作為屈曲病毒(CHIKV)培養(yǎng)的候選細胞系，在每一種細胞系中都觀察到良好的病毒增殖。Vero細胞和BHK-21細胞分別在由含有5Q/。胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco，sModifiedEagleMedium;Sigm&AldrichCatalog#D5523;4妄照廠商的使用說明使用)組成的生長培養(yǎng)基中制備。它們在37。C靜止培養(yǎng)直到80-100%的單細胞層融合為止。此后對細胞進行計數(shù)。MRC-5細胞在由用Hepes緩沖液緩沖到中性pH的含有5%FBS的MEM(MinimalEagle，sMedium)組成的生長培養(yǎng)基中制備，在37。C靜止培養(yǎng)6天，此后對細胞進行計數(shù)。在另一種候選方法中，Vero細胞和MRC-5細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了標定用于病毒感染的細胞的生產(chǎn)，使用來自于工作細胞庫的包含5x106活Vero細胞的一支冷凍管來接種一個T175細胞培養(yǎng)瓶。含有5%FBS和50jug/ml新霉素辟^酸鹽的DMEM被用來復蘇和培養(yǎng)細胞。在T175瓶中的單細胞層融合度超過90%后，細胞用胰蛋白酶消化并在細胞工廠/細胞堆集室(CF10)中進一步增殖。使用同樣的DMEM培養(yǎng)基進行增殖(~2.0L/CF10)。實施例2.病毒的分離屈曲病毒(CHIKV)從具有典型屈曲病毒感染臨床癥狀的感染患者的血清中分離。病毒的印度隔離群被用來制造疫苗制劑。在獲得的眾多隔離群中，名為CHK/03/06和CHK/01/06的兩個隔離群被鑒定。從患者抽取的血液樣本在4。C運送，并從中分離血清。血清使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)1:l稀釋，用0.5ml稀釋的血清在252cm瓶中感染Vero細胞(ATCCNo.CCL-81),并在無血清培養(yǎng)基中34。C到37°C培養(yǎng)。Vero細胞對照瓶用同體積的lxPBS處理。感染后增殖Vero細胞的培養(yǎng)基是含有1%胎牛血清(FBS)的DMEM。在一種可選的方法中，細胞和病毒的培養(yǎng)都在無血清培養(yǎng)基中進行。在感染30-48小時之后收獲病毒。感染的Vero細胞中屈曲病毒隔離群CHK/03/06的細胞病理效應(cpe)如圖1B所示，圖1A是未感染對照。病毒在類似條件下也在MRC-5細胞中培養(yǎng)，在MRC-5細胞中觀察到的CHK/03/06的細胞病理效應如圖1D所示，1C是未感染對照MRC-5細胞。在BHK21細胞中病毒的cpe如圖1F所示，未感染對照BHK-21細胞如圖1E所示。在試驗的另一種候選方法中，Vero和MRC-5細胞在感染前用乂人0.01°/。到1%的低濃度化學試劑諸如胰蛋白酶處理，且使用或不使用二價離子(如鉤和鎂)。實施例3:病毒隔離群CHK/01/06和CHK/03/06的增殖病毒隔離群CHK/01/06和CHK/03/06在Vero細胞(ATCCNo.CCL-81)、BHK-21細胞和MRC-5細胞的連續(xù)細胞培養(yǎng)中擴增。感染用的培養(yǎng)基是含有0%-1%FBS的DMEM。感染48小時后，細月包病理效應接近Vero和BHK21細胞中的全部，并且病毒在細胞外培養(yǎng)基中大量出現(xiàn)。獲得了達到109/ml的病毒TCID50。病毒隔離群在Vero細胞中連續(xù)傳代23次并在連續(xù)細胞培養(yǎng)中穩(wěn)定了。在通過家鼠大腦傳代之后病毒效價大大增加。病毒感染和增殖同樣可選地在無血清培養(yǎng)基中測試。實施例4:病毒的純化從感染的Vero單細胞層中純化兩種病毒隔離群的方法包括但不限于低速離心去除大量細胞碎屑和血清組分，超速離心，蔗糖密度梯度離心和100-1000kDa的膜超濾。利用離子交換柱層析和在瓊脂糖CL4B或類似性質(zhì)的基質(zhì)中凝膠過濾來進一步純化病毒。匯集含有病毒的部分并使用包括在下面列出的一種鹽沉淀在0.020M-0.20MNaCl存在下的PEG,用HimaxTM技術(shù)沉淀，硫酸氨，明礬等。病毒粒的感染性通過Vero、BHK21和MRC-5細胞的再感染和具有傳染性來核實。濃縮的病毒在pH7.2的磷酸鹽緩沖液中懸浮以在7.5%-12%的SDS-PAGE中核實，病毒蛋白通過銀染顯現(xiàn)。病毒的高度純化也可以通過離子交換層析、疏水作用柱層析和使用鹽洗脫MonolithTM柱來實現(xiàn)。病毒制劑的純度通過SDS-PAGE凝膠銀染和使用家兔生產(chǎn)的抗CHIKV抗血清的Westernblot來核實。在Monolith陰離子交換柱上純化帶來了更高的感染性恢復。病毒的感染性在消除血清和宿主細胞對病毒的污染并能常規(guī)地獲得105到107/ml的TCID50的中試規(guī)模純化的不同步驟中也都受到監(jiān)控，并不斷進一步最優(yōu)化。實施例5:病毒制劑的純度利用SDS-PAGE來核實發(fā)現(xiàn)具有高純度。El和E2包膜糖蛋白能夠容易地檢測到。見圖2。根據(jù)通過測定病毒的感染性計數(shù)和通過在2天大小的家鼠大腦內(nèi)注射各種稀釋度的純化病毒部分所測定的，純化的病毒具有感染性。純的純化病毒和一些連續(xù)稀釋物在大腦內(nèi)注射時導致死亡。與注射PBS的對照小鼠相比，小鼠顯示出嚴重的生長遲緩，如圖3所示。實施例6:病毒的電子顯微鏡檢查超離心后的CHIK病毒的透射電子顯微鏡檢查(HitachiH-7500)通過使用2%乙酸雙氧鈾的負染色方法進行，如圖4所示。實施例7:在Vero細胞中生長的屈曲病毒隔離群CHK/01/06和CHK/03/06的遺傳一致性利用CfflK病毒隔離群的病毒基因組RNA的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)確認。病毒基因組RNA按照標準操作規(guī)程從Vero細胞中的病毒培養(yǎng)物中抽提?？俁NA使用oligodT(18mer)和屈曲病毒序列特異性引物在不同的反應中逆轉(zhuǎn)錄?？蛇x地，在逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上使用下面給出的基因特異性正向和反向引物進行PCR。使用VentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)進行PCR。CHIK病毒隔離群cDNA的一些RTPCR的例子見圖5。一些PCR反應中使用的部分正向和反向引物序列如下CHKSPFP1CHKSPFP2CHKSPFP3CHKSPRP4CHKSPRP5;，CTAAATAGGTACGCACTACAGC3，;，TGGACTCCGCGCCCTACTATC3，；;,TACTCAGGAGGCCGGTTCAC3,.;'GTGTCCCATTGTTCCAG3'GTGAACCGGCCTCCTGAGTA3'RT-PCR擴增的cDNA片斷利用雙脫氧鏈中止法測序。演繹的蛋白質(zhì)序列使用通用遺傳密碼確定。屈曲病毒基因組附加區(qū)域的序列用其它基因特異性引物擴增，擴增的DNA的序列利用雙脫氧鏈中止法確定。RT-PCR產(chǎn)物的序列確認了屈曲病毒隔離群的一致性。實施例8:病毒的熱滅活CHK/03/06隔離群的純化病毒粒在溫度范圍50。C到60。C內(nèi)熱滅活30-60min。病毒粒的感染性通過Vero細胞的再感染來核實。沒有再感染被觀察到。實施例9:病毒的化學滅活CHK/03/06隔離群的純化病毒粒使用包括但不限于下列任一種方法來滅活37匸下在濃度范圍從0.01%到0.5%的福爾馬林(曱醛)中滅活2小時，然后在4。C下培養(yǎng)48-96小時。在各種濃度的福爾馬林中滅活的病毒粒在至少三次連續(xù)傳代后再感染Vero細胞時不具有感染性。在一種可選擇的滅活方法中，純化病毒粒在37。C下用BPL:病毒范圍從l:500到1:3000的不同濃度P-丙內(nèi)酯(BPL)滅活2小時，然后在4。C下培養(yǎng)48-200小時的不同時間區(qū)間。BPL:病毒比率為1:500稀釋度到1:1000稀釋度的病毒在三次連續(xù)傳代后沒有觀察到病毒的再感染。在22。C下持續(xù)48-96小時的可變小時數(shù)也能成功進行病毒的滅活。在濃度范圍且測試不同時間長度，福爾馬林和(3-丙內(nèi)酯滅活的病毒粒都沒有觀察到感染性。實施例10:病毒感染效價的測定CHK/03/06隔離群的病毒感染效價通過4吏用Vero細胞的空斑計數(shù)方法以PFUs(plaque-formingunits/ml，空斑形成單位/ml)計數(shù)并采用標準操作規(guī)程確定TCID50(Tissuecultureinfectiousdose，組織培養(yǎng)感染劑量)來計數(shù)?？瞻咭?6-48小時之前準備好，而效價要在30-48小時之前確定。在Vero細胞中，不同傳代數(shù)的Vero適應的病毒產(chǎn)生的效價達到108.5TCID50/ml。將病毒在2天大小的小鼠腦中傳代后觀察到效價升高。病毒從Vero細胞中傳代的2個樣本中斑純化。實施例11:病毒免疫原性的確定CHK/03/06隔離群的屈曲病毒抗原量通過使用BCA方法的蛋白質(zhì)評價和使用家兔抗-屈曲病毒抗血清的ELISA來測定。多克隆抗體通過對家兔皮內(nèi)/皮下/肌肉內(nèi)注射100mg純化的屈曲病毒chk/03/06隔離群并在首次抗原服用7-14天后注射類似抗原量作為加強劑量來生產(chǎn)。從BHK21細胞純化的病毒的單次劑量注射帶來大約6400的ELISA效價，以及通過病毒中和測定的大于80的效價，與之相比正常家兔血清約4。4份康復期的人類抗血清樣本提供了80-240的不同的效價，而對照人類血清提供的效價約為4。也獲得了抗病毒的CHK/01/06和CHK/03/06隔離群的抗血清。根據(jù)采用ELISA和體外中和檢測所測定的，觀察到了良好的血清轉(zhuǎn)化。在單次加強注射之后觀察到的中和測定效價更高。實施例12:血凝反應和血凝抑制反應血凝反應效價采用標準方法在鵝紅細胞懸浮液中測定。家兔免疫血清和康復期人類血清釆用標準操作規(guī)程確定血凝抑制反應。家兔免疫血清和康復期人類血清都顯示出血凝抑制反應。純化病毒的HA效價高于收獲的純的病毒樣本。感染病毒樣本和連續(xù)稀釋后的純化病毒樣本的HA效價如圖6所示。實施例13:動物試驗每一組中使用15只一個月大小的Balb/c家鼠。每組動物使用約0.2ml-0.5ml/家鼠的連續(xù)稀釋的CHK/03/06隔離群疫苗制劑腹膜內(nèi)注射，不同試驗組的劑量范圍從ljiig到約200jLig。動物在首次免疫14天后進行加強。加強注射7天和14天后收集血液。每組匯集等量血清，56。C滅活補體大約30分鐘。產(chǎn)物血清在中和測試中用作免疫血清，以及用于抗體效價的ELISA測定。在一個候選實驗中，通過肌肉內(nèi)服用相似量的滅活病毒制劑。肌肉內(nèi)注射的抗體反應更強。所有劑型都含有pH6.8-7.2含150mMNaCl的40mM磷酸鹽緩沖液中伴隨氳氧化鋁的病毒抗原，50i!g/劑的寡核苷酸和不同量的賦形劑，如下面實施例提到的。實施例14:劑型在含有或不含有154mMNaCl的pH6.9-7.2的40mM磷酸鹽緩沖液中配制屈曲病毒抗原CHK/03/06制劑。病毒制劑與氬氧化鋁/磷酸鋁一起配制成液體劑型，其中含有任意一種或組合的糖例如蔗糖、麥芽糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇或山梨醇。0.5%-10%范圍，優(yōu)選0.5%to5%范圍的糖的存在使制劑具有如37。C下3周的加速穩(wěn)定性確定的良好的穩(wěn)定性。液體劑型中包括50嗎/劑劑量的寡核香酸時得到了顯著提高的抗體反應效價。類似的劑型也在pH6.8-7.2的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中測試，沒有觀察到任何區(qū)別。達到總固體量60%的高濃度的上述糖、緩沖劑和鹽使疫苗的凍干劑型具有良好的穩(wěn)定性。制劑的穩(wěn)定性在小鼠中通過效能測試來測定。實施例15:病毒抗原在原核和真核表達系統(tǒng)中的重組克隆和表達以CHK/03/06病毒隔離群作為克隆和表達序列由SEQIDNO.1到SEQIDNO.10表示的所有病毒抗原的來源。SEQIDNO.l編碼的屈曲病毒結(jié)構(gòu)多聚蛋白的完整開放閱讀框通過病毒基因組RNA的RT-PCR擴增，使用引物CHKCPFP作為正向引物，CHKEIRP作為反向引物，得到一條約3776bp的PCR片段。PCR片段用Ndel和BamHl消化，并克隆到原核表達載體pETllB的Ndel和BamHl位點，包含插入片段的重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a。在一個可選擇的方法中，編碼屈曲病毒結(jié)構(gòu)多聚蛋白的開放閱讀框SEQIDNO.2通過類似的方式克隆和表達，使用CHKCKOZAKFP作為正向引物，CHKE1RP2作為反向引物得到一條相似大小的片段。SEQIDNO.2用一條在5，端引入了Kozak，s共有序列的引物序列擴增以增強在真核表達系統(tǒng)中的表達。引物序列CHKCKOZAKFP含有EcoRl位點，CHKE1RP2含有HindIII和Notl位點以利于分別克隆進入斥干狀病毒載體pFastBac(InvitrogenCorporation,Carlsbad,USA)和畢赤酵母載體pPIC3.5K(InvitrogenCorporation,Carlsbad,USA)。SEQIDNO.2進一步用一條C端引物擴增，在C-末端引入6組氨酸殘基，得到SEQIDNO.3。SEQIDNO.1和SEQIDNO.2編碼SEQIDNO.4的蛋白質(zhì)。SEQIDNO.3編碼在C-末端有6組氨酸殘基的SEQIDNO.5的蛋白質(zhì)。位于SEQIDNO.5的C-末端的6-組氨酸殘基有利于表達的蛋白在Ni+親和柱上的純化。SEQIDNo.4和SEQIDNO.5都在酵母中以及Sf9細胞的桿狀病毒介導表達中表達并裝配病毒樣顆粒。用EcoRl和Not1消化相應于SEQIDNO.2和SEQIDNO.3的PCR基因片段，并按照標準操作規(guī)程凝膠純化，并克隆進入酵母表達載體pPIC3.5K(InvitrogenCorporation,Carlsbad,USA)的EcoRl和Notl位點。在用相同的引物進行PCR驗證之后挑選陽性克隆。編碼SEQIDNO.4和SEQIDNO.5的完整結(jié)構(gòu)蛋白的重組質(zhì)粒按照廠商(Invitrogen)的說明書以及它們操作規(guī)程的概述轉(zhuǎn)化進入巴氏畢赤酵母(PichiaPastoris)GS115。PCR擴增片段被克隆進入AOX1基因座并通過曱醇誘導在AOX1啟動子下表達。重組畢赤酵母菌株的克隆、篩選、分離以及克隆基因的曱醇誘導按照用戶手冊("在巴氏畢赤酵母中表達重組蛋白的方法手冊，，M版，2002年1月，源于畢赤酵母表達試劑盒，Catalog#K171(V01，InvitrogenCorporation,Carlsbad,USA)進行。通過RT-PCR擴增的SEQIDNO.2和SEQIDNO.3編碼的屈曲病毒結(jié)構(gòu)多聚蛋白的完整開放閱讀框(ORF)用EcoRl和HindIII消化，凝膠純化并克隆進入在多面體啟動子(polyhedronpromoter)控制下的pFastBac載體(InvitrogenCorporation,Carlsbad,USA)的EcoRl和HindIII位點。重組桿狀病毒載體的克隆和選擇方法在BactoBac桿狀病毒表達系統(tǒng)用戶手冊("生成用于重組蛋白高水平表達的桿狀病毒的高效位點特異性轉(zhuǎn)座系統(tǒng)"D版，2004年4月6日，InvitrogenCorporation,Carlsbad，USA)中有準確概述。簡要地說，該方法利用了諸如包含上面描述的克隆插入序列的重組pFastBac載體的表達盒的位點特異性轉(zhuǎn)座來進入大腸桿菌中增殖的桿狀病毒穿梭載體(桿粒，bacmid)。包含在多面體啟動子控制下克隆的SEQIDN0.4或SEQIDN0.5其中之一的插入片段的重組pFastBac載體轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌MaxEfficiencyDHlOBacTM感受態(tài)細胞，后者包含桿狀病毒穿梭載體(bMON14272)和有利于允許重組桿粒在含有SEQIDNO.4或SEQIDNO.5的pFastBac重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)座后高效再生的轉(zhuǎn)座的輔助質(zhì)粒(pMON7124)。重組桿粒在含有氨千青霉素、慶大霉素和卡那霉素的平^l上通過^f吏用卣代吲咮基-P-D-半乳糖香(bluo-gal)和IPTG的藍白斑篩選來選擇。重組桿粒采用與分離質(zhì)粒DNA類似的標準操作規(guī)程分離，使用CellfectinTM試劑將1|ig桿粒DNA轉(zhuǎn)染進入在Grace's昆蟲細胞培養(yǎng)基(InvitrogenCorporation,USA)中生長的Sf9昆蟲細胞。PI病毒原液的轉(zhuǎn)染、分離和滴定方法在上面給出的Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)用戶手冊中有準確描述。結(jié)構(gòu)多聚蛋白序列編碼的(如分別相應于下列序列編號SEQIDN0.6、SEQIDN0.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10的衣殼蛋白、E3、E2、6K多肽和E1結(jié)構(gòu)蛋白)每個結(jié)構(gòu)抗原的開放閱讀框通過PCR擴增，使用下面第一步擴增中的基因特異性引物。在第二步中，編碼6組氨酸殘基的反向引物被用于每個單獨基因的PCR(引物序列未給出)，并克隆進入在大腸桿菌中原核表達的pETllB載體和在昆蟲細胞中桿狀病毒介導表達的pFastBac載體。一些原本為大腸桿菌和桿狀病毒的克隆設(shè)計的PCR引物沒有克隆進入pPIC3.5K以在巴氏畢赤酵母中表達的合適限制性位點。由于在正向和反向引物中分別存在相應的限制性位點而在5，末端有EcoRl位點并在C-末端有BamHl位點的那些PCR片,殳最初克隆進入載體pBluescriptSK+的EcoRl和BamHl位點。選擇出的重組克隆用EcoRl和Notl消化，消化片段進一步按照上面的描述亞克隆進用于酵母轉(zhuǎn)化的pPIC3.5K。用于各種擴增的引物序列如下指出。在大腸桿菌中El抗原的表達和在酵母中衣殼蛋白的表達如圖8和圖9所示。引物序列1)CHKCKOZAKFP:5'ATTGAATTCACCATGGAGTTCATCCCAACCCAAAC3'2)CHKE1RP2:AACAAGCTTGCGGCCGCTTAGTGCCTGCTGAACGACACG3'3)CHKSPE3FP:5'ACCGAATTCATATGAGTCTTGCCATCCCAGTTATG3'4)CHKSPE3RP:5，TGCAAGCTTGGATCCTTAGCGTCGCTGGCGGTGGGGAG3，5)CHKSP6KFP:5'ACGGAATTCATATGGCCACATACCAAGAGGCTGCG3'6)CHKSP6KRP:5'ATTAAGCTTGGATCCTTAGGTGCCCACACTGTGAGCGC3'7)CHKCPFP:5，ACAGAATTCATATGGAGTTCATCCCAACCCAAAC3'8)CHKCPRP:5'ATTAAGCTTGGATCCTTACCACTCTTCGGCCCCCTCGGGG9)CHKE1FP:5'TAGAATTCATATGTACGAACACGTAACAGTGATCC3'10)CHKE1RP:5'TATAAGCTTGGATCCTTAGTGCCTGCTGAACGACACGC3'11)CHKE2FP:5'TCGGAATTCATATGAGCACCAAGGACAACTTCAATGTC3'12)CHKE2RP:5'TCCAAGCTTGGATCCTTACGCTTTAGCTGTTCTGATGCAGC實施例16:原核或真核表達系統(tǒng)中表達的重組抗原都能用于諸如ELISA的診斷目的。ELISA用滅活全病毒和用家兔抗血清來建立。相似的技術(shù)也能使用純化的重組抗原代替全病毒抗原來建立。針對病毒抗原尤其是結(jié)構(gòu)抗原的多克隆抗血清或單克隆抗體能夠被用作免疫治療試劑。參考文獻1.BanerjeeK和RanadiveSN.1988.OligonucleotidefingerprintingofChikungunyavirusstrains.Ind.J.Med.Res.87531-541.2.BedekarSD和PavriKM.1969a.StudieswithChikungunyavirus.PartI.Susceptibilityofbirdsandsmallmammals.Ind.J.Med.Res.571181-1192.3.BedekarSD和PavriKM.1969b.StudieswithChikungunyavirus.PartII.SerologiaclsurveyofhumansandanimalsinIndia.Ind.J.Med.Res.57:1193-1197.4.CasalsJ.1957.Thearthropoctbornegroupofanimalviruses.Trans.N.Y.Acad.Sci.19:219-235.5.ChainMMT,DoaneRW和McLeanDM.1966.MorphologicaldevelopmentofChikungunyavirus.Can.J.Microbiol.12895-899.6.ChakravarthySK和SarkarJK.1969.SusceptibilityofnewbornandadultlaboratoryanimalstoChikungunyavirus.Ind.J.Med.Res.571157-1164.7.ChaturvediUC,MehrotraNK，MathurA，KapoorAK和MehrotraRM.1970.ChikungunyavirusHIantibodiesinthepopulationofLucknowandKanpur.Ind.Jour.Med.Res.58:297-301.8.EckelsKH，HarrisonVR和HetrickFM.1970.ChikungunyavirusvaccinepreparedbyTween-etherextraction.AppliedMicrobiol.1ft321-325.9.EdelmanR,TacketCO,WassermanSS,BodisonSA,PerryJG和MagniaficoJA.2000.PhaseIIsafetyandimmunogenicitystudyoflivechikungunyavirusvaccineTStGSD-218.Am.J.Trop.Med.Hyg.62:681-685.10.FauquetCM,MayoMA，ManiloffJ，DesselbergerJ和BallLA(Eds.).2005.8thReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses.11.GiovarelliM，VianoI,ZuccaM，ValbonesiR和DianzaniF.1977.Effectofanti--chain-specificimmunosuppressiononChikungunyavirusencephalitisofmice.Infect.Immun.16849-852.12.HahonN和HankinsWA.1970.AssayforChikungunyavirusincellmonolayersbyimmunofluorescence.AppliedMicrobiol.19t224-231.13.HahonN和ZimmermanWD.1970.Chikungunyavirusinfectionofcellmonolayersbycell-to-cellandextracellulartransmission.AppliedMicrobiol.19:389-391.14.Hannoun.1968.Arbovirushaemgglutininsdifferentialsusceptibilitytotrypsin.Nature219:753-755.15.HarrisonVR，BinnLN和RandallR.1967.Comparativeimmunogenicitiesofchikungunyavaccinespreparedinavianandmammaliantissues.Amer.J.Trop.Med.Hyg.16:786-791.16.HarrisonVR,EckelsKH,BartelloniPJ和HamptonC.1971.Productionandevaluationofaformaliivkilledchikungunyavaccine.J.Immunol.107:643-647.17.HeamHJ和RaineyCT.1963.Cross^protectioninaminalsinfectedwithgroupAarboviruses.J.Immunol.90t720-724.18.HeiseMT，SimpsonDA和JohnstonJE.2000.Sindbi&groupalphavirusreplicationinperiosteumandendosteumoflongbonesinadultmice.J.Virol.74:9294-9299.19.HigashiN，MatsumotoA，TabataK和NagatomoY.1967.ElectronmicroscopestudyofdevelopmentofChikungunyavirusingreenmonkeykidneystable(Vero)cells.Virology3355-69.20.KhanAH,MoritaK,ParquetMC,HasebeF，MathengeEGM和IgarashiA.2002.Completenucleotidesequenceofchikungunyavirusandevidenceforaninternalpolyadenylationsite.J.Gen.Virol.833075-3084.21.KillingtonRA,StokesA和HierholzerJC.1996.Viruspurification.In"Virologymethodsmanual,"MahyBWJandKangro(Eds).AcademicPress,SanDiego,CA，pp71-89.22.KlienF，MahlandtBG，CockeyRR和LincolnRE.1970.ConcentrationofRiftvalleyfeverandChikungunyavirusesbyprecipitation.AppliedMicrobiol.20t346-350.23.LanciottiRS，LudwigML,RwagumaEB,LutwamaJJ，KramTM等1998.EmergenceofepidemicO'nyong^nyongfeverinUgandaaftera35-yearabsence:geneticcharacterizationofthevirus.Virology252:252-268.24.LevittNH，RamsburgHH,HastySE，RepikPM，ColeFEJr和LuptonHW.1986.Developmentofanattenuatedstrainofchikungunyavirusforuseinvaccineproduction.Vaccine4:157-162.25.McClainDJ,PittmanPR，RamsburgHH,NelsonGO,FtossiCA,MangiaficoJA,SchmaljohnAL和MalinoskiFJ.1998.Immunologicinterferencefromsequentialadministrationofliveattenuatedalphavirusvaccines.J.Infect.Dis.177:634-641.26.McintoshBM，PatersonHE,McGillivrayG和DeSousaJ.FurtherstudiesontheChikungunyaoutbreakinSouthernRhodesiain1962.I,Mosquitoes,wildprimatesandbirdsinrelationtotheepidemic.Ann.Trop.Med.Parasitol.58:45-51.27.MyersRM,CareyDE,ReubenR,JesudassES,DeRanitzC,JadhavM.1965.The1964epidemicofDengue-likefeverinSouthIndia:isolationofChikungunyavirusfromhumanseraandfrommosquitoes.Ind.J.Med.Res.53:694-701.28.NimmannityaS，HalsteadSB,CohenSN和MargiottaMR.1969.DengueandchikungunyavirusinfectioninmaninThailand,1962-1964.I,Observationsonhospitalizedpatientswithhemorrhagicfever.Am.J.Trop.Med.Hyg.18:954-971.29.ParksJJ和PriceWJ.1958.Studiesonimmunologicoverlapamongcertainarthropod-borneviruses.Am.J.Trop.Med.Hyg.67:187-206.30.PaulSD和SinghKRR1968.ExperimentalinfectionofMacacaradiatawithChikungunyavirusandtransmissionofvirusbymosquitoes.Ind.J.Med.Res.56:802-810.31.PorterfieldJS.1961.Cross^neutralizationstudieswithgroupAarthropod-borneviruses.BullWHO24:735-741.32.PowersAM，BraultAC,TeshRB和WeaverSC.2000.Re-emergenceofchikungunyaando'nyong^nyongviruses: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