專利名稱：：調(diào)控性核酸元件的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明是關于稱為TE元件的順式活性核酸序列。TE元件優(yōu)選是源自CHO基因組。將其用于(例如)穩(wěn)定細胞群中的表達載體中可使所要染色體基因座中目的基因(GOI)的表達與先前所用的載體相比至少高兩倍。
背景技術：
：哺乳動物細胞為產(chǎn)生復雜生物藥蛋白質(zhì)的優(yōu)選宿主細胞，因為翻譯后修飾在功能上及從藥物動力學觀點來看與人類相容。主要相關細胞類型為融合瘤細胞、骨髓瘤細胞、CHO(中國倉鼠卵巢)細胞及BHK(幼倉鼠腎)細胞。培養(yǎng)宿主細胞逐漸在無血清及無蛋白質(zhì)的產(chǎn)生條件下進行。其緣由為成本相應降低、純化重組蛋白中的干擾減少及引入病原體(例如朊病毒及病毒)的可能性降低。使用CHO細胞作為宿主細胞變得越來越普遍，因為此等細胞適于懸浮生長于無血清及無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中，而且被管理當局視為及接受為安全的制造性細胞。為產(chǎn)生表達目的異源基因的穩(wěn)定哺乳動物細胞系，通常將異源基因與可選擇標記基因(諸如新霉素磷酸轉移酶(NPT))—起通過轉染引入所要細胞系內(nèi)。異源基因及可選擇標記基因可在宿主細胞中自單個載體或自分開共轉染的載體起始而被表達。轉染后兩至三天，將經(jīng)轉染的細胞轉移至含有選擇劑(例如當使用新霉素磷酸轉移酶基因(NPT基因)時為G418)的培養(yǎng)基中，且在此等選擇性條件下培養(yǎng)數(shù)周。將整合有外源DNA的所得高度生長的耐藥性細胞分離，且研究所要的基因產(chǎn)物(目的基因)的表達。生物藥制造需要具有高產(chǎn)率和穩(wěn)定產(chǎn)率的細胞系。用于制造性細胞的表達載體具有諸如CMV增強子及啟動子的強的、一般情況下是組成型的表達啟動子及增強子，以便可實現(xiàn)高產(chǎn)物表達。由于必須保證在盡可能長的時間內(nèi)表達產(chǎn)物，因此應選擇基因組內(nèi)已穩(wěn)定整合產(chǎn)物基因的細胞。此舉可利用可選擇標記(諸如新霉素磷酸轉移酶(NPT)及二氫葉酸還原酶(DHFR))來實現(xiàn)。通過表達載體宿主細胞基因組中的隨機整合，人們獲得具有不同表達量的所需要的基因產(chǎn)物細胞，因為其表達不僅僅由前置啟動子或啟動子/增強子組合的強度來決定。整合位點處存在的染色質(zhì)結構可對表達量具有負面與正面影響。因此，越來越多地將在染色質(zhì)水平上正面影響表達的順式活性元件整合至表達載體中。此等元件包括存在于(例如)P-球蛋白基因的5，區(qū)中(Li等人，2002)及TCRa基因的3'區(qū)中的基因座控制區(qū)(LCR)。其促使偶聯(lián)轉基因在染色質(zhì)中高組織特異性表達，此表達的特征為其不取決于位置而取決于拷貝數(shù)。此等特性表明LCR能夠使其天然組織中的染色質(zhì)開放(Ortiz等人，1997)。在各種形式的(3-地中海貧血癥中，P-球蛋白基因座完整但不表達。缺乏表達的原因為P-球蛋白基因的5'方向上的嚴重缺失。此(3-球蛋白LCR的缺失導致遍布整個基因座的封閉染色質(zhì)構型，且導致基因表達的抑制(Li等人，2002)。LCR與表達細胞染色質(zhì)中的DNAseI-超敏位點(HS)位置重疊。存在HS亦表明開放的染色質(zhì)。HS含有一系列針對轉錄因子的不同的一般性結合位點及組織特異性結合位點。轉錄因子與DNA相互作用而產(chǎn)生HS的開放染色質(zhì)結構(Li等人，2002)。已知許多LCR是由多個HS組成，HS的功能或多或少彼此有別。舉例而言，TCRa基因僅在T細胞組織中在內(nèi)源性控制下表達。視組織及表達狀況而定，基因座可以各種染色質(zhì)模式存在。在3，區(qū)中，其具有含8個HS的基因座控制區(qū)。HS2-6(LCR的6kb部分片段)具有染色質(zhì)開放活性且無組織特異性。HS7、HS8及HS1(3kb)使胸腺中的T細胞特異性表達具有組織特異性。僅在所有HS的完全組合的情況下，TCRaLCR才具有完全功能(Ortiz等人，1997)。TCRaLCR的個別HS功能的更明確的細分及說明可見于Ortiz等人，1999中。此實例表明LCR在功能上極其復雜且可由不同控制元件(諸如增強子、靜止子及隔離子)組成。劃分各種結構域之間的LCR功能的其他實例為TCRy基因座及卩-球蛋白基因座。前者是由DNAseI-超敏位點HsA及增強子3，ECYl組成。亦認為TCRy-LCR除具有其一般功能外亦在TCRy基因重組中發(fā)揮一定作用(Baker等人，1999)。|3-球蛋白基因座具有5種具有可區(qū)分功能的HS,其亦需要組織特異性啟動子以便充分行使功能。由于DNA曱基化作用導致封閉的染色質(zhì)結構且使基因失活，因此LCR亦可能在DNA的組織特異性去曱基化作用中發(fā)揮額外重要作用。通過增強組蛋白乙?；饔脕砘罨虮磉_的活化機制亦有可能(Li等人，2002)。骨架/基質(zhì)結合區(qū)(S/MAR)為以高親和力在活體外結合細胞核的基質(zhì)或骨架的組份的DNA序列。其形成染色質(zhì)結構域的結構性邊界且亦可能形成染色質(zhì)結構域的功能性邊界(Zahn-Zabal等人，2001)。S/MAR能夠與增強子相互作用且能夠局部增加染色質(zhì)中DNA的可及性，且由此可增加穩(wěn)定整合的異源基因在細胞系中、轉基因動物及植物中的表達(Klehr等人，1991;Stief等人，1989;Jenuwein等人，1997;Zahn-Zabal等人，2001)。然而，其不能完全保護染色體基因座免受鄰近元件的影響以便可實現(xiàn)位置獨立性表達(Poljak等人，1994)。MAR的作用可被利用，以增加在轉染實驗中(高)表達細胞克隆或轉基因動物的比例(McKnight等人，I"2;Zahn-Zabal等人，2001)。然而，亦有報導MAR不賦予高表達，但在發(fā)育特異性基因的正確調(diào)控中發(fā)揮重要作用(McKnight等人，1992)。隔離子定義為相互影響的相鄰區(qū)域之間的中性邊界，例如活性與非活性染色質(zhì)之間的中性邊界(邊界元件)。其可限制增強子的作用或隔離與其相抵的整個DNA結構域，且保護經(jīng)穩(wěn)定轉染的報導基因免受位置效應影響(Bell及Felsenfeld，1999;Udvardy，1999)。因此，此等元件可使得表達與基因組位置無關。其亦可防止無選擇壓力的情況下的轉基因靜止(Pikaart等人，1998)。隔離子的另一推測功能為限制復制范圍(Bell及Felsenfeld,1999)。最先被描述的隔離子為源自果蠅(Drosophila)的scs及scs，。其構成hsp70熱休克基因的邊界且抑制位置效應(Udvardy等人，1985)。已發(fā)現(xiàn)含有CpG島，源自^2々基因(中國倉鼠)的富含GC的片段為另一具有隔離功能的元件(Poljak等人，1994)。該片段單獨對報導基因表達不呈現(xiàn)任何影響。然而，該片段位于表達促進SAR與報導基因之間，能夠很大程度上阻礙SAR元件的增強表達作用?？赡艽烁缓珿C的片段阻斷SAR元件的染色質(zhì)開放機制且因而充當隔離子。具有伸長CPG島的元件曱基化的可能性較高，因為其可由DNA曱基轉移酶識別，該酶使胞嘧啶轉化成5-曱基胞嘧啶的。從而形成非活性染色質(zhì)(Poljak等人，1994)。在人類ADA基因(腺香脫氨酶)的第一內(nèi)含子中，Aronow與其同事定義一種新的調(diào)控元件，其主要促進取決于基因拷貝數(shù)但與位置無關的表達(Aronow等人，1995)。該元件長達1kb,且僅在其側接200bp的T細胞特異性增強子時才行使功能。若兩個片段中僅有一個存在，或若該等片段在序列及取向上排列錯誤，則該元件無功能性，因為這阻礙了增強子上DNaseI-超敏位點的形成。CobraTherapeutics公司在其專利WO02/081677中描述另一種影響染色質(zhì)的元件。遍在性染色質(zhì)開力文元件(UbiquitousChromatinOpeningElements,dUCOE)是具有遍在性表達的管家基因(人類hnRNPA2基因、人類p-肌動蛋白基因、人類PDCD2基因)的染色體區(qū)域中形成開放染色質(zhì)結構的原因。所有此等基因在曱基化相對較弱的未翻譯區(qū)中具有富含CpG的烏。CpG鳥未經(jīng)曱基化表明此處存在活性染色質(zhì)。UCOE有助于提供不依賴于基因組環(huán)境胞或組織的性質(zhì)的表達強度。Immunex公司亦描述可增加表達的順式活性DNA序歹'j(US6,027,915、US6，309，851)。稱為表達增強序列元4牛(ExpressionAugmentingSequenceElement,EASE)的該元件推動重組蛋白在哺乳動物細胞中的高度表達，在瞬間表達系統(tǒng)中無活性，且不具有可見于LCR及S/MAR的典型序列特性。由于其不含有開放閱讀框架，因此其亦不是編碼反式活性蛋白質(zhì)的序列。該片段長為14.5kb，源自CHO細胞的基因組DNA且可使經(jīng)穩(wěn)定整合的報導基因的表達增加8倍。該元件超過50%的活性局限于1.8kb長的片段，而此片段的前600個堿基對是正確功能所必需的。具有高EASE活性的序列部分的額外特性為存在多個HMG-I(Y)結合位點。HMG-I(Y)蛋白屬于高活動性組非組蛋白染色質(zhì)蛋白的家族。其亦稱為"結構型轉錄因子"且形成哺乳動物基因的新類別反式調(diào)控子。HMG-I(Y)蛋白識別富含GC的序列且以其所謂的AT鉤(DNA結合結構域)結合在小DNA溝中。此可導致DNA拓樸發(fā)生局部變化且從而導致基因表達改變。美國專利6，309，841的作者推測EASE的作用與MTX誘導的經(jīng)整合質(zhì)粒的擴增有關。在MTX誘導的基因擴增中，存在所謂的斷裂-融合-橋接循環(huán)。易推測HMG-I(Y)蛋白在導致DNA斷裂形成及移除的DNA結構變化中的作用。用于增加哺乳動物細胞中基因表達的其他元件描述于Kwaks等人，2003中。此等所謂的STAR元件(Simulatoryand厶nti-RepressorElements)可由篩選具有500至2100bpDNA片段的人類基因文庫而得到。篩選使用特定設計的報導質(zhì)粒來進行。報導基因僅當其與人類基因庫的抗抑制物元件在功能上連接時才可能表達。以由此所獲得的STAR元件，作者能夠保護轉基因免受哺乳動物細胞基因組中的位置效應影響。與小鼠基因組的比較表明大部分此等STAR元件在人類基因組與鼠科基因組中均存在，且在此等兩物種內(nèi)為高度保守的。建立高度表達所要蛋白質(zhì)的細胞系的主要問題在于重組載體隨機及無定向整合至宿主細胞基因組的轉錄活性基因座或轉錄非活性基因座中。因此，獲得展示完全不同的異源基因表達率的細胞群，而細胞產(chǎn)率通常遵循正態(tài)分布。為鑒別極高度表達目的異源基因的細胞克隆，因此必需檢查及測試大量克隆，從而導致時間、勞力及成本的高消耗。因此，對用于轉染的載體系統(tǒng)加以改良的努力旨在通過使用適當?shù)捻樖交钚栽紫仍试S、其次增強經(jīng)穩(wěn)定整合的轉殖基因的轉錄。在染色質(zhì)水平發(fā)揮作用的順式活性元件包括(例如)已描述的基因座控制區(qū)、骨架-基質(zhì)結合區(qū)、隔離子等。一些此等元件保護特定基因免受周圍染色質(zhì)影響。其他元件呈現(xiàn)增強子樣活性，但此局限于經(jīng)穩(wěn)定整合的構建體。另外的元件集數(shù)種此等功能于一身。通常不能明顯地將其確切歸類于特定群組。在穩(wěn)定細胞系中，轉基因產(chǎn)物基因的表達如此在很大程度上受染色體位置效應制約。此現(xiàn)象是基于染色質(zhì)結構的影響和/或在外來DNA整合位點處存在內(nèi)在調(diào)控元件。此導致表達量差異極大。因此，在細胞選擇期間，常產(chǎn)生產(chǎn)物表達極低或完全無產(chǎn)物表達的克隆。此等染色體位置效應亦為產(chǎn)生表達高含量治療性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定制造性細胞系通常為耗時、高產(chǎn)能消耗且昂貴的過程的原因。具有高產(chǎn)率的穩(wěn)定細胞系一般是通過利用通常與藥劑誘導的基因擴增相組合的陽性可選擇標記(例如二氫葉酸還原酶/曱氨蝶呤(methotrexate)或谷氨酰胺合成酶/曱硫氨酸磺基肟(methioninesulfoximine)進行選擇來制得。將用此選擇策略制得的細胞池及克隆以復雜篩選方法對高度和穩(wěn)定表達進行研究。大部分克隆不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生平均量的產(chǎn)物，而僅有少數(shù)克隆為高產(chǎn)者?；旌先褐懈弋a(chǎn)者的比例可(例如)通過可選擇標記的突變來增加(Sautter及Enenkel，2005,WO2004/050884)。然而，需要進一步增加各個別克隆的比產(chǎn)率(specificproductivity)以及經(jīng)轉染的細胞群內(nèi)高產(chǎn)者的比例。應增加經(jīng)穩(wěn)定轉染的細胞，尤其是CHO細胞或其他制造相關性細胞的比產(chǎn)率及轉染批次中的高產(chǎn)者的比例。此應形成對更有效率的細胞系的最新研發(fā)。因此，可在較短時間內(nèi)建立更多較高產(chǎn)率的細胞系且從而節(jié)省勞力、時間及成本。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是關于可使目的基因在經(jīng)穩(wěn)定轉染的細胞中的轉錄或表達增加的、稱為"TE元件"的調(diào)控核酸，尤其是具有SEQIDNo.1的核酸，或其片段或衍生物。令人驚奇的是已展示在穩(wěn)定整合至宿主基因組(諸如CHO-DG44基因組)中的表達載體上與啟動子、產(chǎn)物基因、可選擇標記及任選增強子一起使用此種TE元件(例如)可克服、遮蔽或消除染色體位置效應。因此，使轉染批次中高產(chǎn)者的比例以及絕對表達量均增加。本發(fā)明進一步是關于含有以下各物的表達載體SEQIDNo.1的轉錄或表達增加區(qū)、片段或衍生物，優(yōu)選為TE元件TE-00(SEQIDNo.2)、TE-01(SEQIDNo.3)、TE-02(SEQIDNo.4)、TE-03(SEQIDNo.5)、TE-04(SEQIDNo.6)、TE-06(SEQIDNo.8)、TE-07(SEQIDNo.9)、TE-08(SEQIDNo.10)、TE-IO(SEQIDNo.12)、TE-11(SEQIDNo.13)、TE-12(SEQIDNo.14)、TE-13(SEQIDNo.15)、TE-14(SEQIDNo.16)、TE-15(SEQIDNo.17)、TE-16(SEQIDNo.18)、TE-17(SEQIDNo.19)、TE-18(SEQIDNo.20)和TE-21(SEQIDNo.21)。TE-06、TE-07、TE-08及TE-13因尺寸小而尤其優(yōu)選。SEQIDNo.1源自位于自CHO-細胞所分離的遍在蛋白/S27a基因的編碼區(qū)上游的序列區(qū)，該基因編碼細胞核糖體代謝中的必需蛋白質(zhì)。與迄今所用的表達載體相比，將順式活性TE元件額外引入表達載體中可使經(jīng)穩(wěn)定轉染的細胞池，尤其是CHO-DG44細胞池的產(chǎn)率高出多達7倍。另一方面，在CHO-DG44細胞池的瞬間轉染中，引入TE元件不能實現(xiàn)產(chǎn)率提高。因此，在穩(wěn)定細胞池中所觀測到的產(chǎn)率提高并非基于存在于TE元件中的增強子。因此，染色體整合是TE元件引起產(chǎn)率提高所絕對必需的。此表明TE元件可抑制、遮蔽或消除染色體位置負面效應。因此，已制造且鑒別順式活性元件，其特征在于特別適用于選擇及富集高產(chǎn)率細胞且因此能夠減少分離及鑒別高產(chǎn)克隆中時間、成本及產(chǎn)能的消耗。本發(fā)明的可能應用包括研發(fā)高產(chǎn)細胞系，其在(例如)制造生物藥、基于細胞的分析性檢定、高產(chǎn)量物質(zhì)篩選或制造用于NMR光譜分析、其他檢定的重組蛋白產(chǎn)物等中是需要的。由于較高的比產(chǎn)率及幾乎不表達或不表達產(chǎn)物的細胞減少，因此可在較短時間內(nèi)建立更多較高產(chǎn)率的細胞從而節(jié)省勞力及成本。其他可能應用為制造穩(wěn)定的、改良的宿主細胞系(例如，引入抗細胞凋亡或糖基化基因)、轉基因動物或植物，及在基因治療中的應用。本發(fā)明并非來源于先前技術。具有SEQIDNo.1的核酸為自中國倉鼠(CWcefw/wgniew)基因組分離的核酸序列。其來自位于遍在蛋白/S27a基因的編碼區(qū)上游的序列區(qū)。具有SEQIDNo.l的核酸具有44%的平均GC含量且不含有任何更冗長的GC重復序列段。此GC含量與針對哺乳動物基因組DNA所述的約40%的平均GC含量相當(Delgado等人，1998)。用newcpgseek(EMBOSS序列分析軟件包)尋找GC豐富區(qū)，僅得到五個^常短的序列區(qū)域，其具有絕對提高的CpG二聚體頻率和/或與GpC相比提高的CpG比例SEQIDNo.l的核苦酸2242-2259(18bp)、3129-3146(18bp)、3215-3240(26bp)、3417-3461(44bp)和3658-3788(131bp)。該搜索結果顯示，該核酸序列不含延長的CpG島。此外，SEQIDNo.1還含有兩個串聯(lián)重復序列(核苦酸2179-2244和核苦酸1027-1080)以及兩個反向重復序列(核普酸8-47和核普酸1726-1766)，其利用EMBOSS程序凈皮鑒定為是串聯(lián)和反向重復的(etandemandeinverted)。TE-08相應含有一個反向重復序列。在1bp到1578bp之間的序列區(qū)域中，相應地存在一個串聯(lián)重復序列和一個反向重復序列。具有SEQIDNo.l的核酸的一部分已描述于WO97/15664中SEQIDNo.l的核苷酸1579至3788對應于WO97/15664中的SEQIDNo.5的核苷酸1至2201,但有差異。在根據(jù)本發(fā)明的SEQIDNo.l制備期間，將4個額外核苷酸通過克隆方法引入，此由填補現(xiàn)存ECORI切割位點的反應來形成。此額外4個核苷酸的插入發(fā)生于WO97/15664中的序列SEQIDNo.5的核香酸357與358之間。然而，本發(fā)明的具有SEQIDNo.l的核酸序列的核苦酸1至1578組成新穎的迄今未知的序列區(qū)，其在本發(fā)明的范圍為經(jīng)分離的。此夕卜，WO97/15664未揭示本發(fā)明的SEQIDNo.l或其片段或衍生物在與啟動子/增強子組合(該啟動子/增強子組合使得功能上連接的目的基因可轉錄)在功能上連接時，可增加目的基因的轉錄或表達，而此與染色體整合位點無關。更確切言之，WO97/15664揭示使用遍在蛋白/S27a基因的5'UTR序列作為啟動子，而根據(jù)WO97/15664中圖5的位置-161至-45的序列區(qū)是啟動子活性所必需的。此序列區(qū)僅部分存在于本發(fā)明的SEQIDNo.l的核酸及自其衍生而得具有SEQIDNo.2的片段(根據(jù)WO97/15664中圖5的位置-161至-89)中。SEQIDNo.1的其他片段及衍生物完全不含此序列區(qū)。此外，當使用標準比對演算法(諸如BLAST時)，本發(fā)明的SEQIDNo.l的核酸不與以下專利申請案中所述的核酸序列展示出序列同源性，以下序列亦可以順式在染色質(zhì)水平正面影響表達a)WO00/05393中的UCOE核酸序列b)US6,309,841中的EASE核酸序列c)WO03/004704中的STAR核酸序列。甚至使用更復雜的比對策略，也沒有找到與a)-c)的這些核酸序列之間延展的序列同源性。圖1:基本載體的示意圖使用A所示的載體在CHO-DG44細胞中表達重組單克隆IgGl抗體。在此情況下，"E/P"為CMV增強子與倉鼠遍在蛋白/S27a啟動子的組合，"P，，僅為啟動子元件且"T"為經(jīng)轉錄mRNA的多聚腺苷酸化所必需的轉錄終止信號。各轉錄單元內(nèi)轉錄起始的位置及方向由箭頭指示。對于克隆TE元件，Spel切割位點("Spel")存在于啟動子/增強子組合之前?？蓴U增的可選擇標記二氬葉酸還原酶縮寫為"DHFR"?？蛇x擇標記新霉素磷酸轉移酶含有點突變D227G且在圖中相應縮寫為"D227G"。源自腦心肌炎病毒的"IRES"元件充當雙順反子轉錄單元內(nèi)的內(nèi)部核糖體結合位點，且使得其后綠色熒光蛋白"GFP"可翻譯。"HC"及"LC"分別編碼人源化單克隆IgGl抗體的重鏈及輕《連。使用B所示的載體在CHO-DG44中表達重組蛋白MCP1。"E/P"為CMV增強子與CMV啟動子的組合，"P"僅為啟動子元件且"T"為經(jīng)轉錄mRNA的多聚腺香酸化所需的轉錄終止信號。各轉錄單元內(nèi)轉錄起始的位置及方向由箭頭指示。對于克隆TE元件，將具有限制性核酸內(nèi)切酶切割位點的序列區(qū)"A"(銜接子)插在啟動子之前?？蛇x擇^i己新霉素磷酸轉移酶含有點突變F204I且在圖中相應縮寫成F240I。源自腦心肌炎病毒的IRES元件充當雙順反子轉錄單元內(nèi)的內(nèi)部核糖體結合位點，且使得其后紅色熒光蛋白"dsRed"可翻譯。"MCP-1"編碼人類單核細胞趨化蛋白-l。圖2:MCP-1基本載體的示意圖4吏用此圖所示的載體在CHO-DG44細胞中表達重組蛋白MCP-1。"E/P"為CMV增強子與CMV啟動子的組合，"P"僅為啟動子元件且"T"為經(jīng)轉錄mRNA的多聚腺苦酸化所需的轉錄終止信號。各轉錄單元內(nèi)轉錄起始的位置及方向由箭頭指示。對于克隆TE元件，將具有限制性核酸內(nèi)切酶切割位點的序列區(qū)"A"(銜接子)插在啟動子之前?？蛇x擇標記二氫葉酸還原酶在圖中縮寫為"dhfr"。源自腦心肌炎病毒的IRES元件充當雙順反子轉錄單元內(nèi)的內(nèi)部核糖體結合位點，且使得其后紅色熒光蛋白"dsRed，，可翻i奪。"MCP-r編碼人類單核細胞趨化蛋白-1。圖3:CHO遍在蛋白/S27S基因的5'序列包含3788bp的序列區(qū)(SEQIDNo.l)分離自CHO(中國倉鼠卵巢)細胞的基因組，且位于Ub/S27a基因的編碼區(qū)上游，該基因為遍在蛋白單元(Ub)與小核糖體亞單元的核糖體蛋白(S27a)的融合體。圖4:TE元件00至12的圖示此圖示意性展示亞克隆于質(zhì)粒中，位于CHO遍在蛋白/S27a基因的編碼區(qū)上游的3788bp的基因組序列區(qū)。由此基因組序列(SEQIDNo.l)(亦稱為TE元件A)，可制備不同長度的部分片段(下文稱TE元件)。TE元件00(SEQIDNo.2)是自此序列的亞克隆中作為SacII限制性片段分離的，且被克隆至目標載體pBID-HC及pBING-LC的Spel切割位點。此等載體含有IgGI的重鏈(HC)或輕鏈的基因(參見圖1A)。因此，形成表達載本，其中TE元件00以順向及逆向定位于啟動子上游。TE元件01至12可使用多種引物對(參見圖5及6)通過PCR制得，且經(jīng)由BamHI/BsrGI克隆至基本質(zhì)粒pTE4/MCP-l(圖1B)及pTE5/MCP-l(圖2)中。圖5:TE元件00至12此表展示由TE-A序列(SEQIDNo.l)制得的TE元件00至21的尺寸及起始位置與末端位置。對于通過PCR制得的片段，另外給出所用引物。元件的尺寸等級為約500bp，且與起始序列TE-A(SEQIDNo.l)相比在5'端或3'端具有缺失。圖6:用于合成TE元件01至12的引物此等引物以5，-3'方向展示。名稱中具有"順向"的引物為與SEQIDNo.l順向的引物，具有"逆向"的引物為逆向的引物。各引物由以下各物組成5'端6個任意核苦酸，其后為BamHI或BsrGI切割位點及與SEQIDNo.l中的序列的一部分100%同源的約20至30個核苷酸的序列。引物中與SEQIDNo.l同源的區(qū)域展示為粗體。使用一個順向引物及一個逆向引物擴增SEQIDNo.1的序列區(qū)。將所得PCR產(chǎn)物經(jīng)由BamHI及BsrGI克隆至基本質(zhì)粒pTE4/MCP-l(圖1B)或pTE5/MCP-l(圖2)中。圖7:轉染系列B的FACS測量此圖展示與無TE元件00的細胞相比，在具有TE元件00的細胞中GFP表達的相對增強。對此，將CHO-DG4細胞用質(zhì)粒組合pBING-LC與pBID-HC轉染，該等組合彼此間不同之處僅為TE元件00的存在及取向。在于無HT的培養(yǎng)基中經(jīng)由添加G418對經(jīng)轉染的細胞池進行長達兩至三周的選擇后，通過FACS分析法測量GFP焚光。除作為陰性對照的未經(jīng)轉染的CHO-DG44細胞(DG44)外，各曲線圖由各情況下轉染系列B的10個池的GFP熒光值的平均值組成。每池研究20000個細胞。"對照"表示基本質(zhì)粒pBING-LC與pBID-HC,"逆向，，表示基本載體中TE元件00為逆向，而"順向"指示基本載體中TE元件00為順向。圖8:轉染系列C的FACS測量此圖展示與不含有TE元件的細胞群中的細胞相比，含有TE元件01、02、05、06、08或09的穩(wěn)定細胞群中表達dsRed2細胞的比例。對此，將CHO-DG44細胞用質(zhì)粒pTE4/MCP-l或由其所獲得的額外含有上述TE元件之一的衍生物轉染。在于添加G418的培養(yǎng)基中對經(jīng)轉染的細胞池進行長達約三周的選擇后，通過FACS分析法測量dsRed2焚光。每池測量10000個細胞且減去未經(jīng)轉染的CHO-DG44細胞的固有熒光值。各值為轉染系列C的6個池的表達dsRed2的細胞的平均百分比。圖9:TE元件對比產(chǎn)率的影響此圖以圖示(A)或表格形式(B)展示，與無TE元件的對照池相比，IgGl或MCP-1的表達量因存在TE元件而獲得的變化。細胞池是通過用基本質(zhì)粒pBING-LC及pBID-HC或pTE4/MCP-l("對照")及由其所獲得的衍生物穩(wěn)定轉染CHO-DG44細胞而制得，各衍生物額外含有TE元件(順向"oo")("oo順向，，)及逆向"oo"("oo逆向，，)、"or至"12")。在于無HT的培養(yǎng)基中經(jīng)由添加G418(系列A及B)或于含HT的培養(yǎng)基中經(jīng)由添加G418(系列C及D)對經(jīng)轉染的細胞池進行長達兩至三周的選擇后，通過ELISA測量細胞培養(yǎng)物上清液中的蛋白質(zhì)表達且計算每天每個細胞的比產(chǎn)率。經(jīng)由在75cn^T形燒瓶中，以2-2-3天的傳代節(jié)律數(shù)次傳代進行經(jīng)穩(wěn)定轉染的CHO-DG44細胞的培養(yǎng)。在系列A中，經(jīng)8次傳代培養(yǎng)取自質(zhì)粒組合"00逆向，，及"00順向，，的4個池及對照的3個池；在系列B中，經(jīng)6次傳代培養(yǎng)各質(zhì)粒組合的各10個池；且在系列C及D中，經(jīng)由6次傳代培養(yǎng)各類型質(zhì)粒的各6個池。對質(zhì)粒組合及系列的池的比產(chǎn)率取平均值且將各系列中的對照平均值設定為1。將具有TE元件的池的比產(chǎn)率平均值與此值相比較。圖10:TE元件對經(jīng)DHFR選擇的細胞池的比產(chǎn)率的影響此圖以曲線圖(A)或表(B)的形式展示，與無TE元件的對照池相比，MCP-1的表達量因存在TE元件而產(chǎn)生的變化。細胞池是通過用基本質(zhì)粒pTEWMCP-l("對照")或由其所獲得的各自額外含有TE元件("01"至"I")的衍生物穩(wěn)定轉染CHO-DG44細胞而制得(系列E)。在于無HT培養(yǎng)基中對經(jīng)轉染的細胞池進行長達兩至三周的選擇后，通過ELISA測量細胞培養(yǎng)物上清液中的蛋白質(zhì)表達且計算每天每個細胞的比產(chǎn)率。經(jīng)由在75cm2T形燒瓶中，以2-2-3天的傳代節(jié)律數(shù)次傳代進行經(jīng)穩(wěn)定轉染的CHO-DG44細胞的培養(yǎng)。培養(yǎng)中各質(zhì)粒變異體的6個池經(jīng)6次傳代。對質(zhì)粒變異體的池的比產(chǎn)率取平均值且將對照平均值設定為1。將具有TE元件的池的比產(chǎn)率平均值與此值相比較。圖11:測試TE元件的增強子活性與無TE元件的對照載體相比，當使用具有TE元件的表達載體時，CHO-DG44細胞的瞬間轉染未展示MCP-1滴度顯著增加。因此TE元件01至12不充當增強子且因此僅在整合至染色體中時才促使表達顯著增加。用pTE4/MCP-l(對照)及自其所獲得的各自額外含有TE元件("01"至"12")的衍生物轉染6個池。同時共轉染SEAP表達質(zhì)粒以測定轉染效率(SEAP二分泌型^咸性-磷酸酶)。以總體積3ml培養(yǎng)48小時后，移除細胞培養(yǎng)物上清液且通過ELISA測定MCP-1滴度且測定SEAP活性。相對于通過SEAP表達所測定的轉染效率修正MCP-1滴度。圖中展示6個平行池的平均值與標準偏差。圖12:其他TE元件迄今為止的結果指示選擇此圖中所示的序列IDNo.l的片段亦可使得基因表達增加?？寺〖胺€(wěn)定轉染此等額外TE元件旨在更清晰地表征序列IDNo.l以便更準確地定位對功能至關重要的序列區(qū)。圖13:TE元件的不同位置及組合的測試此圖描述可能的表達載體的選擇，其中使用TE元件的不同位置、取向及組合來研究是否可以此方式達成表達的額外增加。TE元件不僅可與產(chǎn)物基因側接，而且多個相同或不同的短TE元件亦可縱向連接在一起，諸如TE元件06與08或新的TE元件13與14。圖14:TE元件TE13至TE18對特定MCP-1表達的影響此圖示意性展示與無TE元件的對照池相比，MCP-1的表達量因TE元件的存在而產(chǎn)生的變化。細胞池是通過用基本質(zhì)粒pTE4/MCP-l("對照，，)或由其所獲得的各自額外含有TE元件("13"至"18")的衍生物穩(wěn)定轉染CHO-DG44細胞而制得(系列F)。在于補充有HT的培養(yǎng)基+G418(400嗎/ml)中對經(jīng)轉染的細胞池進行長達兩至三周的選擇后，通過ELISA測量細胞培養(yǎng)物上清液中的蛋白質(zhì)表達且計算每天每個細胞的比產(chǎn)率。經(jīng)由在75cm2T形燒瓶中，以2-2-3天的傳代節(jié)律數(shù)次傳代進行經(jīng)穩(wěn)定轉染的CHO-DG44細胞的培養(yǎng)。各質(zhì)粒變異體的4個池在培養(yǎng)中經(jīng)5至6次傳代。對質(zhì)粒變異體的池的比產(chǎn)率取平均值且將對照平均值設定為1。將具有TE元件的池的比產(chǎn)率平均值與此值相比較。圖15:各種位置及各種組合的TE元件對MCP-1表達的影響此圖示意性展示與無TE元件的對照池相比，MCP-1的表達量因不同TE元件的存在及組合而產(chǎn)生的變化。細胞池是通過用基本質(zhì)粒pTEWMCP-l("對照")或由其所獲得的各自額外含有一或兩個TE元件("06及08、08逆向、09逆向、A")的衍生物穩(wěn)定轉染CHO-DG44細胞而制得(系列G)。在于補充有HT的培，基+G418(400嗎/ml)中對經(jīng)轉染的細胞池進行長達兩至三周的選擇后，通過ELISA測量細胞培養(yǎng)物上清液中的蛋白質(zhì)表達且計算每天每個細胞的比產(chǎn)率。經(jīng)由在6孔培養(yǎng)盤(MAT6)中，以2-2-3天的傳代節(jié)律數(shù)次傳代進行經(jīng)穩(wěn)定轉染的CHO-DG44細胞的培養(yǎng)。各質(zhì)粒變異體的6個池在培養(yǎng)中經(jīng)6次傳代。對質(zhì)粒變異體的池的比產(chǎn)率取平均值且將對照平均值設定為1。將具有TE元件的池的比產(chǎn)率平均值與此值相比較。圖16:以IgG-4抗體測試TE元件TE-08使用此圖所示的載體在CHO-DG44細胞中表達重組單克隆IgG4抗體。在此情況下，E/P為CMV增強子與啟動子的組合，P僅為啟動子元件且T為經(jīng)轉錄mRNA的多聚腺苦酸化所需的轉錄終止信號。各轉錄單元內(nèi)轉錄起始的位置及方向由箭頭指示?？寺≥p鏈(LC)及重鏈(HC)的基因替代MCP-l-IRES-dsRed2序列盒(圖IB及2)。其分別編碼人源化單抹IgG-4抗體的重鏈及輕鏈。可擴增的可選擇標記二氫葉酸還原酶縮寫為"dhfr"?？蛇x擇標記新霉素磷酸轉移酶含有點突變F240I且在圖中相應縮寫為F240I。發(fā)明詳述義。一般術語"含有'，包括更具體術語"由...組成"。此外，無限制性使用術語"單數(shù)"及"復數(shù)"。術語"TE元件"表示調(diào)控核酸。術語"TE元件"或"表達增強元件"或"轉錄增強元件"或"表達或轉錄增強核酸元件，，在本文中以同義使用。此等術語均指調(diào)控核酸序列。特定言之，"TE元件，，或"表達增強元件'，或"轉錄增強元件"或"表達或轉錄增強核酸元件，，意謂自中國倉鼠(CWcefw/wgn&w)基因組分離的序列IDNo.l(包括其互補序列)，或其任何部分、片段或區(qū)域，或序列IDNo.l的衍生物或該衍生物的部分、片段或區(qū)域之一，當其穩(wěn)定整合至染色體中時可使目的基因的轉染或表達增加。亦意謂序列IDNo.l的部分、片段、區(qū)域或衍生物的任意組合，其是由多個相同或不同的SEQIDNo.l的部分、片段、區(qū)域或衍生物組成，而各組份又可以任意取向且以任意間距彼此相對排列，或可與其他調(diào)控序列組合，且可使目的基因的轉錄或表達增加。術語TE元件可指SEQIDNo.l本身及其任意片段、部分、區(qū)域或衍生物。此外，術語"TE元件"、"轉錄增強或表達增強核酸元件"或其片段、部分、區(qū)域或衍生物除中國倉鼠(CWcefw/wgn'化w)序列的部分外亦涵蓋源自其他生物體的相應功能性同源核苷酸序列。此等其他生物體的實例包括人類、小鼠、大鼠、猴及其他哺乳動物及嚙齒動物、爬行動物、鳥類、魚類及植物。"片段"或"部分，，或"區(qū)域，，(此等術語以同義使用)意謂序列與SIQIDNo.l或其互補序列的部分區(qū)域100%—致的核酸分子(單鏈或雙鏈)。已知克隆通過限制酶消化或通過PCR所制得的片段可引起該片段末端區(qū)中的修飾，亦即添加或缺失核香酸或經(jīng)由引物另外引入核苦酸，此為填補反應或斷裂反應的結果。片段的定義包括片段末端區(qū)中的此等變異，即使此等序列區(qū)與SEQIDNo.l的序列同一性小于100%。序列IDNo.l的"部分"或"片段"或"區(qū)域"包括(例如)TE-OO(序列IDNo.2)、TE-01(序歹'JIDNo.3)、TE-02(序歹'JIDNo.4)、TE-03(序歹'JIDNo.5)、TE-04(序歹llIDNo.6)、TE-05(序歹'JIDNo.7)、TE-06(序歹'jIDNo.8)、TE-07(序歹寸IDNo.9)、TE-08(序列IDNo.10)、TE國09(序列IDNo,11)、TE-IO(序歹'JIDNo.12)、TE-ll(序歹'JIDNo.13)、TE-12(序歹'jIDNo.14)、TE-13(序列IDNo.15)、TE-14(序歹'JIDNo.16)、TE-15(序列IDNo.17)、TE-16(序列IDNo.18)、TE-17(序列IDNo.19)、TE-18(序列IDNo.20)、TE-21(序列IDNo.21)。優(yōu)選地，片段經(jīng)穩(wěn)定染色體整合后可使得功能上連接的目的基因的轉錄或表達增加。可使目的基因的轉錄或表達增加的序列IDNo.l的"部分"或"片段"或"區(qū)域"例如為TE-00(序列IDNo.2)、TE-01(序列IDNo.3)、TE-02(序列IDNo.4)、TE-03(序歹'jIDNo.5)、TE-04(序列IDNo.6)、TE-06(序歹'JIDNo.8)、TE-07(序列IDNo.9)、TE—08(序歹'JIDNo.10)、TE-10(序歹'JIDNo.12)、TE-ll(序列IDNo.13)、TE-12(序歹i)IDNo.14)、TE-13(序列IDNo,15)、TE-14(序列IDNo.16)、TE-15(序列IDNo.17)、TE-16(序列IDNo.18)、TE-17(序列IDNo.19)、TE-18(序列IDNo.20)和TE-21(序列IDNo.21)。然而，術語"片^:"亦包括可使目的基因的轉錄或表達增加的、任意取向的SEQIDNo.1的其他所有可能部分，尤其是完全或至少部分處于TE-00(序列IDNo.2)的5'區(qū)中的部分。此對應于SEQIDNo.1中介于1bp與1578bp之間的部分區(qū)域。片段TE-08(SEQIDNo.IO)亦優(yōu)選。在本發(fā)明中，"衍生物"意謂與SEQIDNo.1或其互補序列或與SEQIDNo.1的部分或片段或區(qū)域或SEQIDNo.1的互補序列具有至少70°/。的序列同一性，優(yōu)選至少約80%的序列同一性，優(yōu)選至少約85%的序列同一性，尤其優(yōu)選至少約卯％的序列同一性，且最佳至少約95%的序列同一性，且經(jīng)染色體整合后可使目的基因的轉錄或表達增加的核酸分子(單鏈或雙鏈)。在一方面，與SEQIDNo.1的序列差異可基于源自其他生物體的同源內(nèi)源性核苷酸序列的差異。在另一方面，其亦可基于核苷酸序列的有意修飾，例如至少一或多個核香酸的取代、插入或缺失。缺失、插入及取代突變體可通過"定點誘變"和/或"基于PCR的誘變技術"來制得。相應方法(例如)已由Lottspeich及Zorbas描述(1998;第36.1章及其他參考文獻)。序列同一性可使用所謂的標準比對演算法，諸如"BLAST""(Altschul,S.F.Gish,W.,Miller,W"Myers，E.W.&Lipman,D丄(1990)"Basiclocalalignmentsearchtool"J.Mol.Biol.215:403-410;Madden,T丄.,Tatusov，R丄.&Zhang,J.(1996)"ApplicationsofnetworkBLASTserver"Meth.Enzymol.266:131-141;Zhang，J.&Madden，T丄.(1997)"PowerBLAST:AnewnetworkBLASTapplicationforinteractiveorautomatedsequenceanalysisandannotation"GenomeRes.7:649-656)，來與參考序列(在此情況下為序列IDNo.l)相符才艮據(jù)本發(fā)明，"衍生物"意謂與SEQIDNo.1或與SEQIDNo.1的片l殳或部分或區(qū)域的序列或SEQIDNo.1的互補序列雜交的核酸分子(單鏈或雙鏈)。優(yōu)選地，雜交是在嚴格雜交及洗滌條件(例如，在65。C下含有5xSSC的緩沖液中雜交；在42。C下用0.2xSSC/0.1。/。SDS洗滌)下進行。相應技術描述于(例如)Ausubel等人，1994中。優(yōu)選地，SEQIDNo.1的部分或片段或區(qū)域包括所有或至少部分核苷酸位置1bp與1578bp之間的序列區(qū)。此對應于TE-00序列(SEQIDNo.2)的5，序列區(qū)。片段TE-08(SEQIDNo.10)亦優(yōu)選。術語"變異體，，是指用于特定轉染混合物中的表達載體。此等載體包括基本載體(pTE4/MCP-l或卩丁￡5艦€-1)或基本載體組合^8刖0-1^+pBID-HC)以及含有一或多個不同位置、組合及取向的TE元件的基本載體。在引物的情況下，術語"取向"是指引物相對于SEQIDNo.1的排列。所有序列順序與SEQIDNo.l所示的序列在5，-3，順序上一致的引物(=前向引物)均與此序列取向相同，此亦稱為"順向"。序列順序與SEQIDNo.l所示的序列互補的引物(=反向引物)與此序列取向相反，此亦稱為"逆向"。在本發(fā)明中，與TE元件相關的術語"取向"是指相對于目的基因的排列。SEQIDNo.l所示的序列表示位于遍在蛋白/S27a基因的編碼區(qū)的5，(亦稱為"上游，，)的基因組序列。SEQIDNo.l中所示的此序列沿其后遍在蛋白/S27a基因的編碼區(qū)的方向延伸，可達此基因的起始密碼子。此排列因此稱為"順向"。類似地，在本發(fā)明中，當SEQIDNo.l中所示的序列或其任意部分、片段、區(qū)域或衍生物在表達載體中與目的基因的起始密碼子存在于相同DNA鏈上時，TE元件處于順向。相反，若與SEQIDNo.l互補的序列或其任意部分、片段、區(qū)域或衍生物在表達載體中與目的基因的起始密碼子存在于相同DNA鏈上時，則TE元件處于"逆向"。除非另有說明，否則當提及TE元件時，總是兩種取向都包括/意謂，亦即順向和逆向。"染色體整合"意謂將任意核酸序列整合至細胞的基因組(亦即染色體)中，此整合為視情況以任何所要數(shù)目、位置及取向整合至一或多個染色體中。此外，術語"染色體整合"亦包括將任何所要核酸序列整合至合成染色體、人造染色體或微型染色體中。目的基因的核苷酸序列。基因產(chǎn)物或"目的產(chǎn)物"通常為蛋白質(zhì)、多肽、肽或其片段或衍生物。然而，其亦可為RNA或反義RNA。目的基因可以其全長形式、縮短形式、融合基因形式或經(jīng)標記基因形式存在。其可為基因組DNA,或優(yōu)選為cDNA,或相應片段或融合體。目的基因可為天然基因序列，或其可經(jīng)突變或經(jīng)另外修飾。該等修飾包括密碼子最優(yōu)化(以適應特定宿主細胞)及人源化。目的基因可(例如)編碼分泌型、細胞質(zhì)、核定位、膜結合或細胞表面結合的多肽。術語"核酸"、"核苷酸序列"或"核酸序列"表示寡核普酸、核苷酸、聚核苷酸及其片段，以及以單鏈或雙鏈形式存在且可代表基團的編碼鏈或非編碼鏈的基因組或合成來源的DNA或RNA。核酸序列可使用標準技術進行修飾，標準技術諸如定點誘變或PCR介導的誘變(例如Sambrook等人,1989或Ausubel等人，1994中所述)。"編碼"意謂核酸中的特定核普酸序列(例如染色體或mRNA中的基因)在生物過程中充當其他聚合物及大分子(諸如rRNA、tRNA、mRNA、其他RNA分子、cDNA或多肽)的合成基質(zhì)的特性或能力。因此，若所要蛋白質(zhì)是通過某mRNA的轉錄及后續(xù)翻譯在細胞或其他生物系統(tǒng)中產(chǎn)生，則該基因編碼該蛋白質(zhì)。核苦酸序列與mRNA序列一致且通常亦可獲得于序列資料庫(例如EMBL或GenBank)的編碼鏈、以及充當轉錄基質(zhì)的基因或cDNA的非編碼鏈均可稱為編碼產(chǎn)物或蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)的核酸亦包括基于簡并遺傳密碼因而具有不同順序的核苷酸序列、但可產(chǎn)生蛋白質(zhì)的相同氨基酸序列的核酸。編碼蛋白質(zhì)的核酸序列亦可含有內(nèi)含子。術語"cDNA"表示通過自由基因產(chǎn)生的mRNA或其他RNA逆轉錄及合成第二DNA鏈而制得的去氧核糖核酸。若cDNA以雙鏈DNA分子形式存在，則其含有編碼鏈與非編碼鏈。術語"內(nèi)含子"表示具有任何長度的非編碼核苦酸序列。其天然存在于多種真核基因中，且可通過稱為剪接的方法自預先轉錄的mRNA前體中消除。此需要在5，端及3，端處準確切除內(nèi)含子，且正確連接所形成的mRNA末端，以產(chǎn)生具有以便達成成功蛋白質(zhì)合成的正確閱讀框架的、經(jīng)成熟加工的mRNA。許多與此剪接過程相關的剪接供體及剪接接受體位點(亦即恰位于外顯子-內(nèi)含子或內(nèi)含子-夕卜顯子界面處的序列)迄今已得到表征。回顧可參見Ohshima等人，1987。目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物具有生物藥重要性的蛋白質(zhì)/多肽例如包括(但不限于)抗體、酶、細胞因子、淋巴因子、粘附分子、受體及其衍生物或片段。通常，可使用充當促效劑或拮抗劑和/或具有治療性或診斷性應用的所有多肽。其他目的蛋白質(zhì)例如為(但不限于)在所謂的"細胞工程，，范圍內(nèi)用于改變宿主細胞特性的蛋白質(zhì)/多肽，諸如抗細胞凋亡蛋白、伴侶蛋白、代謝酶、糖基化酶及其衍生物或片段。術語"多肽"是用于氨基酸序列或蛋白質(zhì)，指具有任何長度的氨基酸聚合物。此術語亦包括通過諸如糖基化、磷酸化、乙酰化或蛋白加工的反應經(jīng)翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。多肽的結構可在保留其生物活性的同時(例如)通過取代、缺失或插入氨基酸及與其他蛋白質(zhì)融合來修飾。此外，多肽可多聚化且形成同聚體及異聚體。治療性蛋白質(zhì)的實例為胰島素、胰島素樣生長因子、人類生長激素(hGH)及其他生長因子、受體、組織血纖維蛋白溶解酶原活化因子(tPA)、紅細胞生成素(EPO)、細胞因子(例如白細胞介素(IL),諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL畫IO、IL隱ll、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)、干擾素(IFN)-a、干擾素-|3、干擾素-y、干擾素-Q或干擾素-T、腫瘤壞死因子(TNF)(諸如TNF-a、TNF-(3或TNF-y)、TRAIL、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1及VEGF。其他實例為單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體及單鏈抗體及其片段，諸如Fab、Fab，、F(ab，)2、Fc及Fc，片段、免疫球蛋白輕鏈(L)及重鏈(H)及其恒定區(qū)、可變區(qū)或高變區(qū)以及Fv及Fd片段(Chamov等人，1999)?？贵w可為人類或非人類起源。人源化抗體及嵌合抗體亦可。Fab片段(抗原結合片段^Fab)是由經(jīng)相鄰恒定區(qū)連接在一起的雙鏈的可變區(qū)組成。其可(例如)自常規(guī)抗體通過用蛋白酶(諸如木瓜酶)處理或通過DNA克隆而產(chǎn)生。其他抗體片段為F(ab，)2片段，其可通過用胃蛋白酶進行蛋白水解消化來產(chǎn)生。通過基因克隆亦可制備僅由重鏈(VH)及輕鏈(VL)的可變區(qū)組成的縮短抗體片段。此等片段稱為Fv片段(片段可變區(qū)二可變區(qū)部分的片段)。由于在此等Fv片段中不可能經(jīng)由恒定鏈的半胱氨酸基團形成共價鍵，因此此等Fv片段通常通過某些其他方法達成穩(wěn)定。為此，重鏈與輕鏈的可變區(qū)通常藉助于約10至30個氨基酸，優(yōu)選15個氨基酸的短肽片段連接在一起。由此產(chǎn)生VH與VL經(jīng)肽接頭連接在一起的單一多肽鏈。該等抗體片段亦稱為單鏈Fv片段(scFv)。scFv抗體的實例是已知的且已有描述，例如參見Huston等人，1988。在過去數(shù)年中已研發(fā)多種用于制備多聚scFv衍生物的策略。目的旨在制備具有經(jīng)改良的藥物動力學特性及增加的結合親和力的重組抗體。為達成scFv片段的多聚化，將其制成具有多聚化結構域的融合蛋白。多聚化結構域可例如為IgG的CH3區(qū)或螺旋結構("巻曲螺旋結構")，諸如亮氨酸拉鏈結構域。在其他策略中，利用scFv片段的VH區(qū)與VL區(qū)之間的相互作用實現(xiàn)多聚化(例如，雙功能抗體、三功能抗體及五功能抗體)。術語"雙功能抗體，，在此項技術中用于表示二價、同二聚scFv衍生物。通過疊合VH/VL鏈使scFv分子中的肽接頭縮短為5-10個氨基酸而形成同二聚體。雙功能抗體另外可經(jīng)由所插入的二硫鍵達成穩(wěn)定。雙功能抗體的實例可見于文獻中，例如Perisic等人，1994。術語"微型抗體，，在此項技術中用于表示二價、同二聚scFv衍生物。其是由融合蛋白組成，該融合蛋白含有作為二聚化區(qū)的免疫球蛋白(優(yōu)選IgG，最佳IgGl)的CH3。此區(qū)藉助于亦為IgG的鉸鏈區(qū)及接頭區(qū)與scFv片段連接。該等微型抗體的實例已由Hu等人，1996描述。術語"三功能抗體，，在此項技術中用于表示三價、同三聚scFv衍生物(Kortt等人，1997)。VH-VL直接融合而不使用接頭序列可形成三聚體。此項技術中稱為微抗體的具有二價、三價或四價結構的片段亦為scFv片段的衍生物。多聚化是藉助于二聚、三聚或四聚巻曲螺旋結構達成(Pack等人，1993及1995;Lovejoy等人，1993)。編碼熒光蛋白的基因在另一實施例中，本發(fā)明的表達載體含有與目的基因在功能上連接的編碼熒光蛋白的基因。優(yōu)選地，兩種基因在單一異源啟動子控制下轉錄，使得目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物與熒光蛋白由雙順反子mRNA編碼。此使得可藉助于熒光蛋白的表達率鑒別大量產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物的細胞?；蛘撸幋a熒光蛋白的基因的轉錄可在其自身啟動子的控制下進行。熒光蛋白可為(例如)綠色、藍綠色、藍色、黃色或其他顏色的熒光蛋白。一特定實例為自7JC母(^egMom3W"on'a)或海腎(iem7/(2remybnm's)獲得的綠色熒光蛋白(GFP)及由其所形成的突變體；例如參見Bennet等人，1998;Chalfie等人，1994;WO01/04306及其中所引用的文獻。其他熒光蛋白及其編碼基因描述于WO00/34318、WO00/34326、WO00/34526及WO01/27150中，該等專利以引用的方式并入本文中。此等熒體"f列^口〉每葵(Jwe加om'aw"乂a"o)、習習3冊$月((7/(3"1//0〃'0^/.)、花群海葵I(ZoaW/ms■yp./)、花群海葵II(Zoa"^zz^//)、白花諒珊瑚(ZXscosomaWr/ata)、"紅色'，圓盤擬珊瑚海葵(rfecasowaw.'VecT)、"綠色，，圓盤擬珊瑚海葵、"洋紅色，'圓盤擬珊瑚?？?、溝迎風海葵G4"ewow》w/cato)、青色多管水母根據(jù)本發(fā)明所使用的熒光蛋白除野生型蛋白質(zhì)外亦含有天然或經(jīng)基因工程設計的突變體及變異體、其片段、衍生物或(例如)已與其他蛋白質(zhì)或肽融合的變異體。所引入的突變可(例如)改變激勵或發(fā)射光譜、發(fā)色團的形成、蛋白質(zhì)的消光系數(shù)或穩(wěn)定性。此外，可通過密碼子最優(yōu)化改良在哺乳動物細胞或其他物種中的表達。根據(jù)本發(fā)明，熒光蛋白亦可以與可選擇標記，優(yōu)選可擴增的可選擇標記(諸如二氫葉酸還原酶(DHFR))融合的形式使用。熒光蛋白所發(fā)射的熒光使得可(例如)通過流式細胞計數(shù)法使用熒光活化細胞分選儀(FACS)或通過熒光顯微法檢測蛋白質(zhì)。其他調(diào)控元件表達載體含有至少一種異源啟動子，其使得目的基因可表達且優(yōu)選亦使得熒光蛋白可表達。術語"啟動子"表示允許且控制與其在功能上聯(lián)接的基團或序列的轉錄的聚核苷酸序列。啟動子含有結合RNA聚合酶的識別序列及轉錄起始位點。為在特定細胞類型或宿主細胞中表達所要序列，必須選擇適當?shù)墓δ苄詥幼?。本領域技術人員熟悉各種來源的多種啟動子，包括組成性啟動子、誘導性啟動子及可抑制性啟動子。其保藏于諸如GenBank的資料池中，且可以單獨元件或克隆于聚核普酸序列內(nèi)的元件的形式自商業(yè)或個人來源獲得。在誘導性啟動子中，啟動子的活性可回應于信號而減弱或增強。誘導性啟動子的一實例為四環(huán)素(tet)啟動子。此啟動子含有可由四環(huán)素調(diào)控的反式活化蛋白(tTA)誘導的四環(huán)素操縱子序列(tetO)。在四環(huán)素存在下，tTA與tetO的結合受到抑制。其他誘導性啟動子的實例為jun、fos、金屬硫蛋白及熱休克啟動子(亦參見Sambrook等人，I989;Gossen等人，l"4)。尤其適用于在真核細胞中促成高表達的啟動子包括(例如)倉鼠的遍在蛋白/S27a啟動子(WO97/15664)、SV40早期啟動子、！^病毒主要晚期啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子、勞斯(Rous)肉瘤病毒的長末端重復區(qū)、人類巨細胞病毒的早期啟動子。其他異源哺乳動物啟動子的實例為肌動蛋白、免疫球蛋白或熱休克啟動子。相應異源啟動子可與其他調(diào)控序列在功能上聯(lián)接，用以增強/調(diào)控表達序列盒中的轉錄活性。舉例而言，啟動子可與增強子序列在功能上連接，用以增強轉錄活性。對此，可使用一或多個增強子和/或增強子序列的數(shù)個拷貝，例如CMV或SV40增強子。因此，在另一實施例中，本發(fā)明的表達載體含有一或多個增強子/增強子序列，優(yōu)選為CMV或SV40增強子。術語增強子表示以順式方位作用于啟動子活性且從而刺激與此啟動子在功能上聯(lián)接的基因的轉錄的聚核苷酸序列。與啟動子不同，增強子的作用不依賴于位置及取向，且因此其可定位于轉錄單元之前或之后、內(nèi)含子內(nèi)或甚至編碼區(qū)內(nèi)。增強子可定位于緊鄰轉錄單元，也可遠離啟動子。其亦可與啟動子具有實體性及功能性重疊。本領域技術人員了解來自各種來源的多種增強子(及保藏于諸如GenBank的資料庫中的增強子，例如SV40增強子、CMV增強子、多瘤病毒增強子、腺病毒增強子)，該等增強子可以獨立元件或克隆于聚核苷酸序列內(nèi)的元件的形式獲得(例如保藏于ATCC或來自商業(yè)及個人來源)。多種啟動子序列亦含有增強子序列，諸如常用的CMV啟動子。人類CMV增強子是迄今為止所鑒別的最強增強子之一。誘導性增強子的一實例為金屬硫蛋白增強子，其可由糖皮質(zhì)激素或重金屬刺激。其他可能的修飾例如為引入多個Spl結合位點。亦可使啟動子序列與控制/調(diào)控轉錄活性的調(diào)控序列組合。因此，可使得啟動子具有可抑制性/誘導性。此可(例如)通過與為上調(diào)或下調(diào)轉錄因子的結合位點的序列連接來完成。舉例而言，上述轉錄因子Spl對轉錄活性具有正面作用。另一實例為活化蛋白API的結合位點，活化蛋白API可對轉錄起到正面與負面作用。API的活性可由各種因子(諸如生長因子、細胞因子及血清)控制(Faisst等人,1992及其中所引用的參考文獻)。亦可如下增加轉錄效率通過使一處、兩處、三處或三處以上堿基突變(取代、插入或缺失)來改變啟動子序列，且接著以報導基因測定判定此突變是否增強啟動子活性。額外調(diào)控元件主要包括異源啟動子、增強子、終止信號及多聚腺苷酸化信號及其他表達控制元件。用于各種細胞類型的誘導性及組成性調(diào)控序列均為已知的。"轉錄調(diào)控元件，，通常包含待表達基因序列上游的啟動子、轉錄起始位點及終止位點及多聚腺苷酸化信號。術語"轉錄起始位點"是指構筑體中與并入初級轉錄物(亦即mRNA前體)中的第一核酸相對應的核酸。轉錄起始位點可與啟動子序列重疊。術語"轉錄終止位點"是指通常位于目的基因或待轉錄基因部分的3，端且使經(jīng)由RNA聚合酶的轉錄終止的核苷酸序列。"多聚腺苷酸化信號"為在真核mRNA3'端的特定位點處引起斷裂、且在斷裂的3，端轉錄后并入約100-200個腺嘌呤核苷酸的序列(polyA尾)的信號序列。多聚腺苷酸化信號包含斷裂位點上游約10-30個核苷酸處的序列AATAAA及位于下游的序列。已知多種多聚腺苷酸化元件，諸如tkpolyA、SV40晚期及早期polyA或BGHpolyA(例如US5,122,458中所述)。"翻譯調(diào)控元件，，包含用于各待表達多肽的翻譯起始位點(AUG)、終止密碼子及polyA信號。對達成最佳表達合理的是移除、添加或改變待表達核酸序列的5，-和/或3，-未翻譯區(qū)，以消除任何潛在不適當?shù)念~外翻譯起始密碼子或其他可能在轉錄量或表達量上影響表達的序列?；蛘撸瑸榇龠M表達，可在起始密碼子的上游緊鄰插入核糖體共有結合位點。為產(chǎn)生分泌型多肽，目的基因通常含有信號序列，其編碼將合成多肽轉運至且穿過ER膜的信號前體肽。信號序列通常但不總是位于分泌型蛋白質(zhì)的氨基末端，且在蛋白質(zhì)穿過ER膜后由信號肽酶裂解?；蛐蛄型ǔ５潜囟ê衅渥陨硇盘栃蛄?。若不存在天然信號序列，則可以已知方式引入異源信號序列。多種此類信號序列已為本領域技術人員所知且保藏于諸如GenBank及EMBL的序列資料庫中。另一種調(diào)控元件為內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)。IRES元件包含獨立于5'-端曱基鳥苷帽(帽結構)及上游基因而在功能上活化翻譯起始、且在動物細胞中使得可自單一轉錄物翻譯兩個順反子(開放閱讀框架)的序列。IRES元件提供獨立的核糖體進入位點用于翻譯緊鄰位于下游的開放閱讀框架。與可為多順反子性的細菌mRNA(亦即，其可編碼由mRNA相繼翻譯的多種不同多肽或產(chǎn)物)相比，大部分動物細胞的mRNA為單順反子的且僅編碼一種蛋白質(zhì)或產(chǎn)物。在真核細胞中的多順反子轉錄物的情況下，翻譯可自上游最近的翻譯起始位點起始且由第一個終止密碼子終止，之后轉錄物可自核糖體中釋放。因此，在翻譯期間僅產(chǎn)生由mRNA編碼的第一個多肽或產(chǎn)物。相比而言，具有與轉錄物中的第二或后續(xù)開放閱讀框架在功能上連接的IRES元件的多順反子轉錄物允許隨后翻譯位于IRES元件下游的開放閱讀產(chǎn)物。IRES元件可具有多種長度及多種來源且可(例如)源自腦心肌炎病毒(EMCV)或其他小核糖核酸病毒。多種IRES序列及其在載體構筑中的用途已描述于文獻中，例如參見Pelletier等人，1988;Jang等人，1989;Davies等人,1992;Adam等人，1991;Morgan等人，1992;Sugimoto等人，1994;Ramesh等人，1996;Mosser等人，1997。使位于下游的基因序列與IRES元件的3'端在功能上連接，亦即將間距選擇成使得基因的表達不受影響或僅受微小影響或?qū)τ陬A定目的而言具有足夠的表達。IRES元件與位于其下游的基因的起始密碼子之間的可允許足夠表達的最佳距離可通過簡單實驗通過改變間距且使用報導基因檢定測定隨間距變化的表達率來判定。通過所述方法可獲得對于異源基因產(chǎn)物的表達具有重要價值的最佳表達序列盒。因此，藉助于一或多種該等方法所獲得的表達序列盒為本發(fā)明的另一目標。倉鼠-遍在蛋白/S27a啟動子在另一實施例中，本發(fā)明的表達載體含有倉鼠的遍在蛋白/S27a啟動子，其優(yōu)選是功能性連接至目的基因上，且甚至更佳是功能性連接至目的基因及編碼熒光蛋白或可選擇標記的基因上。倉鼠的遍在蛋白/S27a啟動子為WO97/15664中所描述的強效同源啟動子。該啟動子優(yōu)選具有以下特征中的至少一者富含GC的序列區(qū)、Spl結合位點、多嘧啶元件、無TATA盒。具有Spl結合位點但無TATA盒的啟動子尤其優(yōu)選?？山?jīng)組成性活化且尤其在含血清、低血清及無血清的細胞培養(yǎng)條件下具有相等活性的啟動子亦優(yōu)選。在另一實施例中，其為誘導性啟動子，尤其為可通過移除血清而活化的啟動子。尤其有利的實施例為具有WO97/15664的圖5中所含的核苷酸序列的啟動子。含有圖5中位置-161至-45的序列的啟動子序列尤其優(yōu)選。本專利說明書的實例中所使用的啟動子各含有具有對應于WO97/15664的圖5中的片段-372至+111的序列的DNA分子且代表優(yōu)選啟動子，亦即應含有此序列區(qū)的優(yōu)選啟動子。本發(fā)明的表達載體的制備本發(fā)明的表達載體理論上可通過此項技術中已知的習知方法，例如Sambrook等人(1989)所述的方法來制備。Sambrook亦描述載體的功能性組份，例如適當?shù)膯幼?除倉鼠遍在蛋白/S27a啟動子外)、增強子、終止信號及多聚腺苦酸化信號、抗生素耐性基因、可選擇標記、復制起點及剪接信號。可使用習知克隆載體制備該表達載體，例如質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、粘?；虿《据d體(諸如桿狀病毒、逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒及單純皰滲型病毒)以及合成或人造染色體"鼓型染色體。真核表達載體通常亦含有原核序列，諸如使得載體可在細菌中復制及選擇的復制起點及抗生素耐性基因。已知多種含有用于引入聚核苷酸序列的多克隆位點的真核表達載體，且有些載體可購自各乂>司，諸如Stratagene，LaJolla，CA,USA;Invitrogen，Carlsbad,CA,USA;Promega，Madison,WI，USA或BDBiosciencesClontech，PaloAlto,CA,USA。舉例而言，可以本領域技術人員熟悉的方式將異源啟動子、目的基因、可選擇標記及任選編碼熒光蛋白的基因、額外調(diào)控元件(諸如內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)、增強子、多聚腺苷酸化信號及諸如TE元件的其他順式活性元件)引入表達載體。本發(fā)明的表達載體至少含有異源啟動子、目的基因及TE元件。優(yōu)選地，表達載體亦含有編碼熒光蛋白的基因。根據(jù)本發(fā)明尤其優(yōu)選使用遍在蛋白/S27a啟動子作為異源啟動子。異源啟動子(優(yōu)選遍在蛋白/S27a啟動子)、目的基因及TE元件在功能上連接在一起或在功能上連接的表達載體尤其優(yōu)選。在本說明書的范圍內(nèi)，術語"功能性連接"或"在功能上連接"是指兩個或兩個以上核酸序列或部分序列，其定位成使其可執(zhí)行各自預定功能。舉例而言，啟動子/增強子、啟動子/TE元件或啟動子/增強子/TE元件與編碼基因序列若能夠以順式位置控制或調(diào)節(jié)連接基因序列的轉錄，則其在功能上連接。通常(但非必定)，功能上連接的DNA序列靠近在一起，且若兩個編碼基因序列連接或在分泌信號序列的情況下處于相同閱讀框架中。盡管功能上連接的啟動子通常位于編碼基因序列的上游，但其并非必須靠近該序列。增強子或TE元件同樣不必靠近，限制條件為其應有助于基因序列的轉錄或表達。為此目的，增強子或TE元件可位于基因序列的上游與下游，任選與該序列相隔一定距離。多聚腺苷酸化位點當其以一定方式位于基因序列的3，端使得轉錄經(jīng)由編碼序列前進至多聚腺苷酸化信號，則其與基因序列在功能上連接。可根據(jù)習知重組方法實現(xiàn)連接，例如通過PCR技術、通過適當限制性切割位點處的接合或通過剪接。若無適當?shù)南拗菩郧懈钗稽c可用，則可以本身已知的方式使用合成性寡核苷酸連接子或銜接子。在所述實施例之一中，異源啟動子(優(yōu)選遍在蛋白/S27a啟動子或CMV啟動子)、目的基因及編碼熒光蛋白的基因在功能上連接在一起。此意謂(例如)目的基因與編碼焚光蛋白的基因自相同異源啟動子開始被表達。在一尤其優(yōu)選的實施例中，功能性連接經(jīng)由IRES元件而發(fā)生，使得由兩基因合成雙順反子mRNA。本發(fā)明的表達載體可另外含有在功能上作用于一或多個啟動子的增強子元件和/或TE元件。異源啟動子(優(yōu)選遍在蛋白/S27a啟動子或其修飾形式或CMV啟動子)與增強子元件(例如SV40增強子或CMV增強子元件)及TE元件連接的表達載體尤其優(yōu)選。表達載體內(nèi)基因的表達基本上可自一或多個轉錄單元起始進行。術語轉錄單元定義為含有一或多個待轉錄基因的區(qū)域。轉錄單元內(nèi)的基因以一定方式在功能上彼此連接，使得該單元內(nèi)的所有基因均處于相同啟動子、啟動子/增強子或啟動子/增強子/TE元件的轉錄控制下。由于此基因轉錄連接，可由轉錄單元轉錄一種以上蛋白質(zhì)或產(chǎn)物，且從而使其得以表達。各轉錄單元含有其中所含基因序列的轉錄及翻譯所必需的調(diào)控元件。各轉錄單元可含有相同或不同的調(diào)控元件。IRES元件或內(nèi)含子可用于轉錄單元內(nèi)基因的功能性連接。表達載體可含有用于表達目的基因、可選擇標記及可選擇的編碼熒光蛋白的基因的單一轉錄單元?；蛘?，此等基因亦可排列于兩個或兩個以上轉錄單元中?；蛟谵D錄單元內(nèi)可具有各種組合。在本發(fā)明的另一實施例中，可將一個以上由一個、兩個或兩個以上轉錄單元組成的表達載體通過共轉染或以任何所要順序相繼轉染插入宿主細胞中。可選擇各載體上調(diào)控元件與基因的任何組合，只要能確保轉錄單元的足夠表達。若需要，可將其他調(diào)控元件(諸如TE元件)及基因(例如，其他目的基因或可選擇標記)安置于表達載體上。根據(jù)本發(fā)明，彼等表達載體亦優(yōu)選，其含有一或多個TE元件且(替代目的基因)僅具有使得可經(jīng)由限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列克隆目的基因的多克隆位點的。各種限制性核酸內(nèi)切酶的各種識別序列以及相關限制性核酸內(nèi)切酶在先前技術中是已知的。優(yōu)選使用由至少6個核苷酸組成的序列作為識別序列。適當識別序列的清單可見于(例如)Sambrook等人，1989中。根據(jù)本發(fā)明，替代目的基因而僅具有多克隆位點(該多克隆位點使得可經(jīng)由限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列克隆目的基因)及另外在表達載體的不同位置具有一或多個(優(yōu)選多個)克隆位點(該克隆位點另外使得可經(jīng)由限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列克隆TE元件)的彼等表達載體亦優(yōu)選。各種限制性核酸內(nèi)切酶的各種識別序列以及相關限制性核酸內(nèi)切酶在先前技術中是已知的。優(yōu)選使用由至少6個核苷酸組成的序列作為識別序列。適當識別序列的清單可見于(例如)Sambrook等人，1^9中。宿主細胞對于用本發(fā)明的表達載體轉染而言，使用真核宿主細胞，優(yōu)選為哺乳動物細胞且更尤其為嚙齒動物細胞，諸如小鼠、大鼠及倉鼠細胞系。用本發(fā)明的表達載體成功轉染相應細胞可產(chǎn)生經(jīng)轉化經(jīng)基因修飾的重組或轉基因細胞，其亦為本發(fā)明的目標。用于本發(fā)明的目的的優(yōu)選宿主細胞為倉鼠細胞，諸如BHK21、BHKTK-、CHO、CHO畫Kl、CHO-DUKX、CHO-DUKXBl及CHO-DG44細胞或此等細胞系的衍生物/子代。尤其優(yōu)選為CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1及BHK21細胞，尤其是CHO-DG44及CHO-DUKX細胞。小鼠骨髓瘤細胞，優(yōu)選NS0及Sp2/0細胞及此等細胞系的衍生物/子代亦適用?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的倉鼠及小鼠細胞的實例提供于下表1中然而，此等細胞的衍生物及子代、其他哺乳動物細胞(包括但不限于人類、小鼠、大鼠、猴、嚙齒動物的細胞系)或真核細胞(包括但不限于酵母、昆蟲、鳥類及植物細胞)亦可用作產(chǎn)生生物藥蛋白質(zhì)的宿主細胞。表1:倉鼠及小鼠制造性細胞系<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>用聚核苷酸或本發(fā)明的表達載體之一轉染真核宿主細胞可通過習知方法來進行(Sambrook等人，1989;Ausubd等人，1994)。適當?shù)霓D染方法包括(例如)脂質(zhì)粒介導的轉染、磷酸鈣共沉淀、電穿孔、聚陽離子(例如DEAE葡聚糖)介導的轉染、原生質(zhì)體融合、顯微注射及病毒感染。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選進行穩(wěn)定轉染，其中構筑體整合至宿主細胞的基因組中或人造染色體/微型染色體中，或以穩(wěn)定方式游離地包含于宿主細胞中。可獲得最佳轉染頻率及所述宿主細胞內(nèi)異源基因的表達的轉染方法優(yōu)選。根據(jù)定義，插入宿主細胞內(nèi)的每個序列或每個基因均稱為相對于宿主細胞的"異源序列"或"異源基因"。即使待引入的序列或待引入的基因與宿主細胞的內(nèi)源序列或內(nèi)源基因一致，此定義亦適用。舉例而言，引入倉鼠宿主細胞中的倉鼠肌動蛋白基因根據(jù)定義為異源基因。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選為已經(jīng)本文中所述的本發(fā)明的表達載體之一轉染的重組哺乳動物細胞，優(yōu)選嚙齒動物細胞，最佳倉鼠細胞，諸如CHO或BHK細胞。在異質(zhì)蛋白質(zhì)(諸如單克隆抗體(mAb))的重組制備中，轉染適當宿主細胞理論上可通過兩種不同的方法來進行。此類mAb由大量亞單元重鏈及輕鏈組成?？墒咕幋a此等亞單元的基因容納于單一質(zhì)粒上的獨立轉錄單元或多順反子轉錄單元中，接著用該質(zhì)粒轉染宿主細胞。此舉旨在確保整合至宿主細胞的基因組中后的基因的化學計量代表。然而，在獨立轉錄單元的情況下，必須因此確保編碼不同蛋白質(zhì)的mRNA表現(xiàn)出相同的穩(wěn)定性以及轉錄及翻譯效率。在第二種情況下，基因的表達在多順反子轉錄單元內(nèi)藉助于單一啟動子而發(fā)生，且僅形成一種轉錄物。通過使用IRES元件，在第二順反子及后續(xù)順反子中獲得高效基因內(nèi)部翻譯起始。然而，此等順反子的表達率比第一順反子的表達率低，第一順反子的翻譯起始藉助于所謂的"帽，，依賴性起始前復合體而大體上比IRES依賴性翻譯起始更有效。為達成順反子的真正等摩爾表達，例如可引入與IRES元件一起確保均一表達率的其他順反子間元件(WO94/05785)。根據(jù)本發(fā)明制備多種異源蛋白質(zhì)的一種其它可能性是連續(xù)轉染，其中整合在不同表達載體中的基因在時間上分開轉染。例如，抗體的重鏈和輕鏈在兩步轉染步驟中先后引入細胞。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的另一種同時產(chǎn)生多種異源蛋白的可能方法為共轉染，其中將基因單獨整合至不同的表達載體中。此方法的優(yōu)點在于可調(diào)節(jié)基因與基因產(chǎn)物彼此的特定比例，從而消除mRNA穩(wěn)定性及轉錄及翻譯效率方面的任何差異。此外，表達載體因尺寸小而更為穩(wěn)定且在克隆期間與轉染期間更易于操控。因此，在本發(fā)明的一特定實施例中，另外用一或多個具有編碼一或多種其他目的蛋白質(zhì)的基因的載體轉染(優(yōu)選共轉染)宿主細胞。用于共轉染的其他載體(例如)在相同啟動子控制下，優(yōu)選在相同啟動子/增強子組合控制下，或尤其優(yōu)選在相同啟動子/增強子/TE元件組合控制下，或在相同啟動子/增強子組合與不同TE元件控制下編碼其他目的蛋白質(zhì)，以及編碼至少一種可選擇標記，例如二氫葉酸還原酶。在本發(fā)明的另一實施例中，用于轉染的載體可含有一或多個任何組合、位置及取向的TE元件。在本發(fā)明的另一特定實施例中，將宿主細胞用至少兩個真核表達載體共轉染，該兩個載體中的至少一者含有至少一種編碼至少目的蛋白質(zhì)的基因，而另一載體含有一或多個任何組合、位置及取向的本發(fā)明的核酸且視情況亦編碼至少一種目的基因，且此等本發(fā)明的核酸通過與另一載體共整合將其轉錄增強活性或表達增強活性賦予位于另一共轉染載體上的目的基因。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選在無血清條件下，任選在不含動物蛋白質(zhì)/肽的培養(yǎng)基中建立、調(diào)適及培養(yǎng)宿主細胞。市售培養(yǎng)基的實例包括Ham，sF12(Sigma,Deisenhofen,DE)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco，s經(jīng)改良Eagle's培養(yǎng)基(DMEM;Sigma)、最低必需培養(yǎng)基(MEM;Sigma)、Iscove's經(jīng)改良Dulbecco，s培養(yǎng)基(IMDM;Sigma)、CD-CHO(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、CHO-S-SFMII(Invitrogen)、無血清CHO-培養(yǎng)基(Sigma)及無蛋白質(zhì)CHO-培養(yǎng)基(Sigma)。此等培養(yǎng)基各自可視情況補充有多種化合物，例如激素和/或其他生長因子(例如胰島素、運鐵蛋白、表皮生長因子、胰島素樣生長因子)、鹽(例如氯化鈉、4丐鹽、鎂鹽、磷酸鹽)、緩沖液(例如HEPES)、核苷(例如腺香、胸苦)、谷氨酰胺、葡萄糖或其他等效營養(yǎng)物、抗生素和/或痕量元素。盡管根據(jù)本發(fā)明無血清的培養(yǎng)基優(yōu)選，但亦可使用已混有適量血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞。為選擇表達一或多種可選擇標記基因的經(jīng)基因修飾的細胞，可將一或多種選擇劑添加至培養(yǎng)基中。術語"選擇劑，，是指一種影響缺乏所述可選擇標記基因的宿主細胞的生長或存活的物質(zhì)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，優(yōu)選使用遺傳霉素(geneticin)(G418)作為培養(yǎng)基添加劑用于選擇帶有野生型或優(yōu)選經(jīng)修飾的新霉素磷酸轉移酶基因的異源宿主細胞。培養(yǎng)基中的所用G418濃度優(yōu)選介于100與800jLig/mL之間，最佳為200至鄰0微克G418/毫升培養(yǎng)基。若將用多種表達載體轉染宿主細胞，例如若將數(shù)種目的基因單獨引入宿主細胞中，則其通常具有不同的可選擇標記基因?？蛇x擇標記基因是一種使得可通過向培養(yǎng)基中添加相應選擇劑來特定選擇含有此基因的細胞的基因。舉例而言，可使用抗生素耐性基因作為陽性可選擇標記。僅已經(jīng)此基因轉化的細胞能夠在相應抗生素存在下生長且從而得以選擇。另一方面，未經(jīng)轉化的細胞不能在此等選擇條件下生長或存活。存在陽性、陰性及雙功能性可選擇標記。陽性可選擇標記通過賦予選擇劑耐性或通過彌補宿主細胞中的新陳代謝或分解代謝缺陷而允許選擇且由此富集經(jīng)轉化的細胞。相比之下，接收陰性可選擇標記的基因的細胞可經(jīng)由陰性可選擇標記被選擇性清除。其實例為單純皰滲型病毒的胸香激酶基因，同時添加阿昔洛韋(acyclovir)或更昔洛韋(gancyclovir)時該基因在細胞中表達可導致清除該等細胞。本發(fā)明中所使用的可選^^標記(包括可擴增的可選擇標記)包括經(jīng)基因修飾的突變體及變異體、片段、功能等效物、衍生物、同源物及與其他蛋白質(zhì)或肽的融合體，其限制條件為可選擇標記保留其選擇特性。該等衍生物在被認為具有選擇性的區(qū)域或結構域的氨基酸序列中展現(xiàn)相當大的同源性。文獻中描述了大量的可選擇標記基因，包括雙功能(陽性/陰性)標記(例如參見WO92/08796及WO94/28143)。通常用于真核細胞中的可選擇標記的實例包括氨基糖苷磷酸轉移酶(APH)、潮霉素磷酸轉移酶(HYG)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶的基因以賦予新霉素(G418)、噤呤霉素(puromycin)、組氨醇D、博萊霉素(bleomycin)、腐草霉素(phleomycin)及爭光霉素(zeocin)耐性的基因。術語"經(jīng)修飾的新霉素磷酸轉移酶"(NPT)涵蓋WO2004/050884中所述的所有突變體，尤其是突變體D227G(Asp227Gly)，其特征為氨基酸位置227處的天冬氨酸(Asp，D)被甘氨酸(Gly,G)取代；且尤其優(yōu)選為突變體F2401(Phe240Ile)，其特征為氨基酸位置240處的苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))被異亮氨酸(Ile，I)取代。因此，本發(fā)明包括一種制備及選擇重組哺乳動物細胞的方法，其包含以下步驟(i)用編碼至少一種目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物及新霉素磷酸轉移酶(優(yōu)選經(jīng)修飾)的基因轉染宿主細胞，其中為增強轉錄或表達，使至少目的基因與至少一個TE元件在功能上連接；(ii)在能夠使不同基因得到表達的條件下培養(yǎng)該等細胞；及(iii)通過在諸如G418的選擇劑存在下培養(yǎng)該等細胞來選#^此等經(jīng)共整合的基因。優(yōu)選地，在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉染的細胞。優(yōu)選地，G418的濃度為至少200)ig/mL。然而，濃度亦可為至少400)ig/mL。可擴增的可選擇標記基因此外，本發(fā)明的細胞亦可視情況經(jīng)歷一或多個基因擴增步驟，其中將其在可使得可擴增的可選擇標記基因擴增的選擇劑存在下培養(yǎng)。先決條件為宿主細胞另外經(jīng)編碼可擴增的可選擇標記的基因轉染?？捎诹硪惠d體引入宿主細胞中?？蓴U增的可選擇標記基因通常編碼真核細胞在特定培養(yǎng)條件下生長所需的酶。舉例而言，可擴增的可選4奪標記基因可編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)。在此情況下，若在選擇劑曱氨蝶呤(MTX)存在下培養(yǎng)用此基因轉染的宿主細胞，則此基因可擴增。下表2提供可根據(jù)本發(fā)明使用的其他可擴增的可選擇標記基因及相關選才奪劑的實例，其描述于Kaufman,MethodsinEnzymology，185:537-566(19卯)的綜述中。表2:可擴增的可選擇標記基因<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>根據(jù)本發(fā)明，所用的可擴增的可選擇標記基因優(yōu)選為編碼具有DHFR功能的多肽的基因，例如編碼DHFR的基因或編碼熒光蛋白與DHFR的融合蛋白的基因。DHFR為生物合成噤呤所必需的。缺乏DHFR基因的細胞不能生長于缺乏嘌呤的培養(yǎng)基中。因此，DHFR基因為適用于選擇及擴增在無。票呤的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞中的基因的可選擇標記。與DHFR基因一起使用的選擇性培養(yǎng)基為曱氨蝶呤(MTX)。哺乳動物細胞(優(yōu)選小鼠骨髓瘤及倉鼠細胞)為對于使用DHFR作為可擴增的可選擇標記而言的優(yōu)選宿主細胞。細胞系CHO-DUKX(ATCCCRL-9096)及CHO-DG44(Urlaub等人，1983)尤其優(yōu)選，因為其因突變而本身不具有DHFR活性。為能夠亦在具有自身內(nèi)源DHFR活性的其他細胞類型中利用DHFR誘導的擴增，可在轉染過程中使用編碼對曱氨蝶呤具有低敏感性的蛋白質(zhì)的突變DHFR基因(Simonson等人，1983;Wigler等人，1980;Haber等人，1982)。當使用DHFR陰性基本細胞(諸如CHO-DG44或CHO-DUKX)時，DHFR標記尤其適用于選擇及后續(xù)擴增，因為此等細胞不表達內(nèi)源DHFR且從而不能生長于無嘌呤的培養(yǎng)基中。因此，在此可使用DHFR基因作為主導選擇標記且在無次黃。票呤/胸苷的培養(yǎng)基中選擇所轉化的細胞。因此，本發(fā)明包括一種制備及選擇重組哺乳動物細胞的方法，其包含以下步驟(i)用編碼至少一種目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物及可擴增的可選擇標記DHFR的基因轉染宿主細胞，其中為增強轉錄或表達，使至少目的基因與至少一個TE元件在功能上連接；(ii)在能夠使不同基因得到表達的條件下培養(yǎng)該等細胞；及(iii)通過在使得至少可擴增的可選擇標記基因可擴增的選擇劑(諸如曱氨蝶呤)存在下培養(yǎng)該等細胞來使此等經(jīng)共整合的基因擴增。優(yōu)選地，在無血清存在下在無次黃嘌呤/胸苷的培養(yǎng)基中且添加遞增濃度的MTX來培養(yǎng)經(jīng)轉染的細胞。優(yōu)選地，第一擴增步驟中MTX的濃度為至少100nM。然而，MTX的濃度亦可為至少250nM且可逐步增至1pM。在個別情況下，亦可使用超過1pM的濃度，例如2pM。本發(fā)明亦包括一種制備及選擇重組哺乳動物細胞的方法，其包含以下步驟(i)用編碼至少一種目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物、新霉素磷酸轉移酶(優(yōu)選經(jīng)修飾)及可擴增的可選擇標記DHFR的基因轉染宿主細胞，其中為增強轉錄或表達，使至少目的基因與至少一個TE元件在功能上連接；(ii)在能夠使不同基因得到表達的條件下培養(yǎng)該等細胞；(iii)通過在諸如G418的選擇劑存在下在無次黃嘌呤/胸苷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該等細胞培養(yǎng)來選擇此等經(jīng)共整合的基因；及(iv)通過在使得至少可擴增的可選擇標記基因可擴增的選擇劑(諸如曱氨蝶呤)存在下培養(yǎng)該等細胞來使此等經(jīng)共整合的基因擴增。優(yōu)選地，在無血清存在下在補充有至少200pg/mLG418，優(yōu)選400)ig/mL或甚至更多G418的無次黃噪呤/胸苷的培養(yǎng)基中且添加遞增濃度的MTX來培養(yǎng)經(jīng)轉染的細胞。優(yōu)選地，第一擴增步驟中MTX的濃度為至少100nM。然而，MTX的濃度亦可為至少250nM且可逐步增至1^M。在個別情況下，亦可使用超過1iliM的濃度，例如2pM。細菌p-半乳糖苷酶、細胞表面標記或熒光蛋白(例如，自水母及海腎或其他物種獲得的綠色熒光蛋白(GFP)及其變異體；自非生物發(fā)光生物體，諸如圓盤擬珊瑚海葵、?？鸆4"ewom'aw.)、羽珊瑚、花群?？?、青色多管水母獲得的紅色熒光蛋白及發(fā)出其他顏色熒光的蛋白質(zhì)及其變異體)選擇所轉化的細胞?；虮磉_及高產(chǎn)宿主細胞的選擇術語基因表達是指異源基因序列在宿主細胞中的轉錄和/或翻譯。表達率通?？苫诖嬖谟谒拗骷毎械南鄳猰RNA的量或基于由目的基因編碼所產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的量來測定。所選核苷酸序列經(jīng)轉錄而產(chǎn)生的mRNA的量可(例如)通過Northern印跡雜交、核糖核酸酶-RNA-保護、細胞RNA的原位雜交或通過PCR方法(例如定量PCR)來測定(Sambrook等人，1989;Ausubel等人，1994)。由所選核香酸序列編碼的蛋白質(zhì)亦可通過多種方法來測定，諸如ELISA、蛋白質(zhì)AHPLC、Western印跡、放射免疫測定、免疫沉淀、檢測蛋白質(zhì)的生物活性、先將蛋白質(zhì)免疫染色再執(zhí)行FACS分析或焚光顯微法、通過FACS分析或焚光顯微法直接檢測熒光蛋白(Sambrook等人,l兆^Ausubel等人，1"4)。此等方法可用以(例如)研究本發(fā)明的SEQIDNo.l的TE元件或其任何部分、片段或區(qū)域或其衍生物或組合是否可使得目的基因的轉錄或表達增加。"表達、轉錄或產(chǎn)率增強"意謂與對照相比，引入宿主細胞內(nèi)的異源序列(例如編碼治療性蛋白質(zhì)的基因)的表達或合成增強。若通過本文中所述的本發(fā)明的方法培養(yǎng)本發(fā)明的細胞且若此細胞比產(chǎn)率升高至1.3倍或1.5倍或優(yōu)選具有兩倍的比產(chǎn)率，則存在表達、轉錄或產(chǎn)率的增強。若本發(fā)明的細胞具有至少三倍的比產(chǎn)率，則亦存在表達、轉錄或產(chǎn)率的增強。若本發(fā)明的細胞具有至少四倍的比產(chǎn)率，則存在表達、轉錄或產(chǎn)率的顯著增強。若本發(fā)明的細胞具有至少五倍的比產(chǎn)率，則存在表達、轉錄或產(chǎn)率的顯著增強。若本發(fā)明的細胞具有至少六倍的比產(chǎn)率，則存在表達、轉錄或產(chǎn)率的顯著增強。若本發(fā)明的細胞具有至少七倍的比產(chǎn)率，則存在表達、轉錄或產(chǎn)率的顯著增強?？赏ㄟ^使用本發(fā)明的的表達載體之一且使用本發(fā)明的方法之一達成增強的表達、轉錄或產(chǎn)率。可將相應方法與經(jīng)FACS輔助的對重組宿主細胞的選一奪相組合，該等宿主細胞含有作為額外可選擇標記的一或多種熒光蛋白(例如GFP)或細胞表面標記。其他用于獲得表達增加的方法(其中也可能使用不同方法的組合)例如基于使用操控染色體結構的順式活性元件(例如LCR、UCOE、EASE、隔離子、S/MAR、STAR元件)，基于使用(人造)轉錄因子，用天然或合成藥劑處理細胞以上調(diào)內(nèi)源或異源基因表達，改良mRNA或蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性(半衰期)，改良mRNA翻譯的起始，通過使用游離型質(zhì)粒增加基因劑量(基于使用病毒序列作為復制起點，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、EBV或BPV),使用擴增促進序列(Hemann等人，1994)或基于DNA多聯(lián)體的活體外擴增系統(tǒng)(Monaco等人，1996)。因此，在另一實施例中，本發(fā)明亦是關于用于獲得及選擇表達至少一種目的異源基因的重組哺乳動物細胞的方法，且該方法的特征在于(i)將重組哺乳動物細胞用本發(fā)明的表達載體及可擴增的可選擇標記基因轉染；(ii)將該等哺乳動物細胞在使得目的基因、經(jīng)修飾的新霉素磷酸轉移酶基因及編碼熒光蛋白的基因可表達的條件下培養(yǎng)；(iii)在至少一種選擇性作用于哺乳動物細胞的生長且使表達新霉素磷酸轉移酶基因的那些細胞優(yōu)先生長的選擇劑存在下培養(yǎng)該等哺乳動物細胞；(iv)通過流式細胞分析分選熒光蛋白呈高表達的哺乳動物細胞；(v)將分選出的細胞在可擴增的可選擇標記基因可表達的條件下培養(yǎng)；及(vi)將使可擴增的可選擇標記基因擴增的選擇劑添加至培養(yǎng)基中。根據(jù)本發(fā)明，將制造性細胞復制且用以制備目的編碼基因產(chǎn)物的方法亦優(yōu)選。為此，優(yōu)選將所選高產(chǎn)細胞在使得目的基因可表達的條件下培養(yǎng)于無血清的培養(yǎng)基中且優(yōu)選培養(yǎng)于懸浮液培養(yǎng)物中。目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物優(yōu)選是以分泌型基因產(chǎn)物的形式自細胞培養(yǎng)基獲得。然而，若蛋白質(zhì)是在無分泌信號的情況下表達，則亦可自細胞溶胞物中分離基因產(chǎn)物。為獲得大體上不含其他重組蛋白及宿主細胞蛋白的純均質(zhì)產(chǎn)物，可執(zhí)行常規(guī)純化程序。首先，將細胞及細胞碎片自培養(yǎng)基或溶胞物中移除。接著，可自所要基因產(chǎn)物中除去污染性可溶蛋白質(zhì)、多肽及核酸，例如通過免疫親和柱及離子交換柱分餾、乙醇沉淀、逆相HPLC或葡聚糖凝膠、二氧化硅或陽離子交換樹脂(諸如DEAE)層析進行分離?？捎靡约兓芍亟M宿主細胞表達的異源蛋白質(zhì)的方法已為本領域技術人員所知且已描述于文獻中，例如Harris等人，1995及Scopes1988。本發(fā)明的組合物本發(fā)明是關于一種核酸，其含有TE-13(SEQIDNo.15)或TE-13(SEQIDNo.15)的片段或它們的互補核苷酸序列、或含有TE-13(SEQIDNo.15)的衍生物或其片段或它們的互補核苦酸序列，且在經(jīng)染色體整合后可使得表達系統(tǒng)中目的基因的轉錄或表達增加。本發(fā)明是關于一種核酸，其含有TE-13(SEQIDNo.15)或TE-13(SEQIDNo.15)的片段或它們的互補核苷酸序列，或含有TE-13(SEQIDNo.15)的衍生物或其片段或它們的互補核芬酸序列，且在經(jīng)染色體整合后可使得表達系統(tǒng)中目的基因的轉錄或表達增加，其限制條件為該片段或衍生物包含至少一個來自介于1bp與1578bp之間(相對于SEQIDNo.Ol)的核酸區(qū)域中的序列區(qū)域。這里所說的序列區(qū)域是指至少10bp、15bp、20bp、50bp、lOObp的核酸區(qū)域。本發(fā)明是關于一種核酸，其含有TE-13(SEQIDNo.15)或TE-13(SEQIDNo.15)的片段或它們的互補核苦酸序列，或含有TE-13(SEQIDNo.15)的衍生物或其片段或它們的互補核苦酸序列，且在經(jīng)染色體整合后可使得表達系統(tǒng)中目的基因的轉錄或表達增加，其限制條件為該片段或衍生物包含至少一個TE-09(SEQIDNo.ll)或TE-08(SEQIDNo.IO)或TE-13(SEQIDNo.15)中的序列區(qū)。序列區(qū)同樣意謂至少10bp、15bp、20bp、50bp、100bp的核酸區(qū)。目的基因的表達增強可(例如)通過以EUSA測量產(chǎn)物滴度來測量。在一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明是關于一種核酸，其含有TE-08(SEQIDNo.IO)或TE-08(SEQIDNo.10)的片段或它們的互補核苷酸序列，或含有TE-08(SEQIDNo.10)的衍生物或其片段或它們的互補核苷酸序列，且在經(jīng)染色體整合后可使得表達系統(tǒng)中目的基因的轉錄或表達增加。在上述本發(fā)明的核酸的一優(yōu)選實施例中，限制條件為該片段或衍生物必須亦包括至少一個來自介于1bp與1578bp之間(相對于SEQIDNo.01)的核酸區(qū)中的序列區(qū)。在上述本發(fā)明的核酸的一尤其優(yōu)選實施例中，限制條件為該片段或衍生物亦包括至少一個TE-09(SEQIDNo.ll)或TE-08(SEQIDNo.ll)或TE-13(SEQIDNo.15)中的序列區(qū)。序列區(qū)在此意謂至少10bp、15bp、20bp、50bp、100bp的核酸區(qū)。在另一實施例中，本發(fā)明是關于一種核酸，其含有SEQIDNo.l或SEQIDNo.1的片段或它們的互補核香酸序列，或含有SEQIDNo.1的衍生物或其片段或它們的互補核苷酸序列，其在經(jīng)染色體整合后可使得表達系統(tǒng)中目的基因的轉錄或表達增加。在上述本發(fā)明的核酸的一優(yōu)選實施例中，限制條件為該片段或衍生物亦包含至少一個來自介于1bp與1578bp之間(相對于SEQIDNo.Ol)的核酸區(qū)中的序列區(qū)。在上述本發(fā)明的核酸的一尤其優(yōu)選實施例中，限制條件為該片段或衍生物亦包含至少一個TE-09(SEQIDNo.ll)或TE-08(SEQIDNo.ll)或TE-13(SEQIDNo.15)中的序列區(qū)。序列區(qū)意謂至少10bp、15bp、20bp、50bp、100bp的核酸區(qū)。本發(fā)明亦是關于一種用于增加目的基因的轉錄或表達的具有SEQIDNo.1的核酸^TE元件)或其片段或其衍生物或它們的互補核苷酸序列，其可使得目的基因的轉錄或表達增加。目的基因的表達增加可(例如)通過以ELISA測量產(chǎn)物滴度來測量。(a)核酸序列TE-13(SEQIDNo.15)或TE-08(SEQIDNo.10)的區(qū)域，或(b)TE-13或TE-08的互補核酸序列，或(c)與(a)或(b)具有至少約70%序列同一性的核酸序列，優(yōu)選至少約80%序列同一性或至少約85%序列同一性，最佳至少約卯％序列同一性且最佳至少約95%序列同一性。在一特定實施例中，本發(fā)明的核酸具有至少511bp的長度^SEQIDNo.15TE-13的長度)或至少1015bp的長度(SEQIDNo.10TE-08的長度)。在一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明是關于TE元件TE-00(SEQIDNo.2)的5，片段。此片段對應于SEQIDNo.1中介于1bp與1578bp之間的部分或該部分的互補核香酸序列。本發(fā)明尤其是關于一種核酸或一種轉錄增強或表達增強核酸元件(TE元件)，其含有TE-13(SEQIDNo.15)或TE-08(SEQIDNo,IO)或其衍生物或它們的互補核苷酸序列，其在經(jīng)染色體整合后可使得目的基因的轉錄或表達增力口。本發(fā)明優(yōu)選是關于一種經(jīng)分離的核酸或經(jīng)分離的核酸分子或經(jīng)分離的核酸序列或經(jīng)分離的轉錄增強核酸元件或經(jīng)分離的TE元件。本發(fā)明尤其是關于一種經(jīng)分離的核酸，其含有TE-08(SEQIDNo.10)或其互補核苦酸序列且在經(jīng)染色體整合后可使得表達系統(tǒng)中目的基因的轉錄或表達增加。在一實施例中，該核酸或轉錄增強核酸單元或經(jīng)分離的核酸含有TE元件或SEQIDNo.1的衍生物，其與TE元件序列或其互補序列的相應部分，尤其與相對于SEQIDNo.1的核苷酸位置1bp與1578bp之間的序列區(qū)(對應于TE-OO序列的5，序列區(qū))，且尤其優(yōu)選與TE-13(SEQIDNo.15)或TE-08(SEQIDNo.IO)具有至少約70%的序列同一性，優(yōu)選至少約80%的序列同一性或至少約85%的序列同一性，最佳至少約90%的序列同一性且最佳至少約95%的序列同一性。在一優(yōu)選實施例中，該核酸或轉錄增強核酸元件或經(jīng)分離的核酸含有TE-08核酸(SEQIDNo.IO)的衍生物或優(yōu)選TE-13核酸(SEQIDNo.15)的衍一性，優(yōu)選至少約80%的序列同一性或至少約85%的序列同一性，最佳至少約90%的序列同一性且最佳至少約95%的序列同一性。在另一實施例中，本發(fā)明是關于一種核酸或轉錄增強核酸元件或經(jīng)分離的核酸或TE元件的衍生物，其與TE元件的序列或與TE元件的互補序列，尤其與相對于SEQIDNo.1的核苷酸位置1bp與1578bp之間的序列區(qū)(對應于TE-OO序列(SEQIDNo2)的5，序列區(qū))雜交，或尤其與TE-08元件(SEQIDNo.IO)雜交。雜交優(yōu)選在嚴格雜交及洗滌條件下進行。在另一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的核酸或轉錄增強元件(TE元件)是選自TE-00(SEQIDNo.2)、TE-01(SEQIDNo.3)、TE-02(SEQIDNo.4)、TE-03(SEQIDNo.5)、TE-04(SEQIDNo.6)、TE-06(SEQIDNo.8)、TE-07(SEQIDNo.9)、TE-08(SEQIDNo.10)、TE-10(SEQIDNo.12)、TE-11(SEQIDNo.13)、TE-12(SEQIDNo.14)、TE-13(SEQIDNo.15)、TE-14(SEQIDNo.16)、TE-15(SEQIDNo.17)、TE-16(SEQIDNo.18)、TE-17(SEQIDNo.19)、TE-18(SEQIDNo.20)及TE-21(SEQIDNo.21)。在另一實施例中，該核酸或轉錄增強元件(TE元件)的特征在于該核酸為TE-00(SEQIDNo.2)、TE-06(SEQIDNo.8)、TE-10(SEQIDNo.12)、TE-11(SEQIDNo.13)或TE-12(SEQIDNo.14)，優(yōu)選為TE-06(SEQIDNo.8)。在一優(yōu)選實施例中，該核酸或轉錄增強元件(TE元件)的特征在于該核酸為TE-01(SEQIDNo.3)、TE-02(SEQIDNo.4)、TE-03(SEQIDNo.5)、TE-07(SEQIDNo.9)、TE-08(SEQIDNo.10)。在一尤其優(yōu)選實施例中，該核酸或轉錄增強元件(TE元件)為TE-08(SEQIDNo.10)。在一尤其優(yōu)選實施例中，該核酸或轉錄增強元件(TE元件)為TE-18(SEQIDNo.20)。在另一實施例中，該核酸或轉錄增強元件(TE元件)的特征在于其為TE-01(SEQIDNo.3)的片段或衍生物，優(yōu)選為TE-13(SEQIDNo,15)、TE-14(SEQIDNo.16)、TE-15(SEQIDNo.17)、TE-16(SEQIDNo.18)、TE-17(SEQIDNo.19)、TE-18(SEQIDNo.20)。在一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的核酸為TE-13(SEQIDNo.15)。在另一實施例中，本發(fā)明的核酸或片段或衍生物為經(jīng)分離的核酸。本發(fā)明亦是關于如權利要求1至12項中任一項的本發(fā)明的核酸，其特征在于含有以下序列的核酸是與異源序列連接TE-13(SEQIDNo.15)或TE-08(SEQIDNo.IO)或TE-07(SEQIDNo.9)或TE-06(SEQIDNo.8),或此等序列的片段或它們的互補核苷酸序列，或此等序列的衍生物或此等序列的片段的衍生物，優(yōu)選為TE-13(SEQIDNo.15)或TE-08(SEQIDNo.IO)或互補核香酸序列。在一優(yōu)選實施例中，與異源基因序列連接的核酸可為表達載體，例如質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒載體或尤其是靶向載體。然而，與異源基因序列連接的核酸亦可為其他任何合成核酸分子，諸如合成、人造或微型染色體。本發(fā)明進一步是關于一種真核表達載體，其特征在于此表達載體含有一或多個本發(fā)明的核酸或一或多個本發(fā)明的轉錄增強元件(TE元件)。在一特定實施例中，該真核表達載體的特征在于其含有啟動子和/或目的異源基因和/或可選擇標記和/或任選增強子。本發(fā)明進一步是關于一種真核表達載體，其特征在于此表達載體含有一或多個本發(fā)明的核酸或一或多個轉錄增強元件(TE元件)及啟動子和/或目的異源基因和/或可選擇標記和/或任選增強子。在另一實施例中，該真核表達載體的特征在于其為用于有目的地整合目的基因的靶向載體。在一優(yōu)選實施例中，該真核表達載體的特征在于該啟動子為異源啟動子，諸如人類巨細胞病毒的早期啟動子(CMV啟動子)、SV40早期啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子、勞斯肉瘤病毒的長末端重復區(qū)、肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白或熱休克啟動子，優(yōu)選為CMV啟動子。在另一優(yōu)選實施例中，該真核表達載體的特征在于該啟動子為異源啟動子，優(yōu)選為遍在蛋白/S27a啟動子，最佳為倉鼠遍在蛋白/S27a啟動子。在一特定實施例中，該真核表達載體的特征在于其含有數(shù)個相同或不同的彼此間呈任何取向的本發(fā)明的核酸或TE元件的組合，其中一或多個核酸或TE元件位于目的基因之前(亦即其5'側)且/或一或多個核酸或TE元件位于目的基因之后(亦即其3'側)。在一優(yōu)選實施例中，該真核表達載體的特征在于經(jīng)組合的核酸或TE元件為TE-06(SEQIDNo.8)且尤其優(yōu)選為TE-08(SEQIDNo.10)。優(yōu)選的核酸或TE元件的組合為一個TE-06元件(SEQIDNo.8)位于目的基因之前(亦即其5'側)且一個TE-06元件(SEQIDNo.8)位于目的基因之后(亦即其3'側)，以及3個TE-06元件(SEQIDNo.8)位于目的基因之后(亦即其3，側)(亦參見圖13)。在一尤其優(yōu)選實施例中，該真核表達載體的特征在于一或多個TE-08核酸或元件(SEQIDNo.10)位于目的基因之前(亦即其5，側)且一或多個TE-08元件位于目的基因之后(亦即其3，側)，優(yōu)選為一個TE-08元件(SEQIDNo.IO)在前且一個在后(亦參見圖13)。10)位于目的基因之前和/或之后。在另一實施例中，該真核表達載體的特征在于多個(優(yōu)選為3個)TE-06核酸或元件(SEQIDNo.8)位于目的基因之后(亦即其3，側)(參見圖1"。在一優(yōu)選實施例中，該真核表達載體的特征在于一或多個TE-08核酸或元件(SEQIDNo.10)與一或多個TE-06核酸或元件(SEQIDNo.8)的組合位于目的基因之前(亦即其5，側)和/或之后(亦即其3，側)，優(yōu)選組合為TE-08>核酸或元件(SEQIDNo.IO)與其后的TE-06核酸或元件(SEQIDNo.8)的組合位于目的基因之前(亦即其5'側)(亦參見圖13)。在一優(yōu)選實施例中，該真核表達載體的特征在于其另外含有整合酶。在另一優(yōu)選實施例中，將宿主細胞用至少兩個真核表達載體共轉染，而該兩個載體中的至少一者含有至少一種編碼至少一種目的蛋白質(zhì)的基因，且另一載體含有一或多個任何組合、位置及取向的本發(fā)明的核酸且視情況亦編碼至少一種目的基因，且通過與另一載體共整合此等本發(fā)明的核酸將其轉錄增強作用或表達增強作用賦予位于另一共轉染載體上的目的基因。在一特定實施例中，該真核表達載體的特征在于可選擇標記為DHFR或Neo,例如NeoF2401。本發(fā)明進一步是關于一種制備真核表達載體的方法，其特征為將本發(fā)明的核酸整合至表達載體中。本發(fā)明進一步是關于一種真核宿主細胞，其特征在于其含有本發(fā)明的真核表達載體。在一特定實施例中，該真核宿主細胞的特征在于其為高產(chǎn)者，亦即其比產(chǎn)率高于無本發(fā)明的TE元件或核酸的對等真核宿主細胞，此宿主細胞的表達量可增加至兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍或十倍，或增加至兩倍以上、三倍以上、四倍以上、五倍以上、七倍以上或十倍以上，優(yōu)選為達到五倍或達到三倍以上。在一尤其優(yōu)選實施例中，該真核宿主細胞的特征在于表達載體是穩(wěn)定地整合至基因組中。在另一實施例中，該真核宿主細胞為倉鼠或小鼠細胞，諸如CHO、NS0、Sp2/0-Agl4、BHK21、BHKTIC、HaK、2254-62.2(BHK-21衍生物)、CHO-K1、CHO-DUKX(=CHOduk-、CHO/dhfr)、CHO-DUKXBl、CHO-DG44、CHOPro-5、V79、B14AF28-G3、CHL細胞，優(yōu)選為CHO細胞且尤其優(yōu)選為CHO-DG44細胞。在另一實施例中，該真核宿主細胞為哺乳動物細胞，包括(但不限于)人類、小鼠、大鼠、猴或嚙齒動物細胞系。在另一實施例中，該宿主細胞為真核細胞，包括(但不限于)酵母、昆蟲、鳥類及植物細胞。在另一特定實施例中，該真核宿主細胞的特征在于其另外含有抗細胞凋亡基因，諸如BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、Al、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN畫2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL或CED-9,優(yōu)選為Bcl-xL或BCL-2,最佳為BCL-xL。本發(fā)明進一步是關于一種發(fā)展經(jīng)穩(wěn)定轉染的高產(chǎn)真核宿主細胞系的方法，該方法由以下步驟表征(a)將至少一個本發(fā)明的核酸或一個本發(fā)明的TE元件整合至含有目的基因的真核表達載體中；(b)用此表達載體轉染真核宿主細胞；(c)選擇經(jīng)轉染的高產(chǎn)宿主細胞。本發(fā)明進一步是關于一種發(fā)展經(jīng)穩(wěn)定轉染的高產(chǎn)真核宿主細胞系的方法，該方法由以下步驟表征(a)將目的基因整合至含有至少一個本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的TE元件的真核表達載體中；(b)用此表達載體轉染真核宿主細胞；(c)選擇經(jīng)轉染的高產(chǎn)宿主細胞。在一特定實施例中，該方法的特征在于還含有至少一個額外擴增步驟。本發(fā)明亦是關于一種制備及選擇重組哺乳動物細胞的方法，該方法由以下步驟表征(a)用編碼至少目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物、新霉素磷酸轉移酶(優(yōu)選經(jīng)修飾)及可擴增的可選擇標記DHFR的基因轉染宿主細胞，其中為增強轉錄或表達，使至少目的基因與至少一個如權利要求1至14中任一項的核酸在功能上連接；(b)在能夠使不同基因得到表達的條件下培養(yǎng)該等細胞；(c)通過在諸如G418的選擇劑存在下在無次黃嘌呤/胸苷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該等細胞來選擇此等經(jīng)共整合的基因，及(d)通過在使得至少可擴增的可選擇標記基因可擴增的選擇劑(諸如曱氨蝶呤)存在下培養(yǎng)該等細胞來使此等經(jīng)共整合的基因擴增。在一特定實施例中，此方法的特征在于在無血清存在下在補充有至少200pg/mLG418，優(yōu)選400pg/mL或更多G418的無次黃嘌呤/胸苷的培養(yǎng)基中且添加遞增濃度的MTX來培養(yǎng)經(jīng)轉染的細胞。在另一特定實施例中，此方法的特征在于第一擴增步驟中MTX的濃度為至少100nM或至少250nM且逐步增至1|iM或1(iM以上。在個別情況在另一特定實施例中，此方法的特征在于額外的克隆步驟。在本發(fā)明的方法的另一實施例中，宿主細胞為嚙齒動物/倉鼠細胞，諸^口CHO、NS0、Sp2/0-Ag14、BHK21、BHKTK-、HaK、2254-62.2(BHK-21衍生物)、CHO-Kl、CHO-DUKX(=CHOduk-、CHO/dhfr》、CHO-DUKXBl、CHO-DG44、CHOPro-5、V79、B14AF28-G3、CHL細胞，優(yōu)選為CHO細胞且尤其優(yōu)選為CHO-DG44細胞。在本發(fā)明的一優(yōu)選方法中，表達載體含有可選擇標記，諸如DHFR或NPT,例如NPTF240I或NPTD227G。在本發(fā)明的方法的一尤其優(yōu)選實施例中，高產(chǎn)者的比例可增加至兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍或十倍，或增加至兩倍以上、三倍以上、四倍以上、五倍以上、七倍以上或十倍以上，優(yōu)選為增加至五倍或增加至三倍以上。本發(fā)明進一步是關于一種制備生物藥產(chǎn)物的方法，該方法由以下步驟表征(a)將至少一個本發(fā)明的核酸或一個本發(fā)明的TE元件整合至含有目的基因的真核表達載體中；(b)用此表達載體轉染真核宿主細胞；(c)選擇經(jīng)轉染的高產(chǎn)宿主細胞，及(d)在使得目的基因可表達的條件下培養(yǎng)所獲得的經(jīng)轉染的高產(chǎn)宿主細胞。本發(fā)明進一步是關于一種發(fā)展經(jīng)穩(wěn)定轉染的高產(chǎn)真核宿主細胞系的方法，該方法由以下步驟表征(a)將目的基因整合至含有至少一個本發(fā)明的核酸或一個本發(fā)明的TE元件的真核表達載體中；(b)用此表達載體轉染真核宿主細胞；(c)選擇經(jīng)轉染的高產(chǎn)宿主細胞，及(d)在使得目的基因可表達的條件下培養(yǎng)所獲得的經(jīng)轉染的高產(chǎn)宿主細胞。在一特定實施例中，本發(fā)明的方法的特征在于包含至少一個額外擴增步驟在一特定實施例中，本發(fā)明的方法的特征在于如下的額外步驟(e)收集并純化目的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進一步是關于本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的轉錄增強元件(TE元件)于真核表達載體中的用途，其是用于增加在真核宿主細胞中表達系統(tǒng)中目的基因的轉錄或表達或用于制備生物藥產(chǎn)物。本發(fā)明亦是關于本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的轉錄增強元件(TE元件)用于產(chǎn)生轉基因動物或植物的用途。本發(fā)明進一步是關于本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的轉錄增強元件(TE元件)在基因治療中的用途。本發(fā)明尤其是關于本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的轉錄增強元件(TE元件)作為藥物或在藥物組合物中的用途。本發(fā)明進一步是關于一種試劑盒，其是由本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的TE元件、任選表達載體、任選宿主細胞及任選轉染試劑組成。在一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明是關于一種核酸，特定言之為經(jīng)分離的核酸，更確切言之為除TE元件TE-OO(SEQIDNo.2)以外的具有SEQIDNo.1的轉錄增強或表達增強核酸元件(TE元件)或其片段或其衍生物，其在經(jīng)染色體整合后可使得目的基因的轉錄或表達增加。在另一實施例中，本發(fā)明是關于除TE元件TE-00(SEQIDNo.2)、TE-04(SEQIDNo.6)及TE-06(SEQIDNo.8)以外的本發(fā)明的核酸。在另一實施例中，本發(fā)明是關于除TE元件TE-00(SEQIDNo.2)、TE-04(SEQIDNo.6)、TE-05(SEQIDNo.7)及TE-06(SEQIDNo.8)以外的本發(fā)明的核酸。目的基因的表達增加可(例如)通過利用ELISA測量產(chǎn)物滴度來測量。本發(fā)明的另一實施例是關于一種長度超過160bp,優(yōu)選長度超過170bp的本發(fā)明的TE元件、片段或衍生物。在一特定實施例中，TE元件片段的長度介于160bp與1.2kb之間或介于170bp與1kb之間，優(yōu)選超過200bp且介于200bp與1kb之間。在一優(yōu)選實施例中，TE元件片段位于SEQIDNo.1中介于1bp與1578bp之間的部分中(此片段對應于元件TE-00(SEQIDNo.2)的5'片段)且長度超過113bp或超過132bp且優(yōu)選長度超過160bp或超過170bp。在一特定實施例中，TE元件片段的長度介于113bp與1.2kb之間、或介于132bp與1.2kb之間、或介于160bp與1.2kb之間，優(yōu)選超過200bp且介于200bp與1kb之間。在另一實施例中，TE元件片段不具有任何相鄰序列。此意謂片段不是一個更大序列或序列區(qū)的一部分，例如在其前(5，側)或其后(3'側)無其他序列相連。在另一特定實施例中，本發(fā)明是關于不含任何CpG島的本發(fā)明的核酸。由以下實驗中可明顯看出當將具有與不具有TE元件的真核宿主細胞相比較時，目的基因的比產(chǎn)率的相對變化可展示出增長至七倍。總結有關產(chǎn)物滴度及比產(chǎn)率的資料顯示，平均而言幾乎所有具SEQID的目的基因。在兩個獨立轉染系列中(各情況下使用不同的可選擇標記(NPT或DHFR)),TE元件01(SEQIDNo.3)、02(SEQIDNo.4)及08(SEQIDNo.IO)產(chǎn)生最高產(chǎn)率。其能夠使產(chǎn)率增加至4至7倍。當然，3kb及2.5kb的TE元件01(SEQIDNo.3)及02(SEQIDNo.4)對于另外與表達載體連接而言非常大。另一方面，更令人感興趣的是尺寸僅為1kb的TE元件08(SEQIDNo.10),其能夠使表達增加至5-6倍。TE元件06(SEQIDNo.8)在兩個轉染系列中產(chǎn)生三倍的比產(chǎn)率，該元件尺寸僅為381bp。由于較小載體通常更為穩(wěn)定且更易于在克隆期間與轉染期間處理，因此使表達載體盡可能的小是非常有利的。因此，使用TE-元件06(SEQIDNo.8)及08(SEQIDNo.10)以及13(SEQIDNo.15)作為轉錄4足進元件尤其有利。在下實施例亦顯示含有TE元件3(SEQIDNo.5)、04(SEQIDNo.6)或07(SEQIDNo.9)的細胞池展示目的基因約3至3.5倍的表達，且具有TE元件10(SEQIDNo.12)、11(SEQIDNo.13)或12(SEQIDNo.14)的細胞池展示目的基因約2倍的表達。與無TE元件的對照池相比，與可選纟奪標記NPTF240I—起使用的TE元件08(SEQIDNo.IO)展現(xiàn)目的基因的比產(chǎn)率的最大增長(增加至5倍)。與可選擇標記DHFR—起使用的TE元件08(SEQIDNo.IO)展示更佳增長，增加至約6.0倍。此外，測試系列中TE元件02(SEQIDNo.4)與可選擇標記DHFR展示目的基因的產(chǎn)率增加至6.8倍。TE元件13展示最大升高(增加至15倍)。以下實施例亦表明在一測試系列中具有TE元件05(SEQIDNo.7)及09(SEQIDNo.ll)的池未展現(xiàn)目的基因的表達增加，且一測試系列中甚至展示比對照池低的目的基因的表達。因此，此等兩元件及可能此等序列區(qū)中的部分片段可能在某些情況下具有抑制作用，盡管此并非必定情形。此外，在以下實施例中由所測試的不同TE元件所達成的比產(chǎn)率的相對變化很大程度上與載體系統(tǒng)無關，亦即與所用的可選擇標記或特定目的基因無關。以下實施例亦表明標記基因表達的變化與目的基因表達的變化相關。由以下實施例亦可明顯看出所測試的TE元件均無增強子作用。因此，以下實施例亦表明多個相同或不同的短TE元件(諸如TE元件06及08或21)的組合或級聯(lián)可產(chǎn)生額外表達增強作用。實施例縮寫AP:堿性磷酸酶Asp(=D):天冬氨酸bp:堿基對CHO:中國倉鼠卵巢DHFR:二氫葉酸還原酶ELISA:酶聯(lián)免疫吸附測定FACS:焚光活化細胞分選儀GFP:綠色熒光蛋白Gly(=G):甘氨酸HT:次黃嘌呤/胸苦IgG:免疫球蛋白GHe(=1):異亮氨酸IRES:內(nèi)部核糖體進入位點kb:千堿基mAb:單克隆抗體MCP-1:單核細胞趨化蛋白-lMTX:曱氨蝶呤NPT:新霉素磷酸轉移酶PCR:聚合酶鏈式反應Phe(=F):苯丙氨酸SEAP:分泌型堿性磷酸酶Ub:遍在蛋白UTR:未翻譯區(qū)方法勿應絲及絲在細胞培養(yǎng)瓶中，在37。C下在潮濕氣氛及5。/。C02中，在補充有次黃嘌呤及胸苷(HT)的無血清的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基(InvitrogenGmbH,Karlsruhe,DE)中以懸浮細胞形式永久性培養(yǎng)細胞CHO-DG4"dhf,(Urlaub等人，1983)。用CoulterCounterZ2(BeckmannCoulter)或用Cedex(Innovatis)測定細胞數(shù)及存活力，且接著將細胞以lxl05-3xl05/mL的濃度接種且每隔2-3天傳代一次。使用LipofectaminePlus試劑(InvitrogenGmbH)轉染CHO-DG44。對于各轉染混合物，將總共1.0-1.3嗎的質(zhì)粒-DNA、4的Lipofectamine及6pL的Plus試劑依照制造商說明書混合在一起，且以200的體積添加至位于0.8mL補充有HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基中的6xl()S個細胞中。在細胞培育箱中在37。C下培育3小時后，添加2mL補充有HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時后，收集轉染混合物(瞬間轉染)或使轉染混合物經(jīng)歷選擇。對于基于NPT的選擇，將細胞在轉染后2天轉移至含有400|ig/mLG418(Invitrogen)、補充有HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基中。對于基于DHFR的選擇，將細胞在轉染后2天轉移至無HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基中。若進行共轉染(其中一表達載體含有DHFR而另一表達載體含有NPT可選擇標記)，則在基于DHFR及基于NPT的選擇中，將細胞在轉染后2天轉移至未添加次黃嘌呤及胸苷的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基中，且此外將G418(Invitrogen)以400)ig/mL的濃度添加至培養(yǎng)基中。可通過將選擇劑MTX(Sigma，Deisenhofen,DE)以5-2000nM的濃度添加至無HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基中來達成經(jīng)整合的異源基因基于DHFR的基因擴增。為分析表達，使用真核表達載體，所述載體基于pAD-CMV載體(Wemer等人，1998)且通過CMV增強子/倉鼠遍在蛋白/S27a啟動子(WO97/15664)或CMV增強子/CMV啟動子的組合介導異源基因的表達。盡管基本載體pBID含有可充當可擴增的可選擇標記的dhfr-微型基因(例如參見EP-0-393-438)，但在載體pBING中dhfr微型基因已置換為經(jīng)修飾的NPT基因。此基因為NPT變異體D227G(Asp227Gly)。如WO2004/050884中所粒pTE4含有可選擇標記NPT變異體F240I(Phe240Ile)，且pTE4為質(zhì)粒pBING的衍生物。除將NPT變異體D227G置換為NPT變異體F240I外，亦將GFP置換為來自載體pDsRed2(Clontech,PaloAlto,CA,USA)的紅色熒光蛋白DsRed2?；举|(zhì)粒pTE5含有可選擇標記DHFR且為載體pBIDG(WO2004/050884)的衍生物，其中GFP亦置換為來自載體pDsRed2(Clontech，PaloAlto,CA，USA)的紅色熒光蛋白DsRed2。為表達單克隆人源化IgGl抗體，將重鏈以1.4kbSall/Spel片段形式克隆至經(jīng)XbaI及SalI消化的質(zhì)粒pBID中，以得到質(zhì)粒pBID-HC(圖1A)。另一方面，將輕鏈以0.7kbBamHI/Hindlll片段形式克隆至質(zhì)粒pBING的BglII/Hindin切割位點，從而產(chǎn)生質(zhì)粒pBING-LC(圖1A)。將人類MCP-1cDNA(Yoshimura等人，1989)以0.3kbHindlII/EcoRI片段形式克隆至載體pTE4或pTE5的相應切割位點，乂人而產(chǎn)生質(zhì)粒pTE4/MCP-l及pTE5/MCP-l(分別參見圖1B及圖2)。MGSf炎^活化勿應》遂/力使用BDFACScalibur(BDBioscience)進行流式細胞分析。FACS配備有激勵波長為488nm的氦-氬激光器。熒光強度在適于特定熒光蛋白的波長下吸收，且藉助于所附軟件CellQuestPro進行處理。r錄聯(lián),瘦^[^都;t)使用OptiEIAHumanMCP-1Set試劑盒，依照制造商說明書(BDBiosciencesPharmingen,Heidelberg,DE)，通過ELISA量化上清液中經(jīng)穩(wěn)定轉染或經(jīng)瞬間轉染的CHO-DG44細胞中的MCP-1滴度。在一方面使用山羊抗人類IgGFc片段(Dianova,Hamburg,DE)，且另一方面使用AP偶聯(lián)的山羊抗人類k輕鏈抗體(Sigma),根據(jù)標準程序(CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等人，1994,已更新)通過ELISA量化上清液中經(jīng)穩(wěn)定轉染的CHO-DG44細胞中的IgGlmAb。使用經(jīng)純化的IgGl抗體作為標準。根據(jù)公式pg/((Ct-Co)t/ln(Ct-Co))計算產(chǎn)率(pg/細胞/天)，式中Co及Ct分別為接種及收集后的細胞數(shù)且t為培養(yǎng)時間。編尸政使用SEAP報導基因測定，依照制造商說明書(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,DE)量化培養(yǎng)物上清液中經(jīng)瞬間轉染的CHO-DG44細胞中的SEAP滴度。實施例1:TE元件TE-A的分離及克隆自W097/15664中所述的倉鼠基因組中包含遍在蛋白/S27a基因的編碼區(qū)以及相鄰的包括Ub/S27a-啟動子的5，UTR區(qū)的序列起始，分離進一步上游迄今未知的序列區(qū)。為此，使用銜接子接合的基因組CHO-DG44DNA作為"巢式PCR，，的基質(zhì)。使用與銜接子互補的引物或與W097/15664中所列序列SEQIDNo.5的5'區(qū)中的倉鼠序列互補的引物(引物Ub20:5，-CTCCACACATTTACACATGGACAC-3'(SEQIDNo.39),對應于WO97/15664中SEQIDNo.5的核苷酸62至85(互補序列))的組合來進行第一輪PCR。接著，使用由內(nèi)部銜接子引物與內(nèi)部("巢式")倉鼠特異性引物(引物Ub21:5'-GGGTTTCTCTG丁GTAATAGCCATG-3'(SEQIDNo.40),對應于W097/15664中SEQIDNo.5的核苷酸16至39(互補序列))組成的第二引物組合來進行第二輪PCR。將所得重疊DNA片段一一該片段起始于具有已知序列的倉鼠特異性引物端、且接著并入位于上游的未知新序列區(qū)一一亞克隆至pCR2.1TOPO載體(Invitrogen)中且通過測序加以分析。自倉鼠Ub/S27a基因的上游獲得全部348bp的迄今未知的新序列?；诖诵碌男蛄行畔ⅲ褂蒙鲜?巢式PCR"分離另一更上游的DNA區(qū)。此次，使用銜接子引物及引物Ub33(5'-ATCTCACTGTGTCTACCAACTTAG-3'(SEQIDNo.41),位于新分離的348bp序列的5'區(qū)中，對應于SEQIDNo.1的核苷酸1268-1291(互補序列))進行第一輪PCR，且使用內(nèi)部銜接子引物及進一步靠內(nèi)的倉鼠特異性引物Ub32a(5'-TCTGCACCACCACTACCTGACT-3'(SEQIDNo.42),位于新分離的384bp序列內(nèi)引物Ub33的上游，對應于SEQIDNo.1的核苷酸1243-1264(互補序列))進行第二輪PCR。將所得經(jīng)擴增的物質(zhì)亞克隆至pCR2.1TOPO載體(Invitrogen)中且測序。其含有來自倉鼠Ub/S27a基因上游的另一1239bp的迄今未知的新序列。利用重疊PCR片段的序歹'J信息，使用引物Ub34(5'-CTAAGAGTACTTGCCATGAGAGCCTGAA-3'(SEQIDNo.43)，位于新分離的1239bp序列的最外5，端，1"義部分存在于SEQIDNo.l中(核苷酸1至14》及Ub35(5'-CATTGATACACCACCAAAGAACTTG-3'(SEQIDNo.44),對應于SEQIDNo.1的核芬酸1941至1965(互補序列))，通過PCR擴增來自CHO-DG44基因組DNA的集合在一起的序列區(qū)，其包含所有至此所分離的部分片段，且有383bp延伸至WO97/15664中SEQIDNo.5的5，序列區(qū)中。將所得2kbDNA片段與WO97/15664中所述的序列IDNo.5的5'UTR區(qū)經(jīng)由內(nèi)源EcoRI切割位點(位置353-358)接合，但此切割位點可用KlenowDNA聚合酶通過填補反應消除。以同樣方式消除新分離的基因組區(qū)中的第二個內(nèi)源EcoRI切割位點，從而在SEQIDNo.1中形成相對原基因組序列而言是額外的核苷酸326至329。與內(nèi)源倉鼠序列相比，以此方式在SEQIDNo.1中插入總共8個額外核苷酸。將從位于倉鼠Ub/S27a基因上游的序列區(qū)中得到的3788bpDNA片段命名為具有序列IDNo.1的TE元件A，且將其亞克隆至載體pBluescriptSKM(Stratagene,LaJolla,CA)中。實施例2:多種TE表達載體的產(chǎn)生從來自CHO基因組的3.8kbTE元件TE-A(圖3，序列IDNo,l)起始，通過PCR制備多種片段，其與TE元件TE-A相比在5，-端或3，-端具有缺失(圖4及圖5)。為合成此等片段，使用順向引物與一反向引物的組合(圖5及圖6)。為進行克隆，經(jīng)由引物將BamHI切割位點連接于片段的5，-端、且將BsrGI切割位點連接于片段的3，-端。由此產(chǎn)生12種具有不同長度的TE元件，其命名為TE-01至TE-12(圖4及5)。在用BsrGI及BamHI消化后，將此等片段以順向的方向克隆至基本質(zhì)粒pTE4/MCP-l(圖IB)或pTE5/MCP-l(圖2)的銜接子區(qū)中。通過SacII限制性酶消化，從TE-A的亞克隆分離片段TE-00(SEQIDNo.2)，且將其經(jīng)由位于啟動子/增強子元件的5，的Spel切割位點以順向與逆向克隆至基本載體pBING-LC(圖1A)或pBID-HC(圖1A)中。TE元件的序列TE-A(序歹'jIDNO.l)ccatgagagcctgaagacctgagttgatacccagaacccagatcaagatggaggagagaaccagccccactaagctgtcccctgacccccataaatgcctccctgtccagttatgccacacaatgataggtgaatacagaaaaacacccttcctttagacactaagcggattcctcttacgcataccagttaagtgatagttcttaggcttcaactcagcactttaaaaagtttatattttgcaatgctggggactaaattagggttgtgcacatgctaagtaagcactctacttttgtatcacattttaataattgtaagaattaattcgtgaaatagtagctgagacaatagatttgtttctttcatgtgggaactgctgtgtgtgcttcttgctgatgcaaacaaggtcaaatactttattccccagtgtctgcctagccctgtaacacttctctattatacaatgaccacaaataattaggtgagtgggttttgtttcattttaaattgttgctattttagagacaggatt認gcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctg嗎犯tgaccttg肌a3Ccttcctgtccc3cccctc3aattcc3gaattat昭3C3ccc3ccacatggctt犯加gt犯ac犯c犯c3at犯33gc3tgacttctgggtctgg3gggagggcttgcc3gtt朋gagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggca3C3C3C3catgggc3catec3C3cgcacccgccc3ccatggcttttcccccatc3CttegEic3gccat3ttteaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatCtc犯犯犯ctg犯3c犯c幼c犯c犯c犯肌ca3aata犯犯a3c肌c犯33g3atctt敏ggttc3gtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtg3a肌g肌ctcaaatteatt幼atatttg3aactatctaagaata肌嗎ctea犯tattt犯犯1tec敏c3ggtegtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaat肌ct3at犯3atat3c3a3at3肌gg3g3c3ccac3at3attttgaaatgta3犯gact33attt3ccttttatattgatg3gttgg3ta肌犯犯tc3attteccag3ga3cata犯gtagtcccatc犯3g3c犯肌gc犯t3tatg3tt犯3ctctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtct犯肌agtgatctccagg3c昭ccatggctattec3C3g紹3a3ccctgtctggaaaaac肌幼aatt3gtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtocrtcatatttgaagtattttattctttgcagtgttgaatatcaattctagcacctcagacatgttaggtaagtaccctacaactcaggttaactaatttaatttaactaatttaaccccaacactttttctttgtttatccacatttgtggagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgcgcgcgcgcgcgctcggatcattctaccttttgtttaaaaaatgttagtccaggggtggggtgcactgtgaaagtctgagggtaacttgctggggtcagttctttccactataggacagaactccaggtgtcaactctttactgacagaaccatccaaatagccctatctaattttagttttttatttatttattttttgtttttcgagacagggtttctctgtggctttggaggctgtcctggaactagctcttgtagaccaggctggtctcgaactcagagatccacctgcctctgcctcctgagtgctgggattaaaggcatgcgccaccaacgcttggctctacctaattttaaaagagattgtgtgtcacaagggtgtcatgtcgccctgcaaccaccccccccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaacttcactgaagctgaagcacgatgatttggttactctggctggccaatgagctctagggagtctcctgtcaaacagaatctcaacaggcgcagcagtcttttttaaagtggggttacaacacaggtttttgcatatcaggcattttatctaagctatttcccagcca肌幼tgtgtattttgg3ggc3gc3g3gctaat3gattea3atg紹ggaag3gccc3cacaggttattegg3agat3agcatcttctttatataaaacaaaaccaaaccaaactggaggaggtctacctttagggatggaagaaaagacatttagagggtgcaatagaaagggc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池大(圖7)。在質(zhì)粒中存在順向或逆向的TE元件的各池之間未發(fā)現(xiàn)任何型式的差異。因此，TE元件00的作用(亦即，增加混合群中具有較高產(chǎn)率的細胞的比例)與TE元件00的取向無關。此外，測定經(jīng)六至八次傳代(傳代節(jié)律2-2-3天)的時間后各池的IgGl滴度及比產(chǎn)率。此再次證明含有TE元件00的細胞池平均表達超過無TE元件的細胞池(圖9,系列A及B)。在兩個系列中，可證明池產(chǎn)率因TE元件的存在而加倍，而此與元件在表達質(zhì)粒中克隆的取向無關。實施例4:TE元件TE-01至TE-12對MCP-1的表達的影響研究在CHO-DG44細胞的三個穩(wěn)定轉染系歹'K系列C、D及E)中，與無TE元件情況下的表達相比，TE元件TE-01至TE-12對分泌型MCP-1的表達的影響。在所有三個系列中，每種質(zhì)粒變異體制備6個池。系列C及D中的基本質(zhì)粒為pTE4/MCP-l(圖1B;可選擇標記NPT二新霉素磷酸轉移酶F240I),系列E中為pTE5/MCP-l(圖2;可選4奪標記DHFR二二氫葉酸還原酶)。此等質(zhì)粒不含TE元件(=對照混合物)或在啟動子/增強子的上游含有處于順向的TE元件TE-01至TE-12之一。為將由轉染混合物中DNA的不同量所引起的對轉染效率的影響降至最小，使用總計1.2叱的質(zhì)粒-DNA。視所引入的TE元件的尺寸而定，質(zhì)粒尺寸介于6.7kb與10.7kb之間不等。然而，為確保所有混合物中測試質(zhì)粒的分子總數(shù)保持恒定，在具有較小質(zhì)粒分子的混合物中用所謂的模擬質(zhì)粒平衡DNA的總量，該模擬質(zhì)粒既不含有產(chǎn)物基因及TE元件，亦不含有任何真核可選擇標記。作為陰性對照，對于各轉染系列，亦操作模擬轉染池，亦即以同樣方式處理，但不添加DNA至轉染混合物中。轉染后兩天，在系列C及D中用補充有HT的CHO-S-SFMII+G418(400嗎/mL)且在系列E中用無HT的CHO-S-SFMII對經(jīng)穩(wěn)定轉染的細胞進行選擇。選擇之后，通過FACS測定表達dsRed2的細胞的比例。圖8展示系列C中存活的轉染細胞的相對熒光百分比。與對照池相比，含有TE元件TE-01、TE-02或TE-08的池含有約3至3.5倍的表達dsRed2的細胞，且具有元件TE-06的池含有約2倍的表達dsRed2的細胞。另一方面，與對照池相比，在具有片段TE-05及TE-09的池中，表達dsRed2的細胞的比例未明顯提高。此外，經(jīng)6次傳代(傳代節(jié)律2-2-3天)的時間后MCP-1產(chǎn)物滴度及比產(chǎn)率亦升高。圖9(系列C及D)及圖IO(系列E)展示相對MCP-1比產(chǎn)率。與無TE元件的對照池相比，與可選擇標記NPT-F240I—起使用的元件TE-08展示MCP-1比產(chǎn)率的最大增長(增長至5.3倍)(圖9)。在此變異體中與可選擇標記DHFR組合可達成6倍的增長(圖10)。與對照池相比，TE元件01、02及03可使NPT選擇池的產(chǎn)率增加至4至4.5倍(圖9)且使DHFR選擇池的產(chǎn)率增加至2.6至6.8倍(圖10)。在所有系列中，長僅為300bp的TE元件06亦能夠使產(chǎn)率增加至2.5至3.2倍(圖9及10)。用片段TE-04及TE-O7達成的增長亦為此數(shù)量級(圖10)。使用稍長片段TE-IO、TE-11及TE-12的池展示雙倍的MCP-1表達(圖9及10)。顯然，在所有此等池中，幾乎不表達或不表達產(chǎn)物的細胞的數(shù)目減少，且因此細胞群中總體高產(chǎn)者的比例提高。此指示TE元件能夠抑制、遮蔽或消除負面染色體位置效應。相比之下，如有關dsRed2表達中已經(jīng)見到的，與對照相比，通過使用片段TE-05及TE-09未能增加表達(圖8)，且在某些情況下表達甚至更低(圖9及10)。此等元件或此等序列區(qū)中的部分片段因此可能甚至具有抑制作用?？傊?，所觀測到的MCP-1表達的變化與穩(wěn)定細胞池中表達dsRed2的細胞的比例有關。實施例5:TE元件TE-01至TE-12增強子活性的測試通過瞬間轉染CHO-DG44細胞，進行測試以了解所觀測到的產(chǎn)物表達的增加實際上是基于TE元件的染色質(zhì)開放作用還是基于增強子活性。當質(zhì)粒在瞬間轉染中未整合至基因組內(nèi)時，直接由質(zhì)粒讀出遺傳信息。因此，不存在染色體位置效應。若仍存在對基因表達的正面影響，則此等影響可歸因于存在于TE元件中的增強子。該等增強子可以順式定位作用于啟動子的活性(與位置及取向無關)且刺激功能上連接的基因的轉錄。在圖11中所示的瞬間表達研究中，將6個池用基本質(zhì)粒pTE4/MCP-1(=對照；圖1B)或其衍生物轉染，該等衍生物各自額外在啟動子/增強子和上游含有TE元件TE-01至TE-12之一。在以3mL總體積培養(yǎng)48小時后，進行收集且通過ELISA測定細胞培養(yǎng)物上清液中的MCP-1滴度。通過用SEAP表達質(zhì)粒共轉染(每種轉染混合物添加100ng質(zhì)粒DNA)及隨后測量SEAP活性來修正轉染效率的差異。圖11展示6個平行池的平均值。資料表明，在所有池中細胞培養(yǎng)物上清液中的MCP-1滴度極其類似，且在表達上與無TE元件的對照質(zhì)粒pTE4/MCP-l無顯著差異。因此，在經(jīng)穩(wěn)定轉染的細胞池中，由某些TE元件所引起的2倍以上的產(chǎn)率提高并非基于TE序列中存在增強子。因此，對于通過TE元件獲得表達增強而言，染色體整合是絕對必需的。實施例6:其他TE元件的制備及不同TE元件位置及組合的測試可以類似于實施例2中所述的方法產(chǎn)生序列IDNo.1的其他部分片段或其衍生物，且如實施例3及5中所述測試其對產(chǎn)率的正面影響。可能的片段的一些實例展示于圖12中。迄今所獲得的結果指示(例如)圖12中所示的序列IDNo.1的區(qū)域亦可促使基因表達增加。在穩(wěn)定轉染系列中，更精確表征此等新的TE元件對比產(chǎn)率的影響，以便定位及進一步縮小具有功能重要性的序列區(qū)的范圍。將功能縮小在特定序列區(qū)的范圍內(nèi)及與此相關的片段長度的可能降低有利于表達載體的有效使用，因為表達質(zhì)粒越小越穩(wěn)定，且越易于在克隆和轉染期間操控。此外，可在質(zhì)粒內(nèi)以彼此間的任何取向以及任何位置排列相似或不同的片段區(qū)。亦可在穩(wěn)定轉染系列中研究何種組合有可能使表達達成最佳增長。圖13中展示某些實施例，該等實施例無任何限制性。因此，舉例而言，研究應判定TE元件TE-06及TE-08當側接于產(chǎn)物基因兩側或相繼排列時能否促使表達額外增強。此外，亦可設想諸如TE元件06及08的可相同或不同的短TE元件的級聯(lián)(例如)亦可產(chǎn)生額外的表達增強作用。其他TE元件TE元件13(序列IDNO.15)gttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatcTE元件14(序列IDNO.16)C肌3gcc3teg3ga犯ccctatctc3aaaa3ctga犯ca3ca3c3ac犯c3a3ac幼3ata3aa幼acaaca肌3gaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctecctegtg堪3ccttgttc犯at犯cteat犯3atateca犯at犯agg3g3C3cc3caataattttg犯atgta3aagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccaggTE元件15(序列IDNO.17)gttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaaca肌3c犯肌t肌aaa幼CEiacaa2i3gaatctt3gtggttcagtggttcc3C3C3C3gg犯agt3gaa3gggccttg3tgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatcta3g3atEiEiaagcta犯atattteaaattecagtc3ggtegtggtggtgc3g2igggcte3gttggtagEiC3cagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagEig肌cata肌gtagtccc3tcaaag3caa犯gcaatatatgatt2iaactct3atttaa肌gtttgttegagcctggca3cgtggcacatacctttaatccc3gcaccaggTE元件16(序列IDNO.18)acctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacac3g堪犯Eiccctgtctgg3a犯3c犯a幼att3gtgtccatgtg加atgtgtgg敏3tgcttgtcatgcc3catacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtcccTE元件17(序列IDNO.19)CM3gccatag3g3a3ccctatctc3aa犯actg犯3c犯c犯c3ac3ac犯犯caa3at肌犯aa3ca3c犯肌gaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatg3gac3ggatgatagtga3aag犯ctc3犯ttaatt犯atatttg犯actatcta3ga3t犯犯gct犯aatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtga^ccttgttcaaataactaate犯atateca3aata犯gg3g3caccac3atoattttgaaatgt犯犯g3ctaaatttEiccttttatattgatg3gttggata3犯a犯tc3atttecc3g3ga3cat3犯gtagtcccatc3aagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaCC3ggg3g2lC嗎3ggCC3tCCtggtct犯犯3gtg3tCtCC3gg3C3gCC3tggCta加C3C3g3g33aCCCtgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtcccTE元件18(序列IDNO.20)gttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtccc3cccctc犯3ttcc3g33ttet3g3C3ccc3cc3C3tggctt幼t犯gta犯caac肌C3at33幼gcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaaca333C3幼at3a犯aaac幼c3a肌gaatctt3gtggttC3gtggttcc3C3C3C3gg犯3gtag犯3gggccttg3tgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacaC3gtg3gatcc3ggcc3gcc3gggctacct2igtg3g3ccttgttc3a站a3cta3t3a33t3tec3a33ta33gg3gacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccag3g肌c3t犯agtegtcccatc3a3g3ca犯3gca3tatatgatte犯ctct3attt犯犯gtttgtt3g3gcctggc33cgtggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtcccTE元件21(序歹'JIDNO.21)cttgcggtcgaggactacagtcattttgcaggtttccttactgtatggcttttaaaacgtgcaaaggtgaccattaaccgtttcacgctgggagggcacgtgcggctcagatgcttcctctgactgagggccaggagggggctacacggaagaggccacacccgcacttgggaagactcgatttgggcttcagctggctgagacgccccagcaggctcctcggctacaccttcagccccgaatgccttccggcccataacccttcccttctaggcatttccggcgaggacccaccctcgcgccaaacattcggccccatcccccggtcctcacctgaatctctaactctgactccagagtttagagactataaccagatag實施例7:TE元件TE-13至TE-18對MCP-1的表達的影響研究在CHO-DG44細胞的穩(wěn)定轉染系列(系歹llF)中，與無TE元件情況下的表達相比，TE元件TE-13至TE-18對分泌型MCP-1的表達的影響。每種質(zhì)粒變異體制備4個池。在所有系列中，基本質(zhì)粒為pTE4/MCP-l(圖IB;可選擇標記NPT-新霉素磷酸轉移酶F240I)。各種質(zhì)粒變異體不含TE元件(=對照混合物)或于啟動子/增強子的上游含有處于順向的TE元件TE-13至TE-18之一(圖12)。為將由轉染混合物中DNA的不同量所引起的對轉染效率的任何影響降至最小，各情況下均使用總計1.2pg的質(zhì)粒DNA。視所引入的TE元件的尺寸而定，質(zhì)粒尺寸介于6.7kb與8.2kb之間不等。作為陰性對照，在各轉染系列中同時操作模擬轉染池，亦即以同樣方式處理，但在轉染混合物中不添加DNA。轉染后兩天，使用補充有HT的CHO-S-SFMII+G418(400ng/mL)對經(jīng)穩(wěn)定轉染的細胞進行選擇。MCP-1的產(chǎn)物滴度及比產(chǎn)率經(jīng)5至6次傳代(傳代節(jié)律2-2-3天)得到提高。圖14(系列F)展示相對MCP-1比產(chǎn)率。該等各元件均可使MCP-1平均表達增加。使用元件13獲得最大增長(15倍)，其甚至超過元件08所產(chǎn)生的IO倍增長。實施例8:各種位置及各種組合的TE元件對MCP-1表達的影響研究在CHO-DG44細胞的兩個穩(wěn)定轉染系歹'J(系列G及H)中，與無TE元件情況下的表達相比，表達質(zhì)粒中各種組合及各種位置的TE元件TE-06及TE-08對分泌型MCP-1的表達的影響。在兩個系列中，每種質(zhì)粒變異體制備6個池?；举|(zhì)粒為pTE4/MCP-l(圖1B;可選擇標記NPT-新霉素磷酸轉移酶F2401)。個別質(zhì)粒變異體不含TE元件^對照混合物)，或在增強子/啟動子元件之前含有TE-08或TE-A,或在增強子/啟動子元件之前含有TE-06與TE-08的組合，或在增強子/啟動子元件之前含有逆向的TE-08或TE-09(系列G)。在系列H中，在增強子/啟動子元件(E/P)之前且另外在終止信號(T)之后使用元件TE-06及TE-21或TE-08(圖13)。為將由轉染混合物中DNA的不同量所引起的對轉染效率的任何影響降至最小，各情況下均使用總計1.2(ig的質(zhì)粒DNA。視所引入的TE元件的尺寸而定，質(zhì)粒尺寸介于6.7kb與10.2kb之間不等。作為陰性對照，在各轉染系列中同時操作模擬轉染池，亦即以同樣方式處理，但在轉染混合物中不添加DNA。轉染后兩天，使用補充有HT的CHO-S-SFMII+G418(300^tg/mL)對經(jīng)穩(wěn)定轉染的細胞進行選擇。經(jīng)6次傳代(傳代節(jié)律2-2-3天)的時間后MCP-1的產(chǎn)物滴度及比產(chǎn)率提高。圖15展示系列G的相對MCP-1比產(chǎn)率。所有元件均可使MCP-1平均表達增加。最大增長(4倍)是由元件TE-A產(chǎn)生。在表達序列盒之前及之后TE-08同樣帶來增長。實施例9:TE元件TE-08對兩種免疫球蛋白G-4(IgG4)的表達的影響研究在CHO-DG44細胞的穩(wěn)定轉染系列(系列J)中，與無TE元件情況下的表達相比，TE元件TE-08對兩種IgG-4抗體的表達的影響。用基本質(zhì)粒pBIN-LC2或pBIN-LC3及pBID-HC2或pBID-HC3制備24個池，且用pBIN-LC2/TE08或pBIN-LC3/TE08及pBID-HC2/TE08或pBID-HC3/TE08制備24個池(圖16;可選擇標記NPT:新霉素磷酸轉移酶F240I及dhfF二氫葉酸還原酶)。為將由轉染混合物中DNA的不同量所引起的對轉染效率的任何影響降至最小，在各情況下均使用總計1.2lig的質(zhì)粒DNA。視所引入的TE元件的尺寸而定，質(zhì)粒尺寸介于6.1kb與7.5kb之間不等。作為陰性對照，在各轉染系列中同時操作模擬轉染池，亦即以同樣方式處理，但不添加DNA至轉染混合物中。轉染后兩天，使用無HT的CHO-S-SFMII+G418(400嗎/mL)對經(jīng)穩(wěn)定轉染的細胞進行選擇。經(jīng)4次傳代(傳代節(jié)律2-2-3天)的時間，IGG-4的產(chǎn)物滴度及比產(chǎn)率提高。元件08使得IgG4抗體的表達的平均表達率增加。此外，元件TE-08的存在亦可增加獲得高產(chǎn)細胞池的機率。實施例10:TE元件對293F細胞中的蛋白質(zhì)表達的影響研究在HEK293游離型細胞的穩(wěn)定轉染系列(系列K)中，與無TE元件情況下的MCP-1表達相比，各種TE元件對分泌型MCP-1的表達的影響?；举|(zhì)粒為pTE4-4/MCP-l(圖1B;可選擇標記NPT^新霉素磷酸轉移酶F24(H)。在增強子/啟動子的上游順向使用元件TE-08、TE-13及TE-A，且每種質(zhì)粒變異體制備7-10個池。為將由轉染混合物中DNA的不同量所引起的對轉染效率的任何影響降至最小，在各情況下均使用總計1.2pg的質(zhì)粒DNA。視所引入的TE元件的尺寸而定，質(zhì)粒尺寸介于6.7kb與10.2kb之間不等。作為陰性對照，在各轉染系列中同時操作模擬轉染池，亦即以同樣方式處理，但不添加DNA至轉染混合物中。轉染后兩天，用293SFMII培養(yǎng)基+4mM谷氨酰胺+G418(100pig/ml)對經(jīng)穩(wěn)定轉染的細胞進行選擇。經(jīng)5至6次傳代(傳代節(jié)律2-2-3天)的時間，MCP-1的產(chǎn)物滴度及比產(chǎn)率提高。實施例11:TE元件TE-08對酶(SEAP)表達的影響研究在CHO-DG44細胞的穩(wěn)定轉染系列(系歹'JL)中，與無TE元件情況下的SEAP表達相比，TE元件TE-08對酶(SEAP)表達的影響。每種質(zhì)粒變異體制備6個池?；举|(zhì)粒為卩丁￡-4/8￡八？。其是通過將]\^^-1-11^8-DsRed2表達盒替換為SEAP來產(chǎn)生。將元件TE-08克隆至銜接子A中(圖IB;可選擇標記NPT二新霉素磷酸轉移酶F240I)。為將由轉染混合物中DNA的不同量所引起的對轉染效率的任何影響降至最小，在各情況下均使用總計1.2pg的質(zhì)粒DNA。視所引入的TE元件的尺寸而定，質(zhì)粒尺寸介于6.6kb與7.6kb之間不等。作為陰性對照，在各轉染系列中同時操作測試模擬轉染池，亦即以同樣方式處理，但不添加DNA至轉染混合物中。轉染后兩天，用補充有HT的CHO-S-SFMII+G418(400lig/mL)對經(jīng)穩(wěn)定轉染的細胞進行選擇。使用可購得的SEAP測定(Clontech)來測定相對SEAP表達，且相對SEAP表達經(jīng)6次傳代(傳代節(jié)律2-2-3天)的時間提高。參考文獻清單Adam,M.A.等人,/Wra/1991,65,4985-4990。Altschul，S.F.等人,A^c/e/c爿c/血ies.1997，25，3389-3402。Altschul,S.F.等人,J"Mo/傷o/1990，215，403-410。Aronow,B丄等人，Mo/.CW/.所o/.1995，"，1123-1135。Ausubel,F.M.等人,CurrentProtocolsinmolecularbiology.NewYork:GreenePublishingAssociates及Wiley-Interscience1994(更新)。Baker,丄E.,Towrw"/0/五x/7e〃7we/^"/A/e^jfcz'"e1999，7P0，669-679。Bell,A.C.及Felsenfeld,G"'CwrewfOp/m'owGe"WcscfeZ)eve/opme"f1999，9,191-198。Bennett,R.P.等人，所。:Tec/zm々wes1998，24,478-482。Chalfie，M.等人，&/e"ce1994，263，802-805。Chamov,S.M.等人,AntibodyFusionProteins,Wiley-LissInc.,1999。Davies,M.V.等人，/F/ra/1992,66,1924-1932。Delgado,S.等人，￡MS(9/owwa/1998，77,2426-2435。Faisst，S.等人，7Vwc/ez'd^iasean^1992,20,3-26。Gossen,M.等人，CwrC>//5z'ofec/z1994,5，516-520。Haber,D.A.等人,5bm""cCW/Ge"e"c;1982,8,499-508。Harris等人,ProteinPurification:APracticalApproach,Pickwood及Hames編，IRLPress,1995。Hemann，C.等人，DAC4Ce〃說o/1994，13(4)，437-445。Hu,S.等人，C露erto.1996,56(13),3055-3061。Huston,C.等人，尸tociVaf/爿cad5W1988,85(16),5879-5883。Jang，S.K.等人，/Wra/1989,63，1651-1660。Jenuwein，T.等人，iVa/wrc1997,269-272。Kaufman,R丄，MeAocfe^zymo/c^1990，185,537-566Klehr,D.等人，所oc/zemW^"91，30,1264-1270。Kortt，A.A.等人，5wg/"eer/"g1997，10(4)，423-433。Kwaks,T.H丄等人，A^ww歷otec/zw/ogy2003,2厶553-558。Li，Q.等人，說ood2002'川6>，3077-3086。LottspeichF.及ZorbasH.編，Bioanalytic,SpektrumAkad.Verl.,1998。Lovejoy,B.等人，S",e膨1993,259,1288-1293。McKnight,R.A.等人，尸A^S1992，卯，6943-6947。Monaco,L.等人，G匿1996,180,145-15。Morgan,R.A.等人，A^c/a'cWesea/r/z1992,20,1293-1299。Mosser,D.D.等人，歷orec/zm々腦1997，22，150-161。Ortiz,B.D.等人，Mo/ecw/arcfeCW/w/ar歷o/ogy1999，"，1901-1909。Ortiz,B.D.等人，五MB(9/1997，M,5037-5045。Ohshima,Y.等人，JMo/說W1987，195,247-259。Pack,P.等人，所otec/wo/ogy1993,11,1271-1277。Pack,P.等人，JAfo/傷o/1995，246(11),28-34。Pelletier,J.等人,1988，334，320-325。Perisic,O.等人，》w"鮮1994，2,1217-1226。Pikaart,M丄等人，Dev1998，72，2852-2862。Poljak,L.等人，7Vmc/.Jc/血i^1994，"，4386-4394。Ramesh,N.等人，A^c/e/cJczVfc7asearc/21996,24，2697-2700。Sambrook,J.等人,MolecularCloning:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989。Sautter,K.及Enenkel,B.，歷otec/z"o/ogvaw<i2005,狄530-538。Scopes,R.,ProteinPurification,SpringerVerlag，1988。Simonson，CC等人,/VoctVw/JcadSW1983,80,2495-2499。Stief，A.等人，Atowe1989，34/，343-345。Sugimotoetal"所她c/mo/ogy1994,12，694-698。Udvardy,A.等人，Jb訓a/。/Mo/簡/w腸/ogy1985,341-358。Udvardy,A.，五MSOJ1999,/S，1-8。Urlaub，G.等人，Ce//1983，33，405-412。Urlaub,G.等人，5Vm加.cCe〃&M/,/arG麼"cs1986，"，555-566。Werner,R.G等人，爿，由她/-尸0^1^1998，銀870-880。Wigler,M等人，iVoc胸"cW5W園1980,77,3567-3570。Yoshimura，T.，F(xiàn)五^S"丄e論w1989，2W，487-493。Zahn-Zabal，M.等人，Tow簡/。/所她c/mo/，2001，S7，29-42。WO97/15664EP-0-393-438WO2004/050884WO02/081677US6,027,915US6,309,851WO01/04306WO00/34318WO00/34326WO00/34526WO01/27150US5，122，458WO94/05785WO92/08796WO94/28143WO03/00470權利要求1.一種核酸，其包含TE-13(SEQIDNo.15)、或TE-13(SEQIDNo.15)的片段、或與TE-13或TE-13的片段互補的核苷酸序列、或TE-13(SEQIDNo.15)的衍生物、或該衍生物的片段、或與該衍生物或該衍生物的片段互補的核苷酸序列，其中該核酸在經(jīng)染色體整合后使得表達系統(tǒng)中目的基因的轉錄或表達增加。2.一種核酸，其包含TE-08(SEQIDNo,10)、或TE-08(SEQIDNo.10)的片段、或與TE-08或TE-08的片段互補核苷酸序列、或TE-08(SEQIDNo.10)的衍生物、或該衍生物的片段、或與該衍生物或該衍生物的片段互補的核苷酸序列，其中該核酸在經(jīng)染色體整合后使得表達系統(tǒng)中目的基因的轉錄或表達增力口。3.—種核酸，其包含SEQIDNo.1,或SEQIDNo.1的片,殳、或與SEQIDNo.1或SEQIDNo.1的片段互補的核苷酸序列，或SEQIDNo.l的衍生物、或該衍生物的片段、或與該衍生物或該衍生物的片段互補的核苷酸序列，其中該核酸在經(jīng)染色體整合后使得表達系統(tǒng)中目的基因的轉錄或表達增加，其中所述片段或衍生物包含至少一個由SEQIDNO.1的lbp至1578bp之間的核酸區(qū)域組成的序列區(qū)域。4.如權利要求1至3中任一項所述的核酸，其特征在于表達系統(tǒng)中目的基因的轉錄或表達與不包含TE元件的對照物相比增加例如是通過ELISA測量產(chǎn)物滴度來測定。5.如權利要求1至4中任一項所述的核酸，其在嚴格條件下與下列雜交(a)核酸序列TE-13(SEQIDNo.15)或TE-08(SEQIDNo.10)的區(qū)域，或(b)核酸序列TE-13(SEQIDNo.15)或TE-08(SEQIDNo.IO)的互補核酸序列，或(c)與(a)或(b)具有至少約70%序列同一性的核酸序列，優(yōu)選至少約80%或85。/。序列同一性，更優(yōu)選至少約90%序列同一性，及最優(yōu)選至少約95%序列同一性。6.如權利要求5所述的核酸，其特征在于此核酸具有至少511bp的長度(二SEQIDNo.15所示TE-13的長度)，或至少1015bp的長度(SEQIDNo.10所示TE-08的長度)。7.如權利要求1至6中任一項所述的核酸，其中該核酸是選自TE-00(SEQIDNo.2)、TE-01(SEQIDNo.3)、TE-02(SEQIDNo.4)、TE-03(SEQIDNo.5)、TE-04(SEQIDNo.6)、TE-06(SEQIDNo.8)、TE-07(SEQIDNo.9)、TE-08(SEQIDNo.10)、TE-10(SEQIDNo.12)、TE-11(SEQIDNo.13)、TE-12(SEQIDNo.14)、TE-13(SEQIDNo.15)、TE-14(SEQIDNo.16)、TE-15(SEQIDNo.17)、TE-16(SEQIDNo.18)、TE-17(SEQIDNo.19)、TE-18(SEQIDNo.20)及TE-21(SEQIDNo.21)。8.如權利要求1至7中任一項所述的核酸，其特征在于該核酸為TE-00(SEQIDNo.2)、TE-06(SEQIDNo.8)、TE-21(SEQIDNo.21)、TE-10(SEQIDNo.12)、TE-11(SEQIDNo.13)或TE-12(SEQIDNo.14),優(yōu)選為TE-06(SEQIDNo.8)。9.如權利要求1至7中任一項所述的核酸，其特征在于該核酸為TE-01(SEQIDNo.3)、TE-02(SEQIDNo.4)、TE-03(SEQIDNo.5)、TE-07(SEQIDNo.9)或TE-08(SEQIDNo.10)。10.如權利要求9所述的核酸，其中該核酸為TE-08(SEQIDNo.10)。11.如權利要求1至7中任一項所述的核酸，其特征在于該核酸為TE-01(SEQIDNo.3)的片段或衍生物，優(yōu)選為TE-13(SEQIDNo.15)、TE-14(SEQIDNo.16)、TE-15(SEQIDNo.17)、TE-16(SEQIDNo.18)、TE-17(SEQIDNo.19)或TE-18(SEQIDNo.20)。12.如權利要求11所述的核酸，其中該核酸為TE-13(SEQIDNo.15)。13.如權利要求1至12中任一項所述的核酸，其中該核酸或該片段或該衍生物為分離的核酸。14.如權利要求1至13中任一項所述的核酸，其特征在于包含以下序列的核酸是與異源序列連接的TE-13(SEQIDNo.15)或TE-08(SEQIDNo.IO)或TE-07(SEQIDNo.9)或TE-06(SEQIDNo.8)或TE-21(SEQIDNo.21)，或這些序列的片段，或與這些序列或它們的片段互補的核苷S吏序列，或這些序列的衍生物，或這些序列的片段的衍生物，或它們的互補核苷酸序列，優(yōu)選為TE-13(SEQIDNo.15)或TE-08(SEQIDNo.10)或這些序列的15.—種真核表達載體，其特征在于所述表達載體包含如權利要求1至14中任一項所述的核酸。16.如權利要求15所述的真核表達載體，其特征在于其包含啟動子和/或目的異源基因和/或可選擇標記和/或任選增強子。17.如權利要求15至16中任一項所述的真核表達載體，其特征在于其包含數(shù)個相同或不同的如權利要求1至14中任一項所述的核酸的組合，其中一個或多個所述核酸位于該目的基因之前(亦即5'側)和/或一個或多個所述核酸位于該目的基因^^后(亦即3'側)。18.如權利要求17所述的真核表達載體，其特征在于所述被組合的核酸為TE-06(SEQIDNo.8)，優(yōu)選為TE-08(SEQIDNo.10)。19.如權利要求17或18所述的真核表達載體，其特征在于一或多個TE-08核酸(SEQIDNo.IO)與一或多個TE-06核酸(SEQIDNo.8)或TE-21核酸(SEQIDNo.21)的組合位于該目的基因之前(亦即5'側)和/或之后(亦即3，側)，優(yōu)選TE-08核酸(SEQIDNo.10)與位于其后的TE-06核酸(SEQIDNo.8)或TE-21核酸(SEQIDNo.21)的組合位于該目的基因之前(亦即5'側)。20.如權利要求17所述的真核表達載體，其特征在于一或多個TE-08核酸(SEQIDNo.10)位于該目的基因之前(亦即5，側)，且一或多個TE-08核酸位于該目的基因之后(亦即3，側)，優(yōu)選為一個TE-08核酸在目的基因之前且一個TE-08核酸在目的基因之后。21.如權利要求15至20中任一項所述的真核表達載體，其特征在于其包含一或多個分布于2個質(zhì)粒上的如權利要求1至14中任一項所述的核酸。22.如權利要求15至21中任一項所述的真核表達載體，其特征在于該可選4奪標記為DHFR或Neo，諸如NeoF240I。23.—種產(chǎn)生真核表達載體的方法，其特征為將如權利要求1至14中任一項所述的核酸整合至表達載體中。24.—種真核宿主細胞，其特征在于其包含如權利要求15至23中任一項所述的真核表達載體。25.如權利要求24所述的真核宿主細胞，其特征在于其為高產(chǎn)者，亦即其比產(chǎn)率高于無TE元件的同等真核宿主細胞，所述高產(chǎn)宿主細胞的表達量增加至兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍或十倍，或增加兩倍以上、三倍以上、四倍以上、五倍以上、七倍以上或十倍以上，優(yōu)選為高達五倍或三倍以上。26.如權利要求24或25所述的真核宿主細胞，其特征在于該表達載體是穩(wěn)定地整合至基因組中。27.如權利要求24-26中任一項所述的真核宿主細胞，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞，諸如CHO、NS0、Sp2/0-Ag14、BHK21、BHKTK-、HaK、2254-62.2(BHK-21衍生物)、CHO-K1、CHO-DUKX(=CHOduk-、CHO/dhfr-)、CHO-DUKXBl、CHO-DG44、CHOPro國5、V79、B14AF28-G3、CHL細胞，優(yōu)選為CHO細胞且尤其優(yōu)選為CHO-DG44細胞。28.如權利要求24-27中任一項所述的真核宿主細胞，其特征在于其另外包含抗細胞凋亡基因，諸如BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、Al、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL或CED-9,優(yōu)選為Bcl誦xL或BCL-2，最佳為BCL-xL。29.—種形成經(jīng)穩(wěn)定轉染的高產(chǎn)真核宿主細胞系的方法，其特征在于具有下列步驟(a)將如權利要求1至14中任一項所述的核酸整合至包含目的基因的真核表達載體中；(b)用此表達載體轉染真核宿主細胞；(c)選擇經(jīng)轉染的高產(chǎn)宿主細胞。30.如權利要求29所述的方法，特征在于其具有額外的擴增步驟。31.如權利要求29或30所述的方法，特征在于其具有額外的克隆步驟。32.—種制備及選擇重組哺乳動物細胞的方法，特征在于其具有下列步驟(a)用至少編碼目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物、新霉素磷酸轉移酶(所述新霉素磷酸轉移酶優(yōu)選經(jīng)修飾的)、及可擴增的可選^r標記DHFR的基因轉染宿主細胞，其中為了增強轉錄或表達，該一個或多個目的基因至少是功能性連接至至少一種如權利要求1-14中任一項所述的核酸；(b)在能夠使這些不同基因得到表達的條件下培養(yǎng)所述細胞；(c)通過在諸如G418的選擇劑存在下在無次黃嘌呤/胸苷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細胞，以選擇這些經(jīng)共整合的基因，及(d)通過在選擇劑存在下培養(yǎng)這些細胞以使這些經(jīng)共整合的基因擴增，所述選擇劑至少使得該可擴增的可選擇標記基因得以擴增，所述選擇劑諸如曱氨蝶呤。33.如權利要求32所述的方法，其特征在于該經(jīng)轉染的細胞培養(yǎng)在無次黃噪呤/胸苷的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基在無血清存在下補充有至少200pg/mLG418,優(yōu)選400pg/mL或更多G418,且添加遞增濃度的MTX。34.如權利要求32或33所述的方法，其特征在于該第一擴增步驟中該MTX的濃度為至少100nM或至少250nM,且逐步增至1^M或更高。35.如權利要求29-34中任一項所述的方法，其與改善目的蛋白質(zhì)的糖基化的方法相組合。36.如權利要求29-35中任一項所述的方法，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞，諸如CHO、NSO、Sp2/0-Ag14、BHK21、BHKTK-、HaK、2254-62.2(BHK-21衍生物)、CH0陽K1、CHO-DUKX(=CHOduk-、CHO/dhff)、CHO-DUKXBl、CHO-DG44、CHOPro-5、V79、B14AF28-G3、CHL細胞，優(yōu)選為CHO細胞，且尤其優(yōu)選為CHO-DG44細胞。37.如權利要求29-36中任一項所述的方法，其中該表達載體包含可選4犖標記，諸如DHFR或Neo,例如NeoF2401。38.如權利要求29-37中任一項所述的方法，其中高產(chǎn)者的比例增加至兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍或十倍，或增加兩倍以上、三倍以上、四倍以上、五倍以上、七倍以上或十倍以上，優(yōu)選為升高至五倍或三倍以上。39.—種制備生物藥產(chǎn)物的方法，其特征在于具有下列步驟(a)將權利要求1至14中任一項所述的核酸整合至包含目的基因的真核表達載體中；(b)用此表達載體轉染真核宿主細胞；(c).選擇經(jīng)轉染的高產(chǎn)宿主細胞，及(d)在使得該一個或多個目的基因表達的條件下培養(yǎng)該所獲得的經(jīng)轉染的高產(chǎn)宿主細胞。40.如權利要求39所述的方法，其特征在于具有下列額外步驟(e)收集并純化目的蛋白質(zhì)。41.一種如權利要求1至14中任一項所述的核酸在真核表達載體中用以增加真核宿主細胞的表達系統(tǒng)中目的基因的轉錄或表達或用于制備生物藥產(chǎn)物的用途。42.權利要求1至14中任一項所述的核酸用于產(chǎn)生轉基因動物或植物的用途。43.權利要求1至14中任一項所述的核酸用于基因治療的用途。44.權利要求1至14中任一項所述的核酸元件用作藥物或用于藥物組合物中的用途。45.—種試劑盒，其是由權利要求1至14中任一項所述的一種或多種核酸、一種或多種表達載體、一種或多種宿主細胞及任選一種或多種轉染試劑組成。全文摘要本發(fā)明是關于DNA序列，尤其是轉錄或表達增強元件(TE元件)，及其與增強子、啟動子、產(chǎn)物基因及可選擇標記一起在表達載體上的用途。本發(fā)明描述序列No.1及TE元件TE-01、TE-02、TE-03、TE-04、TE-06、TE-07、TE-08、TE-10、TE-11或TE-12。而TE-06、TE-07或TE-08因尺寸小而尤其優(yōu)選。序列No.1源自位于CHO細胞的Ub/S27a基因的編碼區(qū)上游的序列區(qū)。當穩(wěn)定整合至真核基因組(優(yōu)選CHO-DG44基因組)時，TE元件會引起產(chǎn)物基因的表達增強。藉此可克服、遮蔽或消除染色體位置效應。因此，可使轉染混合物中高產(chǎn)者的比例以及絕對表達量增加高達15倍。文檔編號C12N15/85GK101517085SQ200780035929公開日2009年8月26日申請日期2007年6月15日優(yōu)先權日2006年7月26日發(fā)明者克斯廷·索特,芭芭拉·埃南克爾申請人:貝林格爾英格海姆法瑪兩合公司